TWI447395B - 將核酸進行定序之組成物與方法 - Google Patents

Description

將核酸進行定序之組成物與方法

本發明係關於測定一核酸之序列的方法。此外，本發明關於核苷酸類似物與其在一核酸定序中的用途。

已發展出各種技術與程序來獲得基因資訊，包括在基因密碼(genetic codes)中之分離標誌的廣泛的基因剖析研究或鑑定形態(broad genetic profiling or identifying pattern)與整個基因體的核苷酸程度之定序。對於在多種應用領域，例如生物技術、鑑識生物學(forensic biology)、診斷(diagnostic)、系統生物學(systematic biology)、合成生物學(synthetic biology)與個人健康照顧(personal healthcare)中的基礎生物學研究而言，DNA序列的知識已變成不可缺少。DNA定序的出現已顯著地增進了生物學研究與發現。儘管技術已發展至在核苷酸程度讀取一基因序列，但此類方法可為費時且極度昂貴的。

藉由從電泳基礎方法轉移至晶片基礎定序，新世代定序(Next Generation Sequencing)之最新的技術(於Metzker,M.L.,NATURE REVIEWS GENETICS 11: 31-45(2010)中回顧)，已大幅降低定序之成本，其不是自經擴增之目標分子的族群得到序列資訊，而通常包括將單一目標分子進行定序。即時定序的引入，其中監測連續核苷酸併入事件的發展，同時執行核酸聚合程序，已改善了定序的效率。

即時單一分子定序的一般策略為源自焦磷酸定序(pyrosequencing)的概念，其中以一光可偵測標記來標記核苷酸三磷酸鹽單體的PPi部分。在焦磷酸定序反應中，當各單體被併入一增長之鏈時，即在聚合酶擴展(polymerase extension)期間，光訊號被釋放且偵測(參見，例如Ronaghi,et al.,SCIENCE,281: 363-365(1998);Hyman,ANAL. BIOCHEM.,174: 423-436(1988)；與美國專利號6,255,083與7,329,492)。使用零階波導(zero-mode waveguide,ZMW)以在單一分子定序中增加訊號對雜訊比(signal-to-noise ratio)之單一分子偵測的方法也已被描述於美國專利號7,170,050與7,056,676中。

在任何酵素居中(enzyme-mediated)、模板依賴(template-dependent)定序程序中，併入程序的整體精確度、持續性(processivity)與正確性可直接影響序列測定。目標序列讀取之較低的正確性可能需要多倍覆蓋率(multiple-fold coverage)以測定出一具有高程度的信賴度之目標序列。不論近來之發展，存在著對每個定序反應提供較高之正確性之定序策略的需要。

於此提供之實施例提供用於擴大單一分子訊號偵測之觀察期間以改善單一分子序列測定的正確性的新穎方法。實施例包括一測定一目標核酸之核苷酸序列的方法。在一些實施例中，方法包括步驟：(a)提供一反應複合物，包括，一模板核酸，其包括一目標核酸序列、一引子核酸，其包括與該模板核酸之一區域互補的一序列，與一聚合酶酵素或一酵素複合物，其包括5’至3’聚合活性與校對之3’至5’外核酸酶活性；(b)使該反應複合物與複數個核苷酸類似物接觸，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記，其為指出該鹼基配對部分的身份；(c)藉由該酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性，使該酵素或酵素複合物得以將一核苷酸類似物以一模板依賴方式併入一新生股(nascent strand)，藉此將該標記部分結合至該新生股；(d)偵測該經併入之核苷酸類似物的該光可偵測標記；(e)藉由該酵素或酵素複合物之校對之3’至5’外核酸酶活性，使該酵素或酵素複合物得以從該新生股移除該經併入之核苷酸類似物的該標記部分；以及(f)重複步驟(c)-(e)以測定該目標核酸的序列。

於此描述之方法包括一種測定在一核酸聚合反應中藉由一聚合酶酵素或酵素複合物所併入之一核苷酸鹼基的方法，該方法包括步驟：(a)執行一核酸聚合反應，其利用一聚合酶酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性兩者，且以一模板依賴方式導致一新生股的產生，其中執行該反應於下列存在時：(i)一模板核酸，包括一目標核酸序列，(ii)一引子核酸，包括與該模板核酸之一區域互補的一序列；(iii)一聚合酶酵素或一酵素複合物，包括5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性；(iv)複數個核苷酸類似物，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記；以及(b)偵測該光可偵測標記，其中該標記為指出該鹼基或存在於藉由該酵素或酵素複合物併入該新生股之該核苷酸類似物中之鹼基的身份。

實施例更包括一種測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，該方法包括步驟：(a)執行一核酸聚合反應於下列存在時：(i)一模板核酸，包括一目標核酸序列，(ii)一引子核酸，包括與該模板核酸之一區域互補的一序列；(iii)一聚合酶酵素或一酵素複合物，包括用於以一模板依賴方式併入一核苷酸類似物的一反應位置；(iv)複數個核苷酸類似物，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記，且其中一旦該類似物藉由該聚合酶酵素或酵素複合物以一模板依賴方式被併入該新生股，該類似物不終止一新生股之產生，且其中相較於包括藉由該聚合酶酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性被移除的一標記的一核苷酸類似物，該核苷酸類似物提供至少一個經延長之偵測期間與經延長之中介脈衝持續期間；以及(b)偵測在各個依序併入事件中所併入之該標記部分。

於此敘述之任何定序方法中所使用的光可偵測標記可為一螢光團(fluorophore)或可藉由一光偵測器偵測之任何其他適合之標記。於此敘述之任何方法中所使用的核苷酸類似物可包括至少一螢光淬熄部分(fluorescence quenching moiety)。在藉由酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性以一模板依賴方式併入核苷酸類似物之時，該螢光淬熄部分從該核苷酸類似物被移除。在一些方面中，螢光淬熄部分，視需要而定藉由一連接物(linker)，附著至一核苷酸類似物之5’端。在一些方面中，螢光淬熄部分附著至於核苷酸類似物之5’端之三磷酸鹽基團的β或γ磷酸鹽。

在一些方面中，標記部分包括一光可偵測標記與一可選的連接物其連結光可偵測標記至一磷酸連接(phosphate linkage)。在一些其他方面中，標記部分包括：(a)一或多個非互補核苷酸殘基；(b)一光可偵測標記；以及(c)一可選的連接物連結該光可偵測標記至該一或多個非互補核苷酸殘基。該一或多個非互補核苷酸殘基為獨立地擇自一無鹼基核苷酸殘基與包括一鹼基之一核苷酸殘基，而該鹼基實質上缺乏與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一個鹼基配對的能力。

核苷酸類似物之鹼基配對部分一般包括一鹼基，該鹼基具有在該反應複合物之一併入位置中與該目標核酸之一對應鹼基鹼基配對的能力。在一些方面中，鹼基配對部分之3’端經由一磷酸連接連結至標記區域。在一些實施例中，鹼基配對部分包括至少三個磷酸鹽機團於其5’端，其中，最接近該鹼基配對部分(α磷酸鹽)的磷酸鹽基團為一硫代磷酸鹽(phosphorothioate)、甲基磷酸鹽(methylphosphonate)或硼烷磷酸鹽(boranophosphate)。

實施例更包括一化合物，具有式I：

或一其藥學上可接受之鹽類或水合物，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9；R₁ 與各個R₂ 為擇自O^- 與，其中

(i)　R₁ 與各個R₂ 為O^- ；或

(ii)　R₁ 為且各個R₂ 為O^- ；或

(iii) R₁ 為O^- ，一個R₂ 為；以及任何剩餘之R₂ 獨立地為O^- 、S^- 、BH₃ ^- 或CH₃ ；

R₃ 為一核苷酸部分，其包括一螢光染料F；R₄ 為H、OH、鹵素(包括氟、氯、溴與碘)、烷基(包括CH₃ 、CH₂ CH₃ )或烷氧基(經取代與未經取代兩者)(包括OCH₃ 與OCH₂ CH₃ )；Y₁ 與Y₃ 為各自獨立地擇自O^- 、S^- 、BH₃ ^- 與CH₃ ；L₁ 為擇自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基與磺醯基；Q為一螢光淬熄部分；以及B₁ 為擇自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤(hypoxanthine)與5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)。

方法可被執行於，藉此介於在該反應複合物之併入位置之該核苷酸類似物的結合與從該新生股之標記部分的移除之間的時間長度為從50至250毫秒或任何於此敘述之範圍的條件下。

方法可被執行於，藉此介於兩個連續之偵測步驟之間的時間長度為從約0.2秒至1秒，約0.2至0.6秒，約0.3至0.5秒或任何於此敘述之範圍的條件下。

更進一步提供者為適合用以執行於此敘述之定序方法的裝置。此裝置包括於此敘述之一偵測器或一偵測器系統與一支持器，而於支持器上放置反應複合物。

需瞭解的是，如所主張，前方之大體敘述與下面之詳細描述僅為示例的及用以說明的，而不為實施例的限制。

所附之圖式，其被包含於此說明書之一部分中並構成說明書之一部分，以圖解說明本發明一些實施例並連同描述內容以用來說明其原理。

1.　方法

於此敘述之組成物與方法提供用以執行單一分子定序，特別是即時單一分子定序的一有效方法。於此所提供之定序程序可使一或多個下列獨特的特徵具體化。首先為，偵測期間可被延長，於偵測期間中來自藉由一聚合酶酵素或一酵素複合物以一模板依賴方式被併入之核苷酸的訊號。可達成以上所述，藉由例如，使用一標記而非終止之核苷酸類似物，其標記可留在經併入之核苷酸殘基且維持為新生股(nascent strand)之一部份直到在下一個鹼基之併入前藉由酵素或酵素複合物將其分開。第二為，藉由一經延長的中界(interpulse)持續期間(例如，一“無訊號”或“黑暗”期間)，可將對應於連續之核苷酸併入事件的訊號脈衝之時間更進一步分離。可達成以上所述，藉由例如，利用酵素或酵素複合物從3’至5’外核酸酶活性轉換為5’至3’聚合活性所需的時間。此兩特質的結合可提供對於一偵測器感應一併入事件的一較長之“訊號”期間以及介於各連續不斷之併入事件之間的一清楚“無訊號”或“黑暗”期間，以使偵測器正確地登記一併入事件的完成。

因此，實施例包括一種測定目標核酸之核苷酸序列的方法。在一些實施例中，方法包括步驟：(a)提供一反應複合物，包括，一模板核酸，其包括一目標核酸序列、一引子核酸，其包括與該模板核酸之一區域互補的一序列，與一聚合酶酵素或一酵素複合物，其包括5’至3’聚合活性與校對之3’至5’外核酸酶活性；(b)使該反應複合物與複數個核苷酸類似物接觸，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記，其為指出該鹼基配對部分的身份；(c)藉由該酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性，使該酵素或酵素複合物得以將一核苷酸類似物以一模板依賴方式併入一新生股，藉此將該標記部分結合至該新生股；(d)偵測該經併入之核苷酸類似物的該光可偵測標記；(e)藉由該酵素或酵素複合物之校對之3’至5’外核酸酶活性，使該酵素或酵素複合物得以從該新生股移除該經併入之核苷酸類似物的該標記部分；以及(f)重複步驟(c)-(e)以測定該目標核酸的序列。

實施例更包括一種測定在一核酸聚合反應中藉由一聚合酶酵素或酵素複合物所併入之一核苷酸鹼基的方法，該方法包括步驟：(a)執行一核酸聚合反應，其利用一聚合酶酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性兩者，且以一模板依賴方式導致一新生股的產生，其中執行該反應於下列存在時：(i)一模板核酸，包括一目標核酸序列，(ii)一引子核酸，包括與該模板核酸之一區域互補的一序列；(iii)一聚合酶酵素或一酵素複合物，包括5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性；(iv)複數個核苷酸類似物，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記；以及(b)偵測該光可偵測標記，其中該標記為指出該鹼基或存在於藉由該酵素或酵素複合物併入該新生股之該核苷酸類似物中之鹼基的身份。

實施例更包括一種測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，該方法包括步驟：(a)執行一核酸聚合反應於下列存在時：(i)一模板核酸，包括一目標核酸序列，(ii)一引子核酸，包括與該模板核酸之一區域互補的一序列；(iii)一聚合酶酵素或一酵素複合物，包括用於以一模板依賴方式併入一核苷酸類似物的一反應位置；(iv)複數個核苷酸類似物，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記，且其中一旦該類似物藉由該聚合酶酵素或酵素複合物以一模板依賴方式被併入該新生股，該類似物不終止一新生股之產生，且其中相較於包括藉由該聚合酶酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性被移除的一標記的一核苷酸類似物，該核苷酸類似物提供至少一個經延長之偵測期間與經延長之中介脈衝持續期間；以及(b)偵測在各個依序併入事件中所併入之該標記部分。

實施例包括使用核苷酸類似物作為用於經由合成之定序的核苷酸基質，其中類似物可包括(i)一鹼基配對部分於類似物之5’端，包括一或多個核苷酸殘基其各包括一鹼基，該鹼基具有在一核酸聚合反應複合物之一併入位置中與目標核酸之一對應鹼基鹼基配對的能力，與(ii)一標記部分，經由例如一磷酸連接，至鹼基配對部分之3’端，其中標記部分為不與目標股互補且包括一光可偵測標記。根據本發明之一聚合酶酵素或一酵素複合物，可藉由模板依賴複製將一核苷酸類似物併入一增長的股中，藉此於類似物之5’端的鹼基配對部份與模板股之一或多個對應鹼基鹼基配對，且經由類似物之標記部分上的光可偵測標記來偵測類似物與酵素的結合及類似物進入複製股的併入。光可偵測標記的偵測可持續直到標記部分被聚合酵素之校對的3’至5’外核酸酶活性所切除，而標記部分包括光可偵測標記，且標記部分無法與目標股鹼基配對。因此，光可偵測標記的偵測可被延長，而不降低核苷酸類似物基質的濃度而減緩合成反應的速率。之後酵素或酵素複合物可繼續進行至合成的下個步驟，其中，酵素或酵素複合物可將另一個類似物併入，此類似物包括一鹼基配對部分於其5’端，且鹼基配對部分與模板股之接下來的一或多個鹼基鹼基配對。藉由經延長之訊號來區分在合成期間由經標誌之反應物的短暫結合所引起的雜訊，以增加定序正確性。一來自與一聚合複合物結合之一經標記之反應物之訊號是明顯可見的時間長度可等於，在其中聚合酶可從聚合活性轉換為外核酸酶活性並切割一錯誤配對之核苷酸殘基的時間長度。在一些實施例中，介於核苷酸類似物與一核酸合成反應複合物之併入位置結合與從新生(“引子”)股移除類似物的標記部分之間的時間長度為從約50至250毫秒。在一些實施例中，時間長度小於50毫秒，或大於250毫秒。

1.1　定序複合物與相關材料

於此提供之方法的實行一般包括一反應混合物，反應混合物包括一聚合酶酵素或一酵素複合物、包括一目標核酸序列的一模板核酸、一引子與一或多種形式之核苷酸類似物。也可使用適合用於聚合反應之各種緩衝溶液與金屬離子。

如於此所使用，一“定序複合物”或“反應複合物”(交替使用)意指一複合物，其包括一聚合酶酵素或一酵素複合物、一模板分子與一引子分子。一定序複合物可附著至一固體支持器。附著可藉由一或多個定序複合物的成分，包括聚合酶、模板分子、引子分子來發生，或間接藉由與定序複合物之任何成分結合的一分子來發生，如以下進一步詳述。

