KR20190015371A - 펄스 호출자 및 베이스 호출자 - Google Patents
펄스 호출자 및 베이스 호출자 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190015371A KR20190015371A KR1020187037813A KR20187037813A KR20190015371A KR 20190015371 A KR20190015371 A KR 20190015371A KR 1020187037813 A KR1020187037813 A KR 1020187037813A KR 20187037813 A KR20187037813 A KR 20187037813A KR 20190015371 A KR20190015371 A KR 20190015371A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- light
- time
- nucleotide incorporation
- points
- characteristic
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
- G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B45/00—ICT specially adapted for bioinformatics-related data visualisation, e.g. displaying of maps or networks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
- G01N21/6454—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates using an integrated detector array
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Data Mining & Analysis (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Burglar Alarm Systems (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
핵산들의 서열분석 동안 센서로부터 취득된 데이터에 기초하여 뉴클레오티드들을 식별하기 위한 시스템 및 방법들. 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해, 광의 시간 특성 및 광의 세기 특성을 포함할 수 있다. 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타낸다. 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타낼 수 있다. 이 방법은, 개별 뉴클레오티드들에 포인트들의 그룹들을 할당하는 단계를 더 포함할 수 있다.
Description
본 출원은, 2016년 6월 1일자로 출원되고 발명의 명칭이 "PULSE CALLER AND BASE CALLER"인 미국 가특허 출원 제62/343,997호에 대한 우선권을 주장하고, 이 미국 가특허 출원은 이로써 그 전체가 참조로 포함된다.
핵산들(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA))의 서열분석(sequencing)은, 표적 핵산에서 뉴클레오티드들의 개체를 식별하는 것을 포함한다. 일부 핵산 서열분석 방법들은, 개별 뉴클레오티드들이 표적 핵산에 상보적인 핵산 가닥(nucleic acid strand)에 혼입될 때 이들 개별 뉴클레오티드들을 식별하는 것을 포함한다. 그 후에, 서열분석 프로세스 동안 식별된 상보적인 가닥에 대한 일련의 뉴클레오티드들은 표적 핵산 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열의 식별을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시예들은, 제1 발광 표지(first luminescent label)의 여기(excitation)들에 응답하여 제1 발광 표지가 광을 방출하는 시간들에 관한 제1 시간-빈 정보(first time-bin information)를 수신하는 단계, 제1 시간-빈 정보에 기초하여 제1 광 세기 정보를 계산하는 단계, 제2 발광 표지의 여기들에 응답하여 제2 발광 표지가 광을 방출하는 시간들에 관한 제2 시간-빈 정보를 수신하는 단계, 제2 시간-빈 정보에 기초하여 제2 광 세기 정보를 계산하는 단계, 및 제1 및 제2 광 세기 정보를 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계는 펄스 식별 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 펄스 식별 알고리즘은 변경점 알고리즘(changepoint algorithm), 연속 평균/중앙치(running mean/median) 및 분산 알고리즘(variance algorithm) 또는 상태 머신 알고리즘을 포함할 수 있다. 제1 광 세기 정보를 계산하는 단계는, 제1 시간-빈 정보를 합산하는 단계를 포함할 수 있고, 제2 광 세기 정보를 계산하는 단계는, 제2 시간-빈 정보를 합산하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시예들은, 제1 발광 표지의 여기들에 응답하여 제1 발광 표지가 제1 광을 방출하는 시간들에 관한 제1 시간-빈 정보를 수신하는 단계, 및 제1 시간-빈 정보에 기초하여 제1 광의 제1 시간 특성을 계산하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 시간 특성은 여기 이후의 제1 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타낼 수 있다. 이 방법은, 제2 발광 표지의 여기들에 응답하여 제2 발광 표지가 제2 광을 방출하는 시간들에 관한 제2 시간-빈 정보를 수신하는 단계, 및 제2 시간-빈 정보에 기초하여 제2 광의 제2 시간 특성을 계산하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 시간 특성은 여기 이후의 제2 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타낼 수 있다. 이 방법은 제1 및 제2 시간 특성들을 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계를 더 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계는 펄스 식별 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 펄스 식별 알고리즘은 변경점 알고리즘, 연속 평균/중앙치 및 분산 알고리즘 또는 상태 머신 알고리즘을 포함할 수 있다.
일부 실시예들은, 여기 이후의 하나 이상의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타내는 하나 이상의 시간 특성을 결정하는 단계, 및 적어도 하나의 시간 특성을 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계는, 하나 이상의 발광 표지에 의해 방출된 광의 세기를 사용하여 또한 수행될 수 있다.
