KR20120104216A - 핵산 시퀀싱에 대한 조성물과 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산들의 시퀀싱을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 뉴클레오티드 유사체들 및 자기 교정 활성을 갖는 핵산 중합 효소 또는 효소 복합체의 사용을 포함한다. 상기 뉴클레오티드 유사체들은 복제 가닥으로 결합될 수 있으며, 상기 중합 효소의 상기 자기 교정 활성을 유도하여, 뉴클레오티드 결합에 관련된 신호 기간을 연장할 수 있다.

Description

핵산 시퀀싱에 대한 조성물과 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR SEQUENCING NUCLEIC ACIDS}
본 발명은 핵산 서열 결정 방법에 관한 것이다. 나아가 본 발명은 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analogs)와 이의 핵산 시퀀싱(sequencing)에 있어서의 사용에 관한 것이다.
유전 암호에 있어서 별개 표식의 패턴들에 대한 광범위한 유전학적 프로파일링(profiling) 혹은 식별과, 게놈 전반의 뉴클레오티드 레벨 시퀀싱(nucleotide level sequencing)을 포함하는 유전 정보를 얻기 위해 다양한 기술과 처리 공정들이 개발되고 있다. DNA 서열에 대한 지식은 생명 공학, 법의학적 생물학, 진단술, 시스템 생물학, 합성 생물학 및 개인 건강 관리와 같은 많은 적용 분야에서의 기본적인 생물학적 연구를 위해 필요성이 대두되고 있다. DNA 시퀀싱의 출현은 생물학적 연구와 발견을 상당히 가속화시키고 있다. 뉴클레오티드 레벨(nucleotide level)에서 유전 서열을 판독하는 기술들이 개발되고 있으나, 이러한 방법들은 상당한 시간과 매우 많은 비용이 소요될 수 있다.
차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)에 대한 대다수 현재 기술들(Metzker, M.L., Nature Reviews Genetics 11:31-45(2010)에 리뷰됨)은 전기 영동에 기반한 방법들(electrophoresis-based methods)에서 칩 기반 시퀀싱(chip-based sequencing)으로의 이동에 의해 시퀀싱에 드는 비용이 매우 낮아졌다. 이때, 상기 칩 기반 시퀀싱은 다량의 증폭된 표적 분자들로부터 서열 정보를 유도하는 대신, 전형적으로 단일 표적 분자 시퀀싱을 포함한다. 핵산 중합 과정이 일어나는 동안 연속적인 뉴클레오티드 결합 사건들(events)의 진행이 모니터 되는 실시간 시퀀싱의 도입 역시 시퀀싱의 효율을 증가시켰다.
실시간 단분자 시퀀싱에 대한 일반적인 전략은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 개념으로부터 유도되었으며, 상기 파이로시퀀싱에서는 광-감지 라벨(photo-detectable label)에 의해 뉴클레오티드 3인산염 단량체의 PPi 모이어티(moiety)가 표지된다. 파이로시퀀싱 반응에서, 각 단량체로서의 중합 효소 연장부들(polymerase extensions)이 하나의 성장 사슬로 결합되는 동안, 광 신호가 방출되고 감지된다(예를 들어, Ronaghi, et al., SCIENCE, 281 : 363-365 (1998); Hyman, ANAL. BIOCHEM, 174: 423-436 (1988); and U. S. Pat. Nos. 6,255,083 and 7,329,492 참조). 단일 분자 시퀀싱에서 신호/노이즈 비율 증가를 위해 제로 모드 도파관(Zero-Mode Waveguide: ZMW)을 사용한 단일 분자 감지 방법 역시 미국등록특허 제7,170,050호 및 제7,056,676호에 기재되고 있다.
어떠한 효소-매개(enzyme-mediated), 주형-의존(template-dependent) 시퀀싱 공정에서도, 전반적인 신뢰도, 진행성(processivity), 중합 과정의 정확도는 직접적으로 서열 결정에 영향을 미칠 수 있다. 낮은 정확도의 표적 서열 판독은 높은 신뢰도로 표적 서열을 결정하기 위해 다중-폴드 커버리지(multiple-fold coverage)를 필요로 할 수도 있다. 최근의 발달에도 불구하고, 각 시퀀싱 반응에 대한 보다 높은 정확성을 제공하는 시퀀싱 계획이 필요하다.
여기에 기재된 실시예들은 단분자 서열 결정의 정확도를 향상시키기 위해 단분자 신호 감지의 관찰 기간 증대를 위한 신규한 방법들을 제공한다.
실시예들은 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 표적 핵산 서열을 갖는 주형 핵산을 포함하는 반응 복합체, 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머 핵산(primer nucleic acid), 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성(polymerization activity) 및 3'에서 5' 방향으로 자기 교정(proofreading) 기능을 하는 핵산말단분해효소 활성(exonuclease activity)을 포함하는 중합 효소 또는 효소 복합체의 공급; (b) 반응 복합체와 복수의 뉴클레오티드 유사체들을 접촉, 이때 상기 복수 중 일부에 해당하는 개별 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 염기쌍 모이어티 및 상기 염기쌍 모이어티의 정체(identity)를 나타내는 광-감지 라벨을 갖는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 포함함; (c) 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 주형-의존 양식(template-dependent manner)에서 뉴클레오티드 유사체를 초기 가닥으로 결합하도록 효소 또는 효소 복합체를 허용, 이에 따라 상기 라벨 모이어티는 상기 초기 가닥으로 결합됨; (d)상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 상기 광-감지 라벨의 감지; (e) 상기 효소 또는 효소 복합체의 3'에서 5' 방향으로 자기 교정 기능을 하는 핵산말단분해효소 활성을 통해 상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 라벨 모이어티를 상기 초기 가닥으로부터 제거하도록 상기 효소 또는 효소 복합체를 허용; (f) 상기 표적 핵산의 서열 결정을 위한 (c) - (e)단계의 반복.
여기에 기재된 상기의 방법들은 핵산 중합 반응에서 중합 효소 또는 효소 중합체에 의해 결합된 뉴클레오티드 염기를 결정하는 방법을 포함하며, 상기의 방법은 다음의 각 단계들을 포함한다: (a) 중합 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성 모두를 사용하며, 주형-의존 양식에서 초기 가닥 생산을 야기하는 핵산 중합 반응의 수행, 이때 상기 반응은 (ⅰ)-(ⅳ)의 존재 아래 수행됨. 즉, (ⅰ) 표적 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산, (ⅱ) 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머 핵산, (ⅲ) 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 포함하는 중합 효소 또는 효소 복합체, (ⅳ) 복수의 뉴클레오티드 유사체들, 이때 상기 복수 중 개별 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 염기쌍 모이어티와, 광-감지 라벨을 갖는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 포함함; (b) 상기 광-감지 라벨의 감지, 이때 상기 라벨은 상기 효소 또는 효소 복합체에 의해 상기 초기 가닥으로 결합된 상기 뉴클레오티드 유사체에 존재하는 염기 또는 염기들의 정체를 나타냄.
실시예들은 표적 핵산 서열의 상기 핵산서열 결정방법을 더 포함하고, 상기의 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) (ⅰ)-(ⅳ) 존재에서 핵산 중합반응의 수행, 즉 (ⅰ) 표적 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산, (ⅱ) 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머 핵산, (ⅲ) 주형-의존 양식에서 뉴클레오티드 유사체 결합을 위한 반응 사이트를 포함하는 중합 효소 또는 효소 복합체, (ⅳ) 복수의 뉴클레오티드 유사체들, 이때 상기 복수 중 개별 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 염기쌍 모이어티 및 광-감지 라벨을 갖는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 포함하며, 상기 유사체가 주형-의존 양식에서 일단 상기 효소 또는 효소 복합체에 의해 초기 가닥으로 결합되면 상기 유사체는 초기 가닥의 생성을 종료하지 않고, 또한 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 제거된 라벨을 포함하는 뉴클레오티드 유사체에 반해, 상기의 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 연장된 감지 기간과 연장된 인터펄스(interpulse) 기간을 제공함; (b) 각 연속적인 결합 사건 동안 결합된 상기 라벨 모이어티의 감지.
여기에 기재된 상기의 모든 시퀀싱 방법들에서 활용된 상기 광-감지 라벨은 형광단이나 혹은 광 감지기에 의해 감지될 수 있는 다른 어떠한 적절한 라벨도 될 수 있다. 여기에 기재된 상기의 모든 방법들에서 활용된 상기 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 형광 소광 모이어티(fluorescence quenching moiety)를 포함할 수 있다. 주형-의존 양식에서 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 상기 뉴클레오티드 유사체가 결합하자마자 상기 형광 소광 모이어티는 상기 뉴클레오티드 유사체로부터 제거될 수 있다. 어떤 측면들에서, 상기 형광 소광 모이어티는, 선택적으로 링커(linker)를 통해, 뉴클레오티드 유사체의 5' 말단에 부착될 수 있다. 어떤 측면들에서, 상기 형광 소광 모이어티는 상기 뉴클레오티드 유사체의 5' 말단에 있는 3인산기(triphosphate group)의 베타 또는 감마 인산염에 붙을 수 있다.
어떤 측면들에서, 상기 라벨 모이어티는 광-감지 라벨 및 상기 광-감지 라벨을 인산 결합(phosphate linkage)에 연결하는 선택적 링커(optional linker)를 포함한다. 또 다른 측면들에서, 상기 라벨 모이어티는 다음의 (a)-(c)를 포함한다: (a) 하나 또는 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들(nucleotide residues); (b) 광-감지 라벨; 및 (c) 상기의 하나 또는 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들에 상기 광-감지 라벨을 연결하는 선택적 링커. 상기 하나 또는 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들은 어베이직(abasic) 뉴클레오티드 잔기 및 아데닌(adenine), 사이토신(cytosine), 구아닌(guanine), 티민(thymine), 혹은 우라실(uracil) 중 어느 것과도 염기쌍을 이루는 능력이 실질적으로 부족한 염기를 포함하는 뉴클레오티드 잔기로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
상기 뉴클레오티드 유사체의 상기 염기쌍 모이어티는 전형적으로 상기 반응 복합체 결합 사이트에서 상응하는 상기 주형 핵산의 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 염기를 포함한다. 어느 측면들에서, 상기 염기쌍 모이어티의 상기 3' 말단은 인산 결합을 통해 상기 라벨 모이어티에 연결된다. 어느 측면들에서, 염기쌍 모이어티는 5' 말단에 적어도 3개의 인산기를 포함하고, 이때 상기 염기쌍 모이어티(알파 인산염)에 최근접한 상기 인산기는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 혹은 보라노포스페이트(boranophosphate)이다.
실시예들은 화학식Ⅰ을 갖는 화합물을 더 포함하거나,
Figure pct00001
<화학식Ⅰ>
또는 약제학적으로 수용 가능한 염이나 이의 수화물이고, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이며;
R1과 각 R2는 O-와
Figure pct00002
로부터 선택되고, 이때
ⅰ) R1과 각 R2는 O-이거나; 또는
ⅱ) R1은
Figure pct00003
이고, 각 R2는 O-이거나; 또는,
ⅲ) R1은 O-, 하나의 R2는
Figure pct00004
이고, 다른 잔여 R2는 독립적으로 O-, S-, BH3 -, CH3이다.;
R3은 형광염료 F를 포함하는 뉴클레오티드 모이어티이고;
R4는 H, OH, 할로겐(halogen)(불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는), 알킬(alky)(CH3, CH2CH3을 포함하는), 또는 알콕시(alkoxy)(치환되거나(substituted) 치환되지 않은(unsubstituted) 것 모두)(OCH3, OCH2CH3을 포함하는)이며;
Y1과 Y3은 O-, S-, BH3 -, CH3로부터 각각 독립적으로 선택되고;
L1은 알킬, 알케닐(alkenyl), 알카이닐(alkynyl), 아릴(aryl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로사이클릴(heterocyclyl), 에스테르(ester), 아미노(amino) 및 설포닐(sulfonyl)로부터 선택되며;
Q는 형광 소광 모이어티이고;
B1은 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민, 우라실, 하이포크산틴(hypoxanthine) 및 5-메틸사이토신(5-methylcytosine)으로부터 선택된다.
상기의 방법들은 다음 조건들 아래 수행될 수 있으며, 즉 상기 반응 복합체의 결합 사이트에서 상기 뉴클레오티드 유사체 결합 및 상기 초기 가닥으로부터 상기 라벨 모이어티 제거 사이의 시간 길이가 약 50 내지 250 밀리 초이거나, 혹은 여기에 기재된 어떤 다른 범위이다.
상기의 방법들은 역시 다음 조건들 아래 수행될 수 있으며, 즉 두 개의 연속적 감지 단계 사이의 시간 길이가 약 0.2초부터 1초까지, 약 0.2초부터 0.6초까지, 약 0.3초에서 0.5초까지, 혹은 여기에 기재된 어떤 다른 범위이다.
나아가 여기에 기재된 시퀀싱 방법을 수행하는 데 적합한 장치가 제공된다. 이 장치는 여기에 밝힌 감지기 또는 감지 시스템 및 상기 반응 복합체가 놓인 지지체를 포함한다.
상기 언급한 일반적인 기재와 다음의 상세한 기재는 모두 예시적이고 오로지 설명을 위한 것이며, 청구한 바와 같이 상기 실시예들의 제한이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
이 명세서 일부로 결합되고 일부분을 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 몇몇 실시예들을 도해하고, 상기 기재와 함께 이의 원리들을 설명하는 데 쓰인다.
도 1은 이 문서에서 서술하는 감지 시스템 실시예의 일반적인 개략도를 나타낸다.
도 2는 일 반구(hemisphere)에서 올리고핵산염 프라이머(oligonucleotide primer)로 변형되는 나노 스케일 구 광 커플러 입자(a nano-scale sphere light coupler particle)를 포함하는 예시적인 감지 시스템을 나타낸다. 나노 스케일 구 광 커플러(100)는 구 표면 절반에서 DNA 합성 반응 복합체(200)의 복제 DNA 가닥에 삽입된 서열들로 혼성(hybridizing)이 가능한 올리고핵산염 프라이머로 변형된다. 광 커플러(100)의 상기 올리고핵산염 변형 표면(oligonucleotide-modified surface)을 도파관의 코어층으로 향하도록 광 커플러(100)를 상기 도파관의 어댑터 사이트(adapter site)(104)에 위치시킴으로써, 반응 복합체(200)를 나노 웰 어댑터 사이트(104) 바닥의 제한된 공간(170)으로 국지화시킨다. 그러한 실시예들에서, 여기 광(excitation light)(145)이 상기 도파관의 코어층을 따라 전파되는 광 파장을 제공할 때, 상기 광 커플러는 상기 어댑터 사이트 내 상기 코어층 표면에 인접하여 유도되는 희미한 광 필드를 결합할 수 있고, 이에 따라 상기 이동 가능한 광 커플러와 상기 도파관의 코어층 사이 및 상기 광 커플러의 표면 주위에 유효 여기 지대(zone)(160)를 형성할 수 있다. 광학 필터는 도면 부호 118로 표시되고, 감지기는 도면 부호 102로 표시된다. 미국특허출원번호 제13/046,457호를 참조하라.
도 3은 바이뉴클레오티드 유사체(binucleotide analog)를 사용하는 합성에 의한 시퀀싱 단계에서 형광 신호 펄스 폭(pulse width)의 연장을 나타낸다.
도 4는 바이뉴클레오티드 유사체를 사용하는 합성에 의한 시퀀싱 단계에서 펄스 지속 기간(pulse duration)을 나타낸다.
도 5는 형광소광 일부를 포함하는 바이뉴클레오티드 유사체를 사용한 합성에 의한 시퀀싱 단계에서 펄스 지속 기간을 나타낸다. 도 4와 비교하면, 소광 모이어티를 포함하는 파이로인산염기(pyrophosphate group)가 방출될 때, 소광제(quencher)의 사용으로 인해, 결합되지 못한 뉴클레오티드 유사체로부터의 배경 신호가 감소되고, 중합 효소의 반응 사이트에서의 유사체가 성장 뉴클레오티드 가닥으로 결합될 때까지 신호의 시작을 지연된다.
1. 방법
여기에 기재된 구성과 방법은 단분자 시퀀싱, 특히 실시간 단분자 시퀀싱을 위한 효과적인 수단을 제공한다. 여기에 제공된 시퀀싱 과정들은 다음의 하나 또는 그 이상의 고유 특징들을 구체화한다. 먼저, 주형-의존 방식에서 중합 효소 또는 효소 복합체에 의해 결합된 뉴클레오티드로부터의 신호가 지속되는 감지 기간이 연장될 수 있다. 이것은, 예를 들어 표지되었으나(labeled) 종료되지 않는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 달성할 수 있고, 상기 뉴클레오티드 유사체의 라벨은 결합된 뉴클레오티드 잔기에 머물 수 있으며, 다음 염기 결합에 앞서 효소 또는 효소 복합체에 의해 쪼개질 때까지 초기 가닥의 일부로서 잔류할 수 있다. 둘째로 연속적인 뉴클레오티드 결합 사건들에 상응하는 신호 펄스들(pulses)은 연장된 인터펄스 기간(예를 들면, "신호 없음" 또는 "암(dark)" 기간)에 의해 제 시간에 더 분리될 수 있다. 이것은, 예를 들어 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성에서 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성으로 전환시키는 효소 또는 효소 중합체에 필요한 시간을 이용하는 것에 의해 획득될 수 있다. 이 두 가지 특성의 조합은 감지기가 결합 사건을 감지하는 보다 긴 "신호" 기간과, 감지기가 결합 이벤트의 완료를 기록하도록 각 연이은 결합 사건들 사이의 "신호 없음" 또는 "암" 기간을 제공할 수 있다.
따라서 실시예들은 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법을 포함한다. 몇 개의 실시예들은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 표적 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산을 갖는 반응 복합체, 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머(primer) 핵산 및 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성과 3' 에서 5' 방향으로의 자기 교정(proofreading) 기능을 하는 핵산말단분해효소 활성을 포함하는 중합 효소 또는 효소 복합체의 공급; (b) 복수의 뉴클레오티드 유사체들과 반응 복합체의 접촉, 이때, 상기 복수 중 개별 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 염기쌍 모이어티와, 상기 염기쌍 모이어티의 정체(identity)를 나타내는 광-감지 라벨을 포함하는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 포함함; (c) 주형-의존 방식에 있어 뉴클레오티드 유사체가 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 초기 가닥으로 결합하도록 상기 효소 또는 효소 복합체를 허용하여, 상기 라벨 모이어티가 상기 초기 가닥으로 결합됨; (d) 상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 광-감지 라벨의 감지; (e) 3'에서 5' 방향으로의 자기 교정 기능을 하는 핵산말단분해효소 활성을 통해 상기 초기 가닥으로부터 상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 라벨 모이어티를 제거하도록 상기 효소 또는 효소 복합체를 허용; 및 (f) 상기 표적 핵산의 서열 결정을 위한 (c) - (e) 단계의 반복.
실시예들은 나아가 핵산 중합 반응에서 중합 효소 또는 효소 중합체에 의해 결합된 뉴클레오티드 염기를 결정하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다. : (a) 중합 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성 모두를 사용하며 주형-의존 방식에서 초기 가닥 생산을 야기하는 핵산 중합 반응 수행, 이때, 상기 반응은 아래 (ⅰ)-(ⅳ)의 존재 하에서 수행됨 즉, (ⅰ) 표적 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산, (ⅱ) 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머 핵산, (ⅲ) 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 포함하는 중합 효소 또는 효소 복합체, (ⅳ) 복수의 뉴클레오티드 유사체들, 이때 상기 복수의 뉴클레오티드 유사체들의 개별 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 염기쌍 모이어티와 광-감지 라벨을 포함하는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 포함함; (b) 상기 광-감지 라벨의 감지, 이때 상기 라벨은 상기 효소 또는 효소 복합체에 의해 상기 초기 가닥으로 결합된 뉴클레오티드 유사체에 존재하는 염기 혹은 염기들의 정체를 나타냄.
실시예들은 나아가 표적 핵산 서열의 핵산 서열 결정방법을 포함하고, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 아래 (ⅰ)-(ⅳ) 존재 하에서 핵산 중합 반응 수행, 즉 (ⅰ) 표적 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산, (ⅱ) 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머 핵산, (ⅲ) 주형-의존 방식에서 뉴클레오티드 유사체 결합을 위한 반응 사이트를 포함하는 중합 효소 또는 효소 복합체, (ⅳ) 복수의 뉴클레오티드 유사체들, 이때 상기 복수의 뉴클레오티드 유사체들의 개별 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 염기쌍 모이어티와, 광-감지 라벨을 포함하는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 포함하고, 주형-의존 방식에서 상기 유사체가 상기 효소 또는 효소 복합체에 의해 한번 상기 초기 가닥으로 결합되면 상기 유사체는 초기 가닥 생성을 종료할 수 없으며, 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 제거된 라벨을 포함하는 뉴클레오티드 유사체에 비하여, 상기 뉴클레오티드 유사체는 연장된 감지 기간과 연장된 인터펄스 기간 중 적어도 하나를 제공함; (b) 각 연속적인 결합 사건이 일어나는 동안 결합된 라벨 모이어티의 감지.
실시예들은 합성에 의한 시퀀싱에 필요한 뉴클레오티드 기질들(substrates)로서의 뉴클레오티드 유사체들의 사용을 포함하며, 상기 유사체들은, 아래의 (i)-(ii)를 포함한다. 즉, (ⅰ) 각각이 핵산 중합 반응 복합체의 결합 사이트의 표적 핵산의 상응하는 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 염기를 갖는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 상기 유사체의 5' 말단의 염기쌍 모이어티와, (ⅱ) 예를 들면 인산 결합을 통한 염기쌍 모이어티의 3' 말단으로의 라벨 모이어티, 이때 상기 라벨 모이어티는 상기 표적 가닥에 비-상보적이며 광-감지 라벨을 포함함. 본 발명에 따른 중합 효소 또는 효소 복합체는 뉴클레오티드 유사체를 주형-의존 복제에 의해 성장 가닥으로 결합할 수 있으며, 이에 따라, 상기 유사체 염기의 5' 말단에 있는 상기 염기쌍 모이어티는 상기 주형 가닥의 상응하는 하나 또는 그 이상의 염기들과 쌍을 이루고, 상기 유사체와 상기 효소의 결합과 상기 유사체가 상기 복제 가닥으로 결합되는 것은 상기 유사체의 라벨 모이어티 상의 상기 광-감지 라벨을 통해 감지된다. 상기 광-감지 라벨의 감지는 상기 광-감지 라벨을 포함하고 상기 주형 가닥과 염기쌍을 이룰 수 없는 상기 라벨 모이어티가 자기 교정 기능을 하는 중합 효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성에 의해 제거될 때까지 계속될 수 있다. 그러므로 상기 광-감지 라벨의 감지는 합성 반응 속도 감소를 위한 뉴클레오티드 유사체 기질들의 농도 감소 없이 연장될 수 있다. 그러면 상기 효소 또는 효소 복합체는 합성의 다음 단계로 진행될 수 있으며, 이는 5' 말단에 상기 주형 가닥의 다음 하나 또는 그 이상의 염기들과 염기쌍을 이루는 염기쌍 모이어티를 포함하는 또 다른 유사체를 결합할 수 있다. 시퀀싱의 정확도는 연장된 신호에 의해 증가되어, 상기 합성 반응 동안 표지된 반응물들의 일시적 결합에 의해 발생하는 노이즈를 구별한다. 중합 복합체와 관련되어 잔류하는 표지된 반응물로부터 신호가 가시적인 시간의 길이는 중합 효소가 중합 활성에서 핵산말단분해효소 활성으로 전환하여 잘못 조합된 뉴클레오티드 잔기를 제거할 수 있는 시간의 길이에 대응한다. 몇몇 실시예들에서, 뉴클레오티드 유사체를 핵산-합성반응 복합체의 결합 사이트로 결합하는 것과 초기("프라이머") 가닥으로부터 유사체의 라벨 모이어티를 제거하는 것 사이의 시간 길이는 대략 50에서 250 밀리 초이다. 몇몇 실시예들에서 상기 시간의 길이는 50 밀리 초보다 작거나, 250 밀리 초보다 크다.
1.1. 시퀀싱 복합체와 이와 관련된 물질
여기에 제공된 방법들의 수행은 전형적으로 중합 효소 또는 효소 복합체를 포함하는 반응 혼합물, 표적 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산, 프라이머 및 뉴클레오티드 유사체들의 하나 혹은 그 이상의 타입들을 포함한다. 중합 반응에 적합한 다양한 완충제들과 금속 이온들이 활용될 수 있다.
여기에 사용된 것으로서, "시퀀싱 복합체(sequencing complex)" 또는 "반응 복합체(reaction complex)"(상호 교환 가능하게 사용되는)란 중합 효소 또는 효소 중합체를 포함하는 복합체, 주형 분자 및 프라이머 분자를 지칭한다. 시퀀싱 복합체는 고형 지지체에 부착될 수 있다. 부착은 이하에서 자세히 기재되는 바와 같이, 상기 중합 효소, 상기 주형 분자 및 상기 프라이머 분자를 포함하는 시퀀싱 복합체의 하나 혹은 그 이상의 성분들을 통해, 혹은 상기 시퀀싱 복합체의 어떠한 성분과도 연관되는 분자를 통해 간접적으로 일어날 수 있다.