其所需要的是，聚合酶可被留在溶液中或被固定於支持器上。可將聚合酶固定於一支持器上，藉由任何本技術領域已知的方法，例如藉由直接吸附、親和結合與經由繫鏈分子(tethering molecule)之共價或非共價連接。此種繫鏈連接(tethering linkage)之一些非限制性例子為生物素-卵白素(biotin-streptavidin)、抗體-半抗原(antibody-haptene)、凝集素-醣(lectin-saccharide)、矽烷耦合(silane coupling)、碳二醯亞胺(carbodiimide)、馬來醯亞胺(maleimide)、胜肽、碳水化合物、酯、經取代之酯類、酐(anhydride)、經取代之酐與聚丙交酯(polylactide)連接。有許多可使用之繫鏈分子，其已被廣泛描述於本技術領域中。一些非限制性之例子包括：二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、雙琥珀醯亞胺戊二酸酯(disuccinimidyl glutarate)、雙琥珀亞胺醯辛二酸酯(disuccinimidyl suberate)、雙琥珀醯亞胺辛二酸酯鈉鹽(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、二硫代雙琥珀醯亞胺丙酸鹽(dithiobis(succinimidylpropionate))、二硫代雙(磺酸琥珀醯亞氨基丙酸酯(dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate))、二(N-琥珀醯亞胺)乙烯乙二醇二琥珀酸酯(ethylene glycobis(succinimidylsuccinate))、乙二醇-雙(丁二酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)二磺酸(ethylene glycobis (sulfosuccinimidylsuccinate))、二琥珀醯亞氨基酒石酸鹽(disuccinimidyl tartrate)、雙磺基琥珀酒石酸鹽(disulfosuccinimidyl tartrate)、雙[2-(琥珀醯亞氨氧代羰氧基)乙基]碸(bis[2-(succinimidyloxycarbonyloxy) ethyl]sulfone)、雙[2-(硫代琥珀醯亞氨氧代羰氧基)乙基]碸(bis[2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy) ethyl]sulfone)、琥珀醯亞胺4-(N-馬來醯亞胺基-甲基)環己烯-1-羧酸酯succinimidyl(4-(N-maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate)、硫代-琥珀醯亞胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烯-1-羧酸酯(sulfo-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-lcarboxylate)、m-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、m-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺酸基琥珀醯亞胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)、琥珀醯亞氨4-(p -馬來醯亞胺基-苯基)-丁酸酯(succinimidyl 4-(p -maleimido-phenyl)-butyrate)、硫代琥珀醯亞氨4-(p -馬來醯亞胺基-苯基)-丁酸酯(sulfosuccinimidyl 4-(p -maleimidophenyl)-butyrate)、二馬來醯亞胺基己烷(bismaleimidohexane)、N-(y-馬來醯亞胺基丁醯氧基)琥珀酸亞胺酯(N-(y-maleimidobutyryloxy) succinimide ester)、N-(y-馬來醯亞胺基丁醯氧基)硫代琥珀酸亞胺酯(N-(y-maleimidobutyryloxy) sulfosuccinimide ester)、N-琥珀醯亞氨(4-碘乙醯)氨基苯甲酸(N-succinimidyl(4-iodoacetyl) aminobenzoate)、硫代琥珀醯亞氨(4-碘乙醯)氨基苯甲酸(sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl)-aminobenzoate)、1,4-二-[3’-2’-吡啶二硫代(丙醯氨基)丁烷](1,4-di-[3’-2’-pyridyldithio(propionamido)butane])、4-琥珀醯亞氨氧基羰基-a-(2-吡啶二硫代)甲苯(4-succinimidyloxycarbonyl-a-(2-pyridyldithio)toluene)、硫代琥珀醯亞氨-6-[a-甲基-a-(2-吡啶二硫代)-甲苯醯胺]已酸酯(sulfosuccinimidyl-6-[a-methyl-a-(2-pyridyldithio)-toluamido]hexanoate)、N-琥珀醯亞氨-3(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(N-succinimidyl-3(2-pyridyldithio)-propionate)、琥珀醯亞氨6-[3-(2-吡啶二硫代)-丙醯氨基]已酸酯(succinimidyl6-[3-(2-pyridyldithio)-propionanido]hexanoate)、硫代琥珀醯亞氨-6-[-3-(2-吡啶二硫代)-丙醯氨基]已酸酯、3-(2-吡啶二硫代)-)丙醯肼(3-(2-pyridyldithio)-propionyl hydrazide)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳醯二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)、N,N’-二環己基碳二亞胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide)、4-(p -疊氮基水楊醯胺基)-丁胺(4-(p -azidosalicylamido)-butylamine)、疊氮苯甲醯基醯肼(azidobenzoyl hydrazide)、N-5-疊氮-2-硝基苯甲酸琥珀醯亞胺(N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide)、N-[4-(p -疊氮水楊醯胺基)丁基]-3’(2’-吡啶二硫代)丙醯胺(N-[4-(p -azidosalicylamido)butyl]-3’(2’-pyridyldithio)propionamide)、p-疊氮苯甲醯甲醛一水合物(p-azidophenylglyoxalmonohydrate)、4-(p -疊氮水楊醯胺基)丁胺(4-(p -azidosalicylamido)butylamine)、1-(p -疊氮水楊醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(1-(p -azidosalicylamido)-4-(iodoacetamido)butane)、雙-[(3-4-疊氮水楊醯胺基)乙基]二硫化物(bis-[(3-4-azidosalicylamido)ethyl]disulfide)、N-羥基琥珀醯亞胺-4-疊氮苯甲酸(N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate)、n-羥基硫代-琥珀醯亞胺4-疊氮苯甲酸(n-hydroxysulfo-succinimidyl4-azidobenzoate)、N-羥基琥珀醯亞胺-4-疊氮水楊酸(N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylicacid)、N-羥基硫代琥珀醯亞胺-4-疊氮水楊酸(N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidosalicylicacid)、硫代琥珀醯亞胺-(4-疊氮水楊醯胺基)-已酸酯(sulfosuccinimidyl-(4-azidosalicylamido)-hexanoate)、p-硝基苯-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸(p-nitrophenyl-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionate)、2-重氮-3,3,3,-三氟-丙醯氯(2-diazo-3,3,3,-trifluoro-propionylchloride)、N-琥珀醯亞胺-(4--疊氮苯)1,3’-二硫代丙酸鹽(N-succinimidyl-(4-azidophenyl)1,3’-dithiopropionate)、硫代琥珀醯亞胺-(4-疊氮苯二硫代)丙酸鹽(sulfosuccinimidyl-(4-azidophenyldithio)propionate)、硫代琥珀醯亞胺-2-(7-疊氮-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3’-二硫代丙酸鹽(sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcoumarin-3-acetamide)　ethyl-1,3’-dithiopropionate)、硫代琥珀醯亞胺7-疊氮-4甲基香豆素-3-醋酸鹽(sulfosuccinimidyl 7-azido-4-methylcoumarin-3-acetate)、硫代琥珀醯亞胺2-(m-疊氮-硝基苯醯胺)-乙基-1,3’-二硫代丙酸鹽(sulfosuccinimidyl 2-(m-azido-onitrobenzamido)-ethyl-1,3’-dithio propionate)、N-琥珀醯亞胺-6-(4’-疊氮-2’-硝基苯基胺基)已酸酯(N-succinimidyl-6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate)、硫代琥珀醯亞胺6-(4’-疊氮-2’-硝基苯基胺基)已酸酯(sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate)、硫代琥珀醯亞胺2-(p疊氮水楊醯胺基)乙基-1,3’-二硫代丙酸鹽(sulfosuccinimidyl 2-(pazidosalicylamido)ethyl-1,3’-dithiopropionate)、硫代琥珀醯亞胺4-(p -疊氮苯)-丁酸酯(sulfosuccinimidyl 4-(p -azidophenyl)-butyrate)。

可將聚合酶固定於不干擾一核酸聚合反應的任何支持器上。支持器之材料、形狀及/或尺寸可取決於用以偵測來自反應複合物之訊號的偵測系統。可利用廣泛種類之支持器，包括，但不限於由金屬、金屬氧化物、矽、玻璃、石英、聚合物、碳水化合物、樹脂與其之任何複合材料所製成的支持器。材料可為帶正電荷的、帶負電荷的或不含電荷，且可為未經修飾的，或以一塗層衍生以協助複合物固定。支持物可更為任何適合的形狀與尺寸，其包括，但不限於盤(plate)、小珠(bead)、球體(sphere)、載玻片、晶圓、晶片與各種容器的表面，包括孔洞(well)、毛細管(capillary)、移液管(pipettes)、管道(channel)、試管(tube)、細孔(pore)、比色管(cuvette)、微流管道(microfluidic channel)、反應室(chamber)與孔洞。支持物可採取任何適合之形式，包括，但不限於多孔盤與奈米尺寸孔洞的陣列。聚合酶之固定可用於將聚合酶設置於用來成像的一狹窄空間內，例如在用於零階波導成像(zero mode waveguide imaging)之阿升(attoliter)或仄升(zeptoliter)尺度體積內。

聚合酶藉由聚合酶次單元，或藉由包含於聚合酶中之任何其他次單元可附著至支持器。聚合酶可包含一次單元，其除了使聚合酶附著至固定支持器外沒有提供功能。聚合酶可被隨機固定於支持器上，成陣列或成任何其他模式於支持器表面上。

在於此揭露之定序方法中，可使用具有5’至3’聚合或3’至5’外核酸酶活性的任何聚合酶。措辭“3’至5’外核酸酶活性”意指在一新生股之3’端的磷酸二酯鍵(phosphodiester bond)的水解分裂(hydrolytic cleavage)。3’至5’外核酸酶活性可用來錯誤改正(即，校對)被併入一新生(即，增長的)股的一鹼基。一般而言，使用上述措辭與模板專一核酸聚合酶相關，藉此，不與模板形成華生-克力克(Watson-Crick)鹼基配對的核苷酸，被以一依序之方式從新生股之3’端移除。具有錯誤改正活性之聚合酶的例子包括，但不限於來自嗜超熱球菌(Pyrococcus furiosus )、嗜熱球菌(Thermococcus litoralis )與海棲熱袍菌(Thermotoga maritime )的聚合酶。一“錯誤配對之核苷酸”或一“錯誤配對”意指一核苷酸其不與在那位置之目標核酸序列互補。

如於此使用之措辭“聚合酶”意指一酵素或一酵素複合物，其催化藉由使用DNA或RNA為一模板來將核苷酸單元添加至一核苷酸鏈的聚核苷酸合成。此措辭包括單體的(monomeric)與多聚體的(multimeric)的酵素(例如，一酵素複合物)。一酵素複合物可包括一單一酵素或多重酵素，且也可包括額外之非酵素蛋白質或其他次單元。例如，藉由一酵素複合物的一或多個次單元，可執行兩種類型的酵素活性。經由介於次單元間之非共價結合(例如，經由氫鍵結(hydrogen bonding)、離子鍵結(ionic bonding)、凡得瓦力(Van der Waals force)與疏水交互作用(hydrophobic interactions))或共價結合(例如，經由雙硫鍵(disulfide bond)或內醯胺橋(lactam bridges))可使複合物保持在一起。此類複合物的一些非限制性例子，可包括一核酸聚合酶的至少一個催化次單元，核酸聚合酶包括野生型(wild-type)、重組(recombinant)、突變(mutant)與經工程設計(engineered)的聚合酶。一般而言，聚合酶會在黏附至一聚核苷酸模板序列之一引子的3’端使合成開始，且會朝向模板股之5’端前進。一“DNA聚合酶”催化去氧核苷酸(deoxynucleotide)之聚合。一“RNA聚合酶”催化核糖核苷酸(ribonucleotides)之聚 合。

如上所提及，一些聚合酶也可具有校對活性，例如在執行5’至3’聚合活性之一相同次單元內的3’至5’外核酸酶活性。此種類的聚合酶包括，但不限於，原核生物的(prokaryotic)DNA pol I、II與III、真核生物的(eukaryotic)DNA pol α、δ與ε與噬菌體複製酶(phage replicase)。

一校對聚合酶具有催化來自去氧核苷酸之DNA(或來自核糖核苷酸之RNA)的模板引導合成(template-directed synthesis)的能力及還具有一3’至5’校對的外核酸酶活性，且因此可切除一錯誤配對之核苷酸位於或鄰近一新生股之3’端，當其與模板雜合時。在一些實施例中，5’至3’聚合酶活性與3’至5’校對之外核酸酶分別存在於一聚合酶之分開的次單元中，例如大腸桿菌(E.coli )DNA聚合酶III複合物之α與ε(A.Kornberg & T.A.Baker,“DNA Replication”,Second Edition,University Science Books,U.S.A.,2005)。在一些實施例中，校對聚合酶為Pfu、KOD、Tgo、Vent、Deep Vent、phi29 DN聚合酶、T4 DNA聚合酶(參見，例如Reha-Krantz,L.J.,GENETICS,148：1551-1557(1998))或T7 DNA聚合酶。適合之校對聚合酶可為B型聚合酶。B型聚合酶可為耐熱性的(thermostable)聚合酶，例如Pyrococcus 聚合酶，例如，Pfu、Pwo、Pho、Pab、Pko、Pgl聚合酶；熱球菌屬(Thermococcus )聚合酶，例如，嗜熱球菌(Thermococcus litoralis )、嗜熱球菌種Thermococcus barossii 與嗜熱球菌種Thermococcus gorgonarius 聚合酶；與來自熱網菌(Pyrodictium spp. )之聚合酶。也可從真細菌(eubacterial)菌株，例如棲熱袍菌屬(Thermotoga )分離出具有3’至5’外核酸酶活性的耐高溫聚合酶。聚合酶也可衍生自一自然聚合酶並經工程設計(engineered)的以具有5’至3’聚合酶與3’至5’外核酸酶活性兩者，其中經修飾之3’至5’外核酸酶活性具有水解地分裂(hydrolytically cleave)前述式I之一標記部分R₃ 的能力，其中R₃ 不包括核苷酸或核苷酸類似物結構。

有用的核酸聚合酶可為非耐熱的或嗜熱的(thermophilic)。一嗜熱的聚合酶(也意指為“熱穩定”或“耐熱”聚合酶)意指任何酵素，其催化藉由使用DNA或RNA為模板將核苷酸單元添加至核苷酸鏈的聚核苷酸合成，其在高於45℃之溫度具有最理想的活性，且不會於高溫，例如高於90℃不可逆地變性。耐熱聚合酶的非限制性例子為Taq與Pfu DNA聚合酶與其衍生物，及來自嗜熱生物體(thermophilic organism)，例如嗜熱菌種Thermus aquaticus 、嗜熱菌種Thermus thermophilus 、嗜熱球菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus sterothermophilus) 、嗜熱菌種Thermotoga maritime 與其他嗜熱菌種Thermus 、芽孢桿菌(Bacillus )、嗜熱菌種Thermotoga 與嗜超熱球菌(Pyrococcus )種的那些。耐熱聚合酶也包括，但不限於，來自嗜熱噬菌體(thermophilic bacteriophage)，例如PyroPhage 3173 DNA聚合酶(Lucigen)的那些。

在一些實施例中，聚合酶為一非耐熱聚合酶，包括，但不限於phi29與BST DNA聚合酶。另一說明性的例子為大腸桿菌DNA聚合酶I的一大片段(Klenow)，其具有3’至5’外核酸酶活性且缺乏5’至3’外核酸酶活性。此酵素或等同酵素可被使用於實施例中，其中不在高溫執行合成反應，例如在等溫的(isothermal)聚合酶鏈鎖反應(PCR)期間。在一些實施例中，聚合酶為一古細菌的(archaeal)DNA聚合酶。

適合本發明之複合物也可包含缺乏3’至5’外核酸酶活性的聚合酶，包括聚合酶其自然缺乏外核酸酶活性，例如特定RNA聚合酶、反轉錄酶(reverse transcriptase)，及聚合酶，其已被截短或以其他方式修飾而不包含外核酸酶活性。此類酵素當使用於本發明中時，一般更包括一額外之次單元，其具有執行3’至5’外核酸酶活性的能力。

適合本發明之聚合酶也可具有股取代(strand displacement)活性，其意指在聚合期間，取代下游DNA之聚合酶活性。股取代(strand-displacing)聚合酶可具有減低之5’至3’外核酸酶活性或實質上沒有5’至3’外核酸酶活性。在一環形模板分子上，股取代聚合酶可產生模板序列之串連重複(tandem repeat)，有效地將相同之模板再定序(resequencing)。對於單一分子定序而言，此為一特別優點，由於可以一串連方式重複地自一相同之分子衍生出序列資訊。適合本發明之股取代聚合酶的非限制性例子，包括，但不限於Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶全酵素(holoenzyme)、噬菌體M2DNA聚合酶、噬菌體PRD1 DNA聚合酶與DNA聚合酶I之Klenow片段。

在一些實施例中，聚合酶為一混合蛋白質(hybrid protein)，其包括一聚合區域與一3’至5’外核酸酶。於此使用措辭“混合蛋白質”以描述一蛋白質，其包括來自多重起源(multiple parent)序列的胺基酸殘基。混合聚合酶蛋白質之例子與產生混合蛋白質的方法被敘述於國際專利公開號WO 2004/011605中。因此，此類聚合酶為聚合酶的非自然發生變體(variant)。

在一些實施例中，使用具有經增強之持續性(processivity)的聚合酶是有利的。這些的例子包括敘述於國際專利公開號WO 01/92501與美國專利號7,666,645中的聚合酶。這些經改善之聚合酶具有經增強之持續性，由於一序列非專一雙股DNA結合區域(sequence-non-specific double stranded DNA binding domain)的存在，而序列非專一雙股DNA結合區域與聚合酶或聚合酶之酵素區域連結。在一些實施例中，此結合區域來自一耐熱生物體，且提供一經增強的活性於較高的溫度下，例如高於45℃之溫度。例如，Sso7d與Sac7d為分別來自極端嗜熱(hyperthermophilic)古細菌(archaeabacteria)硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus )與嗜酸熱硫化葉菌(S .acidocaldarius )之小的(約7,000 kd MW)、基礎的染色體(chromosomal)蛋白質(參見，例如Choli et al.,BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 950: 193-203(1988)；Baumann et al.,STRUCTURAL BIOL. 1: 808-819(1994)；與Gao,et al.,NATURE STRUC. BIOL. 5: 782-786(1998))。這些蛋白質以一序列一獨立方式(sequence-independent manner)與DNA結合，且當結合時，在一些條件下，以上至40℃來增加DNA的Tm(McAfee et al.,BIOCHEMISTRY 34:10063-10077(1995))。在經改善之聚合酶融合蛋白質中，這些蛋白質與其同源體(homologs)可被使用為序列非專一DNA結合區域。Sso7d、Sac7d、Sac7e與相關序列(此處意指為“Sso7序列”或“Sso7區域”)為在本技術領域中為已知(參見，例如，獲得編號(P39476(Sso7d)；P13123(Sac7d)；與P13125(Sac7e))。其他序列非專一雙股核酸結合蛋白質為拓樸異構酶(topoisomerase)、解旋酶(helicase)或PCNA。額外例子被描述於Motz,et al.,J. BIOL. CHEM. 277: 16179-88(2002);Pavlov,et al.,PROC. NATL. ACAD. SCI. USA,99: 13510-13515(2002))中。

適合之核酸聚合酶包括核酸聚合酶的功能片段。一聚合酶之“功能片段”意指一野生型或突變之聚合酶的任何部分，其包括少於聚合酶的完整胺基酸序列，且其在至少一組條件下維持催化聚核苷酸之聚合且經由3’至5’外核酸酶活性切除錯誤配對之核苷酸的能力。

本發明之其他實施例可使用複合物，其利用其他機制來合成新生股，例如模板居間之接合(template-mediated ligation)或可經由一非磷酸二酯連接(non-phosphodiester linkage)來添加互補核苷酸，例如經由形成胜肽鍵(peptidebond)。對於本發明之目的而言，此類合成的方法也可被視為5’至3’聚合。

在一些實施例中，可藉由添加其他因子來促進本發明之核酸合成，其他因子包括，但不限於蛋白質，例如解旋酶、單股DNA結合蛋白質(single-stranded DNA binding proteins)、腺病毒DNA結合蛋白質(adenovirus DNA-binding protein)、單純性皰疹病毒(HSV)蛋白質ICP8與BMRF1聚合酶附屬次單元(polymerase accessory subunit)。

1.2　定序引子

一定序引子為一與要被偵測之核酸片段或其連結的末端連結引子互補的寡核苷酸，其具有作為藉由聚合酶之核酸合成之起始點的能力。在一些實施例中，定序引子的長度為至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50個核苷酸或更多。在特定實施例中，定序引子之長度可為自8至25、自10至20、自10至30，或自10至50個核苷酸。定序引子可由任何形式之核苷酸所形成，包括自然發生核苷酸、不存在於自然之核苷酸類似物或經修飾之核苷酸。

對於在擴增期間之最大效率而言，引子較佳為單股，但也可為雙股，且藉由自身黏附(self-annealing)，例如“髮夾(hairpin)”引子，或藉由被黏附至另一個互補之序列。此類雙股引子對於使用“熱啟動(hot start)”聚合酶鏈鎖反應的實施例而言特別有用。

在一些實施例中，一定序引子可包含經修飾之核苷酸，例如鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)(經修飾之核糖核甘酸，其在一聚核酸(polynucleic acid)中提供增強之鹼基堆疊相互作用(base stacking interaction))。如鎖核酸之效用解說，Levin et al.(Nucleic Acid Research 34(20):142(2006))顯示相對於對應之未鎖引子(unlocked primer)，一含鎖核酸之引子具有經改善之專一性及顯示較強之結合。製造MCP1引子(5’-cttaaattttcttgaat-3’)之三種變化，包含3個鎖核酸核苷酸(於蓋(cap)中)於引子中之不同位置：MCP1-LAN-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’)；MCP1-LAN-5’(5’-CtTaAattttcttgaat-3’)；與MCP1-LAN-even(5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)。所有經鎖核酸取代之引子具有提高之熔解溫度(melting temperature,Tm)，而MCP1-LNA-5’引子顯示特別提高之定序準確度(Phred Q30 counts)。因此，在特別的實施例中，定序引子可包含至少一鎖核苷酸於其5’端區域，即，定序引子之5’端一半、三分之一或四分之一。在一些實施例中，引子可包含額外之分子基團，包括，但不限於一偵測標記，一5’阻礙基團(blocking group)或對於補充之聚合酶(recruit polymerase)或其他酵素的結合區域。

