CN109313925A - 脉冲命名器及基质命名器 - Google Patents

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Abstract

在核酸的定序期间基于自传感器获取的数据而识别核苷酸的系统及方法。该方法可以包括获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性。对于每个核苷酸并入事件，所述特性可以包括该光的时间特性及该光的强度特性。该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度。该方法可进一步包括将表示所述核苷酸并入事件的所述特性的点分组成点的组。各个点可表示对应核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性。该方法可进一步包括将所述点的组分配至各个核苷酸。

Description

脉冲命名器及基质命名器
相关申请案
本申请案主张2016年6月1日申请的标题为“脉冲命名器及基质命名器”的美国临时专利申请62/343,997的优先权，该案的全部内容以引用的方式并入。
背景技术
核酸(例如，脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA))的定序包括识别一靶核酸中的个别核苷酸。一些核酸定序方法包括在个别核苷酸并入至与靶核酸互补的核酸链中时识别这些个别核苷酸。接着，在定序过程期间识别的互补链的一系列核苷酸可允许识别用于靶核酸链的核苷酸序列。
发明内容
一些实施例关于一种方法，包括：接收关于第一发光标签响应于该第一发光标签的激发而发光的时间的第一时间分格信息；基于该第一时间分格信息计算第一光强度信息；接收关于第二发光标签响应于该第二发光标签的激发而发光的时间的第二时间分格信息；基于该第二时间分格信息计算第二光强度信息；及使用该第一光强度信息及该第二光强度信息来计算发生核苷酸并入事件的时间。
使用脉冲识别算法来执行该计算发生核苷酸并入事件的时间。该脉冲识别算法包括变化点算法、运行平均值/中值及方差算法或状态机算法。计算该第一光强度信息包括求和该第一时间分格信息，计算该第二光强度信息包括求和该第二时间分格信息。
一些实施例关于一种方法，包括：接收关于第一发光标签响应于该第一发光标签的激发而发射第一光的时间的第一时间分格信息；基于该第一时间分格信息计算该第一光的第一时间特性。该时间特性表示在激发之后该第一发光标签的光子发射概率的衰减速度。该方法还包括接收关于第二发光标签响应于该第二发光标签的激发而发射第二光的时间的第二时间分格信息；基于该第二时间分格信息计算该第二光的第二时间特性。该第二时间特性表示在激发之后该第二发光标签的光子发射概率的衰减速度。该方法还包括使用该第一时间特性及该第二时间特性来计算发生核苷酸并入事件的时间。
使用脉冲识别算法来执行该计算发生核苷酸并入事件的时间。该脉冲识别算法包括变化点算法、运行平均值/中值及方差算法或状态机算法。
一些实施例关于一种方法，包括：确定表示在激发之后通过一个或多个发光标签的光子发射概率的衰减速度的一个或多个时间特性；及使用该至少一个时间特性来计算发生核苷酸并入事件的时间。
还使用由该一个或多个发光标签发射的光的强度来执行该计算发生核苷酸并入事件的时间。
一些实施例关于一种方法，包括：接收时间分格信息，该时间分格信息是关于发光标签响应于该发光标签的激发而发光的时间；基于该时间分格信息计算光强度信息；及使用该光强度信息来计算发生至少一个核苷酸并入事件的时间。
还使用该光的时间特性来执行发生至少一个核苷酸并入事件的该时间。
一些实施例关于一种识别核苷酸所述的方法，包括：获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性。对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及ⅱ)该光的强度特性。所述方法还包括将表示所述核苷酸并入事件的特性的点分组成点的组，各个点表示对应的核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性；及将所述点的组分配至各个核苷酸。
该时间特性包括在不同时间分格中探测的光子的照度寿命或比率。通过聚类算法实行所述点的分组。该聚类算法实行其中k大于或等于四的k平均值聚类。基于所述发光标签的预定发光特性将点的各个组分配至各个核苷酸。
一些实施例关于一种校准定序仪器的方法，包括：获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性。对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及ⅱ)该光的强度特性。该方法还包括将表示所述核苷酸并入事件的所述特性的点分组成点的组，各个点表示对应的核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性；将所述点的组分配至各个核苷酸；确定区分所述群组的一个或多个标准；及存储所述一个或多个标准。
所述一个或多个标准包括所述点的组之间的一个或多个边界。所述一个或多个标准包括所述点的组的质心。所述一个或多个标准存储在非挥发性存储器中。将所述点分组包括对所述点运行聚类算法。
一些实施例关于一种识别核苷酸的方法，该方法包括获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性。对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及ⅱ)该光的强度特性。所述方法还包括对于用于区分所述发光标签的该光的特性的定序仪器，通过鉴于所存储的标准估计所述时间特性和所述强度特性而将所述核苷酸并入事件分配至核苷酸。
该所存储的标准包括用于不同核苷酸的所述发光标签的特性之间的一个或多个边界。所述分配核苷酸并入事件包括比较表示该时间特性及该强度特性的点与所述一个或多个边界。一个或多个所述的所存储的标准包括点的组的质心，每个组对应于各自的核苷酸。所述分配核苷酸并入事件包括：确定表示并入事件的该时间特性及该强度特性的点与所述质心之间的距离；及将所述核苷酸并入事件分配至具有最接近该点的质心的核苷酸。所述所存储的标准是存储在非挥发性存储器中的校准标准。
一些实施例关于一种识别核苷酸的方法，包括：获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性。对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：ⅰ)该光的一时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及ⅱ)该光的第二特性。所述方法还包括将表示所述核苷酸并入事件的所述特性的点分组成点的组，个别点表示对应核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性；及将所述点的组分配至个别核苷酸。
一些实施例关于一种校准定序仪器的方法，包括：获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件。所述特性包括：ⅰ)该光的一时间特性，该时间特性表示在激发之后通过一发光标签的一光子发射概率的一衰减速度；及ⅱ)该光的一第二特性。所述方法还包括将表示所述核苷酸并入事件的所述特性的点分组成组，各个点表示对应核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性；将各个点的组分配至各个核苷酸；确定区分所述点的组的一个或多个标准；及存储所述一个或多个标准。