바람직하게는, 상기 중합 효소는 지지체 상에 용액 상태 또는 고정된 상태에 있을 수 있다. 상기 중합 효소는, 직접 흡착, 친화도 결합(affinity binding), 공유 또는 비공유 결합과 같이 당해 기술 분야에서 알려진 어떠한 방법에 의해서도 지지체 상에 고정된 상태에 있을 수 있다. 그러한 테더링 결합(tethering linkages)의 비한정적인 몇몇 실시예들로서, 바이오틴-스트렙타아비딘(biotin-streptavidin), 안티바디-헵텐(antibody-hapten), 렉틴-살카이드(lectin-saccharid), 실란 커플링(silane coupling), 카보디미드(carbodiimid), 말레이미드(maleimid), 펩티드(peptide), 당질(carbohydrate), 에스테르(ester), 치환된 에스테르(substituted ester), 무수물, 치환된 무수물 및 폴리렉타이드 결합(polylactide linkages)이 있다. 당해 기술 분야에서 광범위하게 기재되고 사용된 많은 테더링 분자들이 있다. 비한정적인 몇몇 예들로서, 디티오트레이톨(dithiothreitol), 디숙신이미딜 글루탐산(disuccinimidyl glutarate), 디숙신이미딜 수베르산(disuccinimidyl suberate), 비스설포숙신이미딜 수베르산(bis(sulfosuccinimidyl)suberate), 디티오비스숙신이미딜프로피오네이트(dithiobis(succinimidylpropionate)), 디티오비스설포숙신이미딜프로피오네이트(dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)), 에틸렌 글리코비스숙신이미딜숙신산(ethylene glycobis(succinimidylsuccinate)), 에틸렌 글리코비스 설포숙신이미딜숙신산(ethylene glycobis (sulfosuccinimidylsuccinate)), 디숙신이미딜 타르트레이트(disuccinimidyl tartrate), 디설포숙신이미딜 타르트레이트(disulfosuccinimidyl tartrate), 비스[2-(숙신이미딜록시카보닐록시) 에틸]설폰(bis [2-(succinimidyloxycarbonyloxy) ethyl]sulfone), 비스[2-(설포숙신이미딜록시카보닐록시) 에틸]설폰(bis[2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy) ethyl]sulfone), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate), 설포-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1카르복실레이트(sulfo-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-lcarboxylate), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), m-말리이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도-페닐)-부티레이트(succinimidyl 4-( p-maleimido-phenyl)-butyrate), 설포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트(sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)-butyrate), 비스말레이미도헥산( bismaleimidohexane), N-(y-말레이미도부티릴록시) 숙신이미드 에스테르( N-(y-maleimidobutyryloxy) succinimide ester), N-(y-말레이미도부티릴록시) 설포숙신이미드 에스테르(N-(y-maleimidobutyryloxy) sulfosuccinimide ester), N-숙신이미딜 (4-요오드아세틸) 아미노벤조에이트( (4-N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate), 설포숙신이미딜 (4-요오드아세틸)-아미노벤조에이트(sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl)-aminobenzoate), 1,4-디-[3'-2'-피리딜디티오(프로피온아미도) 부탄]( 1, 4-di-[3'-2'-pyridyldithio(propionamido) butane]), 4-숙신이미딜록시카보닐-a-(2-피리딜디오) 톨루엔( 4-succinimidyloxycarbonyl-a-(2-pyridyldithio) toluene), 설포숙신이미딜 -6-[a-메틸-a-(2-피리미딜디티오)-톨루아미도]헥사노에이트(sulfosuccinimidyl -6-[a-methyl-a-(2-pyridyldithio)-toluamido]hexanoate), N- 숙신이미딜-3(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(N-succinimidyl-3(2-pyridyldithio)-propionate), 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도 헥사노에이트(succinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido] hexanoate), 설포숙신이미딜-6-[-3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도] 헥사노에이트( sulfosuccinimidyl-6-[-3-(2-pyridyldithio)-propionamido] hexanoate), 3-(2-피리딜디티오)-프로피오닐 하이드라지드( 3-(2-pyridyldithio)-propionyl hydrazide), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디미드 하이드로클로라이드( l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride), N,N'-디사이클로헥실카보디미드( N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), 4-(p-아지도살리실아미도)-부틸아민( 4-(p-azidosalicylamido)-butylamine), 아지도벤조닐 하이드라지드(azidobenzoyl hydrazide), N-5-아지도-2-니트로벤조일록시숙신이미드(N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide), N-[4-(p-아지도살리실아미도)부틸]-3'(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(N-[4-(p-azidosalicylamido)butyl]-3'(2'-pyridyldithio)propionamide), p-아지도페닐 글리옥살 모노하이드레이트 (p-azidophenyl glyoxal monohydrate), 4-(p-아지도살리실아미도)부틸아민( 4-(p-azidosalicylamido)butylamine), 1-(p-아지도살리실아미도)-4-(요오드아세트아미도)부탄(1 -(p-azidosalicylamido)-4-(iodoacetamido)butane), 비스-[(3-4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드(bis-[(3-4-azidosalicylamido)ethyl]disulfide), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate), n-하이드록시설포-숙신이미딜4-아지도벤조에이트(n-hydroxysulfo-succinimidyl4-azidobenzoate), N-하이드록시숙신이미딜-4-아지도살리실릭산(N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylic acid), N-하이드록시설포숙신이미딜-4-아지도살리실릭산(N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidosalicylic acid), 설포숙신이미딜-(4- 아지도살리실아미도)-헥사노에이트(sulfosuccinimidyl-(4-azidosalicylamido)-hexanoate), p-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피로네이트(p-nitrophenyl-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionate), 2-디아조-3,3,3,-트리플루오로-프로피오닐클로라이드(2-diazo-3,3,3,-trifluoro-propionylchloride), N-숙신이미딜-(4-아지도페닐) 1,3'-디티오프로피오네이트((N-succinimidyl -(4-azidophenyl) l,3'-dithiopropionate), 설포숙신이미딜-(4-아지도페닐디티오)프로피오네이트(sulfosuccinimidyl -(4-azidophenyldithio)propionate), 설포숙신이미딜-2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sulfosuccinimidyl-2-(7- azido-4-methylcoumarin-3-acetamide) ethyl -l,3'-dithiopropionate), 설포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(sulfosuccinimidyl 7-azido-4-methylcoumarin-3-acetate), 설포숙신이미딜 2-(m-아지도-오니트로벤자미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sulfosuccinimidyl 2-(m-azido-onitrobenzamido)-ethyl-l ,3' -dithiopropionate), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트(N-succinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate), 설포숙신이미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트(sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate), 설포숙신이미딜 2-(파지도살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sulfosuccinimidyl 2-(pazidosalicylamido) ethyl-1,3'-dithiopropionate), 설포숙신이미딜 4-(p-아지도페닐)-부티레이트(sulfosuccinimidyl 4-(p-azidophenyl)-butyrate)를 포함한다.
상기 중합 효소는 핵산 중합 반응을 간섭하지 않는 어떤 지지체 상에도 고정될 수 있다. 지지체의 재료, 형태 및/또는 크기는 반응 복합체로부터의 신호를 감지하는 데 사용되는 감지 시스템에 좌우될 수 있다. 다양한 지지체가 금속, 금속 산화물, 실리콘, 유리, 석영, 폴리머(polymer), 당질, 합성수지 및 이들의 혼합물들을 포함하여 활용될 수 있으며 이에 반드시 한정되지는 않는다. 상기 재료들은 양으로 대전되거나, 음으로 대전되거나, 혹은 전하를 띄지 않을 수도 있으며, 변형되지 않거나 혹은 복합체 고정을 돕기 위한 코팅으로 유도체 합성될(derivatized) 수도 있다. 상기 지지체들은 평판들(plates), 비즈들(beads), 구들(spheres), 슬라이드들(slides), 웨이퍼들, 칩들을 포함하는 어떠한 적절한 모양 및 크기일 수 있고 이에 반드시 한정되지는 않으며, 모세관들(capillaries), 피펫들(pipettes), 채널들, 튜브들, 기공들(pores), 커벳들(cuvettes), 마이크로플루이드 채널들(microfluidic channels), 챔버들 및 웰들(wells)을 포함하는 다양한 컨테이너들의 표면들일 수 있다. 지지체들은 멀티웰 플레이트들(multiwell plates)과 나노 사이즈 웰들(nano-sized wells)의 어레이들을 포함하는 어떠한 적절한 포맷들도 채택할 수 있으며, 반드시 이에 국한되지는 않는다. 상기 중합 효소의 고정은, 제로 모드 도파관을 위한 아토리터(attoliter) 또는 젭토리터(zeptoliter) 스케일의 부피들 내와 같이, 이미징을 위한 제한된 공간 내에 상기 중합 효소를 국한시키는 역할을 할 수 있다.
상기 중합 효소는 중합 효소 서브 유닛을 통해서 또는 상기 중합 효소에 수용된 어떠한 다른 서브 유닛을 통해서도 상기 지지체에 부착될 수 있다. 상기 중합 효소는 상기 중합 효소를 상기 고정된 지지체로 부착시키는 기능만을 수행하는 서브 유닛을 포함할 수 있다. 중합 효소들은 상기 지지체 상에서 무작위로, 어레이로, 혹은 상기 지지체 표면에 어떠한 다른 패턴으로도 고정될 수 있다.
5'에서 3' 방향으로의 중합과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 처리하는 어떠한 중합 효소도 여기에 기재된 상기 시퀀싱 방법들에 활용될 수 있다. "3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성"이란 용어는 초기 가닥의 3' 말단에서 인산이에스테르 결합(phosphodiester bond)의 가수 분해 제거를 지칭한다. 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성은 초기(예를 들어, 성장) 가닥으로 결합되는 염기의 오류 수정(예를 들어, 자기 교정)에 활용될 수 있다. 전형적으로, 상기 용어는 주형-특정 핵산 중합 효소를 일컫는 데 사용되며, 이에 따라 주형의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 형성하지 않는 뉴클레오티드들이 순차적으로 초기 가닥의 3' 말단으로부터 제거된다. 오류 수정 활성을 갖는 중합 효소들의 예들은 파이로코쿠스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus), 써모코쿠스 리토랄리(Thermococcus litoralis) 및 써모토가 마리타임(Thermotoga maritime)에서 기인한 중합 효소들을 포함하며, 반드시 이에 제한되지는 않는다. "잘못 조합된 뉴클레오티드" 또는 "부조합(mismatch)"은 해당 위치에서 표적 핵산 서열에 상보적이지 않은 뉴클레오티드를 일컫는다.
여기에 사용된 "중합 효소"라는 용어는 DNA나 RNA를 사용하여 뉴클레오티드 유닛들(units)을 뉴클레오티드 사슬에 추가함으로써 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 합성을 촉진하는 효소 또는 효소 복합체를 일컫는다. 상기 용어는 단량체와 다량체 효소(예를 들어, 효소 복합체)를 포함한다. 효소 복합체는 단일 효소 또는 복수의 효소들을 포함할 수 있고, 추가적인 비효소 단백질들 또는 다른 서브 유닛들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 두 가지 타입의 효소 활성들은 효소 복합체의 하나 혹은 그 이상의 서브 유닛들에 의해 수행될 수 있다. 상기 복합체는 서브 유닛들 사이의 비공유 결합(예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘(Van der Waals force) 및 소수성 상호 작용들)이나 혹은 공유 결합(예를 들어, 이황화 결합(disulfide bonds)이나 락탐 결합(lactam bridges))을 통해 유지될 수 있다. 이러한 복합체들의 몇몇 비한정적인 예들은, 야생형, 재조합, 돌연변이 및 엔지니어링 중합 효소를 포함하여, 핵산 중합 효소의 적어도 하나의 촉매적 서브 유닛을 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 중합 효소는 폴리뉴클레오티드 주형 서열에 어닐링된(annealed) 프라이머의 3' 말단에서 합성을 시작하고, 상기 주형 가닥의 5' 말단을 향해 진행된다. "DNA 중합 효소"는 디옥시뉴클레오타이드(deoxynucleotides)의 중합을 촉진한다. "RNA 중합 효소"는 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)의 중합을 촉진한다.
전술한 바와 같이, 몇몇 중합 효소들은 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 수행하는 동일한 서브 유닛 내에서 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성과 같은 자기 교정 기능을 가질 수도 있다. 이러한 종류의 중합 효소들은 원핵 DNA 폴(pol) I, Ⅱ 및 III과 진핵 DNA 폴 , , 및 , 및 파지 복제(phage replicases)를 포함하나, 반드시 이에 한정되지는 않는다.
자기 교정 중합 효소는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)(또는 리보뉴클레오티드로부터의 RNA)에서 기인한 주형-유도(template-directed) DNA 합성을 촉진하는 기능 및 3'에서 5' 방향으로의 자기 교정 핵산말단분해효소를 가지고 있고, 이에 따라 주형으로 혼성될 때 초기 가닥의 3' 말단에서 혹은 3' 말단 근처에서 부조합된 뉴클레오티드를 제거할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소는, E. coli DNA 중합 효소 Ⅲ 복합체의 서브 유닛들과 같이(A. Kornberg & T. A. Baker, "DNA 복제", 2쇄, University Science Books, U.S.A., 2005) 중합 효소 복합체의 각 분리된 서브 유닛들에 머문다. 몇몇 실시예들에서, 상기 자기 교정 중합 효소는 Pfu, KOD, Tgo, Vent, Deep Vent, phi29 DNA 중합 효소, T4 DNA 중합 효소(Reha-Krantz, L.J., GENETICS, 148: 1551 -1557 (1998) 참조) 혹은 T7 DNA 중합 효소이다. 적절한 자기 교정 효소들은 B형 중합 효소들일 수 있다. B형 중합 효소들은 예를 들어 Pfu, Pwo, Pho, Pab, Pko, Pgl 중합 효소와 같은 파이로코쿠스 중합 효소들(Pyrococcus polymerases), 써모코쿠스 리토랄리(Thermococcus litoralis), 써모코쿠스 바로시(Thermococcus barossii) 및 써모코쿠스 고고나리우스(Thermococcus gorgonarius) 중합 효소와 같은 써모코쿠스(호열성) 중합 효소들(Thermococcus polymerases) 및 파이로딕티움(Pyrodictium) spp에서 기인한 중합 효소들과 같은 내열성 중합 효소들이 될 수 있다. 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 갖는 내열성의 중합 효소들은 써모토가(Thermotoga)와 같은 진정세균 변종(eubacterial strains)으로부터 고립될 수 있다. 상기 중합 효소들은 자연적 중합 효소로부터 유도될 수도 있으며, 5'에서 3' 방향으로의 중합 효소 활성과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성 모두를 갖도록 조작될 수 있다. 이때, 상기 변형된 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성은 상기 화학식Ⅰ의 라벨 모이어티 R3을 가수 분해적으로 제거할 수 있고, R3은 뉴클레오티드 모이어티들 혹은 뉴클레오티드 유사체 구조들을 포함하지 않는다.
유용한 핵산 중합 효소들은 비-내열성(non-thermostable)이거나 호열성일 수 있다. 호열성 중합 효소("열적으로 안정한" 혹은 "내열성" 중합 효소들로도 지칭될 수 있다)는 주형으로서 DNA 또는 RNA를 사용하여 뉴클레오티드 유닛들을 뉴클레오티드 사슬에 추가함으로써 폴리뉴클레오티드 합성을 촉진하고, 45℃ 이상에서 선택적 활성을 가지며, 90℃ 이상과 같은 고온에서는 비가역적 변성을 하지 않는 어떠한 효소도 가리킨다. 내열성 중합 효소의 비제한적 예들로서, Taq와 Pfu DNA 중합 효소 및 이들의 파생물들과, 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus), 써모코쿠스 리토랄리(Thermococcus litoralis), 바실러스 스테로서모필러스(Bacillus sterothermophilus), 써모토가 마리타임(Thermotoga maritime)과 같은 호열성 유기체들 및 다른 써머스(Thermus), 바실러스(Bacillus), 써모토가(Thermotoga) 및 파이로코쿠스 종(Pyrococcus species)으로부터의 내열성 중합 효소들이 있다. 내열성 중합 효소들은 파이로파지(PyroPhage) 3713 DNA 중합 효소(Lucigen)와 같은 호열성 박테리오파지에서 기인한 것들까지 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.
몇몇 실시예들에서, 상기 중합 효소는 phi29 및 BST DNA 중합 효소를 포함하는 비-내열성 중합 효소이며, 이에 한정되지는 않는다. 다른 예시적인 예로서, E. coli DNA 중합 효소Ⅰ(클레노브, Klenow)의 큰 프레그먼트(fragment)가 있고, 이는 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 갖고 5'에서 3' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성이 부족하다. 이 효소 또는 상응하는 효소들은 등온 PCR 동안과 같이 고온에서 수행되지 않는 합성 반응의 실시예들에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 중합 효소는 고세균 DNA 중합 효소이다.
발명에 적합한 복합체는, 특정한 RNA 중합 효소들, 역전사 효소들(reverse transcriptases) 및 결절되거나 핵산말단분해효소 활성을 갖지 않도록 변형된 중합 효소와 같이 자연적으로 핵산말단분해효소 활성이 부족한 중합 효소들을 포함하여, 3'에서 5' 방향으로의 핵산말산분해효소 활성이 부족한 중합 효소들을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 그러한 효소 복합체들은 전형적으로 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성이 가능한 추가 서브 유닛들을 더 포함한다.
이 발명에 적합한 중합 효소들은 가닥 대체 활성(strand displacement activity)을 가질 수 있고, 이것은 중합 동안 하류 DNA 대체를 위한 상기 중합 효소의 기능을 일컫는다. 가닥-대체 중합 효소들(strand-displacing polymerases)은 5'에서 3' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성이 감소되거나 혹은 실질적으로 없을 수 있다. 원형 주형 분자 상에서, 가닥-대체 중합 효소들은 효율적으로 동일한 주형을 재서열하면서 상기 주형 서열의 종열 중복들(tandem repeats)을 생성할 수 있다. 종열 방식에서 서열 정보는 동일한 분자로부터 반복적으로 유도될 수 있기 때문에, 이는 특히 단분자 시퀀싱을 위한 장점이다. 본 발명에 적합한 가닥-대체 중합 효소의 비제한적 예는, Phi29 DNA 중합 효소, Bst DNA 중합 효소, T5 DNA 중합 효소, T4 DNA 중합 전효소, 파지 M2 DNA 중합 효소, 파지 PRDl DNA 중합 효소 및 DNA 중합 효소Ⅰ의 클레노브 프레그먼트를 포함한다.
몇몇 실시예들에서, 상기 중합 효소는 중합 도메인(polymerization domain)과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소를 포함하는 혼성 단백질이다. "혼성 단백질(hybrid protein)"이란 용어는 여기에서 여러 상위 서열들로부터의 아미노산 잔기들을 포함하는 단백질을 기술하는 데 사용된다. 혼성 중합 효소 단백질의 예들과 혼성 단백질들의 생성 방법들은 국제공개특허 WO 2004/011605에 기재되어 있다. 이러한 중합 효소들은 그리하여 비자연적으로 생성된 중합 효소들의 변종들이다.
몇몇의 실시예들에서, 강화된 진행성(processivity)을 갖는 중합 효소들을 사용하는 것은 유리하다. 이러한 예들은 국제공개특허 WO 01/92501과 미국등록특허 7,666,645에서 설명된 중합 효소를 포함한다. 이러한 향상된 중합 효소들은, 상기 중합 효소 또는 상기 중합 효소의 효소적 도메인(enzymatic domain)에 결합된 서열-비-특정 이중 가닥 DNA 결합 도메인(sequence-non-specific double stranded DNA binding domain)의 존재로 인해 강화된 프로세시티비티(processivity)를 보인다. 몇몇 실시예들에서, 상기 결합 도메인은 내열성 유기체에서 기인하며 예를 들어, 45℃ 이상과 같은 높은 온도에서 강화된 활성을 제공한다. 예를 들어, Sso7d와 Sac7d는 극호열성 고세균 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)와 S.아시도칼다리우스(S. acidocaldarius)에서 기인한 작고(약 7,000 kd MW) 기본적인 염색체 단백질들이다(각 Choli et al., BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 950: 193-203 (1988), Baumann et al., STRUCTURAL BIOL. 1 : 808-819 (1994), Gao, et al., NATURE STRUC. BIOL. 5: 782-786 (1998) 참조). 이러한 단백질들은 서열-독립 방식에서 DNA를 결합하고, 결합하면, 어떠한 조건 하에서 DNA의 녹는점을 40℃ 이상까지 증가시킨다(McAfee et al., BIOCHEMISTRY 34:10063-10077 (1995)). 이러한 단백질들과 그것의 상동들(homologs)은 향상된 중합 효소 방식 퓨전 단백질들에서 서열-비-특정 DNA 결합 도메인으로서 사용될 수 있다. Sso7d, Sac7d, Sac7e 및 이와 관련된 서열(여기에서 "Sso7 서열들" 혹은 "Sso7 도메인"으로 지칭됨)은 당해 기술 분야에서 알려져있다(열람번호 P39476 (Sso7d), P13123 (Sac7d), P13125 (Sac7e) 참조). 다른 서열-비-특정 이중 가닥 핵산 결합 단백질들(sequence non-specific double stranded nucleic acid binding proteins)은 토포이소머라아제(topoisomerase), 헬리카제(helicase) 또는 PCNA이다. 추가적인 예들이Motz, et al., J. BIOL. CHEM. 277: 16179-88 (2002)과 Pavlov, et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 99: 13510-13515 (2002)에 기재되어 있다.
적절한 핵산 중합 효소들은 핵산 중합 효소의 기능적 단편들(functional fragments)을 포함한다. 중합 효소의 "기능적 단편"은 중합 효소의 전체 아미노산 서열보다 적은 것을 포함하고, 적어도 하나의 조건 세트 하에서 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진하고 자기 교정 기능을 하는 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 통해 잘못 조합된 뉴클레오티드를 제거하는 기능을 갖는 야생형 또는 돌연변이 중합 효소의 어느 부분을 일컫는다.
발명의 다른 실시예들은, 주형-매개 리게이션(template-mediated ligation)과 같은 초기 가닥 합성을 위한 다른 메커니즘을 활용하는 복합체를 사용하거나, 또는 펩티드 결합 형성과 같은 비-인산이에스테르 결합(non-phosphodiester linkage)을 통해 상보적 뉴클레오시드(nucleoside)를 추가할 수도 있다. 이 발명의 목적을 위해, 그러한 합성 방법들 역시 5'에서 3' 방향으로 간주된다.
몇몇 실시예들에서, 본 발명의 핵산 합성은 헬리카제(helicase), 단일 가닥 DNA 결합 단백질들, 아데노바이러스(adenovirus) DNA 결합 단백질, HSV 단백질 ICP8 및 BMRF1 중합 효소 보조 서브 유닛과 같은 단백질을 포함하는 다른 인자들을 추가함으로써 강화될 수 있다.
1.2. 시퀀싱 프라이머(Sequencing Primer)
시퀀싱 프라이머는 감지되는 핵산의 분절(segment)에 상보적인 올리고핵산염(oligonucleotide)이거나, 상기 중합 효소에 의해 핵산 합성을 개시하는 지점의 역할을 할 수 있는 이와 관련된 말단 연결 프라이머이다. 몇몇 실시예들에서, 상기 시퀀싱 프라이머는 적어도 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 시퀀싱 프라이머는 8에서 25까지, 10에서 20까지 10에서 30까지 혹은 10에서 50까지의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 시퀀싱 프라이머는 자연적으로 발생한 뉴클레오티드, 자연 상태로는 존재하지 않는 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 뉴클레오티드들을 포함하는 모든 유형의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
프라이머는 증폭 시의 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일 가닥이지만, 예를 들어 "헤어핀(hairpin)" 프라이머들과 같은 셀프 어닐링(self-annealing) 또는 다른 상보적 서열에 어닐링됨으로써 이중 가닥이 될 수도 있다. 그러한 이중 가닥 프라이머는 "핫 스타트(hot start)" PCR을 활용하는 실시예들에 있어 특히 유용하다.
몇몇 실시예들에서, 시퀀싱 프라이머는 예를 들어 잠금 핵산들(locked nucleic acids)(LNAs; 폴리핵산(polynucleic acid)에 강화된 염기 적층 상호작용을 제공하는 변형된 리보뉴클레오티드들)과 같은 변형된 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. LNA의 활용에 대한 예시로서, Levin et al. (NUCLEIC ACID RESEARCH 34(20):142 (2006))은 LNA 함유 프라이머가 향상된 특성을 가지며 이에 상응하는 비-고정(unlocked) 프라이머에 관한 강한 결합을 나타냄을 보여주었다. 프라이머의 다른 위치들에 3개의 LNA 뉴클레오티드들을 (캡들 내에서) 포함하는 MCP1 프라이머(5'-cttaaattttcttgaat-3')의 세 가지 변형들이 만들어졌다: 즉, MCPl-LNA-3'(5'-cttaaattttCtTgaAt-3'); MCPl-LNA-5'(5'-CtTaAattttcttgaat-3'); 및 MCP1-LNA-even (5'-ctTaaatTttctTgaat-3')이다. 모든 LNA-치환 프라이머들(LNA-substituted primers)은 향상된 녹는점을 가졌고, 반면 상기 MCPl -LNA-5' 프라이머는 특히 강화된 시퀀싱 정확도(Phred Q30 counts)를 나타냈다. 따라서 특정 실시예들에서, 상기 시퀀싱 프라이머는 5' 영역(즉, 시퀀싱 프라이머의 5' 절반, 1/3 혹은 1/4와 같은)에서 적어도 하나의 잠긴(locked) 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서 프라이머들은, 감지 가능한 라벨, 5' 블로킹 그룹(5' blocking group) 혹은 결합 도메인들을 포함하는 추가적인 분자 기들(molecular groups)을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 시퀀싱 프라이머와 표본 핵산은 10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA 완충제와 같이, 상기 표본 핵산을 시퀀싱 프라이머의 몰 액세스(molar excess)와 함께 함염 용액에 섞음으로써 혼성될 수 있다. 상기 혼합물은 최소 5분간 65℃까지 가열될 수 있고, 실온까지 천천히 냉각되어 프라이머/주형 어닐링을 가능하게 할 수 있다. 잔류 프라이머들은 예를 들면 분자 체(molecular sieve)를 포함하는 적당한 수단에 의해 제거될 수 있다.