可將定序引子與樣本核酸雜合，藉由將樣本核酸與一莫耳過剩(molar excess)之定序引子混合於一含鹽溶液中，例如10 mM Tris-HCl，pH 7.5、1 M NaCl與1 mM EDTA緩衝溶液。可將混合物加熱65℃至少5分鐘且緩慢冷卻至室溫以允許引子/模板黏合。藉由適合之方法可將殘餘之引子去除，包括，例如一分子篩(molecular sieve)。

藉由適合的方法，包括序列之視覺檢閱或電腦協助的引子設計，可設計出引子，而引子包括末端連結與定序引子兩者。許多軟體套組為可用來協助引子設計，包括DNAStar^TM (DNAstar,Inc.,Madison,WI)、OLIGO 4.0(National Biosciences,Inc.)、Vectoe(Invitrogen)、Primer Premier 5(Premierbiosoft)與Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)。引子設計，考慮到例如，要被定序之分子、專一性、長度、所需的熔解溫度、二級結構、引子二聚體、GC含量、緩衝溶液的pH與離子強度及所使用之酵素(即，聚合酶或連接酶)。參見，例如Sambrook and Russell,MoLECULAR CLoNING: A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press;3rd edition(2001)。在一些實施例中，引子可由不同序列之混合物所組成，例如用於多重聚合酶鏈鎖反應(multiplex PCR)或當擴增具有一未知序列的一模板分子時。在後面之例子中，引子設計可為不需要的，且隨機序列之一混合物可用來取代引子

1.3末端連結引子

在一些實施例中，一線性核酸可更包括一或多個末端連結引子，其與核酸之5’端、3’端，或5’端與3’端兩者結合。在特別的實施例中，一末端連結引子可被固定於核酸之3’端。可使用末端連結引子以提供對於一定序引子的互補序列。

末端連結引子為短的核酸分子，通常由少於100個核苷酸所組成。在一些實施例中，末端連結引子之長度為至少5、10、15、20、25、30、50、75、90個核苷酸或更多。在特定實施例中，末端連結引子之長度為自8至25、自10至20、自10至30，或自10至50個核苷酸。在一些實施例中，末端連結引子為未經分支的，然而，在其他實施例中，其可為經分支的。

末端連結引子也可做為一對於一定序序列的互補物(complement)。在一些實施例中，末端連結引子的5’端可包括與一定序引子互補的序列。在一些實施例中，與定序引子互補之末端連結引子係可被定位以便定序引子之3’端直接與要被定序之核酸中的第一個核苷酸鄰接。

在一些實施例中，藉由一連接酶(ligase)，例如一DNA連接酶可將末端連結引子加至要被偵測之核酸的末端。在一些實施例中，在連接(ligation)前，末端連結引子與要被偵測之核酸兩者皆為單股。在其他實施例中，兩者皆為雙股。在另外其他實施例中，一者可為單股，而另一者可為雙股。連接為本技術領域所熟知。例如，在聚合群落定序方法(polony sequencing method)中，Shendure et al.(SCIENCE,309:1728-1732(2005))以新英格蘭生物實驗室(New England Biolab’,NEB)快速連接套組(Quick Ligation kit)將一T30末端連結引子(32 bp)連結至一樣本DNA片段。其中，連結反應溶液包括0.26 pmole之DNA、0.8 pmole之T30末端連結引子、4.0 μl T4 DNA連接酶於1×快速連接緩衝溶液(Quick Ligation buffer)中。於混合後，於室溫培養反應溶液約10分鐘，且之後置於冰上。藉由將樣本加熱至65℃，10分鐘來停止連接反應。

在其他實施例中，可將末端連結引子合成於要被定序之核酸上。例如，末端連結引子可為一藉由例如末端轉移酶(terminal transferase)所加入之均聚物(homopolymer)。例如，Harris et al.(SCIENCE3 20:106-109(2008))將一多腺嘌呤尾巴(poly A tail)加至DNA模板，其做為於一病毒基因體之單一分子定序中之一多胸腺嘧啶(poly T)定序引子的互補物。

1.4　核苷酸類似物

實施例包括核苷酸類似物做為藉由合成之核酸定序之基質的用途。在一些實施例中，個別之類似物包括一鹼基配對部分與一標記部分，鹼基配對部分可包括一或多個核苷酸殘基於類似物之5’端，其各包括一鹼基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤(hypoxanthine)或5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine))，鹼基具有與在一反應複合物之併入位置中之模板核酸之一對應鹼基鹼基配對的能力。類似物之標記部分可經由一磷酸連接連結至鹼基配對部分之3’端，其中標記部分係擇自(1)一光可偵測標記，與一可選的連接物其將光可偵測標記連接至磷酸鹽，與(2)一基團，其包括一或多個非互補核苷酸殘基、一光可偵測標記，與一可選的連接物其將光可偵測標記連接至一或多個非互補核苷酸殘基。措辭“非互補”應用於一核苷酸類似物意指，核苷酸實質上缺乏與在模板序列中之一對應鹼基形成華生-克力克鹼基配對(即，A-T、C-G、A-U之配對)的能力。非互補核苷酸類似物包括，但不限於，無鹼基核苷酸，與核苷酸包括一鹼基其缺乏與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一個鹼基配對的能力。非互補核苷酸殘基可導致一“錯誤配對”(“錯誤配對之核苷酸”)，其隨後經由本發明之聚合酶的3’至5’外核酸酶活性被分開。

實施例包括複數個核苷酸類似物的用途，此複數個之一個別的類似物具有如式I中所示之結構：

或一其藥學上可接受之鹽類或水合物，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9；R₁ 與各個R₂ 為擇自O^- 與，其中

(i) R₁ 與各個R₂ 為O^- ；或

(ii) R₁ 為且各個R₂ 為O^- ；或

(iii) R₁ 為O^- ，一個R₂ 為，且任何剩餘之R₂ 獨立地為O^- 、S^- 、BH₃ ^- 或CH₃ ；

R₃ 為一核苷酸部分，其包括一螢光染料F；R₄ 為H、OH、鹵素(包括氟、氯、溴與碘)、烷基(包括CH₃ 、CH₂ CH₃ )或烷氧基(經取代與未經取代兩者)(包括OCH₃ 與OCH₂ CH₃ )；Y₁ 與Y₃ 為各自獨立地擇自O^- 、S^- 、BH₃ ^- 與CH₃ ；L₁ 為擇自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基與磺醯基；Q為一螢光淬熄部分；以及B₁ 為擇自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤與5-甲基胞嘧啶；在一實施例中，例如n為1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，n為1、2、3或4。例如，n為1、2或3。在特定實施例中，n為1。

適合為R₃ 基團之核苷酸部分包括單-、二-與三核苷酸。在一些實施例中，R₃ 為擇自：F、、；其中B₂ 為擇自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤與5-甲基胞嘧啶；X₁ 為擇自亞甲基；L₂ ；一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對；以及基團，其包括L₂ 與一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對；其中L₂ 為擇自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基與磺醯基；X₂ 為擇自H、CH₃ 與一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對；各R₄ 為H、OH、鹵素(包括氟、氯、溴與碘)、烷基(包括CH₃ 、CH₂ CH₃ )或烷氧基(經取代與未經取代兩者)(包括OCH₃ 與OCH₂ CH₃ )；以及Y₂ 為擇自O^- 、S^- 、BH₃ ^- 與CH₃ 。

例如，R₃ 可擇自：從 。

鹼基B₁ 與B₂ 可各自獨立地為，例如，一嘌呤(purine)或一嘧啶(pyrimidine)。例如，B₁ 或B₂ 可為一腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或次黃嘌呤(hypoxanthine)。鹼基B₁ 與B₂ 也可各自為，例如，一鹼基之一自然發生或合成的衍生物，包括吡唑(3,4-d)-嘧啶(pyrazolo(3,4-d)-pyrimidine)；5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine(5-me-C))；5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl cytosine)；黃嘌呤(xanthine)；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤(2-aminoadenine)；腺嘌呤或鳥嘌呤之6-甲基或其他烷基衍生物；腺嘌呤或鳥嘌呤之2-丙基或其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶(2-thiouracil)；2-硫代胸腺嘧啶(2-thiothymine)；2-硫胞嘧啶(2-thiocytosine)；5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyl uracil)；5-丙炔基胞嘧啶(5-propynyl cytosine)；6-偶氮尿嘧啶(6-azo uracil)；6-偶氮胞嘧啶(6-azo cytosine)；6-偶氮胸腺嘧啶(6-azo thymine)；偽尿嘧啶(pseudouracil)；4-硫尿嘧啶(4-thiouracil)；8-鹵素(例如8-溴)、8-胺基、8-硫醇基(8-thiol)、8-硫代烷基(8-thioalkyl)、8-羥基與其他8-取代之腺嘌呤或鳥嘌呤；5-鹵素(例如，5-溴)、5-三氟甲基(5-trifluoromethyl)與其他5-取代尿嘧啶或胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤(7-methylguanine)；7-甲基腺嘌呤(7-methyladenine)；8-氮雜鳥嘌呤(8-azaguanine)；8-氮雜腺嘌呤(8-azaadenine)；脫氮鳥嘌呤(deazaguanine)；7-脫氮鳥嘌呤；3-脫氮鳥嘌呤；脫氮腺嘌呤(deazaadenine)；7-脫氮腺嘌呤；3-脫氮腺嘌呤；比唑(3,4-d)-嘧啶；一咪唑幷(1,5-a)-1,3,5三秦酮(imidazo(1,5-a)-1,3,5 triazinone)；一9-氮雜嘌呤(9-deazapurine)；一咪唑并(4,5-d)-比嗪(imidazo(4,5-d)-pyrazine)；一巰基噻唑(4,5-d)-嘧啶(thiazolo(4,5-d)-pyrimidine)；一比嗪-2-酮(pyrazin-2-one)；一1,2,4-三氮雜苯(1,2,4-triazine)；一達嗪(pyridazine)；一1,3,5三氮雜苯；或其類似物。

於核苷酸類似物中有用之鹼基與於此敘述之方法可允許包括一鹼基B₁ (與一鹼基B₂ 根據一些實施例)之一核苷酸類似物，藉由一聚合酶被併入一新生鏈中，且與模板股上之一或多個鹼基形成一或多個鹼基配對。措辭“鹼基配對”不僅包括標準AT、AU或GC鹼基配對，還包括介於核苷酸及/或包括非標準或經修飾之鹼基的核苷酸類似物之間所形成之鹼基配對，其中氫鍵提供者與氫鍵接受者的安排允許介於非標準鹼基與一標準鹼基之間或介於兩個互補非標準鹼基結構之間的氫鍵結。此類非標準鹼基配對之一例子為介於鹼基類似物次黃嘌呤及腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶任一之間的鹼基配對，其中兩個氫鍵被形成於此鹼基配對中。

核苷酸類似物可包括一基團，而為了使聚合持續，基團在類似物被併入一新生或增長之股中之後，藉由校對聚合酶之3’至5’外核酸酶活性被移除。在一些實施例中，使用於本發明方法中之核苷酸類似物為單核苷酸類似物，其中此核苷酸類似物包括一標記部分於基團R₃ 中。其所需要的是，標記部分包括一光可偵測標記，或一光可偵測標記與一連接物其將光可偵測標記連結至3，磷酸鹽。例如，連接物為如於此處所定義的L₂ 。在此類實施例中，在藉由一聚合酶將類似物併入一增長的股中之後，磷酸鹽、可選的連接物與光可偵測標記被移除以解放3’-OH來連接在一隨後併入步驟中之一進來的核苷酸類似物的一5’磷酸鹽。此移除可藉由校對酵素之校對3’至5’外核酸酶活性來催化。

在一些實施例中，用來使用於本發明方法中之核苷酸類似物為單核苷酸類似物，其中此類似物包括做為一標記部分之一基團R₃ ，R₃ 包括一光可偵測標記，或一光可偵測標記與一連接物其將光可偵測標記連結至3’磷酸鹽，但其中無法切斷連接物以從3’磷酸鹽分離光可偵測標記。例如，連接物為如於此處所定義的L₂ 。

在一些實施例中，具有式I之結構的核苷酸類似物為二核苷酸(binucleotide)類似物，其中此類似物包括做為一標記部分的R₃ 基團，R₃ 基團具有結構。在一些實施例中，具有式I之結構的核苷酸類似物為三核苷酸(trinucleotide)類似物，其中此類似物包括做為一標記部分的R₃ 基團，R₃ 基團具有結構：或。

在此類二核苷酸或三核苷酸實施例中，F為一光可偵測標記，Y₂ 為O、CH₃ 、BH₂ 或S，且各個之基團X₁ 與X₂ 為一基團其無法與在模板股中之一對應鹼基鹼基配對。在一些實施例中，基團X₁ 為一連接物。適合之連接物包括，例如烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基、磺醯基連接物或其類似物。在一些實施例中，連接物為一經取代之烷基、烯基、炔基或胺基。在一些實施例中，連接物為被以異原子中斷(interrupted)之烷基、烯基、炔基或胺基。在一些實施例中，例如連接物為聚乙二醇(polyethylene glycol)。連接物可為任何適合之連接物，其為無反應性的(nonreactive)且其將介於光可偵測標記與核苷酸類似物之剩餘物之間的立體阻礙(steric hindrance)最小化。在一些實施例中，基團X₁ 與基團X₂ 任一或兩者為一鹼基，包括一自然發生或合成之嘧啶或嘌呤衍生物，其不與在目標核酸股中之任何鹼基互補。在一些實施例中，X₂ 為烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基或磺醯基基團。在一些實施例中，X₂ 為氫。在實施例中，於其中類似物為一三核苷酸類似物，其包括一鹼基B₂ 與基團Y₂ ，Y₂ 可為S^- ,CH₃ 或BH₃ ^- ，藉此在三核苷酸類似物併入一增長之股後，可避免包括鹼基B₂ 之核苷酸殘基之持續的(processive)3’至5’切除。

各個R₄ 可獨立地為H、OH、鹵素(包括氟、氯、溴與碘)、烷基(包括CH₃ 、CH₂ CH₃ )或烷氧基(經取代與未經取代兩者)(包括OCH₃ 與OCH₂ CH₂ )。在另一實施例中，R₄ 獨立地為H、OH、氟或OCH₃ 。例如，所有的R₄ 基團可為H。或者，所有的R₄ 基團可為OH。

光可偵測標記F可為任何部分，其可附著至一核苷酸類似物或與一核苷酸類似物結合，且其起作用以提供可偵測訊號。在一些實施例中，標記為一螢光標記，例如一小分子螢光標記。適合為一螢光標記的有用螢光分子(螢光團)包括，但不限於：1,5 IAEDANS；1、8-ANS；4-甲基傘形酮(4-Methylumbelliferone)；5-羧基-2,7-二氯螢光黃(5-carboxy-2,7-dichlorofluorescein)；5-羧基螢光素(5-Carboxyfluorescein,5-FAM)；螢光素醯胺(fluorescein amidite(FAM))；5-羧基萘基螢光素(5-Carboxynapthofluorescein)；四氯-6-羧基螢光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein(TET))；六氯-6-羧基螢光素(hexachloro-6-carboxyfluorescein(HEX))；2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基螢光素(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein(JOE))；VIC;NED^TM ；四甲基若丹明(tetramethylrhodamine(TMR))；5-羧基四甲基羅丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine、5-TAMRA)；5-HAT(羥色胺(Hydroxy Tryptamine))；5-羥色胺(5-Hydroxy Tryptamine、HAT)；5-ROX(羧基-X-羅丹明(carboxy-X-rhodamine))；6-羧基羅丹明(6-Carboxyrhodamine)6G；6-JOE；Lightred 610；Lightred 640；Lightred 670；Lightred 705；7-胺基-4-甲基香豆素(7-Amino-4-methylcoumarin)；7-氨基放線菌素D(7-Aminoactinomycin D,7-AAD)；7-羥基-4-甲基香豆素(7-Hydroxy-4-methylcoumarin)；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)；ABQ；Acid Fuchsin；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine))；吖啶橘(Acridine Orange)；吖啶紅(Acridine Red)；吖啶黃(Acridine Yellow)；叮啶黃(Acriflavin)；叮啶黃佛爾根SITSA(Acriflavin Feulgen SITSA)；自發螢光蛋白質(AFPs-AutoFluorescent Protein-)(Quantum Biotechnologies)；Texas Red；Texas Red-X conjugate；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；噻嗪紅R(Thiazine Red R)；噻唑橘(Thiazole Orange)；硫代黃素5(Thioflavin 5)；硫代黃素S(Thioflavin S)；硫代黃素TCN(Thioflavin TCN)；Thiolyte；噻唑橘(Thiozole Orange)；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；True Blue；TruRed；Ultralite；Uranine B；Uvitex SFC；WW 781；X-Rhodamine；XRITC；Xylene Orange；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；螯合染料(interchelating dyes)，例如YOYO-3、Sybr Green、Thiazole orange；Alexa染料系列(來自Molecular Probes/Invitrogen)之成員，其覆蓋廣泛的光譜且並符合一般激發源的主要輸出波長，例如Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700與750；Cy染料螢光團系列(GE Healthcare)的成員，也覆蓋一寬的光譜，例如Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；染料螢光團(Denovo Biolabels)的成員，例如Oyster-500、-550、-556、645、650、656；DY-標誌系列(Dyomics)的成員，例如，具有自(DY-415)至844 nm(DY-831)的最大吸收範圍，例如DY-415、-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-631、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XL；ATTO系列之螢光標誌(ATTO-TEC GmbH)的成員，例如ATTO 390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740；CAL系列或系列之染料(Biosearch Technologies)的成員，例如CALGold 540、CALOrange 560、570、CALRed 590、CALRed 610、CALRed 635、570與670。

在一些實施例中，光可偵測標記F與一第二光可偵測部分互相作用以修飾由第一或第二標記所提供的可偵測訊號，例如，經由螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer)(“FRET”；也已知為Forster共振能量轉移)。在一些實施例中，使用螢光共振能量轉移(FRET)為基礎的偵測來偵測併入一新生股的核苷酸。例如，在一些實施例中，可使用如敘述於美國專利申請號2010/0035268中之一螢光共振能量轉移為基礎的方法。在此類實施例中，具有能力扮演為一螢光提供者的一量子點(Quantum dot)可連結至一定序引子，且用以合成增長之股的核苷酸類似物攜帶一標記F，標記F為一螢光接受者。藉由在螢光共振能量從經激發的量子點螢光提供者轉移之後偵測類似物連接之螢光接受者的發射(emission)，即時偵測螢光團標記之核苷酸類似物進入位於核酸聚合酵素反應位置的增長之股的併入。各個經併入之核苷酸類似物的身份藉由其螢光標記被測定，當類似物被併入增長之股且直到包含螢光標記之類似物的非互補部分被校對聚合酶之3’至5’外核酸酶活性所移除時，螢光標記是可偵測的。

