RU2480759C2 - Способ измерения эффектов компонентов на продукцию реакционноспособных форм кислорода в клетке - Google Patents

Способ измерения эффектов компонентов на продукцию реакционноспособных форм кислорода в клетке Download PDF

Info

Publication number
RU2480759C2
RU2480759C2 RU2010149794/15A RU2010149794A RU2480759C2 RU 2480759 C2 RU2480759 C2 RU 2480759C2 RU 2010149794/15 A RU2010149794/15 A RU 2010149794/15A RU 2010149794 A RU2010149794 A RU 2010149794A RU 2480759 C2 RU2480759 C2 RU 2480759C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cell
ros
fluorescence
bringing
contact
Prior art date
Application number
RU2010149794/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2010149794A (ru
Inventor
Харш М. ТРИВЕДИ
Даньдань ЧЭНЬ
Original Assignee
Колгейт-Палмолив Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Колгейт-Палмолив Компани filed Critical Колгейт-Палмолив Компани
Publication of RU2010149794A publication Critical patent/RU2010149794A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2480759C2 publication Critical patent/RU2480759C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5038—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving detection of metabolites per se

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области стоматологии, а именно к способам измерения реакционноспособных форм кислорода (ROS) в реальном времени. Способ измерения эффективности тестируемого компонента, находящегося в композиции для ухода за зубами, для уменьшения количества компонентов ROS в клетке, где клетка выбрана из группы, состоящей из лимфоцита, лимфобласта, макрофага, бактерии, факультативного анаэроба и их смесей, включающий контакт клетки с веществом, способным к флуоресценции; приведение клетки в контакт с тестируемым компонентом, выбранным из антиоксиданта; приведение клетки в контакт с ROS и стимулятором ROS; измерение флуоресценции клетки; сравнение флуоресценции клетки (варианты). Заявленный способ позволяет показать стоматологу то, насколько эффективным является средство для уменьшения образования количества ROS в клетках из ротовой полости. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Description

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Реакционноспособные формы кислорода (ROS) представляют собой побочные продукты клетки, образованные посредством метаболизма кислорода, являются ответственными за окислительные повреждения клетки и могут являться причиной повреждения клеток, дисфункции клеток и клеточной смерти (апоптоза). Эффекты ROS на метаболизм клетки хорошо документированы. Накопление ROS в ткани может вызывать окислительное повреждение и, таким образом, может являться желательным уменьшать количества ROS в тканях. Является желательным мониторировать образование ROS в клетках, чтобы определить, являются ли ROS вовлеченными в заболевания, включая сердечно-сосудистые, воспалительные и инфекционные заболевания. Клетки в норме являются способными предотвращать окислительное повреждение от ROS с помощью ферментов, таких как супероксиддисмутаза или каталаза. Другие соединения также являются полезными для предотвращения такого повреждения, включая антиоксиданты, такие как витамины, мочевая кислота и глутатион. Такие соединения (например, антиоксиданты) могут играть важную роль в утилизации свободных радикалов и в защите организма-хозяина от патогенов.
Хотя разработано множество способов для изменения количеств ROS в ткани, существует немного способов для измерения внутриклеточных концентраций ROS в реальном времени. Возможность измерять количества ROS является важной, поскольку концентрации ROS могут изменяться, например, увеличиваться или уменьшаться, с течением времени.
Соответственно, существует постоянная заинтересованность в разработке и введении эффективных антиоксидантных композиций для предотвращения повреждения из-за ROS. Однако существует немного способов, обеспечивающих возможность измерять эффекты композиций на продукцию ROS в реальном времени. Таким образом, является желательным разработать способы, обеспечивающие возможность измерять эффекты компонентов на внутриклеточную продукцию ROS.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с конкретными вариантами осуществления представлен способ, который можно использовать для измерения внутриклеточных концентраций ROS в реальном времени. Способ из вариантов осуществления может являться применимым для определения эффектов тестируемых компонентов на внутриклеточную продукцию ROS и окислительный стресс в клетке. Способы могут являться также применимыми для определения способности тестируемых компонентов уменьшать количество компонентов ROS в клетке, где ROS могут являться эндогенными или экзогенными для клетки.
