CN102782159A - 将核酸进行测序之组合物与方法 - Google Patents
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Abstract
实施例系关于将核酸进行测序的方法。实施例包括核苷酸类似物与包括校对活性之一核酸聚合酶酶或酶复合物的用途。核苷酸类似物可变成被并入一复制之股并且诱发聚合酶的校对活性，因此延长了与核苷酸并入相关之讯号的持续期间，产生更显著的测序结果并增加核酸测序的正确性。
Description
技术领域
本发明系关于测定一核酸之序列的方法。此外，本发明关于核苷酸类似物与其在一核酸测序中的用途。
背景技术
已发展出各种技术与程序来获得基因信息，包括在基因密码(genetic codes)中之分离标志的广泛的基因剖析研究或鉴定形态(broad genetic profiling or identifying pattern)与整个基因体的核苷酸程度之测序。对于在多种应用领域，例如生物技术、鉴识生物学(forensic biology)、诊断(diagnostic)、系统生物学(systematicbiology)、合成生物学(synthetic biology)与个人健康照顾(personalhealthcare)中的基础生物学研究而言，DNA序列的知识已变成不可缺少。DNA测序的出现已显著地增进了生物学研究与发现。尽管技术已发展至在核苷酸程度读取一基因序列，但此类方法可为费时且极度昂贵的。
藉由从电泳基础方法转移至芯片基础测序，新世代测序(NextGeneration Sequencing)之最新的技术（于Metzker,M.L.,NATUREREVIEWS GENETICS 11:31-45(2010)中回顾），已大幅降低测序之成本，其不是自经扩增之目标分子的族群得到序列信息，而通常包括将单一目标分子进行测序。实时测序的引入，其中监测连续核苷酸并入事件的发展，同时执行核酸聚合程序，已改善了测序的效率。
实时单一分子测序的一般策略为源自焦磷酸测序(pyrosequencing)的概念，其中以一光可侦测标记来标记核苷酸三磷酸盐单体的PPi部分。在焦磷酸测序反应中，当各单体被并入一增长之链时，即在聚合酶扩展(polymerase extension)期间，光讯号被释放且侦测（参见，例如Ronaghi,et al.,SCIENCE,281:363-365(1998);Hyman,ANAL.BIOCHEM.,174:423-436(1988)；与美国专利号6,255,083与7,329,492）。使用零阶波导(zero-mode waveguide,ZMW)以在单一分子测序中增加讯号对噪声比(signal-to-noise ratio)之单一分子侦测的方法也已被描述于美国专利号7,170,050与7,056,676中。
在任何酶居中(enzyme-mediated)、模板依赖(template-dependent)测序程序中，并入程序的整体精确度、持续性(processivity)与正确性可直接影响序列测定。目标序列读取之较低的正确性可能需要多倍覆盖率(multiple-fold coverage)以测定出一具有高程度的信赖度之目标序列。不论近来之发展，存在着对每个测序反应提供较高之正确性之测序策略的需要。
发明内容
于此提供之实施例提供用于扩大单一分子讯号侦测之观察期间以改善单一分子序列测定的正确性的新颖方法。实施例包括一测定一目标核酸之核苷酸序列的方法。在一些实施例中，方法包括步骤：(a)提供一反应复合物，包括，一模板核酸，其包括一目标核酸序列、一引物核酸，其包括与该模板核酸之一区域互补的一序列，与一聚合酶酶或一酶复合物，其包括5’至3’聚合活性与校对之3’至5’外核酸酶活性；(b)使该反应复合物与复数个核苷酸类似物接触，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，其为指出该碱基配对部分的身份；(c)藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性，使该酶或酶复合物得以将一核苷酸类似物以一模板依赖方式并入一新生股(nascent strand)，藉此将该标记部分结合至该新生股；(d)侦测该经并入之核苷酸类似物的该光可侦测标记；(e)藉由该酶或酶复合物之校对之3’至5’外核酸酶活性，使该酶或酶复合物得以从该新生股移除该经并入之核苷酸类似物的该标记部分；以及(f)重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸的序列。
于此描述之方法包括一种测定在一核酸聚合反应中藉由一聚合酶酶或酶复合物所并入之一核苷酸碱基的方法，该方法包括步骤：(a)执行一核酸聚合反应，其利用一聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性两者，且以一模板依赖方式导致一新生股的产生，其中执行该反应于下列存在时：(i)一模板核酸，包括一目标核酸序列，(ii)一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的一序列；(iii)一聚合酶酶或一酶复合物，包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性；(iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记；以及(b)侦测该光可侦测标记，其中该标记为指出该碱基或存在于藉由该酶或酶复合物并入该新生股之该核苷酸类似物中之碱基的身份。
实施例还包括一种测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，该方法包括步骤：(a)执行一核酸聚合反应于下列存在时：(i)一模板核酸，包括一目标核酸序列，(ii)一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的一序列；(iii)一聚合酶酶或一酶复合物，包括用于以一模板依赖方式并入一核苷酸类似物的一反应位置；(iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，且其中一旦该类似物藉由该聚合酶酶或酶复合物以一模板依赖方式被并入该新生股，该类似物不终止一新生股之产生，且其中相较于包括藉由该聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性被移除的一标记的一核苷酸类似物，该核苷酸类似物提供至少一个经延长之侦测期间与经延长之中介脉冲持续期间；以及(b)侦测在各个依序并入事件中所并入之该标记部分。
于此叙述之任何测序方法中所使用的光可侦测标记可为一荧光团(fluorophore)或可藉由一光侦测器侦测之任何其它适合之标记。于此叙述之任何方法中所使用的核苷酸类似物可包括至少一荧光淬熄部分(fluorescence quenching moiety)。在藉由酶或酶复合物之5’至3’聚合活性以一模板依赖方式并入核苷酸类似物之时，该荧光淬熄部分从该核苷酸类似物被移除。在一些方面中，荧光淬熄部分，视需要而定藉由一连接物(linker)，附着至一核苷酸类似物之5’端。在一些方面中，荧光淬熄部分附着至于核苷酸类似物之5’端之三磷酸盐基团的β或γ磷酸盐。
在一些方面中，标记部分包括一光可侦测标记与一可选的连接物其连结光可侦测标记至一磷酸连接(phosphate linkage)。在一些其它方面中，标记部分包括：(a)一或多个非互补核苷酸残基；(b)一光可侦测标记；以及(c)一可选的连接物连结该光可侦测标记至该一或多个非互补核苷酸残基。该一或多个非互补核苷酸残基为独立地择自一无碱基核苷酸残基与包括一碱基之一核苷酸残基，而该碱基实质上缺乏与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一个碱基配对的能力。
核苷酸类似物之碱基配对部分一般包括一碱基，该碱基具有在该反应复合物之一并入位置中与该目标核酸之一对应碱基碱基配对的能力。在一些方面中，碱基配对部分之3’端经由一磷酸连接连结至标记区域。在一些实施例中，碱基配对部分包括至少三个磷酸盐机团于其5’端，其中，最接近该碱基配对部分（α磷酸盐）的磷酸盐基团为一硫代磷酸盐(phosphorothioate)、甲基磷酸盐(methylphosphonate)或硼烷磷酸盐(boranophosphate)。
实施例还包括一化合物，具有式I：
式I
或一其药学上可接受之盐类或水合物，其中
n为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
R1与各个R2为择自O-与
其中
(i)R1与各个R2为O-；或
(ii)R1为
且各个R2为O-；或
(iii)R1为O-，一个R2为
以及任何剩余之R2独立地为O-、S-、BH3 -或CH3；
R3为一核苷酸部分，其包括一荧光染料F；
R4为H、OH、卤素（包括氟、氯、溴与碘）、烷基（包括CH3、CH2CH3）或烷氧基（经取代与未经取代两者）（包括OCH3与OCH2CH3）；
Y1与Y3为各自独立地择自O-、S-、BH3 -与CH3；
L1为择自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基与磺酰基；
Q为一荧光淬熄部分；以及
B1为择自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤(hypoxanthine)与5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)。
方法可被执行于，藉此介于在该反应复合物之并入位置之该核苷酸类似物的结合与从该新生股之标记部分的移除之间的时间长度为从50至250毫秒或任何于此叙述之范围的条件下。
方法可被执行于，藉此介于两个连续之侦测步骤之间的时间长度为从约0.2秒至1秒，约0.2至0.6秒，约0.3至0.5秒或任何于此叙述之范围的条件下。
更进一步提供者为适合用以执行于此叙述之测序方法的装置。此装置包括于此叙述之一侦测器或一侦测器系统与一支持器，而于支持器上放置反应复合物。
需了解的是，如所主张，前方之大体叙述与下面之详细描述仅为示例的及用以说明的，而不为实施例的限制。
所附之图式，其被包含于此说明书之一部分中并构成说明书之一部分，以图解说明本发明一些实施例并连同描述内容以用来说明其原理。
附图说明
图1显示一侦测系统之一实施例的一般概要图，而此侦测系统可如于此所述来使用。
图2显示一示例之侦测系统，其包括一纳米尺度之球形光耦合器颗粒(sphere light coupler particle)，以寡核苷酸引物修饰球形光耦合器颗粒于一半球上。以寡核苷酸引物修饰纳米尺度球形光耦合器100于其表面之一半上，寡核苷酸引物具有与嵌入一DNA合成反应复合物200之一复制DNA股中之序列杂合的能力。在一波导(waveguide)之一接合位置(adapter site)104之光耦合器100的定位，由于朝向波导之核层(core layer)之光耦合器的经寡核苷酸引物修饰的表面，将反应复合物200设置在纳米孔洞接合位置104之底部中的狭窄空间(confined space)170中。在此类实施例中，当一激发光145提供一光波，其沿着波导之核层传播时，光耦合器可耦接在接合位置中之核层的表面附近被诱发的一渐逝光场(evanescentlight field)，藉此形成一有效激发区域160在介于可移动之光耦合器与波导之核层之间的狭窄空间中且围绕光耦合器的表面。一光学滤光片由118所表示，且一侦测器由102所表示。参见美国专利申请号13/046,457。
图3显示在藉由使用二核苷酸(binucleotide)类似物之合成的测序步骤中，荧光讯号脉冲(pulse)宽度的延长。
图4显示在藉由使用二核苷酸类似物之合成的测序步骤中的脉冲持续期间。
图5显示在藉由使用包括一荧光淬熄部分之二核苷酸类似物之合成的测序步骤中的脉冲持续期间。相较于图4，淬熄体(quencher)的使用减少了来自未被并入之核苷酸类似物的背景讯号并且延迟了讯号的开始，直到在聚合酶之反应位中之一类似物变为被并入增长的核苷酸股中，在那时包括淬熄部分之焦磷酸基团被释放。
主要组件符号说明
100～纳米尺度球形光耦合器；
102～侦测器；
104～接合位置(adapter site)；
118～光学滤光片；
145～激发光；
160～有效激发区域；
170～狭窄空间；
200～DNA合成反应复合物。
具体实施方式
1.方法
于此叙述之组合物与方法提供用以执行单一分子测序，特别是实时单一分子测序的一有效方法。于此所提供之测序程序可使一或多个下列独特的特征具体化。首先为，侦测期间可被延长，于侦测期间中来自藉由一聚合酶酶或一酶复合物以一模板依赖方式被并入之核苷酸的讯号。可达成以上所述，藉由例如，使用一标记而非终止之核苷酸类似物，其标记可留在经并入之核苷酸残基且维持为新生股(nascent strand)之一部份直到在下一个碱基之并入前藉由酶或酶复合物将其分开。第二为，藉由一经延长的中界(interpulse)持续期间（例如，一“无讯号”或“黑暗”期间），可将对应于连续之核苷酸并入事件的讯号脉冲之时间更进一步分离。可达成以上所述，藉由例如，利用酶或酶复合物从3’至5’外核酸酶活性转换为5’至3’聚合活性所需的时间。此两特质的结合可提供对于一侦测器感应一并入事件的一较长之“讯号”期间以及介于各连续不断之并入事件之间的一清楚“无讯号”或“黑暗”期间，以使侦测器正确地登记一并入事件的完成。
因此，实施例包括一种测定目标核酸之核苷酸序列的方法。在一些实施例中，方法包括步骤：(a)提供一反应复合物，包括，一模板核酸，其包括一目标核酸序列、一引物核酸，其包括与该模板核酸之一区域互补的一序列，与一聚合酶酶或一酶复合物，其包括5’至3’聚合活性与校对之3’至5’外核酸酶活性；(b)使该反应复合物与复数个核苷酸类似物接触，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，其为指出该碱基配对部分的身份；(c)藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性，使该酶或酶复合物得以将一核苷酸类似物以一模板依赖方式并入一新生股，藉此将该标记部分结合至该新生股；(d)侦测该经并入之核苷酸类似物的该光可侦测标记；(e)藉由该酶或酶复合物之校对之3’至5’外核酸酶活性，使该酶或酶复合物得以从该新生股移除该经并入之核苷酸类似物的该标记部分；以及(f)重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸的序列。
实施例还包括一种测定在一核酸聚合反应中藉由一聚合酶酶或酶复合物所并入之一核苷酸碱基的方法，该方法包括步骤：(a)执行一核酸聚合反应，其利用一聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性两者，且以一模板依赖方式导致一新生股的产生，其中执行该反应于下列存在时：(i)一模板核酸，包括一目标核酸序列，(ii)一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的一序列；(iii)一聚合酶酶或一酶复合物，包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性；(iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记；以及(b)侦测该光可侦测标记，其中该标记为指出该碱基或存在于藉由该酶或酶复合物并入该新生股之该核苷酸类似物中之碱基的身份。
实施例还包括一种测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，该方法包括步骤：(a)执行一核酸聚合反应于下列存在时：(i)一模板核酸，包括一目标核酸序列，(ii)一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的一序列；(iii)一聚合酶酶或一酶复合物，包括用于以一模板依赖方式并入一核苷酸类似物的一反应位置；(iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，且其中一旦该类似物藉由该聚合酶酶或酶复合物以一模板依赖方式被并入该新生股，该类似物不终止一新生股之产生，且其中相较于包括藉由该聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性被移除的一标记的一核苷酸类似物，该核苷酸类似物提供至少一个经延长之侦测期间与经延长之中介脉冲持续期间；以及(b)侦测在各个依序并入事件中所并入之该标记部分。
实施例包括使用核苷酸类似物作为用于经由合成之测序的核苷酸基质，其中类似物可包括(i)一碱基配对部分于类似物之5’端，包括一或多个核苷酸残基其各包括一碱基，该碱基具有在一核酸聚合反应复合物之一并入位置中与目标核酸之一对应碱基碱基配对的能力，与(ii)一标记部分，经由例如一磷酸连接，至碱基配对部分之3’端，其中标记部分为不与目标股互补且包括一光可侦测标记。根据本发明之一聚合酶酶或一酶复合物，可藉由模板依赖复制将一核苷酸类似物并入一增长的股中，藉此于类似物之5’端的碱基配对部份与模板股之ㄧ或多个对应碱基碱基配对，且经由类似物之标记部分上的光可侦测标记来侦测类似物与酶的结合及类似物进入复制股的并入。光可侦测标记的侦测可持续直到标记部分被聚合酶之校对的3’至5’外核酸酶活性所切除，而标记部分包括光可侦测标记，且标记部分无法与目标股碱基配对。因此，光可侦测标记的侦测可被延长，而不降低核苷酸类似物基质的浓度而减缓合成反应的速率。之后酶或酶复合物可继续进行至合成的下个步骤，其中，酶或酶复合物可将另一个类似物并入，此类似物包括一碱基配对部分于其5’端，且碱基配对部分与模板股之接下来的一或多个碱基碱基配对。藉由经延长之讯号来区分在合成期间由经标志之反应物的短暂结合所引起的噪声，以增加测序正确性。一来自与一聚合复合物结合之一经标记之反应物之讯号是明显可见的时间长度可等于，在其中聚合酶可从聚合活性转换为外核酸酶活性并切割一错误配对之核苷酸残基的时间长度。在一些实施例中，介于核苷酸类似物与一核酸合成反应复合物之并入位置结合与从新生（“引物”）股移除类似物的标记部分之间的时间长度为从约50至250毫秒。在一些实施例中，时间长度小于50毫秒，或大于250毫秒。
1.1测序复合物与相关材料
于此提供之方法的实行一般包括一反应混合物，反应混合物包括一聚合酶酶或一酶复合物、包括一目标核酸序列的一模板核酸、一引物与一或多种形式之核苷酸类似物。也可使用适合用于聚合反应之各种缓冲溶液与金属离子。
如于此所使用，一“测序复合物”或“反应复合物”（交替使用）意指一复合物，其包括一聚合酶酶或一酶复合物、一模板分子与一引物分子。一测序复合物可附着至一固体支持器。附着可藉由一或多个测序复合物的成分，包括聚合酶、模板分子、引物分子来发生，或间接藉由与测序复合物之任何成分结合的一分子来发生，如以下进一步详述。