在一些實施例中，核苷酸類似物包括一螢光淬熄部分Q。螢光淬熄部分包括任何部分，其具有當位於極接近螢光標記時吸收一經激發之螢光標記之能量的能力，且具有消除那能量而無可見光發射的能力。適合之螢光淬熄部分包括，例如，Deep Dark Quencher I(DDQ-I);4-((4-(二甲胺基)苯基)偶氮)苯甲酸(4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)benzoic acid)、琥珀醯亞胺酯(succinimidyl ester)(DABCYL)；dark quencher；IowaFQ;BHQ-1；QSY-7；BHQ-2；Deep Dark Quencher II(DDQ-II)；IowaRQ；QSY-21；BHQ-3與其類似物。一螢光淬熄部分Q可連接至一核苷酸類似物的γ或β磷酸鹽。一螢光淬熄部分可經由一連接物L₁ 連結至核苷酸三磷酸鹽類似物的γ或β磷酸鹽。適合之連接物包括，例如，烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基、磺醯基、聚乙二醇(PEG)連接物，或其類似物。連接物可為任何適合之連接物，其為無反應性的且其將介於螢光淬熄部分與核苷酸類似物之剩餘物之間的立體阻礙最小化。

如於此使用之措辭“烷基”意指一飽和之直線或分支的碳氫化合物，例如1-22、1-8或1-6個碳原子的一直線或分支基團，此處分別意指為(C_1- C₂₂ )烷基、(C_1- C₈ )烷基與(C_1- C₆ )烷基。示範之烷基基團包括，但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、異丁基、三級丁基(t-butyl)、戊基、異戊基、新戊基(neopentyl)、己基、庚基、辛基等。

如於此使用之措辭“烯基”意指一未飽和之直線或分支的碳氫化合物，其具有至少一個碳-碳雙鍵，例如2-22、2-8或2-6個碳原子的一直線或分支基團，此處分別意指為(C_2- C₂₂ )烯基、(C_2- C₈ )烯基與(C_2- C₆ )烯基。示範之烯基基團包括，但不限於乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁間二烯基(butadienyl)、戊二烯基(pentadienyl)、己二烯基(hexadienyl)、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基等。

如於此使用之措辭“炔基”意指一未飽和之直線或分支的碳氫化合物，其具有至少一個碳-碳三鍵，例如2-22、2-8或2-6個碳原子的一直線或分支基團，此處分別意指為(C_2- C₂₂ )炔基、(C_2- C₈ )炔基與(C_2- C₆ )炔基。示範之炔基基團包括，但不限於乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基與4-丁基-2-己炔基等。

如於此使用之措辭“芳基”意指一單、二-或其他多-碳環、芳香環(aromatic ring)系統。芳基基團視需要而定可融合至一或多個環，擇自芳基(aryl)、環烷基(cycloalkyl)與雜環基(heterocyclyl)。芳基基團可被以擇自烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、醯胺基、胺基、芳基、芳烷基(arylalkyl)、胺甲酸酯(carbamate)、羧基(carboxy)、氰基(cyano)、環烷基(cycloalkyl)、酯、醚、甲醯基(formyl)、鹵素、鹵烷基(haloalkyl)、雜芳基、雜環基、羥基(hydroxyl)、酮、硝基(nitro)、磷酸鹽、硫化物(sulfide)、亞磺醯基(sulfinyl)、磺醯基、磺酸(sulfonic acid)、磺化醯胺(sulfonamide)與硫酮(thioketone)的基團所取代。示範之芳基基團包括，但不限於，苯基、甲苯基(tolyl)、蒽基(anthracenyl)、茀基(fluorenyl)、茚基(indenyl)、薁基(azulenyl)與萘基(naphthyl)，及苯並基-融合之(benzo-fused)碳環部分，例如5,6,7,8-四氫化萘基(5,6,7,8-tetrahydronaphthyl)。示範之芳基基團也包括，但不限於，一單環芳香環系統，其中環包括6個碳原子，於此意指為“(C₆ )芳基”。

如於此使用之措辭“雜芳基”意指一單、二-或多-碳環、芳香環(aromatic ring)系統，其含有一或多個異原子，例如一至三個異原子，例如，氮、氧與硫。雜芳基可被一或多個取代基所取代，取代基包括烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、醯胺、胺基、芳基。芳烷基、胺甲酸酯、羧基、氰基、環烷基、酯、醚、甲醯基、鹵素、鹵烷基、雜芳基、雜環基、羥基、酮、硝基、磷酸鹽、硫化物、亞磺醯基、磺醯基、磺酸、磺化醯胺與硫酮。雜芳基可融合至非芳香族環。雜芳基基團之說明性例子包括，但不限於，啶基(pyridinyl)、噠嗪基(pyridazinyl)、嘧啶基(pyrimidyk)、吡唑(pyrazyl)、三嗪基(triazinyl)、吡咯基(pyrrolyl)、吡唑基(pyrazolyl)、咪唑基(imidazolyl)、(1,2,3)-與(1,2,4)-三唑基((1,2,3)-and(1,2,4)-triazolyl)、吡【口+井】基(pyrazinyl)、嘧啶鹼基(pyrimidilyl)、四唑基(tetrazolyl)、呋喃基(furyl)、噻吩基(thienyl)、異噁唑基(isoxazolyl)、三唑基、呋喃基、苯基、異噁唑基與噁唑基(oxazolyl)。示範之雜芳基基團包括，但不限於，一單環芳香環，其中環包括2至5個碳原子與1至3個異原子，於此意指為“(C_2-5 )雜芳基”。

如於此使用之措辭“雜環基”或“雜環(heterocycle)”意指飽和或未飽和3-、4-、5-、6-或7-員(membered)環，其含有一、二或三個異原子獨立地擇自氮、氧與硫。雜環可為芳香族的(雜芳基)或非芳香族的。雜環可被一或多個取代基所取代，取代基包括烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、醯胺、胺基、芳基、芳烷基、胺甲酸酯、羧基、氰基、環烷基、酯、醚、甲醯基、鹵素、鹵烷基、雜芳基、雜環基、羥基、酮、硝基、磷酸鹽、硫化物、亞磺醯基、磺醯基、磺酸、磺化醯胺與硫酮。雜環也包括雙環(bicyclic)、三環(tricyclic)與四環(tetracyclic)基團，於其中，任何上述之雜環的環融合至一或兩個環，其獨立地擇自芳基、環烷基與雜環。示範之雜環包括吖啶基(acridinyl)、苯并咪唑基(benzimidazolyl)、苯并呋喃基(benzofuryl)、苯并噻唑(benzothiazolyl)、苯幷噻吩基(benzothienyl)、苯並噁唑基(benzoxazolyl)、生物素基(biotinyl)、[口辛]啉基(cinnolinyl)、二氫呋喃基(dihydrofuryl)、二氫吲哚(dihydroindolyl)、二氫吡喃基(dihydropyranyl)、二氫噻吩(dihydrothienyl)、二氫噻唑(dithiazolyl)、呋喃基(furyl)等哌啶基(homopiperidinyl)、咪唑烷基(imidazolidinyl)、咪唑啉基(imidazolinyl)、咪唑基(imidazolyl)、吲哚基(indolyl)、異喹啉基(isoquinolyl)、異噻唑烷基(isothiazolidinyl)、異噻唑基(isothiazolyl)、異噁唑烷基(isoxazolidinyl)、異異噁唑基(isoxazolyl)、嗎啉基(morpholinyl)、噁二唑基(oxadiazolyl)、噁唑啶基(oxazolidinyl)、噁唑基(oxazolyl)、哌[口井]基(piperazinyl)、哌啶(piperidinyl)、吡喃基(pyranyl)、吡唑烷基(pyrazolidinyl)、吡嗪基(pyrazinyl)、吡唑基(pyrazolyl)、吡唑啉基(pyrazolinyl)、噠嗪基(pyridazinyl)、吡啶(pyridyl)、嘧啶鹼基(pyrimidinyl)、嘧啶基(pyrimidyl)、吡咯烷基(pyrrolidinyl)、吡咯烷基-2基(pyrrolidin-2-only)、吡咯啉基(pyrrolinyl)、吡咯基(pyrrolyl)、喹啉基(quinolinyl)、喹喔啉甲酰(quinoxaloyl)、四氫呋喃(tetrahydrofuryl)、四氫異喹啉(tetrahydroisoquinolyl)、四氫吡喃基(tetrahydropyranyl)、四氫喹啉基(tetrahydroquinolyl)、四唑基(tetrazolyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、噻唑烷基(thiazolidinyl)、噻唑基(thiazolyl)、噻吩(thienyl)、硫基嗎啉基(thiomorpholinyl)、噻喃基(thiopyranyl)與三唑基(triazolyl)。

措辭“酯”意指結構-C(O)O-、-C(O)O-R_j -、-R_k C(O)O-R_j -或-R_k C(O)O-，其中O不與氫鍵結，且R_j 與R_k 可獨立地擇自烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、醯胺、胺基、芳基、芳烷基、環烷基、酯、鹵烷基、雜芳基、雜環。R_k 可為氫，但R_j 不可為氫。酯可為環狀的，例如碳原子與R_j 、氧原子與R_k ，或Rj與Rk可被連接以形成一3-至12-員環。示範之酯包括，但不限於烷基酯(alkyl ester)，其中至少一個之R_j 或R_k 為烷基，例如-O-C(O)-烷基-、-C(O)-O-烷基-、-烷基-C(O)-O-烷基-等。示範之酯也包括芳基或雜芳基酯，例如，其中至少一個之R_j 或R_k 為一雜芳基基團，例如砒啶(pyridine)、噠嗪(pyridazine)、嘧啶(pyrmidine)與吡嗪(pyrazine)，例如一吡啶羧酸酯(nicotinate ester)。示範之酯也包括反式酯(reverse ester)，其具有結構-R_k C(O)O-，其中氧為與起源分子基團(parent molecular group)鍵結。示範之反式酯包括琥珀酸酯(succinate)、D-精氨酸甲酯(D-argininate)、L-精氨酸甲酯(L-argininate)、L-賴胺酸酯(L-lysinate)與賴胺酸酯(D-lysinate)。酯也包括羧酸酸酐(carboxylic acid anhydride)與酸鹵化物(acid halide)。

如於此使用之措辭“胺基”意指形式-NR_d R_e 或-N(R_d )R_e -，其中R_d 與R_e 獨立地擇自烷基、烯基、炔基芳基、芳烷基、胺甲酸酯、環烷基。鹵烷基、雜芳基、雜環基與氫。胺基可經由氮附著至起源分子基團。胺基也可為環狀，例如，R_d 與R_e 可與N共同或一起連結以形成一3-至12-員環，例如，嗎啉(morpholino)或哌啶(piperidinyl)。措辭胺基也包括任何胺基基團之對應的四級銨鹽(quaternary ammonium salt)。示範之胺基基團可包括烷基胺基基團，其中至少一個之R_d 與R_e 為烷基基團。

如於此使用之措辭“磺醯基”意指結構R_u SO₂ -，其中R_u 可為烷基、烯基、炔基、芳基、環烷基與雜環基，例如，烷基磺醯基。如於此使用之措辭措辭“烷基磺醯基”意指一烷基基團附著至一磺醯基基團。“烷基磺醯基”基團可視需要而定包含烯基或炔基基團。

“烷基、“烯基”、“炔基”與“胺基”基團可被至少一基團取代或中斷或分支，此至少一基團為擇自烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、醯胺基、胺基、芳基、芳烷基、胺甲酸酯、羧基、氰基、環烷基、酯、醚、甲醯基、鹵素、鹵烷基、雜芳基、雜環基、羥基、酮、硝基、磷酸鹽、硫化物、亞磺醯基、磺醯基、磺酸、磺化醯胺、硫酮、脲基(ureido)與氮。取代基可被分支以形成一經取代或未經取代之雜環或環烷基。連接物可為一烷基，其視需要定被一或多個異原子所中斷，異原子例如氧。在一些實施例中，連接物為聚乙二醇(PEG)。

如於此使用之措辭“適合之取代基”意指一基團，其不會使核苷酸類似物或用於製備它們之中間物(intermediates)的合成或酵素功效失效。適合之取代基的例子包括，但不限於C_1-22 、C_1-8 與C_1-6 烷基、烯基或炔基；C_1-6 芳基、C_2-5 雜芳基；C_3-7 環烷基；C_1-22 、C_1-8 與C_1-6 烷氧基；C₆ 芳烷基；-CN；-OH；氧基(oxo)；鹵素；羧基；胺基，例如，-NH(C_1-22 ,C_1-8 或C_1-6 烷基)、-N(C_1-22 ,C_1-8 與C_1-6 烷基)₂ 、-NH((C₆ )芳基)或-N((C₆ )芳基)₂ ；甲醯基；酮，例如-CO(C_1-22 ,C_1-8 與C_1-6 烷基)、--CO((C₆ 芳基)酯，例如-CO₂ (C_1-22 ,C_1-8 與C_1-6 烷基)與-CO₂ (C₆ 芳基)。根據核苷酸類似物的穩定性及生化與合成活性，熟悉此技藝人士可快速地選擇一適合的取代基。

措辭“可接受之鹽類”意指酸性或鹼性基團的鹽類，其可存在於在本發明組合物中使用的化合物中。可接受之鹽類包括鹽類，其不干擾於此完成之反應且不以其他形式不受歡迎。可接受之鹽類與它們之自由鹼基(free base)在活性上沒有區別，且可包括鹽類，其一般意指為藥學上可接受之鹽類，其為維持自由鹼基之生物活性的非毒性鹽類。包含於本發明組成物之為自然酸性的化合物，為具有與各種陽離子形成鹼基鹽(base salt)的能力。這些鹽類之例子包括鹼金屬或鹼土金屬，包括，例如鈣、鎂、鈉、鋰與鉀鹽。可接受之鹽類也可包括鋅、鐵、銨(ammonium)、銅、錳、鋁鹽與其類似物。可接受之鹽類也可為衍生自有機非毒性鹼基的那些，且也可包括一級、二級與三級胺(amine)、經取代之胺，其包括自然發生之經取代的胺、環胺與鹼性離子交換樹脂，例如異丙胺(isopropylamine)、三丙胺(tripropylamine)、乙醇胺(ethanolamine)、2-二乙胺乙醇(2-diethylaminoethanol)、2-二甲基乙醇胺(2-dimethylaminoethanol)、二環己胺(dicyclohexylamine)、賴胺酸(lysine)、麩胺酸(glutamine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)、咖啡因(caffeine)、普魯卡因(procain)、哈胺(hydrabamine)、膽鹼(choline)、甜菜鹼(betaine)、乙二胺(ethylenediamine)、葡萄糖胺(glucosamine)、甲基葡萄糖胺(methylglucamine)、可可鹼(theobromine)、嘌呤(purine)、哌嗪(piperazines)、哌啶(piperidine)、多胺樹脂(polyamine resin)與其類似物。此外，鹽類可從具有嘌呤，特別是鳥嘌呤或嘧啶間之鹼性中心的特定有機與無機酸的添加來形成。最後，於此敘述之化合物之實施例包括它們之未離子化及兩性離子(zwitterionic)形式及/或水合物(hydrate)或溶劑合物(solvate)。

一螢光團與一反應分子或部分的組合，其包括淬熄分子或部分，已知為“螢光共振能量轉移(FRET)配對”。螢光共振能量轉移配對互相作用的機制需要配對之一成員的吸收光譜與其他成員，第一螢光團，之發射光譜部分重疊。若互相作用之分子或部分為一淬熄基團，其吸收光譜必須與螢光團之發射光譜部分重疊(Stryer,L.,ANN. REV. BIOCHEM. 47: 819-846(1978);C. R. Cantor and P. R. Schimmel,“Biophysical Chemistry-part II: Techniques for the Study of Biological Structure and Function,”W. H. Freeman and Co.,San Francisco,U.S.A.,1980(pages 448-455)；與Selvin,P.R.,METHODS IN ENZYMOLOGY,246: 300-335(1995))。有效之螢光共振能量轉移互相作用要求配對物之吸收與放射光譜具有大程度的部分重疊。螢光共振能量轉移互相作用的效率與此部分重疊成線性比例(參見Haugland,R.P.,et al. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA,63: 24-30(1969))。一般而言，需要一大量級(magnitude)的訊號(即，一高程度之部分重疊)。因此，根據此基礎典型地來選擇包括螢光團-淬熄基團配對的螢光共振能量轉移配對。

對於選擇用於特定探針之適合的螢光共振能量轉移提供者-接受者配對而言，可實施的指南為在文獻中立即可獲得的，由下列之參考文獻所示例：Pesce et al.,Eds.,“Fluorescence Spectroscopy,”Marcel Dekker,New York,1971;White et al.,“Fluorescence Analysis: A Practical Approach,”Marcel Dekker,New York,1970。文獻也包括參考文獻，其提供螢光與色原質(chromogenic)分子的詳盡列表與它們用於選擇報告體-淬熄體配對(reporter-quencher pairs)的有關光學特性(參見，例如，Berlman,HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES,2ND EDITION,Academic Press,New York,1971;Griffiths,COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES,Academic Press,New York,1976;Bishop,Ed.,INDICATORS,Pergamon Press,OxfOrd,1972;Haugland,HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS,Molecular Probes, Eugene, 1992; Pringsheim,FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE, Interscience Publishers,New York,1949)。此外，文獻提供豐富之指南，其關於為了經由可添加至一核苷酸類似物之共同反應基團的共價附著而使報告體與淬熄體分子衍生化(參見，Haugland(supra)；美國專利號3,996,345與4,351,760)。

在一些實施例中，核苷酸類似物各包括一鹼基配對部分於其5’端，其包括一核苷酸類似物，核苷酸類似物包括一鹼基，鹼基具有與在反應複合物之一反應位置中之目標核酸的一對應鹼基鹼基配對的能力。在核苷酸類似物併入新生股之時，藉由偵測在標記部分中之對應的光可偵測標記，可測定經併入之核苷酸類似物的第一鹼基的身份。

在一些實施例中，核苷酸類似物各包括一鹼基配對部分於其5’端，其包括兩個核苷酸殘基，每個核苷酸殘基包括一鹼基，鹼基具有與在反應複合物之一反應位置中之目標核酸的對應鹼基鹼基配對的能力。在核苷酸類似物併入新生股之時，藉由偵測在標記部分中之對應的光可偵測標記，可測定經併入之核苷酸類似物的首兩個鹼基的身份。

在一些實施例中，核苷酸類似物各包括一鹼基配對部分於其5’端，其包括三個核苷酸殘基，每個核苷酸殘基包括一鹼基，鹼基具有與在反應複合物之一反應位置中之目標核酸的一對應鹼基鹼基配對的能力。在核苷酸類似物併入新生股之時，藉由偵測在標記部分中之對應的光可偵測標記，可測定經併入之核苷酸類似物的首三個鹼基的身份。