Таким образом, конкретные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, включают способ измерения эффекта, который тестируемый компонент оказывает на продукцию ROS в клетке. Способ включает приведение клетки в контакт с веществом, способным к флуоресценции, приведение клетки в контакт с тестируемым компонентом, приведение клетки в контакт с ROS или стимулятором ROS и измерение флуоресценции клетки. Кроме того, варианты осуществления включают измерение флуоресценции клетки после приведения клетки в контакт с веществом, способным к флуоресценции, и с ROS или стимулятором ROS, измерение флуоресценции клетки после приведения клетки в контакт с тестируемым компонентом, сравнение двух значений флуоресценции и определения, уменьшает ли тестируемый компонент количество ROS.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На Фиг. 1 показаны значения флуоресценции, полученные в примере 1; и
На Фиг. 2 показаны значения флуоресценции для различных тестируемых компонентов, как описано в примере 1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как применяют на протяжении этого описания, диапазоны используют в качестве краткого обозначения для описания всех без исключения значений, находящихся в пределах диапазона. Любое значение внутри диапазона можно выбрать в качестве конца диапазона. Кроме того, полное содержание всех ссылок, процитированных в настоящем документе, таким образом приведено в качестве ссылки. В случае конфликта определения в настоящем описании и в процитированной ссылке, настоящее описание обладает преимуществом.
Если не указано иначе, все проценты и количества, указанные в настоящем документе и где-либо еще в описании, следует понимать как относящиеся к процентам по массе. Данные количества основаны на активной массе вещества.
На протяжении этого описания, использование терминов в единственном числе не предназначено для ограничения вариантов осуществления формой единственного числа предмета. Например, выражение «компонент» может обозначать отдельный компонент или множество компонентов. Компонент в вариантах осуществления включает в себя химические соединения, малые и большие пептиды и белки, ДНК, экспрессирующую малые и большие пептиды и белки, и т.п.
Способ включает в себя приведение клетки в контакт с веществом, способным к флуоресценции при окислении или восстановлении, приведение клетки в контакт с тестируемым компонентом, приведение клетки в контакт с ROS или стимулятором ROS, и измерение флуоресценции клетки. Предпочтительно, вещество, способное к флуоресценции, представляет собой краситель, флуоресцирующий при окислении, более предпочтительно, краситель, выбранный из диацетата 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF-DA), дигидрородамина (DHR 123) и их смеси. Способ включает в себя также применение вещества, способного к флуоресценции при восстановлении.
Предпочтительный способ включает в себя применение антиоксиданта в качестве тестируемого соединения. Другой предпочтительный способ включает в себя в качестве ROS образующее ионы кислорода соединение, образующее свободные радикалы соединение, пероксид или их сочетания. Предпочтительно, ROS представляет собой пероксид, и более предпочтительно, пероксид водорода. Другие предпочтительные способы включают в себя применение стимулятора ROS, такого как медиатор воспаления.
Способ из предпочтительных вариантов осуществления включает в себя также в качестве стимулятора ROS: (i) бактериальный эндотоксин, экзотоксин или их сочетания; или (ii) липополисахарид, липоолигосахарид, или их сочетания. Предпочтительно, ROS представляет собой липополисахарид.
Клетки, применимые в различных способах из предпочтительных вариантов осуществления, включают в себя иммунную клетку, лимфоцит, лимфобласт, макрофаг, ядросодержащую клетку, например, ее митохондрии, или их смеси. Клетка может являться иммортализованной или присутствовать в культуре клеток. Предпочтительно, клетка обладает клеточной стенкой, поддающейся проникновению красителя. Кроме того, краситель может накапливаться в митохондриях клетки. Является предпочтительным отмывать клетки от всего избытка красителя.
В способе из предпочтительных вариантов осуществления тестируемое соединение транспортируют в клетку, либо активно, либо пассивно. Предпочтительно, клетки отмывают от всего избытка тестируемого соединения. Таким же образом ROS или стимулятор ROS (например, медиатор воспаления) предпочтительно транспортируют в клетку, либо активно, либо пассивно, и является предпочтительным отмывать клетки от всего избытка ROS или стимулятора ROS.