말단 연결부와 시퀀싱 프라이머들 모두를 포함하는 프라이머들은 서열의 시각적 조사 또는 컴퓨터-보조의 프라이머 설계(primer design)를 포함하는 적당한 방법에 의해 고안될 수 있다. DNAStar™ (DNAStar, Inc., Madison, WI), OLIGO 4.0 (National Biosciences, Inc.), Vector NTI® (Invitrogen), Primer Premier 5 (Premierbiosoft) 및 Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)을 포함한 많은 소프트웨어 패키지들이 상기 프라이머 설계를 돕는 데 유용하다. 프라이머들은, 예를 들어 서열화될 분자, 특성, 길이, 최적 녹는점, 이차 구조, 프라이머 이합체들(primer dimmers), GC 내용, pH 및 완충 용액의 이온 세기와 사용된 효소(즉, 중합 효소 또는 리가아제(ligase))를 고려하여 설계될 수 있다 (Sambrook and Russell, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001) 참조). 몇몇 실시예들에서, 프라이머들은 멀티플렉스 PCR을 위해서 혹은 미지의 서열과 함께 주형 분자를 증폭할 때, 다른 서열들의 혼합물을 구성할 수 있다. 후자의 경우, 프라이머 설계는 불필요하며, 무작위 서열들의 혼합이 상기 프라이머들 대신으로 사용될 수 있다.
1.3. 말단 연결 프라이머
몇몇 실시예들에서, 선형 핵산은 핵산의 5' 말단, 3' 말단 혹은 5' 말단과 3' 말단 모두에 연결된 말단 연결 프라이머를 하나 또는 그 이상 더 포함한다. 특정 실시예들에서, 말단 연결 프라이머는 상기 핵산의 3' 말단에 접합될 수 있다. 말단 연결 프라이머는 시퀀싱 프라이머에 대한 상보적 서열 제공하는 데 사용될 수 있다.
말단 연결 프라이머들은 보통 100개 미만의 뉴클레오티드들로 구성된 짧은 핵산 분자들이다. 몇몇 실시예들에서, 말단 연결 프라이머는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 90 또는 그 이상 뉴클레오티드들 길이이다. 특정 실시예들에서, 말단 연결 프라이머들은 8에서 25, 10에서 20, 10에서 30 혹은 10에서 50 뉴클레오티드들 길이일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 말단 연결 프라이머들은 분기(分岐)되지 않을 수 있으나, 다른 실시예들에서, 이들은 분기(分岐)될 수 있다.
상기 말단 연결 프라이머는 시퀀싱 프라이머의 상보로서 작용한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 말단 연결 프라이머의 5' 말단은 시퀀싱 프라이머에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 시퀀싱 프라이머에 상보적인 상기 말단 연결 프라이머 서열이 지향되어, 상기 시퀀싱 프라이머의 3' 말단은 서열화될 핵산 내의 제1 뉴클레오티드에 바로 인접할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 말단 연결 프라이머들은 상기 핵산의 말단들에 추가되어 DNA 리가아제와 같은 리가아제로 감지될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 감지될 상기 말단 연결 프라이머와 핵산은 모두 리게이션(ligation) 이전에 단일 가닥일 수 있다. 다른 실시예들에서, 두 가지는 모두 이중 가닥일 수 있다. 또 다른 실시예들에서, 하나는 단일 가닥, 다른 하나는 이중 가닥일 수 있다. 리게이션(ligation)은 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴로니(polony) 시퀀싱 방법에서, Shendure et al. (SCIENCE, 309:1728-1732 (2005))은 a T30 말단 연결 프라이머 (32 bp)를 New England Biolabs' (NEB) Quick Ligation kit을 가지고 표본 DNA 세그먼트에 리게이트(ligated)하였다. 거기서, 리게이션 반응 용액은 1X 빠른 리게이션 완충제에 DNA 0.26 pmole, T30 말단 연결 프라이머 0.8 pmole, 4.0 ㎕ T4 DNA 리가아제를 포함하였다. 혼합 후, 상기 반응 용액은 약 10분간 실온에서 배양되었으며, 이후 얼음 위에 놓여졌다. 상기 리게이션 반응은 65℃까지 10분간 표본을 가열함에 따라 중단되었다.
몇몇 실시예들에서, 상기 말단 연결 프라이머는 서열화될 상기 핵산 상에서 합성될 수 있다. 예를 들어, 상기 말단 연결 프라이머는 말단 전이 효소(terminal transferase)에 의해 추가된 동종 중합체(homopolymer)일 수 있다. 예를 들면, Harris et al., (SCIENCE 320:106-109 (2008))은 DNA 주형들로 폴리-A 테일(poly-A tail)을 첨가했으며, 이것은 바이러스성 게놈의 단분자 시퀀싱에서 폴리-T 시퀀싱 프라이머의 상보로서 수행할 수 있다.
1.4. 뉴클레오티드 유사체
실시예들은 합성에 의한 핵산 시퀀싱의 기질로서 뉴클레오티드 유사체들의 사용을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 개별 유사체는 염기쌍 모이어티와 라벨 모이어티를 포함한다. 상기 염기쌍 모이어티는 반응 복합체의 결합 사이트에서 상응하는 주형 핵산 가닥의 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 염기(예를 들어, 아데닌(adenine), 사이토신(cytosine), 구아닌(guanine), 티민(thymine), 우라실(uracil), 하이포크산틴 또는 5-메틸사이토신(5-methylcytosine))를 각각 포함하는 유사체의 5' 말단에 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기들을 포함할 수 있다. 상기 유사체의 라벨 모이어티가 인산 결합을 통해 상기 염기쌍 모이어티의 3' 말단으로 연결될 수 있다. 이때, 상기 라벨 모이어티는 (1) 광-감지 라벨과 상기 광-감지 라벨을 상기 인산에 연결하는 선택적 연결 인자(optional linker) 및 (2) 하나 또는 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들을 포함하는 작용기, 광-감지 라벨 및 상기 광-감지 라벨을 하나 또는 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들에 연결하는 선택적 연결 인자로부터 선택된다. 뉴클레오티드 유사체에 적용되는 상기 "비-상보적"이란 용어는 주형 서열의 상응하는 염기와 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍(예를 들어, A-T, C-G 또는 A-U와 같은 쌍)을 형성하는 능력이 실질적으로 부족한 뉴클레오티드를 의미한다. 비-상보적 뉴클레오티드 유사체들은 어베이직(abasic) 뉴클레오티드 잔기들과, 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 혹은 우라실 중 어떠한 것과도 염기쌍을 이루는 능력이 실질적으로 부족한 염기를 포함하는 뉴클레오티드 잔기들을 포함한다. 상기 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들은 결과적으로 본 발명의 중합 효소인 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 통해 제거되는 "부조합(mismatch)"("잘못 조합된 뉴클레오티드")을 야기할 수 있다.
실시예들은 복수의 뉴클레오티드 유사체들의 사용을 포함하며, 상기 복수의 뉴클레오티드 유사체들의 개별 유사체는 화학식 1에 도시된 구조를 갖거나,
Figure pct00005
<화학식Ⅰ>
혹은 약학적으로 수용 가능한 염이나 이의 수화물이다.
이때, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이고;
R1과 각 R2는 O-와
Figure pct00006
로부터 선택되면, 이때
ⅰ) R1과 각 R2는 O-이거나,
ⅱ) R1은
Figure pct00007
이고, 각 R2는 O-이거나,
ⅲ) R1은 O-이고, R2의 하나는
Figure pct00008
이고, 나머지 R2는 독립적으로 O-, S-, BH3 -, CH3이며;
R3은 형광염료 F를 포함하는 뉴클레오티드 모이어티이고;
R4는 H, OH, 할로겐(불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는), 알킬(CH3, CH2CH3을 포함하는) 또는 알콕시(치환되거나 치환되지 않은 것 모두)(OCH3, OCH2CH3을 포함하는)이며;
Y1과 Y3은 O-, S-, BH3 -, CH3로부터 각각 독립적으로 선택되고;
L1은 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알카이닐(alkynyl), 아릴(aryl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로사이클릴(heterocyclyl), 에스테르(ester), 아미노(amino) 및 설포닐(sulfonyl)로부터 선택되며;
Q는 형광 소광 모이어티이고;
B1은 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민, 우라실, 하이포크산틴 및 5-메틸사이토신으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 예를 들어 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 몇몇 실시예들에서, n은 1, 2, 3 또는 4이다. 예를 들어, n은 1, 2 또는 3이다. 특정 실시예들에서, n은 1이다.
R3 기들(groups)로 적합한 뉴클레오티드 모이어티들은 모노뉴클레오티드(mononucleotides), 디뉴클레오티드(dinucleotides) 및 트리뉴클레오티드(trinucleotides)를 포함한다. 몇몇 실시예들에서,
R3은
Figure pct00009
Figure pct00010
및
Figure pct00011
로부터 선택된다.
이때, B2는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민, 우라실, 하이포크산틴 및 5-메틸사이토신으로부터 선택되고;
X1은 메틸렌(methylene); L2; 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기; 및 L2와, 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기를 포함하는 작용기(group)로부터 선택되며, 이때, L2는 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 에스테르, 아미노 및 설포닐로부터 선택되며;
X2는 H, CH3 및 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기로부터 선택되고;
각 R4는 H, OH, 할로겐(불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는), 알킬(CH3, CH2CH3을 포함하는), 알콕시(치환되거나 혹은 치환되지 않은 것 모두)(OCH3, OCH2CH3을 포함하는)이며;
Y2는 O-, S-, BH3 - 및 CH3로부터 선택된다.
예를 들어, R3은
Figure pct00012
Figure pct00013
및
Figure pct00014
로부터 선택될 수 있다.
염기 B1과 B2는 각각 독립적으로 예를 들면, 퓨린(purinen) 또는 피리미딘(pyrimidine)일 수 있다. 예를 들어 B1 또는 B2는 아데닌 사이토신, 구아닌, 티민, 우라실, 하이포크산틴일 수 있다. 염기 B1과 B2는 또한 각각, 예를 들어, 자연적으로 발생한 것이거나, 피라졸로(3,4-d)-피리미딘(pyrazolo(3,4- d)-pyrimidine); 5-메틸 사이토신 (5-me-C)(5 -methyl cytosine (5-me-C)); 5-하이트록시메틸 사이토신(5-hydroxymethyl cytosine); 잔틴(xanthine); 하이포크산틴; 2-아미노아데닌(2-aminoadenine); 6-메틸(6-methyl)을 포함하는 염기의 합성 유도체, 또는 아데닌 혹은 구아닌; 2-프로필(2-propyl)의 다른 알킬 유도체, 또는 아데닌 혹은 구아닌; 2-티오우라실(2-thiouracil); 2-티오티민(2-thiothymine); 2-티오사이토신(2-thiocytosine); 5-프로피닐 우라실(5-propynyl uracil); 5-프로피닐사이토신(5-propynylcytosine); 6-아조 우라실(6-azo uracil); 6-아조 사이토신(6-azo cytosine); 6-아조 티민(6-azo thymine); 유사 우라실(pseudouracil); 4-티오우라실(4-thiouracil); 8-할로(8-halo)(예를 들어, 8-브로모(8-bromo)), 8-아미노(8-amino), 8-티올(8-thiol), 8-티오알킬(8-thioalkyl), 8-하이드록실(8-hydroxyl)의 다른 알킬 유도체, 그리고 다른 8-치환된 우라실 혹은 사이토신(other 8- substituted adenine or guanine); 5-할로(5-halo) (예를 들어, 5-브로모(5-bromo)), 5-트리플루오로메틸(5-trifluoromethyl), 그리고 다른 5-치환된 우라실 혹은 사이토신(other 5- substituted uracil or cytosine); 7-메틸구아닌(7-methylguanine); 7-메틸아데닌(7-methyladenine); 8-아자구아닌(8-azaguanine); 8-아자아데닌(8-azaadenine); 디아자구아닌(deazaguanine); 7-디아자구아닌(7-deazaguanine); 3-디아자구아닌(3-deazaguanine); 디아자아데닌(deazaadenine); 7-디아자아데닌(7-deazaadenine); 3-디아자아데닌(3 -deazaadenine); 피라졸로(3,4-d)피리미딘(pyrazolo(3,4-d)pyrimidine); 이미다조(1,5-a)-1,3,5 트리아지논(an imidazo(l,5-a)-l,3,5 triazinone); 9-디아자퓨린(a 9-deazapurine); 이미다조(4,5-d)-피라진(an imidazo(4,5-d)-pyrazine); 티아졸로(4,5-d)-피리미딘(a thiazolo(4,5-d)-pyrimidine); 피라진-2-하나(a pyrazin-2-one); 1,2,4-트리아진(a 1 ,2,4-triazine); 피리다진(a pyridazine); 1,3,5 트리아진(a 1 ,3,5 triazin); 혹은 이와 같은 것일 수 있다.
상기 뉴클레오티드 유사체들 및 여기에 기재한 방법들에 유용한 염기들은 염기 B1(및 몇몇 실시예들에 따르면 염기 B2)을 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 중합 효소를 통해 초기 사슬로 결합시키고, 상기 주형 가닥 상의 하나 또는 그 이상의 염기들을 가지고 하나 또는 그 이상의 염기쌍들을 형성하는 것을 허용할 수 있다. 상기 "염기 쌍"이란 용어는 상기 표준 AT, AU 또는 GC 염기쌍들 뿐 아니라, 비-표준 혹은 변형된 염기들을 포함하는 뉴클레오티드들 및/또는 뉴클레오티드 유사체들 사이에 형성되는 염기쌍들까지 포함하고, 이때 수소 결합의 도너들(donors) 및 억셉터들(acceptors)의 배열은 비-표준 염기와 표준 염기 사이 혹은 두 개의 상보적 비-표준 염기 구조들 사이에 수소 결합을 허용한다. 이러한 비-표준 염기쌍의 한 예는 염기 유사체 하이포크산틴 및 아데닌, 사이토신, 혹은 우라실 중 어느 것과의 사이에 있는 염기쌍이며, 두 수소 결합들은 상기 염기쌍에서 형성된다.
중합을 지속하기 위해 상기 뉴클레오티드 유사체들은 상기 유사체가 초기 또는 성장 가닥으로 결합되고 난 후 자기 교정 기능을 하는 중합 효소의 상기 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 통해 제거되는 작용기를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법들에 사용되는 뉴클레오티드 유사체들은 모노뉴클레오티드 유사체들이며, 이때 상기 유사체들은 R3 기에 있는 라벨 모이어티를 포함한다. 바람직하게는, 상기 라벨 모이어티는 광-감지 라벨, 혹은 광-감지 라벨 및 상기 광-감지 라벨을 상기 3' 인산염에 연결하는 링커를 포함한다. 예를 들어, 상기 링커는 여기에 정의된 것으로 L2이다. 이러한 실시예들에서, 상기 유사체가 중합 효소에 의해 성장 가닥으로 결합되고 나면, 상기 인산염, 선택적 링커 및 광-감지 라벨이 제거되어, 차후 결합 단계에서 유입되는 뉴클레오티드 유사체(incoming nucleotide analog)의 5' 인산염과의 결합을 위한 상기 3'-OH를 자유롭게 할 수 있다. 이 제거는 상기 자기 교정 효소의 상기 자기 교정 기능을 하는 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성에 의해 촉진될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 본 방법들에 사용되는 뉴클레오티드 유사체들은 모노뉴클레오티드 유사체들이며, 이때 상기 유사체들은 라벨 모이어티로서, 광-감지 라벨, 혹은 광-감지 라벨 및 상기 광-감지 라벨을 상기 3' 인산염에 연결하는 링커를 포함하는 작용기 R3을 포함하나, 상기 링커는 상기 광-감지 라벨을상기 3' 인산염으로부터 분리하기 위해 제거될 수 없다. 예를 들어, 상기 링커는 여기에 정의된 것으로 L2이다.
몇몇 실시예들에서, 상기 화학식 I의 구조를 갖는 뉴클레오티드 유사체들은 바이뉴클레오티드 유사체들이며, 이때 상기 유사체들은 라벨 모이어티로서 상기
Figure pct00015
구조를 갖는 작용기 R3을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 화학식Ⅰ의 상기 구조를 갖는 뉴클레오티드 유사체들은 트리뉴클레오티드 유사체들이며, 이때 상기 유사체들은 라벨 모이어티로서
Figure pct00016
혹은
Figure pct00017
의 구조를 갖는 작용기 R3을 포함한다. 이러한 바이뉴클레오티드 혹은 트리뉴클레오티드 실시예들에서, F는 광-감지 라벨, Y2는 O, CH3, BH2, S이고, 각 X1, 및 X2 작용기들은 주형 가닥에 있는 상응하는 염기와 함께 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기이다. 몇몇 실시예들에서, 작용기 X1은 링커이다. 적합한 링커들은, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 에스테르, 아미노, 설포닐 링커들(sulfonyl linkers), 혹은 이와 같은 것을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 링커는 치환된 알킬, 알케닐, 알카이닐, 혹은 아미노이다. 몇몇 실시예들에서, 상기 링커는 알킬, 알케닐, 알카이닐, 혹은 이종 원자들에 간섭받는 아미노이다. 몇몇 실시예들에서, 예를 들어, 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)이다. 상기 링커는 비-반응적이며 상기 광-감지 라벨과 상기 뉴클레오티드 유사체의 잔여물 사이에 입체 장애(steric hindrance)를 최소화하는 다른 적합한 링커일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 작용기 X1 및 X2 둘 중 하나 혹은 모두는 자연적으로 발생한 것 또는 합성 피리미딘 혹은 퓨린 유도체를 포함하는 염기이고, 이것은 표적 핵산 가닥에 있는 어느 염기쌍과도 상보적이지 않다. 몇몇 실시예들에서, X2는 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 에스테르, 아미노, 혹은 설포닐 기이다. 몇몇 실시예들에서, X2 는 수소이다. 상기 유사체가 염기 B2와 작용기 Y2를 포함하는 트리뉴클레오티드 유사체인 실시예들에서, 작용기 Y2는 S-, CH3 , BH3 - 일 수 있으며, 이에 따라 염기 B2를 포함하는 상기 뉴클레오티드 잔기의 3'에서 5' 방향으로 진행되는 제거가 이후 상기 뉴클레오티드 유사체의 성장 가닥으로의 결합에서 방지될 수 있다.
각 R4는 독립적으로 H, OH, 할로겐(불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는), 알킬(CH3, CH2CH3을 포함하는) 또는 알콕시(치환되거나 치환되지 않은 것 모두)(OCH3, OCH2CH3을 포함하는)이다. 다른 실시예에서, R4는 독립적으로 H, OH, 불소 또는 OCH3이다. 예를 들어, 모든 R4 작용기들은 수소일 수 있다. 이와는 달리, 모든 R4 작용기들은 OH일 수 있다.
상기 광-감지 라벨 F는 뉴클레오티드 유사체에 부착되거나(attached) 혹은 뉴클레오티드 유사체에 관련될(associated) 수 있으며 감지 신호를 제공하는 기능을 하는 모이어티일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 라벨은 작은 분자 형광 라벨(small molecule fluorescent label) 같은 형광 라벨이다. 형광 라벨로서 적합한 것으로 유용한 형광 분자들(형광단들)은 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-Methylumbelliferone; 5-carboxy-2,7-dichlorofluorescein; 5-Carboxyfluorescein (5-FAM); fluorescein amidite (FAM); 5-Carboxynapthofluorescein; tetrachloro-6-carboxyfluorescein (TET); hexachloro-6-carboxyfluorescein (HEX); 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE); VIC® NED™; tetramethylrhodamine (TMR); 5-Carboxytetramethylrhodamine (5-TAMRA); 5-HAT (Hydroxy Tryptamine); 5 -Hydroxy Tryptamine (HAT); 5-ROX (carboxy-X-rhodamine); 6-Carboxyrhodamine 6G; 6- JOE; Light Cycler® red 610; Light Cycler® red 640; Light Cycler® red 670; Light Cycler® red 705; 7-Amino-4-methylcoumarin; 7-Aminoactinomycin D (7-AAD); 7-Hydroxy-4-methylcoumarin; 9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine; ABQ; Acid Fuchsin; ACMA (9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine); Acridine Orange; Acridine Red; Acridine Yellow; Acriflavin; Acriflavin Feulgen SITSA; AFPs-AutoFluorescent Protein-(Quantum Biotechnologies); Texas Red; Texas Red-X conjugate; Thiadicarbocyanine (DiSC3); Thiazine Red R; Thiazole Orange; Thioflavin 5; Thioflavin S; Thioflavin TCN; Thiolyte; ThiozoleOrange; Tinopol CBS (Calcofluor White); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; TriColor (PE-Cy5); TRITC (TetramethylRodamine-lsoThioCyanate); True Blue; TruRed; Ultralite; Uranine B; Uvitex SFC; WW 781; X-Rhodamine; XRITC; Xylene Orange; Y66F; Y66H; Y66W; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3, Sybr Green, Thiazole orange와 같은 인터킬레이팅(interchelating) 염료; Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700 및 750과 같은 넓은 스펙트럼을 커버하고 일반적인 여기 소스들(excitation sources)의 주요한 출력 파장들에 잘 맞는 (Molecular Probes/Invitrogen 사의) 알렉사 형광염료 시리즈들(Alexa Fluor® dye series)의 구성 요소들; Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7과 같은, 역시 넓은 스펙트럼을 커버하는 (GE Healthcare 사의) Cy 염료 형광단 시리즈들의 구성 요소들; Oyster-500, -550, -556, 645, 650, 656과 같은 (Denovo Biolabels 사의) 오이스터 염료 형광단들(Oyster® dye fluorophores)의 구성 요소들; 예를 들어, 418nm(DY-415) 내지 844nm(DY-831) 범위의 최대 흡수를 갖는 DY-415, -495, -505, -547, -548, -549, -550, -554, -555, -556, -560, -590, -610, -615, -630, -631, -632, -633, -634, -635, -636, -647, -648, -649, -650, -651, -652, -675, -676, -677, -680, -681 , -682, -700, -701, -730, -731 , -732, -734, -750, -751, -752, -776, -780, -781 , -782, -831, -480XL, -481XL, -485XL, -510XL, -520XL, -521XL과 같은, (Dyomics 사의) DY-라벨들 시리즈들의 구성 요소들; ATTO 390, 425, 465, 488, 495, 520, 532, 550, 565, 590, 59®4, 610, 61 IX, 620, 633, 635, 637, 647, 647N, 655, 680, 700, 725, 740과 같은 (ATTO-TEC GmbH 사의) 형광 라벨들의 ATTO 시리즈들의 구성 요소들; CAL Fluor® Gold 540, CAL Fluor® Orange 560, Quasar® 570, CAL Fluor® Red 590, CAL Fluor® Red 610, CAL Fluor® Red 635, Quasar® 570 및 Quasar® 670과 같은 (Biosearch Technologies 사의) CAL® 형광 시리즈들 혹은 염료들의 Quasar® 시리즈들의 구성 요소들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
몇몇 실시예들에서, 상기 광-감지 라벨 F는 제2 광-감지 라벨 모이어티와 상호작용을 하여, 예를 들어, 형광 공명 에너지 전이("FRET", F
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rster resonance energy transfer로서도 알려짐)와 같은 상기 제1 혹은 제2 라벨에 의해 제공된 상기 감지 라벨을 변형할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 초기 가닥으로 결합된 뉴클레오티드들은 형광 공명 에너지 전이-기반(fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based) 감지를 이용해 감지된다. 예를 들어, 몇몇 실시예들에서, 미국특허공개번호 제2010/0035268호에서 기재된 것으로서 FRET-기반 방법이 사용될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 형광 도너(fluorescence donor)로서 작용할 수 있는 양자 점이 시퀀싱 프라이머에 연결될 수 있고, 상기 성장 가닥을 합성하는 데 사용된 상기 뉴클레오티드 유사체들은 형광 억셉터(fluorescence acceptor)인 라벨 F를 이송한다. 핵산 중합 효소 반응 사이트에서 상기 형광단 표지된(fluorophore-labeled) 뉴클레오티드 유사체의 상기 성장 뉴클레오티드 가닥으로의 결합은 상기 여기된 양자 점 형광 도너로부터의 형광 진공 에너지 전이에 뒤 이은 상기 유사체-연결된(analog-linked) 형광 억셉터의 방출을 감지함으로써 실시간 감지된다. 각 결합된 뉴클레오티드 유사체의 정체는 형광 라벨에 의해 결정되고, 이는 상기 유사체가 상기 성장 가닥으로 결합되는 동안 그리고 상기 형광 라벨을 포함하는 상기 유사체의 비-상보적 모이어티가 상기 자기 교정 기능을 하는 중합 효소의 상기 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성에 의해 제거될 때까지 감지될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 형광 소광 모이어티 Q를 포함한다. 형광 소광 모이어티는 상기 형광 라벨에 인접해 위치할 때 여기된 형광 라벨의 에너지를 흡수할 수 있는 모이어티 및 시각적 빛의 방출 없이도 그 에너지를 소멸시킬 수 있는 모이어티를 포함한다. 적절한 형광 소광 모이어티들은, 예를 들어, Deep Dark Quencher I (DDQ-I); 4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)benzoic acid, succinimidyl ester (DABCYL); Eclipse® dark quencher; Iowa Black® FQ; BHQ-1; QSY-7; BHQ-2; Deep Dark Quencher II (DDQ-II); Iowa Black® RQ; QSY-21; BHQ-3 및 기타를 포함한다. 형광 소광 모이어티 Q는 뉴클레오티드 유사체의 감마 혹은 베타 인산염에 연결될 수 있다. 형광 소광 모이어티 Q는 연결자 L1을 통해 상기 뉴클레오티드 3인산염 유사체의 상기 감마 혹은 베타 인산염에 연결될 수 있다. 적절한 연결자들은, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 아카이닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 에스테르, 아미노, 설포닐, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 연결자들, 혹은 기타를 포함한다. 상기 연결자는 비-반응적이며 상기 형광 소광 모이어티와 상기 뉴클레오티드 유사체의 상기 잔여물 사이 입체 장애를 최소화하는 다른 적절한 연결자일 수 있다.