於此敘述之方法中使用的核苷酸類似物之類型的數目可為4^N 類型之核苷酸類似物，其中N為在各類似物之5’端的鹼基配對部分中之核苷酸殘基的數目，而類似物為具有與目標核酸之一對應鹼基鹼基配對的能力。例如，類似物可為單核苷酸，其各含有一個鹼基B₁ ，B₁ 為具有與目標核酸之一對應鹼基鹼基配對的能力(參見，例如，實施例5以下與式VI)。其中於定序反應中使用複數種類型之單核苷酸，互補之鹼基B₁ 的數目N為1，因此一模板核酸連同一聚合酶與一定序引子被以4¹ ，或4種類型之單核苷酸類似物接觸，其中各類型包含四種鹼基腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶(或尿嘧啶)與鳥嘌呤之一做為鹼基B₁ 。其中需要的是，四種類型之類似物的各個可包括一獨特之對應於鹼基B₁ 之身分的螢光標記F。

在一些實施例中，類似物為二核苷酸，其中於類似物之5’端的一鹼基配對部分為一核苷酸殘基，其具有一互補之鹼基B₁ ，且其中連結至鹼基配對部分之3’位置的一標記部分為一核苷酸殘基，其包括一非互補之基團X₁ 與一螢光標記F，如於此所敘述(參見，例如，實施例1，以下與式II)。根據此類實施例，互補之鹼基B₁ 的數目N為1，因此一模板核酸連同一聚合酶與一定序引子被以4¹ ，或4種類型之二核苷酸類似物接觸，其中各類型包含四種鹼基腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶與鳥嘌呤之一做為鹼基B₁ 。其中需要的是，四種類型之類似物的各個可包括一獨特之對應於鹼基B₁ 之身分的螢光標記F。

在一些實施例中，類似物為三核苷酸，其中於類似物之5’端的一鹼基配對部分包括兩個核苷酸殘基，其分別具有互補之鹼基B₁ 與B₂ ，且其中連結至鹼基配對部分之3’位置的一標記部分為一核苷酸殘基，其包括一非互補之基團X₁ 與一螢光標記F，如於此所敘述(參見，例如，實施例9，以下與式X)。根據此類實施例，互補之鹼基B₁ 與B₂ 的數目N為2，因此一模板核酸連同一聚合酶與一定序引子被以4² ，或十六種類型之二核苷酸類似物接觸，其中各類型包含腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或鳥嘌呤之兩個連續之鹼基的十六種組合之一為鹼基B₁ 與B₂ ，且其中十六種類型之類似物的各個包括一獨特之對應於鹼基B₁ 與B₂ 之連續組合的螢光標記F。

1.5　類似物之製備

鹼基連接與磷酸鹽連接螢光團與淬熄體為本技術領域所熟知。例如，從Life Technologies(San Diego,California),Sigma-Genosys(The Woodlands,Texas)、AnaSpec(Fremont,CA)、Eurofins MWG Operon(Huntsville，Alabama)、Glen Research(Sterling,Virginia)或Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)可獲得它們。鹼基連接螢光團的例子包括，但不限於，經修飾之胸腺嘧啶或尿嘧啶鹼基，其中螢光團被附著在，例如，尿嘧啶基團之5-位置。可使用各種長度之連接物來使螢光團附著至鹼基。

在一些例子中，藉由核苷酸類似物的後合成修飾(post-synthesis modification)，將鹼基連接螢光團併入核苷酸類似物，而核苷酸類似物隨著連接至一非互補鹼基的反應基團被合成。此類反應基團包括，但不限於胺基基團(其可與，例如一經活化之羧酸或一N-琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide)反應)；疊氮(azide)或炔基基團(其可分別與一炔(alkyne)或疊氮反應，在一“即合(click)”三唑形成反應(triazole-forming reaction)中)；或醛(aldehyde)(其可與胺基基團反應以形成一Schiff’s鹼基，與肼基(hydrazine)基團反應以形成腙(hydrazone)，且與半卡肼semicarbazide以形成5-硝糠醛半卡腙(semi-carbazones))。

於一定序反應混合中之核苷酸類似物的濃度可為任何適合之濃度，其產生一適合之中介脈衝持續期間。一“中介脈衝持續期間”意指介於連續訊號之間的一時間，而連續訊號係偵測自在一聚合酶之併入位置中與增長之股連結及變為被併入增長之股中的一經標記核苷酸類似物。當用於藉由聚合酶鏈鎖反應之核酸擴增的核苷酸濃度典型地為約200 μM，且當用於循環定序的濃度為約400 μM時，於單一分子定序中使用之經標記核苷酸的濃度通常低得多，例如約250 nM。在一些實施例中，於定序反應中使用之核苷酸類似物的濃度為從約50 nM至10 μM。在些實施例中，核苷酸類似物的濃度為小於50 nM，或大於10 μM。在一些實施例中，核苷酸類似物之濃度為從約50 nM至約500 nM，從約75 nM至約400nM，從約100 nM至約300 nM，或從約125 nM至約250 nM。在一些實施例中，核苷酸類似物的濃度為約250 nM。在一些實施例中，中介脈衝持續期間為從約0.2秒至約1秒。在一些實施例中，中介脈衝持續期間為小於0.2秒，或大於1秒。在一些實施例中，中介脈衝持續期間為從約0.2秒至0.6秒。在一些實施例中，中介脈衝持續期間為從約0.3秒至約0.5秒。

在一些實施例中，使用於此揭露之四種類型之核苷酸類似物來執行定序，各種類型包括一與其他不同之鹼基(腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶/尿嘧啶)，藉由其獨特之可偵測標記來區別。自併入位置偵測之四種獨特標記的時間的次序或時間順序為指明一或多種之鹼基併入新生股的順序，且因此允許模板之核酸序列的推論，而模板具有目標分子的序列。

在一些實施例中，使用少於四種標記來執行主題定序程序。例如，使用於此揭露之三種類型的單核苷酸或二核苷酸類似物，各種類型包括一與其他不同之鹼基，藉由其獨特之可偵測標記來區別，且一第四種類型之核苷酸類似物不包括可偵測標記。藉由偵測上述三種標記，伴隨第四種標記被偵測為介於觀察到兩個經標記核苷酸類似物之間的一長的延遲，之後可測定出序列。

也可以於此揭露之兩種類型之單核苷酸或二核苷酸類似物來執行主題定序方法，各種類型包括一與其他不同之鹼基，藉由其獨特之可偵測標記來區別，且一第三與一第四種類型之核苷酸類似物不包括可偵測標記。藉由將模板股與其互補物(complement)定序可推論出模板的序列與由此之目標核酸。或者，可以不同配對之經標誌二核苷酸類似物(例如第一對之經標記二核苷酸，其包括嘧啶C與T，及第二對之經標記二核苷酸，其包括嘌呤A與G，或以在含A、T、C與G之核苷酸中之任何其他可能配對的排列(permutation))來將模板股被至少定序兩次。其他變化為使用單-或二-核苷酸類似物之組，其中兩種類型之核苷酸類似物包括一種之可偵測標記，而其他兩種類型之核苷酸類似物包括一第二種之可偵測標記。使用兩種可偵測標記之定序方法的進一步描述可發現於Sauer et al.,“Detection and Identification of Single Dye Labelled Mononucleotide Molecules Released From an Optical Fiber in a Microcapillary: First Steps Towards a New Single Molecule DNA Sequencing Technique,”PHYS. CHEM. CHEM. PHYS. 1:2471-77(1999)。

使用以一第一可偵測標記來標記之一種類型之單-或二-核苷酸類似物，與以一第二可偵測標記來標記之其他三種類型之單-或二-核苷酸類似物可執行主題定序方法。藉由將模板分子至少定序三次，每次以包括一獨特之可偵測標記的一不同核苷酸類似物，可推論出序列。需注意的是，一等同方法可使用三種類型之單-或二-核苷酸類似物，其各包括相同之可偵測標記與一第四之-二核苷酸類似物，其不包括可偵測標記。

在一些相關但有區別之實施例中，使用於此敘述之三核苷酸類似物來執行定序，其中各個三核苷酸類似物包括兩個核苷酸，其可與一模板分子鹼基配對，以使各個三核苷酸類似物與一不同之二核苷酸序列互補。就其本身而言，具有十六種類型之可能的三核苷酸類似物。在本發明之一些實施例中，使用十六種不同之可偵測標記來在三核苷酸類似物之間進行區分。在一些實施例中，藉由不同方法可偵測標記。對於經螢光標記之三核苷酸類似物而言，不僅以發射波長也以其他參數來區分是可能的，其他參數包括但不限於螢光壽命(lifetime)與螢光強度。

在一些實施例中，使用少於16種可偵測標記可執行定序。螢光團與其周遭分子環境(例如，在附近的鹼基)的互相作用可影響螢光團之特性為本技術領域所周知。例如，比起香豆素(coumarin)-CTP，香豆素-dGTP具有一較短的螢光壽命。因此，使用相同之螢光標記可區分多種三核苷酸類似物。

在其他實施例中，一些三核苷酸類似物可包括相同之可偵測標記及/或一些三核苷酸類似物可不包括可偵測標記。藉由以三核苷酸類似物與可偵測標記的不同組合將模板分子重新定序多次，可之後測定出序列。例如，以一組之三核苷酸類似物可執行一第一定序循環，其中類似物包括與模板互補之兩個鹼基，例如腺嘌呤為5’鹼基配對單元(AA、AC、AG或AT，全體為A-次組(subset))、胞嘧啶為5’鹼基配對核苷酸(CA、CC、CG或CT，全體為C-次組)、鳥嘌呤為5’鹼基配對核苷酸(GA、GC、GG或GT，全體為G-次組)與胸線嘧啶為5’鹼基配對核苷酸(TA、TC、TG或TT，全體為T-次組)。這些三核苷酸的次組各攜帶一與其他不同之標記，例如Alexa Fluor 405用於A-次組，Alexa Fluor 488用於C-次組，Alexa Fluor 546用於G-次組與Alexa Fluor 635用於T-次組。以這些組的三核苷酸類似物執行定序可因此測定出模板股之每第二鹼基的身份。之後使用一第二組之經標記三核苷酸類似物可執行第二定序循環，其中類似物腺嘌呤為第二、下游鹼基配對單元(即，其中類似物包括序列AA、CA、GA或TA)、胞嘧啶為下游鹼基配對單元(AC、CC、GC或TC)、鳥嘌呤為下游鹼基配對核苷酸(AG、CG、GG或TG)與胸線嘧啶為下游鹼基配對核苷酸(AT、CT、GT或TT)。類似第一組，於第二回合之定序中的各次組攜帶一與其他不同之標記。以此第二組之三核苷酸類似物執行第二定序循環可顯示剩餘部分之模板股的身份，因此測定出模板之完整序列。用於第二定序循環的另一可能方案為，使用與第一定序循環相同組的三核苷酸類似物，但伴隨著以一奇數數目之核苷酸來在長度上與第一定序循環中使用之引子產生區隔的一引子，此引子包括，但不限於，短7個核苷酸、短5個核苷酸、短3個核苷酸、短1個核苷酸、長1個核苷酸、長3個核苷酸、長5個核苷酸、長7個核苷酸。在此方案中，僅以奇數數目之核苷酸來在長度上產生區隔之引子，允許鑑定出其在第一回合之定序反應中沒有顯示身份之在模板股中的第二鹼基。於本發明中具體化者為其他替代方案，其包括將經標記三核苷酸的組進行變化，使用一或更少的定序循環，及/或使用不同組合之可偵測標記。

對於藉由合成之單一分子定序而言，本發明之方法可提供具有重新定序單一分子之能力的優勢。例如，可以環狀形式來提供要被定序之一模板核酸分子，連同一定序引子。藉由執行複數個定序循環可達成重新定序以獲得一序列讀出，此序列讀出大於在模板核酸分子中之核苷酸的數目。所以此定序讀出包括一資訊，其多餘地鑑定出在模板核酸分子中之至少一個位置中的鹼基。在一些實施例中，定序讀出包括一資訊，其多餘地鑑定出至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之在模板核酸分子中的鹼基。在一些實施例中，定序讀出包括一資訊，其鑑定出至少25%,50%,75%,90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之在模板核酸分子中的鹼基，以2倍、3倍、4倍、5倍、7倍或10倍或更多的多餘量(redundancy)。藉由將相同之分子進行定序，定序錯誤被預期以定序讀出之數目的次方下降。例如，若一單一讀出之每個鹼基的錯誤率為10^-3 ，之後在三個讀出後，其下降至(10^-3 )³ ，即10^-9 。此對於單一分子定序而言，在用於定序之核苷酸失去其標記而導致，例如假性刪除(spurious deletion)的情況中，是特別有利的。

其中所需要的是，在核酸聚合反應期間，可以一不同之酵素組取代聚合酶酵素或酵素複合物。相似地，在核酸聚合反應期間，包括核苷酸類似物之試劑與緩衝溶液也可被取代或再補充。

1.6額外的應用

在一些實施例中，螢光標記核苷酸類似物可扮演對於附著至一聚合酶之提供者發色團(chromophore)的一接受者發色團。因此，在這些實施例中，設置於聚合酶之提供者發色團可激發於一增長之核酸股上的一接受者發色團，而增長之核酸股為從目標核酸複製。由於在螢光共振能量轉移效能中的快速減少，不接近聚合酶之螢光標記核苷酸類似物可能不被激發。在一些實施例中，提供者分子可為，例如，另一螢光團，例如，一量子點。量子點，例如半導體量子點，為本技術領與所知，且敘述於，例如，國際公開號WO 03/003015。結合量子點至，例如生物分子的方法為本技術領域所知，且分別於Mednitz et al.,NATURE MATERIALS 4:235-46(2005)與公開於2006/3/30與2008/4/17之美國專利公開號2006/0068506與2008/0087843中回顧。在一些實施例中，可將量子點結合至一DNA聚合酶分子。熟悉此技藝人士可瞭解，當將螢光團結合至，例如一DNA聚合酶時，必須小心，藉由減少將螢光團結合於酵素第一、第二或第三結構上的任何影響來維持酵素功能。

1.7　多光子激發

在一些實施例中，可由兩個或更多之光子激發一螢光團。例如，在一些實施例中，於FRET中，不是提供者就是接受者螢光團之激發係經由兩個或更多之光子。兩個光子與多光子激發更進一步敘述於，例如美國專利號6,344,653與5,034,613中。

1.8　目標序列

目標序列包括要藉由本發明方法所測定的序列。可使用主題之發明來將廣大種類的目標核酸進行定序。目標序列可包括一完全未知的序列(例如，重新(de novo)定序)、一部份未知序列(例如，對於SNP之鑑定)或可為完全已知(例如，確認一轉錄產物或鑑定供替換的切割位(splice site))。在一些實施例中，目標序列可包含被重複未知數目之次數已知序列，其例如可被使用於DNA指紋分析(DNA fingerprinting)、端粒分析(telomere analysis)及/或特定基因疾病之診斷。目標序列可包括核糖核酸(RNA)及/或去氧核糖核酸(DNA)，包括，但不限於此類核酸之經修飾的變化，例如用於亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing)的CpG甲基化。

目標序列可分離自一生物樣本，其包含其他成分，例如蛋白質、脂質、糖與非目標核酸。可從任何細胞材料來獲得樣本，樣本包括，但不限，於自一動物、植物、細菌、真菌與細胞培養獲得的那些。樣本可直接獲自組織、體液樣本或其他樣本，包括，但不限於血液、淋巴液、尿液、腦脊髓液(cerebrospinal fluid)、精液(seminal fluid)、唾液、痰與糞便。樣本也可獲自被病毒或其他細胞內病原體感染的組織，或獲自病毒之顆粒、樣本或製備物。產生樣本與萃取核酸序列之方法為本技術領域所熟知。

在一些實施例中，可將樣本之核酸成為碎片並以其他方式修飾以產生適合之長度的片段或組成物以做為定序之目標序列。藉由本技術領域已知的任何方法，可執行破碎與修飾，包括，但不限於，音波震動處理(sonication)、限制酵素分解(restriction enzyme digestion)、連接至其他核酸序列，與共價連接至其他分子或固體支持器。

在一些實施例中，目標序列可包括非自然序列，質體的部分或人工產生標籤(tag)。目標序列可為一序列之混合物，包括，但不限於，萃取自一生物樣本的總RNA(total RNA)、一cDNA資料庫(cDNA library)或基因體DNA(genomic DNA)。目標序列可為任何長度，例如，於長度上介於5個鹼基與50 kb之間、於長度上介於5個鹼基與20 kb之間。

在一些實施例中，目標序列可構成模板序列全部或部分，其為一股，做為藉由聚合酶之本發明核酸合成的模板。

模板包括至少一用於擴增的目標序列與視需要而定額外的序列，其可被用於引子雜合(primer hybridization)、模板固定化(template immobilization)、探針雜合(probe hybridization)、其他目的或留下未使用。模板可為任何形狀，包括，但不限於，線性、環狀與超螺旋(supercoiled)。模板可為單股、雙股、具有單股區域(例如於一髮夾環(hairpin loop)中)之雙股、缺口的(nicked)或經修飾的(例如藉由甲基化)，且可包含RNA、DNA或非自然核苷酸。如上述，為了聚合酶可將模板固定至一表面或模板可為以溶液形式自由的。例如，經由雜合至一經固定、互補的寡核苷酸，或其一些組合，固定化可發生於5’端、3’端、沿著序列之任何地方。

適合用於偵測之目標核酸可包括任何核酸，包括，例如DNA、RNA或PNA(peptide nucleic acid(胜肽核酸))，且可含有任何序列-已知與未知，包括自然發生或人工序列。核酸可被自然取得、重組產生或化學合成。核酸可包括自然發生核苷酸、不存在於自然的核苷酸類似物或經修飾的核苷酸。基於實際應用，被偵測之核酸的長度可多樣化。在一些實施例中，核酸包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000個鹼基或更多。在一些實施例中，核酸可為自10至20、自10至50、自10至100、自50至100、自50至500、自50至1000、自50至5000、自500至2000、自500至5000，或自1000至5000個鹼基，或自5個鹼基至20 kb，或自5個鹼基至50 kb。

用以偵測之目標核酸可為單股。藉由本技術領域所知的方法，例如加熱或鹼或其他化學處理，可自一雙股模板分子獲得單股核酸。藉由例如化學或in vitro 合成，也可產生單股核酸模板。

在一些實施例中，要被偵測之核酸可為環狀。在一些實施例中，方法包括，提供包括具有一已知序列之插入的一環狀核酸分子，其可被使用為對於一引子的結合位。可以一單股狀態、一雙股狀態或兩種狀態之混合來提供環狀核酸分子，且環狀核酸分子一般包括至少一共價封閉股(covalently closed strand)。雙股環狀分子可包括一缺口股或一第二共價封閉股。

在一些實施例中，藉由從環狀核酸分子之來源以環狀形式分離出環狀核酸分子來提供環狀核酸分子，若其序列之部分為已知且因此可做為核酸插入物的話(例如，在包含於環狀分子中之一基因的序列內的保守部分可為已知，或分子被已知為包含一序列，根據其在高度嚴厲條件下與另一已知序列之核酸雜的能力)。在一些實施例中，僅為不確切地得知核酸插入物之序列，此類例子為當序列資訊係來自嚴厲雜交特性時。在一些實施例中，確切地得知核酸插入物之序列，此類例子為當環狀核酸分子具有一已知骨幹序列(backbone sequence)或已被工程設計來包含一已知序列時。