В соответствии с различными аспектами предпочтительных вариантов осуществления клетку сначала приводят в контакт с веществом, способным к флуоресценции при окислении или восстановлении, предпочтительно, красителем. Красители, применимые в настоящих вариантах осуществления, включают в себя красители, флуоресцирующие при окислении или восстановлении. Предпочтительно, такие красители флуоресцируют при окислении или восстановлении, например, посредством ROS. Является предпочтительным использовать красители, которые контактируют с клетками в нефлуоресцентной форме, и затем флуоресцируют при реакции с ROS, например, ROS, либо продуцируемым внутри клеток, либо введенным из внешних источников. Некоторые применимые красители, обладающие этими свойствами, известны специалистам в данной области, и могут включать в себя красители типа флуоресцеина, такие как диацетат 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF-DA). DCF-DA представляет собой проникающий через мембрану краситель, который может диффундировать через липидную мембрану клеток. Он является нефлуоресцентным, когда не активен, и образует высокофлуоресцентный дихлорфлуоресцеин (DCF) при его окислении посредством ROS. Другие красители, применимые по настоящему изобретению, могут включать в себя производные и аналоги флуоресцеина, такие как дигидрородамин (DHR 123), который является аналогом DCF-DA. DHR123 накапливается в митохондриях и, таким образом, может являться особенно полезным для определения уровней ROS в них. Другие применимые красители могут включать в себя производные флуоресцеина, такие как Oregon Green, Tokyo Green, карбоксисеминафтофлуоресцеин (SNAFL - доступен из Molecular Probes, (Invitrogen Corp.), Carlsbad, CA), карбоксинафтофлуоресцеин, красители Alexa Fluor (например, Alexa 488 - также доступны из Molecular Probes, (Invitrogen Corp.), Carlsbad, CA), красители DyLight Fluor (например, DyLight 488, коммерчески доступный из Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), и красители HiLyte Fluor (коммерчески доступны из AnaSpec, San Jose, CA). Клетки можно инкубировать с красителем, чтобы позволить включение красителя в клетку. Затем клетки можно промывать для удаления остаточного красителя.
После мечения с помощью красителя клетки можно подвергать воздействию одного или нескольких тестируемых соединений. Такие тестируемые соединения предпочтительно вводят в клетку посредством активного или пассивного транспорта, например, диффузии, и они предпочтительно задерживаются внутри клетки. Клетки можно инкубировать в присутствии таких тестируемых соединений, и затем промывать для удаления остаточных тестируемых соединений.
После обработки тестируемым соединением, клетку затем предпочтительно подвергают воздействию ROS. ROS, как правило, включают в себя ионы кислорода, свободные радикалы и пероксиды как неорганические, так и органические, и соединения, образующие такие ионы кислорода и свободные радикалы внутри клетки. ROS (или агенты ROS) известны специалистам в данной области и, как правило, представляют собой малые молекулы, которые являются высокореакционноспособными из-за присутствия неспаренных электронов валентной оболочки. Примеры пероксидов включают в себя гидропероксиды, пероксид водорода, пероксиды щелочных и щелочноземельных металлов, органические пероксисоединения, пероксикислоты и их смеси. Клетки можно подвергать воздействию агентов ROS из внешнего источника, где клетку можно инкубировать в среде, содержащей агент ROS, чтобы позволить клетке включать агент ROS внутрь клетки, например, посредством активного или пассивного транспорта. Затем клетки можно промывать для удаления остаточных ROS, не включенных в клетку.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ROS можно приводить в контакт с клеткой в сочетании с соединением, индуцирующим продукцию ROS, например, стимулятором ROS, таким как медиатор воспаления, где медиатор вызывает или является известным как вызывающий продукцию ROS в клетке. В другом варианте осуществления клетку приводят в контакт со стимулятором ROS в отсутствие дополнительного агента ROS. Как известно в данной области, медиатор воспаления может включать в себя бактериальный токсин, например, эндотоксин или экзотоксин, такой как липополисахарид или липоолигосахарид. Клетку можно инкубировать с ROS и медиатором воспаления, так чтобы позволять ROS и медиатору воспаления входить в клетку. Затем клетку можно промывать для удаления остаточного ROS и медиатора воспаления. Альтернативно, клетку можно инкубировать с медиатором воспаления, чтобы позволять медиатору воспаления входить в клетку. Затем клетку можно промывать для удаления остаточного медиатора воспаления.
