CN112362646B - 一种基于纳米酶的谷胱甘肽传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米酶的谷胱甘肽传感器及其制备方法与应用。该方法包括：将十六烷基三甲基溴化铵和一水合柠檬酸加入水中，得到溶液A；将K2PdCl4、CuCl2·2H2O和HAuCl4·4H2O加入水中，得到溶液B；将溶液A和溶液B混合，加热，得到复合物；将复合物加入水中，得到PdCuAu溶液；将2‑甲基咪唑和Zn(NO3)2·6H2O加入甲醇中，加入PdCuAu溶液，搅拌，得到纳米复合物；将纳米复合物和二氧化锰纳米片加入溶剂中，孵育，得到基于纳米酶的谷胱甘肽传感器。本发明得到的传感器中，PdCuAu在载体上均匀分布，PdCuAu与ZIF‑8具有正向的协同作用，能提高催化活性。

Description

一种基于纳米酶的谷胱甘肽传感器及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于纳米酶的谷胱甘肽传感器及其制备方法与应用。
背景技术
谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用，是细胞内含量最丰富的非蛋白硫醇，在维持氧化还原动态平衡、对抗氧化应激、抵御自由基和毒素等方面发挥着重要作用。尤其是细胞内谷胱甘肽水平的异常与许多临床疾病密切相关，如艾滋病、癌症、心脏问题和神经退行性疾病等。因此，对谷胱甘肽进行灵敏、准确的测定具有重要的临床和医学意义。
到目前为止，已经建立了多种检测谷胱甘肽的方法，包括高效液相色谱法(HPLC)、电化学分析、毛细管电泳分析(HPCE)、质谱、荧光分析、磁共振成像等。刘等人利用负载还原石墨烯的聚鲁米诺/苯胺纳米棒(PLA@rGO)为纳米探针，构建了一种超灵敏的电化学发光(ECL)生物传感器，实现了谷胱甘肽的检测(Biosensors and Bioelectronics,2019,133,154-159)。具体检测步骤：将聚乳酸@rGO混悬液滴在GCE上，在含有PLL和不同浓度GSH的CBS(pH9.25)缓冲液中，用MPI-E电化学发光分析仪记录ECL信号,此方法虽然能够实现对GSH定量的检测，但存在一定的缺陷，如样品制备复杂、仪器昂贵、操作繁琐、不易普及应用等缺点。然而，比色法因具有灵敏度高、操作简便、成本低等优点，已成为检测谷胱甘肽的优异选择。
随着纳米技术的发展，一系列被称为“纳米酶”的纳米材料逐渐被认为具有天然的类酶活性，如过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等。因其合成简单、稳定性好、成本低、操作可控等优点，作为一种新型的人工酶被广泛研究。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种基于纳米酶的谷胱甘肽传感器及其制备方法与应用。
本发明的目的之一在于提供一种可以特异性检测谷胱甘肽的生物传感器。
本发明的目的之二是提供该生物传感器制备的方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将十六烷基三甲基溴化铵和一水合柠檬酸加入水中，混合均匀，得到溶液A；将K2PdCl4、CuCl2·2H2O和HAuCl4·4H2O加入水中，混合均匀，得到溶液B；将步骤(1)所述溶液A和步骤(2)所述溶液B混合均匀，得到混合液，将所述混合液升温进行加热处理，离心洗涤，取沉淀，得到PdCuAu复合物；
(2)将PdCuAu复合物加入水中，分散均匀，得到PdCuAu溶液；将2-甲基咪唑和Zn(NO3)2·6H2O加入甲醇中，然后加入所述PdCuAu溶液，搅拌处理，过滤取滤渣，洗涤，干燥，得到ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物；
(3)将ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物和二氧化锰纳米片加入溶剂中，分散均匀，进行孵育处理，得到所述基于纳米酶的谷胱甘肽传感器。
进一步地，步骤(1)所述十六烷基三甲基溴化铵和一水合柠檬酸的质量比为1.19-1.30；在所述溶液A中，十六烷基三甲基溴化铵的浓度为25.0-26.0mg/mL。
进一步地，步骤(1)所述K2PdCl4、CuCl2·2H2O和HAuCl4·4H2O三者的摩尔比为1:(0.98-1.02):(0.98-1.02)；在所述溶液B中，K2PdCl4的浓度为0.99-1.01mol/L；所述溶液A与溶液B的体积比为0.9:9.08-9.10。
进一步地，步骤(1)所述加热处理的温度为185-195℃，加热处理的时间为4-5h。
优选地，步骤(1)所述加热处理的温度为190℃，加热处理的时间为4h。
进一步地，步骤(2)所述PdCuAu溶液的3.9-4.1mg/mL。
进一步地，步骤(2)所述2-甲基咪唑和Zn(NO3)2·6H2O的质量比为0.274-0.278:1；步骤(2)所述2-甲基咪唑与甲醇的质量体积比为0.111-0.113g/mL。
进一步地，步骤(2)所述PdCuAu溶液与甲醇的体积比为1:29.8-30.2；步骤(2)所述搅拌处理的时间为10-12h。
进一步地，步骤(3)所述溶剂为去离子水、乙醇中的一种以上；所述ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物和二氧化锰纳米片的质量比为0.98-1.0；所述ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物与溶剂的质量体积比为0.98-1.02g/mL；所述孵育处理的时间为20-25min。
优选地，所述孵育处理的时间为20min。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器。
本发明提供的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器在谷胱甘肽的特异性检测中的应用。
本发明所得的纳米材料(基于纳米酶的谷胱甘肽传感器)在GSH的刺激下发生酶活性的转换。基于这种酶活性的变化，可以实现谷胱甘肽的特异性检测。
本发明是采用比色技术对谷胱甘肽特异性和灵敏性的检测。为实现以上目的，该基于纳米酶的谷胱甘肽传感器是将具有独特性质的MOF材料作为载体负载PdCuAu纳米粒子。载体不仅能用来稳定PdCuAu纳米粒子，同时还能与PdCuAu产生协同效应，提高复合材料的整体催化效果。
本发明采用的载体ZIF-8是一种金属有机骨架材料，具有多孔性、高的比表面积和生物相容性。合成出来的ZIF-8(PdCuAu)与裸PdCuAu相比具有更高的催化活性，主要反映为ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性得到显著提高。通过将ZIF-8(PdCuAu)与二氧化锰纳米片直接混合孵育，可以有效抑制ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶模拟酶活性；然而当有谷胱甘肽存在，谷胱甘肽将二氧化锰还原为锰离子，ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物模拟酶活性恢复，基于这种酶活性的变化，构成了GSH的生物传感器。
本发明所述的金属有机框架ZIF-8采用本领域常用的制备方法，如，将六水合硝酸锌与2-甲基咪唑反应得到。
优选地，所述金属有机框架ZIF-8的制备方法，包括如下步骤：
(1)PdCuAu的合成：将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和一水合柠檬酸溶于去离子水中，得溶液A，然后将K2PdCl4、CuCl2·2H2O,和HAuCl4·4H2O以摩尔比为1：1：1的比例混合，得溶液B，A液与B液混合均匀，搅拌30min后转移至不锈钢反应釜中，并在190摄氏度条件下加热4h；反应后通过离心洗涤收集产物；