在一些實施例中，藉由執行in vitro反應以將一線性核酸樣本併入一伴隨核酸插入物的環狀分子，來提供環狀核酸分子。在一些實施例中，in vitro反應包括藉由一連接酶之連接及/或其他之股連接反應，例如其可藉由各種酵素催化，包括重組酵素(recombinase)與拓樸異構酶(topoisomerases)。可使用DNA連接酶或RNA連接酶以酵素性地連接一線性模板之兩端，偕同或不偕同一接合物(adapter)分子或連接物，來形成一環狀。例如，如於Tessieret al .,ANAL. BIOCHEM.,158: 171-78(1986).CIRCLIGASE(TM)(Epicentre,Madison,Wis.)中所述之結合單股DNA或RNA的T4 RNA連接酶，也可被用來催化一單股核酸的連接。或者，也可使用一雙股連接酶，例如E. coli 或T4 DNA連接酶，來執行環狀化反應。

在一些實施例中，提供環狀核酸分子包括藉由從至少一包括互補區域的引子(其可包括具有5’封蓋(flap)之已知序列的隨機引子，已知序列可做為一核酸插入物)延伸來複製一核酸模板，與使經擴增之核酸成為環狀，例如可由連接酶或重組酵素來催化；在一些實施例中，在環狀化之前，例如可藉由限制(restriction)或磷酸化來處理經擴增之核酸於其末端。

在一些實施例中，藉由執行化學環狀化來提供環狀核酸分子。化學方法使用已知偶合劑(coupling agent)，例如BrCN加上咪唑(imidazole)與二價金屬、N-氰咪唑(N-cyanoimidazole)伴隨ZnCl₂ 、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二酰亞胺，鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide HCl)與其他碳二醯亞胺(carbodiimide)與羰基二咪唑(carbonyl diimidazole)。藉由將一5’磷酸鹽與一3’羥基，或5’羥基與一3’磷酸鹽縮合也可連接一線性模板的末端。

在一些實施例中，環狀核酸分子包含一插入序列，由於此分子為環狀，插入序列可被視為一末端連接引子(下方討論)，只是其不在末端。

在一些實施例中，目標核酸序列包括一或多個序列重複。一“序列重複”意指至少3個相同類型之連續核苷酸鹼基的延伸(stretch)、或者至少3個連續核苷酸鹼基的延伸，其於一所提供之目標核酸中至少被重複一次。例如，一序列重複可為含A核苷酸(例如，(A)n)、含T核苷酸(例如，(T)n)、含C核苷酸(例如，(C)n)或含G核苷酸(例如，(G)n)的延伸，其中n為3、4、5、6、7、8、9、10之整數或更大。在一些例子中，n為介於3至10、介於3至300、介於3至15、3至30、3至150之整數。

2.　偵測系統

於此揭露之定序方法的實施，一般包括使用一偵測器以偵測來自一被併入之核苷酸類似物的訊號，而此核苷酸類似物係以一模板依賴方式藉由聚合酶酵素或酵素複合物被併入。當執行核酸聚合反應時，可執行此類偵測以登記對應於連續合併事件之訊號的時間次序。

任何適合之偵測器或其系統可提供一偵測位置，其包含反應複合物，反應複合物包括一聚合酶酵素或酵素複合物，與一模板。介於在偵測位置中標記部分的起始偵測與從偵測位置之標記部分的移除之間的時間為“偵測期間偵測期間(detection duration)”。偵測期間之長度可變化，例如，隨著反應條件、使用之聚合酶與核苷酸類似物，且也可遭受在單一酵素動力學中之隨機變異(stochastic variation)的影響。在一些實施例中，相較於其標記係經由酵素或酵素聚合物之5’至3’聚合活性被移除的一經標記核苷酸類似物，於本發明中使用之核苷酸類似物提供一經延長之偵測期間。例如，偵測期間可以至少1、5、10、20、50、100、200、500、1000倍或甚至更高來被延長。在一些方面，使偵測期間維持了從約30毫秒至約300毫秒，或從約50毫秒至約250毫秒。在一些方面，偵測期間可不小於約30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300毫秒。在一些實施例中，兩個連續之偵測步驟(對應於以模板依賴方式之兩個連續的併入事件)平均被以，例如約0.2至約1秒、從0.2至約0.6秒，或從0.3至約0.5秒分隔。在一些實施例中，本發明之方法可在藉此任何兩個連續之偵測步驟被以至少約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1秒分隔的狀態下被執行。

具有提供單一分子偵測之能力的任何偵測器或其系統可使用於本發明。偵測器或偵測器系統的選擇可取決於在核酸聚合反應中使用的標記種類而定。可設置偵測器以偵測放射線(radioactivity)、化學冷光(chemiluminesce)、酵素活性(enzymatic activity)、導電度(conductivity)、電荷(charge)及/或螢光(fluorescence)。

在實施於此揭露的定序方法中，可使用廣泛種類之偵測系統。它們包括，但不限於，在2011/3/11提申、題名為“單一分子偵測系統與方法(Single-Molecule Detection System and Methods)”的美國專利申請號13/046,457中描述的偵測系統。簡單而言，使用於此揭露之方法要被來定序的一目標核酸，係設置於為一核酸合成反應複合物之部份的可移動光耦合器上。此種系統利用零階波導(ZMW)以促進單一分子偵測，藉由例如，產生一經定義之激發光場與使用一奈米尺度孔洞以將反應體積最小化，藉此大幅地使背景訊號最小化。對於與在此敘述之方法一起使用而言，合併零階波導之適合的偵測系統也包括於2010/6/11提申之美國專利申請號12/801,503；2010/7/29提申之美國專利申請號12/805,411；美國專利號6,917,726；7,170,050；與7,486,865；及Eid,J.,et al.,SCIENCE,323: 133-138(2009)中所描述的系統。於美國專利號7,767,441與美國專利申請號13/046,457中描述了兩種其他適合的偵測系統。在一些實施例中，偵測系統包括一光照來源(illumination source)、一偵測器與一波導(waveguide)。在一些實施例中，波導包括一奈米孔洞(nanowell)或其他微流體結構(microfluidic structure)，其可將一定序複合物維持在一夠小的體積中，以選擇成像(selective imaging)發生聚合的反應位置。在其他實施例中，偵測系統可包括一可移動光耦合器、一偵測器與一波導，其中波導包括一對於可移動光耦合器的一接合位置(adapter site)。偵測系統可執行定序位置之連續或同時發生的偵測。在一些實施例中，一獨立奈米孔洞之小的尺寸或覆蓋區(footprint)促進了定序之高度有效平行化(parallelization)，其可增加輸出量(throughput)及/或靈敏度。例如，一偵測系統可包括一或多個波導，其各包括數以百計至千計的接合位置。

可設置包含於一偵測系統中的光源來發射光，之後可將其至少部分結合進一波導為做一激發光以激發目標物(object)。光源可為，例如雷射，例如He-Ne雷射與雷射二極體(laser diode,LD)、發光二極體(light emitting diode,LED)、有機發光二極體(organic light emitting diode,OLED)、量子點發光二極體(quantum dot light emitting diode,QLED)、光纖(fiber light)或弧光放電螢光燈(arc discharge fluorescent lamp)。偵測系統可包括一光源耦合器(light source coupler)。光源耦合器可將至少一部份發射自至少一光源的光連接進入光導。光源耦合器可為，例如一稜鏡耦合器(prism coupler)、光柵耦合器(grating coupler)、側面注入耦合器(side-injection coupler)、垂直注入耦合器(vertical-injection coupler)或同向耦合器(co-directional coupler)。第1圖顯示適合本發明之一偵測系統的實施例，包括一控制器單元其控制一光源，光源產生光，其穿過波導以照射一樣本，且藉由一光偵測器偵測從此樣本發射出的光，光偵測器產生一資料訊號，其可視需要而定被傳送至一外部裝置，例如一電腦伺服器。視需要而定，介於控制器單元與電腦伺服器之間可具有雙向溝通，例如以允許遠端存取或控制(remote access or control)。

2.1波導

波導可為一通道波導(channel waveguide)或一平面波導(planar waveguide)。波導可包括一核層(core layer)與至少一被覆層(cladding layer)。例如，若波導為一通道波導，則其可包括一核層與圍繞核層的一被覆層。如另一實施例，若波導為一平面波導，則其可包括一核層與設置於核層上的一被覆層或將核層夾於中間的兩層被覆層。核層可具有比上述之至少一被覆層高的折射係數(refractive index)。激發光可在波導之核層中延長。適合使用於偵測系統之示例的波導與其特定結構被描述於2010/3/9提申之美國專利申請號12/720,352；2010/6/11提申之美國專利申請號12/801,503；與2010/7/29提申之美國專利申請號12/805,411中。

偵測系統可包括一波導，其包括對於一可移動光耦合器的至少一接合位置，於以下更詳細敘述。接合位置可至少被形成於波導的至少一被覆層中。接合位置可為一奈米孔洞，其包括一上開口與一下表面，其中上開口可大於下表面。奈米孔洞可延伸穿過上述至少一被覆層的部分厚度、上述至少一被覆層的全部厚度、上述至少一被覆層的全部厚度與上述核層的部分厚度，或上述至少一被覆層的全部厚度與上述核層的全部厚度。有效激發區域之下方界線可為奈米孔洞的底部。藉由在奈米孔洞接合位置中激發光以垂直於核層之縱向方向的方向(例如，垂直方向)可到達的距離，可定義有效激發區域的上方界線。

偵測系統之波導構成要素可包括複數個接合位置。因此，也可使用此系統來監測大量的目標物。在一些實施例中，可於波導中形成複數個接合位置。在一些實施例中，對於複數個接合位置之各個而言，可形成光偵測器，以在接合位置的有效激發區域內，偵測從一目標物發射的光。在一些實施例中，可使用一個光偵測器以在複數個接合位置的有效激發區域內偵測從目標物發射的光。

2.2　可移動光耦合器

偵測系統之實施例包括一可移動光耦合器，其具有使一單一分子目標物設置於波導之至少一個接合位置的能力。可移動光耦合器可為一奈米尺度顆粒。可移動光耦合器可為一奈米尺度球體或一非球體奈米尺度顆粒。當光耦合器靠入於在波導中的一接合位置時，適合單一分子偵測之的一狹窄的激發空間(一有效激發空間)可之後形成，且要被偵測之目標物可被設置於此狹窄的空間內。當一可移動光耦合器靠入一接合位置時，其可避免一第二光耦合器靠入於相同的接合位置。

可移動光耦合器可包括至少一特性，藉由此特性光耦合器可被吸引至接合位置，此特性包括，例如，一表面特性或一磁性特性以促進靠入。在一些實施例中，光耦合器可包括至少一特性，藉由此特性光耦合器可被設置於在一特定定向(orientation)中的至少一個接合位置。藉此光耦合器可被設置於在一特定定向(orientation)中的至少一個接合位置的適合特性，可包括不對稱表面特性(asymmetric surface property)。在一些實施例中，光耦合器可使一單一分子目標物設置於，在接合位置內鄰近波導之核層的表面的一狹窄空間中，其中一目標物被設置於一有效激發區域中，有效激發區域被形成於接合位置內來自藉由沿著波導之核層延伸之一光波所誘發的一光場。

可移動光耦合器可為一同質固體(homogenous solid)、一膠體或多孔固體，或由具有聚合物主幹(polymer backbone)之材料所組成的固體。在一些實施例中，多重功能可移動光耦合器包括一或多個金屬材料，其包括，例如金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉑(Pt)、鎳(Ni)、鉻(Cr)或一金屬合金。在一些實施例中，光耦合器包括一或多個氧化物材料，其包括，例如TiO₂ 、Ta2O₅ 、Nb2O₅ 、SiO₂ 、HfO₂ 、Al2O₃ 、ZrO₂ 、ZnO、V2O₅ 、CeO₂ 、CdO、Fe₂ O₃ 、Fe₃ O₄ 、Cu₂ O、CuO、In₂ O₃ 、La₂ O₃ 、MoO₃ 或WO₃ 。在更進一步之實施例中，光耦合器包括一或多個硫化物材料，其包括，例如CdS、ZnS、PbS、Au₂ S或Ag₂ S。在一些實施例中，光耦合器包括一或多個硒化物材料，其包括，例如CdSe、ZnSe或PbSe。在一些實施例中，光耦合器包括一或多個氮化物材料，其包括，例如Si₃ N₄ 、TiN、BN與GaN。在更進一步之實施例中，光耦合器包括一或多個聚合物材料，其包括，例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)、聚磷睛(polyphosphazene)、聚丙交酯(polylactide)、聚乳酸-聚甘醇酸共聚合物(polylactide-co-glycolide)、聚己內酯(polycaprolactone)、聚[酸]酐(polyanhydride)、聚馬來酸(polymaleic acid)與其衍生物，聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcyanoacrylate)、聚酸酐羟丁酸酯(polyanhydride oxybutyrate)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚原酸酯(polyorthoester)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚-L-賴胺酸(poly-L-lysine)、聚甘醇酸(polyglycolide)、聚甲基丙烯酸酯(polymethylmethacrylate)、聚乙烯吡咯啶(polyvinylpyrrolidone)或其共聚合物。

在一些實施例中，可移動光耦合器係由一材料所製成，此材料具有一折射係數，其相較於波導之核層之材料的折射係數，較接近波導之第一被覆層之材料的折射係數。在一些實施例中，可移動光耦合器係由一材料所製成，此材料具有一折射係數，其相較於波導之核層之材料的折射係數，較接近一周遭樣本溶液的折射係數。在一些實施例中，可移動光耦合器係由一材料所製成，此材料具有一折射係數，其為中間介於波導之第一被覆層的折射係數與波導之核層的折射係數之間。在一些實施例中，可移動光耦合器係由一材料所製成，此材料具有一折射係數，其大體上相似於波導之核層的折射係數。在一些實施例中，可移動光耦合器係由一材料所製成，此材料具有一折射係數，其等於波導之核層的折射係數。

在一些實施例中，可移動光耦合器具有一適合尺寸與一折射係數充分地相似於波導之核層之材料的折射係數，以使當光耦合器被置於波導中的一接合位置時，其具有耦合來自波導之光的能力。在此類實施例中，一經誘發之光場可環繞可移動光耦合器的表面來形成，藉此形成一有效激發區域圍繞光耦合器，其中在光耦合器之表面的一特定距離內可激發一分子以發射螢光。

在一些實施例中，可移動光耦合器為不透明的且可侷限激發光於其表面，藉此由於可移動光耦合器阻礙來自波導的激發光分佈至主體空間(bulk space)，而形成適合單一分子偵測的狹窄空間。在一些實施例中，可移動光耦合器對於光是反射的。在一些實施例中，可移動光耦合器對於激發光是反射的。在一些實施例中，可移動光耦合器具有吸收由波導所發射的激發光且之後由其本身發射出一光線，而此光線可激發要被偵測的分子。

在一些實施例中，當光耦合器在一特地範圍內被特定分子所圍繞時，光耦合器之光學特性會改變。在一些實施例中，當光耦合器在一特地範圍內被特定分子所圍繞時所改變的光學特性為折射係數、光吸收能力、藉由耦合器所吸收之光的波長或穿過光耦合器延伸之光的方向。

在一些實施例中，可移動光耦合器之表面的一或多個區域被修飾。例如，可修飾奈米尺度球狀光耦合器的全部表面。表面修飾與一具有一核殼結構(core-shell structure)之光耦合器的殼材(shell material)有區別，即，包括表面修飾之一核殼光耦合器具有殼材之外側表面的修飾。在一更進一步的例子中，可修飾一奈米尺度球形光耦合器之一半球的表面而未修飾剩餘的半球。藉由化學修飾技術，可以一或多個異質(heterogeneous)材料，來塗覆光耦合器的表面，遍及其全部表面或至少其表面之一部分。一表面修飾可用來將可移動光耦合器設置於一接合位置。不對稱之表面修飾，例如僅於一個表面上的修飾，或於相對之表面上的不同修飾，可使可移動光耦合器設置於在一特定定向中的接合位置。一表面修飾也可使一單一分子目標物設置於光耦合器之表面的一特定區域，藉此此種區域可被定位以面對波導的核層，由此將目標物與包含目標物的反應設置在一狹窄的空間內，而此狹窄的空間介於可移動光耦合器與接合位置表面之間鄰近波導的核層。於第2圖中顯示一示例之偵測系統的概要圖式，偵測系統包括一奈米尺度球狀光耦合器顆粒，其被以寡核苷酸引子於一半球上進行修飾。以寡核苷酸引子來修飾奈米尺度球狀光耦合器100於其表面之的一半上，寡核苷酸引子具有與嵌入一DNA合成反應複合物200之一複製DNA股中的序列雜合的能力。以面向波導之核層之光耦合器的寡核苷酸修飾表面，將光耦合器定位於接合位置104，使反應混合物200設置於奈米孔洞接合位置104之底部中的狹窄空間170中。

在一些實施例中，僅修飾可移動光耦合器之表面的一個區域，而剩餘的光耦合器之表面則為未修飾的。在一些實施例中，可移動光耦合器之表面的經修飾區域為從約10至90%之可移動光耦合器的表面。用來描述此種實施例之“約10至90%之可移動光耦合器的表面”意指來表示可移動光耦合器之表面的經修飾區域可為從稍微小於10%至稍微大約90%之光耦合器的表面的任何地方。在更進一步之實施例中，光耦合器之表面的修飾區域為小於光耦合器之表面的10%。在又更進一步之實施例中，光耦合器之表面的修飾區域為大於光耦合器之表面的90%。

在一些實施例中，在操作期間，複數個偵測位置的一些包含一個目標核酸分子(視需要而定附著至一光耦合器)，而其他偵測位置不包含一目標核酸分子。此可避免在定序完成前兩個或更多之核酸分子設置於一偵測位置的情況，以避免一個定序之結果包括來自多於一個分子的資訊。例如，在一些實施例中，由於將低濃度的生物分子設置於要被偵測或鑑定之偵測位置，所以低於於或等於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之偵測位置產生一訊號。在於其中一第一目標核酸從一偵測位置分離，且一第二核酸隨後與相同之偵測位置結合的情況中，藉由在偵測經併入核苷酸中的任何間斷(gap)及/或藉由在經測定之核苷酸序列中的差異，可將第一核酸進行定序之結果與第二核酸進行定序之結果進行區別。