其所需要的是，聚合酶可被留在溶液中或被固定于支持器上。可将聚合酶固定于一支持器上，藉由任何本技术领域已知的方法，例如藉由直接吸附、亲和结合与经由系链分子(tethering molecule)之共价或非共价连接。此种系链连接(tethering linkage)之一些非限制性例子为生物素-卵白素(biotin-streptavidin)、抗体-半抗原(antibody-haptene)、凝集素-醣(lectin-saccharide)、硅烷耦合(silanecoupling)、碳二酰亚胺(carbodiimide)、马来酰亚胺(maleimide)、胜肽、碳水化合物、酯、经取代之酯类、酐(anhydride)、经取代之酐与聚丙交酯(polylactide)连接。有许多可使用之系链分子，其已被广泛描述于本技术领域中。一些非限制性之例子包括：二硫苏糖醇(dithiothreitol)、双琥珀酰亚胺戊二酸酯(disuccinimidyl glutarate)、双琥珀亚胺酰辛二酸酯(disuccinimidyl suberate)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯钠盐(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、二硫代双琥珀酰亚胺丙酸盐(dithiobis(succinimidylpropionate))、二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯(dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate))、二(N-琥珀酰亚胺)乙烯乙二醇二琥珀酸酯(ethyleneglycobis(succinimidylsuccinate))、乙二醇-双(丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)二磺酸(ethylene glycobis(sulfosuccinimidylsuccinate))、二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(disuccinimidyl tartrate)、双磺基琥珀酒石酸盐(disulfosuccinimidyl tartrate)、双[2-(琥珀酰亚氨氧代羰氧基)乙基]砜(bis[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]sulfone)、双[2-(硫代琥珀酰亚氨氧代羰氧基)乙基]砜(bis[2-(sulfosuccinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone)、琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烯-l-羧酸酯succinimidyl(4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-l-carboxylate)、硫代-琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烯-l-羧酸酯(sulfo-succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-lcarboxylate)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)、琥珀酰亚氨4-(p-马来酰亚胺基-苯基)-丁酸酯(succinimidyl4-(p-maleimido-phenyl)-butyrate)、硫代琥珀酰亚氨4-(p-马来酰亚胺基-苯基)-丁酸酯(sulfosuccinimidyl4-(p-maleimidophenyl)-butyrate)、二马来酰亚胺基己烷(bismaleimidohexane)、N-(y-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酸亚胺酯(N-(y-maleimidobutyryloxy)succinimide ester)、N-(y-马来酰亚胺基丁酰氧基)硫代琥珀酸亚胺酯(N-(y-maleimidobutyryloxy)sulfosuccinimide ester)、N-琥珀酰亚氨(4-碘乙酰)氨基苯甲酸(N-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate)、硫代琥珀酰亚氨(4-碘乙酰)氨基苯甲酸(sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoate)、1,4-二-[3’-2’-吡啶二硫代(丙酰氨基)丁烷](1,4-di-[3’-2’-pyridyldithio(propionamido)butane])、4-琥珀酰亚氨氧基羰基-a-(2-吡啶二硫代)甲苯(4-succinimidyloxycarbonyl-a-(2-pyridyldithio)toluene)、硫代琥珀酰亚氨-6-[a-甲基-a-(2-吡啶二硫代)-甲苯酰胺]已酸酯(sulfosuccinimidyl-6-[a-methyl-a-(2-pyridyldithio)-toluamido]hexanoate)、N-琥珀酰亚氨-3(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(N-succinimidyl-3(2-pyridyldithio)-propionate)、琥珀酰亚氨6-[3-(2-吡啶二硫代)-丙酰氨基]已酸酯(succinimidyl6-[3-(2-pyridyl dithio)-propionanido]hexanoate)、硫代琥珀酰亚氨-6-[-3-(2-吡啶二硫代)-丙酰氨基]已酸酯、3-(2-吡啶二硫代)-)丙酰肼(3-(2-pyridyl dithio)-propionyl hydrazide)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)、N,N’-二环己基碳二亚胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide)、4-(p-迭氮基水杨酰胺基)-丁胺(4-(p-azidosalicylamido)-butylamine)、迭氮苯甲酰基酰肼(azidobenzoyl hydrazide)、N-5-迭氮-2-硝基苯甲酸琥珀酰亚胺(N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide)、N-[4-(p-迭氮水杨酰胺基)丁基]-3’(2’-吡啶二硫代)丙酰胺(N-[4-(p-azidosalicylamido)butyl]-3’(2’-pyridyldithio)propionamide)、p-迭氮苯甲酰甲醛一水合物(p-azidophenyl glyoxal monohydrate)、4-(p-迭氮水杨酰胺基)丁胺(4-(p-azidosalicylamido)butylamine)、1-(p-迭氮水杨酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(1-(p-azidosalicylamido)-4-(iodoacetamido)butane)、双-[(3-4-迭氮水杨酰胺基)乙基]二硫化物(bis-[(3-4-azidosalicylamido)ethyl]disulfide)、N-羟基琥珀酰亚胺-4-迭氮苯甲酸(N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate)、n-羟基硫代-琥珀酰亚胺4-迭氮苯甲酸(n-hydroxysulfo-succinimidyl4-azidobenzoate)、N-羟基琥珀酰亚胺-4-迭氮水杨酸(N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylic acid)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺-4-迭氮水杨酸(N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidosalicylic acid)、硫代琥珀酰亚胺-(4-迭氮水杨酰胺基)-已酸酯(sulfosuccinimidyl-(4-azidosalicylamido)-hexanoate)、p-硝基苯-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸(p-nitrophenyl-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionate)、2-重氮-3,3,3,-三氟-丙酰氯(2-diazo-3,3,3,-trifluoro-propionylchloride)、N-琥珀酰亚胺-(4--迭氮苯)1,3’-二硫代丙酸盐(N-succinimidyl-(4-azidophenyl)1,3’-dithiopropionate)、硫代琥珀酰亚胺-(4-迭氮苯二硫代)丙酸盐(sulfosuccinimidyl-(4-azidophenyl dithio)propionate)、硫代琥珀酰亚胺-2-(7-迭氮-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3’-二硫代丙酸盐(sulfosuccinimidyl-2-(7-azido-4-methylcoumarin-3-acetamide)ethyl-1,3’-dithiopropionate)、硫代琥珀酰亚胺7-迭氮-4甲基香豆素-3-醋酸盐(sulfosuccinimidyl 7-azido-4-methylcoumarin-3-acetate)、硫代琥珀酰亚胺2-(m-迭氮-硝基苯酰胺)-乙基-1,3’-二硫代丙酸盐(sulfosuccinimidyl 2-(m-azido-onitrobenzamido)-ethyl-1,3’-dithiopropionate)、N-琥珀酰亚胺-6-(4’-迭氮-2’-硝基苯基胺基)已酸酯(N-succinimidy1-6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate)、硫代琥珀酰亚胺6-(4’-迭氮-2’-硝基苯基胺基)已酸酯(sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate)、硫代琥珀酰亚胺2-(p迭氮水杨酰胺基)乙基-1,3’-二硫代丙酸盐(sulfosuccinimidyl 2-(pazidosalicylamido)ethyl-1,3’-dithiopropionate)、硫代琥珀酰亚胺4-(p-迭氮苯)-丁酸酯(sulfosuccinimidyl 4-(p-azidophenyl)-butyrate)。
可将聚合酶固定于不干扰一核酸聚合反应的任何支持器上。支持器之材料、形状及/或尺寸可取决于用以侦测来自反应复合物之讯号的侦测系统。可利用广泛种类之支持器，包括，但不限于由金属、金属氧化物、硅、玻璃、石英、聚合物、碳水化合物、树脂与其之任何复合材料所制成的支持器。材料可为带正电荷的、带负电荷的或不含电荷，且可为未经修饰的，或以一涂层衍生以协助复合物固定。支持物可更为任何适合的形状与尺寸，其包括，但不限于盘(plate)、小珠(bead)、球体(sphere)、载玻片、晶圆、芯片与各种容器的表面，包括孔洞(well)、毛细管(capillary)、移液管(pipettes)、管道(channel)、试管(tube)、细孔(pore)、比色管(cuvette)、微流管道(microfluidic channel)、反应室(chamber)与孔洞。支持物可采取任何适合之形式，包括，但不限于多孔盘与纳米尺寸孔洞的数组。聚合酶之固定可用于将聚合酶设置于用来成像的一狭窄空间内，例如在用于零阶波导成像(zero mode waveguide imaging)之阿升(attoliter)或仄升(zeptoliter)尺度体积内。
聚合酶藉由聚合酶次单元，或藉由包含于聚合酶中之任何其它次单元可附着至支持器。聚合酶可包含一次单元，其除了使聚合酶附着至固定支持器外没有提供功能。聚合酶可被随机固定于支持器上，成数组或成任何其它模式于支持器表面上。
在于此揭露之测序方法中，可使用具有5’至3’聚合或3’至5’外核酸酶活性的任何聚合酶。措辞“3’至5’外核酸酶活性”意指在一新生股之3’端的磷酸二酯键(pho sphodiester bond)的水解分裂(hydrolytic cleavage)。3’至5’外核酸酶活性可用来错误改正（即，校对）被并入一新生（即，增长的）股的一碱基。一般而言，使用上述措辞与模板专一核酸聚合酶相关，藉此，不与模板形成华生-克力克(Watson-Crick)碱基配对的核苷酸，被以一依序之方式从新生股之3’端移除。具有错误改正活性之聚合酶的例子包括，但不限于来自嗜超热球菌(Pyrococcus furiosus)、嗜热球菌(Thermococcus litoralis)与海栖热袍菌(Thermotogamaritime)的聚合酶。一“错误配对之核苷酸”或一“错误配对”意指一核苷酸其不与在那位置之目标核酸序列互补。
如于此使用之措辞“聚合酶”意指一酶或一酶复合物，其催化藉由使用DNA或RNA为一模板来将核苷酸单元添加至一核苷酸链的聚核苷酸合成。此措辞包括单体的(monomeric)与多聚体的(multimeric)的酶（例如，一酶复合物）。一酶复合物可包括一单一酶或多重酶，且也可包括额外之非酶蛋白质或其它次单元。例如，藉由一酶复合物的一或多个次单元，可执行两种类型的酶活性。经由介于次单元间之非共价结合（例如，经由氢键结(hydrogenbonding)、离子键结(ionic bonding)、凡得瓦力(Van der Waals force)与疏水交互作用(hydrophobic interactions)）或共价结合（例如，经由双硫键(disulfide bond)或内酰胺桥(lactam bridges))可使复合物保持在一起。此类复合物的一些非限制性例子，可包括一核酸聚合酶的至少一个催化次单元，核酸聚合酶包括野生型(wild-type)、重组(recombinant)、突变(mutant)与经工程设计(engineered)的聚合酶。一般而言，聚合酶会在黏附至一聚核苷酸模板序列之一引物的3’端使合成开始，且会朝向模板股之5’端前进。一“DNA聚合酶”催化脱氧核苷酸(deoxynucleotide)之聚合。一“RNA聚合酶”催化核糖核苷酸(ribonucleotides)之聚合。
如上所提及，一些聚合酶也可具有校对活性，例如在执行5’至3’聚合活性之一相同次单元内的3’至5’外核酸酶活性。此种类的聚合酶包括，但不限于，原核生物的(prokaryotic)DNA pol I、II与III、真核生物的(eukaryotic)DNA polα、δ与ε与噬菌体复制酶(phage replicase)。
一校对聚合酶具有催化来自脱氧核苷酸之DNA（或来自核糖核苷酸之RNA）的模板引导合成(template-directed synthesis)的能力及还具有一3’至5’校对的外核酸酶活性，且因此可切除一错误配对之核苷酸位于或邻近一新生股之3’端，当其与模板杂合时。在一些实施例中，5’至3’聚合酶活性与3’至5’校对之外核酸酶分别存在于一聚合酶之分开的次单元中，例如大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶III复合物之α与ε(A.Kornberg&T.A.B aker,“DNAReplication”,Second Edition,University Science Books,U.S.A.,2005)。在一些实施例中，校对聚合酶为Pfu、KOD、Tgo、Vent、Deep Vent、phi29DN聚合酶、T4DNA聚合酶（参见，例如Reha-Krantz,L.J.,GENETICS,148:1551-1557(1998)）或T7DNA聚合酶。适合之校对聚合酶可为B型聚合酶。B型聚合酶可为耐热性的(thermostable)聚合酶，例如Pyrococcus聚合酶，例如，Pfu、Pwo、Pho、Pab、Pko、Pgl聚合酶；热球菌属(Thermococcus)聚合酶，例如，嗜热球菌(Thermococcus litoralis)、嗜热球菌种Thermococcus barossii与嗜热球菌种Thermococcus gorgonarius聚合酶；与来自热网菌(Pyrodictium spp.)之聚合酶。也可从真细菌(eubacterial)菌株，例如栖热袍菌属(Thermotoga)分离出具有3’至5’外核酸酶活性的耐高温聚合酶。聚合酶也可衍生自一自然聚合酶并经工程设计(engineered)的以具有5’至3’聚合酶与3’至5’外核酸酶活性两者，其中经修饰之3’至5’外核酸酶活性具有水解地分裂(hydrolytically cleave)前述式I之一标记部分R3的能力，其中R3不包括核苷酸或核苷酸类似物结构。
有用的核酸聚合酶可为非耐热的或嗜热的(thermophilic)。一嗜热的聚合酶（也意指为“热稳定”或“耐热”聚合酶）意指任何酶，其催化藉由使用DNA或RNA为模板将核苷酸单元添加至核苷酸链的聚核苷酸合成，其在高于45℃之温度具有最理想的活性，且不会于高温，例如高于90℃不可逆地变性。耐热聚合酶的非限制性例子为Taq与Pfu DNA聚合酶与其衍生物，及来自嗜热生物体(thermophilic organism)，例如嗜热菌种Thermus aquaticus、嗜热菌种Thermus thermophilus、嗜热球菌、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillussterothermophilus)、嗜热菌种Thermotoga maritime与其它嗜热菌种Thermus、芽孢杆菌(Bacillus)、嗜热菌种Thermotoga与嗜超热球菌(Pyrococcus)种的那些。耐热聚合酶也包括，但不限于，来自嗜热噬菌体(thermophilic bacteriophage)，例如PyroPhage 3173DNA聚合酶(Lucigen)的那些。
在一些实施例中，聚合酶为一非耐热聚合酶，包括，但不限于phi29与BST DNA聚合酶。另一说明性的例子为大肠杆菌DNA聚合酶I的一大片段(Klenow)，其具有3’至5’外核酸酶活性且缺乏5’至3’外核酸酶活性。此酶或等同酶可被使用于实施例中，其中不在高温执行合成反应，例如在等温的(isothermal)聚合酶链锁反应(PCR)期间。在一些实施例中，聚合酶为一古细菌的(archaeal)DNA聚合酶。
适合本发明之复合物也可包含缺乏3’至5’外核酸酶活性的聚合酶，包括聚合酶其自然缺乏外核酸酶活性，例如特定RNA聚合酶、反转录酶(reverse transcriptase)，及聚合酶，其已被截短或以其它方式修饰而不包含外核酸酶活性。此类酶当使用于本发明中时，一般还包括一额外之次单元，其具有执行3’至5’外核酸酶活性的能力。
适合本发明之聚合酶也可具有股取代(strand displacement)活性，其意指在聚合期间，取代下游DNA之聚合酶活性。股取代(strand-displacing)聚合酶可具有减低之5’至3’外核酸酶活性或实质上没有5’至3’外核酸酶活性。在一环形模板分子上，股取代聚合酶可产生模板序列之串连重复(tandem repeat)，有效地将相同之模板再测序(resequencing)。对于单一分子测序而言，此为一特别优点，由于可以一串连方式重复地自一相同之分子衍生出序列信息。适合本发明之股取代聚合酶的非限制性例子，包括，但不限于Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、T4DNA聚合酶全酶(holoenzyme)、噬菌体M2DNA聚合酶、噬菌体PRD1DNA聚合酶与DNA聚合酶I之Klenow片段。
在一些实施例中，聚合酶为一混合蛋白质(hybrid protein)，其包括一聚合区域与一3’至5’外核酸酶。于此使用措辞“混合蛋白质”以描述一蛋白质，其包括来自多重起源(multiple parent)序列的胺基酸残基。混合聚合酶蛋白质之例子与产生混合蛋白质的方法被叙述于国际专利公开号WO 2004/011605中。因此，此类聚合酶为聚合酶的非自然发生变体(variant)。