Способы из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, включают в себя измерение флуоресценции клеток, которые приводили в контакт с различными компонентами. Способы включают в себя измерение флуоресценции после приведения клеток в контакт с веществом, способным к флуоресценции, и ROS или стимулятором ROS, и затем измерение флуоресценции после приведения клеток в контакт с этими компонентами и тестируемым соединением. Флуоресценцию можно определять любым способом, известным в данной области и легко доступным. Такие известные и коммерчески доступные способы включают в себя оптический способ с массивом живых клеток или системы получения изображения с помощью микроскопа. Как хорошо известно, флуоресценцию, как правило, измеряют при возбуждении и при излучении. Обычные специалисты в данной области способны измерять и определять флуоресценцию с использованием руководства, представленного в настоящем документе.
Без желания быть связанными какой-либо теорией, считают, что способы по настоящему изобретению позволяют анализ в реальном времени эффектов тестируемых соединений на внутриклеточные уровни ROS. Посредством включения компонента, способного к флуоресценции, тестируемого соединения и затем ROS/медиатора воспаления в клетки, можно измерять антиоксидантную активность тестируемого соединения посредством измерения флуоресценции клетки. Компонент, способный к флуоресценции при окислении или восстановлении, предпочтительно, краситель, как правило, обладает некоторой фоновой флуоресценцией, но при связывании со свободными радикалами интенсивность флуоресценции увеличивается. Это увеличение интенсивности флуоресценции можно легко измерять. Тестируемые соединения можно добавлять к клеткам, чтобы оценить их способность уменьшать образование свободных радикалов ROS (или уничтожать их посредством реакции), и если они способны уменьшать образование свободных радикалов, интенсивность флуоресценции должна уменьшаться.
Соответственно, тестируемое соединение, обладающее большей способностью ингибировать ROS, приводит к реакции, в которой меньше ROS является способным реагировать с красителем, и таким образом, присутствует уменьшенная флуоресценция. С другой стороны, тестируемое соединение, которое не ингибирует ROS, приводит к реакции, в которой большее количество ROS является способным реагировать с красителем, и таким образом, присутствует увеличенная флуоресценция. Клеточную флуоресценцию можно мониторировать в течение периода минут, часов или суток для определения эффекта тестируемого соединения на ROS/медиатор воспаления.
В одном варианте осуществления клетку приводят в контакт с красителем перед приведением в контакт с тестируемым соединением. Необязательно, клетку приводят в контакт с тестируемым соединением перед приведением в контакт с ROS и/или стимулятором ROS. В другом варианте осуществления ROS вводят в клетку, например, ROS является экзогенным для клетки.
Клетки, применимые в предпочтительных способах, включают в себя ядросодержащие клетки, имеющие митохондрии. Клетки могут являться иммортализованными, например, клетки злокачественных опухолей, и могут являться иммунными клетками, такими как клетки лимфоциты или лимфобласты. Такие клетки можно культивировать любым числом способов, известных специалистам в данной области. Клетки можно культивировать также непосредственно на месте во время процедуры операции или обследования, и затем тестировать в реальном времени для оценки эффектов конкретных тестируемых соединений на ингибирование клеточной продукции ROS.
Способы из вариантов осуществления являются применимыми для определения эффектов, которые соединения оказывают на продукцию ROS в клетках. Как указано выше, известно, что образование свободных радикалов в клетке является нежелательным, часто приводя к клеточной смерти. Например, конкретные бактерии оказывают эффект индукции образования свободных радикалов в клетках человека и следовательно, повреждения клеток. Способы, описанные в настоящем документе, позволяют определять тестируемые соединения, которые могут уменьшать образование свободных радикалов (приводя к более низкой интенсивности флуоресценции) и, таким образом, могут являться применимыми для противодействия повреждающим эффектам бактерий.
Множество таких бактерий существует в полости рта и на слизистой оболочке полости рта. Бактерии могут вызывать любое количество повреждающих эффектов. Например, в качестве клеток в предпочтительных вариантах осуществления можно использовать бактериальные клетки, предпочтительно, факультативные анаэробные клетки. Тогда способ позволяет измерить способность конкретных тестируемых соединений уменьшать образование свободных радикалов для таких клеток.