일부 실시예들은, 발광 표지의 여기들에 응답하여 발광 표지가 광을 방출하는 시간들에 관한 시간-빈 정보를 수신하는 단계, 시간-빈 정보에 기초하여 광 세기 정보를 계산하는 단계, 및 광 세기 정보를 사용하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 혼입 이벤트가 발생하는 시간을 계산하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
적어도 하나의 뉴클레오티드 혼입 이벤트가 발생하는 시간은 광의 시간 특성을 사용하여 또한 수행될 수 있다.
일부 실시예들은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드들을 식별하는 방법에 관한 것이다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해: i) 광의 시간 특성 - 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및 ii) 광의 세기 특성을 포함할 수 있다. 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계 - 개별 포인트들은, 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -, 및 포인트들의 그룹들을 개별 뉴클레오티드들에 할당하는 단계를 더 포함할 수 있다.
시간 특성은, 상이한 시간 빈들에서 검출된 광자들의 비율 또는 휘도 수명을 포함할 수 있다. 포인트들을 그룹화하는 단계는 클러스터링 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 클러스터링 알고리즘은, k가 4 이상인 k-평균 클러스터링을 수행할 수 있다. 포인트들의 개별 그룹들은 발광 표지들의 미리 결정된 광-방출 특성들에 기초하여 개별 뉴클레오티드들에 할당될 수 있다.
일부 실시예들은 서열분석 기기를 교정(calibrating)하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함한다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해: i) 광의 시간 특성 - 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및 ii) 광의 세기 특성을 포함할 수 있다. 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계 - 개별 포인트들은, 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -, 포인트들의 개별 그룹들을 개별 뉴클레오티드들에 할당하는 단계, 포인트들의 그룹들을 구별하는 하나 이상의 기준을 결정하는 단계, 및 하나 이상의 기준을 저장하는 단계를 더 포함할 수 있다.
하나 이상의 기준은 포인트들의 그룹들 사이의 하나 이상의 경계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 기준은 포인트들의 그룹들의 중심들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 기준은 비휘발성 메모리에 저장될 수 있다. 포인트들을 그룹화하는 단계는, 포인트들 상에서 클러스터링 알고리즘을 실행하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시예들은 뉴클레오티드들을 식별하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함한다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해: i) 광의 시간 특성 - 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및 ii) 광의 세기 특성을 포함할 수 있다. 이 방법은, 발광 표지들에 대한 광의 특성들 사이를 구별하는 서열분석 기기에 대한 저장된 기준들을 고려하여 시간 특성 및 세기 특성을 평가함으로써 뉴클레오티드들에 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 할당하는 단계를 더 포함할 수 있다.
저장된 기준들은 상이한 뉴클레오티드들에 대한 발광 표지들의 특성들 사이의 하나 이상의 경계를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 할당하는 단계는, 시간 특성 및 세기 특성을 나타내는 포인트를 하나 이상의 경계와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 저장된 기준은 포인트들의 그룹들의 중심들을 포함할 수 있고, 각각의 그룹은 개개의 뉴클레오티드에 대응한다. 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 할당하는 단계는, 혼입 이벤트에 대한 시간 특성 및 세기 특성을 나타내는 포인트 내지 중심들 사이의 거리들을 결정하는 단계, 및 포인트에 가장 가까운 중심을 갖는 뉴클레오티드에 뉴클레오티드 혼입 이벤트를 할당하는 단계를 포함할 수 있다. 저장된 기준들은, 비휘발성 메모리에 저장되는 교정 기준들일 수 있다.
일부 실시예들은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드들을 식별하는 방법에 관한 것이다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해: i) 광의 시간 특성 - 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및 ii) 광의 제2 특성을 포함할 수 있다. 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계 - 개별 포인트들은, 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -, 및 포인트들의 그룹들을 개별 뉴클레오티드들에 할당하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예들은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함하는, 서열분석 기기를 교정하는 방법에 관한 것이다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해: i) 광의 시간 특성 - 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및 ii) 광의 제2 특성을 포함할 수 있다. 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계 - 개별 포인트들은, 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -, 포인트들의 개별 그룹들을 개별 뉴클레오티드들에 할당하는 단계, 포인트들의 그룹들을 구별하는 하나 이상의 기준을 결정하는 단계, 및 하나 이상의 기준을 저장하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예들은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드들을 식별하는 방법에 관한 것이다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해: i) 광의 시간 특성 - 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및 ii) 광의 세기 특성을 포함할 수 있다. 이 방법은, 발광 표지들에 대한 광의 특성들 사이를 구별하는 서열분석 기기에 대한 저장된 기준들을 고려하여 시간 특성 및 제2 특성을 평가함으로써 뉴클레오티드들에 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 할당하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예들은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해: i) 광의 시간 특성 - 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및 ii) 광의 세기 특성을 포함할 수 있다. 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들의 그룹들을 구별하는 하나 이상의 기준을 결정하는 단계 - 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 - 를 더 포함할 수 있다.