在一些实施例中，使用具有经增强之持续性(processivity)的聚合酶是有利的。这些的例子包括叙述于国际专利公开号WO01/92501与美国专利号7,666,645中的聚合酶。这些经改善之聚合酶具有经增强之持续性，由于一序列非专一双股DNA结合区域(sequence-non-specific double stranded DNA binding domain)的存在，而序列非专一双股DNA结合区域与聚合酶或聚合酶之酶区域连结。在一些实施例中，此结合区域来自一耐热生物体，且提供一经增强的活性于较高的温度下，例如高于45℃之温度。例如，Sso7d与Sac7d为分别来自极端嗜热(hyperthermophilic)古细菌(archaeabacteria)硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)与嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)之小的（约7,000kd MW）、基础的染色体(chromosomal)蛋白质（参见，例如Choli et al.,BIOCHIMICAET BIOPHYSICA ACTA 950:193-203(1988);Baumann et al.,STRUCTURAL BIOL.1:808-819(1994);与Gao,et al.,NATURESTRUC.BIOL.5:782-786(1998)）。这些蛋白质以一序列一独立方式(sequence-independent manner)与DNA结合，且当结合时，在一些条件下，以上至40℃来增加DNA的Tm(McAfee et al.,BIOCHEMISTRY 34:10063-10077(1995))。在经改善之聚合酶融合蛋白质中，这些蛋白质与其同源体(homologs)可被使用为序列非专一DNA结合区域。Sso7d、Sac7d、Sac7e与相关序列（此处意指为“Sso7序列”或“S so7区域”）为在本技术领域中为已知（参见，例如，获得编号（P39476(Sso7d)；P13123(Sac7d)；与P13125(Sac7e)）。其它序列非专一双股核酸结合蛋白质为拓朴异构酶(topoisomerase)、解旋酶(helicase)或PCNA。额外例子被描述于Motz,et al.,J.BIOL.CHEM.277:16179-88(2002);Pavlov,et al.,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA,99:13510-13515(2002))中。
适合之核酸聚合酶包括核酸聚合酶的功能片段。一聚合酶之“功能片段”意指一野生型或突变之聚合酶的任何部分，其包括少于聚合酶的完整胺基酸序列，且其在至少一组条件下维持催化聚核苷酸之聚合且经由3’至5’外核酸酶活性切除错误配对之核苷酸的能力。
本发明之其它实施例可使用复合物，其利用其它机制来合成新生股，例如模板居间之接合(template-mediated ligation)或可经由一非磷酸二酯连接(non-phosphodiester linkage)来添加互补核苷酸，例如经由形成胜肽键(peptide bond)。对于本发明之目的而言，此类合成的方法也可被视为5’至3’聚合。
在一些实施例中，可藉由添加其它因子来促进本发明之核酸合成，其它因子包括，但不限于蛋白质，例如解旋酶、单股DNA结合蛋白质(single-stranded DNA binding proteins)、腺病毒DNA结合蛋白质(adenovirus DNA-binding protein)、单纯性疱疹病毒(HSV)蛋白质ICP8与BMRF1聚合酶附属次单元(polymerase accessorysubunit)。
1.2测序引物
一测序引物为一与要被侦测之核酸片段或其连结的末端连结引物互补的寡核苷酸，其具有作为藉由聚合酶之核酸合成之起始点的能力。在一些实施例中，测序引物的长度为至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸或更多。在特定实施例中，测序引物之长度可为自8至25、自10至20、自10至30，或自10至50个核苷酸。测序引物可由任何形式之核苷酸所形成，包括自然发生核苷酸、不存在于自然之核苷酸类似物或经修饰之核苷酸。
对于在扩增期间之最大效率而言，引物较佳为单股，但也可为双股，且藉由自身黏附(self-annealing)，例如“发夹(hairpin)”引物，或藉由被黏附至另一个互补之序列。此类双股引物对于使用“热启动(hot start)”聚合酶链锁反应的实施例而言特别有用。
在一些实施例中，一测序引物可包含经修饰之核苷酸，例如锁核酸(locked nucleic acid,LNA)（经修饰之核糖核甘酸，其在一聚核酸(polynucleic acid)中提供增强之碱基堆栈相互作用(basestacking interaction)）。如锁核酸之效用解说，Levin et al.(NucleicAcid Research 34(20):142(2006))显示相对于对应之未锁引物(unlocked primer)，一含锁核酸之引物具有经改善之专一性及显示较强之结合。制造MCP1引物(5’-cttaaattttcttgaat-3’)之三种变化，包含3个锁核酸核苷酸（于盖(cap)中）于引物中之不同位置：MCP1-LAN-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’)；MCP1-LAN-5’(5’-CtTaAattttcttgaat-3’)；与MCP1-LAN-even(5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)。所有经锁核酸取代之引物具有提高之熔解温度(melting temperature,Tm)，而MCP1-LNA-5’引物显示特别提高之测序准确度(Phred Q30 counts)。因此，在特别的实施例中，测序引物可包含至少一锁核苷酸于其5’端区域，即，测序引物之5’端一半、三分之一或四分之一。在一些实施例中，引物可包含额外之分子基团，包括，但不限于一侦测标记，一5’阻碍基团(blockinggroup)或对于补充之聚合酶(recruit polymerase)或其它酶的结合区域。
可将测序引物与样本核酸杂合，藉由将样本核酸与一莫耳过剩(molar excess)之测序引物混合于一含盐溶液中，例如10mMTris-HCl，pH 7.5、1M NaCl与1mM EDTA缓冲溶液。可将混合物加热65℃至少5分钟且缓慢冷却至室温以允许引物/模板黏合。藉由适合之方法可将残余之引物去除，包括，例如一分子筛(molecular sieve)。
藉由适合的方法，包括序列之视觉检阅或计算机协助的引物设计，可设计出引物，而引物包括末端连结与测序引物两者。许多软件套组为可用来协助引物设计，包括DNAStarTM(DNAstar,Inc.,Madison,WI)、OLIGO 4.0(National Biosciences,Inc.)、Vectoe
(Invitrogen)、Primer Premier 5(Premierbiosoft)与Primer3(Whitehead Institute for Biome dical Research,Cambridge,MA)。引物设计，考虑到例如，要被测序之分子、专一性、长度、所需的熔解温度、二级结构、引物二聚体、GC含量、缓冲溶液的pH与离子强度及所使用之酶（即，聚合酶或连接酶）。参见，例如Sambrookand Russell,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press;3rd edition(2001)。在一些实施例中，引物可由不同序列之混合物所组成，例如用于多重聚合酶链锁反应(multiplex PCR)或当扩增具有一未知序列的一模板分子时。在后面之例子中，引物设计可为不需要的，且随机序列之一混合物可用来取代引物。
1.3末端连结引物
在一些实施例中，一线性核酸可还包括一或多个末端连结引物，其与核酸之5’端、3’端，或5’端与3’端两者结合。在特别的实施例中，一末端连结引物可被固定于核酸之3’端。可使用末端连结引物以提供对于一测序引物的互补序列。
末端连结引物为短的核酸分子，通常由少于100个核苷酸所组成。在一些实施例中，末端连结引物之长度为至少5、10、15、20、25、30、50、75、90个核苷酸或更多。在特定实施例中，末端连结引物之长度为自8至25、自10至20、自10至30，或自10至50个核苷酸。在一些实施例中，末端连结引物为未经分支的，然而，在其它实施例中，其可为经分支的。
末端连结引物也可做为一对于一测序序列的互补物(complement)。在一些实施例中，末端连结引物的5’端可包括与一测序引物互补的序列。在一些实施例中，与测序引物互补之末端连结引物系可被定位以便测序引物之3’端直接与要被测序之核酸中的第一个核苷酸邻接。
在一些实施例中，藉由一连接酶(ligase)，例如一DNA连接酶可将末端连结引物加至要被侦测之核酸的末端。在一些实施例中，在连接(ligation)前，末端连结引物与要被侦测之核酸两者皆为单股。在其它实施例中，两者皆为双股。在另外其它实施例中，一者可为单股，而另一者可为双股。连接为本技术领域所熟知。例如，在聚合群落测序方法(polony sequencing method)中，Shendure et al.(SCIENCE,309:1728-1732(2005))以新英格兰生物实验室(NewEngland Biolab’,NEB)快速连接套组(Quick Ligation kit)将一T30末端连结引物(32bp)连结至一样本DNA片段。其中，连结反应溶液包括0.26pmole之DNA、0.8pmole之T30末端连结引物、4.0μlT4DNA连接酶于1×快速连接缓冲溶液(Quick Ligation buffer)中。于混合后，于室温培养反应溶液约10分钟，且之后置于冰上。藉由将样本加热至65℃，10分钟来停止连接反应。
在其它实施例中，可将末端连结引物合成于要被测序之核酸上。例如，末端连结引物可为一藉由例如末端转移酶(terminaltransferase)所加入之均聚物(homopolymer)。例如，Harris etal.(S CIENCE 320:106-109(2008))将一多腺嘌呤尾巴(poly A tail)加至DNA模板，其做为于一病毒基因体之单一分子测序中之一多胸腺嘧啶(poly T)测序引物的互补物。
1.4核苷酸类似物
实施例包括核苷酸类似物做为藉由合成之核酸测序之基质的用途。在一些实施例中，个别之类似物包括一碱基配对部分与一标记部分，碱基配对部分可包括一或多个核苷酸残基于类似物之5’端，其各包括一碱基（例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤(hypoxanthine)或5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)），碱基具有与在一反应复合物之并入位置中之模板核酸之一对应碱基碱基配对的能力。类似物之标记部分可经由一磷酸连接连结至碱基配对部分之3’端，其中标记部分系择自(1)一光可侦测标记，与一可选的连接物其将光可侦测标记连接至磷酸盐，与(2)一基团，其包括一或多个非互补核苷酸残基、一光可侦测标记，与一可选的连接物其将光可侦测标记连接至一或多个非互补核苷酸残基。措辞“非互补”应用于一核苷酸类似物意指，核苷酸实质上缺乏与在模板序列中之一对应碱基形成华生-克力克碱基配对（即，A-T、C-G、A-U之配对）的能力。非互补核苷酸类似物包括，但不限于，无碱基核苷酸，与核苷酸包括一碱基其缺乏与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一个碱基配对的能力。非互补核苷酸残基可导致一“错误配对”（“错误配对之核苷酸”），其随后经由本发明之聚合酶的3’至5’外核酸酶活性被分开。
实施例包括复数个核苷酸类似物的用途，此复数个之一个别的类似物具有如式I中所示之结构：
或一其药学上可接受之盐类或水合物，其中
n为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
R1与各个R2为择自O-与
其中
(i)R1与各个R2为O-；或
(ii)R1为
且各个R2为O-；或
(iii)R1为O-，一个R2为
且任何剩余之R2独立地为O-、S-、BH3 -或CH3；
R3为一核苷酸部分，其包括一荧光染料F；
OCH2CH3）；
Y1与Y3为各自独立地择自O-、S-、BH3 -与CH3；
L1为择自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基与磺酰基；
Q为一荧光淬熄部分；以及
B1为择自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤与5-甲基胞嘧啶；
在一实施例中，例如n为1、2、3、4、5或6。在一些实施例中，n为1、2、3或4。例如，n为1、2或3。在特定实施例中，n为1。
适合为R3基团之核苷酸部分包括单-、二-与三核苷酸。在一些实施例中，R3为择自：F、
其中L2为择自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基与磺酰基；
X2为择自H、CH3与一碱基其不与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶与尿嘧啶之任一个碱基配对；
各R4为H、OH、卤素（包括氟、氯、溴与碘）、烷基（包括CH3、CH2CH3）或烷氧基（经取代与未经取代两者）（包括OCH3与OCH2CH3）；以及
Y2为择自O-、S-、BH3 -与CH3。
例如，R3可择自：从
与
于核苷酸类似物中有用之碱基与于此叙述之方法可允许包括一碱基B1（与一碱基B2根据一些实施例）之一核苷酸类似物，藉由一聚合酶被并入一新生链中，且与模板股上之一或多个碱基形成一或多个碱基配对。措辞“碱基配对”不仅包括标准AT、AU或GC碱基配对，还包括介于核苷酸及/或包括非标准或经修饰之碱基的核苷酸类似物之间所形成之碱基配对，其中氢键提供者与氢键接受者的安排允许介于非标准碱基与一标准碱基之间或介于两个互补非标准碱基结构之间的氢键结。此类非标准碱基配对之一例子为介于碱基类似物次黄嘌呤及腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶任一之间的碱基配对，其中两个氢键被形成于此碱基配对中。
核苷酸类似物可包括一基团，而为了使聚合持续，基团在类似物被并入一新生或增长之股中之后，藉由校对聚合酶之3’至5’外核酸酶活性被移除。在一些实施例中，使用于本发明方法中之核苷酸类似物为单核苷酸类似物，其中此核苷酸类似物包括一标记部分于基团R3中。其所需要的是，标记部分包括一光可侦测标记，或一光可侦测标记与一连接物其将光可侦测标记连结至3’磷酸盐。例如，连接物为如于此处所定义的L2。在此类实施例中，在藉由一聚合酶将类似物并入一增长的股中之后，磷酸盐、可选的连接物与光可侦测标记被移除以解放3’-OH来连接在一随后并入步骤中之一进来的核苷酸类似物的一5’磷酸盐。此移除可藉由校对酶之校对3’至5’外核酸酶活性来催化。
在一些实施例中，用来使用于本发明方法中之核苷酸类似物为单核苷酸类似物，其中此类似物包括做为一标记部分之一基团R3，R3包括一光可侦测标记，或一光可侦测标记与一连接物其将光可侦测标记连结至3’磷酸盐，但其中无法切断连接物以从3’磷酸盐分离光可侦测标记。例如，连接物为如于此处所定义的L2。
在一些实施例中，具有式I之结构的核苷酸类似物为二核苷酸(binucleotide)类似物，其中此类似物包括做为一标记部分的R3基团，R3基团具有结构
在一些实施例中，具有式I之结构的核苷酸类似物为三核苷酸(trinucleotide)类似物，其中此类似物包括做为一标记部分的R3基团，R3基团具有结构：
或
在此类二核苷酸或三核苷酸实施例中，F为一光可侦测标记，Y2为O、CH3、BH2或S，且各个之基团X1与X2为一基团其无法与在模板股中之一对应碱基碱基配对。在一些实施例中，基团X1为一连接物。适合之连接物包括，例如烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基、磺酰基连接物或其类似物。在一些实施例中，连接物为一经取代之烷基、烯基、炔基或胺基。在一些实施例中，连接物为被以异原子中断(interrupted)之烷基、烯基、炔基或胺基。在一些实施例中，例如连接物为聚乙二醇(polyethyleneglycol)。连接物可为任何适合之连接物，其为无反应性的(nonreactive)且其将介于光可侦测标记与核苷酸类似物之剩余物之间的立体阻碍(steric hindrance)最小化。在一些实施例中，基团X1与基团X2任一或两者为一碱基，包括一自然发生或合成之嘧啶或嘌呤衍生物，其不与在目标核酸股中之任何碱基互补。在一些实施例中，X2为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基或磺酰基基团。在一些实施例中，X2为氢。在实施例中，于其中类似物为一三核苷酸类似物，其包括一碱基B2与基团Y2，Y2可为S-,CH3或BH3 -，藉此在三核苷酸类似物并入一增长之股后，可避免包括碱基B2之核苷酸残基之持续的(proces sive)3’至5’切除。
各个R4可独立地为H、OH、卤素（包括氟、氯、溴与碘）、烷基（包括CH3、CH2CH3）或烷氧基（经取代与未经取代两者）（包括OCH3与OCH2CH3）。在另一实施例中，R4独立地为H、OH、氟或OCH3。例如，所有的R4基团可为H。或者，所有的R4基团可为OH。
光可侦测标记F可为任何部分，其可附着至一核苷酸类似物或与一核苷酸类似物结合，且其起作用以提供可侦测讯号。在一些实施例中，标记为一荧光标记，例如一小分子荧光标记。适合为一荧光标记的有用荧光分子（荧光团）包括，但不限于：1,5IAEDANS；1、8-ANS；4-甲基伞形酮(4-Methylumbelliferone)；5-羧基-2,7-二氯荧光黄(5-carboxy-2,7-dichlorofluorescein)；5-羧基荧光素(5-Carboxyfluorescein,5-FAM)；荧光素酰胺(fluorescein amidite(FAM))；5-羧基萘基荧光素(5-Carboxynapthofluorescein)；四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein(TET))；六氯-6-羧基荧光素(hexachloro-6-carboxyfluorescein(HEX))；2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein(JOE));
NEDTM;四甲基若丹明(tetramethylrhodamine(TMR))；5-羧基四甲基罗丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine、5-TAMRA)；5-HAT（羟色胺(Hydroxy Tryptamine)）；5-羟色胺(5-Hydroxy Tryptamine、HAT)；5-ROX（羧基-X-罗丹明(carboxy-X-rhodamine)）；6-羧基罗丹明(6-Carboxyrhodamine)6G；6-JOE；Light
red 610；Light
red 640；Light
red 670；Light