一些实施例关于一种识别核苷酸的方法，该方法包括：获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性。对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及ⅱ)该光的强度特性。所述方法还包括对于用于区分所述发光标签的该光的特性的定序仪器，通过鉴于所存储的标准估计所述时间特性和所述强度特性而将所述核苷酸并入事件分配至核苷酸。
一些实施例关于一种方法，包括：获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及ⅱ)该光的强度特性。所述方法还包括确定区分点的组的一个或多个标准，所述点表示所述核苷酸并入事件的特性，各个点表示对应的核苷酸并入事件的该时间特性及该强度特性。
所述方法还包括将所述组分配至各自的核苷酸以产生所述组的核苷酸分配。所述方法还包括基于所述一个或多个标准及所述组的所述核苷酸分配而将所述点分配至核苷酸。
一些实施例关于一种方法，包括：获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性。对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后通过一发光标签的一光子发射概率的一衰减速度；及ⅱ)该光的第二特性。所述方法包括确定区分点的组的一个或多个标准，所述点表示所述核苷酸并入事件的特性，各个点表示对应的核苷酸并入事件的该时间特性及该强度特性。
一些实施例关于一种非暂态计算机可读存储介质，其具有存储于其上的指令，所述指令在被处理器执行时，执行任何前述的方法。
一些实施例关于一种装置，包括：处理器，其配置为执行任何前述的方法。
一些实施例关于一种定序仪器，包括：光探测器，其配置为以在定序反应期间自发光标签接收光；及处理器，其配置为以实行任何前述的方法。
附图说明
将参考下图描述本申请的各种方案及实施例。应该理解的是，图不一定按比例绘制。出现在多个图中的项目在其出现的全部图中由相同的附图标记指示。
图1A是根据一些实施例的通过脉冲命名器实施的算法的流程图。
图1B是根据一些实施例的光子发射概率与光子数目分布的图示，所述光子发射概率为在激发之后随时间经过的光子发射概率，所光子数目为与由光探测器探测的时间分格中的光子数目分布。
图1C是根据一些实施例的方法的流程图，该方法用于使用发射光的(多个)时间参数判定核苷酸并入事件。
图1D是根据一些实施例的方法的流程图，该方法用于使用发射光的(多个)强度及时间特性判定核苷酸并入事件。
图2是根据一些实施例的在核苷酸的定序期间，随时间经过由光探测器探测的光的强度的图示。
图2-1A是根据一些实施例的装置的展示框图，所述装置可用于生物及化学试样的快速、可移动的分析。
图2-1B是根据一些实施例的集成装置及仪器的框图。
图3是根据一些实施例的通过基质命名器实施的算法的流程图。
图3-1A是根据一些实施例的集成器件的示意图。
图3-1B是根据一些实施例的耦合至一行像素中的样品槽(well)的激发能量和来自每个样品槽的发射能量引导至传感器的示意图。
图4是根据一些实施例的强度对时间分格的比率的图示，所述比率作为核苷酸并入事件的时间参数，该时间参数示出用于不同核苷酸的点的群。
图5是示出根据一些实施例的在图4中示出的群的边界及质心位置的图示。
图6是根据一些实施例的算法的流程图，该算法通过基质命名器实施以基于一个或多个校准标准识别核苷酸。
图7是根据一些实施例的强度对时间参数的图示，说明对于不同核苷酸，与核苷酸并入事件的对应的点到质心位置的距离。
图8是说明性的计算机装置的框图，该计算机装置用于实施本文中描述的技术的一些实施例。
具体实施方式
本文中描述的技术涉及诸如DNA及RNA的核酸的定序，尤其是关于用于基于从传感器获取的数据识别核苷酸的技术。核酸定序允许判定靶核酸中的核苷酸的顺序及位置。一些核酸定序方法是基于通过合成的定序，其中在核苷酸并入至与靶核酸互补的最新合成核酸链中时确定定核苷酸的身份。在定序期间，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可耦合(例如，附接)至靶核酸分子的启始位置且经由聚合酶的作用将核苷酸添加或并入至引物，其通常可称为引物延伸反应。
各核苷酸可与发光分子(例如，荧光团)结合，发光分子响应于激发而发光且其用于标记各类型的核苷酸以辨别不同类型的核苷酸。例如，可以使用一组四个标签来标记DNA中存在的核碱基使得该组的各标记与不同核碱基相关联，例如，第一标签与腺嘌呤(A)相关联，第二标签与胞嘧啶(C)相关联，第三标签与鸟嘌呤(G)相关联，第四标签与胸腺嘧啶(T)相关联。标签可通过经由连接分子将该标签直接或间接接合至核苷酸而耦合至核苷酸。
随着发生引物延伸反应，在将核苷酸并入至合成互补核酸中的过程中通过聚合酶保留核苷酸及其各自的发光标签。在核苷酸并入至合成核酸中的期间发光标签可以被光脉冲激发并且发射标签的光特性。在一些实施例中，标签通过连接分子直接或间接地附接至核苷酸的末端磷酸盐使得标签在并入核苷酸的过程中经由聚合酶的作用而自核苷酸分离或释放(例如，磷酸盐键的断裂)。感测并分析由发光标签响应于激发而发射的光可允许识别并入的核苷酸。随着引物延伸反应发生，针对添加至合成核酸的各后续核苷酸实行激发、感测及分析。可以从合成核酸的互补序列确定靶核酸的序列。
由发光标签发射的光可具有很多特性，用于区分标签与其他标签，由此识别核苷酸。这些特性包括强度(例如，发光的概率)、时间特性(例如，在激发之后光子发射概率的衰减速率、并入的脉冲持续时间和/或在并入之前和/或之后的中间脉冲的持续时间)、光谱特性(例如，发射光的波长)或其任何组合。可通过可探测这些特性的一个或多个的光探测器探测由发光标签发射的光。在标题为“INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OFRECEIVED PHOTONS”的美国专利申请14/821,656中描述适合的光探测器的示例，该案的全部内容以引用的方式并入。如其中描述，光探测器可具有探测光子的到达时间的能力，其可允许确定由标签发射的光的时间特性。探测发射光的时间特性可允许区分发射具有不同时间特性的光的标签。时间特性的一个示例是照度寿命。发光分子(诸如荧光团等)可响应于激发而发射光子。在激发发生之后，发光分子发射光子的概率随时间减小。概率衰减的速率可为指数的。“寿命”是概率随时间经过衰减的速度的特性。快速衰减被称为具有短寿命，而缓慢衰减被称为具有长寿命。探测由发光分子发射的光的时间特性可以允许区分具有不同寿命的发光分子。用具有不同寿命的发光分子标记不同核苷酸可允许基于所探测光的时间特性区分核苷酸。
美国专利申请14/821,656中描述的光探测器可以用纳秒或皮秒分辨率探测光子的到达时间，且可时间分格化入射光子的到达。由于光子的发射是概率性的，因此标签可以被多次激发且任何所产生的光子发射可为时间分格化的。多次实行这样的测量允许构成在激发事件之后光子到达的时间的直方图。可以分析此信息以计算发射光的时间特性，这可以允许基于时间特性区分标签与另一标签。
本文中描述的技术可分析来自光探测器的数据流以基于所探测光的特性对核酸定序。这些技术可以由“脉冲命名器”及“基质命名器”实施，其可以为定序仪器或另一器件的软件和/或硬件模块。通常，脉冲命名器分析数据串流以识别来自标签的发光脉冲出现的时间周期，从而表示染料共轭核苷酸通过聚合酶并入至寡核苷酸链中。“基质命名器”分析在由脉冲命名器所识别的时间周期期间探测的光的特性以判定或“命名”核苷酸的身份。