Способы из вариантов осуществления, таким образом, можно использовать на месте для определения эффективной терапии (введения эффективного тестируемого соединения, в достаточной степени уменьшающего флуоресценцию) для лечения конкретных клеток, чувствительных к образованию свободных радикалов. Способы из вариантов осуществления являются также применимыми для демонстрации эффективности конкретных соединений (или композиций, содержащих эти соединения) для конкретных клеток, например бактериальных клеток. Например, способ можно использовать, чтобы показать стоматологу, насколько эффективным является конкретное средство для чистки зубов для уменьшения образования свободных радикалов в бактериальных клетках, обычно обнаруживаемых во рту человека. Способ можно использовать также в качестве инструмента сравнения в маркетинге продукта путем показа сравнений между продуктами (например, средствами для чистки зубов от различных конкурентов).
Предпочтительные варианты осуществления изобретения в настоящее время описаны по отношению к следующему неограничивающему примеру. Пример является только иллюстративным и никаким образом не ограничивает объем изобретения, как описано и заявлено в формуле изобретения.
ПРИМЕР
Клетки гистоцитарной лимфомы человека U937 (ATCC, Manassas, VA) первоначально культивировали в среде RPMI-1640 media (ATCC, Manassas, VA), содержащей 10% сыворотку и 1% пенициллин, и затем переносили в концентрации 2×105 клеток/мл в среду, содержащую 1 нг/мл PMA на 48 часов при 37°C. Клетки подвергали голоданию в течение ночи в бессывороточной культуральной среде перед подверганием воздействию красителя.
Клетки дважды промывали буфером PBS и разделяли на два набора для инкубации с DCF-DA или DHR123 (Calibochem, La Jolla, CA) в течение 30 минут при 30°C. Клетки дважды промывали PBS для удаления остаточного красителя. Обеспечивали также соответствующие экспериментальные контроли.
Затем клетки разделяли на несколько групп, и различные количества 1% раствора α-токоферола (Витамин E), вещества 1 или вещества 2 добавляли к каждой группе и инкубировали при 37°C в течение 15 минут. Затем клетки дважды промывали PBS для удаления остаточных количеств тестируемых соединений. Затем добавляли агенты ROS H2O2 и LPS и инкубировали в течение различных периодов времени. Затем флуоресценцию клеток считывали при возбуждении 485 нм и излучении 530 нм в течение вплоть до 5 часов.
Как показано на фиг. 1 и 2, для клеток, окрашенных только красителем, например, DCF-DA и DHR123, показали фоновую флуоресценцию. Ссылаясь на фиг. 1, через два часа инкубации, клетки, инкубированные в отсутствие тестируемого соединения, но в присутствии ROS при 2,5 мМ и стимулятора ROS, флуоресцируют сильнее, чем клетки, инкубированные в присутствии тестируемого соединения (α-токоферола) и ROS при 2,5 мМ, и стимулятора ROS.
Анализ флуоресценции клеток таким образом позволяет выполнить мониторинг внутриклеточного окислительного стресса в реальном времени, что можно использовать для скрининга тестируемых соединений. Измерение флуоресценции клеток можно осуществлять с помощью оптического способа с массивом живых клеток и/или систем получения изображения с помощью микроскопа в отдельных клетках.
Ссылаясь на фиг. 2, 2 м.д., 10 м.д., или 100 м.д. α-токоферола, вещества 1 и вещества 2 инкубировали с клетками. На фиг. 2 показано, что в присутствии 2,5 мМ пероксида водорода, 2 м.д. α-токоферола и вещества 1 вступают в реакцию с ROS и уменьшают уровень окисления приблизительно на 30%. При 10 м.д. и 100 м.д. для α-токоферола не показали увеличенной способности утилизации ROS или свободных радикалов; однако, 100 м.д. вещества 1 уменьшали уровень окисления на 50%. На фиг. 2 показано также, что вещество 2 усиливало уровень окисления и что вещество 2 увеличивало почти в 3 раза уровень свободных радикалов при 100 м.д., по сравнению с 2 м.д.
Специалистам в данной области понятно, что изменения и исправления можно вносить в варианты осуществления, описанные выше, без отклонения от идеи изобретения в широком смысле. Таким образом, понятно, что это изобретение не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления, но предназначено, чтобы охватывать модификации в пределах сущности и объема настоящего изобретения.