red705；7-胺基-4-甲基香豆素(7-Amino-4-methylcoumarin)；7-氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D,7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素(7-Hydroxy-4-methylcoumarin)；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)；ABQ；Acid Fuchsin；ACMA（9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)）；吖啶橘(AcridineOrange)；吖啶红(Acridine Red)；吖啶黄(Acridine Yellow)；叮啶黄(Acriflavin)；叮啶黄佛尔根SITSA(Acriflavin Feulgen SITSA)；自发荧光蛋白质(AFPs-AutoFluorescent Protein-)(QuantumBiotechnologies)；Texas Red；Texas Red-X conjugate；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；噻嗪红R(Thiazine Red R)；噻唑橘(Thiazole Orange)；硫代黄素5(Thioflavin 5)；硫代黄素S(ThioflavinS)；硫代黄素TCN(Thioflavin TCN)；Thiolyte；噻唑橘(ThiozoleOrange)；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；True Blue；TruRed；Ultralite；Uranine B；Uvitex SFC；WW 781；X-Rhodamine；XRITC；Xylene Orange；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；螯合染料(interchelating dyes)，例如YOYO-3、Sybr Green、Thiazole orange；Alexa染料系列(来自Molecular Probes/Invitrogen)之成员，其覆盖广泛的光谱且并符合一般激发源的主要输出波长，例如Alexa Fluor 350、Alexa Fluor405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700与750；Cy染料荧光团系列(GE Healthcare)的成员，也覆盖一宽的光谱，例如Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；
染料荧光团(DenovoBiolabels)的成员，例如Oyster-500、-550、-556、645、650、656；DY-标志系列(Dyomics)的成员，例如，具有自(DY-415)至844nm(DY-831)的最大吸收范围，例如DY-415、-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-631、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XL；ATTO系列之荧光标志(ATTO-TEC GmbH)的成员，例如ATTO 390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740；CAL
系列或系列之染料(Biosearch Technologies)的成员，例如CAL
Gold 540、CAL
Orange 560、
570、CAL
Red 590、CAL
Red 610、CAL
Red 635、
570与670。
在一些实施例中，光可侦测标记F与一第二光可侦测部分互相作用以修饰由第一或第二标记所提供的可侦测讯号，例如，经由荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer)（“FRET”；也已知为Forster共振能量转移）。在一些实施例中，使用荧光共振能量转移(FRET)为基础的侦测来侦测并入一新生股的核苷酸。例如，在一些实施例中，可使用如叙述于美国专利申请号2010/0035268中之一荧光共振能量转移为基础的方法。在此类实施例中，具有能力扮演为一荧光提供者的一量子点(Quantum dot)可连结至一测序引物，且用以合成增长之股的核苷酸类似物携带一标记F，标记F为一荧光接受者。藉由在荧光共振能量从经激发的量子点荧光提供者转移之后侦测类似物连接之荧光接受者的发射(emission)，实时侦测荧光团标记之核苷酸类似物进入位于核酸聚合酶反应位置的增长之股的并入。各个经并入之核苷酸类似物的身份藉由其荧光标记被测定，当类似物被并入增长之股且直到包含荧光标记之类似物的非互补部分被校对聚合酶之3’至5’外核酸酶活性所移除时，荧光标记是可侦测的。
在一些实施例中，核苷酸类似物包括一荧光淬熄部分Q。荧光淬熄部分包括任何部分，其具有当位于极接近荧光标记时吸收一经激发之荧光标记之能量的能力，且具有消除那能量而无可见光发射的能力。适合之荧光淬熄部分包括，例如，Deep Dark Quencher I(DDQ-I);4-((4-(二甲胺基)苯基)偶氮)苯甲酸(4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)benzoic acid)、琥珀酰亚胺酯(succinimidyl ester)(DABCYL)；
dark quencher；Iowa
FQ;BHQ-1；QSY-7；BHQ-2；Deep Dark Quencher II(DDQ-II)；Iowa
RQ；Q SY-21；BHQ-3与其类似物。一荧光淬熄部分Q可连接至一核苷酸类似物的γ或β磷酸盐。一荧光淬熄部分可经由一连接物L1连结至核苷酸三磷酸盐类似物的γ或β磷酸盐。适合之连接物包括，例如，烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基、磺酰基、聚乙二醇(PEG)连接物，或其类似物。连接物可为任何适合之连接物，其为无反应性的且其将介于荧光淬熄部分与核苷酸类似物之剩余物之间的立体阻碍最小化。
如于此使用之措辞“烷基”意指一饱和之直线或分支的碳氢化合物，例如1-22、1-8或1-6个碳原子的一直线或分支基团，此处分别意指为(C1-C22)烷基、(C1-C8)烷基与(C1-C6)烷基。示范之烷基基团包括，但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、三级丁基(t-butyl)、戊基、异戊基、新戊基(neopentyl)、己基、庚基、辛基等。
如于此使用之措辞“烯基”意指一未饱和之直线或分支的碳氢化合物，其具有至少一个碳-碳双键，例如2-22、2-8或2-6个碳原子的一直线或分支基团，此处分别意指为(C2-C22)烯基、(C2-C8)烯基与(C2-C6)烯基。示范之烯基基团包括，但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁间二烯基(butadienyl)、戊二烯基(pentadienyl)、己二烯基(hexadienyl)、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基等。
如于此使用之措辞“炔基”意指一未饱和之直线或分支的碳氢化合物，其具有至少一个碳-碳三键，例如2-22、2-8或2-6个碳原子的一直线或分支基团，此处分别意指为(C2-C22)炔基、(C2-C8)炔基与(C2-C6)炔基。示范之炔基基团包括，但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基与4-丁基-2-己炔基等。
如于此使用之措辞“芳基”意指一单、二-或其它多-碳环、芳香环(aromatic ring)系统。芳基基团视需要而定可融合至一或多个环，择自芳基(aryl)、环烷基(cycloalkyl)与杂环基(heterocyclyl)。芳基基团可被以择自烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺基、胺基、芳基、芳烷基(arylalkyl)、胺甲酸酯(carbamate)、羧基(carboxy)、氰基(cyano)、环烷基(cycloalkyl)、酯、醚、甲酰基(formyl)、卤素、卤烷基(haloalkyl)、杂芳基、杂环基、羟基(hydroxyl)、酮、硝基(nitro)、磷酸盐、硫化物(sulfide)、亚磺酰基(sulfinyl)、磺酰基、磺酸(sulfonic acid)、磺化酰胺(sulfonamide)与硫酮(thioketone)的基团所取代。示范之芳基基团包括，但不限于，苯基、甲苯基(tolyl)、蒽基(anthracenyl)、茀基(fluorenyl)、茚基(indenyl)、薁基(azulenyl)与萘基(naphthyl)，及苯并基-融合之(benzo-fused)碳环部分，例如5,6,7,8-四氢化萘基(5,6,7,8-tetrahydronaphthyl)。示范之芳基基团也包括，但不限于，一单环芳香环系统，其中环包括6个碳原子，于此意指为“(C6)芳基”。
如于此使用之措辞“杂芳基”意指一单、二-或多-碳环、芳香环(aromatic ring)系统，其含有一或多个异原子，例如一至三个异原子，例如，氮、氧与硫。杂芳基可被一或多个取代基所取代，取代基包括烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、胺基、芳基。芳烷基、胺甲酸酯、羧基、氰基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤素、卤烷基、杂芳基、杂环基、羟基、酮、硝基、磷酸盐、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺化酰胺与硫酮。杂芳基可融合至非芳香族环。杂芳基基团之说明性例子包括，但不限于，啶基(pyridinyl)、哒嗪基(pyridazinyl)、嘧啶基(pyrimidyl)、吡唑(pyrazyl)、三嗪基(triazinyl)、吡咯基(pyrrolyl)、吡唑基(pyrazolyl)、咪唑基(imidazolyl)、(1,2,3)-与(1,2,4)-三唑基((1,2,3)-and(1,2,4)-triazolyl)、吡嗪基(pyrazinyl)、嘧啶碱基(pyrimidilyl)、四唑基(tetrazolyl)、呋喃基(furyl)、噻吩基(thienyl)、异恶唑基(isoxazolyl)、三唑基、呋喃基、苯基、异恶唑基与恶唑基(oxazolyl)。示范之杂芳基基团包括，但不限于，一单环芳香环，其中环包括2至5个碳原子与1至3个异原子，于此意指为“(C2-5)杂芳基”。
如于此使用之措辞“杂环基”或“杂环(heterocycle)”意指饱和或未饱和3-、4-、5-、6-或7-员(membered)环，其含有一、二或三个异原子独立地择自氮、氧与硫。杂环可为芳香族的（杂芳基）或非芳香族的。杂环可被一或多个取代基所取代，取代基包括烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、胺基、芳基、芳烷基、胺甲酸酯、羧基、氰基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤素、卤烷基、杂芳基、杂环基、羟基、酮、硝基、磷酸盐、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺化酰胺与硫酮。杂环也包括双环(bicyclic)、三环(tricyclic)与四环(tetracyclic)基团，于其中，任何上述之杂环的环融合至一或两个环，其独立地择自芳基、环烷基与杂环。示范之杂环包括吖啶基(acridinyl)、苯幷咪唑基(benzimidazolyl)、苯幷呋喃基(benzofuryl)、苯幷噻唑(benzothiazolyl)、苯幷噻吩基(benzothienyl)、苯并恶唑基(benzoxazolyl)、生物素基(biotinyl)、[口辛]啉基(cinnolinyl)、二氢呋喃基(dihydrofuryl)、二氢吲哚(dihydroindolyl)、二氢吡喃基(dihydropyranyl)、二氢噻吩(dihydrothienyl)、二氢噻唑(dithiazolyl)、呋喃基(furyl)等哌啶基(homo piperidinyl)、咪唑烷基(imidazolidinyl)、咪唑啉基(imidazolinyl)、咪唑基(imidazolyl)、吲哚基(indolyl)、异喹啉基(isoquinolyl)、异噻唑烷基(isothiazolidinyl)、异噻唑基(isothiazolyl)、异恶唑烷基(isoxazolidinyl)、异异恶唑基(isoxazolyl)、吗啉基(morpholinyl)、恶二唑基(oxa diazolyl)、恶唑啶基(oxazolidinyl)、恶唑基(oxazolyl)、哌嗪基(piperazinyl)、哌啶(piperidinyl)、吡喃基(pyranyl)、吡唑烷基(pyrazolidinyl)、吡嗪基(pyrazinyl)、吡唑基(pyrazolyl)、吡唑啉基(pyrazolinyl)、哒嗪基(pyridazinyl)、吡啶(pyridyl)、嘧啶碱基(pyrimidinyl)、嘧啶基(pyrimidyl)、吡咯烷基(pyrrolidinyl)、吡咯烷基-2基(pyrrolidin-2-only)、吡咯啉基(pyrrolinyl)、吡咯基(pyrrolyl)、喹啉基(quinolinyl)、喹喔啉甲酰(quinoxaloyl)、四氢呋喃(tetrahydrofuryl)、四氢异喹啉(tetrahydroisoquinolyl)、四氢吡喃基(tetrahydropyranyl)、四氢喹啉基(tetrahydroquinolyl)、四唑基(tetrazolyl)、噻二唑基(thia diazolyl)、噻唑烷基(thiazolidinyl)、噻唑基(thiazolyl)、噻吩(thienyl)、硫基吗啉基(thiomorpholinyl)、噻喃基(thiopyranyl)与三唑基(triazolyl)。
措辞“酯”意指结构-C(O)O-、-C(O)O-Rj-、-RkC(O)O-Rj-或-RkC(O)O-，其中O不与氢键结，且Rj与Rk可独立地择自烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、胺基、芳基、芳烷基、环烷基、酯、卤烷基、杂芳基、杂环。Rk可为氢，但Rj不可为氢。酯可为环状的，例如碳原子与Rj、氧原子与Rk，或Rj与Rk可被连接以形成一3-至12-员环。示范之酯包括，但不限于烷基酯(alkyl ester)，其中至少一个之Rj或Rk为烷基，例如–O-C(O)-烷基–、–C(O)-O-烷基–、–烷基–C(O)-O-烷基–等。示范之酯也包括芳基或杂芳基酯，例如，其中至少一个之Rj或Rk为一杂芳基基团，例如砒啶(pyridine)、哒嗪(pyridazine)、嘧啶(pyrmidine)与吡嗪(pyrazine)，例如一吡啶羧酸酯(nicotinate ester)。示范之酯也包括反式酯(reverse ester)，其具有结构-RkC(O)O-，其中氧为与起源分子基团(parent molecular group)键结。示范之反式酯包括琥珀酸酯(succinate)、D-精氨酸甲酯(D-argininate)、L-精氨酸甲酯(L-argininate)、L-赖胺酸酯(L-lysinate)与赖胺酸酯(D-lysinate)。酯也包括羧酸酸酐(carboxylic acid anhydride)与酸卤化物(acidhalide)。
如于此使用之措辞“胺基”意指形式-NRdRe或-N(Rd)Re-，其中Rd与Re独立地择自烷基、烯基、炔基芳基、芳烷基、胺甲酸酯、环烷基。卤烷基、杂芳基、杂环基与氢。胺基可经由氮附着至起源分子基团。胺基也可为环状，例如，Rd与Re可与N共同或一起连结以形成一3-至12-员环，例如，吗啉(morpholino)或哌啶(piperidinyl)。措辞胺基也包括任何胺基基团之对应的四级铵盐(quaternary ammonium salt)。示范之胺基基团可包括烷基胺基基团，其中至少一个之Rd与Re为烷基基团。
如于此使用之措辞“磺酰基”意指结构RuSO2-，其中Ru可为烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基与杂环基，例如，烷基磺酰基。如于此使用之措辞措辞“烷基磺酰基”意指一烷基基团附着至一磺酰基基团。“烷基磺酰基”基团可视需要而定包含烯基或炔基基团。
“烷基、“烯基”、“炔基”与“胺基”基团可被至少一基团取代或中断或分支，此至少一基团为择自烷氧基、芳氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺基、胺基、芳基、芳烷基、胺甲酸酯、羧基、氰基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤素、卤烷基、杂芳基、杂环基、羟基、酮、硝基、磷酸盐、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺化酰胺、硫酮、脲基(ureido)与氮。取代基可被分支以形成一经取代或未经取代之杂环或环烷基。连接物可为一烷基，其视需要定被一或多个异原子所中断，异原子例如氧。在一些实施例中，连接物为聚乙二醇(PEG)。
如于此使用之措辞“适合之取代基”意指一基团，其不会使核苷酸类似物或用于制备它们之中间物(intermediates)的合成或酶功效失效。适合之取代基的例子包括，但不限于C1-22、C1-8与C1-6烷基、烯基或炔基；C1-6芳基、C2-5杂芳基；C3-7环烷基；C1-22、C1-8与C1-6烷氧基；C6芳烷基；-CN；-OH；氧基(oxo)；卤素；羧基；胺基，例如，-NH(C1-22,C1-8或C1-6烷基)、-N(C1-22,C1-8与C1-6烷基)2、-NH((C6)芳基)或-N((C6)芳基)2；甲酰基；酮，例如-CO(C1-22,C1-8与C1-6烷基)、--CO((C6芳基)酯，例如-CO2(C1-22,C1-8与C1-6烷基)与-CO2(C6芳基)。根据核苷酸类似物的稳定性及生化与合成活性，熟悉此技艺人士可快速地选择一适合的取代基。
措辞“可接受之盐类”意指酸性或碱性基团的盐类，其可存在于在本发明组合物中使用的化合物中。可接受之盐类包括盐类，其不干扰于此完成之反应且不以其它形式不受欢迎。可接受之盐类与它们之自由碱基(free base)在活性上没有区别，且可包括盐类，其一般意指为药学上可接受之盐类，其为维持自由碱基之生物活性的非毒性盐类。包含于本发明组合物之为自然酸性的化合物，为具有与各种阳离子形成碱基盐(base salt)的能力。这些盐类之例子包括碱金属或碱土金属，包括，例如钙、镁、钠、锂与钾盐。可接受之盐类也可包括锌、铁、铵(ammonium)、铜、锰、铝盐与其类似物。可接受之盐类也可为衍生自有机非毒性碱基的那些，且也可包括一级、二级与三级胺(amine)、经取代之胺，其包括自然发生之经取代的胺、环胺与碱性离子交换树脂，例如异丙胺(isopropylamine)、三丙胺(tripropylamine)、乙醇胺(ethanolamine)、2-二乙胺乙醇(2-diethylaminoethanol)、2-二甲基乙醇胺(2-dimethylaminoethanol)、二环己胺(dicyclohexylamine)、赖胺酸(lysine)、麸胺酸(glutamine)、精胺酸(arginine)、组胺酸(histidine)、咖啡因(caffeine)、普鲁卡因(procain)、哈胺(hydrabamine)、胆碱(choline)、甜菜碱(betaine)、乙二胺(ethylene diamine)、葡萄糖胺(glucosamine)、甲基葡萄糖胺(methylglucamine)、可可碱(theobromine)、嘌呤(purine)、哌嗪(piperazines)、哌啶(piperidine)、多胺树脂(polyamine resin)与其类似物。此外，盐类可从具有嘌呤，特别是鸟嘌呤或嘧啶间之碱性中心的特定有机与无机酸的添加来形成。最后，于此叙述之化合物之实施例包括它们之未离子化及两性离子(zwitterionic)形式及/或水合物(hydrate)或溶剂合物(solvate)。