图1A示出可以由脉冲命名器实施的算法的流程图。在步骤S1中，计算所接收光的强度比上时间。如以上所述，光探测器可以将响应于将标签曝露于激发源(例如，通过激光脉冲)而来自于该标签的入射光子的到达时间分格化。可以重复激发标签，并且可以时间分格化来自该标签的入射光子的到达。作为一示例，在10ms测量周期期间，可以按100MHz的频率发射激光激发脉冲以激发标签。标签可以低概率地发射光子(例如，10,000次激发1次光子发射)。若标签在10ms周期内激发很多次(例如，一百万次)，则可接收近似100个光子。在一些例子中，标签可以在曝露于激发源之后不激发且在激发事件之后不发射光子，这会贡献低发射概率。如上文所述，入射光子关于激发的到达时间可为时间分格化的。光探测器可提供表示各时间分格中的光子数目的信号。
图1B示出光探测器将入射光子的到达时间分格化为八个时间分格的示例。由于如上所述光子发射概率随时间经过而衰减，因此与稍后的时间分格相比，初期的时间分格具有更多光子。通过重复地激发标签且探测发射光子的时序，可以构成接近计算光子发射概率随时间经过衰减的直方图，如图1B中所示。
可以由脉冲命名器通过求和表示各时间分格中所接收的光子数目的值而计算在测量周期(例如，10ms)内接收的光的强度。例如，若光探测器将入射光子的到达分格化为八个时间分格，如图1B中所示，则八个时间分格中接收的光子的数目被求和以判定强度。然而，可以使用任何数目的时间分格。若光探测器具有两个时间分格，则表示两个时间分格中所接收的光子的数目的值被求和以判定强度。例如，若第一时间分格具有100个光子且第二时间分格具有50个光子，则这些值可以被求和以判定150个光子的强度。可替代地，出于测量总光子强度的目的，可存在单独的时间分格。
可针对来自光探测器的数据流中的后续测量周期执行所接收光的强度的确定。例如，若光探测器以10ms周期执行测量，则对于每个测量周期，可通过求和各10ms周期中的时间分格而判定强度。因此，可判定表示随时间经过接收的光的强度的数据。
图2示出数分钟的示例性迹线，该迹线表示接收的光的强度比上时间。由于迹线中存在明显基线及方差且真实脉冲往往具有低信噪比，因此识别对应于并入事件的脉冲具有挑战性。在步骤S2中，对强度比上时间数据运行脉冲发现算法以识别对应于并入事件发射猝发光的时间。
对于脉冲发现算法，一个适合方法是对迹线数据运行变化点算法以判定何时发生信号的平均值及方差的偏移，例如，何时自背景(即，中间脉冲)变为信号(即，脉冲)且反之亦然。在识别各变化点之后，阈值在变化点级别(例如，强度)的基础上将中间脉冲区域(脉冲之间的区域)与脉冲区域分离。可以使用直方图、核密度估计或k平均值集合手动地判定此阈值。
另一适合方法是分析迹线的平均值/中值及方差，接着将脉冲定义为特定数目的标准偏差或更高于平均值/中值。
其另一适合方法是使用状态机器，其处于脉冲或中间脉冲状态且被判断以在该两者之间交替变化。阈值定义两个状态之间的转变。
在一些实施例中，可发生命名脉冲的额外过滤，诸如移除未达到最小或最大持续时间阈值(因为极短脉冲及极长脉冲往往误报)的脉冲。
后两个方法具有如下的额外益处：它们可在数据被获取时运行，而变化点算法可能需要全部数据以便运行。
上文中描述用于基于发射光的强度识别对应于核苷酸并入事件的脉冲的技术。然而，除强度以外或作为强度的替代品，可以使用发射光的其他特性来识别脉冲。在一些实施例中，作为强度的替代品或除使用强度以外，可以基于发射光的时间特性识别脉冲。可用发射具有不同时间特性的光的分子标记不同核苷酸，且可分析时间特性以确定并入事件何时开始及结束。作为一示例，不同发光标签可具有不同“寿命”或响应于激发的光子发射概率随时间经过衰减的速率。测量的寿命的变化可以指示并入事件的开始或结束。
图1C示出使用(多个)时间特性来确定对应于并入事件的脉冲何时出现的方法的流程图。在步骤S3中，确定在并入事件过程中发射的光的(多个)时间特性。例如，如下所述，可基于时间分格信息(即，来自或基于一个或多个时间分格的信息)确定时间特性。在一些实施例中，(多个)时间特性可以由基质命名器确定且提供至脉冲命名器。在步骤S4中，可对表示随时间经过的时间参数的数据运行脉冲发现算法。脉冲发现算法可与上文中关于强度的讨论类似地运行。
在一些实施例中，可以使用强度和(多个)时间特性一起来识别发生并入事件的时间。作为一示例，可以使用时间特性的变化以使基于强度的脉冲识别精细化。图1D示出此方法的流程图。在步骤S1中，可针对各并入事件获得光的强度。如上所述，可通过求和各时间分格集合中的时间分格而计算强度。然而，强度不是必须通过求和时间分格而获得，可以通过不同方式测量和/或确定。在步骤S2中，对强度比上时间数据运行脉冲发现算法以识别对应于并入事件发射淬发光的时间。在步骤S3中，确定在并入事件期间发射的光的(多个)时间参数。在步骤S5中，可基于(多个)时间参数估计且可能精细化步骤S2中识别的脉冲。例如，如果识别长脉冲(例如，具有大于阈值量的长度)，则可估计在脉冲期间发射的光的(多个)时间参数。若时间参数在脉冲期间显著偏移(例如，改变达一个以上阈值量，或可指示不同核苷酸的数量)，则初始脉冲命名可经修正以识别两个分开脉冲而非一个长脉冲。发生时间参数的偏移的时间可对应于两个脉冲之间的时间边界。若时间参数在脉冲期间未显著偏移(例如，未改变或改变一相对较小数量)，则初始脉冲命名可保持未改变。相应地，可以使用(多个)时间参数来估计和/或精细化基于强度的初始脉冲命名的结果。
在一些实施例中，可以使用(多个)时间参数来实行初始脉冲命名，且可以使用强度信息来精细化脉冲。
作为运行脉冲发现算法的结果，脉冲命名器识别对应于并入事件发生的脉冲的时间。对于各脉冲，脉冲命名器可识别开始时间及停止时间，开始时间及持续时间，或停止时间及持续时间。可分析出现这些脉冲的时间以识别发光标签，由此识别其关联的核苷酸。
在来自光探测器的数据流上命名脉冲命名器之后，可命名基质命名器以分析各并入事件的光的一个或多个特性。脉冲命名器可将出现脉冲的时间传递至基质命名器。可选择地，脉冲命名器可将额外信息传递至基质命名器，诸如关于在各时间分格中接收的光子数目的信息、针对各测量周期的所计算的强度或任何其他适合信息。
图3示出可以由基质命名器实施以识别核苷酸和/或可用于校准定序仪器的算法的流程图。
在步骤S11中，可对于各并入事件获得强度。如上所述，可通过求和各时间分格集合中的时间分格而计算强度。替代地，基质命名器可从脉冲命名器接收强度。
可以对于由脉冲命名器识别的并入事件的持续时间使强度标准化。例如，若并入事件持续测量间隔的两倍，则可通过求和两个测量间隔的时间分格并除以2而计算强度。例如，若并入事件持续20ms，测量周期是10ms，且将光子分组成两个时间分格，则可通过求和在第一测量的两个时间分格中收集的光子以及在第二测量的两个时间分格中收集的光子，接着除以二而计算强度。此计算也可以被认为是在20ms并入事件内的平均强度的计算。