(2)ZIF-8(PdCuAu)的合成：将2-甲基咪唑和Zn(NO3)2·6H2O溶于甲醇中，加入PdCuAu溶液，室温搅拌2h，收集产品，用甲醇洗涤三次。
(3)制备二氧化锰纳米片：四甲基氢氧化铵与过氧化氢混合，然后加入去离子水，然后将上述溶液与MnCl4·4H2O混合，溶液立即变成深褐色，整个溶液室温下搅拌过夜，用水和乙醇洗涤三次，最后在50℃干燥箱中干燥备用。为了得到二氧化锰纳米片，对制备的二氧化锰进行了超声波剥离。
步骤(1)中，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和一水合柠檬酸超声溶解为澄清的溶液。
步骤(2)中，PdCuAu在磁力搅拌下快速加入到溶液中。
作为本发明的优选方案，ZIF-8(PdCuAu)纳米材料的制备方法如下：
(1)PdCuAu的合成：将0.26g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和0.2g一水合柠檬酸溶于去离子水中，得溶液A，然后将0.1M的K2PdCl4、CuCl2·2H2O、HAuCl4·4H2O各300μL混合，得溶液B,A液与B液混合均匀，搅拌30min后转移至不锈钢反应釜中，并在190度加热4h。反应后通过离心洗涤收集产物；
(2)制备ZIF-8(PdCuAu)：将31mg 2-甲基咪唑和112mg Zn(NO3)2·6H2O各溶于15mL甲醇中，快速加入1mL PdCuAu溶液，室温搅拌2h，收集产品，用甲醇洗涤三次，干燥备用，得到所述ZIF-8(PdCuAu)纳米材料。
作为本发明的优选方案，二氧化锰纳米片的制备方法如下：
将8mL四甲基氢氧化铵(TMA·OH，1.5M)与2mL过氧化氢(H2O2，30％)混合，然后加入去离子水使总体积为20mL，然后在15秒内将上述溶液与10mL MnCl4·4H2O(0.3M)混合，溶液立即变成深褐色，将溶液在室温下搅拌过夜，用水和乙醇洗涤三次，50℃干燥箱中干燥备用。为了得到二氧化锰纳米片，对制备的二氧化锰进行了超声剥离。即10mg二氧化锰溶于20mL水中，超声剥离5h，以2000rpm离心得到二氧化锰纳米片。
本发明的检测原理如下：ZIF-8(PdCuAu)首先通过静电作用与二氧化锰纳米片结合形成复合体系并产生过氧化物酶活性受到抑制，氧化酶活性增强的现象。在加入GSH后，二氧化锰与GSH通过氧化还原作用形成锰离子。由于二氧化锰的消耗，使得ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性恢复，相应的氧化酶活性被抑制。由于复合体系的酶活性与GSH的浓度是相关的，基于在GSH刺激下，体系酶活性的变化可以实现GSH的检测。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法简便易行，不需要复杂的设备辅助，可在一般溶剂中合成，无需惰性气体保护；
(2)本发明得到的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器中，PdCuAu复合物在载体上均匀分布，PdCuAu与ZIF-8具有正向的协同作用，能提高PdCuAu的催化活性；
(3)现有的同时具有多种酶活性的材料在相同条件下酶活性会相互干扰，而本发明提供的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器，其两种酶活性不会产生相互干扰。
附图说明
图1为本发明所述材料的电镜图；
图2为本发明所述纳米粒子的结构鉴定结果图；
图3为二氧化锰纳米片的紫外吸收表征；
图4为本发明所述纳米粒子相应的zeta电位表征；
图5为本发明所述纳米粒子的类过氧化物酶催化活性结果图；
图6为本发明所述纳米粒子与二氧化锰共孵育的复合物的类氧化酶催化活性；
图7为本发明所述纳米粒子可作为比例检测GSH的可能性结果图；
图8为GSH和二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)类过氧化物酶活性的调控结果图；
图9为不同浓度GSH作用下基于酶活性变化比例检测GSH的结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
1、ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物的制备
(1)将0.26g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和0.2g一水合柠檬酸溶于9.1毫升去离子水中，得溶液A，然后将浓度为0.1M的K2PdCl4溶液、CuCl2·2H2O溶液、HAuCl4·4H2O溶液各300μL混合，得溶液B，将溶液A与溶液B混合均匀，搅拌30min后转移至不锈钢反应釜中，并在190℃加热4h，反应后通过离心洗涤，取沉淀收集产物，得到PdCuAu复合物；
(2)将PdCuAu复合物加入水中，分散均匀，得到PdCuAu溶液(4.0mg/mL)；制备ZIF-8(PdCuAu)：将31mg 2-甲基咪唑和112mg Zn(NO3)2·6H2O分别溶于15毫升甲醇中，快速加入1毫升PdCuAu溶液，室温搅拌1h，收集产品，用甲醇洗涤三次，干燥备用，得到ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物。ZIF-8的合成与ZIF-8(PdCuAu)的合成基本相同，除了不加PdCuAu溶液，其他操作均相同。
(3)制备二氧化锰纳米片：取8mL四甲基氢氧化铵溶液(TMA·OH，1.5M)与2mL过氧化氢(H2O2，30wt％)混合后加入去离子水使总体积为20mL，然后在15秒内将上述溶液与10mLMnCl4·4H2O溶液(0.3M)混合，溶液立即变成深褐色，将溶液在室温下搅拌10小时，用水和乙醇洗涤三次，50℃干燥箱中干燥备用，得到二氧化锰，为了得到二氧化锰纳米片，对制备的二氧化锰进行了超声剥离：即10mg二氧化锰溶于20mL水中，超声剥离5h，以2000rpm离心得到二氧化锰纳米片。
(4)制备二氧化锰纳米片与ZIF-8(PdCuAu)的纳米复合物(这里命名为ZIF(PdCuAu)@MnO2)：取二氧化锰纳米片与ZIF-8(PdCuAu)加入水中，二氧化锰纳米片的浓度为0.15mg/mL，ZIF-8(PdCuAu)的浓度为0.12mg/mL，共同孵育20min，即得所述基于纳米酶的谷胱甘肽传感器。
2、ZIF-8(PdCuAu)和二氧化锰纳米片的电镜图
结果分析：
由电镜图的结果(图1的A部分所示)可知PdCuAu均匀的分布于ZIF-8上；二氧化锰纳米片呈现出片状结构(图1的B部分所示)。上述材料的形貌表征结果与预期相符，也证明了本发明实施例1基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的成功合成。
3、ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物的红外、热重(TG)、XRD、BET表征
图2的A部分为本发明实施例的纳米粒子的红外光谱，图2的B部分为本发明实施例的纳米粒子的热重分析结果，图2的C部分为本发明实施例的纳米粒子的X-射线衍射图谱，图2的D部分为本发明实施例的纳米粒子的氮气吸脱附表征。