여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "알킬"은 여기에 각각 (C1-C22)알킬, (C1-C8)알킬 및 (C1-C6)알킬로 참조된 1-22, 1-8 혹은 1-6 탄소 원자들의 직쇄 혹은 분기된 작용기(straight or branched group)와 같은 포화된 직쇄 혹은 분기 탄화수소를 일컫는다. 예시적 알킬 작용기들은 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 프로필(propyl), 아이소프로필(isopropyl), 2-메틸-1-프로필(2-methyl-l-propyl), 2-메틸-2-프로필(2-methyl-2-propyl), 2-메틸-1-부틸(2-methyl-l-butyl), 3-메틸-1-부틸(3-methyl-1-butyl), 2-메틸-3-부틸(2-methyl-3-butyl), 2,2-디메틸-1-프로필(2,2-dimethyl-l-propyl), 2-메틸-1-펜틸(2-methyl-l-pentyl), 3-메틸-1-펜틸(3-methyl-1-pentyl), 4-메틸-1-펜틸(4-methyl-l-pentyl), 2-메틸-2-펜틸(2-methyl-2-pentyl), 3-메틸-2-펜틸(3-methyl-2-pentyl), 4-메틸-2-펜틸(4-methyl-2-pentyl), 2,2-디메틸-1-부틸(2,2-dimethyl-l-butyl), 3,3-디메틸-1-부틸(3,3 -dimethyl-1-butyl), 2-에틸-1-부틸(2-ethyl-l-butyl), 부틸(butyl), 아이소부틸(isobutyl), t-부틸(t-butyl), 펜틸(pentyl), 아이소펜틸(isopentyl), 네오펜틸(neopentyl), 헥실(hexyl), 헵틸(heptyl), 옥틸(octyl) 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "알케닐"은 여기에 각각 (C2-C22)알케닐, (C2-C8)알케닐 및 (C2- C6)알케닐로 참조된 2-22, 2-8, 혹은 2-6 탄소 원자들의 직쇄 혹은 분기된 작용기와 같은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화된 직쇄 혹은 분기된 탄화수소를 일컫는다. 예시적 알케닐 작용기들은 비닐(vinyl), 알릴(allyl), 부테닐(butenyl), 펜테닐(pentenyl), 헥세닐(hexenyl), 부타디에닐(butadienyl), 펜타디에닐(pentadienyl), 헥사디에닐(hexadienyl), 2-에틸헥세닐(2-ethylhexenyl), 2-프로필-2-부테닐(2-propyl-2-butenyl), 4-(2-(메틸-3-부텐)-펜테닐(4-(2-methyl-3-butene)-pentenyl), 기타를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "알카이닐"은 여기에 각각 (C2-C22)알카이닐, (C2-C8)알카이닐, 및 (C2- C6)알카이닐로 참조된 2-22, 2-8, 혹은 2-6 탄소 원자들의 직쇄 혹은 분기된 작용기와 같은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화된 직쇄 혹은 분기된 탄화수소를 일컫는다. 예시적 알카이닐 작용기들은 에티닐(ethynyl), 프로피닐(propynyl), 부티닐(butynyl), 펜티닐(pentynyl), 헥시닐(hexynyl), 메틸프로피닐(methylpropynyl), 4-메틸-1-부티닐(4-methyl-1-butynyl), 4-프로피닐-2-펜티닐(4-propyl-2-pentynyl) 및 4-부틸-2-헥시닐(4-butyl-2-hexynyl), 기타를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "아릴"은 모노-, 바이-, 혹은 다른 다중-카보사이클릭(multi-carbocyclic), 방향 고리 시스템(aromatic ring system)을 일컫는다. 상기 아릴 작용기는 선택적으로 아릴들(aryls), 사이클로알킬들(cycloalkyls) 및 헤테로사이클릴들(heterocyclyls)로부터 선택된 하나 혹은 그 이상의 고리들에 융합될 수 있다. 상기 아릴 작용기는 알콕시(alkoxy), 아릴록시(aryloxy), 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알카이닐(alkynyl), 아미드(amide), 아미노(amino), 아릴(aryl), 아릴알킬)arylalkyl, 카바네이트(carbamate), 카르복시(carboxy), 시아노(cyano), 사이클로알킬(cycloalkyl), 에스테르, 에테르(ether), 포밀(formyl), 할로겐, 할로알킬(haloalkyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로사이클릴(heterocyclyl), 하이드록실(hydroxyl), 케톤(ketone), 니트로(nitro), 인산염, 황화물, 설피닐(sulfinyl), 설포닐(sulfonyl), 설폰산(sulfonic acid), 설폰아미드(sulfonamide) 및 티오케톤(thioketone)으로부터 선택된 작용기들로 치환될 수 있다. 예시적 알릴 작용기들은 페닐(phenyl), 토릴(tolyl), 안트라세닐(anthracenyl), 플루오레닐(fluorenyl), 인데닐(indenyl), 아줄레닐(azulenyl) 및 나프닐(naphthyl) 뿐만 아니라 5,6,7,8-테트라하이드로나프틸(5,6,7,8-tetrahydronaphthyl)과 같은 융합된 카보사이클릭 모이어티에 융합된 벤조(benzo)도 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적 아릴 작용기들은 또한 모노사이클릭 방향 고리 시스템(monocyclic aromatic ring system)을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이때 상기 고리는 여기에 "(C6)아릴"로서 언급된 6개 탄소 원자들을 포함한다.
여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "헤테로아릴"은 모노-, 바이- 혹은 다중-사이클릭(multi-cyclic), 하나 혹은 그 이상의 헤테로원자를 포함하는, 예를 들어, 질소, 산소 및 황과 같은 한 개 내지 세 개의 헤테로 원자들을 포함하는, 방향 고리 시스템을 일컫는다. 헤테로아릴들은 알콕시, 아릴록시, 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아미드, 아미노, 아릴, 아릴알킬, 카바네이트, 카르복시, 시아노, 사이클로알킬, 에스테르, 에테르, 포밀, 할로겐, 할로알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 하이드록실, 케톤, 니트로, 인산염, 황화물, 설피닐, 설포닐, 설폰산, 설폰아미드 및 티오케톤을 포함하는 하나 혹은 그 이상 치환기들로 치환될 수 있다. 헤테로아릴들은 또한 비-방향 고리들로 융합될 수 있다. 헤테로아릴 작용기들의 도해적 예들은 피미디닐(pyridinyl0, 피리다지닐(pyridazinyl), 피리미딜(pyrimidyl), 피라질(pyrazyl), 트리아지닐(triazinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 피라졸릴(pyrazoly)l, 이미다졸릴(imidazolyl), (1,2,3)- 및 (1,2,4)-트리아졸릴((1,2,3)- and (l,2,4)-triazolyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피리미디릴(pyrimidilyl), 테트라졸릴(tetrazolyl), 퓨릴(furyl), 티에닐(thienyl), 아이속사졸릴(isoxazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 퓨릴(furyl), 페닐(phenyl), 아이속사졸릴(isoxazolyl) 및 옥사졸릴(oxazoly)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적 헤테로아릴 작용기들은 모노사이클릭 방향 고리를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이때 "(C2-C5)헤테로아릴"로서 여기에 참조된 상기 고리는 2개 내지 5개의 탄소 원자들과 1개 내지 3개의 헤테로원자들을 포함한다.
여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클"은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 한 개, 두 개 또는 세 개의 헤테로원자들을 포함하는, 포화되거나 혹은 불포화된 3원, 4원, 5원, 6원, 혹은 7원 고리(3-, 4-, 5-, 6- or 7-membered ring)를 일컫는다. 헤테로사이클들은 방향족(aromatic)(헤테로아릴들) 혹은 비-방향족(non-aromatic)일 수 있다. 헤테로사이클들은 알콕시, 아릴록시, 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아미드, 아미노, 아릴, 아릴알킬, 카바네이트, 카르복시, 시아노, 사이클로알킬, 에스테르, 에테르, 포밀, 할로겐, 할로알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 하이드록실, 케톤, 니트로, 인산염, 황화물, 설피닐, 설포닐, 설폰산, 설폰아미드 및 티오케톤을 포함하는 하나 혹은 그 이상의 치환기들로 치환될 수 있다. 헤테로사이클들은 또한 바이사이클릭(bicyclic), 트리사이클릭(tricyclic) 및 상기 헤테로사이클릭 고리들 중 어느 것이든 아릴들, 사이클로알킬들 및 헤테로사이클들로부터 독립적으로 선택된 하나 혹은 두 개의 고리들에 융합되는 테트라사이클릭(tetracyclic) 작용기들을 포함한다. 예시적 헤테로사이클들은 아크리디닐(acridinyl), 벤지미다졸릴(benzimidazolyl), 벤조퓨릴(benzofuryl), 벤조티아졸릴(benzothiazolyl), 벤조티에닐(benzothienyl), 벤조옥사졸릴(benzoxazolyl), 바이오티닐(biotinyl), 시놀리닐(cinnolinyl), 디하이드로퓨릴(dihydrofuryl), 디하이드로인도릴(dihydroindolyl), 디하이드로피라닐(dihydropyranyl), 디하이드로티에닐(dihydrothienyl), 디티아졸릴(dithiazolyl), 퓨릴(furyl), 호모피페리디닐(homopiperidinyl), 미디다졸리디닐(imidazolidinyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 인도릴(indolyl), 아이소퀴놀릴(isoquinolyl), 아이소티아졸리디닐(isothiazolidinyl), 아이소티아졸릴(isothiazolyl), 아이속사졸리디닐(isoxazolidiny)l, 아이속사졸릴(isoxazolyl), 모르포리닐(morpholinyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 옥사졸리디닐(oxazolidinyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 피페라지닐(piperazinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 피라닐(pyranyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라졸리닐(pyrazolinyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 피리딜(pyridyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피리미딜(pyrimidyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 피롤리딘-2-오닐(pyrrolidin-2-onyl), 피롤리닐(pyrrolinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 퀴녹사로일(quinoxaloyl), 테트라하이드로퓨릴(tetrahydrofuryl), 테트라히아드로아이소퀴놀릴(tetrahydroisoquinolyl), 테트라하이드로피라닐(tetrahydropyranyl), 테트라히아드로퀴놀릴(tetrahydroquinolyl), 테트라졸릴(tetrazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 티아졸릴디닐(thiazolidinyl), 티아졸릴(thiazolyl), 티에닐(thienyl), 티오모르포리닐(thiomorpholinyl), 티오피라닐(thiopyranyl) 및 티아졸릴(triazoly)을 포함한다.
상기 용어 "에스테르"는 -C(O)O-, -C(O)O-Rj-, RkC(O)O-Rj-, 혹은 -RkC(O)O-구조를 일컫고, 여기서 O는 수소에 결합되지 않으며, Rj 및 Rk는 알콕시, 아릴록시, 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아미드, 아미노, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 에테르, 할로알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택될 수 있다. Rk는 수소일 수 있고, 그러나 Rj는 수소일 수가 없다. 상기 에스테르는 고리형일 수 있고, 예를 들어, 상기 탄소 원자 및 Rj, 상기 산소 원자 및 Rk, 또는 Rj 및 Rk가 결합되어 3원 내지 12원 고리(3- to 12-membered ring)를 형성할 수 있다. 예시적 에스테르들은 알킬 에스테르들을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이때 Rj 또는 Rk의 최소 하나는 -O-C(O)-알킬-, -C(O)-O-알킬-, -알킬-C(O)-O-알킬-, 기타와 같은 알킬 등이다. 예시적 에스테르들은 또한 아릴 혹은 헤테로아릴 에스테르들을 포함하고, 이때 예를 들어 Rj 또는 Rk의 최소 하나는 피리딘(pyridine), 피리다진(pyridazine), 피리미딘(pyrmidine) 및 피라진(pyrazine)과 같은 헤테로아릴기 혹은 니코티네이트 에스테르(nicotinate ester)와 같은 헤테로아릴기이다. 예시적 에스테르들은 -RkC(O)O- 구조를 갖는 역 에스테르들(reverse esters)을 포함하며, 여기서 상기 산소는 상기 모분자기(parent molecular group)에 구속된다. 예시적인 역 에스테르들은 숙신산(succinate), D-아르기니네이트(D-argininate), L-아르기니네이트(L-argininate), L-리지네이트(L-lysinate) 및 D-리지네이트(D-lysinate)를 포함한다. 에스테르들은 또한 카르복시산 알데하이드들(carboxylic acid anhydrides) 및 산 할로겐화물(acid halides)을 포함한다.
여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "아미노"는 -NRdRe 혹은 -N(Rd)Re- 형태를 일컬으며, 여기에 Rd 및 Re는 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아릴, 알릴알킬, 카바네이트, 사이클로알킬, 할로알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 및 수소로부터 독립적으로 선택된다. 상기 아미노는 상기 질소를 통해 상기 모분자기에 부착될 수 있다. 상기 아미노는 또한 고리형(cyclic)일 수 있으며, 예를 들어, Rd 및 Re가 함께 혹은 상기 질소와 함께 결합되어, 예를 들어 모노폴리노(morpholino) 혹은 피페리딜(piperidinyl)과 같은 3원 내지 12원 고리를 형성할 수 있다. 상기 용어 아미노는 또한 어떠한 아미노기의 상응하는 사차 암모늄염(quaternary ammonium salt)을 포함한다. 예시적 아미노기들은 알킬 아미노기들을 포함하며, Rd 및 Re의 최소 하나는 알킬기이다.
여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "설포닐"은 RuSO2- 구조를 일컬으며, 여기서 Ru은, 예를 들어 알킬설포닐(alkylsulfony) 같은, 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아릴, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴일 수 있다. 여기에 사용된 것으로서 상기 용어 "알킬설포닐"은 설포닐기에 부착된 알킬기를 일컫는다. "알킬설포닐" 작용기들은 선택적으로 알케닐 혹은 알카이닐 작용기들을 포함할 수 있다.
"알킬", "알케닐", "알카이닐" 및 "아미노" 작용기들은 알콕시, 아릴록시, 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아미드, 아미노, 아릴, 아릴알킬, 카바네이트, 카르복시, 시아노, 사이클로알킬, 에스테르, 에테르, 포밀, 할로겐, 할로알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 하이드록실, 케톤, 니트로, 인산염, 황화물, 설피닐, 설포닐, 설폰산, 설폰아미드, 티오케톤, 우레이도(ureido) 및 질소로부터 선택된 적어도 하나의 작용기로 치환되거나(substituted with) 간섭되거나(interrupted by) 혹은 분기될(branched with) 수 있다. 상기 치환기들은 분기되어 치환된 혹은 비-치환된 헤테로사이클 또는 사이클로알킬을 형성할 수 있다. 상기 링커는 산소와 같은 하나 또는 그 이상의 헤테로원자들에 의해 선택적으로 간섭된 알킬일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
여기에 사용된 것으로 "적절한 치환기"는 상기 뉴클레오티드 유사체들의 상기 합성 혹은 효소적 활용 또는 그것을 준비하기 위한 상기 매개물들의 유용을 무효화시키지 않는 작용기를 일컫는다. 적절한 치환기들의 예는 C1-22, C1-8 및 C1-6 알킬, 알케닐 혹은 알카이닐; C1-6 아릴, C2-5 헤테로아릴; C3-7 사이클로알킬; C1-22, C1-8 및 C1-6 알콕시; C6 아릴록시; -CN; -OH; oxo; halo, 카르복시(carboxy); -NH(C1-22, C1-8 혹은 C1-6 알킬), -N(C1-22, C1-8 혹은 C1-6 알킬)2, -NH((C6)아릴), 혹은 -N((C6)아릴)2와 같은 아미노; 포밀(formyl); -CO(C1-22, C1-8 및 C1-6 알킬)과 같은 케톤들(ketones), -CO2(C1-22, C1-8 및 C1-6 알킬) 및 -CO2(C6아릴)와 같은 --CO(C6아릴) 에스테르들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 상기 뉴클레오티드 유사체들의 안정성 및 생화학적 및 합성 활성에 기초한 적절한 치환기를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
상기 용어 "수용 가능한 염(들)"은 본 발명의 조성물들에 사용되는 화합물들에 존재할 수 있는 산성 또는 염기 작용기들의 염들을 일컫는다. 수용 가능한 염들은 여기에 고려된 상기 반응들을 방해하지 않는 염들을 포함하며 그렇지 않은 것들은 바람직하지 않다. 수용 가능한 염들은 활성에 있어 이들의 자유 염기와 다르지 않고, 이는 통상 약제학적으로 수용 가능한 염들로 지칭되는 염들을 포함하는데, 이들은 상기 자유 염기의 생물학적 활성을 함유하는 비-독성 염들이다. 자연 상태에서 산성인 본 조성물들에 포함된 화합물들은 다양한 양이온과 함께 염기 염들(base salts)을 형성할 수 있다. 이러한 염들의 예들은 알칼리 금속, 또는 예를 들어 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 리튬 및 칼륨 염들을 포함하는 알칼리 토금속들을 포함한다. 수용 가능한 염들은 또한 아연, 철, 암모늄, 구리, 망간, 알루미늄 염들 등을 포함할 수 있다. 수용 가능한 염들은 유기 비-독성 염들에서 유도된 것들일 수도 있으며, 1차, 2차 및 3차 아민들의 염들, 자연적으로 발생하는 치환된 아민들을 포함하여 치환된 아민들, 사이클릭 아민들(cyclic amines) 및 아이소프로필아민(isopropylamine), 트리프로필아민(tripropylamine), 에탄올아민(ethanolamine), 2-디에틸아미노에탄올(2-diethylaminoethanol), 2-디메틸아미노에탄올(2-dimethylaminoethanol), 디사이클로헥실아민(dicyclohexylamine), 리신(lysine), 클루타민(glutamine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 카페인(caffeine), 프로카인(procain), 하이드라바민(hydrabamine), 클로린(choline), 베타인(betaine), 에틸렌디아민(ethylenediamine), 글루고사민(glucosamine), 메틸글루카민(methylglucamine), 테오브로민(theobromine), 퓨린들(purines), 피페라진들(piperazines), 피페리딘(piperidine), 폴리아민 레진(polyamine resin) 등과 같은 기본적인 이온 교환 수지들을 포함할 수 있다. 게다가, 염들은 상기 퓨린, 특히 구아닌의 염기 중심들(basic centers) 혹은 피리미딘 염기를 갖는 특정 유기 및 무기 산들의 산 추가로부터 형성될 수 있다. 마지막으로, 여기에 기재한 상기 조성물들의 실시예들은 그들의 비-이온화된 형태 뿐 아니라 쌍성 이온 형태(zwitterionic form) 및/또는 용매 화합물 형태들을 포함한다.
형광단과, 소광 분자들 또는 모이어티들을 포함하는 상호 작용 분자 혹은 모이어티의 조합은 "FRET 쌍들"로 알려져 있다. FRET-쌍 상호 작용의 메커니즘은 상기 쌍의 한 구성 요소의 흡수 스펙트럼이 제1 형광단인 상기 쌍의 다른 구성 요소의 방출 스펙트럼에 중첩하는 것을 필요로 한다. 만약 상기 상호 작용 분자 혹은 모이어티가 소광기(quenching group)라면, 이것의 흡수 스펙트럼은 상기 형광단의 방출 스펙트럼에 반드시 중첩해야 한다(Stryer, L., ANN. REV. BIOCHEM. 47: 819-846 (1978); C. R. Cantor와 P. R. Schimmel, "생물물리학 화학 - part II: 생물학적 구조 및 기능의 연구를 위한 기술" W. H. Freeman과 그 동료들, San Francisco, U.S.A., 1980 (pages 448-455); 및 Selvin, P. R., METHODS IN ENZYMOLOGY, 246: 300-335 (1995)). 효율적인 FRET 상호 작용은 상기 쌍의 흡수 및 방출 스펙트럼들이 큰 정도의 중첩을 갖는 것을 필요로 한다. FRET 상호 작용의 효율은 이 중첩에 선형적으로 비례한다(See Haugland, R.P., et al. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 63: 24-30 (1969)). 전형적으로, 큰 크기의 신호(즉, 높은 정도의 중첩)가 필요하다. 형광-소광기 쌍들을 포함하는 FRET 쌍들은 그러므로 전형적으로 이를 기준으로 선택된다.
실용적인 가이드가 다음의 참고 문헌들에 의해 예시된 것처럼 특정 프로브들을 위한 적절한 FRET 도너-억셉터 쌍들을 선택하기 위한 문헌들에서 활용 가능하다: Pesce et al., Eds., "형광 스펙트로스코피(spectroscopy)", Marcel Dekker, 뉴욕, 1971; White et al., "형광 분석: 실용적 접근", Marcel Dekker, 뉴욕, 1970. 상기 문헌은 또한 형광 및 크로모제닉 분자들 및 이들에 관련된 리포터-소광제(reporter-quencher) 쌍들 선택을 위한 선택적 특성들을 제공하는 참고 문헌들을 포함한다(예를 들어, Berlman, 방향 분자들의 형광 스펙트럼들의 안내서, 2쇄, Academic Press, 뉴욕, 1971; Griffiths, 유기 분자들의 색과 구조, Academic Press, 뉴욕, 1976; Bishop, Ed., 지표들, Pergamon Press, 옥스퍼드, 1972; Haugland, 형광 프로브들 및 조사 화학 물질들의 안내서, Molecular Probes, Eugene, 1992; Pringsheim, 형광 및 인광, Interscience Publishers, 뉴욕, 1949. 참조). 나아가, 상기 문헌은 뉴클레오티드 유사체에 첨가될 수 있는 일반적 반응기들(reactive groups)을 통한 공유 부착을 위해 리포터 및 소광제 분자들을 유도하기 위한 충분한 안내를 제공한다(예를 들어, Haugland (supra); 미국등록특허 제3,996,345호 및 제4,351,76호 참조).
몇몇 실시예들에서, 상기 뉴클레오티드 유사체들 각각은 상기 반응 복합체의 반응 사이트에서 상기 표적 핵산의 상응하는 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 염기를 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 갖는 염기쌍 모이어티를 5' 말단에 포함한다. 상기 뉴클레오티드 유사체가 상기 초기 가닥으로 결합되자마자, 상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 제1 염기의 정체는 상기 라벨 모이어티의 상응하는 광-감지 라벨의 감지에 의해 결정될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 각 뉴클레오티드 유사체들은, 각각이 상기 반응 복합체의 반응 사이트에서 상기 표적 핵산의 상응하는 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기를 포함하는 두 개의 뉴클레오티드 잔기들을 갖는 염기쌍 모이어티를 5' 말단에 포함한다. 상기 뉴클레오티드 유사체가 상기 초기 가닥으로 결합되자마자, 상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 처음 두 개의 염기들의 정체는 상기 라벨 모이어티의 상응하는 광-감지 라벨의 감지에 의해 결정될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 각 뉴클레오티드 유사체들은, 각각이 상기 반응 복합체의 반응 사이트에서 상기 표적 핵산의 상응하는 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 염기를 각각 포함하는 세 개의 뉴클레오티드 잔기들을 5' 말단에 갖는 염기쌍 모이어티를 5' 말단에 포함한다. 상기 뉴클레오티드 유사체가 상기 초기 프라이머 가닥으로 결합되자마자, 상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 처음 세 개의 염기들의 정체는 상기 라벨 모이어티의 상응하는 광-감지 라벨의 감지에 의해 결정될 수 있다.