在步骤S12中，可以对于各并入事件确定时间参数。时间参数可表示在激发之后随时间经过由标签发射的光子发射概率的衰减。可以使用任何适合时间参数。在一些实施例中，可通过将指数拟合至时间分格而计算照度寿命(例如，参见图1B)，且可以使用该照度寿命作为时间参数。在一些实施例中，可比较不同时间分格的光子计数(或表示其的值)以确定表示光子发射概率随时间经过的衰减的时间参数。例如，若将入射光子的到达分格化为两个时间分格，则可计算两个分格的光子计数的比率，且以可以使用该比率作为时间参数。在一些实施例中，分格的比率可以为用于计算照度寿命的代理。可以用任何适合方式计算比率。在一些实施例中，如果使用两个时间分格，则在时间上最接近激发事件的时间分格的光子计数可被第二时间分格的光子计数除，以产生比率。在一些实施例中，时间分格的光子计数或表示其的值可以被标准化(例如，通过时间分格集合内的求和强度)，且可以使用标准化值来确定时间参数。在一些实施例中，可以使用具有最大光子计数的时间分格作为时间参数。为确定具有最大光子计数的时间分格，时间分格的光子计数可以互相比较。作为具有两个时间分格的一个示例，第一时间分格的光子计数可与一第二时间分格的光子计数比较。具有较高光子计数的分格可以被选择作为时间参数，且可用于区分发光分子。例如，一个发光分子可具有相对较短寿命，其可产生具有最大光子计数的第一时间分格(在时间上最接近激发事件)，且另一发光分子可具有相对较长寿命，其可产生具有最大光子计数的另一时间分格(在时间上更远离激发事件)。
尽管图3示出在步骤S12之前执行步骤S11，然而这仅是说明，可以在步骤S11之前执行步骤S12，或可以同时执行步骤S11及S12。
图4示出各并入事件的强度及时间参数可绘制为二维空间中的一点，其中强度及时间参数在各自轴上。在此实例中，将时间参数绘制在水平(x)轴上且将强度绘制在垂直(y)轴上。四个不同标签可以用于基于强度、时间参数或基于强度和时间参数而与彼此区分的核苷酸。如图4中所示，绘制各并入事件的测量强度及时间参数产生对应于四个核苷酸A、C、G及T的四个点群集。
在步骤S13中，可将点分配至组(在本文中亦称为“群”)。在一些实施例中，可对点运行聚类算法以将各并入事件的点分配至四个群的一个。例如，聚类算法可在n维空间中实行脉冲的k平均值聚类，其中k是4(A、C、G、T)，且n是用于基质命名的度量的数目。然而，在一些实施例中，可分配四个以上群集。若分配四个以上的群，则可实行其中k大于4的聚类。发明人已经辨识且了解，在一些情况下，群集可以不被充分解析，且将点分组成四个以上群可以示有利的。在此情况中，可将一个以上群分配至相同核苷酸。在一些实施例中，可实行过滤以消除是离群值的点。例如，若一个点具有在预期范围外部的时间参数和/或强度，则其可自聚类算法排除和/或可不分配至任何核苷酸群组。
任何适合数目的点可提供至聚类算法，诸如大于50、大于100、大于500等。聚类算法的结果是将各点分组至四个(或四个以上)群集的一者中。在图4的实例中，n＝2，此是因为使用两个度量：强度及时间参数。在图4中绘制具有强度及时间分格比率作为时间参数的二维示例。然而，可以使用其他度量。
另一二维示例涉及时间参数及光谱参数都获得，其中在图4的垂直(y)轴上是光谱参数而非强度。在此实示中，获得关于对于各并入事件发射的光的光谱信息，并且用于区分核苷酸。
然而，可以使用任何数目的度量，而不限于两个。例如，在一些实施例中，除强度及时间参数以外，可获得的并入事件的光谱信息，其可绘制为三维空间中的点，其中强度、时间参数及光谱信息在各轴上。
可能地，用比初始分组步骤中使用的更多的度量将点分组之后，进一步精致化群组是有益的。出于此目的，可以使用支持向量机(SVM)或其他监督分类器。可以使用聚类标签作为初始训练数据。可重复此程序，使用来自分类器的最新迭代的结果作为下一迭代的训练，直至其收敛。
尽管可以使用聚类算法将点分配至群集，然而在一些实施例中，可在不使用聚类算法的情况下将点分配至群组。在一些实施例中，可在不运行聚类算法的情况下判定点群组之间的边界。
在步骤S14中，可将点群集分配至核苷酸。可基于标签的已知特性实行此分配。例如，在图4的图示中，可能已知用于T的标签具有高强度及最低寿命，用于A的标签具有低强度及中等寿命，用于G的标签具有高强度及中等寿命，且用于C的标签具有最高寿命及高强度。可以使用群集相对于彼此的位置将点群集分配至基质。例如，可将具有最低寿命的群集分配至T，可将具有最高寿命的群集分配至C，可将具有最低强度的群集分配至A，且可将剩余群集分配至G。各群集中的点可被分配它们其等群集的核苷酸。通过存储关于实行强度及时间特性的各测量的时间的信息，可对核苷酸链定序。
若使用方法来实行定序，则该方法可在此时终止。若该方法用于校准，则该方法可继续步骤S15。发明人已经辨识且了解，若实行初始校准，则不必运行聚类算法以将全部点分配至核苷酸。在一些实施例中，可判定校准标准用于将一点分配至核苷酸类型。作为一实例，在步骤S13中的聚类或步骤S14中的核苷酸的分配之后，可确定不同类型的核苷酸之间的边界。如图5中所说明的，边界可以为定义相位空间的区域的函数。相位空间的轴可以包括强度、时间参数、发射波长和/或激发激光脉冲的激发波长。作为一示例，二维空间中的线段或曲线可以被选择以描绘不同核苷酸之间的边界51，如图5中所示。在较高维空间中，边界可为表面或较高维对象(称为“超平面”)。一旦确定边界51，点便可以通过估计它们相对于边界的位置而分配至核苷酸，且无需执行聚类。相应地，在一些实施例中，定序仪器可经校准以描绘边界51。可以使用与核酸的定序期间相同的标签集合来实行校准程序。作为执行步骤S15中的校准的另一示例，可以确定群集的质心，其可允许基于哪一群集具有最接近一个单独点的质心而将点分配至核苷酸。不管确定的校准标准的类型，接着校准标准被存储(例如，在仪器的存储器中)以供随后使用。
可在任何适合时间实行校准。在一些实施例中，在首先使用仪器之前，在使用新标签集合后，在使用仪器的环境条件的变化后，或在考虑仪器的组件的老化的使用周期之后，可期望校准。可响应于来自使用者的请求而实行校准，诸如通过按压仪器上的按钮或自另一器件将校准命令发送至仪器，或自动基于安排或响应于确定效能次佳的仪器软件根据需要。一旦获得校准标准，便可以通过估计关于校准标准所探测的点而更快速地实行定序。
图6展示可以由基质命名器使用以基于一个或多个校准标准识别核苷酸的算法的流程图。可以在步骤S11及S12中确定光的参数(例如，强度及时间参数)，与图3中示出的相同，且可以任何顺序执行步骤S11及S12，如上所述。在步骤S33中，可通过使用所存储的校准信息估计光的测量参数(例如，强度及时间参数)而识别核苷酸。例如，若所存储的校准信息包括核苷酸群集之间的一个或多个边界，则可通过比较到边界的点而将点分配至核苷酸，与执行聚类相比，计算效率更高。作为另一示例，可通过计算一点至核苷酸群集的四个质心中每一个的距离而将点分配至核苷酸，接着将点分配至具有最接近的质心的核苷酸。在图7中说明此技术，图7示出表示测量的强度及时间参数的点61。也在图7中示出对应于四个核苷酸的标签的质心。为确定哪一质心最接近，可计算自点61至四个质心中每一个的距离，并且将具有距点61最短距离的质心的核苷酸分配至点61。如图所示，对于对应于核苷酸“A”的标签，点61最接近质心。相应地，点61经确定以对应于核苷酸“A”。
在一些实施例中，识别核苷酸包括对与并入事件相关联的点的第一部分实行聚类及使用校准标准来对点的第二部分实行基质命名。第一部分可以包括任何适合数目的点以在校准标准中提供所要级别的精确性。
在一些实施例中，可以确定一点对应于特定类型的核苷酸的可信度级别。作为一示例，可以使用一点距一区域的质心(诸如图5中展示的质心)的距离来判定点的可信度级别。具有至质心的小距离的点可以具有高可信度级别，表示该点很有可能正确地被识别为对应于核苷酸，而具有距质心的较大距离或与另一个相比几乎没有更接近一个质心的点不太可能被正确地识别。在此示例中，可基于点与质心之间的距离，或基于比较点与质心之间的距离和点与一个或多个其他质心之间的距离来量化可信度级别。作为另一示例，若校准标准包括群集之间的一个或多个边界，则可通过判定点与一个或多个边界之间的距离而量化可信度级别。较接近边界的点可被给予较低可信度级别。在一些实施例中，除存储核苷酸识别标识自身以外，也可存储各核苷酸标识的可信度级别。