一荧光团与一反应分子或部分的组合，其包括淬熄分子或部分，已知为“荧光共振能量转移(FRET)配对”。荧光共振能量转移配对互相作用的机制需要配对之一成员的吸收光谱与其它成员，第一荧光团，之发射光谱部分重迭。若互相作用之分子或部分为一淬熄基团，其吸收光谱必须与荧光团之发射光谱部分重迭（Stryer,L.,ANN.REV.BIOCHEM.47:819-846(1978);C.R.Cantor and P.R.Schimmel,“Biophysical Chemistry-part II:Techniques for theStudy of Biological Structure and Function,”W.H.Freeman and Co.,San Francisco,U.S.A.,1980(pages 448-455)；与Selvin,P.R.,METHODS IN ENZYMOLOGY,246:300-335(1995)）。有效之荧光共振能量转移互相作用要求配对物之吸收与放射光谱具有大程度的部分重迭。荧光共振能量转移互相作用的效率与此部分重迭成线性比例（参见Haugland,R.P.,et al.PROC.NATL.ACAD.SCI.USA,63:24-30(1969)）。一般而言，需要一大量级(magnitude)的讯号（即，一高程度之部分重迭）。因此，根据此基础典型地来选择包括荧光团-淬熄基团配对的荧光共振能量转移配对。
对于选择用于特定探针之适合的荧光共振能量转移提供者-接受者配对而言，可实施的指南为在文献中立即可获得的，由下列之参考文献所示例：Pesce et al.,Eds.,“Fluorescence Spectroscopy,”Marcel Dekker,New York,1971;White et al.,“FluorescenceAnalysis:A Practical Approach,”Marcel Dekker,New York,1970。文献也包括参考文献，其提供荧光与色原质(chromogenic)分子的详尽列表与它们用于选择报告体-淬熄体配对(reporter-quencher pairs)的有关光学特性（参见，例如，Berlman,HANDBOOK OFFLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES,2NDEDITION,Academic Press,New York,1971;Griffiths,COLOURAND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES,AcademicPress,New York,1976;Bishop,Ed.,INDICATORS,Pergamon Press,Oxford,1972;Haugland,HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBESAND RESEARCH CHEMICALS,Molecular Probes,Eugene,1992;Pringsheim,FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE,Interscience Publishers,New York,1949）。此外，文献提供丰富之指南，其关于为了经由可添加至一核苷酸类似物之共同反应基团的共价附着而使报告体与淬熄体分子衍生化（参见，Haugland(supra)；美国专利号3,996,345与4,351,760）。
在一些实施例中，核苷酸类似物各包括一碱基配对部分于其5’端，其包括一核苷酸类似物，核苷酸类似物包括一碱基，碱基具有与在反应复合物之一反应位置中之目标核酸的一对应碱基碱基配对的能力。在核苷酸类似物并入新生股之时，藉由侦测在标记部分中之对应的光可侦测标记，可测定经并入之核苷酸类似物的第一碱基的身份。
在一些实施例中，核苷酸类似物各包括一碱基配对部分于其5’端，其包括两个核苷酸残基，每个核苷酸残基包括一碱基，碱基具有与在反应复合物之一反应位置中之目标核酸的对应碱基碱基配对的能力。在核苷酸类似物并入新生股之时，藉由侦测在标记部分中之对应的光可侦测标记，可测定经并入之核苷酸类似物的首两个碱基的身份。
在一些实施例中，核苷酸类似物各包括一碱基配对部分于其5’端，其包括三个核苷酸残基，每个核苷酸残基包括一碱基，碱基具有与在反应复合物之一反应位置中之目标核酸的一对应碱基碱基配对的能力。在核苷酸类似物并入新生股之时，藉由侦测在标记部分中之对应的光可侦测标记，可测定经并入之核苷酸类似物的首三个碱基的身份。
于此叙述之方法中使用的核苷酸类似物之类型的数目可为4N类型之核苷酸类似物，其中N为在各类似物之5’端的碱基配对部分中之核苷酸残基的数目，而类似物为具有与目标核酸之一对应碱基碱基配对的能力。例如，类似物可为单核苷酸，其各含有一个碱基B1，B1为具有与目标核酸之一对应碱基碱基配对的能力（参见，例如，实施例5以下与式VI）。其中于测序反应中使用复数种类型之单核苷酸，互补之碱基B1的数目N为1，因此一模板核酸连同一聚合酶与一测序引物被以41，或4种类型之单核苷酸类似物接触，其中各类型包含四种碱基腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶（或尿嘧啶）与鸟嘌呤之一做为碱基B1。其中需要的是，四种类型之类似物的各个可包括一独特之对应于碱基B1之身分的荧光标记F。
在一些实施例中，类似物为二核苷酸，其中于类似物之5’端的一碱基配对部分为一核苷酸残基，其具有一互补之碱基B1，且其中连结至碱基配对部分之3’位置的一标记部分为一核苷酸残基，其包括一非互补之基团X1与一荧光标记F，如于此所叙述（参见，例如，实施例1，以下与式II）。根据此类实施例，互补之碱基B1的数目N为1，因此一模板核酸连同一聚合酶与一测序引物被以41，或4种类型之二核苷酸类似物接触，其中各类型包含四种碱基腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶与鸟嘌呤之一做为碱基B1。其中需要的是，四种类型之类似物的各个可包括一独特之对应于碱基B1之身分的荧光标记F。
在一些实施例中，类似物为三核苷酸，其中于类似物之5’端的一碱基配对部分包括两个核苷酸残基，其分别具有互补之碱基B1与B2，且其中连结至碱基配对部分之3’位置的一标记部分为一核苷酸残基，其包括一非互补之基团X1与一荧光标记F，如于此所叙述（参见，例如，实施例9，以下与式X）。根据此类实施例，互补之碱基B1与B2的数目N为2，因此一模板核酸连同一聚合酶与一测序引物被以42，或十六种类型之二核苷酸类似物接触，其中各类型包含腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或鸟嘌呤之两个连续之碱基的十六种组合之一为碱基B1与B2，且其中十六种类型之类似物的各个包括一独特之对应于碱基B1与B2之连续组合的荧光标记F。
1.5类似物之制备
碱基连接与磷酸盐连接荧光团与淬熄体为本技术领域所熟知。例如，从Life Technologies(San Diego,California),Sigma-Genosys(The Woodlands,Texas)、AnaSpec(Fremont,CA)、Eurofins MWG Operon(Huntsville,Alabama)、Glen Research(Sterling,Virginia)或Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)可获得它们。碱基连接荧光团的例子包括，但不限于，经修饰之胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基，其中荧光团被附着在，例如，尿嘧啶基团之5-位置。可使用各种长度之连接物来使荧光团附着至碱基。
在一些例子中，藉由核苷酸类似物的后合成修饰(post-synthesis modification)，将碱基连接荧光团并入核苷酸类似物，而核苷酸类似物随着连接至一非互补碱基的反应基团被合成。此类反应基团包括，但不限于胺基基团（其可与，例如一经活化之羧酸或一N-琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)反应）；迭氮(azide)或炔基基团（其可分别与一炔(alkyne)或迭氮反应，在一“即合(click)”三唑形成反应(triazole-forming reaction)中）；或醛(aldehyde)（其可与胺基基团反应以形成一Schiff’s碱基，与肼基(hydrazine)基团反应以形成腙(hydrazone)，且与半卡肼semicarbazide以形成5-硝糠醛半卡腙(semi-carbazones)）。
于一测序反应混合中之核苷酸类似物的浓度可为任何适合之浓度，其产生一适合之中介脉冲持续期间。一“中介脉冲持续期间”意指介于连续讯号之间的一时间，而连续讯号系侦测自在一聚合酶之并入位置中与增长之股连结及变为被并入增长之股中的一经标记核苷酸类似物。当用于藉由聚合酶链锁反应之核酸扩增的核苷酸浓度典型地为约200μM，且当用于循环测序的浓度为约400μM时，于单一分子测序中使用之经标记核苷酸的浓度通常低得多，例如约250nM。在一些实施例中，于测序反应中使用之核苷酸类似物的浓度为从约50nM至10μM。在些实施例中，核苷酸类似物的浓度为小于50nM，或大于10μM。在一些实施例中，核苷酸类似物之浓度为从约50nM至约500nM，从约75nM至约400nM，从约100nM至约300nM，或从约125nM至约250nM。在一些实施例中，核苷酸类似物的浓度为约250nM。在一些实施例中，中介脉冲持续期间为从约0.2秒至约1秒。在一些实施例中，中介脉冲持续期间为小于0.2秒，或大于1秒。在一些实施例中，中介脉冲持续期间为从约0.2秒至0.6秒。在一些实施例中，中介脉冲持续期间为从约0.3秒至约0.5秒。
在一些实施例中，使用于此揭露之四种类型之核苷酸类似物来执行测序，各种类型包括一与其它不同之碱基（腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶/尿嘧啶），藉由其独特之可侦测标记来区别。自并入位置侦测之四种独特标记的时间的次序或时间顺序为指明一或多种之碱基并入新生股的顺序，且因此允许模板之核酸序列的推论，而模板具有目标分子的序列。
在一些实施例中，使用少于四种标记来执行主题测序程序。例如，使用于此揭露之三种类型的单核苷酸或二核苷酸类似物，各种类型包括一与其它不同之碱基，藉由其独特之可侦测标记来区别，且一第四种类型之核苷酸类似物不包括可侦测标记。藉由侦测上述三种标记，伴随第四种标记被侦测为介于观察到两个经标记核苷酸类似物之间的一长的延迟，之后可测定出序列。
也可以于此揭露之两种类型之单核苷酸或二核苷酸类似物来执行主题测序方法，各种类型包括一与其它不同之碱基，藉由其独特之可侦测标记来区别，且一第三与一第四种类型之核苷酸类似物不包括可侦测标记。藉由将模板股与其互补物(complement)测序可推论出模板的序列与由此之目标核酸。或者，可以不同配对之经标志二核苷酸类似物（例如第一对之经标记二核苷酸，其包括嘧啶C与T，及第二对之经标记二核苷酸，其包括嘌呤A与G，或以在含A、T、C与G之核苷酸中之任何其它可能配对的排列(permutation)）来将模板股被至少测序两次。其它变化为使用单-或二-核苷酸类似物之组，其中两种类型之核苷酸类似物包括一种之可侦测标记，而其它两种类型之核苷酸类似物包括一第二种之可侦测标记。使用两种可侦测标记之测序方法的进一步描述可发现于Sauer et al.,“Detection and Identification of Single Dye LabelledMononucleotide Molecules Released From an Optical Fiber in aMicrocapillary:First Steps Towards a New Single Molecule DNASequencing Technique,”PHYS.CHEM.CHEM.PHYS.1:2471–77(1999)。
使用以一第一可侦测标记来标记之一种类型之单-或二-核苷酸类似物，与以一第二可侦测标记来标记之其它三种类型之单-或二-核苷酸类似物可执行主题测序方法。藉由将模板分子至少测序三次，每次以包括一独特之可侦测标记的一不同核苷酸类似物，可推论出序列。需注意的是，一等同方法可使用三种类型之单-或二-核苷酸类似物，其各包括相同之可侦测标记与一第四之-二核苷酸类似物，其不包括可侦测标记。
在一些相关但有区别之实施例中，使用于此叙述之三核苷酸类似物来执行测序，其中各个三核苷酸类似物包括两个核苷酸，其可与一模板分子碱基配对，以使各个三核苷酸类似物与一不同之二核苷酸序列互补。就其本身而言，具有十六种类型之可能的三核苷酸类似物。在本发明之一些实施例中，使用十六种不同之可侦测标记来在三核苷酸类似物之间进行区分。在一些实施例中，藉由不同方法可侦测标记。对于经荧光标记之三核苷酸类似物而言，不仅以发射波长也以其它参数来区分是可能的，其它参数包括但不限于荧光寿命(lifetime)与荧光强度。
在一些实施例中，使用少于16种可侦测标记可执行测序。荧光团与其周遭分子环境（例如，在附近的碱基）的互相作用可影响荧光团之特性为本技术领域所周知。例如，比起香豆素(coumarin)-CTP，香豆素-dGTP具有一较短的荧光寿命。因此，使用相同之荧光标记可区分多种三核苷酸类似物。
在其它实施例中，一些三核苷酸类似物可包括相同之可侦测标记及/或一些三核苷酸类似物可不包括可侦测标记。藉由以三核苷酸类似物与可侦测标记的不同组合将模板分子重新测序多次，可之后测定出序列。例如，以一组之三核苷酸类似物可执行一第一测序循环，其中类似物包括与模板互补之两个碱基，例如腺嘌呤为5’碱基配对单元（AA、AC、AG或AT，全体为A-次组(subset)）、胞嘧啶为5’碱基配对核苷酸（CA、CC、CG或CT，全体为C-次组）、鸟嘌呤为5’碱基配对核苷酸（GA、GC、GG或GT，全体为G-次组）与胸线嘧啶为5’碱基配对核苷酸（TA、TC、TG或TT，全体为T-次组）。这些三核苷酸的次组各携带一与其它不同之标记，例如Alexa Fluor 405用于A-次组，Alexa Fluor 488用于C-次组，Alexa Fluor 546用于G-次组与Alexa Fluor 635用于T-次组。以这些组的三核苷酸类似物执行测序可因此测定出模板股之每第二碱基的身份。之后使用一第二组之经标记三核苷酸类似物可执行第二测序循环，其中类似物腺嘌呤为第二、下游碱基配对单元（即，其中类似物包括序列AA、CA、GA或TA）、胞嘧啶为下游碱基配对单元（AC、CC、GC或TC）、鸟嘌呤为下游碱基配对核苷酸（AG、CG、GG或TG）与胸线嘧啶为下游碱基配对核苷酸（AT、CT、GT或TT）。类似第一组，于第二回合之测序中的各次组携带一与其它不同之标记。以此第二组之三核苷酸类似物执行第二测序循环可显示剩余部分之模板股的身份，因此测定出模板之完整序列。用于第二测序循环的另一可能方案为，使用与第一测序循环相同组的三核苷酸类似物，但伴随着以一奇数数目之核苷酸来在长度上与第一测序循环中使用之引物产生区隔的一引物，此引物包括，但不限于，短7个核苷酸、短5个核苷酸、短3个核苷酸、短1个核苷酸、长1个核苷酸、长3个核苷酸、长5个核苷酸、长7个核苷酸。在此方案中，仅以奇数数目之核苷酸来在长度上产生区隔之引物，允许鉴定出其在第一回合之测序反应中没有显示身份之在模板股中的第二碱基。于本发明中具体化者为其它替代方案，其包括将经标记三核苷酸的组进行变化，使用一或更少的测序循环，及/或使用不同组合之可侦测标记。
对于藉由合成之单一分子测序而言，本发明之方法可提供具有重新测序单一分子之能力的优势。例如，可以环状形式来提供要被测序之一模板核酸分子，连同一测序引物。藉由执行复数个测序循环可达成重新测序以获得一序列读出，此序列读出大于在模板核酸分子中之核苷酸的数目。所以此测序读出包括一信息，其多余地鉴定出在模板核酸分子中之至少一个位置中的碱基。在一些实施例中，测序读出包括一信息，其多余地鉴定出至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之在模板核酸分子中的碱基。在一些实施例中，测序读出包括一信息，其鉴定出至少25%,50%,75%,90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之在模板核酸分子中的碱基，以2倍、3倍、4倍、5倍、7倍或10倍或更多的多余量(redundancy)。藉由将相同之分子进行测序，测序错误被预期以测序读出之数目的次方下降。例如，若一单一读出之每个碱基的错误率为10-3，之后在三个读出后，其下降至(10-3)3，即10-9。此对于单一分子测序而言，在用于测序之核苷酸失去其标记而导致，例如假性删除(spurious deletion)的情况中，是特别有利的。
其中所需要的是，在核酸聚合反应期间，可以一不同之酶组取代聚合酶酶或酶复合物。相似地，在核酸聚合反应期间，包括核苷酸类似物之试剂与缓冲溶液也可被取代或再补充。
1.6额外的应用
在一些实施例中，荧光标记核苷酸类似物可扮演对于附着至一聚合酶之提供者发色团(chromophore)的一接受者发色团。因此，在这些实施例中，设置于聚合酶之提供者发色团可激发于一增长之核酸股上的一接受者发色团，而增长之核酸股为从目标核酸复制。由于在荧光共振能量转移效能中的快速减少，不接近聚合酶之荧光标记核苷酸类似物可能不被激发。在一些实施例中，提供者分子可为，例如，另一荧光团，例如，一量子点。量子点，例如半导体量子点，为本技术领与所知，且叙述于，例如，国际公开号WO03/003015。结合量子点至，例如生物分子的方法为本技术领域所知，且分别于Mednitz et al.,NATURE MATERIALS 4:235-46(2005)与公开于2006/3/30与2008/4/17之美国专利公开号2006/0068506与2008/0087843中回顾。在一些实施例中，可将量子点结合至一DNA聚合酶分子。熟悉此技艺人士可了解，当将荧光团结合至，例如一DNA聚合酶时，必须小心，藉由减少将荧光团结合于酶第一、第二或第三结构上的任何影响来维持酶功能。
1.7多光子激发
在一些实施例中，可由两个或更多之光子激发一荧光团。例如，在一些实施例中，于FRET中，不是提供者就是接受者荧光团之激发系经由两个或更多之光子。两个光子与多光子激发更进一步叙述于，例如美国专利号6,344,653与5,034,613中。
1.8目标序列
目标序列包括要藉由本发明方法所测定的序列。可使用主题之发明来将广大种类的目标核酸进行测序。目标序列可包括一完全未知的序列（例如，重新(de novo)测序）、一部份未知序列（例如，对于SNP之鉴定）或可为完全已知（例如，确认一转录产物或鉴定供替换的切割位(splice site)）。在一些实施例中，目标序列可包含被重复未知数目之次数已知序列，其例如可被使用于DNA指纹分析(DNA fingerprinting)、端粒分析(telomere analysis)及/或特定基因疾病之诊断。目标序列可包括核糖核酸(RNA)及/或脱氧核糖核酸(DNA)，包括，但不限于此类核酸之经修饰的变化，例如用于亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing)的CpG甲基化。
目标序列可分离自一生物样本，其包含其它成分，例如蛋白质、脂质、糖与非目标核酸。可从任何细胞材料来获得样本，样本包括，但不限，于自一动物、植物、细菌、真菌与细胞培养获得的那些。样本可直接获自组织、体液样本或其它样本，包括，但不限于血液、淋巴液、尿液、脑脊髓液(cerebrospinal fluid)、精液(seminalfluid)、唾液、痰与粪便。样本也可获自被病毒或其它细胞内病原体感染的组织，或获自病毒之颗粒、样本或制备物。产生样本与萃取核酸序列之方法为本技术领域所熟知。
在一些实施例中，可将样本之核酸成为碎片并以其它方式修饰以产生适合之长度的片段或组合物以做为测序之目标序列。藉由本技术领域已知的任何方法，可执行破碎与修饰，包括，但不限于，音波震动处理(sonication)、限制酶分解(restriction enzymedigestion)、连接至其它核酸序列，与共价连接至其它分子或固体支持器。