여기에 기재된 상기 방법들에서 사용된 뉴클레오티드 유사체들의 타입 수는 4N 타입의 뉴클레오티드 유사체들일 수 있으며, 여기서 N은 상기 표적 핵산의 상응하는 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 각 유사체의 상기 5' 말단에 있는 상기 염기쌍 모이어티 내의 뉴클레오티드 잔기들의 수이다. 예를 들어, 상기 유사체들은 상기 표적 핵산의 상응하는 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1 하나를 각각 갖는 모노뉴클레오티드들일 수 있다(예를 들어, 아래의 실시예 5 및 화학식Ⅵ 참조). 복수 타입들의 모노뉴클레오티드들이 시퀀싱 반응에 사용될 경우, 상보적 염기 B1의 수 N은 하나이고, 그러므로 주형 핵산은 중합 효소 및 시퀀싱 프라이머와 함께 41 즉 4개 타입들의 모노뉴클레오티드 유사체들에 접촉되며, 이때 각 타입은 염기 B1로서 네 가지 염기들인 아데닌, 사이토신, 티민(또는 우라실) 및 구아닌 중 하나를 갖는다. 바람직하게는, 상기 4개 타입의 유사체들 각각은 상기 염기 B1의 정체에 상응하는 고유 형광 라벨 F를 포함할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 유사체들은 바이뉴클레오티드들이고, 이때 상기 유사체의 상기 5' 말단에 있는 염기쌍 모이어티는 상보적 염기 B1을 갖는 뉴클레오티드 잔기이며, 상기 염기쌍 모이어티의 상기 3' 위치에 연결된 라벨 모이어티는 여기에 기재된 것처럼, 비-상보적 작용기 X1 및 형광 라벨 F를 포함하는 뉴클레오티드 잔기이다(예를 들어, 아래의 실시예 1 및 화학식Ⅱ 참조). 이러한 실시예들에 따르면, 상보적 염기들 B1의 수 N은 하나이고, 그러므로 표적 핵산은 중합 효소 및 시퀀싱 프라이머와 함께 41 즉 4개 타입들의 바이뉴클레오티드 유사체들에 접촉되며, 이때 각 타입은 염기 B1로서 네 가지 염기들인 아데닌, 사이토신, 티민 및 구아닌 중 하나를 갖는다. 바람직하게는, 4개 타입의 유사체들 각각은 상기 염기 B1의 정체에 상응하는 고유 형광 라벨 F를 포함한다.
몇몇 실시예들에서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 트리뉴클레오티드 유사체이고, 이때 상기 유사체의 상기 5' 말단에 있는 염기쌍은 상보적 염기 B1 및 B2를 각각 갖는 두 개의 뉴클레오티드 잔기들을 포함하며, 상기 염기쌍 모이어티의 상기 3' 위치에 연결된 라벨 모이어티는 여기에 기재된 것처럼, 비-상보적 작용기 X1 및 형광 라벨 F를 포함하는 뉴클레오티드 잔기이다(예를 들어, 아래의 실시예 9 및 화학식Ⅹ 참조). 이러한 실시예들에 따르면, 상보적 염기들 B1 및 B2의 수 N은 두 개이며, 그러므로 표적 핵산은 자기 교정 기능을 하는 중합 효소 및 시퀀싱 프라이머와 함께 42 즉 16개 타입들의 바이뉴클레오티드 유사체들에 접촉된다. 바람직하게는, 각 타입은 염기 B1 및 B2로서 아데닌, 사이토신, 티민, 혹은 구아닌의 두 개의 순차적 염기들의 16개 조합들 중 하나를 가지며, 유사체들의 상기 16개 타입들 각각은 염기들 B1 및 B2의 상기 순차적 조합에 상응하는 고유 형광 라벨 F를 포함한다.
1.5. 유사체들의 제조
염기-연결 및 인산염-연결 형광단들 및 소광제들은 당해 기술에서 잘 알려져 있다. 이들은, 예를 들어, Life Technologies (San Diego, California), Sigma-Genosys (The Woodlands, Texas), AnaSpec (Fremont, CA), Eurofins MWG Operon (Huntsville, Alabama), Glen Research (Sterling, Virginia) 혹은 Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)로부터 얻어질 수 있다. 염기-연결된 형광단들의 비한정적인 예들은 변형된 티민 혹은 우라실 염기들을 포함하며, 이때 상기 형광단은 예를 들어 우라실기의 상기 5-위치에 부착된다. 다양한 길이들의 링커들은 상기 형광단을 상기 염기에 부착하는 데 사용될 수 있다.
몇몇 경우들에서, 염기-연결된 형광단들은 비-상보적 염기에 연결된 반응기로 합성된 뉴클레오티드 유사체들의 합성 후 변형(post-synthesis modification)에 의해 상기 뉴클레오티드 유사체들로 합성된 다. 이러한 반응기들은 (예를 들어, 활성된 카르복시산 또는 N-하이드로숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)와 재반응할 수 있는) 아미노기들; ("클릭" 트리아졸-형성 반응 ("click" triazole-forming reaction)에서 알카인 또는 아지드와 각각 재반응 할 수 있는) 아지드(azide) 또는 알카인 작용기들; 혹은 (시프 염기(Schiffs base)를 형성하기 위해 아미노기들과 재반응 할 수 있고, 히드라존들(hydrazones)을 형성하기 위해 히드라지노기들(hydrazino groups)들과 재반응 할 수 있으며, 세미-카바존들(semi-carbazones)을 형성하기 위한 세미카바자이드들(semicarbazides)과 재반응 할 수 있는) 알데하이드들(aldehydes)을 포함한다.
시퀀싱 반응 혼합물에서 뉴클레오티드 유사체들의 농도는 적합한 인터펄스 기간을 생성하는 어떠한 적절한 농도도 가능하다. "인터펄스 기간"은 중합 효소의 상기 결합 사이트에서 성장 가닥에 관련되고 성장 가닥으로 결합되기 시작하는 표지된 뉴클레오티드 유사체로부터 감지된 연속적 신호들 사이의 시간을 일컫는다. PCR에 의한 핵산 증폭을 위한 뉴클레오티드 농도들이 전형적으로 약 200 마이크로몰(micromolar)이고, 사이클-시퀀싱(cycle-sequencing)을 위한 농도들이 약 400 마이크로몰인 한편, 단분자 시퀀싱에서 쓰이는 표지된 뉴클레오티드들의 농도는, 예를 들어 약 250 나노몰(nM)로서 훨씬 낮다. 몇몇 실시예들에서, 시퀀싱 반응에서 사용되는 뉴클레오티드 유사체들의 농도는 약 50 나노몰 내지 10 마이크로몰이다. 몇몇 실시예들에서, 뉴클레오티드 유사체들의 농도는 50 나노몰보다 작거나, 또는 10 마이크로몰보다 크다. 몇몇 실시예들에서, 뉴클레오티드 유사체들의 농도는 약 50 나노몰 내지 약 500 나노몰, 약 75 나노몰 내지 약 400 나노몰, 약 100 나노몰 내지 300 나노몰, 또는 약 125 나노몰 내지 약 250 나노몰이다. 몇몇 실시예들에서, 뉴클레오티드 유사체들의 농도는 약 250 나노몰이다. 몇몇 실시예들에서, 상기 인터펄스 기간은 약 0.2초 내지 1초이다. 몇몇 실시예들에서, 상기 인터펄스 기간은 0.2초보다 작거나, 혹은 1초보다 크다. 몇몇 실시예들에서, 상기 인터펄스 기간은 약 0.2초 내지 0.6초이다. 몇몇 실시예들에서, 상기 인터펄스 기간은 약 0.3초 내지 0.5초이다.
몇몇 실시예들에서, 시퀀싱은 여기에 밝힌 네 가지 타입의 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 수행되며, 각 타입은 그것의 고유 감지 라벨에 의해 구별될 수 있는 별개의 염기(아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민/우라실)를 포함한다. 상기 결합 사이트로부터 감지될 수 있는 상기 네 가지 고유 라벨들의 일시적 순서 혹은 시간 서열은 상기 초기 가닥으로 결합된 염기들의 하나 또는 그 이상 타입들의 상기 서열들을 나타내고, 그러므로 표적 분자의 상기 서열을 갖는 주형의 핵산 서열의 추론을 허용한다.
몇몇 실시예들에서, 주된 시퀀싱 과정은 4개보다 적은 라벨들을 이용하여 수행된다. 예를 들어, 시퀀싱은 여기에 밝힌 모노뉴클레오티드 또는 바이뉴클레오티드 유사체들의 세 가지 타입들 및 감지 라벨을 포함하지 않는 뉴클레오티드 유사체의 제4 타입을 이용하여 수행되며, 상기 세 가지의 각 타입은 고유 감지 라벨에 의해 구별되는 별개의 염기를 포함한다. 그러면 상기 서열은 상기 세 가지 라벨들을 감지함으로써 결정될 수 있으며, 상기 제4 뉴클레오티드는 두 개의 표지된 뉴클레오티드 유사체들을 관찰하는 사이의 긴 지연으로서 감지될 수 있다.
주된 시퀀싱 방법은 또한 여기에 밝힌 모노- 또는 바이-뉴클레오티드 유사체들의 2개 타입들 및 감지 라벨을 포함하지 않는 뉴클레오티드의 제3 및 제4 타입을 가지고 수행될 수 있다. 이때, 상기 2개 타입들 각각은 고유 감지 라벨에 의해 구별 가능한 별개 염기를 포함한다. 상기 주형의 서열 및 이에 따라 상기 표적 핵산의 서열은 상기 주형 가닥 및 이것의 상보에 의해 추론될 수 있다. 이와는 달리, 상기 주형 가닥은 표지된 바이뉴클레오티드 유사체들의 다른 염기쌍들로 적어도 두 번 서열될 수 있다(예를 들어, 피리미딘들 C 및 T를 포함하는 표지된 바이뉴클레오티들의 제1 쌍과, 퓨린들 A 및 G를 포함하는 표지된 바이뉴클레오티드들의 제2 쌍, 또는 뉴클레오티드들을 포함하는 A, T, C 및 G 중에서 다른 가능한 쌍 순열들(pairing permutations)). 또 다른 변형은 모노- 또는 바이뉴클레오티드 유사체들의 세트들을 사용하는 것이며, 상기 뉴클레오티드 유사체들의 두 가지 타입들은 감지 라벨의 한 종류를 포함하고, 반면 상기 뉴클레오티드 유사체들의 상기 다른 두 가지 타입들은 감지 라벨의 제2 종류를 포함한다. 나아가 두 개 감지 라벨들을 활용한 시퀀싱 방법들에 대한 기재는 Sauer et al., "마이크로캐필러리(microcapillary)에 있는 광섬유에서 풀려나온 단일 염색 표지된 모노뉴클레오티드 분자들의 감지와 확인: 새로운 단분자 DNA 시퀀싱 기술을 향한 제1 단계들", PHYS. CHEM. CHEM. PHYS . 1 :2471-77 (1999)에서 찾을 수 있다.
주된 시퀀싱 방법은 제1 감지 라벨로써 표지되는 모노- 또는 바이-뉴클레오티드 유사체의 한 가지 타입 및 제2 감지 라벨로써 표지되는 모노- 또는 바이-뉴클레오티드 유사체들의 다른 3개 타입들을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 서열은 상기 주형 분자 시퀀싱에 의해 적어도 세 번 추론되며, 각 추론은 고유한 감지 라벨을 포함하는 다른 뉴클레오티드 유사체를 가지고 수행된다. 동등한 방법으로서, 각각이 동일한 감지 라벨을 포함하는 모노- 또는 바이-뉴클레오티드 유사체들의 3개 타입들 및 감지 라벨을 포함하지 않는 제4 바이뉴클레오티드 유사체를 활용할 수 있다는 것이 주목되어야만 한다.
관련되었으나 별개의 몇몇 실시예들에서, 시퀀싱은 여기에 기재한 상기 트리뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 수행되고, 이때 각 트리뉴클레오티드 유사체들은 주형 분자와 염기쌍을 형성할 수 있는 두 개의 뉴클레오티드들을 포함하며, 이에 따라 각 트리뉴클레오티드 유사체는 다른 디뉴클레오티드(dinucleotide) 서열에 상보적이다. 따라서 16개의 가능한 트리뉴클레오티드 유사체 타입들이 있다. 본 발명의 몇몇 실시예들에서, 16개의 다른 감지 라벨들이 상기 트리뉴클레오티드 유사체들을 구별하는 데 사용된다. 몇몇 실시예들에서, 상기 라벨들은 다른 수단들에 의해 감지될 수 있다. 형광적으로 표지된 트리뉴클레오티드 유사체들에 대해서는, 상기 라벨들은 방출 파장 뿐 아니라, 또한 형광 수명 및 형광 강도를 포함하는 비한정적인 다른 파라미터들로 구별하는 것이 가능하다.
몇몇 실시예들에서, 시퀀싱은 16개보다 적은 감지 라벨들을 이용하여 수행될 수 있다. 형광단 및 이것을 둘러싼 분자 환경(예를 들어 근처의 염기들)의 상호 작용들이 상기 형광단의 특성들에 영향을 줄 수 있음은 당해 기술에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 쿠마린-dGTP(coumarin-dGTP)는 쿠마린-CTP(coumarin-CTP)보다 짧은 형광 수명을 갖는다. 그 결과 다중 트리뉴클레오티드 유사체들은 동일한 형광 라벨을 사용하여 구별될 수 있다.
다른 실시예들에서, 몇몇 트리뉴클레오티드 유사체들은 동일한 감지 라벨을 포함하며/하거나 몇몇 트리뉴클레오티드 유사체들은 감지 라벨을 포함하지 않을 수 있다. 그러면, 상기 서열은 상기 주형 분자를 트리뉴클레오티드 유사체들 및 감지 라벨들의 다른 조합들을 가지고 복수 번 재시퀀싱(resequencing)함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 제1 시퀀싱 주기는 하나의 트리뉴클레오티드 유사체들의 세트로 수행될 수 있으며, 이때 상기 유사체들은 주형에 상보적인 두 개 염기들, 예를 들어 상기 5' 염기-쌍 단위로서(총체적으로 A-서브세트(subset)로서, AA, AC, AG 또는 AT) 아데닌, 상기 5' 염기-쌍 뉴클레오티드로서(총체적으로 C-서브세트로서, CA, CC, CG 또는 CT) 사이토신, 상기 5' 염기-쌍 뉴클레오티드로서(총체적으로 G-서브세트로서, GA, GC, GG 또는 GT) 구아닌 및 상기 5' 염기-쌍 뉴클레오티드로서(총체적으로 T-서브세트로서, TA, TC, TG 또는 TT) 티민을 포함한다. 상기 뉴클레오티드들의 이 서브세트들은 각기 상기 A-서브세트를 위한 알렉사 형광(Alexa Fluor) 405, 상기 C-서브세트를 위한 알렉사 형광 488, 상기 G-서브세트를 위한 알렉사 형광 546 및 상기 T-서브세트를 위한 알렉사 형광 635와 같은 별개의 라벨을 이송한다. 그러므로 이러한 트리뉴클레오티드 유사체들 세트로 수행되는 시퀀싱은 상기 주형 가닥의 매 제2 염기(every second base)의 정체를 결정할 수 있다. 그러면, 제2 시퀀싱 싸이클은 표지된 트리뉴클레오티드 유사체들의 제2 세트를 사용하여 수행될 수 있으며, 상기 유사체들은 상기 제2 하류 염기쌍 단위로서(즉, 상기 유사체들은 서열 AA, CA, GA 또는 TA를 포함한다) 아데닌, 상기 하류 염기쌍 단위로서(AC, CC, GC 또는 TC) 사이토신, 상기 하류 염기쌍 뉴클레오티드로서(AG, CG, GG 또는 TG) 구아닌 및 상기 하류 염기쌍 뉴클레오티드로서(AT, CT, GT 또는 TT) 티민을 포함한다. 상기 제1 세트와 같이, 시퀀싱의 상기 제2 회(round)에서 각 서브세트는 별개의 라벨을 이송한다. 트리뉴클레오티드 유사체들의 이 제2 세트로 수행되는 두 번째 시퀀싱 사이클은 상기 주형 가닥의 나머지의 정체를 드러낼 수 있으며, 이에 따라 상기 주형의 완전한 서열을 결정할 수 있다. 상기 제2 시퀀싱 사이클을 위한 또 다른 가능한 계획은, 상기 제1 시퀀싱 싸이클로서 동일한 세트의 트리뉴클레오티드 유사체들을 사용하되 상기 제1 시퀀싱 싸이클에서 사용된 프라이머와 홀수 개의 뉴클레오티드들만큼 길이가 다른 프라이머를 사용하는 것이다. 비한정적인 예로서, 7개, 5개, 3개 및 1개 뉴클레오티들 길이만큼 짧거나, 1개, 3개, 5개 및 7개 뉴클레오티드들 길이만큼 길 수 있다. 이 계획에서, 홀수 개 뉴클레오티드들만큼의 길이에 있어서만 다른 프라이머는 시퀀싱 반응의 상기 제1 회 동안 정체가 드러나지 않은 상기 주형 가닥에 있는 상기 제2 염기의 확인을 허용한다. 본 발명에서, 표지된 트리뉴클레오티드 유사체들의 상기 세트를 변화시키는 것, 좀 더 많은 혹은 좀 더 적은 시퀀싱 사이클들을 사용하는 것 및/또는 감지 라벨들의 다양한 조합들을 활용하는 것을 포함하는 다른 대안적 계획들이 구체화된다.
합성에 의한 단분자 시퀀싱을 위해, 본 방법들은 단분자들을 재서열할 수 있는 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 서열될 주형 핵산 분자는 시퀀싱 프라이머와 함께 원형 형태로 제공될 수 있다. 재시퀀싱(resequencing)은 복수 개의 시퀀싱 싸이클들을 수행하여 서열 판독이 상기 주형 핵산 분자에 있는 뉴클레오티드들의 수보다 크게 얻어짐으로써 달성될 수 있다. 그러므로 상기 시퀀싱 판독은 상기 주형 핵산 분자의 적어도 하나의 위치에 있는 염기를 과다하게(redundantly) 확인하는 정보를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 시퀀싱 판독은 상기 주형 핵산 분자에 있는 상기 염기들의 최소 25%, 50%, 75%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 과다하게 확인하는 정보를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 시퀀싱 판독은 이중(two-fold), 삼중(three-fold), 사중(four-fold), 오중(five-fold), 7중(sevenfold) 또는 10중(ten-fold)으로 혹은 이보다 큰 과잉(redundancy)으로 상기 핵산 분자에 있는 상기 염기들의 최소 25%, 50%, 75%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 확인하는 정보를 포함한다. 동일한 분자를 재서열함으로써, 시퀀싱 오류들은 시퀀싱 판독들 수의 파워(power)로 감소할 것으로 예상된다. 예를 들어, 만약 단일 판독에서 염기당 오류율들이 10-3이면, 세 번의 판독 뒤, 이것은 예를 들면 (10-3)-3 즉 10-9까지 감소한다. 이것은 시퀀싱에 사용되는 뉴클레오티드가 그들의 라벨들을 잃어, 예를 들면 왜곡된 결손을 유발하는 사건에서 단분자 시퀀싱에 특히 유용하다.
바람직하게는, 상기 중합 효소 또는 효소 복합체는 상기 핵산 중합 반응 동안 다른 효소 세트로 대체될 수 있다. 비슷하게, 뉴클레오티드 유사체들과 완충제들을 포함하는 시약들은 상기 핵산 중합 반응 동안 대체되거나 또는 다시 보충될 수 있다.
1.6. 추가적인 응용들
몇몇 실시예들에서, 형광적으로 표지된 뉴클레오티드 유사체들은 중합 효소에 부착된 도너 발색단(donor chromophore)을 위한 억셉터 발색단들(acceptor chromophores)로 기능할 수 있다. 따라서 이러한 실시예들에서, 상기 중합 효소 상에 위치한 상기 도너 발색단은 상기 표적 핵산으로부터 복제된 성장 핵산 가닥 위에 있는 억섹터 발색단을 활성화할 수 있다. 상기 중합 효소에 근접하지 않은 형광적으로 표지된 뉴클레오티드 유사체들은 FRET 효율에서의 빠른 감소로 인해 활성되지 않을 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 도너 분자는 예를 들어 다른 형광단, 예를 들어 양자 점일 수 있다. 예를 들어 반도체 양자 점들과 같은 양자 점들은 당해 기술에서 알려져 있으며, 예를 들어 국제공개특허 WO 03/00301에 기재되고 있다. 예를 들어, 양자 점들을 예를 들어 생체 분자들에 커플링(coupling)하는 방법들은 Mednitz et al., NATUREMATERIALS 4:235-46 (2005)과, 2006년 3월 30일 및 2008년 4월 17일에 각각 공개된 미국특허 공개번호 2006/0068506 및 2008/0087843에서 검토된 것처럼 당해 기술에서 알려져 있다. 몇몇 실시예들에서, 양자 점들은 DNA 중합 효소 분자에 접합될 수 있다. 당업자라면 형광단들을 예를 들어 DNA 중합 효소로 접합할 때, 상기 효소의 1차, 2차 및 3차 구조들 위로 상기 형광단을 접합하는 것의 영향을 완화시킴으로써 효소 기능을 유지하도록 신경을 써야 함을 알 수 있을 것이다.
1.7. 다중 광자 여기
몇몇 실시예들에서, 형광단은 두 개 또는 그 이상의 광자들에 의해 여기될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시예들에서, FRET에 있는 도너 또는 억셉터 형광단은 두 개 또는 그 이상의 광자들을 통해 여기될 수 있다. 두 개 광자 및 다중 광자 여기는 나아가, 예를 들어 미국등록특허번호 제6,344,653호 및 제5,034,61호에 기재되고 있다.
1.8. 표적 서열들
표적 서열들은 본 방법들에 의해 결정되는 서열을 포함한다. 본 발명은 활용되어 폭넓고 다양한 표적 핵산들을 서열 분석할 수 있다. 표적 서열들은 전혀 알려지지 않은 서열(예를 들어, 데 노보 시퀀싱(de novo sequencing)), 부분적으로 알려진 서열(예를 들어, SNP 식별을 위한), 또는 완전히 알려진 서열(전사된 물질의 존재를 확인하거나 또는 대체 스플라이스 사이트들(alternate splice sites)을 식별하기 위한)을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 표적 서열들은 알려지지 않은 횟수만큼 반복되는 알려진 서열들을 포함할 수 있으며, 이와 같은 것들은 DNA 검사(DNA fingerprinting), 텔로모어 분석(telomere analysis), 및/또는 특정한 유전적 장애들의 진단에 사용될 수 있다. 표적 서열들은 비설파이트 시퀀싱(bisulfite sequencing)을 위한 CpG 메틸화와 같은 핵산들의 변형된 버전들을 포함하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 리보핵산(RNA, ribonucleic acid) 및/또는 디옥시리보핵산(DNA, deoxyribonucleic acid)을 포함할 수 있다.
표적 서열들은 단백질들, 지질들, 당들 및 비-표적 핵산들과 같은 다른 성분들을 포함하는 생물학적 표본으로부터 고립될 수 있다. 표본들은 동물, 식물, 박테리아, 균류 및 세포 배양들로부터 얻어지는 것들을 포함하는 비한정적 어떠한 세포성 물질들로부터 얻어질 수 있다. 표본들은 조직, 체액 시료들 또는 혈액, 림프액, 소변, 뇌척수액, 정액, 타액, 객담 및 대변을 포함하는 비한정적 다른 표본들로부터 직접적으로 얻어질 수 있다. 표본들은 역시 바이러스 또는 다른 세포 내 병원체에 의해 감염된 적 있는 조직으로부터 얻어질 수 있으며, 혹은 바이러스 입자들, 표본들 또는 조제 물질들로부터 얻어질 수 있다. 표본들을 생산하고 핵산 서열들을 추출하는 방법들은 당해 기술에서 잘 알려져 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 표본의 상기 핵산들은 분절될 수 있으며, 그렇지 않으면 변형되어 시퀀싱을 위한 표적 서열들로 작용하는 적절한 길이 및 구성의 조각들을 생산한다. 분절 및 다른 변형들은 음파 처리, 제한 효소 소화, 다른 핵산 서열로의 리게이션 및 다른 분자 또는 고형 지지체로의 공유 결합을 포함하는 당해 기술에서 알려진 비한정적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 표적 서열들은 플라스미드들(plasmids)의 일부분들 또는 인공적으로 생성된 태그들(tags)과 같은 비-자연적 서열들을 포함할 수 있다. 표적 서열들은 생물학적 시료, cDNA 라이브러리 또는 게놈의 DNA로부터 추출된 전체 RNA를 포함하는 비한정적인 서열들의 혼합물일 수 있다. 표적 서열들은, 예를 들어 5 베이스(bases)와 50 킬로베이스(kb) 사이 길이, 5 베이스와 20 킬로베이스 사이 길이와 같이 어떠한 길이도 가능하다.
몇몇 실시예들에서, 표적 서열들은 주형 가닥의 모두 또는 부분을 구성할 수 있으며, 이것은 본 발명의 상기 중합 효소에 의해 핵산 합성을 위한 주형으로서 쓰일 수 있는 가닥이다.
상기 주형은 적어도 유전자 증폭을 위한 표적 서열 및 선택적으로 추가 서열(들)을 포함하며, 이는 프라이머 혼성, 주형 고정, 프로브 혼성, 다른 목적들을 위해 사용될 수 있으며 혹은 사용되지 않고 남겨질 수도 있다. 상기 주형은 선형, 원형, 및 초나선형을 포함하는 비한정적인 어떠한 형태든 가능하다. 상기 주형은 단일 가닥이거나, 이중 가닥이거나, 단일 가닥 영역(예를 들어, 헤어핀 고리 내)을 갖는 이중 가닥이거나, 틈이 있거나, 혹은 변형(메틸화과 같은 것에 의한)될 수 있으며, RNA, DNA 또는 비-자연적 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 상기 주형은 전술한 대로 상기 중합 효소에 대해 표면에 고정되거나 또는 용액에서 자유로울 수 있다. 고정화는 상기 5' 말단, 상기 3' 말단, 고정된 상보적 올리고핵산염으로의 혼성과 같은 것을 통해 상기 서열을 따라 어느 곳에서든, 혹은 이들의 몇몇 조합에서 일어날 수 있다.