Claims (13)

1. Способ измерения эффективности тестируемого компонента, находящегося в композиции для ухода за зубами, для уменьшения количества компонентов реакционноспособных форм кислорода (ROS) в клетке, где клетка выбрана из группы, состоящей из лимфоцита, лимфобласта, макрофага, бактерии, факультативного анаэроба и их смесей, включающий:
а. приведение клетки в контакт с веществом, способным к флуоресценции;
b. приведение клетки в контакт с тестируемым компонентом, выбранным из антиоксиданта;
c. приведение клетки в контакт с ROS и стимулятором ROS, где ROS выбрана из группы, состоящей из образующего ионы кислорода соединения, образующего свободные радикалы соединения, пероксида и их смесей, и где стимулятор ROS выбран из группы, состоящей из бактериального экзотоксина и их смесей, или стимулятор ROS содержит липополисахарид; и
d. измерение флуоресценции клетки.
2. Способ по п.1, где вещество, способное к флуоресценции, представляет собой краситель, флуоресцирующий при окислении.
3. Способ по п.2, где краситель выбран из группы, состоящей из диацетата 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF-DA), дигидрородамина (DHR 123) и их смесей.
4. Способ по п.1, где вещество, способное к флуоресценции, представляет собой краситель, флуоресцирующий при восстановлении.
5. Способ по п.3, где ROS представляет собой пероксид.
6. Способ по п.5, где пероксид представляет собой пероксид водорода.
7. Способ по п.1, где клетка обладает стенкой, поддающейся проникновению вещества, способного к флуоресценции.
8. Способ по п.1, где тестируемый компонент транспортируют в клетку.
9. Способ по п.1, где тестируемый компонент транспортируют в клетку активно или пассивно.
10. Способ по п.1, где ROS транспортируют в клетку посредством активного или пассивного транспорта.
11. Способ по п.1, где клетка флуоресцирует.
12. Способ по п.1, где способом измеряют содержание ROS в клетке.
13. Способ измерения эффективности тестируемого компонента, находящегося в композиции для ухода за зубами, для уменьшения количества компонентов ROS в клетке человека, где клетка выбрана из группы, состоящей из лимфоцита, лимфобласта, макрофага, бактерии, факультативного анаэроба и их смесей, включающий:
а. приведение клетки в контакт с веществом, способным к флуоресценции;
b. приведение клетки в контакт с тестируемым компонентом, выбранным из антиоксиданта;
с. измерение флуоресценции клетки;
d. приведение клетки в контакт с ROS и стимулятором ROS, где ROS выбрана из группы, состоящей из образующего ионы кислорода соединения, образующего свободные радикалы соединения, пероксида и их смесей, и где стимулятор ROS выбран из группы, состоящей из бактериального экзотоксина и их смесей, или стимулятор ROS содержит липополисахарид;
е. измерение флуоресценции клетки; и
f. сравнение флуоресценции клетки из (с) с флуоресценцией из (е) и определение эффективности тестируемого компонента для уменьшения количества ROS.
RU2010149794/15A 2008-05-06 2009-05-06 Способ измерения эффектов компонентов на продукцию реакционноспособных форм кислорода в клетке RU2480759C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5087108P 2008-05-06 2008-05-06