2.3　偵測器

可設置主題偵測系統之一偵測器以偵測從一目標物發射的光。此類偵測器可包括一光學感測器，其具有至少部分吸收入射於其上的光與產生作為對此光之應答的輸出訊號的能力。光學感測器可為，例如p-n光二極體(p-n photodiode)、p-i-n光二極體(p-i-n photodiode)、多重接面光二極體(multi-junction photodiode)、累崩光二極體(avalanche photodiode,APD)、光電晶體(phototransistor)、量子井紅外線偵測器(quantum-well infrared photodetector,QWIP)、光電導型光學感測器(photoconductive type optical sensor)、光伏打型光學感測器(photovoltaic type optical sensor)、薄膜上特殊功能積體電路(thin-film on ASIC,TFA)、金屬半導體金屬光偵測器(metal-semiconductor-metal(MSM)photodetector)、電荷耦合元件(charge coupled device,CCD)、互補式金氧半導體感測器(CMOS sensor)或其組合。

在一些實施例中，光偵測器包括用來控制光偵測器之操作的控制電路。控制電路可包括一訊號放大器(signal amplifier)、A/D轉換器(A/D convertor)、積算器(integrator)、比較器(comparator)、邏輯電路(logic circuit)、讀出電路(readout circuit)、記憶體(memory)、微處理器(microprocessor)、時鐘震盪器(clock)及/或位址(address)的電路。

可將光偵測器配置於從目標物發射之光可到達的地方。例如，可將光偵測器配置在就接合位置而言之核層的相對側。即，若將接合位置以垂直方向配置於核層的一側上，則之後可將光偵測器以垂直方向配置於核層的另一側上。偵測器系統可更包括至少一濾光片介於核層與偵測器之間。

在一些實施例中，偵測器可為一奈米孔洞感測器(nanopore sensor)。藉由製造稱為奈米孔洞之約1 nm於直徑的小孔洞來產生奈米孔洞感測器。用於偵測目的之奈米孔洞可為天然的(例如，穿膜蛋白質)、或人工的(例如，藉由於矽薄板中蝕刻一洞且使用離子束雕刻(ion-beam sculpting method)來將其佔滿以產生奈米孔洞)。奈米孔洞感測器一般藉由將一奈米孔洞浸入於一導電液體中且提供橫跨其之電壓來運作。因為穿過奈米孔洞的電流量對於奈米孔洞之尺寸與形狀為非常靈敏的，所以可觀察到任何由於穿過奈米孔洞之離子傳導的輕微電流。一分子，包括，但不限於從如本發明中所述之核苷酸類似物斷裂的一標記部分，穿過奈米孔洞可產生在穿過奈米孔洞之電流的量值中的一特有改變。

藉由電泳可控制分子穿過奈米孔洞，其中使一分子朝向奈米孔洞移動。多重的分子以一次一個分子來穿過奈米孔洞。當每個分子穿過時，其以此分子之身分的種類特性來阻塞奈米孔洞：即，在一給予之時間中，穿過奈米孔洞之電流量取決於在那時阻礙奈米孔洞的分子。當切除之標記穿過奈米孔洞時，本發明之核苷酸類似物上的不同標記可允許不同之電流來穿過奈米孔洞，提供了穿過奈米孔洞之標記之順序的確認，且因此提供了目標序列的確認。奈米感測器更進一步由出版物Howorka,et al.,Nature Biotechnology,19: 636-639(2001)；Clarke,et al.,Nature Nanotechnology,4: 265-270(2009)；與美國專利號5,795,782；6,362,002；6,123,819；與6,413,792所揭露。

2.4　系統之其他光學構成

在一些實施例中，偵測系統可更包括一光學濾光片介於波導之核層與光偵測器之間。在一些實施例中，可將一光學濾光片配置在介於波導之一下被覆層與光偵測器之間。在一些實施例中，可將一光學濾光片配置在介於波導之一下保護層與光偵測器之間。在一實施例中，下保護層其本身可作為一光學濾光片。一光學濾光片可允許具有在一特定範圍內之波長的光穿過，但至少部分阻礙具有在特定範圍外之波長的光。因此，可選擇一光學濾光片以允許自定序複合物發射的光穿過但減少由激發光所引起的雜訊，以便改善S/N比。

在一些實施例中，可使用微流體通道來引導樣本溶液進入接合位置。可將微流體通道以目標之目標物一次一個通過接合位置的方式來設計，以便實現類流式細胞分析(flow-cytometry-like)偵測。在一些實施例中，可形成一遮蓋物於偵測系統上以容納樣本溶液及/或阻擋周圍的光線。在一些實施例中，偵測系統可包括一控制器，其操作至少一部份之偵測系統，包括，但不限於一光源、一偵測器與任何流量或偵測系統之其他構成。控制器可包括一電腦可讀取媒體，其包含關於偵測系統之各種構成之控制的操作指南，且也可包含對於資料處理與分析的操作指南。可以瞭解的是，本技術領域中已知的其他構成也可被包含於偵測系統中，當其對於本發明之實施為有用時。

在一些實施例中，可在與定序反應同時或於稍後之時間，將關於訊號脈衝的資料儲存於偵測系統中且視需要而定來進行擷取、傳送或分析。在一些實施例中，可將此資料傳送至一或多個外部裝置，包括，但不限於電腦系統、伺服器、行動電話、平板電腦系統(tablet computing system)、分佈式計算網路(distributed computing network)與其他具有儲存或處理資料之能力的電子裝置。可在偵測同時傳送資料，或可在偵測之後傳送資料。在一些實施例中，外部裝置包括一序列之資料庫，其可為公眾的或個人的。在一些實施例中，外部裝置分析訊號脈衝資料以產生一目標核酸的序列。在一些實施例中，外部裝置可執行額外的功能，包括，但不限於鹼基名稱的校對(proof reading of base calls)、與其他序列，例如一參考序列的排比(alignmnt)、錯誤分析、報告產生，或更進一步傳送資料至其他裝置，包括將資料傳回偵測系統。在一些實施例中，資料與視需要而定所產生之序列與分析可被譯成密碼。在一些實施例中，在將資料被傳送至外部裝置之前，可將其譯成密碼。

可將一通信配件納入於偵測系統內，且通信配件具有傳送或接收來自外部裝置之資料的能力。此類通信可經由有線網路(wired network)或為無線的。可使用各種通信方法，例如，經由一乙太(Ethernet)或其他區域(local area)網路、一USB連結、一FireWire連結、以一數據機(modem)的撥接連結(dial-up wired connection)、一直接鏈路(direct link)，例如T1、ISD N或電纜線路(cable line)。無線通信可為藍牙或RTM技術。在較佳實施例中，使用典型無線網路(exemplary wireless network)，例如蜂巢式(cellula)、衛星(satellite)或呼叫(pager)網路、GPRS，或一區域資料傳送系統(local data transport system)，例如，乙太或信號環覆蓋一局部區域網路(token ring over a local area network)來建立一無線連結。在一些實施例中，可將資料送至一個人通訊位址(personal address)，包括，但不限於一電話號碼、一文字訊息位址(text messaging address)、一電子郵件位址(email address)或一線上帳號(online account)。在一些實施例中，通信配件可包含用來發送與接收資料的一無線紅外通信(wireless infrared communication)構件。

3.1實施例1

於此與下方實施例中，示例之核苷酸類似物可包括鹼基B₁ 、B₂ 及/或基團L₁ 、L₂ 、Q、F、X₁ 與X₂ ，各具有如於此所敘述的身份，代表具有前述式I之結構的核苷酸類似物。

一示例之二核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式II中所顯示的結構：

於第3圖中提供藉由合成之校對依賴定序的一單一循環的概要圖式，而此合成係使用具有式II之結構的類似物。包括一校對聚合酶、一目標(模板)股與一複製股的反應複合物被暴露至激發光。一進來的核苷酸類似物，其具有做為鹼基B₁ 的腺嘌呤，與聚合酶的反應位置結合並與在目標股中的一胸腺嘧啶鹼基配對。藉由聚合酶，二核苷酸類似物被併入增長之股中，於是螢光標記F被激發光所刺激並發射出一訊號其被一偵測器所獲得。如光譜圖中所示，此訊號維持為可偵測的，直到藉由聚合酶之外核酸酶活性從增長之股來切斷類似物的未配對部分(包括基團X，其無法與在目標股中之隨後的鹼基鹼基配對，及螢光標記F)。當類似物之經標記、未配對部分從反應複合物分離時，訊號消失。

3.2　實施例2

一示例之二核苷酸三磷酸鹽類似物，其包括一螢光淬熄部分Q，此二核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式III中所顯示的結構：

3.3　實施例3

一示例之二核苷酸三磷酸鹽類似物，其具有代替三磷酸鹽鏈之α-磷酸鹽的一硫代磷酸鹽(phosphorothioate)，因此避免聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性，此二核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式IV中所顯示的結構：

於第4圖中提供藉由合成之校對依賴定序的一單一循環的概要圖式，而此合成係使用具有式IV之結構的類似物。包括一校對聚合酶、一目標(“模板”)股與一複製股(“引子”)的反應複合物被暴露至激發光。一進來的核苷酸類似物，其具有做為鹼基B₁ 的鳥嘌呤，與聚合酶的反應位置結合並與在模板股中的一胞嘧啶鹼基配對。藉由聚合酶，二核苷酸類似物被併入增長之股中，於是螢光標記F被激發光所刺激並發射出一訊號其被一偵測器所獲得。如在第4圖底部顯示訊號出現的長條所示，當二核苷酸藉由聚合酶被併入增長的股時，此訊號維持為可偵測的，且持續直到藉由聚合酶之外核酸酶活性從增長之股來切斷類似物的未配對部分(包括基團X，其無法與在目標股中之隨後的鹼基鹼基配對，及螢光標記F)。當類似物之經標記、未配對部分從反應複合物分離時，訊號消失。

3.4　實施例4

一示例之二核苷酸三磷酸鹽類似物，其具有一螢光淬熄部分Q與代替三磷酸鹽鏈之α-磷酸鹽的一硫代磷酸鹽，因此避免聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性，此二核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式V中所顯示的結構：

於第5圖中提供藉由合成之校對依賴定序的一單一循環的概要圖式，而此合成係使用具有式V之結構的類似物。包括一校對聚合酶、一目標(“模板”)股與一複製股(“引子”)的反應複合物被暴露至激發光。一進來的核苷酸類似物，其具有做為鹼基B₁ 的鳥嘌呤，與聚合酶的反應位置結合並與在模板股中的一胞嘧啶鹼基配對。螢光淬熄部分Q將從螢光基團F發射的光淬熄，直到二核苷酸類似物藉由聚合酶被併入增長的股，藉此附著至焦磷酸鹽(pyrophosphate)的螢光淬熄部分Q從反應複合物被釋放。如顯示訊號出現之第5圖底部的長條所示，來自被併入之螢光基團F的訊號維持為可偵測的，直到藉由聚合酶之外核酸酶活性從增長之股來切斷類似物的未配對部分(包括基團X，其無法與在目標股中之隨後的鹼基鹼基配對，及螢光標記F)。當類似物之經標記、未配對部分從反應複合物分離時，訊號消失。

3.5　實施例5

一示例之單核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式VI中所顯示的結構：

在將具有如式VI中所示之結構的單核苷酸三磷酸鹽類似物併入一增長之核酸股後，為了下一步驟的合成，藉由一校對聚合酶之3’至5’外核酸酶活性來移除磷酸鹽-L₂ -F基團，以使經併入之單核苷酸三磷酸鹽類似物的3’-OH自由。

3.6　實施例6

一示例之單核苷酸三磷酸鹽類似物，其包括一螢光淬熄部分Q，此單核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式VII中所顯示的結構：

3.7　實施例7

一示例之單核苷酸三磷酸鹽類似物，其包括一α-磷酸硫代磷酸鹽以避免校對聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性，此單核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式VIII中所顯示的結構：

3.8　實施例8

一示例之單核苷酸三磷酸鹽類似物，其包括一α磷酸硫代磷酸鹽以避免校對聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性，且包括一螢光淬熄部分Q，此單核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式IX中所顯示的結構：

3.9　實施例9

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括鹼基B₁ 與B₂ 於其5’端，鹼基B₁ 與B₂ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，且此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ ，其無法與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式X中所顯示的結構：

3.10　實施例10

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括(1)鹼基B₁ 與B₂ 於其5’端，鹼基B₁ 與B₂ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，(2)一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ ，其無法與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對，與(3)一螢光淬熄部分Q，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式XI中所顯示的結構：

3.11　實施例11

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括(1)鹼基B₁ 與B₂ 於其5’端，鹼基B₁ 與B₂ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，(2)一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ ，其無法與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對，與(3)一α磷酸硫代磷酸鹽，其避免聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式XII中所顯示的結構：

3.12　實施例12

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括(1)鹼基B₁ 與B₂ 於其5’端，鹼基B₁ 與B₂ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，(2)一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ ，其無法與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對，(3)一螢光淬熄部分Q，與(4)一α磷酸硫代磷酸鹽，其避免聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式XIII中所顯示的結構：

3.13　實施例13

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括(1)鹼基B₁ 於其5’端，鹼基B₁ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，與(2)一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ -F與X₂ ，其無法與在一目標核酸中之鹼基鹼基配對，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式XIV中所顯示的結構：

3.14　實施例14

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括(1)鹼基B₁ 於其5’端，鹼基B₁ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，(2)一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ -F與X₂ ，其無法與在一目標核酸中之鹼基鹼基配對，與(3)一螢光淬熄部分Q，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式XV中所顯示的結構：

3.15實施例15

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括(1)鹼基B₁ 於其5’端，鹼基B₁ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，(2)一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ -F與X₂ ，其無法與在一目標核酸中之鹼基鹼基配對，與(3)一α磷酸硫代磷酸鹽，其避免聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式XVI中所顯示的結構：

3.16實施例16

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括(1)鹼基B₁ 於其5’端，鹼基B₁ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，(2)一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ -F與X₂ ，其無法與在一目標核酸中之鹼基鹼基配對，(3)一螢光淬熄部分Q，與(4)一α磷酸硫代磷酸鹽，其避免聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式XVII中所顯示的結構：

3.17　實施例17

一示例之三核苷酸三磷酸鹽類似物，此三核苷酸三磷酸鹽類似物包括(1)鹼基B₁ 於其5’端，鹼基B₁ 具有與在一目標核酸中之互補鹼基鹼基配對的能力，與(2)一核苷酸殘基於其3’端，核苷酸殘基包括基團X₁ -F與X₂ ，其無法與在一目標核酸中之鹼基鹼基配對，此三核苷酸三磷酸鹽類似物具有如式XVIII中所顯示的結構：

在一些實施例中，以與敘述於實施例3、4、7、8、11、12、15與16中之類似物相同的方式，式XVIII之三核苷酸三磷酸鹽類似物，具有代替α磷酸鹽基團之一α磷酸硫代磷酸鹽基團，其避免一校對聚合酶之持續的3’至5’外核酸酶活性。在一些實施例中，以與敘述於實施例2、4、6、8、10、12、14與16中之類似物相同的方式，式XVIII之三核苷酸三磷酸鹽類似物，包括一螢光淬熄部分Q於γ磷酸鹽類。

3.18　實施例18

根據於此敘述的方法來將一DNA分子進行定序。將具有200 nt平均長度之環狀、單股DNA分子的溶液，以每阿升(attoliter)0.1分子在適合之定序緩衝溶液中的濃度，提供至如於2011/3/11提申，題名為“Single-Molecule Detection System and Methods.”的美國專利申請號13/046,457中所述的偵測系統。或者，將環狀、單股DNA分子的溶液提供至如於2010/6/11提申的美國專利申請號12/801,503；2010/7/29提申的美國專利申請號12/805,411；美國專利號6,917,726；7,170,050；與7,486,865；與Eid,J.,et al.,Science,323: 133-138(2009)中所述的偵測系統。

環狀DNA分子包含一約20個核苷酸的一已知插入序列至一未知樣本序列。提供與已知插入序列互補的定序引子及四種類型的螢光標記二核苷酸類似物，四個核苷酸類似物之各個包括鹼基B₁ ，其分別為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶。在偵測裝置中的複數個偵測位置中，形成一校對聚合酶之三元複合物(ternary complex)、DNA分子與定序引子，且聚合酶將經螢光標記之核苷酸類似物添加至定序引子之3’端。

在複數個偵測位置中，一經螢光標記之二核苷酸類似物，其與聚合酶之反應位置結合且被併入增長之(引子)股中，被來自與偵測裝置耦接之一光源的激發光所激發，且發射出螢光。藉由偵測裝置來偵測螢光，其產生要被處理的輸出訊號以鑑定由添加至定序引子之二核苷酸類似物所包含之鹼基的身份。當聚合酶從增長之股切斷包含螢光標記非互補核苷酸基團時，螢光訊號消失，而為了下次核苷酸類似物併入，使包括鹼基B₁ 之互補基團的3’-OH自由。

之後聚合酶添加其他二核苷酸類似物，其如上述被偵測。將此循環重複一有效數目的次數以獲得至少兩次DNA分子的長度的定序讀取(即，將DNA分子進行定序與重複定序)。藉由接受或拒絕定序重複，且將來自被接受之重複之排比的一致序列進行測定以計算地獲得DNA分子的序列，如公開於2010/5/13之美國專利公開號2010/0121582所述。

3.19　實施例19

於此將λ噬菌體(lambda phag)的基因體進行定序。將經純化、線性之基因體以每阿升0.1分子懸浮於適合之反應緩衝溶液中並提供至如美國專利申請號13/046,457中所述的一偵測系統。或者可將基因體純化為環狀或進行連接以形成一環狀結構。在任一的例子中，使用熱來將雙股λ基因體進行變性以形成對定序而言有適合條件的單一模板股。

設計一定序引子以與經線性化之模板股的一末端互補，或在經環狀化基因體的例子中，引子與於模板股上之任何已知序列互補。將引子以大約每阿升1分子的濃度進行懸浮並提供至偵測系統，隨著校對持續聚合酶與四種類型的經螢光標記二核苷酸類似物，其中四種二核苷酸類似物包括一互補之鹼基B₁ ，其分別為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶。此二核苷酸類似物更包括一螢光淬熄體連接至γ磷酸鹽基團。於偵測裝置中之複數個偵測位置中，形成校對聚合酶之三元複合物(ternary complex)、DNA分子與定序引子，且聚合酶將經螢光標記之核苷酸類似物添加至定序引子之3’端。

在複數個偵測位置的各個中，將於聚合酶之反應位置之經螢光標記之二核苷酸類似物併入增長的(引子)股，包括從二核苷酸類似物將螢光淬熄體切斷。藉由來自與偵測裝置耦接之一光源的激發光激發於二核苷酸類似物上之螢光標記，且發射出螢光。藉由偵測裝置來偵測此螢光，其產生要被處理的輸出訊號以鑑定由添加至定序引子之二核苷酸類似物所包含之鹼基的身份。當聚合酶從增長之股切斷包含螢光標記非互補核苷酸基團時，螢光訊號消失，而為了下次核苷酸類似物併入，使包括鹼基B₁ 之互補基團的3’-OH自由。