감지에 적절한 표적 핵산들은, 예를 들어 DNA, RNA 또는 PNA(펩티드 핵산)를 포함하는 어떠한 핵산도 포함할 수 있으며, 자연적으로 발생하거나 또는 인공적인 서열들을 포함하는 어떠한 서열-알려진 것 및 알려지지 않은 것 모두-를 포함할 수 있다. 상기 핵산은 자연적으로 유도되거나, 재조합적으로 생성되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 상기 핵산은 자연적으로 발생한 뉴클레오티드들, 자연에는 존재하지 않는 뉴클레오티드 유사체들 또는 변형된 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 감지될 상기 핵산의 길이는 실제 적용에 따라 다양할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 핵산은 적어도 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000 베이스 또는 그 이상 길이를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 핵산은 10 내지 20, 10 내지 50, 10 내지 100, 50 내지100, 50 내지 500, 50 내지 1000, 50 내지 5000, 500 내지 2000, 500 내지 5000, 1000 내지 5000 베이스, 또는 5 베이스 내지 20 킬로베이스, 또는 5 베이스 내지 50 킬로 베이스일 수 있다.
표적 핵산은 감지를 위해 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산들은 당해 기술에서 알려진, 예를 들어 가열, 또는 알칼리 혹은 다른 화학적 처리를 포함하는 방법들을 통해 이중 가닥 분자로부터 유도될 수 있다. 단일 가닥 핵산 주형들은 역시, 예를 들어 화학적 합성 혹은 체외 합성에 의해 생성될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 감지될 상기 핵산은 원형(circular)일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 방법들은 알려진 서열로의 삽입을 포함하는 원형 핵산 분자 제공을 포함하며, 이는 프라이머에서 결합 사이트로서 사용될 수 있다. 상기 원형 핵산 분자는 단일 가닥 상태에서, 이중 가닥 상태에서 또는 두 상태들의 혼합에서 제공될 수 있으며, 일반적으로 적어도 하나의 공유 결합적으로 닫힌 가닥을 포함할 수 있다. 이중 가닥 원형 분자들은 틈이 있는 가닥 또는 제2 공유 결합적으로 닫힌 가닥을 포함할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 원형 핵산 분자는 이것의 서열 일부분이 알려졌고, 그래서 상기 핵산 삽입으로서 쓰일 수 있다면, 이것의 소스로부터 원형 형태로 이를 고립시킴으로써 제공된다(예를 들어, 상기 원형 분자에 포함된 유전자의 상기 서열 내에 잘 보존된 부위(conserved motif)가 알려질 수 있고, 또는 상기 분자가 알려져 매우 엄중 조건 아래 알려진 서열의 다른 핵산으로 혼성하는 이것의 능력에 기반을 둔 서열을 포함할 수 있다). 몇몇 실시예들에서, 상기 핵산 삽입의 서열은 단지 정확하지 않게만 알려지며, 이는 상기 서열에 대한 지식이 엄중한 혼성 특성들로부터 유도될 때의 경우일 것이다. 몇몇 실시예들에서, 상기 핵산 삽입의 서열은 정확하게 알려지며, 이는 상기 원형 핵산 분자가 알려진 백본 서열(backbone sequence)을 가질 때 또는 조작되어 알려진 서열을 포함하는 때와 같은 경우일 것이다.
몇몇 실시예들에서, 상기 원형 핵산 분자는 체외 반응 혹은 반응들을 수행하여 선형 핵산 표본을 핵산 삽입과 함께 원형 분자로 결합시킴으로써 제공된다. 상기 체외 반응 또는 반응들은 몇몇 실시예들에서 리가아제에 의한 결찰(ligation) 및/또는 재조합 효소들 및 토포아이소머라제들(topoisomerases)을 포함하는 다양한 효소들에 의해 촉진될 수 있는 것과 같은 다른 가닥이 참여하는 반응들을 포함할 수 있다. DNA 리가아제 또는 RNA 리가아제는 어댑터 분자(adapter molecule) 또는 링커들을 가지고 혹은 이것들 없이, 선형 주형의 두 말단들을 효소적으로 연결하여 원을 형성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, T4 RNA 리가아제는 Tessier et al, ANAL. BIOCHEM, 158: 171-78 (1986)에 기재된 것처럼 단일 가닥 DNA 혹은 RNA를 결합한다. CIRCLIGASE(TM) (Epicentre, Madison, Wis.) 역시 단일 가닥 핵산의 결찰을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 이와는 달리, E. coli 또는 T4 DNA 리가아제와 같은 이중 가닥 리가아제는 상기 원형화 반응을 수행하는 데 사용될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 원형 핵산 분자를 제공하는 것은 적어도 하나의 프라이머(이는 상기 핵산 삽입으로서 쓰일 수 있는 알려진 서열의 5' 플랩들(flaps)을 갖는 무작위 프라이머들(random primers)을 포함할 수 있다.)로부터 확장을 통해 핵산 주형을 복제하는 것과 리가아제 또는 재조합 효소에 의해 촉진될 수 있는 것과 같이 상보적 영역들을 포함하는 상기 증폭된 핵산을 원형화하는 것을 포함한다; 상기 확장된 핵산은 몇몇 실시예들에서, 원형화 이전에, 예를 들어 제한 또는 인산화를 통해 이것의 말단부들에서 처리될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 원형 핵산 분자는 화학적 원형화를 수행함으로써 제공된다. 화학적 방법들은 BrCN 플러스 이미다졸(BrCN plus imidazole) 및 2가 금속, ZnCl2와 함께 N-시아노이미다졸(N-cyanoimidazole), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3(l-(3-dimethylaminopropyl)-3), 에틸카보디미드 염산(ethylcarbodiimide HCl), 및 다른 카보디미드들(carbodiimides)과 카보닐 디미다졸들(carbonyl diimidazoles)과 같이 알려진 커플링 에이전트들을 사용한다. 선형 주형의 말단들은 역시 5'-인산염 및 3'-수산기 또는 5'-수산기 및 3'-인산염을 응축함으로써 참여할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 원형 핵산 분자는 상기 분자가 원형이기 때문에 이것이 말단이 아니라는 점을 제외하고는 말단 연결 프라이머(밑에 논의한)로 고려될 수 있는 삽입 서열을 갖는다.
몇몇 실시예들에서, 상기 표적 핵산은 하나 또는 그 이상의 서열 반복들을 포함한다. "서열 반복"은 동일 타입들의 적어도 3개 연이은 뉴클레오티드 염기들의 스트레치(stretch) 또는 주어진 표적 핵산에서 최소 한 번 반복되는 적어도 3개 연이은 뉴클레오티드 염기들의 스트레치를 일컫는다. 예를 들어, 서열 반복은 A-뉴클레오티드들(예를 들어, (A)n), T-뉴클레오티드들(예를 들어, (T)n), C-뉴클레오티드들(예를 들어, (C)n) 또는 G-뉴클레오티드들(예를 들어, (G)n)을 갖는 스트레치일 수 있으며, 이때 n은 정수 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10이거나 또는 더 크다. 몇몇 사례에서, n은 3 내지 10 사이, 3 내지 300 사이, 3 내지 15 사이, 3과 30, 3 내지 150 사이의 정수이다.
2. 감지 시스템
여기에 기재된 상기 시퀀싱 방법들의 수행은 전형적으로 주형 의존 방식에서 중합 효소 또는 효소 복합체에 의해 결합되는 뉴클레오티드 유사체로부터 기인한 상기 신호들을 감지하는 감지기의 사용을 포함한다. 이러한 감지는 수행되어 상기 핵산 중합 반응이 일어나는 동안 연이은 결합 사건들에 상응하는 신호들의 일시적 순서를 기록할 수 있다.
적절한 감지기 또는 이의 시스템은 중합 효소 또는 효소 복합체를 포함하는 반응 복합체 및 주형을 포함하는 감지 사이트를 제공할 수 있다. 상기 감지 사이트에 있는 상기 라벨 모이어티의 초기 감지 및 상기 감지 사이트로부터 이것이 제거되는 사이의 시간이 "감지 기간"이다. 상기 감지 기간의 길이는, 예를 들어 반응 조건들, 사용되는 중합 효소 및 뉴클레오티드 유사체에 의해 다양할 수 있으며, 그리고 역시 단일 효소 속도론(single enzyme kinetics)에서 확률 변수들에 의존할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 본 발명에서 활용되는 상기 뉴클레오티드 유사체는 상기 효소 또는 효소 복합체의 상기 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 제거되는 라벨을 갖는 표지된 뉴클레오티드 유사체에 비해 연장된 감지 기간을 제공한다. 예를 들어, 상기 감지 기간은 적어도 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000배 또는 심지어 그 이상까지 연장될 수 있다. 어떤 측면들에서, 상기 감지 기간이 약 30 밀리초 내지 약 300 밀리초, 또는 약 50 밀리초 내지 약 250 밀리초로 지속된다. 어떤 측면들에서, 상기 감지 기간은 무려 약 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300 밀리초일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, (주형 의존 방식에서 두 개의 연이은 결합 사건들에 상응하는)두 개의 연속적 감지 단계들은 대체로 예를 들어 약 0.2초 내지 1초, 약 0.2초 내지 0.6호, 또는 약 0.3초 내지 0.5초로 분리된다. 몇몇 실시예들에서, 본 발명의 상기 방법들은 어떠한 두 개의 연속적 감지 단계들도 적어도 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1초에 의해 분리되는 조건들 하에서 수행될 수 있다.
단분자 감지를 제공할 수 있는 어떠한 감지기 또는 이의 시스템은 본 발명을 위해 활용될 수 있다. 감지기 또는 감지 시스템의 선택은 상기 핵산 중합 반응에서 활용되는 라벨들의 타입들에 달려있을 것이다. 감지기들은 설정되어(configured) 방사능, 화학발광, 효소적 활성, 전도도, 전하 및/또는 형광성을 감지할 수 있다.
다양한 감지 시스템들은 여기에 기재된 상기 시퀀싱 방법들을 수행하는 데 쓰일 수 있다. 이것은 "단분자 감지 시스템 및 방법들"이란 제목으로 2011년 3월 11일 에 출원된 미국특허출원번호 제13/046,457호에서 기재된 감지 시스템들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 간단히, 여기에 기재된 상기 방법들을 사용하여 서열되는 표적 핵산은 핵산 합성 반응 복합체의 일부분으로서 이동 가능한 광 커플러 상으로 국지화된다. 이러한 시스템은 제로 모드 도파관(Zero Mode Waveguide: ZMW)을 활용하여, 예를 들어 정의된 여기 광 필드를 창출하고 나노 스케일 웰들을 사용하여 반응 부피들을 최소화함으로써 단분자 감지를 가능하게 할 수 있으며, 이는 배경 신호들을 크게 최소화한다. ZMW를 여기에 기재된 상기 방법들의 사용에 결합시키는 적절한 감지 시스템들은 역시 2010년 6월 11일 에 출원된 미국특허출원번호 제12/801,503호 2010년 6월 29일 에 출원된 미국특허출원번호 제12/805,411호 미국등록특허 제6,917,726호, 제7,170,050호 및 제7,486,865호와 Eid, J., et al., SCIENCE, 323: 133-138 (2009)에 기재된 시스템들을 포함한다. 두 개의 다른 적절한 감지 시스템들이 미국등록특허 제7,767,441호 및 미국특허출원번호 제13/046,457호에 기재되고 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 감지 시스템은 조명 소스, 감지기 및 도파관을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 도파관은 중합이 일어나는 상기 반응 사이트의 선택적 이미징에 충분히 작은 부피로 시퀀싱 복합체를 잡을 수 있는 나노웰 또는 다른 미세 유체 구조를 포함한다. 다른 실시예들에서, 상기 감지 시스템은 이동 가능한 광 커플러, 감지기 및 도파관을 포함하며, 상기 도파관은 상기 이동 가능한 광 커플러를 위한 어댑터 사이트를 포함한다. 상기 감지 시스템은 시퀀싱 사이트들의 순차적 감지 또는 동시 감지를 수행할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 개별 나노웰의 작은 사이즈 및 면적은 시퀀싱의 높은 효율적 병렬화를 가능하게 하며, 이것은 스루풋(throughput) 및/또는 감도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 감지 시스템은 각각이 수백 개 내지 수천 개의 어댑터 사이트들을 포함하는 하나 또는 그 이상의 도파관들을 포함할 수 있다.
감지 시스템에 구현된 광 소스는 빛을 방출하도록 구성되며, 이는 물체를 여기시키는 여기광으로서 상기 도파관으로 적어도 부분적으로 결합될 수 있다. 상기 광 소스는, 예를 들어 헬륨-네온 레이저(He-Ne laser) 및 레이저 다이오드(laser diode (LD))와 같은 레이저, 발광 다이오드(LED), 유기 발광 다이오드(OLED), 양자 점 발광 다이오드(QLED), 섬유 광 또는 아크 방전 형광 램프(arc discharge fluorescent lamp)일 수 있다. 상기 감지 시스템은 광 소스 커플러를 포함할 수 있다. 상기 광 소스 커플러는 적어도 하나의 상기 광 소스로부터 방출된 상기 광의 적어도 일부를 상기 도파관으로 연결할 수 있다. 상기 광 소스 커플러는, 예를 들어 프리즘 커플러, 격자 커플러, 측면-주입 커플러(side-injection coupler), 수직-주입 커플러(vertical-injection coupler) 또는 동일 방향 커플러일 수 있다. 도 1은 본 발명에 적합한 감지 시스템의 예를 나타내며, 이는 광 소스를 조절하는 컨트롤러 유닛(controller unit)을 포함한다. 상기 광 소스는 도파관을 거쳐 표본을 비추는 빛을 생성한다. 또한 상기 표본으로부터 방출되는 빛은 광 감지기에 의해 감지되며, 상기 광 감지기는 컴퓨터 서버(server)와 같은 외부 장치에 선택적으로 전송될 수 있는 데이터 신호를 생성한다. 선택적으로, 상기 컨트롤러 유닛과 상기 컴퓨터 서버 사이에 양방향 통신(two-way communication)이 가능하여, 원격 접근 또는 원격 제어와 같은 것을 허용할 수 있다.
2.1. 도파관
상기 도파관은 채널 도파관 또는 평판형 도파관일 수 있다. 상기 도파관은 코어층 및 적어도 하나의 클래드 층(cladding layer)을 포함한다. 예를 들어, 만약 상기 도파관이 채널 도파관이면, 이는 코어층 및 상기 코어층을 둘러싼 클래드 층을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 만약 상기 도파관이 평판형 도파관이면, 이는 코어층 및 상기 코어층 상에 놓인 하나의 클래드 층 또는 상기 코어층을 사이에 둔 두 개의 크래드 층들을 포함할 수 있다. 상기 코어층은 적어도 하나의 상기 클래드 층보다 높은 굴절률을 가질 수 있다. 상기 여기 광은 상기 도파관의 상기 코어층 내에서 전파될 수 있다. 예시적 도파관들 및 상기 감지 시스템에서 사용에 적합한 이의 구체적인 특성들은 2010년 3월 9일에 출원된 미국특허출원번호 제12/720,352호 2010년 6월 11일 에 출원된 미국특허출원번호 제12/801,503호 및 2010년 6월 29일에 출원된 미국특허출원번호 제12/805,411호에 기재된다.
상기 감지 시스템은 아래에서 보다 상세히 기재되는 것으로서, 이동 가능한 광 커플러를 위한 적어도 하나의 어댑터 사이트를 포함하는 도파관을 포함한다. 상기 어댑터 사이트는 상기 도파관의 적어도 하나의 클래드 층에서 형성될 수 있다. 상기 어댑터 사이트는 상부 개구 및 저면을 포함하는 나노웰일 수 있고, 상기 상부 개구는 상기 저면보다 클 수 있다. 상기 나노웰은 적어도 하나의 상기 클래드 층의 부분적 두께, 적어도 하나의 상기 클래드 층의 전체 두께, 적어도 하나의 상기 클래드 층의 전체 두께 및 상기 코어층의 부분적 두께, 또는 적어도 하나의 상기 클래드 층의 전체 두께 및 상기 코어층의 전체 두께를 통해 확장될 수 있다. 효율적인 여기 지대의 하부 경계는 상기 나노웰의 상기 바닥일 수 있다. 상기 효율적인 여기 지대의 상부 경계는 상기 코어층의 세로 방향에 직각인 방향(예를 들어 수직 방향)으로 상기 여기 광이 상기 나노웰 어댑터 사이트에 닿을 수 있는 거리에 의해 정의될 수 있다.
상기 감지 시스템의 상기 도파관 구성은 복수 개의 어댑터 사이트들을 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 시스템은 다수의 물체들을 모니터 하는 데 사용될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 복수 개의 어댑터 사이트들이 상기 도파관에서 형성될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 복수 개의 어댑터 사이트들의 각각을 위해, 광 감지기가 형성되어 물체로부터 방출되는 상기 광을 상기 어댑터 사이트의 효율적 여기 지대에서 감지할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 하나의 광 감지기는 복수 개의 어댑터 사이트들의 효율적인 여기 지대 내의 물체들로부터 방출되는 광을 감지하는 데 사용될 수 있다.
2.2. 이동 가능한 광 커플러
상기 감지 시스템의 실시예들은 단분자 물체를 상기 도파관의 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트에 국지화할 수 있는 이동 가능한 광 커플러를 포함한다. 상기 이동 가능한 광 커플러는 나노 스케일의 입자일 수 있다. 상기 이동 가능한 광 커플러는 나노 스케일 구 또는 비-구상(nonspheroidal) 입자일 수 있다. 이동 가능한 광 커플러가 상기 도파관에서 어댑터 사이트에 닿을 때, 그러면 단분자 감지에 적절한 제한된 여기 공간(상기 효율적 여기 공간)이 형성될 수 있고, 감지될 상기 물체는 상기 제한된 공간 내에 국지화될 수 있다. 이동 가능한 광 커플러가 어댑터 사이트에 닿을 때, 이것은 제2 이동 가능한 광 커플러가 상기 동일한 어댑터 사이트에 닿는 것을 방지할 수 있다.
상기 이동 가능한 광 커플러는 상기 광 커플러가 상기 어댑터 사이트로 부착될 수 있는, 예를 들어, 도킹(docking)을 가능하게 하는 표면 특성 또는 자기 특성(magnetic property)과 같은 적어도 하나의 특성을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 광 커플러는 상기 광 커플러가 특정 방향으로 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트에 국지화될 수 있는 적어도 하나의 특성을 포함한다. 상기 광 커플러가 특정 방향으로 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트에 국지화될 수 있는 적절한 특성들은 비대칭 표면 특성들(asymmetric surface properties)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 광 커플러는 상기 도파관의 코어층 표면 가까이의 제한된 공간 내 단분자 물체를 상기 어댑터 사이트 내에 국지화할 수 있으며, 이때 물체는 상기 도파관의 상기 코어층을 따라 전파되는 광 파장에 의해 유도되는 광 필드로부터 상기 어댑터 사이트 내에 형성된 효율적 여기 지대로 국지화될 수 있다.
상기 이동 가능한 광 커플러는 균일 고용체, 콜로이드성(colloidal) 또는 다공성 고체 또는 폴리머 백본(polymer backbone)을 갖는 물질을 포함하는 고용체일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 다기능적인 이동 가능한 광 커플러는, 예를 들어 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 니켈(Ni), 크롬(Cr) 또는 금속 합금을 포함하는 하나 또는 그 이상의 금속 물질들을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 광 커플러는, 예를 들어 티타늄 이산화물(Ti02), 탄탈륨 산화물(Ta205), 니오븀 산화물(Nb205), 실리콘 산화물(Si02), 하프늄 산화물(Hf02), 알루미늄 산화물(A1203), 지르코늄 산화물(Zr02), 아연 산화물(ZnO), 바나듐 산화물(V205), 세슘 산화물(Ce02), 카드뮴 산화물(CdO), 제2 철 산화물(Fe203), 제3 철 산화물(Fe304), 제2 구리 산화물(Cu20), 제1 구리 산화물(CuO), 인듐 산화물(ln203), 란탄 산화물(La203), 몰리브덴 산화물(Mo03) 또는 텅스텐 산화물(W03)을 포함하는 적어도 하나 또는 그 이상의 산화물을 포함한다. 추가 실시예들에서, 상기 광 커플러는, 예를 들어 카드뮴 황화물(CdS), 아연 황화물(ZnS), 납 황화물(PbS), 금 황화물(Au2S) 또는 은 황화물(Ag2S)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 황화물을 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 광 커플러는 카드뮴 셀레나이드(CdSe), 아연 셀레나이드(ZnSe)또는 납 셀레나이드(PbSe)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 셀렌나이드를 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 예를 들어 실리콘 질화물(S13N4), 티타늄 질화물(TiN), 붕질화물(BN) 및 갈륨 질화물(GaN)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 질화물을 포함한다. 추가 실시예들에서, 상기 광 커플러는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌이민(a polyethyleneimine), 폴리포스파젠(a polyphosphazene), 폴리락티드(polylactide), 폴리락티드-코-클리코라이드(polylactide-co-glycolide), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리안하이드라이드(a polyanhydride), 폴리말레익산(polymaleic acid) 및 이의 유도체들, 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate), 폴리안하이드라이드 옥시부티레이트(polyanhydride oxybutyrate), 폴리카보네이트 폴리오르토에스테르(polycarbonate, polyorthoester), 폴리에틸렌 클리콜(polyethylene glycol), 폴리-L-리신(poly-L-lysine), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리비닐필로리돈(polyvinylpyrrolidone) 또는 이의 공중합체들(copolymers)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 폴리머를 포함한다.
몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러는 상기 도파관의 상기 코어층 재료의 굴절률보다 상기 도파관의 상기 제1 클래드 층 재료의 굴절률에 가까운 굴절률을 갖는 재료로 만들어진다. 몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러는 상기 도파관의 상기 코어층 재료의 굴절률보다 둘러싸는 표본 용액 주변의 굴절률에 가까운 굴절률을 갖는 재료로 만들어 진다. 몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러는 상기 도파관의 상기 제1 클래드 층의 굴절률과 상기 도파관의 상기 코어층의 굴절률 사이의 중간 굴절률을 갖는 재료로 만들어 진다. 추가 실시예들에서, 상기 광 커플러는 상기 도파관의 상기 코어층의 굴절률과 실질적으로 유사한 굴절률을 갖는 재료로 만들어 진다. 몇몇 실시예들에서, 상기 광 커플러는 상기 코어층의 굴절률과 동등한 굴절률을 갖는 재료로 만들어 진다.
몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러는 적절한 사이즈 및 상기 도파관의 상기 코어층 재료의 굴절률과 충분히 비슷한 굴절률을 가져, 상기 광 커플러가 상기 도파관에 있는 어댑터 사이트에 놓일 때 상기 광 커플러가 상기 도파관으로부터의 빛을 결합할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 유도된 광 필드가 상기 이동 가능한 광 커플러의 표면 주변에 형성될 수 있고, 이에 따라 상기 광 커플러 주변에 효율적 여기 지대를 형성할 수 있으며, 이때 분자는 여기 되어 형광(fluorescent light)을 상기 광 커플러 표면의 특정 거리 이내에 방출할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러는 불투명하며 이것의 표면에 여기 광을 제한할 수 있고, 이때 단분자 감지에 적절한 상기 제한된 공간은 상기 도파관으로부터의 상기 여기 광이 벌크 공간으로 퍼져 나가는 것을 차단한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러는 빛을 반사한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러는 여기 광을 반사한다. 몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러는 상기 도파관에 의해 방출된 여기 광을 흡수할 수 있으며, 따라서 이것 스스로가 감지될 분자들을 여기시킬 수 있는 빛을 방출한다.
몇몇 실시예들에서, 상기 광 커플러의 광학 특성은 상기 광 커플러가 특정 범위 내에서 특정 분자들에 의해 둘러싸일 때 변화된다. 몇몇 실시예들에서, 상기 광 커플러가 특정 범위 내에서 특정 분자들에 의해 둘러싸일 때 변하는 상기 광학 특성은 굴절률, 광-흡수 능력, 상기 커플러에 의해 흡수되는 빛의 파장 또는 상기 광 커플러를 통해 전파되는 빛의 방향이다.
몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러 표면의 하나 또는 그 이상의 영역들은 변형될 수 있다. 예를 들어, 나노-스케일 구 광 커플러의 전체 표면은 변형될 수 있다. 표면 변형은 코어-쉘 구조(core-shell structure)를 갖는 광 커플러의 쉘 재료로부터 구별된다. 즉, 표면 변형을 포함하는 코어-쉘 광 커플러는 상기 쉘 재료의 바깥 표면의 변형을 갖는다. 추가 실시예에서, 나노-스케일 구 광 커플러의 일 반구 표면은 변형될 수 있으나, 남아 있는 반구는 변형되지 않을 수 있다. 상기 광 커플러의 표면은 이것의 전체 표면 또는 이것 표면의 적어도 일부를 화학적 변형 기술들을 통해 하나 또는 그 이상의 이종 재료들로 커버할 수 있다. 표면 변형은 상기 이동 가능한 광 커플러를 어댑터 사이트로 국지화하는 데 쓰일 수 있다. 비대칭 표면 변형, 예를 들어 오직 일 표면 상의 변형, 또는 반대 표면들 상의 서로 다른 변형은 상기 이동 가능한 광 커플러를 특정 방향으로 어댑터 사이트에 국지화하는 데 쓰일 수 있다. 표면 변형은 또한 단분자 물체를 상기 광 커플러 표면의 특정 영역으로 국지화하는 데 쓰일 수 있으며, 이러한 영역은 상기 도파관의 코어층을 향하도록 지향될 수 있고, 따라서 상기 물체 및 상기 물체를 포함하는 어떠한 반응도 상기 이동 가능한 광 커플러 및 상기 도파관의 상기 코어층 가까이에 있는 상기 어댑터 사이트 표면 사이의 제한된 공간에 국지화된다. 일 반구에서 올리고핵산염 프라이머들로 변형된 나노-스케일 구 광 커플러 입자를 포함하는 예시적인 감지 시스템의 도식적 도해는 도 2에 나타나 있다. 나노-스케일 구 광 커플러(100)는 DNA 합성 반응 복합체(200)의 복제 DNA 가닥에 내장된 서열들로 혼성이 가능한 올리고핵산염 프라이머들을 통해 이것 표면의 일 절반 상에서 변형된다. 광 커플러(100)의 올리고핵산염 변형 표면을 상기 도파관의 코어층으로 향하도록 상기 광 커플러(100)를 상기 어댑터 사이트(104)에 위치시킴으로써, 반응 복합체(200)를 나노웰 어댑터 사이트(104) 바닥의 제한된 공간(170)으로 국지화시킨다.
몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러 표면의 오직 한 영역은 변형되는 반면, 상기 광 커플러의 남은 표면은 변형되지 않는다. 몇몇 실시예들에서, 상기 이동 가능한 광 커플러 표면의 변형된 영역은 상기 이동 가능한 광 커플러 표면의 약 10 내지 90%이다. 이러한 실시를 설명하기 위해 사용된 것처럼 "상기 이동 가능한 광 커플러 표면의 약 10 내지 90%"라는 것은, 상기 이동 가능한 광 커플러 표면의 변형된 영역이 상기 광 커플러 표면의 10%보다 약간 작은 값으로부터 90%보다 약간 큰 값 사이의 어떤 곳에도 있을 수 있음을 나타내기 위한 것이다. 추가 실시예들에서, 상기 광 커플러 표면의 변형된 영역은 상기 광 커플러 표면의 10% 미만이다. 그러나 추가 실시예들에서, 상기 광 커플러 표면의 변형된 영역은 상기 광 커플러 표면의 90%보다 크다.
몇몇 실시예들에서, 동작 동안, 복수 개의 감지 사이트들의 일부는 하나의 표적 핵산 분자(선택적으로 광 커플러에 부착된)를 포함하며, 다른 감지 사이트들은 표적 핵산 분자를 포함하지 않는다. 이것은 시퀀싱이 완료되기 전에 둘 또는 그 이상의 핵산 분자들이 감지 사이트로 국지화되는 시나리오를 방지하여, 일 시퀀싱의 결과들이 하나 이상의 분자로부터 기인한 정보를 포함하는 것을 방지할 수 있다 예를 들어, 몇몇 실시예들에서, 상기 감지 사이트들의 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하는 감지되거나 식별되어질 감지 사이트들에 국지화된 생물학적 분자들의 낮은 농도 때문에 신호를 발생할 것이다. 제1 표적 핵산이 감지 사이트로부터 분리되고 뒤이어 제2 핵산이 상기 동일한 감지 사이트로 결합되는 예들에서, 상기 제1 핵산 시퀀싱의 결과들은 결합된 뉴클레오티드들의 감지에서의 어떠한 공백 및/또는 상기 결정된 뉴클레오티드 서열들에서의 차이들을 통해 제2 핵산 시퀀싱의 결과들로부터 구별될 수 있다.
2.3. 감지기
본 감지 시스템의 감지기는 물체로부터 방출된 빛을 감지할 수 있다. 이러한 감지기는 광학 센서를 포함할 수 있으며, 상기 광학 센서는 입사하는 광을 적어도 부분적으로 흡수할 수 있으며, 상기 광에 대응하여 출력 신호들을 발생할 수 있다. 상기 광학 센서는 예를 들어, p-n 포토다이오드(photodiode), p-i-n 포토다이오드, 다중-접합 포토다이오드(multi-junction photodiode), 애벌런치 다이오드(avalanche photodiode (APD)), 포토트랜지스터(phototransistor), 양자-우물 적외선 광 감지기(quantum-well infrared photodetector (QWIP)), 광전도 타입 광학 센서(photoconductive type optical sensor), 광전기력 타입 광학 센서(photovoltaic type optical sensor), ASIC 상의 박막(TFA), 금속-반도체-금속(MSM) 광 감지기, 전하 결합 소자(charge coupled device(CCD)), CMOS 센서 또는 이들의 조합일 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 광 감지기는 상기 광 감지기의 작동을 제어하기 위한 제어 회로를 포함한다. 상기 제어 회로는 신호 증폭기의 회로, AID 컨버터(converter), 적분기(integrator), 콤퍼레이터(comparator), 논리 회로, 판독 회로, 메모리(memory), 마이크로프로세서(microprocessor), 클럭(clock) 및/또는 어드레스(address)를 포함할 수 있다.
상기 광 감지기는 상기 물체로부터 방출된 빛이 도달할 수 있는 장소에 배열될 수 있다. 예를 들어, 상기 광 감지기는 상기 어댑터 사이트에 대해 상기 코어층 반대편에 배열될 수 있다. 즉, 만약 상기 어댑터 사이트가 수직 방향으로 상기 코어층의 일측 상에 배열되면, 상기 광 감지기는 수직 방향으로 상기 코어층의 타측 상에 배열될 수 있다. 상기 감지 시스템은 상기 코어층 및 상기 감지기 사이에 있는 적어도 하나의 필터(filter)를 추가적으로 포함할 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 감지기는 나노포어(nanopore) 센서일 수 있다. 나노포어 센서들은 나노포어들로 불리는 약 1nm 직경의 작은 구멍들을 만듦에 따라 생성된다. 감지 목적들을 위해 사용되는 나노포어들은 자연적(막관통 단백질들(transmembrane proteins)과 같이) 또는 인공적(실리콘 시트에서 홀을 식각하고 이온 빔 스퍼터링 방법들(ion-beam sculpting methods)을 이용해 상기 홀을 채워 나노포어들을 만드는 것과 같이)일 수 있다. 나노포어 센서들은 전형적으로 나노포어를 전도성 유체에 침지시키고 이에 전압을 걸어줌으로써 작동한다. 상기 나노포어를 통과하는 전류량은 상기 나노포어의 크기 및 형태에 매우 민감하기 때문에, 상기 나노포어들을 관통하는 이온들의 작용으로 인한 어떠한 작은 전류도 관찰될 수 있다. 본 발명에서 기재한 것처럼 상기 뉴클레오티드 유사체로부터 제거된 라벨 모이어티를 포함하는 분자는 상기 나노포어를 관통하는 상기 전류의 크기에 있어 특성 변화를 발생시킬 수 있다.
상기 나노포어를 통해 분자들을 전달하는 것은 전기영동에 의해 제어될 수 있으며, 이때 분자는 상기 나노포어 쪽으로 끌린다. 다중 분자들은 한 번에 한 분자씩 상기 나노포어를 통과한다. 각 분자가 통과됨에 따라, 이는 상기 분자 정체의 특징적인 방식으로 상기 나노포어를 막는다; 즉, 주어진 순간에 상기 나노포어를 통과하는 전류량은 그 순간에 상기 나노포어를 막고 있는 상기 분자에 의존한다. 본 발명의 뉴클레오티드 유사체의 서로 다른 라벨들은 상기 잘려진 라벨들이 상기 나노포어를 통과할 때, 서로 다른 전류들이 상기 나노포어를 통과하도록 허용할 수 있고, 상기 나노포어를 통과하는 라벨들의 순서를 식별하도록 허용하며, 이에 따라 상기 표적 서열의 식별을 허용한다. 나노포어 센서들은 Howorka, et al., Nature Biotechnology, 19: 636-639 (2001); Clarke, et al., Nature Nanotechnology, 4: 265-270 (2009) 및 미국등록특허들 제5,795,782호 제6,362,002호 및 제6,413,792호들과 같은 간행물에서도 기재되고 있다.
2.4. 상기 시스템의 다른 선택적 성분들
몇몇 실시예들에서, 상기 감지 시스템은 추가적으로 상기 도파관의 코어층 및 상기 광 감지기 사이에 강학 필터를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 광학 필터는 상기 도파관의 하부 클래드 층 및 상기 광 감지기 사이에 배열될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 광학 필터는 상기 도파관의 하부 보호 층 및 상기 광 감지기 사이에 배열될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 하부 보호 층 자체는 광학 필터로서 쓰일 수 있다. 광학 필터는 특정 영역 내의 파장을 갖는 광이 통과하는 것을 허용하지만, 상기 특정 영역 밖의 파장의 빛은 적어도 부분적으로 차단한다. 그러므로 광학 필터는 상기 시퀀싱 복합체로부터 방출된 상기 빛이 통과하도록 허용하나 상기 여기 광에 의해 발생한 상기 노이즈는 감소하도록 선택되어, 상기 신호/노이즈 비율을 향상시킨다.
몇몇 실시예들에서, 마이크로플루이드 채널은 상기 표본 용액을 상기 어댑터 사이트에서 수행하는 데 사용될 수 있다. 상기 마이크로플루이드 채널은 상기 표적 물체들이 한 번에 하나씩 상기 어댑터 사이트를 통과하는 방식으로 고안되어, 유동-세포계수-같은 감지를 인식할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 커버(cover)가 상기 감지 시스템 위에 형성되어 상기 표본 용액을 포함하고/하거나 희미한 광을 차단할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 감지 시스템은 광 소스, 감지기 및 상기 감지 시스템의 어떠한 유동 또는 다른 성분들을 비한정적으로 포함하는 상기 감지 시스템의 적어도 일부에서 작동하는 제어기를 포함할 수 있다. 상기 제어기는 상기 감지 시스템의 다양한 성분들의 제어에 관련된 명령들을 갖는 컴퓨터-판독가능 매체를 포함할 수 있으며, 또한 데이터 처리 및 분석에 대한 명령들을 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에서 알려진 다른 성분들이 본 발명의 실시에 유용한 것으로서 상기 감지 시스템에 포함될 수 있다는 것은 이해될 수 있을 것이다.
몇몇 실시예들에서, 신호 펄스들에 관한 정보가 상기 감지 시스템에 저장될 수 있으며, 상기 시퀀싱 반응과 함께 또는 이후에 선택적으로 개선되거나, 송신되거나 혹은 분석될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 이러한 정보는 컴퓨터 시스템들, 서버들, 무선 단말기, 태블릿 컴퓨팅 시스템들(tablet computing systems), 분포된 컴퓨팅 네트워크들 및 정보를 저장하고 처리할 수 있는 다른 전기적 장치들을 비한정적으로 포함하는 하나 또는 그 이상의 외부 장치들로 송신될 수 있다. 정보는 감지와 병행하여 송신될 수 있고, 또한 감지 후에 송신될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 외부 장치는 서열들의 데이터베이스를 포함하며, 이는 공공적이거나 개인적일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 외부 장치는 상기 신호 펄스 정보를 분석하여 표적 핵산의 서열을 생성할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 외부 장치는 염기 calls의 자기 교정, 참고 서열과 같은 다른 서열들을 통한 정렬(alignment), 오류 분석, 보고서 생성, 또는 상기 감지 시스템으로의 정보 재전송을 포함하는 다른 장치들로의 상기 정보 전송을 비한정적으로 포함하는 추가적 기능들을 수행할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 정보 및 선택적으로 상기 결과 서열들 및 분석들은 암호화될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 정보는 이것이 외부 장치로 전송되는 것에 우선하여 암호화될 수 있다.
통신 어셈블리(communication assembly)는 상기 감지 시스템 내에 수용될 수 있으며, 외부 장치로부터 정보를 송신하고 수신할 수 있다. 이러한 통신은 유선 네트워크 또는 무선 네트워크를 통할 수 있다. 다양한 통신 방법들은 이더넷(Ethernet) 또는 다른 로컬 영역 네트워크, USB 접속, 파이어 와이어 접속(Fire Wire connection), 모뎀(modem)을 통한 다이얼 업(dial-up) 유선 접속, T1과 같은 직접 링크, ISDN 또는 케이블 회선을 통해서 활용될 수 있다. 무선 통신은 블루투스(Bluetooth) 또는 RTM 기술일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 무선 연결은 셀룰러(cellular), 인공위성, 또는 페이저 망들(pager networks)과 같은 예시적인 무선 네트워크들, GPRS 또는 이더넷 혹은 토큰 링(token ring)과 같이 로컬 영역 네트워크에 걸친 로컬 데이터 전송 시스템을 이용해 확립될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 정보는 전화번호, 문자 메시지 어드레스, 이메일 어드레스 또는 온라인 계정을 비한정적으로 포함하는 개인적 어드레스로 보내질 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 통신 어셈블리는 정보 송신 및 수신을 위한 무선 적외선 통신 구성을 포함할 수 있다.
3.1. 실시예 1
여기 및 다음의 실시예들에서, 예시적인 뉴클레오티드 유사체들은 염기 B1, B2 및/또는 작용기들 L1, L2, Q, F, X1 및 X2를 포함할 수 있으며, 각각은 여기에 기재된 것처럼 앞선 화학식 Ⅰ의 구조를 갖는 뉴클레오티드 유사체들의 정체를 갖는다.
예시적인 바이뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅱ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00019
화학식 Ⅱ의 구조를 갖는 유사체를 이용한 합성을 통한 자기 교정-의존 시퀀싱의 단일 사이클의 개략적인 도해가 도 3에서 제공된다. 자기 교정 중합효소, 표적(주형) 가닥 및 복제 가닥을 포함하는 반응 복합체는 여기 광에 노출된다. 염기 B1과 같은 아데닌을 갖고 유입되는 바이뉴클레오티드 유사체는 상기 중합효소의 반응 사이트와 관련되며 상기 표적 가닥에 있는 티민 염기와 염기쌍들을 이룬다. 상기 바이뉴클레오티드 유사체는 상기중합효소에 의해 상기 성장 가닥으로 결합되며, 이 때문에 형광 라벨 F는 상기 여기 광에 의해 여기되며 감지기에 의해 포착된 신호를 방출한다. 상기 분광사진에 나타난 바와 같이, 이 신호는 상기 유사체(상기 표적 가닥에 있는 차후의 염기와 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기 X 및 상기 형광 라벨 F를 포함하는)의 짝 없는 모이어티가 상기 중합효소의 핵산말단분해 활성에 의해 상기 성장 가닥으로부터 제거될 때까지 감지 가능성이 유지된다. 상기 유사체의 상기 표지되고 짝 없는 모이어티가 상기 반응 복합체로부터 분리됨에 따라 상기 신호는 사라진다.
3.2. 실시예 2
형광 소광 모이어티 Q를 포함하는 예시적인 바이뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅲ의 구조를 갖는다. :
Figure pct00020

3.3. 실시예 3
상기 3인산염 체인(chain)의 알파-인산염 대신에 포스포로티오에이트를 가짐에 따라 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막는 예시적인 바이뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅳ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00021
화학식 Ⅳ의 구조를 갖는 유사체를 이용한 합성을 통한 자기 교정-의존 시퀀싱의 단일 사이클의 개략적인 도해가 도 4에 도시된다. 자기 교정 중합효소, 표적("주형") 가닥 및 복제 가닥("프라이머")을 포함하는 반응 복합체가 여기 광에 노출된다. 염기 B1과 같은 구아닌을 갖고 유입되는 바이뉴클레오티드 유사체는 상기 중합효소의 반응 사이트와 관련되며 상기 주형 가닥에 있는 사이토신 염기와 염기쌍들을 이루고, 이 때문에 상기 형광 라벨 F는 상기 여기 광에 의해 여기되며 감지기에 의해 포착된 신호를 방출한다. 신호가 나타나는 것을 개시한 도 4의 하부에 있는 바(bar)에 나타난 바와 같이, 이 신호는 상기 바이뉴클레오티드 유사체가 상기 중합효소에 의해 상기 성장 가닥으로 결합됨에 따라 감지 가능성이 유지되며, 상기 유사체(상기 표적 가닥에 있는 상기 차후의 염기와 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기 X 및 상기 형광 라벨 F를 포함하는)의 짝 없는 모이어티가 상기 중합효소의 핵산말단분해 활성에 의해 상기 성장 가닥으로부터 제거될 때까지 계속된다. 상기 유사체의 표지되고 짝 없는 모이어티가 상기 반응 복합체로부터 분리됨에 따라 상시 신호는 사라진다.
3.4. 실시예 4
상기 3인산염 체인(chain)의 알파-인산염 대신에 형광 소광 모이어티 Q 및 포스포로티오에이트를 가짐에 따라 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막는 예시적인 바이뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅴ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00022
화학식 Ⅴ의 구조를 갖는 유사체를 이용한 합성을 통한 자기 교정-의존 시퀀싱의 단일 사이클의 개략적인 도해는 도 5에 나타난다. 자기 교정 중합효소, 표적("주형") 가닥 및 복제 가닥("프라이머")을 포함하는 반응 복합체는 여기 광에 노출된다. 염기 B1과 같은 구아닌을 갖고 유입되는 바이뉴클레오티드 유사체는 상기 중합효소의 반응 사이트와 관련되며 상기 주형 가닥에 있는 사이토신 염기와 염기쌍들을 이룬다. 형광 소광 모이어티 Q는 상기 바이뉴클레오티드 유사체가 상기 중합효소에 의해 상기 성장 가닥으로 결합될 때까지 여기된 형광 작용기 F로부터 방출된 빛을 소광하고, 이 때문에 파이로인산염에 부착된 상기 형광 소광제 Q는 상기 반응 복합체로부터 풀려난다. 신호가 나타나는 것을 개시한 도 5의 하부에 있는 바(bar)에 나타난 바와 같이, 결합된 형광 작용기 F로부터의 상기 신호는 상기 유사체(상기 표적 가닥에 있는 상기 차후의 염기와 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기 X 및 상기 형광 라벨 F를 포함하는)의 짝 없는 모이어티가 상기 중합효소의 핵산말단분해 활성에 의해 상기 성장 가닥으로부터 제거될 때까지 감지 가능성이 유지된다. 상기 유사체의 짝 없는 모이어티가 상기 반응 복합체로부터 분리됨에 따라 상기 신호가 사라진다.
3.5. 실시예 5
예시적인 모노뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅵ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00023
화학식 Ⅵ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는 모노뉴클레오티드 3인산염 유사체의 성장 핵산 가닥으로의 결합에 이어, 인산염-L2-F 작용기는 자기 교정 중합효소의 상기 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성을 통해 제거되어, 합성의 다음 단계를 위해 상기 결합된 모노뉴클레오티드의 3'-OH를 자유롭게 할 수 있다.
3.6. 실시예 6
형광 소광 모이어티 Q를 포함하는 예시적인 모노뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅶ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00024
3.7. 실시예 7
알파-인산염을 포함하여 자기 교정 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막는 예시적인 모노뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅷ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00025
3.8. 실시예 8
알파-인산염을 포함하여 자기 교정 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막고 형광 소광 모이어티 Q를 포함하는 예시적 모노뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅸ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00026
3.9. 실시예 9
표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기들 B1 및 B2를 5' 말단에서 포함하며 표적 핵산에 있는 상보적 염기와 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기 X1을 포함하는 뉴클레오티드 잔기를 3' 말단에서 포함하는 예시적인 트리뉴클레오티드 3인산염은 화학식 Ⅹ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00027
3.10. 실시예 10
⑴ 표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1 및 B2를 5' 말단에서 포함하고, ⑵ 표적 핵산에 있는 상보적 염기와 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기 X1을 포함하는 뉴클레오티드 잔기를 3' 말단에서 포함하며, ⑶ 형광 소광 모이어티 Q를 포함하는 예시적인 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅱ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00028
3.11. 실시예 11
⑴ 표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1 및 B2를 5' 말단에서 포함하고, ⑵ 표적 핵산에 있는 상보적 염기와 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기 X1을 포함하는 뉴클레오티드 잔기를 3' 말단에서 포함하며, ⑶ 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막는 알파-포스포로티오에이트를 포함하는 예시적 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 Ⅱ에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00029
3.12. 실시예 12
⑴ 표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1 및 B2를 5' 말단에서 포함하고, ⑵ 표적 핵산에 있는 상보적 염기와 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기 X1을 포함하는 뉴클레오티드 잔기를 3' 말단에서 포함하며, ⑶ 형광 소광 모이어티 Q 및 ⑷ 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막는 알파-포스포로티오에이트를 포함하는 예시적인 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 XIII에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00030
3.13. 실시예 13
⑴ 표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1을 5' 말단에서 포함하고, ⑵ 표적 핵산에 있는 염기들과 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기들 X1-F 및 X2를 포함하는 뉴클레오티드 잔기들을 3' 말단에서 포함하는 예시적 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 XIV에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00031
3.14. 실시예 14
⑴ 표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1을 5' 말단에서 포함하고, ⑵ 표적 핵산에 있는 염기들과 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기들 X1-F 및 X2를 포함하는 뉴클레오티드 잔기들을 3' 말단에서 포함하며, ⑶ 형광 소광 모이어티 Q를 포함하는 예시적 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 XV에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00032
3.15. 실시예 15
⑴ 표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1을 5' 말단에서 포함하고, ⑵ 표적 핵산에 있는 염기들과 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기들 X1-F 및 X2를 포함하는 뉴클레오티드 잔기들을 3' 말단에서 포함하며, ⑶ 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막는 알파-포스포로티오에이트를 포함하는 예시적인 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 XVI에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00033
3.16. 실시예 16
⑴ 표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1을 5' 말단에서 포함하고, ⑵ 표적 핵산에 있는 염기들과 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기들 X1-F 및 X2를 포함하는 뉴클레오티드 잔기들을 3' 말단에서 포함하며, ⑶ 형광 소광 모이어티 Q 및 ⑷ 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막는 알파-포스포로티오에이트를 포함하는 예시적인 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 XVII에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00034
3.17. 실시예 17
⑴ 표적 핵산에 있는 상보적 염기들과 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 B1을 5' 말단에서 포함하고, ⑵ 표적 핵산에 있는 염기들과 염기쌍을 이룰 수 없는 작용기들 X1-F 및 X2를 포함하는 뉴클레오티드 잔기들을 3' 말단에서 포함하는 예시적인 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 화학식 XVIII에 도시된 것과 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00035
몇몇 실시예들에서, 화학식 XVIII의 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 실시예 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15 및 16에서 기재된 상기 유사체들과 같은 방식으로 알파-인산염 기 대신에 자기 교정 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성의 진행을 막는 알파-포스포로티오에이트 작용기를 갖는다. 몇몇 실시예들에서, 화학식 XV의 트리뉴클레오티드 3인산염 유사체는 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16에서 기재된 상기 유사체들과 같은 방식으로 상기 감마 인산염 자리에 형광 소광 모이어티 Q를 포함한다.
3.18. 실시예 18
DNA 분자는 여기에 기재된 상기 방법들에 따라 서열된다. 적절한 시퀀싱 반응 완충액에 있는 아토리터 당 0.1몰 농도에서, 200nt의 평균 길이를 갖는 원형, 단일가닥 DNA 분자들의 용액은 "단분자 감지 시스템 및 방법들"이란 제목으로 2011년 3월 11일에 출원된 미국특허출원번호 제13/046,457호에서 기재된 것처럼 감지 장치들에 적용된다. 이와는 달리, 원형, 단일 가닥 DNA 분자들의 용액은 2010년 6월 11일에 출원된 미국특허출원번호 제12/801,503호 2010년 7월 29일에 출원된 미국특허출원번호 제12/805,411호 미국등록특허 제6,917,726호 제7,170,050호 및 제7,486,865호 및 Eid, I, et al., SCIENCE, 323 : 133-138 (2009)에 기재된 것처럼 감지 장치들에 적용된다.
상기 원형 DNA 분자들은 알려지지 않은 표본 서열에 약 20 뉴클레오티드들 3'의 알려진 삽입 서열을 갖는다. 상기 알려진 삽입 서열 및 형광적으로 표지된 바이뉴클레오티드 유사체의 4개 타입들에 상보적 시퀀싱 프라이머가 제공되고, 이때 각 상기 4개 바이뉴클레오티드 유사체들은 각각 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 티민인 상보적 염기 B1을 포함한다. 상기 감지 장치들에 있는 복수 개의 상기 사이트들에 있어서, 자기 교정 중합효소, DNA 분자 및 시퀀싱 프라이머의 세 복합체가 형성되며, 상기 중합효소는 상기 시퀀싱 프라이머의 3' 말단으로 형광적으로 표지된 하나의 뉴클레오티드 유사체를 첨가한다.
상기 복수 개의 감지 사이트들에 있어서, 상기 중합효소의 반응 사이트에 관련되고 상기 성장(프라이머) 가닥으로 결합되는 형광적으로 표지된 바이뉴클레오티드 유사체는 상기 감지 장치에 결합된 광 소스로부터의 여기 광에 의해 여기되고 형광을 방출한다. 이 형광은 상기 감지 장치들을 통해 감지되고, 이는 처리될 출력 신호들을 생성하여 상기 시퀀싱 프라이머에 첨가된 상기 바이뉴클레오티드 유사체에 의해 포함된 상기 염기를 식별한다. 상기 형광 신호는 상기 중합효소가 상기 형광 라벨을 포함하는 비-상보적 뉴클레오티드 작용기를 상기 성장 가닥으로부터 제거하여, 염기 B1을 포함하는 상기 상보적 작용기의 3'-OH를 다음의 뉴클레오티드 유사체 결합을 위해 자유롭게 남겨둘 때 사라진다.