如图2的A部分所示，对实施例1基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的红外光谱进行了分析。1567cm-1为咪唑骨架的振动吸收，3450cm-1为水分子中-O-H的振动吸收峰，1549cm-1为苯环上C＝C双键的振动吸收峰，表明配体在此位置完全脱质子化，为制备ZIF-8晶体提供了必要的条件。这些特征峰出现在ZIF-8和ZIF-8(PdCuAu)中，证明了该材料的成功制备。ZIF-8、PdCuAu、MnO2、ZIF(PdCuAu)@MnO2的热重(TG)曲线如图2的B部分所示，随着温度的升高，在50-700℃范围内有两次失重。两次失重是ZIF-8晶体洗涤过程中残留水分挥发和孔隙结构中有机配体结合水分子的去除所造成的重量损失。结果表明，该材料在700℃时仍能保持75％以上的质量，具有较好的热稳定性。纯ZIF-8、ZIF-8(PdCuAu)、PdCuAu、ZIF(PdCuAu)@MnO2的XRD图谱如图2的C部分所示，除了衍射强度降低外，衍射角没有明显的位移变化，因此MOFs晶形也没有发生明显变化，证明MOFs材料具有良好的化学稳定性。此外，纯ZIF-8样品的峰位与模拟样品的峰位基本一致，说明PdCuAu的包封不会破坏ZIF-8的晶体结构。ZIF-8的N2吸附-解吸等温线与Ⅳ型介孔材料相似。随着压力的增加，吸附体积急剧增加，吸附曲线发生跳跃，出现较大的滞后环，这是介孔结构存在的有力证据(图2的D部分)。而且在MnO2条件下，ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的比表面积明显小于ZIF-8和ZIF-8(PdCuAu)，也说明PdCuAu被成功地加载到ZIF-8中。综上实验数据表明，实验所需的材料已成功制备。
4、二氧化锰纳米片的紫外吸收表征
本实验是对实施例1中得到的MnO2纳米材料(二氧化锰纳米片)的紫外吸收进行表征。
实施步骤：
取等量的MnCl2·4H2O,TMA·OH/H2O2,MnO2于紫外可见分光光度计上检测200-700nm处的吸收。
结果分析：
与MnCl2·4H2O,TMA·OH+H2O2组相比只有MnO2在此范围内有强的吸收(图3)，而且此吸收与文献上报道的二氧化锰的吸收一致，也证明了二氧化锰纳米片的成功制备。
5、本实验是对实施例1中得到的纳米材料的zeta电位进行表征。
实施步骤：
取一定浓度的(PdCuAu)、ZIF-8、ZIF-8(PdCuAu)、ZIF-8(PdCuAu)@MnO2在Zetasizer纳米粒度电位仪上检测其电位。
结果分析：
如图4结果所示，二氧化锰纳米片在此条件下带负电荷，ZIF-8(PdCuAu)在此条件下带正电荷，二者电性的差异为后续检测GSH提供了充足的证据。
6、本实验是对实施例1中得到的纳米材料的类过氧化物酶活性进行研究。
实施步骤：
反应体系中含有5mM H2O2、2mM TMB、20μg mL-1上述实施例1获得的不同材料和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长550-750nm范围内的光谱图。
结果分析：
如图5的A部分所示，对比曲线a、b、c可以发现只有ZIF-8(PdCuAu)与H2O2同时存在时，在652nm处才有明显的吸收，证明ZIF-8(PdCuAu)优异的类过氧化物酶活性。为了进一步证明ZIF-8(PdCuAu)中PdCuAu是包覆于ZIF-8中，而不是二者的简单混合，做了关于ZIF-8、PdCuAu、ZIF-8与PdCuAu直接混合和ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性的比较。如图5的B部分所示，ZIF-8组没有显示出酶活性，ZIF-8与PdCuAu直接混合组显示出与裸PdCuAu组同样的催化效果，这个结果也证明了ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性主要来自于PdCuAu，而且ZIF-8和PdCuAu之间的正的协同作用提高了ZIF-8(PdCuAu)的催化活性。
7、本实验是对实施例1中得到的纳米材料与二氧化锰孵育后的类氧化酶活性进行研究。
实施步骤：
反应体系含有2mM TMB、20μg mL-1上述实施案例1中得到的纳米材料与二氧化锰孵育后所得复合物和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长550-750nm范围内的光谱图。
结果分析：
如图6所示，ZIF-8(PdCuAu)@MnO2在氮气饱和气氛下，没有任何的吸收，但当在氧气存在下，ZIF-8(PdCuAu)@MnO2表现出较强的吸收，证明了ZIF-8(PdCuAu)@MnO2比较优异的氧化酶模拟酶活性。
8、本实验是对ZIF-8(PdCuAu)和ZIF-8(PdCuAu)@MnO2相应的酶促反应动力学表征。
实施步骤：
为了阐明纳米复合材料的催化机理，进行了稳态动力学实验。在室温下，用0.2mgmL-1ZIF-8(PdCuAu)@MnO2，在不同浓度TMB的醋酸缓冲液中，研究了类氧化酶活性的稳态动力学。用0.2mg mL-1ZIF-8(PdCuAu)在醋酸缓冲液中加入不同浓度的H2O2(TMB)，离心管内加入一定浓度的TMB(H2O2)，进行过氧化物酶样活性的稳态动力学分析。测定了ox-TMB在652nm处的吸光度。
结果分析：
图7的A部分为二氧化锰的类氧化酶和类过氧化物酶活性效果图；图7的B部分为ZIF-8(PdCuAu)的类氧化酶和类过氧化物酶活性效果图；图7的C部分为MnO2对ZIF-8(PdCuAu)的类氧化酶和类过氧化物酶活性的影响效果图；图7的D部分为GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的类氧化酶和类过氧化物酶活性的影响效果图；
为了更好地了解ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物作为过氧化物酶模拟物和ZIF-8(PdCuAu)@MnO2作为氧化酶模拟物催化氧化TMB的机理，进行了稳态动力学实验(图5)。在适当的H2O2和TMB浓度范围内，获得了ZIF-8(PdCuAu)的典型Michaelis-Menten曲线。图7的A部分和图7的B部分显示了固定TMB浓度改变H2O2浓度的动力学曲线，图7的C部分和图7的D部分分别显示了固定H2O2浓度改变TMB浓度的动力学曲线。初始反应速率(V0)、最大反应速率(Vmax)和Michaelis–Menten常数(Km)采用Lambert-Beer定律和双倒数曲线计算，如下表1所示。众所周知，Km是酶对底物亲和力的指标。如果Km值较小，这表示酶对底物的亲和力越大，反之亦然。Km值表明，该材料对H2O2和TMB具有良好的催化亲和力，证明ZIF-8(PdCuAu)可以作为一种良好的过氧化物酶模拟酶。
表1
Figure BDA0002745333010000081
ZIF-8(PdCuAu)@MnO2在TMB氧化过程中表现出典型的米氏行为(图7的E部分)。Michaelis-Menten方程的双倒数图如图7的F部分所示。催化剂的Km和Vmax如下表2所示。比较了ZIF-8(PdCuAu)@MnO2与其它氧化酶模拟酶的Km值，得出ZIF-8(PdCuAu)@MnO2具有较高的底物亲和力的结论，也证明了ZIF-8(PdCuAu)@MnO2比较优异的氧化酶模拟酶活性。
表2
Figure BDA0002745333010000091
9、基于在GSH刺激下ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的POD与OXD活性的变化检测GSH的可能性。
实施步骤：
实验1：MnO2的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的检测
反应体系含有5mM H2O2、2mM TMB、0-300μg mL-1的二氧化锰和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于二氧化锰的氧化酶活性检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验2：ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的检测