在一些实施例中，可信度级别取决于校准标准及校准标准与校准数据的拟合程度。校准标准与校准数据越精确地拟合，不同点的可信度级别可能越高。
在一些实施例中，可信度级别可取决于与一点相关联的并入事件的持续时间，这是因为可信度级别可以取决于由脉冲命名器识别的脉冲的信噪比。作为一示例，一长持续时间可指示脉冲命名器未能识别两个后续并入事件，诸如相同核苷酸类型的并入事件。在一些实施例中，基质命名器可与脉冲命名器通信以请求脉冲命名器重新估计并入事件的持续时间。
在一些实施例中，之前导出的边界(例如，一SVM模型)可应用于新脉冲命名以确定在各脉冲命名事件处并入的适当核苷酸。首先定标脉冲命名度量，接着，可应用先前导出的边界分类该并入事件。
为导出跨越来自多个像素的脉冲命名数据而概括的边界，有必要在将这些数据包括在校准数据集之前，将来自于阵列中的每个像素的脉冲命名数据的每个集合定标。通过定标强度度量，通过仅对强度聚类，且使用这些群集的一个或多个作为强度的平均值或中值，可以使全部传入脉冲命名的强度度量标准化。在校准阶段期间以及在使用所存储的校准数据基质命名阶段期间应用此定标或标准化。这具有无需针对阵列中的各像素生成边界的益处，这是性能的改进，并且能够对其中全部数据通常无法立即拟合至RAM的非常大的阵列对标。进一步益处是运行时间的缩减，这是因为较小数目的脉冲将需要通过强度被分离且被定标或标准化至校准数据集。此方法也允许在建立定标或标准化因子之前存储并分组较少的脉冲，因此允许在自像素阵列获取数据时几乎实时地输出基质命名。
已经描述可以由一脉冲命名器及一基质命名器实施以执行一定序仪器的定序和/或校准的技术，现将描述一适合定序仪器的一实例。在一些实施例中，仪器配置为集成器件配合，该集成器件包括像素的阵列。集成器件的表面具有多个样本槽，其中样本槽配置为以从放置在集成器件的表面上的试样接收样本。试样可以包含多个样本，且在一些实施例中，含有不同类型的样本。多个样本槽可具有适合的大小及形状使得样本槽的至少一部分从一个试样接收一个样本。在一些实施例中，在这些样本槽之中，样本槽内的样本的数目可以是分散式的，使得一些样本槽含有一个样本而其他样本槽含有零个、两个或两个以上样本。
在一些实施例中，试样可含有多个单链DNA样板，且一集成器件的一表面上的个别样本槽可经定大小且塑形以接收一单链DNA样板。单链DNA样板可分布在集成器件的样本槽当中使得集成器件的样本槽的至少一部分含有单链DNA样板。试样亦也可以包括标记dNTP，标记dNTP接着进入样本槽并且可以允许在核苷酸并入至与样本槽中的单链DNA样板互补的DNA链中时识别该核苷酸。在这样的示例中，“样本”可以指目前通过聚合酶并入的单链DNA及标记dNTP。在一些实施例中，试样可以包含单链DNA样板且标记dNTP可在核苷酸并入至样本槽内的互补DNA链中时随后被引入至一样本槽。以此方式，可以由标记dNTP何时被引入至集成器件的样本槽来控制核苷酸的并入的时序。
从与集成器件的像素阵列分开定位的激发源提供激发能量。激发能量被集成器件的组件至少部分地引导朝向一个或多个像素以照亮样本槽内的照明区域。接着，标签可以在位于照明区域内并且响应于被激发能量照射时发出发射能量。在一些实施例中，一个或多个激发源是系统的仪器的部分，其中仪器及集成器件的组件配置为将激发能量引导至一个或多个像素。
接着，可通过集成器件的像素内的一个或多个传感器探测由样本发出的发射能量。所探测的发射能量的特性可提供用于识别与发射能量相关联的标记的指示。这些特性可以包括任何适合类型的特性，包括由传感器探测的光子的到达时间、由传感器随时间经过累积的一定数量的光子，和/或跨两个或两个以上传感器的光子的分布。在一些实施例中，传感器可以具有允许探测与样本的发射能量相关联的一个或多个时序特性(例如，荧光寿命)的配置。传感器可在激发能量的脉冲传播通过集成器件之后探测光子到达时间的分布，且到达时间的分布可以提供样本的发射能量的时序特性的指示(例如，荧光寿命的代理)。在一些实施例中，一个或多个传感器提供由标签发射的发射能量的概率的指示(例如，荧光强度)。在一些实施例中，多个传感器可以被调整尺寸并且被排列以撷取发射能量的空间分布。接着，可以使用来自一个或多个传感器的输出信号以在多个标签当中区分标签，其中可以使用多个标签来识别试样内的样本。
在图2-1A及图2-1B中示出系统2-100的概括示意图。系统包括与仪器2-104配合的集成器件2-102。在一些实施例中，仪器2-104可以包括集成为仪器2-104的部分的一个或多个激发源2-106。在一些实施例中，激发源可以在仪器2-104及集成器件2-102两者的外部，且仪器2-104可配置为从激发源接收激发能量且将其引导至集成器件。集成器件可以使用任何合适的插座与仪器配合，插座用于接受集成器件并且保持其与激发源精确光学对准。激发源2-106可以配置为提供激发能量至集成器件2-102。如图2-1B中示意性地示出，集成器件2-102具有多个像素，其中至少一部分像素2-112可以执行样本的独立分析。这些像素2-112可称为“无源像素”，这是因为像素自与像素分离的源2-106接收激发能量，其中源激发多个像素。像素2-112具有配置为接收样本的样本槽2-108及传感器2-110，传感器2-110用于探测样本响应于由激发源2-106提供的激发能量照射样本而发出的发射能量。样本槽2-108可以将样本保持在集成器件2-102的表面附近以便将激发能量递送至样本且探测来自样本的发射能量。
用于将激发能量导引且耦合至样本槽2-108的光学组件位于在集成器件2-102及仪器2-104两者上。这些源至槽组件可以包括位于在集成器件2-102上的一个或多个光栅耦合器以将激发能量耦合至集成器件及导波管，以将激发能量从仪器2-104递送至像素2-112中的样本槽。在一些实施例中，定位位于集成器件上的元件可用于将激发能量从样本槽引导至传感器。样本槽2-108、激发源至槽光学器件的一部分、以及样本槽至传感器光学器件位于集成器件2-102上。激发源2-106及源至槽组件的一部分位于仪器2-104中。在一些实施例中，单个组件可以在将激发能量耦合至样本槽2-108及将激发能量从样本槽2-108递送至传感器2-110中都起作用。在标题为“INTEGRATED DEVICE FOR PROBING,DETECTING ANDANALYZING MOLECULES”的美国专利申请14/821,688及标题为“INTEGRATED DEVICE WITHEXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING,DETECTING,AND ANALYZING MOLECULES”的美国专利申请案14/543,865中描述包括于集成器件中的适合组件的示例，该组件用于将激发能量耦合至样本槽和/或将激发能量引导至传感器，这两件专利申请的全部内容以引用的方式并入。
如图2-1B所示，集成器件包括多个像素，其中像素2-112与其个别的样本槽2-108及至少一个传感器2-110相关联。多个像素可配置成阵列，且阵列中可能存在任何适合数目的像素。集成器件2-102中的像素的数目可以在近似10,000个像素至1,000,000个像素的范围中或该范围内的任何值或任何范围。在一些实施例中，像素可配置成512个像素×512个像素的阵列。集成器件2-102及仪器2-104可以包括多信道高速通信链路，用于处置与大像素阵列(例如，10,000个以上像素)相关联的数据。
