CN102124334B - 测量组分对细胞活性氧类物质产生的作用的方法 - Google Patents

Abstract

一种测定供试组分对细胞内ROS水平的作用的方法。该方法可用于市场推广或筛选在降低细胞中ROS水平方面有用的组分，细胞中ROS水平受增加的ROS产生不利影响。

Description

测量组分对细胞活性氧类物质产生的作用的方法

发明背景

活性氧类物质(ROS)是由氧的代谢而形成的细胞副产物，是造成细胞氧化伤害的原因，并且可为细胞损伤、细胞功能失调和细胞死亡(细胞凋亡)的原因。已经充分证明ROS对细胞代谢的作用。ROS在组织中的聚集可引起氧化损伤，并且因此可能需要减少组织中ROS的量。需要监测细胞中的ROS产生以确定ROS是否涉及包括心血管、炎症和感染性疾病的疾病。正常情况下，细胞能够用酶，例如超氧化物岐化酶或过氧化氢酶预防ROS的氧化伤害。其它化合物，包括抗氧化剂，例如维生素、尿酸和谷胱甘肽在预防这样的伤害方面也是有用的。这样的化合物(如抗氧化剂)可在清除自由基和保护宿主有机体免受病原体侵害中起重要的作用。

虽然已经开发了许多方法测量组织中的ROS的量，但是很少方法实时测量细胞内ROS浓度。测量ROS的量的能力是重要的，因为ROS浓度可随时间而变化，如增加或减少。

因此，对于开发和给予有效的抗氧化剂组合物以预防ROS伤害存在持续的兴趣。然而，几乎没有方法能够实时测量组合物对ROS产生的作用。因此，需要开发可测量组分对细胞内ROS产生的作用的方法。

发明简述

依据某些实施方案，提供可用于实时测量细胞内ROS浓度的方法。此类实施方案的方法可用于测定供试组分对细胞内ROS产生和对细胞的氧化应激的作用。此类方法也可用于测定供试组分减少细胞内ROS组分的能力，其中ROS可为细胞内源性的或外源性的。

因此，本文描述的某些实施方案包括测量供试组分对细胞中ROS的产生的作用的方法。该方法包括使细胞与能够发荧光的材料接触、使细胞与供试组分接触、使细胞与ROS或ROS刺激物接触和测量细胞荧光。此类实施方案还包括在使细胞与能够发荧光的材料以及ROS或者ROS刺激物接触后测量细胞荧光、在使细胞与供试组分接触后测量细胞荧光、比较两个荧光值和测定供试组分是否减少ROS。

附图简述

图1显示实施例1获得的荧光值；和

图2显示如在实施例1中描述的各种供试组分的荧光值。

发明详述

如在本说明书中通篇使用的，范围用作描述在该范围内的各个值和每一个值的简略的表达方式。在范围内的任何值可选作该范围的终点。另外，本文所引用的所有参考文献通过引用而全文结合于本文中。如发生与在本公开以及本文所引用的参考文献中所定义的相冲突的情形时，以本公开的为准。

除非另有说明，在本文和说明书的其它地方表达的所有的百分比和量应该被理解为是指重量百分比。给出的量基于材料的活性重量。

贯穿本说明书中，冠词“该”、“一”、“一个”等的使用并不意欲将实施方案限制为该项的单数形式。例如，表达“一种组分”可表示单一组分或多个组分。实施方案中的组分包括化学化合物、小的和大的肽以及蛋白质、表达小的和大的肽以及蛋白质的DNA等。

所述方法包括使细胞与当氧化或还原时能够发荧光的材料接触、使细胞与供试组分接触、使细胞与ROS或ROS刺激物接触和测量细胞荧光。优选，能够发荧光的材料是氧化时发荧光的染料，更优选是选自2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)、二氢罗丹明(DHR 123)及其混合物的染料。所述方法也包括使用在还原时能够发荧光的材料。

优选的方法包括使用抗氧化剂作为供试化合物。另一种优选的方法包括作为ROS的产生氧离子的化合物、产生自由基的化合物、过氧化物或其组合。优选ROS为过氧化物，更优选为过氧化氢。其它优选的方法包括使用ROS刺激物，例如炎性递质。