反应体系含有5mM H2O2、2mM TMB、0-0.80mg mL-1的ZIF-8(PdCuAu)和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于ZIF-8(PdCuAu)的氧化酶活性检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验3：不同浓度二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性活性的影响
将不同浓度的MnO2(0-300μg mL-1)与ZIF-8(PdCuAu)共同孵育15min,然后加入5mMH2O2、2mM TMB和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于加入不同浓度二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)的氧化酶活性影响的检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验4：不同浓度GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的影响
将不同浓度的GSH(0-200μM)与ZIF-(PdCuAu)@MnO2共同孵育15min,然后加入5mMH2O2、2mM TMB和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于加入不同浓度GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的氧化酶活性影响的检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
结果分析：
如图8的A部分所示，MnO2在此条件下主要表现为类氧化酶活性；ZIF-8(PdCuAu)主要表现为类过氧化物酶活性(图8的B部分)；从图8的C部分结果可以看出加入不同浓度的MnO2后，ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性受到抑制，而相应的氧化酶活性得到提高。这主要是因为这里MnO2的加入导致ZIF-8(PdCuAu)的活性位点由暴露的状态转变为掩蔽的状态，使得ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性不能发挥出来，而且加入的MnO2本身具有较优异的氧化酶活性，所以体系最终主要表现为类氧化酶活性。对于基于酶活性的变化检测GSH来言，GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的酶活性的影响是非常重要的。加入不同的GSH会导致MnO2被消耗，就会使得ZIF-8(PdCuAu)的活性位点重新暴露出来，相应的过氧化物酶活性就会恢复，相反由于MnO2被消耗掉后，主要的氧化酶活性的源头被切断，则氧化酶活性就会受到抑制。如图8的D部分结果所示，加入不同浓度GSH后，体系过氧化物酶活性变化的相对值随着GSH的浓度增大而升高，相反氧化酶活性的变化值随着GSH浓度的增大而降低。上述这些结果都可以说明此发明可作为GSH的传感器。
10、基于在GSH刺激下ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的POD与OXD活性的变化检测GSH。
实验步骤：
在含ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的醋酸缓冲液中加入不同浓度的GSH后，加入TMB或过氧化氢和TMB，在紫外可见分光光度计上进行检测652nm处的吸收。
结果分析：
如预期结果，系统的吸光度比值取决于分析物(GSH)的浓度。在0.05μM-20μM范围内，吸光度比随GSH浓度呈线性变化(如图9所示)，根据3σ标准，计算出检测限(LOD)为0.025μM。与许多有关GSH检测的文献相比，该系统具有更宽的检测范围和更低的检测限。
11、细胞裂解液中GSH的检测
实验步骤：
将A549细胞以106/well的密度铺于六孔板，孵育24小时后，去掉培养基，用PBS洗涤三次，加入胰酶消化细胞，离心用PBS洗两次，再分散于PBS中。为制得裂解液，将上述所得细胞于-80℃和37℃水浴反复冻融三次，然后在4℃下3000rpm离心3分钟，所得上清即为细胞裂解液。
为评定分析方法的准确性，采用标准加入法检测细胞裂解液中GSH。即在含ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的体系中加入5％的细胞裂解液后，分别加入0、5、10μM GSH,孵育20min后，加入TMB或过氧化氢和TMB，在紫外可见分光光度计上进行检测652nm处的吸收。
结果分析：
表3是采用标准加入法检测细胞裂解液中GSH的结果数据表。
表3
加入量(μM) 测得量(μM) 回收率(％) 相对标准偏差(％)
0 12.61±0.6 - 2.2％
5 17.67±0.75 103％ 1.9％
10 22.27±0.9 101％ 3.1％
以上实验结果(表3)，该方法适用于细胞裂解液中GSH的检测。细胞裂解液中GSH的回收率为101.0％～103.0％，rsd为1.9％～3.1％。良好的回收率和相对标准偏差表明所建立的生物样品中谷胱甘肽的检测方法具有较高的准确度和可靠性。
实施例2
1、ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物的制备
(1)将0.25g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和0.21g一水合柠檬酸溶于9.1毫升去离子水中，得溶液A，然后将浓度为0.1M的K2PdCl4溶液、CuCl2·2H2O溶液、HAuCl4·4H2O溶液各300μL混合，得溶液B，将溶液A与溶液B混合均匀，搅拌30min后转移至不锈钢反应釜中，并在185℃加热4h，反应后通过离心洗涤，取沉淀收集产物，得到PdCuAu复合物；
(2)将PdCuAu复合物加入水中，分散均匀，得到PdCuAu溶液(3.9mg/mL)；制备ZIF-8(PdCuAu)：将30.7mg 2-甲基咪唑和112mg Zn(NO3)2·6H2O分别溶于15毫升甲醇中，快速加入1毫升PdCuAu溶液，室温搅拌1h，收集产品，用甲醇洗涤三次，干燥备用，得到ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物。ZIF-8的合成与ZIF-8(PdCuAu)的合成基本相同，除了不加PdCuAu溶液，其他操作均相同。
(3)制备二氧化锰纳米片：取8mL四甲基氢氧化铵溶液(TMA·IH，1.5M)与2mL过氧化氢(H2O2，30wt％)混合后加入去离子水使总体积为20mL，然后在15秒内将上述溶液与10mLMnCl4·4H2O溶液(0.3M)混合，溶液立即变成深褐色，将溶液在室温下搅拌10小时，用水和乙醇洗涤三次，50℃干燥箱中干燥备用，得到二氧化锰，为了得到二氧化锰纳米片，对制备的二氧化锰进行了超声剥离：即10mg二氧化锰溶于20mL水中，超声剥离5h，以2000rpm离心得到二氧化锰纳米片。
(4)制备二氧化锰纳米片与ZIF-8(PdCuAu)的纳米复合物(这里命名为ZIF(PdCuAu)@MnO2)：取二氧化锰纳米片与ZIF-8(PdCuAu)加入水中，二氧化锰纳米片的浓度为0.15mg/mL，ZIF-8(PdCuAu)的浓度为0.12mg/mL，共同孵育20min，即得所述基于纳米酶的谷胱甘肽传感器。
2、ZIF-8(PdCuAu)和二氧化锰纳米片的电镜图
结果分析：