仪器2-104通过集成器件接口2-114而与集成器件2-102配合。集成器件接口2-114可以包括组件以将集成器件2-102定位和/或对准至仪器2-104，以提高来自激发源2-106的激发能量至集成器件2-102的耦合。激发源2-106可以是被排列以将激发能量递送至至少一个样本槽的任何适合光源。在标题为“INTEGRATED DEVICE FOR PROBING,DETECTING ANDANALYZING MOLECULES”的美国专利申请14/821688中描述适合的激发源的实例，该案的全部内容以引用的方式并入。在一些实施例中，激发源2-106包括经组合以将激发能量递送至集成器件2-102的多个激发源。该多个激发源可配置为产生多个激发能量或波长。集成器件接口2-114可以从位于集成器件上的像素中的传感器接收读出信号。集成器件接口2-114可被设计成通过将集成器件固定至集成器件接口2-114而使得集成器件附接至仪器。
仪器2-104包括用于控制仪器2-104的操作的用户接口2-116。用户接口2-116配置为允许用户将信息(诸如用于控制仪器的功能的命令和/或设定)输入至仪器中。在一些实施例中，用户接口2-116可以包括按钮、开关、拨盘及用于语音命令的麦克风。此外，用户接口2-116可允许用户接收关于仪器和/或集成器件的性能的反馈，诸如通过来自集成器件上的传感器的读出信号获得的正确对准和/或信息。在一些实施例中，用户接口2-116可以使用扬声器提供反馈以提供声音反馈，及指示灯和/或显示屏幕用于提供视觉反馈。在一些实施例中，仪器2-104包括用于与计算器件2-120连接的计算机接口2-118。可以使用任何适合计算机接口2-118及计算器件2-120。例如，计算机接口2-118可为USB接口或火线接口。计算器件2-120可为任何通用计算机，诸如膝上型或桌面计算机。计算机接口2-118促进仪器2-104与计算器件2-120之间的信息的通信。可以通过连接至仪器的计算机接口2-118的计算器件2-120提供用于控制和/或配置仪器2-104的输入信息。可以由计算器件2-120通过计算机接口2-118接收输出信息。此输出信息可以包括关于仪器2-104和/或集成器件2-112的性能的反馈及来自传感器2-110的读出信号的信息。仪器2-104也可以包括用于分析从传感器2-110接收的数据和/或将控制信号发送至激发源2-106的处理器件2-122。在一些实施例中，处理器件2-122可以包括通用处理器、特别调适处理器(例如，中央处理单元(CPU)，诸如一个或多个微处理器或微控制器核心、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)、定制集成电路、数字信号处理器(DSP)或其组合)。在一些实施例中，处理器件2-122及外部计算器件2-120都可以执行来自传感器2-110的数据的处理。在其他实施例中，可省略计算器件2-120且可以由处理器件2-122独自执行来自传感器2-110的数据的处理。
在图3-1A中示出说明一行像素的集成器件3-102的剖面示意图。各像素3-112包括样本槽3-108及传感器3-110。传感器3-110可以背对准且定位至样本槽3-108使得传感器3-110接收由样本槽3-108内的样本所发出的发射能量。在标题为“INTEGRATED DEVICE FORTEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS”的美国专利申请14/821,656中描述适合的传感器的实例，该案的全部内容以引用的方式并入。
耦合至集成器件的激发源可提供激发能量至集成器件3-102的一个或多个像素。图3-1B是说明激发源3-106耦合至集成器件3-102以将激发能量3-130(以虚线形式展示)提供至集成器件3-102的示意图。图3-1B说明激发能量自激发能量源3-106至像素3-112中的样本槽3-108的路径。可以使用位于集成器件外的组件将激发源3-106定位并对准至集成器件。这些组件可以包括光学组件，包括透镜、镜子、棱镜、光圈、衰减器和/或光纤。额外的机械组件可以包括于仪器中以允许控制一个或多个对准组件。这些机械组件可以包括致动器、步进马达和/或旋钮。
集成器件包括将激发能量3-130引导至集成器件中的像素的组件。在各像素3-112内，激发能量耦合至与像素相关联的样本槽3-108。尽管图3-1B说明耦合至一行像素中的各样本槽的激发能量，然而在一些实施例中，激发能量可以不耦合至一行中的全部像素。在一些实施例中，激发能量可以耦合至集成器件的一列像素中一部分像素的或样本槽。激发能量可以照射位于样本槽内的样本。样本可响应于由激发能量照射而达到激发态。当样本处于激发态时，样本可发出发射能量且可以通过传感器探测发射能量。图3-1B示意性地说明发射能量3-140(以实线示出)从样本槽3-108至像素3-112的传感器3-110的路径。像素3-112中的传感器3-110可以配置并且定位成探测来自样本槽3-108的发射能量。在一些实施例中，传感器3-110可以包括多个子传感器。
可将待分析的样本引入至像素3-112的样本槽3-108中。样本可为生物样本或任何其他适合样本，诸如化学样本。样本可以包括多个分子且样本槽可以配置成隔离单一分子。在一些例子中，样本槽的尺寸可用于将单个分子限制在该样本槽内，从而允许对单个分子执行测量。激发源3-106可以配置为将激发能量递送至样本槽3-108中，以便在样本处于样本槽3-108内的照明区域内时激发样本或至少一个发光标记，所述至少一个发光标记附接至样本或以其他方式与样本相关联。
当激发源将激发能量递送至样本槽时，槽内的至少一个样本可以发光，且可通过传感器探测所产生的发射。如本文中使用，词组“样本可以发光”或“样本可以发射辐射”或“来自样本的发射”是指发光标签、标记或报告、样本自身或与样本相关联的反应产物可产生发射辐射。
集成器件的一个或多个组件可将发射能量引导朝向传感器。发射能量或多个能量可以由传感器探测且转换成至少一个电气信号。可沿着通过集成器件接口(诸如图2-1B中展示的仪器2-104的集成器件接口2-114)连接至仪器的集成器件的电路中的导线传输电气信号。可随后处理和/或分析电气信号。可在位于仪器2-104上或脱离仪器的适合计算器件(诸如图2-1B中展示的计算器件2-120)上发生电气信号的处理或分析。
在操作中，通过使用激发源激发槽内的样本且使用传感器探测来自样本发射的信号而执行样本槽内的样本的平行分析。来自样本的发射能量可以由对应传感器探测且转换为至少一个电气信号。在一些实施例中，所得信号或多个信号可在集成器件上处理，或传输至仪器以由处理器件和/或计算器件处理。来自样本槽的信号可以被独立地从和其他像素相关联的信号接收和处理。
在一些实施例中，可用一个或多个标记标记样本，且与标记相关联的发射可以由仪器辨别。例如，传感器可配置为将来自发射能量的光子转换成电子以形成可用于辨别取决于来自特定标记的发射能量的寿命的电气信号。通过使用具有不同寿命的标记来标记样本，可基于由传感器探测的所得电气信号识别特定样本。
样本可含有多个类型的分子且不同发光标记可与分子类型唯一地关联。在激发期间或之后，发光标记可发出发射能量。可以使用发射能量的一个或多个性质来识别样本中的一个或多个类型的分子。用于区分分子类型的发射能量的性质可以包括荧光寿命值、强度和/或发射波长。传感器可探测光子(包括发射能量的光子)，且提供表示这些性质的一个或多个电气信号。在一些实施例中，来自传感器的电气信号可提供关于跨一个或多个时间间隔的光子到达时间的分布的信息。光子到达时间的分布可对应于在由激发源发射激发能量的脉冲之后何时探测光子。时间间隔的值可对应于在该时间间隔期间所探测的多个光子。跨多个时间间隔的相对值可提供发射能量的时间特性的指示(例如，寿命)。分析样本可以包括通过比较分布内的两个或两个以上不同时间间隔的值而区分标记。在一些实施例中，可通过确定跨分布中的全部时间分格的光子数目而提供强度的指示。