优选的实施方案的方法还包括作为ROS刺激物的：(i)细菌内毒素、外毒素或其组合；或(ii)脂多糖、脂低聚糖或其组合。优选ROS为脂多糖。

可用于优选的实施方案的多种方法中的细胞包括免疫细胞、淋巴细胞、成淋巴细胞、巨噬细胞、有核细胞例如线粒体或其混合物。细胞可无限增殖化，或存在于组织培养物中。优选，细胞具有可被染料透过的细胞壁。另外，染料可聚集于细胞线粒体中。优选从细胞中洗涤任何过多的染料。

在优选的实施方案的方法中，主动或者被动地将供试化合物转运至细胞中。优选，从细胞中洗涤任何过多的供试化合物。按类似的思路(vein)，优选主动地或者被动地使ROS或ROS刺激物(如炎性递质)转运进入细胞内，并且优选从细胞中洗涤任何过多的ROS或ROS刺激物。

依据优选的实施方案的多个方面，最初使细胞与在氧化或还原时能够发荧光的材料，优选染料接触。可用于本发明实施方案中的染料包括在氧化或还原时发荧光的染料。优选，这样的染料在如通过ROS氧化或还原时发荧光。优选使用染料，所述染料以不发荧光的形式与细胞接触，然后在与ROS，如产生自细胞内或者由外部来源引入的ROS反应时发荧光。具有这些属性的一些有用的染料为本领域中的普通技术人员所已知，并且可包括荧光素类型的染料，例如2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)。DCF-DA是能透过膜的染料，其可扩散穿越细胞脂质膜。其在无活性时不发荧光，而在被ROS氧化时形成高度发荧光的二氯荧光素(DCF)。可用于本发明中的其它染料可包括荧光素衍生物和类似物，例如为DCF-DA的类似物的二氢罗丹明(DHR123)。DHR123聚集在线粒体中，并且因此可在线粒体中具体用于测定ROS水平。其它有用的染料可包括荧光素的衍生物，例如Oregon Green、TokyoGreen、羧基半萘并荧光素(SNAFL-可从Molecular Probes，(Invitrogen Corp.)，Carlsbad，CA获得)、羧基萘并荧光素、Alexa Fluor染料(如Alexa 488一也可从Molecular Probes，(InvitrogenCorp.)，Carlsbad，CA获得)、DyLight Fluor染料(如DyLight 488，可从Thermo FisherScientific，Waltham，MA购得)和HiLyte Fluor染料(可从AnaSpec，San Jose，CA购得)。可将细胞与染料一起孵育，以使染料结合至细胞中。然后，可洗涤细胞以去除残余的染料。

在用染料标记后，可将细胞暴露于一种或多种供试化合物。这样的供试化合物优选通过主动或被动转运，如扩散导入细胞，并且优选留在细胞内。可在这样的供试化合物的存在下孵育细胞，然后洗涤以去除残余的供试化合物。

在用供试化合物处理后，然后优选将细胞暴露于ROS。ROS典型地包括氧离子、自由基和过氧化物(无机和有机过氧化物两者)，和在细胞内产生这样的氧离子和自由基的化合物。ROS(或ROS试剂)为本领域中的普通技术人员所已知，一般为高度反应性的小分子，因为它们存在未成对价电子层电子。过氧化物的实例包括氢过氧化物、过氧化氢、碱金属和碱土金属的过氧化物、有机过氧化合物、过氧酸及其混合物。可将细胞暴露于来自外部来源的ROS试剂，其中可在含ROS试剂的培养基中孵育细胞，以在细胞内，如通过主动转运或者被动转运，使细胞与ROS试剂结合。然后可洗涤细胞，以去除尚未结合至细胞的残余的ROS。

在本发明的一个实施方案中，可在诱导ROS产生的化合物，如ROS刺激物，例如炎性递质的联合下，使ROS与细胞接触，其中所述递质在细胞中引起或已知引起ROS产生。还在另一个实施方案中，在没有额外的ROS试剂存在下，使细胞与ROS刺激物接触。如本领域已知的，炎性递质可包括细菌毒素，如内毒素或外毒素，例如脂多糖或脂低聚糖。细胞可与ROS和炎性递质一起孵育，以便使ROS和炎性递质结合至细胞中。然后可洗涤细胞，以去除残余的ROS和炎性递质。或者，细胞可与炎性递质一起孵育，以便使炎性递质结合至细胞中。然后可洗涤细胞，以去除残余的炎性递质。