之後聚合酶添加其他二核苷酸類似物，其如上述被偵測。將此循環重複一有效數目的次數以獲得上至基因體長度的一定序讀取(約48 kb)。之後將定序反應加熱或以高鹽處理以移除新近合成的股、將其清洗，且之後為了第二次定序讀取重新添加定序混合物。或者，取代在每次讀取獲得一全部的序列，起始之讀取可僅覆蓋λ基因體的一子集(subset)。在清洗步驟之後，將不同之定序引子包含於定序反應中，以將λ基因體之一第二、部分重複的區域進行定序。重複這些步驟直到達成全部基因體的2×覆蓋率。藉由接受或拒絕定序重複，且將來自被接受之重複之排比的一致序列進行測定以計算地獲得DNA分子的序列，如公開於2010/5/13之美國專利公開號2010/0121582所述。

3.20　實施例20

偵測系統的一個例子利用了一奈米球狀可移動光耦合器，將此奈米球狀可移動光耦合器以磁性官能基來於其表面之一部分上進行修飾以吸引目標序列。將奈米球狀顆粒以卵白素(streptavidin)來於經磁性修飾的表面上進行化學修飾。生物素化寡核苷酸引子與經卵白素修飾之奈米球體結合，而生物素化寡核苷酸引子包括與定序引子(連接核酸引子)之序列互補的序列，因此將生物素化引子連接至奈米球體。之後將目標序列與生物素化引子雜合，且添加DNA聚合酶以形成一反應複合物。藉由使用設置於接合位置下方的微製造線圈(micro-fabricated coil)，將可移動光耦合器沈澱於一奈米孔洞中，以使奈米球體的底部將目標序列與引子侷限於奈米孔洞的基部的一阿升體積內在一波導(接合位置)中。使電流穿過微製造線圈以產生磁場，其於接合位置捕獲具有經吸附之反應複合物的奈米球體，伴隨著具有經吸附之反應複合物的磁性修飾表面朝向波導的核層。因此，將反應複合物設置於接合位置於一狹窄的空間中，而狹窄的空間鄰近波導之核層的表面。

於接合位置中執行敘述於上述實施例中之使用二核苷酸或三核苷酸類似物的DNA合成。在合成反應的各步驟中，四種經標記之dNTP的一個與反應複合物的反應位置結合，其中其與目標核酸的對應鹼基鹼基配對。藉由在接合位置之底部形成的漸逝光場(evanescent light field)及/或從奈米球體表面發射的漸逝光場來刺激螢光標記。藉由偵測dNTP連接之螢光團的發射來即時偵測一經螢光團標記核苷酸磷酸鹽併入增長的股。各個經併入之核苷酸的身份藉由其螢光標記而被測定出，其中螢光標記從核苷酸類似物被切斷，由於併入增長的股。藉由將在聚合反應期間將所偵測到之螢光發射訊號的順序轉換為一核酸序列以衍生出目標核酸的序列。

依照於說明書中所提之參考文獻的教示，可完全瞭解說明書。於說明書中之實施例提供本發明之實施例的說明，且不應被解釋來限制本發明之精神。熟悉此技藝人士輕易瞭解本發明包含許多其他實施例。所有於揭露中所提之出版品、專利申請與專利以其全文被引入以供參考。被引入以供參考之資料範圍與本說明書抵觸或不符時本說明書將取代任何此類資料。於此任何參考文獻之引用並非承認此類參考文獻為本發明的先前技術。

除非以其他方式指出，使用於說明書，包括申請專利範圍中之成分、反應條件等的所有數字表現量，可被理解為在所有情況下藉由措辭“約”來修飾。因此，除非以其他方式指出反對，數字的參數為近似值，且可根據要被本發明獲得所搜尋之所需特性而改變。在最小，且不為限制對於申請專利範圍均等論的申請的企圖，根據顯著數字與一般圓形方法可建立各數字參數。在本發明說明書中，具有不同量之有效位數的一系列數字的列舉，不被限制為意指所給予之伴隨較少有效位數的數字具有與伴隨較多有效位數的數字相同的確切性。

用語“一”的用途，當在申請專利範圍及/或說明書中與措辭“包括”結合使用時可意指“一個(one)”，但也與“一或多個”、“至少一個”與“一或大於一個”一致。用語“或”於申請專利範圍中的用途被用來意指“及/或”，除非明確地指出僅意指二擇一，或兩者互相排斥，但揭露支持僅意指二擇一與“及/或”的定義。

除非以其他方式指出，在一系列要素之前的措辭“至少”可被瞭解為意指於系列中之每一要素。僅使用例行實驗，熟悉此技藝人士會認定或可確認，一些對於此處所述本發明特定實施例的許多等同物。此類等同物包含於下列申請專利範圍中。

除非以其他方式指出，於此使用之技術與科學用語具有與熟悉本發明所屬技藝領域人士一般所瞭解的相同意義。任何方法或材料相似於或等同於於此敘述的那些，可被使用於本發明之實施與測試中。

於此討論之出版物僅僅以早於本申請之申請日的揭露被提供。於此沒有任何事物被建構為由於較早之發明本發明不被給予早於此類公開的權力。此外，所提供之公開日期可能與實際公開日期不同，其需要被獨立地確認。

對於熟悉此技藝人士，從考慮本發明說明書與於此揭露之實施例的實施而言，其他實施例為明顯的。其被意指為說明書與實施例僅被視為示例的，由於發明之真實範圍與精神係由下列申請專利範圍所指出。

100‧‧‧奈米尺度球形光耦合器

102‧‧‧偵測器

104‧‧‧接合位置(adapter site)

118‧‧‧光學濾光片

145‧‧‧激發光

160‧‧‧有效激發區域

170‧‧‧狹窄空間

200‧‧‧DNA合成反應複合物

第1圖顯示一偵測系統之一實施例的一般概要圖，而此偵測系統可如於此所述來使用。

第2圖顯示一示例之偵測系統，其包括一奈米尺度之球形光耦合器顆粒(sphere light coupler particle)，以寡核苷酸引子修飾球形光耦合器顆粒於一半球上。以寡核苷酸引子修飾奈米尺度球形光耦合器100於其表面之一半上，寡核苷酸引子具有與嵌入一DNA合成反應複合物200之一複製DNA股中之序列雜合的能力。在一波導(waveguide)之一接合位置(adapter site) 104之光耦合器100的定位，由於朝向波導之核層(core layer)之光耦合器的經寡核苷酸引子修飾的表面，將反應複合物200設置在奈米孔洞接合位置104之底部中的狹窄空間(confined space) 170中。在此類實施例中，當一激發光145提供一光波，其沿著波導之核層傳播時，光耦合器可耦接在接合位置中之核層的表面附近被誘發的一漸逝光場(evanescent light field)，藉此形成一有效激發區域160在介於可移動之光耦合器與波導之核層之間的狹窄空間中且圍繞光耦合器的表面。一光學濾光片由118所表示，且一偵測器由102所表示。參見美國專利申請號13/046,457。

第3圖顯示在藉由使用二核苷酸(binucleotide)類似物之合成的定序步驟中，螢光訊號脈衝(pulse)寬度的延長。

第4圖顯示在藉由使用二核苷酸類似物之合成的定序步驟中的脈衝持續期間。

第5圖顯示在藉由使用包括一螢光淬熄部分之二核苷酸類似物之合成的定序步驟中的脈衝持續期間。相較於第4圖，淬熄體(quencher)的使用減少了來自未被併入之核苷酸類似物的背景訊號並且延遲了訊號的開始，直到在聚合酶之反應位中之一類似物變為被併入增長的核苷酸股中，在那時包括淬熄部分之焦磷酸基團被釋放。

Claims (38)

1. 一種測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，包括步驟：(a)提供一反應複合物，包括，一模板核酸，其包括一目標核酸序列、一引子核酸，其包括與該模板核酸之一區域互補的一序列，與一聚合酶酵素或一酵素複合物，其包括5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性；(b)使該反應複合物與複數個核苷酸類似物接觸，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括：(i)一光可偵測標記，其為指出該鹼基配對部分的身份；(ii)一或多個非互補核苷酸殘基；以及(iii)一可選的連接物連結該光可偵測標記至該一或多個非互補核苷酸殘基；(c)藉由該酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性，使該酵素或酵素複合物得以將一核苷酸類似物以一模板依賴方式併入一新生股，藉此將該標記部分結合至該新生股；(d)偵測該經併入之核苷酸類似物的該光可偵測標記；(e)藉由該酵素或酵素複合物之3’至5’外核酸酶活性，使該酵素或酵素複合物得以從該新生股移除該經併入之核苷酸類似物的該標記部分；以及(f)重複步驟(c)-(e)以測定該目標核酸序列的序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該光可偵測標記為一螢光團。
3. 如申請專利範圍第2項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該核苷酸類似物更包括至少一螢光淬熄部分，且其中在該核苷酸類似物藉由該酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性併入該新生股之時該螢光淬熄部分從該核苷酸類似物被移除。
4. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該至少一鹼基配對部分，具有一5’端與一3’端，包括一或多個核苷酸殘基其各包括一鹼基，該鹼基具有在該反應複合物之一反應位置中與該目標核酸序列之一對應鹼基鹼基配對的能力。
5. 如申請專利範圍第4項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該鹼基配對部分之3’端為藉由一磷酸連接連結至該標記部分。
6. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該一或多個非互補核苷酸殘基為獨立地擇自一無鹼基核苷酸殘基與包括一鹼基之一核苷酸殘基，而該鹼基實質上缺乏與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一個鹼基配對的能力。
7. 如申請專利範圍第3項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該螢光淬熄部分為附著至一核苷酸類似物的5’端。
8. 如申請專利範圍第7項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該螢光淬熄部分為藉由一連接物附著至一核苷酸類似物的5’端。
9. 如申請專利範圍第7項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該核苷酸類似物為一核苷酸三磷酸鹽類似物，其具有一α磷酸鹽、一β磷酸鹽與一γ磷酸鹽，且其中該螢光淬熄部分為附著至在該核苷酸類似物之5’端之三磷酸鹽基團的該β或γ磷酸鹽。
10. 如申請專利範圍第4項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該至少一鹼基配對部分包括至少三個磷酸鹽基團於其5’端，其中最接近該鹼基配對部分(α磷酸鹽)的磷酸鹽基團為一硫代磷酸鹽。
11. 如申請專利範圍第4項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該至少一鹼基配對部分包括至少三個磷酸鹽基團於其5’端，其中最接近該鹼基配對部分(α磷酸鹽)的磷酸鹽基團為一甲基磷酸鹽。
12. 如申請專利範圍第4項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該至少一鹼基配對部分包括至少三個磷酸鹽基團於其5’端，其中最接近該鹼基配對部分(α磷酸鹽)的磷酸鹽基團為一硼烷磷酸鹽。
13. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，介於在該反應複合物之活性位置之該核苷酸類似物的結合與從該新生股之標記部分的移除之間的時間長度為從50至250毫秒。
14. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該方法被執行於，藉由介於兩個連續之偵測步驟(d)之間的時間長度為從約0.2秒至1 秒的條件下。
15. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該方法被執行於，藉由介於兩個連續之偵測步驟(d)之間的時間長度為從0.2秒至0.6秒的條件下。
16. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該方法被執行於，藉由介於兩個連續之偵測步驟(d)之間的時間長度為自0.3秒至0.5秒的條件下。
17. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中在步驟(f)中重複步驟(c)-(e)以測定該目標核酸的序列包括持續監測與記錄在要被依序併入該引子股之核苷酸類似物之該標記部分中的各光可偵測標記的依序併入。
18. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中各核苷酸類似物包括：(a)於該核苷酸類似物的5’端，一鹼基配對部分包括一或多個核苷酸殘基，其各包括一鹼基，該鹼基為具有在該反應複合物之一活性位置中與目標核酸序列之一對應鹼基鹼基配對的能力，以及(b)於該核苷酸類似物的3’端，一標記部分視需要而定包括一或多個非互補核苷酸殘基，其之各個實質上缺乏與該目標核酸序列之一對應的鹼基鹼基配對的能力。
19. 一種化合物，其具有式(I)： 或一其藥學上可接受之鹽類或水合物，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9；R₁ 與各個R₂ 為擇自O^- 與，其中(i)R₁ 與各個R₂ 為O^- ；或(ii)R₁ 為且各個R₂ 為O^- ；或(iii)R₁ 為O^- ，一個R₂ 為，且任何剩餘之R₂ 獨立地為O^- 、S^- 、BH₃ ^- 或CH₃ ；R₃ 為一核苷酸部分，其包括一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對與一螢光染料F；R₄ 為H、OH、鹵素、烷基或烷氧基；Y₁ 與Y₃ 為各自獨立地擇自O^- 、S^- 、BH₃ ^- 與CH₃ ；L₁ 為擇自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基與磺醯基；Q為一螢光淬熄部分；以及B₁ 為擇自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤與5-甲基胞嘧啶。
20. 如申請專利範圍第19項所述之化合物，其中R₃ 為擇自與 B₂ 為擇自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤與5-甲基胞嘧啶；X₁ 為擇自L₂ ；一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對；以及群組，其包括L₂ 與不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對一鹼基；其中L₂ 為擇自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基與磺醯基；X₂ 為擇自H、CH₃ 與一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對；各R₄ 獨立地為H、OH氟或OCH₃ ；以及Y₂ 為擇自O^- 、S^- 、BH₃ ^- 與CH₃ 。
21. 如申請專利範圍第19項所述之化合物，其中R₃ 為擇自與 B₂ 為擇自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤與5-甲基胞嘧啶；X₁ 為擇自L₂ ；一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對；以及群組，其包括L₂ 與一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對；其中L₂ 為擇自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、酯、胺基與磺醯基；X₂ 為擇自H、CH₃ 與一鹼基其不與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶與尿嘧啶之任一個鹼基配對；Y₂ 為擇自O^- 、S^- 、BH₃ ^- 與CH₃ 。
22. 如申請專利範圍第20項所述之化合物，其中n為1，R₁ 為，且R₂ 為O^- 。
23. 如申請專利範圍第20項所述之化合物，其中Y₁ 為S^- 。
24. 如申請專利範圍第20項所述之化合物，其中R₃ 為
25. 如申請專利範圍第20項所述之化合物，其中R₃ 為
26. 如申請專利範圍第20項所述之化合物，其中Y₃ 為O^- 。
27. 一種測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，包括步驟：(a)提供一反應複合物，包括，一模板核酸，其包括一目標核酸序列、一引子核酸，其包括與該模板核酸之一區域互補的一序列，與一聚合酶酵素或一酵素複合物，其包括5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性；(b)使該反應複合物與如申請專利範圍第19項所述之化合物接觸；(c)藉由該酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性，使得使該酵素或酵素複合物得以將如申請專利範圍第19項所述之化合物併入一新生股，藉此將基團F結合至該新生股；(d)偵測該基團F，其為指出鹼基B₁ 的身份與順序；(e)藉由該酵素或酵素複合物之3’至5’外核酸酶活性，使該酵素或酵素複合物得以移除位於經併入之核苷酸 殘基之3’位置的該F基團，該經併入之核苷酸殘基具有鹼基B₁ ；以及(f)重複步驟(c)-(e)以測定該目標核酸序列的序列。
28. 如申請專利範圍第1項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該複數個核苷酸類似物包括至少四種類型的核苷酸類似物，各種類型包括一獨特之鹼基配對部分與一獨特之螢光團，該螢光團為可與其他類型之該複數個之核苷酸類似物的螢光團區別。
29. 如申請專利範圍第28項所述之測定一目標核酸序列之核苷酸序列的方法，其中該複數個核苷酸類似物更包括一核苷酸類似物，其具有一螢光淬熄部分，該螢光淬熄部分在該核苷酸類似物併入該新生股之時從該核苷酸類似物被移除。
30. 一種測定在一核酸聚合反應中藉由一聚合酶酵素或酵素複合物所併入之一核苷酸鹼基的方法，該方法包括步驟：(a)執行一核酸聚合反應，其利用一聚合酶酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性兩者，且以一模板依賴方式導致一新生股的產生，其中執行該反應於下列存在時：(i)一模板核酸，包括一目標核酸序列，(ii)一引子核酸，包括與該模板核酸之一區域互補的一序列；(iii)一聚合酶酵素或一酵素複合物，包括5’至3’聚合 活性與3’至5’外核酸酶活性；(iv)複數個核苷酸類似物，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記、一或多個非互補核苷酸殘基，與一可選的連接物連結該光可偵測標記至該一或多個非互補核苷酸殘基；以及(b)偵測該光可偵測標記，其中該標記為指出該鹼基或存在於藉由該酵素或酵素複合物併入該新生股之該核苷酸類似物中之鹼基的身份。
31. 如申請專利範圍第30項所述之測定在一核酸聚合反應中藉由一聚合酶酵素或酵素複合物所併入之一核苷酸鹼基的方法，其中於各個依序的核苷酸併入事件中執行該偵測步驟，該核苷酸併入事件係在藉由該酵素或酵素複合物之3’至5’外核酸酶活性來移除於先前併入事件中所併入之該核苷酸類似物的光可偵測標記之後。
32. 一種測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，該方法包括步驟：(a)執行一核酸聚合反應於下列存在時：(i)一模板核酸，包括一目標核酸序列，(ii)一引子核酸，包括與該模板核酸之一區域互補的一序列；(iii)一聚合酶酵素或一酵素複合物，包括用於以一模板依賴方式併入一核苷酸類似物的一反應位置以及5’至3’聚合活性與3’至5’外核酸酶活性兩者； (iv)複數個核苷酸類似物，其中該複數個之一個別的核苷酸類似物包括至少一鹼基配對部分與至少一標記部分，該標記部分包括一光可偵測標記、一或多個非互補核苷酸殘基，與一可選的連接物連結該光可偵測標記至該一或多個非互補核苷酸殘基，且其中一旦該類似物藉由該聚合酶酵素或酵素複合物以一模板依賴方式被併入該新生股，該類似物不終止一新生股之產生，且其中相較於包括藉由該聚合酶酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性被移除的一標記的一核苷酸類似物，該核苷酸類似物提供至少一個經延長之偵測期間與經延長之中介脈衝持續期間；以及(b)偵測在各個依序併入事件中所併入之該標記部分。
33. 如申請專利範圍第32項所述之測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，其中相對於包括藉由該聚合酶酵素或酵素複合物的5’至3’聚合活性來移除之一標記的一類似物的偵測期間，該偵測期間以至少10倍被延長。
34. 如申請專利範圍第32所述之測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，其中兩個連續之偵測步驟被以約0.2至約1秒分隔。
35. 如申請專利範圍第32項所述之測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，其中該核苷酸類似物更包括至少一螢光淬熄部分，且其中該螢光淬熄部分在該核苷酸類似物藉由該酵素或酵素複合物之5’至3’聚合活性併入該新生股之時從該核苷酸類似物被移除。
36. 如申請專利範圍第32項所述之測定一目標核酸序列之核酸序列的方法，其中藉由該酵素或酵素複合物經由其5’至3’聚合活性來移除該標記部分。
37. 如申請專利範圍第1、30或32項之任一項所述的方法，其中該目標核酸序列包括序列重複。
38. 如申請專利範圍第1、30或32項之任一項所述的方法，其中該目標核酸序列包括一或多個序列重複，其擇自(A)n、(T)n、(C)n或(G)n，其中n為3或更大之整數。