合成出来的材料的电镜图与实施案例一中图1的电镜图相符，证明了本合成方法的可行性。
3、ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物的红外、热重(TG)、XRD、BET表征
合成出来的材料的结构表征与实施案例一的图2结果相符，证明了本合成方法的可行性。
4、二氧化锰纳米片的紫外吸收表征
本实验是对实施例1中得到的MnO2纳米材料(二氧化锰纳米片)的紫外吸收进行表征。
实验结果显示所合成的二氧化锰纳米片紫外吸收与文献一致且与实验案例一中图3结果一致，也证明了二氧化锰纳米片的成功制备和合成方法的可行性。
5、本实验是对实施例2中得到的纳米材料的zeta电位进行表征。
电位检测结果所示，二氧化锰纳米片在此条件下带负电荷，ZIF-8(PdCuAu)在此条件下带正电荷，与实施例1的图4结果一致，二者电性的差异为后续检测GSH提供了充足的证据。
6、本实验是对实施例2中得到的纳米材料的类过氧化物酶活性进行研究。
实验结果显示与实施例1中图5所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
7、本实验是对实施例2中得到的纳米材料与二氧化锰孵育后的类氧化酶活性进行研究。
实验结果显示与实施例1中图6所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
8、本实验是对ZIF-8(PdCuAu)和ZIF-8(PdCuAu)@MnO2相应的酶促反应动力学表征。
实验结果显示与实施例1中图7所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
9、基于在GSH刺激下ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的POD与OXD活性的变化检测GSH的可能性。
实施步骤：
实验1：MnO2的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的检测
反应体系含有5mM H2O2、2mM TMB、0-300μg mL-1的二氧化锰和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于二氧化锰的氧化酶活性检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验2：ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的检测
反应体系含有5mM H2O2、2mM TMB、0-0.80mg mL-1的ZIF-8(PdCuAu)和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于ZIF-8(PdCuAu)的氧化酶活性检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验3：不同浓度二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的影响
将不同浓度的MnO2(0-300μg mL-1)与ZIF-8(PdCuAu)共同孵育15min,然后加入5mMH2O2、2mM TMB和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于加入不同浓度二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)的氧化酶活性影响的检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验4：不同浓度GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的影响
将不同浓度的GSH(0-200μM)与ZIF-(PdCuAu)@MnO2共同孵育15min,然后加入5mMH2O2、2mM TMB和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于加入不同浓度GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的氧化酶活性影响的检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
结果分析：
实验结果与实施例1中图8结果一致。如图8的A部分所示，MnO2在此条件下主要表现为类氧化酶活性；ZIF-8(PdCuAu)主要表现为类过氧化物酶活性(图8的B部分)；从图8的C部分结果可以看出加入不同浓度的MnO2后，ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性受到抑制，而相应的氧化酶活性得到提高。这主要是因为这里MnO2的加入导致ZIF-8(PdCuAu)的活性位点由暴露的状态转变为掩蔽的状态，使得ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性不能发挥出来，而且加入的MnO2本身具有较优异的氧化酶活性，所以体系最终主要表现为类氧化酶活性。对于基于酶活性的变化检测GSH来言，GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的酶活性的影响是非常重要的。加入不同的GSH会导致MnO2被消耗，就会使得ZIF-8(PdCuAu)的活性位点重新暴露出来，相应的过氧化物酶活性就会恢复，相反由于MnO2被消耗掉后，主要的氧化酶活性的源头被切断，则氧化酶活性就会受到抑制。如图8的D部分结果所示，加入不同浓度GSH后，体系过氧化物酶活性变化的相对值随着GSH的浓度增大而升高，相反氧化酶活性的变化值随着GSH浓度的增大而降低。上述这些结果都可以说明此发明可作为GSH的传感器。
10、基于在GSH刺激下ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的POD与OXD活性的变化检测GSH。
实验步骤：
在含ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的醋酸缓冲液中加入不同浓度的GSH后，加入TMB或过氧化氢和TMB，用紫外可见分光光度计上检测652nm处的吸收值。
结果分析：
与实施例1中图9结果保持一致，系统的吸光度比值取决于分析物(GSH)的浓度。在0.05μM-20μM范围内，吸光度比随GSH浓度呈线性变化，根据3σ标准，计算出检测限(LOD)为0.025μM。与许多有关GSH检测的文献相比，该系统具有更宽的检测范围和更低的检测限。
11、细胞裂解液中GSH的检测
实验步骤：
将A549细胞以106/well的密度铺于六孔板，孵育24小时后，去掉培养基，用PBS洗涤三次，加入胰酶消化细胞，离心后用PBS洗两次，再分散于PBS中。为制得裂解液，将上述所得细胞于-80℃和37℃水浴反复冻融三次，然后在4℃、3000rpm下离心3分钟，所得上清即为细胞裂解液。
为评定分析方法的准确性，采用标准加入法检测细胞裂解液中GSH。即在含ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的体系中加入5％的细胞裂解液后，分别加入0、5、10μM GSH,孵育20min后，加入TMB或过氧化氢和TMB，在紫外可见分光光度计上进行检测652nm处的吸收。
结果分析：
实验结果与实施例1中表三保持一致，证实了该传感器在一定范围内适用于细胞裂解液中GSH的检测。细胞裂解液中GSH的回收率为101.0％～103.0％，rsd为1.9％～3.1％。良好的回收率和相对标准偏差表明所建立的生物样品中谷胱甘肽的检测方法具有较高的准确度和可靠性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