本文描述的实施方案的方法考虑测量已经与多种组分接触的细胞的荧光。所述方法包括在使细胞与能够发荧光的材料和ROS或ROS刺激物接触后，测量荧光，然后，在使细胞与这些组分和供试化合物接触后测量荧光。可通过本领域中的普通技术人员已知的和易于得到的任何方法测定荧光。这样的已知的和商业上可获得的方法包括光学活细胞阵列技术或显微镜成像系统。如已熟知的，典型地在激发和发射波长测量荧光。本领域中的普通技术人员能够使用本文提供的指南测量和测定荧光。

不打算受限于任何理论，相信本发明的方法允许实时分析供试化合物对细胞内ROS水平的作用。通过将能发荧光的组分、供试化合物结合至细胞，然后使ROS/炎性递质结合至细胞，人们能够通过测量细胞荧光而测量供试化合物的抗氧化剂活性。在氧化或还原时能发荧光的组分，优选染料，典型地具有一些背景荧光，但是结合自由基后，荧光强度增加。可易于测量荧光强度的该增加。可将供试化合物添加至细胞中，以评价它们减少形成ROS自由基(或通过反应消耗它们)的能力，并且如果能减少自由基形成，则荧光强度应减少。

因此，具有较大能力抑制ROS的供试化合物导致反应，其中较少ROS能够与染料反应，因此荧光减少。另一方面，不抑制ROS的供试化合物导致反应，其中较大量ROS能够与染料反应，因此有增加的荧光。可在为期数分钟、数小时或数天的时间内监测细胞的荧光，以测定供试化合物对ROS/炎性递质的作用。

在一个实施方案中，使细胞与染料接触，之后与供试化合物接触。任选，使细胞与供试化合物接触，之后与ROS和/或ROS刺激物接触。在另一个实施方案中，将ROS导入细胞中，如ROS对细胞而言是外源性的。

可用于优选的方法中的细胞包括具有线粒体的有核细胞。细胞可为无限增殖化的，如癌细胞，并且可为免疫细胞，例如淋巴细胞或成淋巴细胞。可用本领域技术人员已知的任何方法培养这样的细胞。也可在手术或实验过程期间原位培养细胞，然后进行实时测试，以评价某些供试化合物对抑制细胞的ROS产生的作用。

所述实施方案的方法可用于测定化合物对在细胞中ROS产生的作用。如上所述，已知细胞中自由基的产生是不合需要的，常常导致细胞死亡。例如，某些细菌具有在人细胞中诱导自由基形成的作用，并且因此损害细胞。本文描述的方法能测定可减少自由基形成(导致比较低的荧光强度)的供试化合物，并因此可用于对抗细菌的有害作用。

许多这样的细菌存在于口腔中和口腔粘膜上。细菌可引起许多有害作用。例如，细菌细胞可被用作优选的实施方案的细胞，优选兼性厌氧菌细胞。于是，所述方法可测量某些供试化合物减少这样的细胞的自由基产生的能力。

所以，所述实施方案的方法可原位用于确定有效疗法(给予足以减少荧光的有效的供试化合物)，用于治疗易受自由基产生的影响的某些细胞。所述实施方案的方法也可用于证明某些化合物(或含这些化合物的组合物)对已知细胞，如细菌细胞的效力。例如，所述方法可用于向牙科专业人员显示某些牙粉是如何有效减少通常在人口腔中发现的细菌细胞中的自由基产生。通过显示在产品间(如多种竞争者的牙粉)的比较，在产品的市场推广中所述方法也可用作比较工具。

现在，通过以下的非限制性实施例描述本发明的优选的实施方案。实施例仅为阐述性的，并不以任何方式限制所述和要求保护的本发明的范围。

实施例1

起初将人组织细胞淋巴瘤U937细胞(ATCC，Manassas，VA)在含10％血清和1％青霉素的RPMI-1640培养基(ATCC，Manassas，VA)中培养，然后于37℃下以2X10⁵个细胞/ml浓度转移至含1ng/ml PMA的培养基中，保持48小时。在暴露于染料之前，使细胞于无血清的培养基中饥饿过夜。

用PBS缓冲液洗涤细胞两次，并分成两组，与DCF-DA或DHR123(Calibochem，LaJolla，CA)一起于30℃下孵育30分钟。用PBS洗涤细胞两次以去除残余的染料。也保持适当的实验对照。