如本文中使用的术语“核酸”通常系指包括一个或多个核酸子单元的分子。核酸可以包括选自腺苷酸(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)或其变体的一个或多个子单元。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物。核酸可为单链或双链。核酸可以为环状。
如本文中使用的术语“核苷酸”通常是指核酸子单元，其可以包括A、C、G、T或U或其变体或类似物。核苷酸可以包括可并入至生长核酸链中的任何子单元。此子单元可为A、C、G、T或U，或具体为一个或多个互补A、C、G、T或U，或与嘌呤(即，A或G或其变体或类似物)或嘧啶(即，C、T或U或其变体或类似物)互补的任何其他子单元。
核苷酸通常包括核苷及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上磷酸盐(PO3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)及一个或多个磷酸盐基团。核糖核苷酸是其中糖系核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中糖系脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可以为核苷单磷酸盐或核苷多磷酸盐。核苷酸可以为脱氧核苷多磷酸盐，诸如(例如)脱氧核苷三磷酸盐，其可选自脱氧腺苷三磷酸盐(dATP)、脱氧胞苷三磷酸盐(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸盐(dGTP)、脱氧尿苷三磷酸盐(dUTP)及脱氧胸苷三磷酸盐(dTTP)dNTP，它们包括可探测标签(例如，荧光团)。
在一些实施例中，可以使用一个或多个计算器件来执行本文中描述的技术。实施例不限于使用任何特定类型的计算器件操作。
图8是示意性计算器件1000的框图。计算器件1000可以包括一个或多个处理器1001及一个或多个有形非暂态计算机可读存储介质(例如，存储器1003)。存储器1003可将在执行时实施任何上述功能性的计算机程序指令存储在有形非暂态计算机可记录介质中。(多个)处理器1001可耦合至存储器1003且可执行这些计算机程序指令以使得功能被实现和执行。
计算器件1000也可以包括网络输入/输出(I/O)接口1005，经由该接口计算器件可与其他计算器件通信(例如，经由网络)，且也可以包括一个或多个用户I/O接口1007，经由这些接口计算器件可提供输出至使用者且自使用者接收输入。用户I/O接口可以包括器件，诸如键盘、鼠标、麦克风、显示器件(例如，监测器或触控屏幕)、扬声器、相机和/或各种其他类型的I/O器件。
可以众多方式的任一个实施上述实施例。例如，可以使用硬件、软件或其组合来实施实施例。当在软件中实施时，可在设置于单独的计算器件中或分布于多个计算器件当中的任何适合处理器(例如，微处理器)或处理器集上执行软件代码。应了解，实行上文中描述的功能的任何组件或组件的集合可一般视为控制上文讨论的功能的一个或多个控制器。可以众多方式实施一个或多个控制器，诸如运用专用硬件，或运用使用微码或软件程序化以实行上文中叙述的功能的通用硬件(例如，一个或多个处理器)实施。
在此方面，应了解，本文中描述的实施例的一个实施方案包括用计算机程序(即，多个可执行指令)编码的至少一个计算机可读存储介质(例如，RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他内存技术、CD-ROM、数字通用磁盘(DVD)或其他光盘存储器、磁盒、磁带、磁盘存储器或其他磁性存储器件，或其他有形非暂态计算机可读存储介质)，计算机程序在一个或多个处理器上执行时实行一个或多个实施例的上文讨论的功能。计算机可读介质可为可携带使得存储在其上的程序可加载至任何计算器件上以实施本文中论述的技术的方案。另外，应了解，参考在执行时实行任何上文讨论的功能的计算机程序不限于在主机上运行的应用程序。实际上，本文中在一般意义上使用术语计算机程序及软件以参考可用于程序化一个或多个处理器以实施本文中论述的技术的方案的任何类型的计算机码(例如，应用软件、硬件、微码或任何其他形式的计算机指令)。
本发明的各种方案可单独、组合或以未在前述内容中描述的实施例中明确论述的各种配置使用且因此在其应用程序中不限于前述描述中陈述或图式中图解说明的组件的细节及配置。例如，一项实施例中描述的方案可以任何方式与其他实施例中描述的态样组合。
再者，本发明可体现为一种方法，已提供该方法的实例。可以任何适合方式对实行为该方法的部分的动作排序。相应地，可建构其中以不同于图解说明的顺序实行动作的实施例，其可以包括同时实行一些动作，即使在阐释性实施例中展示为循序动作。
在发明申请专利范围中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等的序数词以修改主张组件本身并非意指一个主张组件超过另一者的任何优先权、优先级或顺序或实行方法的动作的时间顺序，而仅用作标签以区分具有一特定名称的一个主张组件与具有相同名称(但用于序数词的使用)的另一组件以区分主张组件。
再者，本文中使用的措辞及术语用于描述的目的且不应视为限制。本文中使用“包括”、“包括”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变动是指涵盖其后列出项及其等效物以及额外项。

Claims (35)

1.一种方法，包括：
接收关于第一发光标签响应于该第一发光标签的激发而发光的时间的第一时间分格信息；
基于该第一时间分格信息计算第一光强度信息；
接收关于第二发光标签响应于该第二发光标签的激发而发光的时间的第二时间分格信息；
基于该第二时间分格信息计算第二光强度信息；及
使用该第一光强度信息及该第二光强度信息来计算发生核苷酸并入事件的时间。
2.如权利要求1所述的方法，其中使用脉冲识别算法来执行该计算发生核苷酸并入事件的时间。
3.如权利要求2所述的方法，其中该脉冲识别算法包括变化点算法、运行平均值/中值及方差算法或状态机算法。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中计算该第一光强度信息包括求和该第一时间分格信息，计算该第二光强度信息包括求和该第二时间分格信息。
5.一种方法，包括：
接收关于第一发光标签响应于该第一发光标签的激发而发射第一光的时间的第一时间分格信息；
基于该第一时间分格信息计算该第一光的第一时间特性，该时间特性表示在激发之后该第一发光标签的光子发射概率的衰减速度；
接收关于第二发光标签响应于该第二发光标签的激发而发射第二光的时间的第二时间分格信息；
基于该第二时间分格信息计算该第二光的第二时间特性，该第二时间特性表示在激发之后该第二发光标签的光子发射概率的衰减速度；及
使用该第一时间特性及该第二时间特性来计算发生核苷酸并入事件的时间。
6.如权利要求5所述的方法，其中使用脉冲识别算法来执行该计算发生核苷酸并入事件的时间。
7.如权利要求6所述的方法，其中该脉冲识别算法包括变化点算法、运行平均值/中值及方差算法或状态机算法。
8.一种方法，包括：
确定表示在激发之后通过一个或多个发光标签的光子发射概率的衰减速度的一个或多个时间特性；及
使用该至少一个时间特性来计算发生核苷酸并入事件的时间。