实施例3
1、ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物的制备
(1)将0.256g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和0.205g一水合柠檬酸溶于9.1毫升去离子水中，得溶液A，然后将浓度为0.1M的K2PdCl4溶液、CuCl2·2H2O溶液、HAuCl4·4H2O溶液各300μL混合，得溶液B，将溶液A与溶液B混合均匀，搅拌30min后转移至不锈钢反应釜中，并在190℃加热4h，反应后通过离心洗涤，取沉淀收集产物，得到PdCuAu复合物；
(2)将PdCuAu复合物加入水中，分散均匀，得到PdCuAu溶液(4.0mg/mL)；制备ZIF-8(PdCuAu)：将30.9mg 2-甲基咪唑和112mg Zn(NO3)2·6H2O分别溶于15毫升甲醇中，快速加入1毫升PdCuAu溶液，室温搅拌1h，收集产品，用甲醇洗涤三次，干燥备用，得到ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物。ZIF-8的合成与ZIF-8(PdCuAu)的合成基本相同，除了不加PdCuAu溶液，其他操作均相同。
(3)制备二氧化锰纳米片：取8mL四甲基氢氧化铵溶液(TMA·OH，1.5M)与2mL过氧化氢(H2O2，30wt％)混合后加入去离子水使总体积为20mL，然后在15秒内将上述溶液与10mLMnCl4·4H2O溶液(0.3M)混合，溶液立即变成深褐色，将溶液在室温下搅拌11小时，用水和乙醇洗涤三次，50℃干燥箱中干燥备用，得到二氧化锰，为了得到二氧化锰纳米片，对制备的二氧化锰进行了超声剥离：即10mg二氧化锰溶于20mL水中，超声剥离5h，以2000rpm离心得到二氧化锰纳米片。
(4)制备二氧化锰纳米片与ZIF-8(PdCuAu)的纳米复合物(这里命名为ZIF(PdCuAu)@MnO2)：取二氧化锰纳米片与ZIF-8(PdCuAu)加入水中，二氧化锰纳米片的浓度为0.15mg/mL，ZIF-8(PdCuAu)的浓度为0.12mg/mL，共同孵育20min，即得所述基于纳米酶的谷胱甘肽传感器。
2、ZIF-8(PdCuAu)和二氧化锰纳米片的电镜图
结果分析：
合成出来的材料的电镜图与实施案例一中图1的电镜图相符，证明了本合成方法的可行性。
3、ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物的红外、热重(TG)、XRD、BET表征
合成出来的材料的结构表征与实施案例一的图2结果相符，证明了本合成方法的可行性。
4、二氧化锰纳米片的紫外吸收表征
本实验是对实施例1中得到的MnO2纳米材料(二氧化锰纳米片)的紫外吸收进行表征。
实验结果显示所合成的二氧化锰纳米片紫外吸收与文献一致且与实验案例一中图3结果一致，也证明了二氧化锰纳米片的成功制备和合成方法的可行性。
5、本实验是对实施例2中得到的纳米材料的zeta电位进行表征。
电位检测结果所示，二氧化锰纳米片在此条件下带负电荷，ZIF-8(PdCuAu)在此条件下带正电荷，与实施例1的图4结果一致，二者电性的差异为后续检测GSH提供了充足的证据。
6、本实验是对实施例2中得到的纳米材料的类过氧化物酶活性进行研究。
实验结果显示与实施例1中图5所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
7、本实验是对实施例2中得到的纳米材料与二氧化锰孵育后的类氧化酶活性进行研究。
实验结果显示与实施例1中图6所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
8、本实验是对ZIF-8(PdCuAu)和ZIF-8(PdCuAu)@MnO2相应的酶促反应动力学表征。
实验结果显示与实施例1中图7所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
9、基于在GSH刺激下ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的POD与OXD活性的变化检测GSH的可能性。
实施步骤：
实验1：MnO2的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的检测
反应体系含有5mM H2O2、2mM TMB、0-300μg mL-1的二氧化锰和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于二氧化锰的氧化酶活性检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验2：ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的检测
反应体系含有5mM H2O2、2mM TMB、0-0.80mg mL-1的ZIF-8(PdCuAu)和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于ZIF-8(PdCuAu)的氧化酶活性检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验3：不同浓度二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的影响
将不同浓度的MnO2(0-300μg mL-1)与ZIF-8(PdCuAu)共同孵育15min,然后加入5mMH2O2、2mM TMB和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于加入不同浓度二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)的氧化酶活性影响的检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验4：不同浓度GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的影响
将不同浓度的GSH(0-200μM)与ZIF-(PdCuAu)@MnO2共同孵育15min,然后加入5mMH2O2、2mM TMB和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于加入不同浓度GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的氧化酶活性影响的检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
结果分析：
实验结果与实施例1中图8结果一致。如图8的A部分所示，MnO2在此条件下主要表现为类氧化酶活性；ZIF-8(PdCuAu)主要表现为类过氧化物酶活性(图8的B部分)；从图8的C部分结果可以看出加入不同浓度的MnO2后，ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性受到抑制，而相应的氧化酶活性得到提高。这主要是因为这里MnO2的加入导致ZIF-8(PdCuAu)的活性位点由暴露的状态转变为掩蔽的状态，使得ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性不能发挥出来，而且加入的MnO2本身具有较优异的氧化酶活性，所以体系最终主要表现为类氧化酶活性。对于基于酶活性的变化检测GSH来言，GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的酶活性的影响是非常重要的。加入不同的GSH会导致MnO2被消耗，就会使得ZIF-8(PdCuAu)的活性位点重新暴露出来，相应的过氧化物酶活性就会恢复，相反由于MnO2被消耗掉后，主要的氧化酶活性的源头被切断，则氧化酶活性就会受到抑制。如图8的D部分结果所示，加入不同浓度GSH后，体系过氧化物酶活性变化的相对值随着GSH的浓度增大而升高，相反氧化酶活性的变化值随着GSH浓度的增大而降低。上述这些结果都可以说明此发明可作为GSH的传感器。