在一些实施例中，目标序列可包括非自然序列，质体的部分或人工产生标签(tag)。目标序列可为一序列之混合物，包括，但不限于，萃取自一生物样本的总RNA(total RNA)、一cDNA数据库(cDNA library)或基因体DNA(genomic DNA)。目标序列可为任何长度，例如，于长度上介于5个碱基与50kb之间、于长度上介于5个碱基与20kb之间。
在一些实施例中，目标序列可构成模板序列全部或部分，其为一股，做为藉由聚合酶之本发明核酸合成的模板。
模板包括至少一用于扩增的目标序列与视需要而定额外的序列，其可被用于引物杂合(primer hybridization)、模板固定化(template immobilization)、探针杂合(probe hybridization)、其它目的或留下未使用。模板可为任何形状，包括，但不限于，线性、环状与超螺旋(supercoiled)。模板可为单股、双股、具有单股区域（例如于一发夹环(hairpin loop)中）之双股、缺口的(nicked)或经修饰的（例如藉由甲基化），且可包含RNA、DNA或非自然核苷酸。如上述，为了聚合酶可将模板固定至一表面或模板可为以溶液形式自由的。例如，经由杂合至一经固定、互补的寡核苷酸，或其一些组合，固定化可发生于5’端、3’端、沿着序列之任何地方。
适合用于侦测之目标核酸可包括任何核酸，包括，例如DNA、RNA或PNA(peptide nucleic acid（胜肽核酸）)，且可含有任何序列—已知与未知，包括自然发生或人工序列。核酸可被自然取得、重组产生或化学合成。核酸可包括自然发生核苷酸、不存在于自然的核苷酸类似物或经修饰的核苷酸。基于实际应用，被侦测之核酸的长度可多样化。在一些实施例中，核酸包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000个碱基或更多。在一些实施例中，核酸可为自10至20、自10至50、自10至100、自50至100、自50至500、自50至1000、自50至5000、自500至2000、自500至5000，或自1000至5000个碱基，或自5个碱基至20kb，或自5个碱基至50kb。
用以侦测之目标核酸可为单股。藉由本技术领域所知的方法，例如加热或碱或其它化学处理，可自一双股模板分子获得单股核酸。藉由例如化学或in vitro合成，也可产生单股核酸模板。
在一些实施例中，要被侦测之核酸可为环状。在一些实施例中，方法包括，提供包括具有一已知序列之插入的一环状核酸分子，其可被使用为对于一引物的结合位。可以一单股状态、一双股状态或两种状态之混合来提供环状核酸分子，且环状核酸分子一般包括至少一共价封闭股(covalently closed strand)。双股环状分子可包括一缺口股或一第二共价封闭股。
在一些实施例中，藉由从环状核酸分子之来源以环状形式分离出环状核酸分子来提供环状核酸分子，若其序列之部分为已知且因此可做为核酸插入物的话（例如，在包含于环状分子中之一基因的序列内的保守部分可为已知，或分子被已知为包含一序列，根据其在高度严厉条件下与另一已知序列之核酸杂的能力）。在一些实施例中，仅为不确切地得知核酸插入物之序列，此类例子为当序列信息系来自严厉杂交特性时。在一些实施例中，确切地得知核酸插入物之序列，此类例子为当环状核酸分子具有一已知骨干序列(backbone sequence)或已被工程设计来包含一已知序列时。
在一些实施例中，藉由执行in vitro反应以将一线性核酸样本并入一伴随核酸插入物的环状分子，来提供环状核酸分子。在一些实施例中，in vitro反应包括藉由一连接酶之连接及/或其它之股连接反应，例如其可藉由各种酶催化，包括重组酶(recombinase)与拓朴异构酶(topoisomerases)。可使用DNA连接酶或RNA连接酶以酶性地连接一线性模板之两端，偕同或不偕同一接合物(adapter)分子或连接物，来形成一环状。例如，如于Tessier et al.,ANAL.BIOCHEM.,158:171-78(1986).CIRCLIGASE(TM)(Epicentre,Madison,Wis.)中所述之结合单股DNA或RNA的T4RNA连接酶，也可被用来催化一单股核酸的连接。或者，也可使用一双股连接酶，例如E.coli或T4DNA连接酶，来执行环状化反应。
在一些实施例中，提供环状核酸分子包括藉由从至少一包括互补区域的引物（其可包括具有5’封盖(flap)之已知序列的随机引物，已知序列可做为一核酸插入物）延伸来复制一核酸模板，与使经扩增之核酸成为环状，例如可由连接酶或重组酶来催化；在一些实施例中，在环状化之前，例如可藉由限制(restriction)或磷酸化来处理经扩增之核酸于其末端。
在一些实施例中，藉由执行化学环状化来提供环状核酸分子。化学方法使用已知偶合剂(coupling agent)，例如BrCN加上咪唑(imidazole)与二价金属、N-氰咪唑(N-cyanoimidazole)伴随ZnCl2、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二酰亚胺，盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylcarbo diimide HCl)与其它碳二酰亚胺(carbodiimide)与羰基二咪唑(carbonyl diimidazole)。藉由将一5’磷酸盐与一3’羟基，或5’羟基与一3’磷酸盐缩合也可连接一线性模板的末端。
在一些实施例中，环状核酸分子包含一插入序列，由于此分子为环状，插入序列可被视为一末端连接引物（下方讨论），只是其不在末端。
在一些实施例中，目标核酸序列包括一或多个序列重复。一“序列重复”意指至少3个相同类型之连续核苷酸碱基的延伸(stretch)、或者至少3个连续核苷酸碱基的延伸，其于一所提供之目标核酸中至少被重复一次。例如，一序列重复可为含A核苷酸（例如，(A)n）、含T核苷酸（例如，(T)n）、含C核苷酸（例如，(C)n）或含G核苷酸（例如，(G)n）的延伸，其中n为3、4、5、6、7、8、9、10之整数或更大。在一些例子中，n为介于3至10、介于3至300、介于3至15、3至30、3至150之整数。
2.侦测系统
于此揭露之测序方法的实施，一般包括使用一侦测器以侦测来自一被并入之核苷酸类似物的讯号，而此核苷酸类似物系以一模板依赖方式藉由聚合酶酶或酶复合物被并入。当执行核酸聚合反应时，可执行此类侦测以登记对应于连续合并事件之讯号的时间次序。
任何适合之侦测器或其系统可提供一侦测位置，其包含反应复合物，反应复合物包括一聚合酶酶或酶复合物，与一模板。介于在侦测位置中标记部分的起始侦测与从侦测位置之标记部分的移除之间的时间为“侦测期间侦测期间(detection duration)”。侦测期间之长度可变化，例如，随着反应条件、使用之聚合酶与核苷酸类似物，且也可遭受在单一酶动力学中之随机变异(stochasticvariation)的影响。在一些实施例中，相较于其标记系经由酶或酶聚合物之5’至3’聚合活性被移除的一经标记核苷酸类似物，于本发明中使用之核苷酸类似物提供一经延长之侦测期间。例如，侦测期间可以至少1、5、10、20、50、100、200、500、1000倍或甚至更高来被延长。在一些方面，使侦测期间维持了从约30毫秒至约300毫秒，或从约50毫秒至约250毫秒。在一些方面，侦测期间可不小于约30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300毫秒。在一些实施例中，两个连续之侦测步骤（对应于以模板依赖方式之两个连续的并入事件）平均被以，例如约0.2至约1秒、从0.2至约0.6秒，或从0.3至约0.5秒分隔。在一些实施例中，本发明之方法可在藉此任何两个连续之侦测步骤被以至少约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1秒分隔的状态下被执行。
具有提供单一分子侦测之能力的任何侦测器或其系统可使用于本发明。侦测器或侦测器系统的选择可取决于在核酸聚合反应中使用的标记种类而定。可设置侦测器以侦测放射线(radioactivity)、化学冷光(chemiluminesce)、酶活性(enzymatic activity)、导电度(conductivity)、电荷(charge)及/或荧光(fluorescence)。
在实施于此揭露的测序方法中，可使用广泛种类之侦测系统。它们包括，但不限于，在2011/3/11提申、题名为“单一分子侦测系统与方法(Single-Molecule Detection System and Methods)”的美国专利申请号13/046,457中描述的侦测系统。简单而言，使用于此揭露之方法要被来测序的一目标核酸，系设置于为一核酸合成反应复合物之部份的可移动光耦合器上。此种系统利用零阶波导(ZMW)以促进单一分子侦测，藉由例如，产生一经定义之激发光场与使用一纳米尺度孔洞以将反应体积最小化，藉此大幅地使背景讯号最小化。对于与在此叙述之方法一起使用而言，合并零阶波导之适合的侦测系统也包括于2010/6/11提申之美国专利申请号12/801,503；2010/7/29提申之美国专利申请号12/805,411；美国专利号6,917,726；7,170,050；与7,486,865；及Eid,J.,et al.,SCIENCE,323:133-138(2009)中所描述的系统。于美国专利号7,767,441与美国专利申请号13/046,457中描述了两种其它适合的侦测系统。在一些实施例中，侦测系统包括一光照来源(illumination source)、一侦测器与一波导(waveguide)。在一些实施例中，波导包括一纳米孔洞(nanowell)或其它微流体结构(microfluidic structure)，其可将一测序复合物维持在一够小的体积中，以选择成像(selectiveimaging)发生聚合的反应位置。在其它实施例中，侦测系统可包括一可移动光耦合器、一侦测器与一波导，其中波导包括一对于可移动光耦合器的一接合位置(adapter site)。侦测系统可执行测序位置之连续或同时发生的侦测。在一些实施例中，一独立纳米孔洞之小的尺寸或覆盖区(footprint)促进了测序之高度有效平行化(parallelization)，其可增加输出量(throughput)及/或灵敏度。例如，一侦测系统可包括一或多个波导，其各包括数以百计至千计的接合位置。
可设置包含于一侦测系统中的光源来发射光，之后可将其至少部分结合进一波导为做一激发光以激发目标物(object)。光源可为，例如雷射，例如He-Ne雷射与雷射二极管(laser diode,LD)、发光二极管(light emitting diode,LED)、有机发光二极管(organiclight emitting diode,OLED)、量子点发光二极管(quantum dot lightemitting diode,QLED)、光纤(fiber light)或弧光放电荧光灯(arcdischarge fluorescent lamp)。侦测系统可包括一光源耦合器(lightsource coupler)。光源耦合器可将至少一部份发射自至少一光源的光连接进入光导。光源耦合器可为，例如一棱镜耦合器(prismcoupler)、光栅耦合器(grating coupler)、侧面注入耦合器(side-injection coupler)、垂直注入耦合器(vertical-injection coupler)或同向耦合器(co-directional coupler)。图1显示适合本发明之一侦测系统的实施例，包括一控制器单元其控制一光源，光源产生光，其穿过波导以照射一样本，且藉由一光侦测器侦测从此样本发射出的光，光侦测器产生一数据讯号，其可视需要而定被传送至一外部装置，例如一计算机服务器。视需要而定，介于控制器单元与计算机服务器之间可具有双向沟通，例如以允许远程访问或控制(remote access or control)。
2.1波导
波导可为一通道波导(channel waveguide)或一平面波导(planarwaveguide)。波导可包括一核层(core layer)与至少一被覆层(cladding layer)。例如，若波导为一通道波导，则其可包括一核层与围绕核层的一被覆层。如另一实施例，若波导为一平面波导，则其可包括一核层与设置于核层上的一被覆层或将核层夹于中间的两层被覆层。核层可具有比上述之至少一被覆层高的折射系数(refractive index)。激发光可在波导之核层中延长。适合使用于侦测系统之示例的波导与其特定结构被描述于2010/3/9提申之美国专利申请号12/720,352；2010/6/11提申之美国专利申请号12/801,503；与2010/7/29提申之美国专利申请号12/805,411中。
侦测系统可包括一波导，其包括对于一可移动光耦合器的至少一接合位置，于以下更详细叙述。接合位置可至少被形成于波导的至少一被覆层中。接合位置可为一纳米孔洞，其包括一上开口与一下表面，其中上开口可大于下表面。纳米孔洞可延伸穿过上述至少一被覆层的部分厚度、上述至少一被覆层的全部厚度、上述至少一被覆层的全部厚度与上述核层的部分厚度，或上述至少一被覆层的全部厚度与上述核层的全部厚度。有效激发区域之下方界线可为纳米孔洞的底部。藉由在纳米孔洞接合位置中激发光以垂直于核层之纵向方向的方向（例如，垂直方向）可到达的距离，可定义有效激发区域的上方界线。
侦测系统之波导构成要素可包括复数个接合位置。因此，也可使用此系统来监测大量的目标物。在一些实施例中，可于波导中形成复数个接合位置。在一些实施例中，对于复数个接合位置之各个而言，可形成光侦测器，以在接合位置的有效激发区域内，侦测从一目标物发射的光。在一些实施例中，可使用一个光侦测器以在复数个接合位置的有效激发区域内侦测从目标物发射的光。
2.2可移动光耦合器
侦测系统之实施例包括一可移动光耦合器，其具有使一单一分子目标物设置于波导之至少一个接合位置的能力。可移动光耦合器可为一纳米尺度颗粒。可移动光耦合器可为一纳米尺度球体或一非球体纳米尺度颗粒。当光耦合器靠入于在波导中的一接合位置时，适合单一分子侦测之的一狭窄的激发空间（一有效激发空间）可之后形成，且要被侦测之目标物可被设置于此狭窄的空间内。当一可移动光耦合器靠入一接合位置时，其可避免一第二光耦合器靠入于相同的接合位置。
可移动光耦合器可包括至少一特性，藉由此特性光耦合器可被吸引至接合位置，此特性包括，例如，一表面特性或一磁性特性以促进靠入。在一些实施例中，光耦合器可包括至少一特性，藉由此特性光耦合器可被设置于在一特定定向(orientation)中的至少一个接合位置。藉此光耦合器可被设置于在一特定定向(orientation)中的至少一个接合位置的适合特性，可包括不对称表面特性(asymmetric surface property)。在一些实施例中，光耦合器可使一单一分子目标物设置于，在接合位置内邻近波导之核层的表面的一狭窄空间中，其中一目标物被设置于一有效激发区域中，有效激发区域被形成于接合位置内来自藉由沿着波导之核层延伸之一光波所诱发的一光场。
可移动光耦合器可为一同质固体(homogenous solid)、一胶体或多孔固体，或由具有聚合物主干(polymer backbone)之材料所组成的固体。在一些实施例中，多重功能可移动光耦合器包括一或多个金属材料，其包括，例如金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)、镍(Ni)、铬(Cr)或一金属合金。在一些实施例中，光耦合器包括一或多个氧化物材料，其包括，例如TiO2、Ta2O5、Nb2O5、SiO2、HfO2、Al2O3、ZrO2、ZnO、V2O5、CeO2、CdO、Fe2O3、Fe3O4、Cu2O、CuO、In2O3、La2O3、MoO3或WO3。在更进一步之实施例中，光耦合器包括一或多个硫化物材料，其包括，例如CdS、ZnS、PbS、Au2S或Ag2S。在一些实施例中，光耦合器包括一或多个硒化物材料，其包括，例如CdSe、ZnSe或PbSe。在一些实施例中，光耦合器包括一或多个氮化物材料，其包括，例如Si3N4、TiN、BN与GaN。在更进一步之实施例中，光耦合器包括一或多个聚合物材料，其包括，例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、聚磷睛(polyphosphazene)、聚丙交酯(polylactide)、聚乳酸-聚甘醇酸共聚合物(polylactide-co-glycolide)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚[酸]酐(polyanhydride)、聚马来酸(polymaleic acid)与其衍生物，聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcyanoacrylate)、聚酸酐羟丁酸酯(polyanhydrideoxybutyrate)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚原酸酯(polyorthoester)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚-L-赖胺酸(poly-L-lysine)、聚甘醇酸(polyglycolide)、聚甲基丙烯酸酯(polymethylmethacrylate)、聚乙烯吡咯啶(polyvinylpyrrolidone)或其共聚合物。
在一些实施例中，可移动光耦合器系由一材料所制成，此材料具有一折射系数，其相较于波导之核层之材料的折射系数，较接近波导之第一被覆层之材料的折射系数。在一些实施例中，可移动光耦合器系由一材料所制成，此材料具有一折射系数，其相较于波导之核层之材料的折射系数，较接近一周遭样本溶液的折射系数。在一些实施例中，可移动光耦合器系由一材料所制成，此材料具有一折射系数，其为中间介于波导之第一被覆层的折射系数与波导之核层的折射系数之间。在一些实施例中，可移动光耦合器系由一材料所制成，此材料具有一折射系数，其大体上相似于波导之核层的折射系数。在一些实施例中，可移动光耦合器系由一材料所制成，此材料具有一折射系数，其等于波导之核层的折射系数。
在一些实施例中，可移动光耦合器具有一适合尺寸与一折射系数充分地相似于波导之核层之材料的折射系数，以使当光耦合器被置于波导中的一接合位置时，其具有耦合来自波导之光的能力。在此类实施例中，一经诱发之光场可环绕可移动光耦合器的表面来形成，藉此形成一有效激发区域围绕光耦合器，其中在光耦合器之表面的一特定距离内可激发一分子以发射荧光。
在一些实施例中，可移动光耦合器为不透明的且可局限激发光于其表面，藉此由于可移动光耦合器阻碍来自波导的激发光分布至主体空间(bulk space)，而形成适合单一分子侦测的狭窄空间。在一些实施例中，可移动光耦合器对于光是反射的。在一些实施例中，可移动光耦合器对于激发光是反射的。在一些实施例中，可移动光耦合器具有吸收由波导所发射的激发光且之后由其本身发射出一光线，而此光线可激发要被侦测的分子。
在一些实施例中，当光耦合器在一特地范围内被特定分子所围绕时，光耦合器之光学特性会改变。在一些实施例中，当光耦合器在一特地范围内被特定分子所围绕时所改变的光学特性为折射系数、光吸收能力、藉由耦合器所吸收之光的波长或穿过光耦合器延伸之光的方向。