9.如权利要求8所述的方法，其中还使用由该一个或多个发光标签发射的光的强度来执行该计算发生核苷酸并入事件的时间。
10.一种方法，包括：
接收时间分格信息，该时间分格信息是关于发光标签响应于该发光标签的激发而发光的时间；
基于该时间分格信息计算光强度信息；及
使用该光强度信息来计算发生至少一个核苷酸并入事件的时间。
11.如权利要求10的方法，其中还使用该光的时间特性来执行所述计算发生至少一个核苷酸并入事件的时间。
12.一种识别核苷酸所述的方法，包括：
获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：
ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及
ⅱ)该光的强度特性；及
将表示所述核苷酸并入事件的特性的点分组成点的组，各个点表示对应的核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性；及
将所述点的组分配至各个核苷酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中该时间特性包括在不同时间分格中探测的光子的照度寿命或比率。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中通过聚类算法实行所述点的分组。
15.如权利要求14所述的方法，其中该聚类算法实行其中k大于或等于四的k平均值聚类。
16.如权利要求12至15中任一项所述的方法，其中基于所述发光标签的预定发光特性将点的各个组分配至各个核苷酸。
17.一种校准定序仪器的方法，包括：
获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：
ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及
ⅱ)该光的强度特性；
将表示所述核苷酸并入事件的所述特性的点分组成点的组，各个点表示对应的核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性；
将所述点的组分配至各个核苷酸；
确定区分所述群组的一个或多个标准；及
存储所述一个或多个标准。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述一个或多个标准包括所述点的组之间的一个或多个边界。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述一个或多个标准包括所述点的组的质心。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中将所述一个或多个标准存储在非挥发性存储器中。
21.如权利要求17至20中任一项所述的方法，其中将所述点分组包括对所述点运行聚类算法。
22.一种识别核苷酸的方法，该方法包括：
获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：
ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及
ⅱ)该光的强度特性；及
对于用于区分所述发光标签的该光的特性的定序仪器，通过鉴于所存储的标准估计所述时间特性和所述强度特性而将所述核苷酸并入事件分配至核苷酸。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述所存储的标准包括用于不同核苷酸的所述发光标签的特性之间的一个或多个边界，所述分配核苷酸并入事件包括比较表示该时间特性及该强度特性的点与所述一个或多个边界。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中一个或多个所述的所存储的标准包括点的组的质心，每个组对应于各自的核苷酸，所述分配核苷酸并入事件包括：
确定表示并入事件的该时间特性及该强度特性的点与所述质心之间的距离；及
将所述核苷酸并入事件分配至具有最接近该点的质心的核苷酸。
25.如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述所存储的标准是存储在非挥发性存储器中的校准标准。
26.一种识别核苷酸的方法，包括：
获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：
ⅰ)该光的一时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及
ⅱ)该光的第二特性；及
将表示所述核苷酸并入事件的特性的点分组成点的组，个别点表示对应核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性；及
将所述点的组分配至个别核苷酸。
27.一种校准定序仪器的方法，包括：
获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：
ⅰ)该光的一时间特性，该时间特性表示在激发之后通过一发光标签的一光子发射概率的一衰减速度；及
ⅱ)该光的一第二特性；
将表示所述核苷酸并入事件的所述特性的点分组成组，各个点表示对应核苷酸并入事件的至少该时间特性及该强度特性；
将各个点的组分配至各个核苷酸；
确定区分所述点的组的一个或多个标准；及
存储所述一个或多个标准。
28.一种识别核苷酸的方法，该方法包括：
获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：
ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及
ⅱ)该光的强度特性；及
对于用于区分所述发光标签的该光的特性的定序仪器，通过鉴于所存储的标准估计所述时间特性和所述强度特性而将所述核苷酸并入事件分配至核苷酸。
29.一种方法，包括：
获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：
ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后发光标签的光子发射概率的衰减速度；及
ⅱ)该光的强度特性；及
确定区分点的组的一个或多个标准，所述点表示所述核苷酸并入事件的特性，各个点表示对应的核苷酸并入事件的该时间特性及该强度特性。
30.如权利要求29所述的方法，进一步包括将所述组分配至各自的核苷酸以产生所述组的核苷酸分配。
31.如权利要求30所述的方法，进一步包括基于所述一个或多个标准及所述组的所述核苷酸分配而将所述点分配至核苷酸。
32.一种方法，包括：
获得在核苷酸并入事件期间与所述核苷酸相关联的自发光标签探测的光的特性，对于每个核苷酸并入事件，所述特性包括：
ⅰ)该光的时间特性，该时间特性表示在激发之后通过一发光标签的一光子发射概率的一衰减速度；及
ⅱ)该光的第二特性；及
确定区分点的组的一个或多个标准，所述点表示所述核苷酸并入事件的特性，各个点表示对应的核苷酸并入事件的该时间特性及该强度特性。
33.一种非暂态计算机可读存储介质，其具有存储于其上的指令，所述指令在被处理器执行时，执行任何前述权利要求所述的方法。
34.一种装置，包括：
处理器，其配置为执行任何前述权利要求的方法。
35.一种定序仪器，其包括：
光探测器，其配置为以在定序反应期间自发光标签接收光；及
处理器，其配置为以实行任何前述权利要求的方法。
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