然后将细胞分成几组，并将各种量的α-生育酚(维生素E)、物质1或物质2的1％溶液添加至各组中，并于37℃下孵育15分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，以去除残余量的供试化合物。然后添加ROS试剂H₂O₂和LPS，并孵育不同的时期。然后，在激发波长485nm和发射波长530nm读取细胞荧光值，最长达5小时。

如图1和2中显示，仅用染料，如DCF-DA和DHR123染色的细胞表现出背景荧光。参考图1，孵育2个小时后，在缺乏供试化合物但是存在2.5mM ROS和ROS刺激物下孵育的细胞，与在供试化合物(α-生育酚)和2.5mMROS和ROS刺激物的存在下孵育的细胞比较，发出较多荧光。

因此，细胞荧光的分析允许实时监测细胞内氧化应激，该细胞内氧化应激可用于筛选供试化合物。可采用光学活细胞阵列技术和/或显微镜成像系统在各细胞中完成细胞荧光的测量。

参考图2，将2ppm、10ppm或100ppm的α-生育酚、物质1和物质2与细胞一起孵育。图2显示，在2.5mM的过氧化氢的存在下，2ppm的α-生育酚和物质1与ROS反应，并使氧化水平降低约30％。在10ppm和100ppm，α-生育酚不显示增强清除ROS或自由基的能力；然而，100ppm的物质1使氧化水平降低50％。图2也显示物质2提高氧化水平，与2ppm比较，100ppm的物质2使自由基水平提高至接近3倍。

本领域中的普通技术人员应该认识到，可对以上描述的实施方案进行变化和更改，而不背离其广义的发明概念。因此，应该理解，本发明不限于所公开的具体的实施方案，而将涵盖在本发明精神和范围内的各种修改。

Claims (16)

1.一种测量供试组分在减少细胞中ROS组分的效力的方法，所述方法包括：

a.使细胞与能够发荧光的材料接触；

b.使细胞与供试组分接触；

c.从细胞中洗涤任何过多的供试组分；

d.使细胞与ROS和ROS刺激物接触；和

e.测量细胞荧光；

其中所述ROS选自产生氧离子的化合物、产生自由基的化合物、过氧化物及其混合物；

其中所述ROS刺激物选自细菌内毒素、外毒素及其混合物；以及

其中所述供试组分转运至细胞内。

2.权利要求1的方法，其中所述能够发荧光的材料是氧化时发荧光的染料。

3.权利要求2的方法，其中所述染料选自2，7-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)、二氢罗丹明(DHR 123)及其混合物。

4.权利要求1的方法，其中所述能够发荧光的材料是还原时发荧光的染料。

5.权利要求1的方法，其中所述供试组分是抗氧化剂。

6.权利要求1的方法，其中所述ROS是过氧化物。

7.权利要求6的方法，其中所述过氧化物是过氧化氢。

8.权利要求1的方法，其中所述ROS刺激物包括脂多糖。

9.权利要求1的方法，其中所述细胞是免疫细胞。

10.权利要求1的方法，其中所述细胞选自淋巴细胞、成淋巴细胞、巨噬细胞、细菌、兼性厌氧菌及其混合物。

11.权利要求1的方法，其中所述细胞具有壁，该壁可被能够发荧光的材料透过。

12.权利要求1的方法，其中所述供试组分经主动或被动转运至细胞内。

13.权利要求1的方法，其中所述ROS通过主动或被动转运方式转运至细胞内。

14.权利要求1的方法，其中所述细胞发荧光。

15.权利要求1的方法，其中所述方法测量细胞的ROS含量。

16.一种测量供试组分在减少细胞中ROS组分的效力的方法，所述方法包括：

a.使细胞与能够发荧光的材料接触；

b.使细胞与供试组分接触；

c.从细胞中洗涤任何过多的供试组分；

d.测量细胞荧光；

e.使细胞与ROS和ROS刺激物接触；

f.测量细胞荧光；和

g.将来自d的细胞荧光与来自f的荧光进行比较，并确定供试组分在减少ROS中的效力；

其中所述ROS选自产生氧离子的化合物、产生自由基的化合物、过氧化物及其混合物；

其中所述ROS刺激物选自细菌内毒素、外毒素及其混合物；以及

其中所述供试组分转运至细胞内。