在一些实施例中，可移动光耦合器之表面的一或多个区域被修饰。例如，可修饰纳米尺度球状光耦合器的全部表面。表面修饰与一具有一核壳结构(core-shell structure)之光耦合器的壳材(shellmaterial)有区别，即，包括表面修饰之一核壳光耦合器具有壳材之外侧表面的修饰。在一更进一步的例子中，可修饰一纳米尺度球形光耦合器之一半球的表面而未修饰剩余的半球。藉由化学修饰技术，可以一或多个异质(heterogeneous)材料，来涂覆光耦合器的表面，遍及其全部表面或至少其表面之一部分。一表面修饰可用来将可移动光耦合器设置于一接合位置。不对称之表面修饰，例如仅于一个表面上的修饰，或于相对之表面上的不同修饰，可使可移动光耦合器设置于在一特定定向中的接合位置。一表面修饰也可使一单一分子目标物设置于光耦合器之表面的一特定区域，藉此此种区域可被定位以面对波导的核层，由此将目标物与包含目标物的反应设置在一狭窄的空间内，而此狭窄的空间介于可移动光耦合器与接合位置表面之间邻近波导的核层。于图2中显示一示例之侦测系统的概要图式，侦测系统包括一纳米尺度球状光耦合器颗粒，其被以寡核苷酸引物于一半球上进行修饰。以寡核苷酸引物来修饰纳米尺度球状光耦合器100于其表面之的一半上，寡核苷酸引物具有与嵌入一DNA合成反应复合物200之一复制DNA股中的序列杂合的能力。以面向波导之核层之光耦合器的寡核苷酸修饰表面，将光耦合器定位于接合位置104，使反应混合物200设置于纳米孔洞接合位置104之底部中的狭窄空间170中。
在一些实施例中，仅修饰可移动光耦合器之表面的一个区域，而剩余的光耦合器之表面则为未修饰的。在一些实施例中，可移动光耦合器之表面的经修饰区域为从约10至90%之可移动光耦合器的表面。用来描述此种实施例之“约10至90%之可移动光耦合器的表面”意指来表示可移动光耦合器之表面的经修饰区域可为从稍微小于10%至稍微大约90%之光耦合器的表面的任何地方。在更进一步之实施例中，光耦合器之表面的修饰区域为小于光耦合器之表面的10%。在又更进一步之实施例中，光耦合器之表面的修饰区域为大于光耦合器之表面的90%。
在一些实施例中，在操作期间，复数个侦测位置的一些包含一个目标核酸分子（视需要而定附着至一光耦合器），而其它侦测位置不包含一目标核酸分子。此可避免在测序完成前两个或更多之核酸分子设置于一侦测位置的情况，以避免一个测序之结果包括来自多于一个分子的信息。例如，在一些实施例中，由于将低浓度的生物分子设置于要被侦测或鉴定之侦测位置，所以低于于或等于50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之侦测位置产生一讯号。在于其中一第一目标核酸从一侦测位置分离，且一第二核酸随后与相同之侦测位置结合的情况中，藉由在侦测经并入核苷酸中的任何间断(gap)及/或藉由在经测定之核苷酸序列中的差异，可将第一核酸进行测序之结果与第二核酸进行测序之结果进行区别。
2.3侦测器
可设置主题侦测系统之一侦测器以侦测从一目标物发射的光。此类侦测器可包括一光学传感器，其具有至少部分吸收入射于其上的光与产生作为对此光之应答的输出讯号的能力。光学传感器可为，例如p-n光二极管(p-n photodiode)、p-i-n光二极管(p-i-nphoto diode)、多重接面光二极管(multi-junction photo diode)、累崩光二极管(avalanche photodiode,APD)、光敏晶体管(phototransistor)、量子井红外线侦测器(quantum-well infraredphotodetector,QWIP)、光电导型光学传感器(photoconductive typeoptical sensor)、光伏打型光学传感器(photovoltaic type opticalsensor)、薄膜上特殊功能集成电路(thin-film on ASIC,TFA)、金属半导体金属光侦测器(metal-semiconductor-metal(MSM)photodetector)、电荷耦合组件(charge coupled device,CCD)、互补式金氧半导体传感器(CMOS sensor)或其组合。
在一些实施例中，光侦测器包括用来控制光侦测器之操作的控制电路。控制电路可包括一讯号放大器(signal amplifier)、A/D转换器(A/D convertor)、积算器(integrator)、比较器(comparator)、逻辑电路(logic circuit)、读出电路(readout circuit)、内存(memory)、微处理器(microprocessor)、时钟震荡器(clock)及/或地址(address)的电路。
可将光侦测器配置于从目标物发射之光可到达的地方。例如，可将光侦测器配置在就接合位置而言之核层的相对侧。即，若将接合位置以垂直方向配置于核层的一侧上，则之后可将光侦测器以垂直方向配置于核层的另一侧上。侦测器系统可还包括至少一滤光片介于核层与侦测器之间。
在一些实施例中，侦测器可为一纳米孔洞传感器(nanoporesensor)。藉由制造称为纳米孔洞之约1nm于直径的小孔洞来产生纳米孔洞传感器。用于侦测目的之纳米孔洞可为天然的（例如，穿膜蛋白质）、或人工的（例如，藉由于硅薄板中蚀刻一洞且使用离子束雕刻(ion-beam sculpting method)来将其占满以产生纳米孔洞）。纳米孔洞传感器一般藉由将一纳米孔洞浸入于一导电液体中且提供横跨其之电压来运作。因为穿过纳米孔洞的电流量对于纳米孔洞之尺寸与形状为非常灵敏的，所以可观察到任何由于穿过纳米孔洞之离子传导的轻微电流。一分子，包括，但不限于从如本发明中所述之核苷酸类似物断裂的一标记部分，穿过纳米孔洞可产生在穿过纳米孔洞之电流的量值中的一特有改变。
藉由电泳可控制分子穿过纳米孔洞，其中使一分子朝向纳米孔洞移动。多重的分子以一次一个分子来穿过纳米孔洞。当每个分子穿过时，其以此分子之身分的种类特性来阻塞纳米孔洞：即，在一给予之时间中，穿过纳米孔洞之电流量取决于在那时阻碍纳米孔洞的分子。当切除之标记穿过纳米孔洞时，本发明之核苷酸类似物上的不同标记可允许不同之电流来穿过纳米孔洞，提供了穿过纳米孔洞之标记之顺序的确认，且因此提供了目标序列的确认。纳米传感器更进一步由出版物Howorka,et al.,Nature Biotechnology,19:636-639(2001)；Clarke,et al.,Nature Nanotechnology,4:265-270(2009)；与美国专利号5,795,782；6,362,002；6,123,819；与6,413,792所揭露。
2.4系统之其它光学构成
在一些实施例中，侦测系统可还包括一光学滤光片介于波导之核层与光侦测器之间。在一些实施例中，可将一光学滤光片配置在介于波导之一下被覆层与光侦测器之间。在一些实施例中，可将一光学滤光片配置在介于波导之一下保护层与光侦测器之间。在一实施例中，下保护层其本身可作为一光学滤光片。一光学滤光片可允许具有在一特定范围内之波长的光穿过，但至少部分阻碍具有在特定范围外之波长的光。因此，可选择一光学滤光片以允许自测序复合物发射的光穿过但减少由激发光所引起的噪声，以便改善S/N比。
在一些实施例中，可使用微流体信道来引导样本溶液进入接合位置。可将微流体信道以目标之目标物一次一个通过接合位置的方式来设计，以便实现类流式细胞分析(flow-cytometry-like)侦测。在一些实施例中，可形成一遮盖物于侦测系统上以容纳样本溶液及/或阻挡周围的光线。在一些实施例中，侦测系统可包括一控制器，其操作至少一部份之侦测系统，包括，但不限于一光源、一侦测器与任何流量或侦测系统之其它构成。控制器可包括一计算机可读取媒体，其包含关于侦测系统之各种构成之控制的操作指南，且也可包含对于数据处理与分析的操作指南。可以了解的是，本技术领域中已知的其它构成也可被包含于侦测系统中，当其对于本发明之实施为有用时。
在一些实施例中，可在与测序反应同时或于稍后之时间，将关于讯号脉冲的数据储存于侦测系统中且视需要而定来进行撷取、传送或分析。在一些实施例中，可将此数据传送至一或多个外部装置，包括，但不限于计算机系统、服务器、行动电话、平板计算机系统(tablet computing system)、分布式计算网络(distributedcomputing network)与其它具有储存或处理数据之能力的电子装置。可在侦测同时传送数据，或可在侦测之后传送数据。在一些实施例中，外部装置包括一序列之数据库，其可为公众的或个人的。在一些实施例中，外部装置分析讯号脉冲数据以产生一目标核酸的序列。在一些实施例中，外部装置可执行额外的功能，包括，但不限于碱基名称的校对(proof reading of base calls)、与其它序列，例如一参考序列的排比(alignmnt)、错误分析、报告产生，或更进一步传送数据至其它装置，包括将数据传回侦测系统。在一些实施例中，数据与视需要而定所产生之序列与分析可被译成密码。在一些实施例中，在将数据被传送至外部装置之前，可将其译成密码。
可将一通信配件纳入于侦测系统内，且通信配件具有传送或接收来自外部装置之数据的能力。此类通信可经由有线网络(wirednetwork)或为无线的。可使用各种通信方法，例如，经由一以太(Ethernet)或其它区域(local area)网络、一USB连结、一FireWire连结、以一调制解调器(modem)的拨接连结(dial-up wiredconnection)、一直接链路(direct link)，例如T1、ISDN或电缆线路(cable line)。无线通信可为蓝牙或RTM技术。在较佳实施例中，使用典型无线网络(exemplary wireless network)，例如蜂巢式(cellula)、卫星(satellite)或呼叫(pager)网络、GPRS，或一区域数据传送系统(local data transport system)，例如，以太或信号环覆盖一局部局域网络(token ring over a local area network)来建立一无线连结。在一些实施例中，可将数据送至一个人通讯地址(personaladdress)，包括，但不限于一电话号码、一文字讯息地址(textmessaging address)、一电子邮件地址(email address)或一在线账号(online account)。在一些实施例中，通信配件可包含用来发送与接收数据的一无线红外通信(wireless infrared communication)构件。
3.1实施例1
于此与下方实施例中，示例之核苷酸类似物可包括碱基B1、B2及/或基团L1、L2、Q、F、X1与X2，各具有如于此所叙述的身份，代表具有前述式I之结构的核苷酸类似物。
一示例之二核苷酸三磷酸盐类似物具有如式II中所显示的结构：
于图3中提供藉由合成之校对依赖测序的一单一循环的概要图式，而此合成系使用具有式II之结构的类似物。包括一校对聚合酶、一目标（模板）股与一复制股的反应复合物被暴露至激发光。一进来的核苷酸类似物，其具有做为碱基B1的腺嘌呤，与聚合酶的反应位置结合并与在目标股中的一胸腺嘧啶碱基配对。藉由聚合酶，二核苷酸类似物被并入增长之股中，于是荧光标记F被激发光所刺激并发射出一讯号其被一侦测器所获得。如光谱图中所示，此讯号维持为可侦测的，直到藉由聚合酶之外核酸酶活性从增长之股来切断类似物的未配对部分（包括基团X，其无法与在目标股中之随后的碱基碱基配对，及荧光标记F）。当类似物之经标记、未配对部分从反应复合物分离时，讯号消失。
3.2实施例2
一示例之二核苷酸三磷酸盐类似物，其包括一荧光淬熄部分Q，此二核苷酸三磷酸盐类似物具有如式III中所显示的结构：
3.3实施例3
一示例之二核苷酸三磷酸盐类似物，其具有代替三磷酸盐链之α-磷酸盐的一硫代磷酸盐(phosphorothioate)，因此避免聚合酶之持续的3’至5’外核酸酶活性，此二核苷酸三磷酸盐类似物具有如式IV中所显示的结构：
3.4实施例4
一示例之二核苷酸三磷酸盐类似物，其具有一荧光淬熄部分Q与代替三磷酸盐链之α-磷酸盐的一硫代磷酸盐，因此避免聚合酶之持续的3’至5’外核酸酶活性，此二核苷酸三磷酸盐类似物具有如式V中所显示的结构：
于图5中提供藉由合成之校对依赖测序的一单一循环的概要图式，而此合成系使用具有式V之结构的类似物。包括一校对聚合酶、一目标（“模板”）股与一复制股（“引物”）的反应复合物被暴露至激发光。一进来的核苷酸类似物，其具有做为碱基B1的鸟嘌呤，与聚合酶的反应位置结合并与在模板股中的一胞嘧啶碱基配对。荧光淬熄部分Q将从荧光基团F发射的光淬熄，直到二核苷酸类似物藉由聚合酶被并入增长的股，藉此附着至焦磷酸盐(pyrophosphate)的荧光淬熄部分Q从反应复合物被释放。如显示讯号出现之图5底部的长条所示，来自被并入之荧光基团F的讯号维持为可侦测的，直到藉由聚合酶之外核酸酶活性从增长之股来切断类似物的未配对部分（包括基团X，其无法与在目标股中之随后的碱基碱基配对，及荧光标记F）。当类似物之经标记、未配对部分从反应复合物分离时，讯号消失。
3.5实施例5
一示例之单核苷酸三磷酸盐类似物具有如式VI中所显示的结构：
一示例之单核苷酸三磷酸盐类似物，其包括一荧光淬熄部分Q，此单核苷酸三磷酸盐类似物具有如式VII中所显示的结构：
3.7实施例7
一示例之单核苷酸三磷酸盐类似物，其包括一α-磷酸硫代磷酸盐以避免校对聚合酶之持续的3’至5’外核酸酶活性，此单核苷酸三磷酸盐类似物具有如式VIII中所显示的结构：
式IX
3.9实施例9
一示例之三核苷酸三磷酸盐类似物，此三核苷酸三磷酸盐类似物包括碱基B1与B2于其5’端，碱基B1与B2具有与在一目标核酸中之互补碱基碱基配对的能力，且此三核苷酸三磷酸盐类似物包括一核苷酸残基于其3’端，核苷酸残基包括基团X1，其无法与在一目标核酸中之互补碱基碱基配对，此三核苷酸三磷酸盐类似物具有如式X中所显示的结构：
一示例之三核苷酸三磷酸盐类似物，此三核苷酸三磷酸盐类似物包括(1)碱基B1与B2于其5’端，碱基B1与B2具有与在一目
物具有如式XI中所显示的结构：
3.11实施例11
一示例之三核苷酸三磷酸盐类似物，此三核苷酸三磷酸盐类似物包括(1)碱基B1与B2于其5’端，碱基B1与B2具有与在一目标核酸中之互补碱基碱基配对的能力，(2)一核苷酸残基于其3’端，核苷酸残基包括基团X1，其无法与在一目标核酸中之互补碱基碱基配对，与(3)一α磷酸硫代磷酸盐，其避免聚合酶之持续的3’至5’外核酸酶活性，此三核苷酸三磷酸盐类似物具有如式XII中所显示的结构：
3.12实施例12
3.13实施例13
一示例之三核苷酸三磷酸盐类似物，此三核苷酸三磷酸盐类似物包括(1)碱基B1于其5’端，碱基B1具有与在一目标核酸中之互补碱基碱基配对的能力，与(2)一核苷酸残基于其3’端，核苷酸残基包括基团X1-F与X2，其无法与在一目标核酸中之碱基碱基配对，此三核苷酸三磷酸盐类似物具有如式XIV中所显示的结构：
3.14实施例14
一示例之三核苷酸三磷酸盐类似物，此三核苷酸三磷酸盐类似物包括(1)碱基B1于其5’端，碱基B1具有与在一目标核酸中之互补碱基碱基配对的能力，(2)一核苷酸残基于其3’端，核苷酸残基包括基团X1-F与X2，其无法与在一目标核酸中之碱基碱基配对，与(3)一荧光淬熄部分Q，此三核苷酸三磷酸盐类似物具有如式XV中所显示的结构：
3.15实施例15
3.16实施例16
一示例之三核苷酸三磷酸盐类似物，此三核苷酸三磷酸盐类似物包括(1)碱基B1于其5’端，碱基B1具有与在一目标核酸中之互补碱基碱基配对的能力，(2)一核苷酸残基于其3’端，核苷酸残基包括基团X1-F与X2，其无法与在一目标核酸中之碱基碱基配对，(3)一荧光淬熄部分Q，与(4)一α磷酸硫代磷酸盐，其避免聚合酶之持续的3’至5’外核酸酶活性，此三核苷酸三磷酸盐类似物具有如式XVII中所显示的结构：
3.17实施例17
一示例之三核苷酸三磷酸盐类似物，此三核苷酸三磷酸盐类似物包括(1)碱基B1于其5’端，碱基B1具有与在一目标核酸中之互补碱基碱基配对的能力，与(2)一核苷酸残基于其3’端，核苷酸残基包括基团X1-F与X2，其无法与在一目标核酸中之碱基碱基配对，此三核苷酸三磷酸盐类似物具有如式XVIII中所显示的结构：
分子在适合之测序缓冲溶液中的浓度，提供至如于2011/3/11提申，题名为“Single-Molecule Detection System and Methods.”的美国专利申请号13/046,457中所述的侦测系统。或者，将环状、单股DNA分子的溶液提供至如于2010/6/11提申的美国专利申请号12/801,503；2010/7/29提申的美国专利申请号12/805,411；美国专利号6,917,726；7,170,050；与7,486,865；与Eid,J.,et al.,Science,323:133-138(2009)中所述的侦测系统。
环状DNA分子包含一约20个核苷酸的一已知插入序列至一未知样本序列。提供与已知插入序列互补的测序引物及四种类型的荧光标记二核苷酸类似物，四个核苷酸类似物之各个包括碱基B1，其分别为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在侦测装置中的复数个侦测位置中，形成一校对聚合酶之三元复合物(ternarycomplex)、DNA分子与测序引物，且聚合酶将经荧光标记之核苷酸类似物添加至测序引物之3’端。
在复数个侦测位置中，一经荧光标记之二核苷酸类似物，其与聚合酶之反应位置结合且被并入增长之（引物）股中，被来自与侦测装置耦接之一光源的激发光所激发，且发射出荧光。藉由侦测装置来侦测荧光，其产生要被处理的输出讯号以鉴定由添加至测序引物之二核苷酸类似物所包含之碱基的身份。当聚合酶从增长之股切断包含荧光标记非互补核苷酸基团时，荧光讯号消失，而为了下次核苷酸类似物并入，使包括碱基B1之互补基团的3’-OH自由。
之后聚合酶添加其它二核苷酸类似物，其如上述被侦测。将此循环重复一有效数目的次数以获得至少两次DNA分子的长度的测序读取（即，将DNA分子进行测序与重复测序）。藉由接受或拒绝测序重复，且将来自被接受之重复之排比的一致序列进行测定以计算地获得DNA分子的序列，如公开于2010/5/13之美国专利公开号2010/0121582所述。
3.19实施例19
于此将λ噬菌体(lambda phag)的基因体进行测序。将经纯化、线性之基因体以每阿升0.1分子悬浮于适合之反应缓冲溶液中并提供至如美国专利申请号13/046,457中所述的一侦测系统。或者可将基因体纯化为环状或进行连接以形成一环状结构。在任一的例子中，使用热来将双股λ基因体进行变性以形成对测序而言有适合条件的单一模板股。
设计一测序引物以与经线性化之模板股的一末端互补，或在经环状化基因体的例子中，引物与于模板股上之任何已知序列互补。将引物以大约每阿升1分子的浓度进行悬浮并提供至侦测系统，随着校对持续聚合酶与四种类型的经荧光标记二核苷酸类似物，其中四种二核苷酸类似物包括一互补之碱基B1，其分别为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。此二核苷酸类似物还包括一荧光淬熄体连接至γ磷酸盐基团。于侦测装置中之复数个侦测位置中，形成校对聚合酶之三元复合物(ternary complex)、DNA分子与测序引物，且聚合酶将经荧光标记之核苷酸类似物添加至测序引物之3’端。
在复数个侦测位置的各个中，将于聚合酶之反应位置之经荧光标记之二核苷酸类似物并入增长的（引物）股，包括从二核苷酸类似物将荧光淬熄体切断。藉由来自与侦测装置耦接之一光源的激发光激发于二核苷酸类似物上之荧光标记，且发射出荧光。藉由侦测装置来侦测此荧光，其产生要被处理的输出讯号以鉴定由添加至测序引物之二核苷酸类似物所包含之碱基的身份。当聚合酶从增长之股切断包含荧光标记非互补核苷酸基团时，荧光讯号消失，而为了下次核苷酸类似物并入，使包括碱基B1之互补基团的3’-OH自由。
之后聚合酶添加其它二核苷酸类似物，其如上述被侦测。将此循环重复一有效数目的次数以获得上至基因体长度的一测序读取（约48kb）。之后将测序反应加热或以高盐处理以移除新近合成的股、将其清洗，且之后为了第二次测序读取重新添加测序混合物。或者，取代在每次读取获得一全部的序列，起始之读取可仅覆盖λ基因体的一子集(subset)。在清洗步骤之后，将不同之测序引物包含于测序反应中，以将λ基因体之一第二、部分重复的区域进行测序。重复这些步骤直到达成全部基因体的2×覆盖率。藉由接受或拒绝测序重复，且将来自被接受之重复之排比的一致序列进行测定以计算地获得DNA分子的序列，如公开于2010/5/13之美国专利公开号2010/0121582所述。
3.20实施例20