그러면 상기 중합효소는 또 다른 바이뉴클레오티드 유사체를 첨가하며, 이는 전술한 바와 같이 감지된다. 상기 사이클은 충분한 횟수만큼 반복되어 상기 DNA 분자 길이에 적어도 두 배 만큼 시퀀싱 판독을 획득한다(즉, 상기 DNA 분자는 서열되며 재서열된다.). 그러면 상기 DNA 분자의 서열은 2010년 5월 13일에 공개된 미국공개특허번호 제2010/0121582호에 기재된 것처럼 시퀀싱 반복들을 수락하거나 거절하고 상기 수락된 반복들의 정렬로부터 공통 서열(consensus sequence)을 결정함으로써 계산적으로 얻어진다.
3.19. 실시예 19
여기에서, 람다 파지의 게놈은 서열된다. 상기 정제된, 선형 게놈은 적절한 반응 완충액에 있는 아토리터 당 0.1몰에서 중지되며 미국특허출원번호 제13/046,457호에 기재된 것처럼 감지 시스템에 적용된다. 이와는 달리, 상기 게놈은 원형 형태에서 정제될 수 있고 또는 결합되어 원형 구조를 형성할 수 있다. 어느 경우에나, 열은 상기 이중 가닥 람다 게놈을 변성하기 위해 사용되며, 시퀀싱을 준비하기 위한 단일 주형 가닥을 형성한다.
시퀀싱 프라이머는 상기 선형화된 주형 가닥의 일 말단을 보완하거나, 또는 상기 원형화된 게놈의 경우, 상기 프라이머가 상기 주형 가닥 상의 어떤 알려진 서열을 보완하도록 고안된다. 상기 프라이머는 자기 교정 진행 중합효소 및 형광적으로 표지된 바이뉴클레오티드 유사체들의 4개 타입에 따라, 아토리터 당 약 1몰의 농도에서 중지되고 상기 감지 시스템에 적용되며, 이때 상기 4개의 바이뉴클레오티드 유사체 각각은 각기 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 티민인 상보적 염기 B1을 포함한다. 상기 바이뉴클레오티드 유사체들은 추가적으로 상기 감마 인산염 기에 연결된 형광 소광제를 포함한다. 상기 감지 장치들에 있는 복수 개의 감지 사이트들에 있어서, 자기 교정 중합효소, DNA 분자 및 시퀀싱 프라이머의 세 복합체가 형성되며, 상기 중합효소는 상기 시퀀싱 프라이머의 3' 말단에 형광적으로 표지된 하나의 뉴클레오티드 유사체를 첨가한다.
상기 복수 개의 감지 사이트들 각각에 있어서, 상기 중합효소의 반응 사이트에서 형광적으로 표지된 바이뉴클레오티드 유사체의 상기 성장(프라이머) 가닥으로의 결합은 상기 바이뉴클레오티드 유사체로부터의 상기 형광 소광제의 제거를 포함한다. 상기 바이뉴클레오티드 유사체 상의 상기 형광 라벨은 상기 감지 장치에 결합된 광 소자로부터의 여기 광에 의해 여기되며 형광을 방출한다. 이 형광은 상기 감지 장치들에 의해 감지되며, 이는 처리될 출력 신호들을 생성하여 상기 시퀀싱 프라이머로 첨가된 상기 바이뉴클레오티드 유사체에 의해 포함된 상기 염기를 식별한다. 상기 형광 신호는 상기 중합효소의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해 활성이 상기 형광 라벨을 포함하는 비-상보적 뉴클레오티드 작용기를 상기 성장 가닥으로부터 제거하여, 염기 B1을 포함하는 상기 상보적 작용기의 3'-OH를 다음의 뉴클레오티드 유사체 결합을 위해 자유롭게 남겨둘 때 사라진다.
그러면 상기 중합효소는 또 다른 바이뉴클레오티드 유사체를 첨가하며, 이는 상기와 같이 감지된다. 이 사이클은 충분한 횟수만큼 반복되어 상기 게놈 길이(약40kb) 만큼 시퀀싱 판독을 획득한다. 그러면 상기 시퀀싱 반응은 가열되거나, 또는 고염(high salt)을 통해 처리되어 새로이 합성된 가닥을 제거하고, 세척되며, 상기 시퀀싱 혼합은 제2 시퀀싱 판독을 위해 다시 추가된다. 이와는 달리, 각 판독 동안에 전체 서열을 얻는 대신에, 상기 초기 판독은 오로지 상기 람다 게놈의 서브세트만을 커버할 수 있다. 상기 세척 단계에 다음으로, 다른 시퀀싱 프라이머는 상기 시퀀싱 반응에 포함되어 상기 람다 게놈의 제2 중첩 부분을 서열한다. 이러한 단계들은 상기 전체 게놈의 2배 범위가 달성될 때까지 반복된다. 그러면 상기 DNA 분자의 서열은 2010년 5월 13일 에 공개된 미국공개특허번호 제2010/0121582호에서 기재된 것처럼 시퀀싱 반복들을 수락하거나 거절하고 상기 수락된 반복들의 정렬로부터 공통 서열(consensus sequence)을 결정함으로써 계산적으로 얻어진다.
3.20. 실시예 20
감지 시스템의 일 실시예는 표적 서열 부착을 위해 표면 일부 상에 자기 작용기들(magnetic functional groups)을 통해 변형된 나노-구 형상의 이동 가능한 광 커플러를 활용한다. 상기 나노-구 입자는 상기 자기적으로 변형된 표면 상에서 스트렙타아비딘을 통해 화학적으로 변형된다. 상기 시퀀싱 프라이머(상기 연결된 핵산 분자)의 서열에 상보적 서열을 포함하는 바이오틴화 올리고핵산염 프라이머들은 상기 스트렙타아비딘-변형된 나노-구와 결합되며, 이에 따라 상기 바이오틴화 프라이머들은 상기 나노-구로 연결된다. 그러면 상기 표적 서열은 상기 바이오틴화 프라이머로 혼성되며, 상기 DNA 중합효소가 첨가되어 반응 복합체를 형성한다. 상기 이동 가능한 광 커플러는 나노 웰에 놓여, 상기 나노-구의 바닥은 상기 어댑터 사이트 밑에 위치한 미세 코일들을 사용하여 상기 표적 서열 및 프라이머를 도파관(상기 어댑터 사이트)에 있는 상기 나노 웰의 염기에 아토리터 부피 내로 제한한다. 상기 미세 코일들을 관통하도록 전류를 통과시킴으로써, 상기 어댑터 사이트에서 흡수된 반응 복합체를 가지며, 이때 상기 도파관의 상기 코어층을 향하는 흡수된 반응 복합체를 갖는 자기적으로-변형된 표면을 갖는 상기 나노-구를 트랩시키는 자기장이 생성된다. 그러므로 상기 반응 복합체는 상기 도파관의 코어층 표면 가까이의 상기 제한된 공간에 있는 상기 어댑터 사이트로 국지화된다.
앞서 상기 실시예들에 기재된 상기 바이뉴클레오티드 또는 트리뉴클레오티드 유사체들을 통한 DNA 합성은 상기 어댑터 사이트에서 수행된다. 상기 합성 반응의 각 단계에서, 표지된 dNTP들 4개 타입 중 하나는 상기 반응 복합체의 반응 사이트와 관련되며, 이것은 상기 표적 핵산의 상응하는 염기와 염기쌍을 이룬다. 상기 형광 라벨은 어댑터 사이트 바닥에 형성된 상기 희미한 광 영역 및/또는 상기 나노-구의 표면으로부터 방출된 상기 희미한 광 영역에 의해 여기된다. 형광-표지된 뉴클레오티드 폴리인산염을 상기 반응 사이트에서 상기 성장 뉴클레오티드 가닥으로 결합시키는 것은 상기 dNTP-연결 형광의 방출 감지를 통해 실시간으로 감지된다. 결합된 뉴클레오티드 각각의 정체는 이의 형광 라벨에 의해 결정되며, 이때 상기 형광 라벨은 상기 성장 가닥으로 결합되자마자 상기 뉴클레오티드로부터 제거된다. 상기 표적 핵산의 서열은 상기 중합 반응 동안 감지된 상기 형광 방출 신호들의 서열을 핵산 서열로 전환함에 따라 유도된다.
본 명세서는 본 명세서 내에서 인용된 참고문헌들의 가르침의 견지에서 대부분 완전히 이해된다. 본 명세서 내의 상기 실시예들은 본 발명의 실시예들의 도해를 제공하며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 다른 많은 실시예들이 본 발명에 의해 포함된다는 것을 당업자라면 쉽게 인지할 것이다. 여기에 인용된 모든 간행물들, 특허 출원들 및 특허들은 전부 본 명세서에 참조로 결합된다. 참조로 결합된 내용이 본 명세서와 모순되거나 또는 불일치하는 정도에서는, 본 명세서가 어떤 그러한 내용도 대체할 것이다. 여기서의 어떤 참고 문헌들에 대한 인용도 그러한 참고 문헌들이 본 발명에 대한 선행 기술이라고 인정하는 것은 아니다.
다르게 기재되지 않은 한, 청구항을 포함하여 본 명세서에 사용된 성분들의 양, 반응 조건 및 기타 등등을 포현하는 모든 요소들은 "약"이라는 용어에 의해 모든 실시예에서 변형되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서 반대되는 기재가 없는 한, 상기 수치적 파라미터들은 근사치이며 본 발명에 의해 달성하고자 하는 바람직한 특성들에 의존하여 변할 수 있다. 적어도, 그리고 상기 청구항들의 범위에 균등론의 적용을 제한하려는 시도가 아닌 것으로서, 각 수치적 파라미터는 유효 숫자 및 일반적인 대략적 접근의 견지에서 이해되어야만 한다. 본 명세서 내 다른 양의 유효 숫자들을 갖는 수 배열의 열거는 더 적게 주어진 유효숫자를 갖는 수들이 더 많이 주어진 유효 숫자를 갖는 수들과 같은 정확성을 갖는 것이라고 암시하는 것으로 이해될 수 없다.
청구항들 및/또는 본 명세서에서 "포함하는(comprising)"이란 용어와 함께 사용되는 "a" 또는 "an"이란 용어 사용은 "하나"라는 의미일 수 있으나, 이것은 "하나 또는 그 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나보다 큰"의 의미와도 일치할 수 있다. 청구항들에서 "또는(or)"이란 용어의 사용은, 비록 기재된 부분이 단지 대안들(alternatives)과 " 및/또는(and/or)"을 언급하는 정의를 뒷받침하더라도, 대안들만을 언급하거나 혹은 상기 대안들이 서로 배타적이라고 명백하게 지시하지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 데 사용된다.
다른 표시가 없으면, 일련의 요소들 앞에 "적어도"란 용어는 상기 일련의 모든 요소들을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 보통의 실험 이상을 사용하지 않고도 여기에 기재된 상기 특정 실시예들에 대한 많은 균등물들을 인지하고 알 수 있을 것이다. 이러한 균등물들은 다음의 청구항들에 포함될 예정이다.
다르게 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 여기에 기재된 것들과 비슷하거나 동등한 어떤 방법들 및 재료들은 본 발명의 실시 및 시험에서 사용될 수 있다
여기에 기재된 상기 간행물들은 본 출원의 출원일 이전에 오로지 개시 내용을 위해 제공되었다. 여기에 기재된 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물을 앞서는 자격이 되지 못한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 나아가, 제공된 간행물의 날짜들은 독립적으로 확정되기 위해 필요한 실제 공개일들과는 다를 수 있다.
본 발명의 다른 실시예들은 여기에 기재된 명세서의 고려 사항 및 실시예들의 실시로부터 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것일 수 있다. 본 명세서 및 실시예들은 오로지 예시적으로서 고려되는 것으로 의도되며, 본 발명의 실제 범위 및 사상은 다음의 청구항들을 통해 나타난다.

Claims (40)

  1. (a) 표적 핵산 서열을 갖는 주형 핵산, 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 핵산, 및 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성 및 3'에서 5' 방향으로 핵산말단분해효소 활성을 갖는 중합 효소 또는 효소 복합체를 포함하는 반응 복합체를 공급하는 단계;
    (b) 상기 반응 복합체를, 적어도 하나의 염기쌍 모이어티와 상기 염기쌍 모이어티의 정체를 나타내는 광-감지 라벨을 갖는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 개별적으로 포함하는 복수의 뉴클레오티드 유사체들과 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 주형-의존 양식에 따라 뉴클레오티드 유사체를 초기 가닥으로 결합하도록 상기 효소 또는 효소 복합체를 허용하여, 이에 따라 상기 라벨 모이어티가 상기 초기 가닥으로 결합되는 단계;
    (d) 상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 광-감지 라벨을 감지하는 단계;
    (e) 상기 효소 또는 효소 복합체의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 통해 상기 결합된 뉴클레오티드 유사체의 라벨 모이어티를 상기 초기 가닥으로부터 제거하도록 상기 효소 또는 효소 복합체를 허용하는 단계; 및
    (f) (c) - (e) 단계들을 반복하여 상기 표적 핵산의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 광-감지 라벨은 형광인 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 형광 소광 모이어티를 더 포함하며, 상기 형광 소광 모이어티는 상기 뉴클레오티드 유사체가 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 상기 초기 가닥으로 결합되자마자 상기 뉴클레오티드 유사체로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  4. 제1항에 있어서, 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 상기 적어도 하나의 염기쌍 모이어티는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기들을 포함하며, 이들 각각은 상기 반응 복합체의 활성 사이트에서 상기 표적 핵산 서열의 대응되는 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 염기쌍 모이어티의 3' 말단은 인산 결합을 통해 상기 라벨 모이어티로 연결되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 라벨 모이어티는 광-감지 라벨 및 상기 광-감지 라벨을 상기 인산 결합으로 연결시키는 선택적 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 라벨 모이어티는,
    ⒜ 하나 또는 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들; 및
    ⒝ 상기 광-감지 라벨을 상기 하나 또는 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들에 연결하는 선택적 링커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들은 어베이직 뉴클레오티드 잔기 및 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 또는 우라실의 어떤 것과도 염기쌍을 이룰 수 있는 능력이 실질적으로 없는 염기를 포함하는 뉴클레오티드 잔기로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 형광 소광 모이어티가 뉴클레오티드 유사체의 5' 말단에 부착되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 형광 소광 모이어티는 링커를 통해 상기 뉴클레오티드 유사체의 5' 말단에 부착되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 알파 인산염, 베타 인산염 및 감마 인산염을 갖는 뉴클레오티드 3인산염이며, 상기 형광 소광 모이어티는 뉴클레오티드 유사체의 5' 말단에 있는 상기 3인산염 기의 상기 베타 또는 감마 인산염에 부착되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  12. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 염기쌍 모이어티가 이것의 5' 말단에 적어도 3개의 인산염 기들을 포함하고, 상기 염기쌍 모이어티(상기 알파 인산염)에 최근접한 상기 인산염 기가 포스포로티오에이트인 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  13. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 염기쌍 모이어티가 이것의 5' 말단에 적어도 3개의 인산염 기들을 포함하고, 상기 염기쌍 모이어티(상기 알파 인산염)에 최근접한 상기 인산염 기가 메틸포스포네이트인 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  14. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 염기쌍 모이어티가 이것의 5' 말단에 적어도 3개의 인산염 기들을 포함하고, 상기 염기쌍 모이어티(상기 알파 인산염)에 최근접한 상기 인산염 기가 보라노포스페이트인 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 반응 복합체의 활성 사이트에서 상기 뉴클레오티드 유사체 결합 및 상기 초기 가닥으로부터 상기 라벨 모이어티 제거 사이의 시간 길이가 약 50 내지 250 밀리 초인 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 방법은, 두 개의 연속적 감지 단계들 (d) 사이의 시간 길이가 약 0.2초부터 1초까지인 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 방법은, 두 개의 연속적 감지 단계들 (d) 사이의 시간 길이가 약 0.2초부터 0.6초까지인 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 방법은, 두 개의 연속적 감지 단계들 (d) 사이의 시간 길이가 약 0.3초부터 0.5초까지인 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  19. 제1항에 있어서, 단계 ⒡에서 ⒞ - ⒠ 단계들을 반복하여 상기 표적 핵산 서열을 결정하는 단계는 상기 프라이머 가닥으로 순차적으로 결합되는 뉴클레오티드 유사체들의 라벨 모이어티 내 각 광-감지 라벨의 순차적 결합을 지속적으로 모니터하고 기록하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  20. 제1항에 있어서, 각 뉴클레오티드 유사체는,
    (a) 상기 뉴클레오티드 유사체의 5' 말단에서, 각각이 상기 반응 복합체의 활성 사이트에서 상기 표적 핵산 서열의 대응되는 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 하나 혹은 그 이상의 뉴클레오티드 잔기들을 포함하는 염기쌍 모이어티; 및
    (b) 상기 뉴클레오티드 유사체의 3' 말단에서, 각각이 상기 표적 핵산 서열의 대응되는 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 능력이 실질적으로 없는 하나 혹은 그 이상의 비-상보적 뉴클레오티드 잔기들을 포함하는 라벨 모이어티를 구비하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  21. 화학식Ⅰ을 갖는 화합물:
    Figure pct00036
    <화학식Ⅰ>
    또는 약제학적으로 수용 가능한 염이나 이의 수화물이고, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이며 ;
    R1과 각 R2는 O-와
    Figure pct00037
    로부터 선택되고, 이때
    ⅰ) R1과 각 R2는 O-이거나; 또는
    ⅱ) R1은
    Figure pct00038
    이고, 각 R2는 O-이거나; 또는,
    ⅲ) R1은 O-, 하나의 R2는
    Figure pct00039
    이고, 다른 잔여 R2는 독립적으로 O-, S-, BH3 -, CH3이며;
    R3은 형광염료 F를 포함하는 뉴클레오티드 모이어티이고;
    R4는 H, OH, (불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는)할로겐, (CH3, CH2CH3을 포함하는)알킬, 또는 (치환되거나 치환되지 않은 것 모두)(OCH3, OCH2CH3을 포함하는)알콕시이며;
    Y1과 Y3은 O-, S-, BH3 -, CH3로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    L1은 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 에스테르, 아미노 및 설포닐로부터 선택되며;
    Q는 형광 소광 모이어티이고;
    B1은 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민, 우라실, 하이포크산틴 및 5-메틸사이토신으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 제21항에 있어서, R3가
    Figure pct00040
    Figure pct00041
    및
    Figure pct00042
    로부터 선택되며;
    B2는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민, 우라실, 하이포크산틴 및 5-메틸사이토신으로부터 선택되고;
    X1은 메틸렌; L2; 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기; 및 L2와, 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기를 포함하는 작용기로부터 선택되며, 이때, L2는 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 에스테르, 아미노 및 설포닐로부터 선택되고;
    X2는 H, CH3 및 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기로부터 선택되며;
    각 R4는 독립적으로 H, OH, 불소 또는 OCH3이고;
    Y2는 O-, S-, BH3 - 및 CH3로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 제21항에 있어서, R3가
    Figure pct00043
    Figure pct00044
    및
    Figure pct00045
    로부터 선택되며,
    B2는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민, 우라실, 하이포크산틴 및 5-메틸사이토신으로부터 선택되고;
    X1은 메틸렌; L2; 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기; 및 L2와, 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기를 포함하는 작용기로부터 선택되며, 이때, L2는 알킬, 알케닐, 알카이닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 에스테르, 아미노 및 설포닐로부터 선택되고;
    X2는 H, CH3 및 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민 및 우라실 중 어느 것과도 염기쌍을 이루지 않는 염기로부터 선택되며;
    Y2는 O-, S-, BH3 - 및 CH3로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  24. 제22항에 있어서, n은 1, R1은
    Figure pct00046
    , 그리고 R2는 O- 인 것을 특징으로 하는 화합물.
  25. 제22항에 있어서, Y1은 S-인 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제22항에 있어서, R3은
    Figure pct00047
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 제22항에 있어서, R3은
    Figure pct00048
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 제22항에 있어서, Y3은 S-인 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. (a) 표적 핵산 서열을 갖는 주형 핵산, 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 핵산, 및 5'에서 3 '방향으로의 중합 활성 및 3' 에서 5'방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 갖는 중합 효소 또는 효소 복합체를 포함하는 반응 복합체를 공급하는 단계;
    (b) 상기 반응 복합체와 제21항에서 정의된 것과 같은 화합물들을 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 제21항에서 정의한 것과 같은 화합물을 초기 가닥으로 결합하도록 상기 효소 또는 효소 복합체를 허용하여 상기 작용기 F가 상기 초기 가닥으로 결합되는 단계;
    (d) 염기 B1 및 선택적으로 존재하는 염기 B2의 정체 및 순서를 나타내는 상기 작용기 F를 감지하는 단계;
    (e) 상기 효소 또는 효소 복합체의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 통해 염기 B1 및 선택적으로 존재하는 염기 B2를 갖는 상기 결합된 뉴클레오티드 잔기들의 3' 위치에 있는 상기 작용기 F를 제거하도록 상기 효소 또는 효소 복합체를 허용하여 상기 작용기 F가 상기 초기 가닥으로부터 제거되는 단계; 및
    (f) (c) - (e) 단계들을 반복하여 상기 표적 핵산 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 표적 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 복수 개의 뉴클레오티드 유사체는 적어도 4개 타입의 뉴클레오티드 유사체들을 포함하며, 각 타입은 고유 염기쌍 모이어티 및 상기 복수 개 뉴클레오티드 유사체의 다른 타입들의 형광들로부터 구별될 수 있는 고유 형광을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 복수 개의 뉴클레오티드 유사체들이, 상기 뉴클레오티드 유사체가 상기 초기 가닥으로 결합되자마자 상기 뉴클레오티드 유사체로부터 제거되는 형광 소광 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 유사체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열 결정 방법.
  32. (a) 중합 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성 모두를 사용하고, 주형-의존 양식에서 초기 가닥 생산을 야기하며,
    (ⅰ) 표적 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산,
    (ⅱ) 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머 핵산,
    (ⅲ) 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성과 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 포함하는 중합 효소 또는 효소 복합체, 및
    (ⅳ) 개별적으로 적어도 하나의 염기쌍 모이어티와, 광-감지 라벨을 갖는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 포함하는 복수의 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에 수행되는 핵산 중합반응을 수행하는 단계; 및
    (b) 상기 효소 또는 효소 복합체에 의해 상기 초기 가닥으로 결합된 상기 뉴클레오티드 유사체에 존재하는 염기 또는 염기들의 정체를 나타내는 광-감지 라벨을 감지하는 단계를 포함하는 핵산 중합 반응에서 중합 효소 또는 효소 중합체에 의해 결합된 뉴클레오티드 염기를 결정하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 이전 결합 사건에서 결합된 상기 뉴클레오티드 유사체의 광-감지 라벨이 상기 효소 또는 효소 복합체의 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 통해 제거된 이후, 상기 감지 단계가 각각의 연속적 뉴클레오티드 결합 사건 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 중합 반응에서 중합 효소 또는 효소 중합체에 의해 결합된 뉴클레오티드 염기를 결정하는 방법.
  34. (a) (ⅰ) 표적 핵산 서열을 포함하는 주형 핵산,
    (ⅱ) 상기 주형 핵산의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 프라이머 핵산,
    (ⅲ) 주형-의존 양식에서 뉴클레오티드 유사체 결합을 위한 반응 사이트를 포함하는 중합 효소 또는 효소 복합체, 및
    (ⅳ) 개별적으로 적어도 하나의 염기쌍 모이어티와, 광-감지 라벨을 갖는 적어도 하나의 라벨 모이어티를 포함하며, 주형-의존 양식에서 일단 상기 효소 또는 효소 복합체에 의해 초기 가닥으로 결합되면 초기 가닥의 생성을 종료하지 않고, 또한 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 제거된 라벨을 포함하는 뉴클레오티드 유사체에 비해, 적어도 하나의 연장된 감지 기간과 연장된 인터펄스(interpulse) 기간을 제공하는 복수의 뉴클레오티드 유사체들의 존재하에서 핵산 중합 반응을 수행하는 단계; 및
    (b) 각 연속적인 결합 사건 동안 결합된 상기 라벨 모이어티를 감지하는 단계를 포함하는 표적 핵산 서열의 핵산 서열 결정 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 감지 기간이 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 제거되는 라벨을 포함하는 유사체를 통한 감지 기간에 대해 적어도 약 10회까지 연장되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 서열의 핵산 서열 결정 방법.
  36. 제34항에 있어서, 두 개의 연속적인 감지 단계들이 약 0.2 내지 약 1초까지 분리되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 서열의 핵산 서열 결정 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 적어도 하나의 형광 소광 모이어티를 더 포함하며, 이때 상기 뉴클레오티드 유사체가 상기 효소 또는 효소 복합체의 5'에서 3' 방향으로의 중합 활성을 통해 결합되자마자 상기 형광 소광 모이어티가 상기 뉴클레오티드 유사체로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 서열의 핵산 서열 결정 방법.
  38. 제34항에 있어서, 상기 라벨 모이어티는 3'에서 5' 방향으로의 핵산말단분해효소 활성을 통해 제거되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 서열의 핵산 서열 결정 방법.
  39. 제1항, 제32항 또는 제34항 중 어떠한 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열이 서열 반복들을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 서열의 핵산 서열 결정 방법.
  40. 제1항, 제32항 또는 제34항 중 어떠한 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열은 (A)n, (T)n, (C)n, 또는 (G)n으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 서열 반복들을 포함하며, 이때 n은 정수 3이거나 이보다 큰 것을 특징으로 하는 표적 핵산 서열의 핵산 서열 결정 방법.
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