US61/050,871 2008-05-06
PCT/US2009/042958 WO2009137560A1 (en) 2008-05-06 2009-05-06 Method of measuring effects of components on cell reactive oxygen species production

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010149794A RU2010149794A (ru) 2012-06-20
RU2480759C2 true RU2480759C2 (ru) 2013-04-27

Family

ID=40757060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010149794/15A RU2480759C2 (ru) 2008-05-06 2009-05-06 Способ измерения эффектов компонентов на продукцию реакционноспособных форм кислорода в клетке

Country Status (19)

Country Link
US (1) US8927227B2 (ru)
EP (1) EP2283356B1 (ru)
JP (1) JP5022516B2 (ru)
CN (2) CN105907835A (ru)
AR (1) AR071685A1 (ru)
AU (1) AU2009244341B2 (ru)
BR (1) BRPI0908597A2 (ru)
CA (1) CA2720132C (ru)
CO (1) CO6331324A2 (ru)
DK (1) DK2283356T3 (ru)
ES (1) ES2524561T3 (ru)
HK (1) HK1153812A1 (ru)
MX (1) MX2010011525A (ru)
MY (1) MY155238A (ru)
PL (1) PL2283356T3 (ru)
RU (1) RU2480759C2 (ru)
TW (1) TWI448687B (ru)
WO (1) WO2009137560A1 (ru)
ZA (1) ZA201005848B (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104568928B (zh) * 2013-10-22 2017-05-31 上海中医药大学 一种筛选抗氧化活性成分的方法
CN106191194A (zh) * 2016-06-29 2016-12-07 南京大学 一种对细胞内活性氧含量的检测方法
CN106566808A (zh) * 2016-10-17 2017-04-19 广西大学 过氧化氢诱导的猪肺泡巨噬细胞系氧化应激模型的建立方法
CN106995833A (zh) * 2016-11-25 2017-08-01 云南中烟工业有限责任公司 一种用于检测口含烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法
CN108531543A (zh) * 2018-03-12 2018-09-14 黄健聪 一种评价生发/防脱发功效的体外组合方法
CN110361378B (zh) * 2019-07-25 2021-04-02 浙江大学 基于荧光素乙酯的orac抗氧化活性评价方法及荧光指示剂
CN112326607B (zh) * 2020-10-16 2022-06-28 暨南大学 一种低浓度ros的检测方法及其应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2571186B2 (ja) * 1993-11-22 1997-01-16 デンカグレース株式会社 空気圧送式湿式吹付モルタル
US5891734A (en) 1994-08-01 1999-04-06 Abbott Laboratories Method for performing automated analysis
US6933887B2 (en) * 1998-09-21 2005-08-23 Ipr Licensing, Inc. Method and apparatus for adapting antenna array using received predetermined signal
US6426362B1 (en) * 1999-10-08 2002-07-30 Galileo Laboratories, Inc. Formulations of tocopherols and methods of making and using them
AU3599801A (en) * 2000-02-29 2001-09-12 Daiichi Pure Chemicals Co Ltd Reagents for the quantitation of active oxygen
ES2295066T3 (es) 2000-10-25 2008-04-16 THE PROCTER & GAMBLE COMPANY Composiciones para cuidado dental.
JP2003189893A (ja) 2001-12-26 2003-07-08 Mitsubishi Gas Chem Co Inc 抗酸化物質高生産細胞のスクリーニング方法
JP2004233164A (ja) 2003-01-29 2004-08-19 Shizuoka Prefecture 動物細胞が発する光を用いたラジカル捕捉能評価方法
US8298387B2 (en) * 2003-02-24 2012-10-30 Makoto Yuasa Reactive oxygen species measuring device
US7378282B2 (en) * 2003-05-14 2008-05-27 Tetsuo Nagano Method for measuring hypochlorite ion
JP4171834B2 (ja) * 2003-07-11 2008-10-29 財団法人大阪産業振興機構 スルホン酸エステル化合物およびそれを用いた蛍光プローブ
JP2005095171A (ja) 2003-09-05 2005-04-14 Toyobo Co Ltd 環境の変化を検出するプローブ、タンパク質、それをコードする遺伝子ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよび環境の変化の検出方法
JP2007077065A (ja) 2005-09-14 2007-03-29 Meiji Univ 単子葉植物の病害抵抗性誘導剤
MX2008013917A (es) 2006-05-03 2008-11-12 Wisconsin Alumni Res Found Composiciones farmaceuticas de n1, n4-bis(buta-1,3-dienil) butan-1,4-diamina y usos de las mismas.