10、基于在GSH刺激下ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的POD与OXD活性的变化检测GSH。
实验步骤：
在含ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的醋酸缓冲液中加入不同浓度的GSH后，加入TMB或过氧化氢和TMB，用紫外可见分光光度计上检测652nm处的吸收值。
结果分析：
与实施例1中图9结果保持一致，系统的吸光度比值取决于分析物(GSH)的浓度。在0.05μM-20μM范围内，吸光度比随GSH浓度呈线性变化，根据3σ标准，计算出检测限(LOD)为0.025μM。与许多有关GSH检测的文献相比，该系统具有更宽的检测范围和更低的检测限。
11、细胞裂解液中GSH的检测
实验步骤：
将A549细胞以106/well的密度铺于六孔板，孵育24小时后，去掉培养基，用PBS洗涤三次，加入胰酶消化细胞，离心后用PBS洗两次，再分散于PBS中。为制得裂解液，将上述所得细胞于-80℃和37℃水浴反复冻融三次，然后在4℃、3000rpm下离心3分钟，所得上清即为细胞裂解液。
为评定分析方法的准确性，采用标准加入法检测细胞裂解液中GSH。即在含ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的体系中加入5％的细胞裂解液后，分别加入0、5、10μM GSH,孵育20min后，加入TMB或过氧化氢和TMB，在紫外可见分光光度计上进行检测652nm处的吸收。
结果分析：
实验结果与实施例1中表三保持一致，证实了该传感器在一定范围内适用于细胞裂解液中GSH的检测。细胞裂解液中GSH的回收率为101.0％～103.0％，rsd为1.9％～3.1％。良好的回收率和相对标准偏差表明所建立的生物样品中谷胱甘肽的检测方法具有较高的准确度和可靠性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
实施例4
1、ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物的制备
(1)将0.26g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和0.20g一水合柠檬酸溶于9.1毫升去离子水中，得溶液A，然后将浓度为0.1M的K2PdCl4溶液、CuCl2·2H2O溶液、HAuCl4·4H2O溶液各300μL混合，得溶液B，将溶液A与溶液B混合均匀，搅拌30min后转移至不锈钢反应釜中，并在195℃加热4h，反应后通过离心洗涤，取沉淀收集产物，得到PdCuAu复合物；
(2)将PdCuAu复合物加入水中，分散均匀，得到PdCuAu溶液(4.1mg/mL)；制备ZIF-8(PdCuAu)：将31.1mg 2-甲基咪唑和112mg Zn(NO3)2·6H2O分别溶于15毫升甲醇中，快速加入1毫升PdCuAu溶液，室温搅拌1h，收集产品，用甲醇洗涤三次，干燥备用，得到ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物。ZIF-8的合成与ZIF-8(PdCuAu)的合成基本相同，除了不加PdCuAu溶液，其他操作均相同。
(3)制备二氧化锰纳米片：取8mL四甲基氢氧化铵溶液(TMA·OH，1.5M)与2mL过氧化氢(H2O2，30wt％)混合后加入去离子水使总体积为20mL，然后在15秒内将上述溶液与10mLMnCl4·4H2O溶液(0.3M)混合，溶液立即变成深褐色，将溶液在室温下搅拌12小时，用水和乙醇洗涤三次，50℃干燥箱中干燥备用，得到二氧化锰，为了得到二氧化锰纳米片，对制备的二氧化锰进行了超声剥离：即10mg二氧化锰溶于20mL水中，超声剥离5h，以2000rpm离心得到二氧化锰纳米片。
(4)制备二氧化锰纳米片与ZIF-8(PdCuAu)的纳米复合物(这里命名为ZIF(PdCuAu)@MnO2)：取二氧化锰纳米片与ZIF-8(PdCuAu)加入水中，二氧化锰纳米片的浓度为0.15mg/mL，ZIF-8(PdCuAu)的浓度为0.12mg/mL，共同孵育20min，即得所述基于纳米酶的谷胱甘肽传感器。
2、ZIF-8(PdCuAu)和二氧化锰纳米片的电镜图
结果分析：
合成出来的材料的电镜图与实施案例一中图1的电镜图相符，证明了本合成方法的可行性。
3、ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物的红外、热重(TG)、XRD、BET表征
合成出来的材料的结构表征与实施案例一的图2结果相符，证明了本合成方法的可行性。
4、二氧化锰纳米片的紫外吸收表征
本实验是对实施例1中得到的MnO2纳米材料(二氧化锰纳米片)的紫外吸收进行表征。
实验结果显示所合成的二氧化锰纳米片紫外吸收与文献一致且与实验案例一中图3结果一致，也证明了二氧化锰纳米片的成功制备和合成方法的可行性。
5、本实验是对实施例2中得到的纳米材料的zeta电位进行表征。
电位检测结果所示，二氧化锰纳米片在此条件下带负电荷，ZIF-8(PdCuAu)在此条件下带正电荷，与实施例1的图4结果一致，二者电性的差异为后续检测GSH提供了充足的证据。
6、本实验是对实施例2中得到的纳米材料的类过氧化物酶活性进行研究。
实验结果显示与实施例1中图5所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
7、本实验是对实施例2中得到的纳米材料与二氧化锰孵育后的类氧化酶活性进行研究。
实验结果显示与实施例1中图6所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
8、本实验是对ZIF-8(PdCuAu)和ZIF-8(PdCuAu)@MnO2相应的酶促反应动力学表征。
实验结果显示与实施例1中图7所得结论是一致的，也说明本方法在一定范围内是有效的。
9、基于在GSH刺激下ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的POD与OXD活性的变化检测GSH的可能性。
实施步骤：
实验1：MnO2的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的检测
反应体系含有5mM H2O2、2mM TMB、0-300μg mL-1的二氧化锰和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于二氧化锰的氧化酶活性检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验2：ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的检测
反应体系含有5mM H2O2、2mM TMB、0-0.80mg mL-1的ZIF-8(PdCuAu)和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于ZIF-8(PdCuAu)的氧化酶活性检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验3：不同浓度二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的影响