侦测系统的一个例子利用了一纳米球状可移动光耦合器，将此纳米球状可移动光耦合器以磁性官能基来于其表面之一部分上进行修饰以吸引目标序列。将纳米球状颗粒以卵白素(streptavidin)来于经磁性修饰的表面上进行化学修饰。生物素化寡核苷酸引物与经卵白素修饰之纳米球体结合，而生物素化寡核苷酸引物包括与测序引物（连接核酸引物）之序列互补的序列，因此将生物素化引物连接至纳米球体。之后将目标序列与生物素化引物杂合，且添加DNA聚合酶以形成一反应复合物。藉由使用设置于接合位置下方的微制造线圈(micro-fabricated coil)，将可移动光耦合器沈淀于一纳米孔洞中，以使纳米球体的底部将目标序列与引物局限于纳米孔洞的基部的一阿升体积内在一波导（接合位置）中。使电流穿过微制造线圈以产生磁场，其于接合位置捕获具有经吸附之反应复合物的纳米球体，伴随着具有经吸附之反应复合物的磁性修饰表面朝向波导的核层。因此，将反应复合物设置于接合位置于一狭窄的空间中，而狭窄的空间邻近波导之核层的表面。
于接合位置中执行叙述于上述实施例中之使用二核苷酸或三核苷酸类似物的DNA合成。在合成反应的各步骤中，四种经标记之dNTP的一个与反应复合物的反应位置结合，其中其与目标核酸的对应碱基碱基配对。藉由在接合位置之底部形成的渐逝光场(evanescent light field)及/或从纳米球体表面发射的渐逝光场来刺激荧光标记。藉由侦测dNTP连接之荧光团的发射来实时侦测一经荧光团标记核苷酸磷酸盐并入增长的股。各个经并入之核苷酸的身份藉由其荧光标记而被测定出，其中荧光标记从核苷酸类似物被切断，由于并入增长的股。藉由将在聚合反应期间将所侦测到之荧光发射讯号的顺序转换为一核酸序列以衍生出目标核酸的序列。
依照于说明书中所提之参考文献的教示，可完全了解说明书。于说明书中之实施例提供本发明之实施例的说明，且不应被解释来限制本发明之精神。熟悉此技艺人士轻易了解本发明包含许多其它实施例。所有于揭露中所提之出版品、专利申请与专利以其全文被引入以供参考。被引入以供参考之数据范围与本说明书抵触或不符时本说明书将取代任何此类资料。于此任何参考文献之引用并非承认此类参考文献为本发明的先前技术。
除非以其它方式指出，使用于说明书，包括申请专利范围中之成分、反应条件等的所有数字表现量，可被理解为在所有情况下藉由措辞“约”来修饰。因此，除非以其它方式指出反对，数字的参数为近似值，且可根据要被本发明获得所搜寻之所需特性而改变。在最小，且不为限制对于申请专利范围均等论的申请的企图，根据显著数字与一般圆形方法可建立各数字参数。在本发明说明书中，具有不同量之有效位数的一系列数字的列举，不被限制为意指所给予之伴随较少有效位数的数字具有与伴随较多有效位数的数字相同的确切性。
用语“一”的用途，当在申请专利范围及/或说明书中与措辞“包括”结合使用时可意指“一个(one)”，但也与“一或多个”、“至少一个”与“一或大于一个”一致。用语“或”于申请专利范围中的用途被用来意指“及/或”，除非明确地指出仅意指二择一，或两者互相排斥，但揭露支持仅意指二择一与“及/或”的定义。
除非以其它方式指出，在一系列要素之前的措辞“至少”可被了解为意指于系列中之每一要素。仅使用例行实验，熟悉此技艺人士会认定或可确认，一些对于此处所述本发明特定实施例的许多等同物。此类等同物包含于下列申请专利范围中。
除非以其它方式指出，于此使用之技术与科学用语具有与熟悉本发明所属技艺领域人士一般所了解的相同意义。任何方法或材料相似于或等同于于此叙述的那些，可被使用于本发明之实施与测试中。
于此讨论之出版物仅仅以早于本申请之申请日的揭露被提供。于此没有任何事物被建构为由于较早之发明本发明不被给予早于此类公开的权力。此外，所提供之公开日期可能与实际公开日期不同，其需要被独立地确认。
对于熟悉此技艺人士，从考虑本发明说明书与于此揭露之实施例的实施而言，其它实施例为明显的。其被意指为说明书与实施例仅被视为示例的，由于发明之真实范围与精神系由下列申请专利范围所指出。
Claims (40)
1.一种测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，包括步骤：
(a)提供一反应复合物，包括，一模板核酸，其包括一目标核酸序列、一引物核酸，其包括与该模板核酸之一区域互补的一序列，与一聚合酶酶或一酶复合物，其包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性；
(b)使该反应复合物与复数个核苷酸类似物接触，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，其为指出该碱基配对部分的身份；
(c)藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性，使该酶或酶复合物得以将一核苷酸类似物以一模板依赖方式并入一新生股，藉此将该标记部分结合至该新生股；
(d)侦测该经并入之核苷酸类似物的该光可侦测标记；
(e)藉由该酶或酶复合物之3’至5’外核酸酶活性，使该酶或酶复合物得以从该新生股移除该经并入之核苷酸类似物的该标记部分；以及
(f)重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸序列的序列。
2.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该光可侦测标记为一荧光团。
3.根据权利要求2所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该核苷酸类似物还包括至少一荧光淬熄部分，且其中在该核苷酸类似物藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性并入该新生股之时该荧光淬熄部分从该核苷酸类似物被移除。
4.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该至少一碱基配对部分，具有一5’端与一3’端，包括一或多个核苷酸残基其各包括一碱基，该碱基具有在该反应复合物之一反应位置中与该目标核酸序列之一对应碱基碱基配对的能力。
5.根据权利要求4所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该碱基配对部分之3’端为藉由一磷酸连接连结至该标记部分。
6.根据权利要求5所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该标记部分包括一光可侦测标记与一可选的连接物其连结该光可侦测标记至该磷酸连接。
7.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该标记部分还包括：
(a)一或多个非互补核苷酸残基；以及
(b)一可选的连接物连结该光可侦测标记至该一或多个非互补核苷酸残基。
8.根据权利要求7所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该一或多个非互补核苷酸残基为独立地择自一无碱基核苷酸残基与包括一碱基之一核苷酸残基，而该碱基实质上缺乏与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一个碱基配对的能力。
9.根据权利要求3所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该荧光淬熄部分为附着至一核苷酸类似物的5’端。
10.根据权利要求9所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该荧光淬熄部分为藉由一连接物附着至一核苷酸类似物的5’端。
11.根据权利要求9所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该核苷酸类似物为一核苷酸三磷酸盐类似物，其具有一α磷酸盐、一β磷酸盐与一γ磷酸盐，且其中该荧光淬熄部分为附着至在该核苷酸类似物之5’端之三磷酸盐基团的该β或γ磷酸盐。
12.根据权利要求4所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该至少一碱基配对部分包括至少三个磷酸盐基团于其5’端，其中最接近该碱基配对部分（α磷酸盐）的磷酸盐基团为一硫代磷酸盐。
13.根据权利要求4所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该至少一碱基配对部分包括至少三个磷酸盐基团于其5’端，其中最接近该碱基配对部分（α磷酸盐）的磷酸盐基团为一甲基磷酸盐。
14.根据权利要求4所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该至少一碱基配对部分包括至少三个磷酸盐基团于其5’端，其中最接近该碱基配对部分（α磷酸盐）的磷酸盐基团为一硼烷磷酸盐。
15.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，介于在该反应复合物之活性位置之该核苷酸类似物的结合与从该新生股之标记部分的移除之间的时间长度为从50至250毫秒。
16.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该方法被执行于，藉由介于两个连续之侦测步骤(d)之间的时间长度为从约0.2秒至1秒的条件下。
17.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该方法被执行于，藉由介于两个连续之侦测步骤(d)之间的时间长度为从0.2秒至0.6秒的条件下。
18.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该方法被执行于，藉由介于两个连续之侦测步骤(d)之间的时间长度为自0.3秒至0.5秒的条件下。
19.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中在步骤(f)中重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸的序列包括持续监测与记录在要被依序并入该引物股之核苷酸类似物之该标记部分中的各光可侦测标记的依序并入。
20.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中各核苷酸类似物包括：
(a)于该核苷酸类似物的5’端，一碱基配对部分包括一或多个核苷酸残基，其各包括一碱基，该碱基为具有在该反应复合物之一活性位置中与目标核酸序列之一对应碱基碱基配对的能力，以及
(b)于该核苷酸类似物的3’端，一标记部分视需要而定包括一或多个非互补核苷酸残基，其之各个实质上缺乏与该目标核酸序列之一对应的碱基碱基配对的能力。
21.一种化合物，其具有式(I)：
或一其药学上可接受之盐类或水合物，其中
n为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
R1与各个R2为择自O-与其中
(i)R1与各个R2为O-；或
(ii)R1为
且各个R2为O-；或
(iii)R1为O-，一个R2为
且任何剩余之R2独立地为O-、S-、BH3 -或CH3；
R3为一核苷酸部分，其包括一荧光染料F；
R4为H、OH、卤素（包括氟、氯、溴与碘）、烷基（包括CH3、CH2CH3）或烷氧基（经取代与未经取代两者）（包括OCH3与OCH2CH3）；
Y1与Y3为各自独立地择自O-、S-、BH3 -与CH3；
L1为择自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基与磺酰基；
Q为一荧光淬熄部分；以及
B1为择自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤与5-甲基胞嘧啶。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中R3为择自与
B2为择自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤与5-甲基胞嘧啶；
X1为择自亚甲基；L2；一碱基其不与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶与尿嘧啶之任一个碱基配对；以及群组，其包括L2与不与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶与尿嘧啶之任一个碱基配对一碱基；
其中L2为择自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基与磺酰基；
X2为择自H、CH3与一碱基其不与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶与尿嘧啶之任一个碱基配对；
各R4独立地为H、OH氟或OCH3；以及
Y2为择自O-、S-、BH3 -与CH3。
23.根据权利要求21所述的化合物，其中R3为择自
与
B2为择自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤与5-甲基胞嘧啶；
X1为择自亚甲基；L2；一碱基其不与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶与尿嘧啶之任一个碱基配对；以及群组，其包括L2与一碱基其不与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶与尿嘧啶之任一个碱基配对；
其中L2为择自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酯、胺基与磺酰基；
X2为择自H、CH3与一碱基其不与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶与尿嘧啶之任一个碱基配对；
Y2为择自O-、S-、BH3 -与CH3。
24.根据权利要求22所述的化合物，其中n为1，R1为
且R2为O-。
25.根据权利要求22所述的化合物，其中Y1为S-。
26.根据权利要求22所述的化合物，其中R3为
27.根据权利要求22所述的化合物，其中R3为
28.根据权利要求22所述的化合物，其中Y3为O-。
29.一种测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，包括步骤：
(a)提供一反应复合物，包括，一模板核酸，其包括一目标核酸序列、一引物核酸，其包括与该模板核酸之一区域互补的一序列，与一聚合酶酶或一酶复合物，其包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性；
(b)使该反应复合物与根据权利要求21所述的化合物接触；
(c)藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性，使得使该酶或酶复合物得以将根据权利要求21所述的化合物并入一新生股，藉此将基团F结合至该新生股；
(d)侦测该基团F，其为指出碱基B1与视需要而定存在之碱基B2的身份与顺序；
(e)藉由该酶或酶复合物之3’至5’外核酸酶活性，使该酶或酶复合物得以移除位于经并入之核苷酸残基之3’位置的该F基团，该经并入之核苷酸残基具有碱基B1与视需要而定存在之碱基B2；以及
(f)重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸序列的序列。
30.根据权利要求1所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该复数个核苷酸类似物包括至少四种类型的核苷酸类似物，各种类型包括一独特之碱基配对部分与一独特之荧光团，该荧光团为可与其它类型之该复数个之核苷酸类似物的荧光团区别。
31.根据权利要求30所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该复数个核苷酸类似物还包括一核苷酸类似物，其具有一荧光淬熄部分，该荧光淬熄部分在该核苷酸类似物并入该新生股之时从该核苷酸类似物被移除。
32.一种测定在一核酸聚合反应中藉由一聚合酶酶或酶复合物所并入之一核苷酸碱基的方法，该方法包括步骤：
(a)执行一核酸聚合反应，其利用一聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性两者，且以一模板依赖方式导致一新生股的产生，其中执行该反应于下列存在时：
(i)一模板核酸，包括一目标核酸序列，
(ii)一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的一序列；
(iii)一聚合酶酶或一酶复合物，包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性；
(iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记；以及
(b)侦测该光可侦测标记，其中该标记为指出该碱基或存在于藉由该酶或酶复合物并入该新生股之该核苷酸类似物中之碱基的身份。
33.根据权利要求32所述的测定在一核酸聚合反应中藉由一聚合酶酶或酶复合物所并入之一核苷酸碱基的方法，其中于各个依序的核苷酸并入事件中执行该侦测步骤，该核苷酸并入事件系在藉由该酶或酶复合物之3’至5’外核酸酶活性来移除于先前并入事件中所并入之该核苷酸类似物的光可侦测标记之后。
34.一种测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，该方法包括步骤：
(a)执行一核酸聚合反应于下列存在时：
(i)一模板核酸，包括一目标核酸序列，
(ii)一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的一序列；
(iii)一聚合酶酶或一酶复合物，包括用于以一模板依赖方式并入一核苷酸类似物的一反应位置；
(iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，且其中一旦该类似物藉由该聚合酶酶或酶复合物以一模板依赖方式被并入该新生股，该类似物不终止一新生股之产生，且其中相较于包括藉由该聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性被移除的一标记的一核苷酸类似物，该核苷酸类似物提供至少一个经延长之侦测期间与经延长之中介脉冲持续期间；以及
(b)侦测在各个依序并入事件中所并入之该标记部分。
35.根据权利要求34所述的测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，其中相对于包括藉由该聚合酶酶或酶复合物的5’至3’聚合活性来移除之一标记的一类似物的侦测期间，该侦测期间以至少10倍被延长。
36.根据权利要求34所述的测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，其中两个连续之侦测步骤被以约0.2至约1秒分隔。
37.根据权利要求34所述的测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，其中该核苷酸类似物还包括至少一荧光淬熄部分，且其中该荧光淬熄部分在该核苷酸类似物藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性并入该新生股之时从该核苷酸类似物被移除。
38.根据权利要求34所述的测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，其中藉由该酶或酶复合物经由其5’至3’聚合活性来移除该标记部分。
39.根据权利要求1、32或34项之任一项所述的方法，其中该目标核酸序列包括序列重复。
40.根据权利要求1、32或34项之任一项所述的方法，其中该目标核酸序列包括一或多个序列重复，其择自(A)n、(T)n、(C)n或(G)n，其中n为3或更大之整数。
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