DE102006058183A1 (de) * 2006-11-29 2008-06-05 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Verwendung von Substanzen, die den zellulären Glutathion-Gehalt absenken, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von T-Zell vermittelten Autoimmunkrankheiten
JP2007138961A (ja) 2007-03-01 2007-06-07 Kubota Corp 可動翼ポンプ装置の運転方法
US8877206B2 (en) * 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZURGIL N. et al. Concomitant real-time monitoring of intracellular reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential in individual living promonocytic cells. J Immunol methods. 2006. v 316(1-2), p.27-41. CHERNYAK B.V. et al Production of reactive oxygen species in mitochondria of HeLa cells under oxidation. Biochim Biophys Acta. 2006, v.1757 (5-6), p.525-534. LEGRAND-POELS S. et al Activation of the transcription factor NF-kappaB in lipopolysaccharide-stimulated U937 cells. Biochem Pharmacol. 1997 Feb 7; 53(3): 339-46. TADA Y. et al Nitric oxide and reactive oxygen species do not elicit hypersensitive cell death but induce apoptosis in the adjacent cells during the defense response of oat. Mol Plant Microbe Interact. 2004 Mar; 17(3): 245-53. *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2720132C (en) 2014-04-08
CN105907835A (zh) 2016-08-31
TWI448687B (zh) 2014-08-11
CO6331324A2 (es) 2011-10-20
JP2011516868A (ja) 2011-05-26
CA2720132A1 (en) 2009-11-12
WO2009137560A1 (en) 2009-11-12
AU2009244341A1 (en) 2009-11-12
AR071685A1 (es) 2010-07-07
ZA201005848B (en) 2015-05-27
US8927227B2 (en) 2015-01-06
ES2524561T3 (es) 2014-12-10
MY155238A (en) 2015-09-30
AU2009244341B2 (en) 2012-01-19
EP2283356A1 (en) 2011-02-16
US20110065144A1 (en) 2011-03-17
HK1153812A1 (en) 2012-04-05
EP2283356B1 (en) 2014-10-22
CN102124334B (zh) 2017-05-31
MX2010011525A (es) 2010-11-12
BRPI0908597A2 (pt) 2015-09-15
JP5022516B2 (ja) 2012-09-12
PL2283356T3 (pl) 2015-03-31
CN102124334A (zh) 2011-07-13
RU2010149794A (ru) 2012-06-20
DK2283356T3 (en) 2014-12-15
TW201005295A (en) 2010-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2480759C2 (ru) Способ измерения эффектов компонентов на продукцию реакционноспособных форм кислорода в клетке
Sánchez‐Siles et al. Salivary Concentration of Oxidative Stress Biomarkers in a Group of Patients with Peri‐Implantitis: A Transversal Study
Vengerfeldt et al. Oxidative stress in patients with endodontic pathologies
Pendyala et al. The challenge of antioxidants to free radicals in periodontitis
Purdey et al. Boronate probes for the detection of hydrogen peroxide release from human spermatozoa
Thangaswamy et al. Evidence of increased oxidative stress in aged mesenteric lymphatic vessels
Aziz et al. Effect of nonsurgical periodontal therapy on some oxidative stress markers in patients with chronic periodontitis: A biochemical study
Yoshino et al. Assessments of salivary antioxidant activity using electron spin resonance spectroscopy
Back et al. A simplified hydroethidine method for fast and accurate detection of superoxide production in isolated mitochondria
Villa‐Correa et al. Influence of periodontal clinical status on salivary levels of glutathione reductase
Chhattani et al. Comparative evaluation of antimicrobial efficacy of silver diamine fluoride, chlorhexidine varnish with conventional fluoride varnish as a caries arresting agent. An in vivo sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis study
Hegde et al. Relation between salivary and serum vitamin c levels and dental caries experience in adults-a biochemical study
Sánchez et al. Relationship between salivary leukotriene B 4 levels and salivary mucin or alveolar bone resorption, in subjects with periodontal health and disease
RU2436101C1 (ru) Способ диагностики нарушений метаболизма в организме в условиях окислительного стресса
Schwarzer et al. Redox-independent activation of NF-κB by Pseudomonas aeruginosa pyocyanin in a cystic fibrosis airway epithelial cell line
Rest Measurement of human neutrophil respiratory burst activity during phagocytosis of bacteria
Oktay et al. Determination of Oxidative Stress Parameters and Tissue Factor Activity in the Saliva of Patients with Periodontitis
Pascual et al. Effect of antioxidants on induction time of luminol luminescence elicited by 3‐morpholinosydnonimine (SIN‐1)
Kluknavská et al. Activities of selected antioxidants in saliva and plasma in patients with periodontal diseases-initial results
Raj et al. Pyruvate protects giardia trophozoites from cysteine-ascorbate deprived medium induced cytotoxicity
Kovačević et al. Oxidative/antioxidative effects of colloidal silver ions and chlorhexidine in saliva and gingival fluid of periodontal patients
Ori et al. Spontaneous DNA repair in human peripheral blood mononuclear cells
Maslii et al. Preclinical study of anti-proliferative effects of ascorbic acid in combination with lysozyme hydrochloride on cultured cells
Suárez et al. Increased Resolvin E1 Production by Peripheral Blood Mononuclear Cells in Periodontitis Patients: Pilot Study
Berkels et al. Nisoldipine increases the bioavailability of endothelial NO

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170507