将不同浓度的MnO2(0-300μg mL-1)与ZIF-8(PdCuAu)共同孵育15min,然后加入5mMH2O2、2mM TMB和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于加入不同浓度二氧化锰对ZIF-8(PdCuAu)的氧化酶活性影响的检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
实验4：不同浓度GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的类过氧化物酶活性和类氧化酶活性的影响
将不同浓度的GSH(0-200μM)与ZIF-(PdCuAu)@MnO2共同孵育15min,然后加入5mMH2O2、2mM TMB和0.2M pH为5.0的醋酸缓冲溶液，反应15分钟后，用紫外-可见分光光度计记录波长652nm处的吸收值。对于加入不同浓度GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的氧化酶活性影响的检测除了不加H2O2其他操作与检测过氧化物酶活性相同。
结果分析：
实验结果与实施例1中图8结果一致。如实施例1中图8的A部分所示，MnO2在此条件下主要表现为类氧化酶活性；ZIF-8(PdCuAu)主要表现为类过氧化物酶活性(实施例1中图8的B部分)；从实施例1中图8的C部分结果可以看出加入不同浓度的MnO2后，ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性受到抑制，而相应的氧化酶活性得到提高。这主要是因为这里MnO2的加入导致ZIF-8(PdCuAu)的活性位点由暴露的状态转变为掩蔽的状态，使得ZIF-8(PdCuAu)的过氧化物酶活性不能发挥出来，而且加入的MnO2本身具有较优异的氧化酶活性，所以体系最终主要表现为类氧化酶活性。对于基于酶活性的变化检测GSH来言，GSH对ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的酶活性的影响是非常重要的。加入不同的GSH会导致MnO2被消耗，就会使得ZIF-8(PdCuAu)的活性位点重新暴露出来，相应的过氧化物酶活性就会恢复，相反由于MnO2被消耗掉后，主要的氧化酶活性的源头被切断，则氧化酶活性就会受到抑制。如实施例1中图8的D部分结果所示，加入不同浓度GSH后，体系过氧化物酶活性变化的相对值随着GSH的浓度增大而升高，相反氧化酶活性的变化值随着GSH浓度的增大而降低。上述这些结果都可以说明此发明可作为GSH的传感器。
10、基于在GSH刺激下ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的POD与OXD活性的变化检测GSH。
实验步骤：
在含ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的醋酸缓冲液中加入不同浓度的GSH后，加入TMB或过氧化氢和TMB，用紫外可见分光光度计上检测652nm处的吸收值。
结果分析：
与实施例1中图9结果保持一致，系统的吸光度比值取决于分析物(GSH)的浓度。在0.05μM-20μM范围内，吸光度比随GSH浓度呈线性变化，根据3σ标准，计算出检测限(LOD)为0.025μM。与许多有关GSH检测的文献相比，该系统具有更宽的检测范围和更低的检测限。
11、细胞裂解液中GSH的检测
实验步骤：
将A549细胞以106/well的密度铺于六孔板，孵育24小时后，去掉培养基，用PBS洗涤三次，加入胰酶消化细胞，离心后用PBS洗两次，再分散于PBS中。为制得裂解液，将上述所得细胞于-80℃和37℃水浴反复冻融三次，然后在4℃、3000rpm下离心3分钟，所得上清即为细胞裂解液。
为评定分析方法的准确性，采用标准加入法检测细胞裂解液中GSH。即在含ZIF-8(PdCuAu)@MnO2的体系中加入5％的细胞裂解液后，分别加入0、5、10μM GSH,孵育20min后，加入TMB或过氧化氢和TMB，在紫外可见分光光度计上进行检测652nm处的吸收。
结果分析：
实验结果与实施例1中表三保持一致，证实了该传感器在一定范围内适用于细胞裂解液中GSH的检测。细胞裂解液中GSH的回收率为101.0％～103.0％，rsd为1.9％～3.1％。良好的回收率和相对标准偏差表明所建立的生物样品中谷胱甘肽的检测方法具有较高的准确度和可靠性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将十六烷基三甲基溴化铵和一水合柠檬酸加入水中，混合均匀，得到溶液A；将K2PdCl4、CuCl2·2H2O和HAuCl4·4H2O加入水中，混合均匀，得到溶液B；将所述溶液A和溶液B混合均匀，得到混合液，将所述混合液升温进行加热处理，离心洗涤，取沉淀，得到PdCuAu复合物；
（2）将PdCuAu复合物加入水中，分散均匀，得到PdCuAu溶液；将2-甲基咪唑和Zn(NO3)2∙6H2O加入甲醇中，然后加入所述PdCuAu溶液，搅拌处理，过滤取滤渣，洗涤，干燥，得到ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物；所述PdCuAu溶液的浓度为3.9-4.1mg/mL，所述2-甲基咪唑和Zn(NO3)2∙6H2O的质量比为0.274-0.278:1；所述2-甲基咪唑与甲醇的质量体积比为0.111-0.113：1g/mL；所述PdCuAu溶液与甲醇的体积比为1:29.8-30；
（3）将ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物和二氧化锰纳米片加入溶剂中，分散均匀，进行孵育处理，得到所述基于纳米酶的谷胱甘肽传感器；所述ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物和二氧化锰纳米片的质量比为3.9-5.1：1。
2.根据权利要求1所述的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述十六烷基三甲基溴化铵和一水合柠檬酸的质量比为1.19-1.30；在所述溶液A中，十六烷基三甲基溴化铵的浓度为25.0-26.0mg/mL。
3.根据权利要求1所述的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述K2PdCl4、CuCl2·2H2O和HAuCl4·4H2O三者的摩尔比为1:(0.98-1.02):(0.98-1.02)；在所述溶液B中，K2PdCl4的浓度为0.099-1.01mol/L；所述溶液A与溶液B的体积比为0.9: 9.08-9.10。
4.根据权利要求1所述的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述加热处理的温度为185-195℃，加热处理的时间为4-4.5h。
5.根据权利要求1所述的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述搅拌处理的时间为10-12h。
6.根据权利要求1所述的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器的制备方法，步骤（3）所述溶剂为去离子水、乙醇中的至少一种；所述ZIF-8(PdCuAu)纳米复合物与溶剂的质量体积比为0.98-1.02：1g/mL；所述孵育处理的时间为20-25min。
7.一种由权利要求1-6任一项所述制备方法制得的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器。
8.权利要求7所述的基于纳米酶的谷胱甘肽传感器在谷胱甘肽的特异性检测中的应用。
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