이 방법은, 그룹들을 개개의 뉴클레오티드들에 할당하여 그룹들에 대한 뉴클레오티드 할당들을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 방법은, 그룹들에 대한 뉴클레오티드 할당들 및 하나 이상의 기준에 기초하여 포인트들을 뉴클레오티드들에 할당하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예들은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해: i) 광의 시간 특성 - 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및 ii) 광의 제2 특성을 포함할 수 있다. 이 방법은, 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들의 그룹들을 구별하는 하나 이상의 기준을 결정하는 단계 - 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 시간 특성 및 제2 특성을 나타냄 - 를 더 포함할 수 있다.
일부 실시예들은, 프로세서에 의해 실행될 때, 본 명세서에 설명된 방법들 중 임의의 방법을 수행하는 명령어들을 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체에 관한 것이다.
일부 실시예들은, 본 명세서에 설명된 방법들 중 임의의 방법을 수행하도록 구성되는 프로세서를 포함하는 장치에 관한 것이다.
일부 실시예들은, 서열분석 반응 동안 발광 표지들로부터의 광을 수신하도록 구성되는 광검출기, 및 본 명세서에 설명된 방법들 중 임의의 방법을 수행하도록 구성되는 프로세서를 포함하는 서열분석 기기에 관한 것이다.
본 출원의 다양한 양태들 및 실시예들은 다음의 도면들을 참조하여 설명될 것이다. 도면들은 반드시 일정한 비율로 그려진 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 다수의 도면들에서 나타나는 항목들은 이들이 나타나는 모든 도면들에서 동일한 참조 번호로 표시된다.
도 1a는 일부 실시예들에 따른, 펄스 호출자(pulse caller)에 의해 구현되는 알고리즘의 흐름도이다.
도 1b는 일부 실시예들에 따른, 광검출기에 의해 검출되는 시간 빈들에서의 광자들의 수의 분포 및 여기 이후의 시간에 걸친 광자 방출 확률의 플롯(plot)이다.
도 1c는 일부 실시예들에 따른, 방출된 광의 시간 파라미터(들)를 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 결정하기 위한 방법의 흐름도이다.
도 1d는 일부 실시예들에 따른, 방출된 광의 세기 및 시간 특성(들)을 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 결정하기 위한 방법의 흐름도이다.
도 2는 일부 실시예들에 따른, 핵산의 서열분석 동안 시간에 걸쳐 광검출기에 의해 검출되는 광의 세기의 플롯이다.
도 2aa는 일부 실시예들에 따른, 생물학적 및 화학적 표본들의 신속한 모바일 분석을 위해 사용될 수 있는 장치의 블록도 표현이다.
도 2ab는 일부 실시예들에 따른, 집적 디바이스(integrated device) 및 기기의 블록도이다.
도 3은 일부 실시예들에 따른, 베이스 호출자(base caller)에 의해 구현되는 알고리즘의 흐름도이다.
도 3aa는 일부 실시예들에 따른, 집적 디바이스의 개략도이다.
도 3ab는 일부 실시예들에 따른, 픽셀들의 로우(row)에서의 샘플 웰(sample well)들에 커플링되는 여기 에너지 및 센서들을 향해 지향되는 각각의 샘플 웰로부터의 방출 에너지의 개략도이다.
도 4는 일부 실시예들에 따른, 상이한 뉴클레오티드들에 대한 포인트들의 클러스터들을 도시하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트들에 대한 시간 파라미터로서의 세기 대 시간 빈 비율의 플롯이다.
도 5는 일부 실시예들에 따른, 도 4에 도시된 클러스터들에 대한 경계들 및 중심 포지션들을 도시하는 플롯이다.
도 6은 일부 실시예들에 따른, 하나 이상의 교정 기준에 기초하여 뉴클레오티드들을 식별하기 위해 베이스 호출자에 의해 구현되는 알고리즘의 흐름도이다.
도 7은 일부 실시예들에 따른, 상이한 뉴클레오티드들에 대한 중심 포지션들에 대한 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대응하는 포인트의 상대적인 거리들을 예시하는 세기 대 시간 파라미터의 플롯이다.
도 8은 본 명세서에 설명된 기술의 일부 실시예들을 구현하는 데 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨팅 디바이스의 블록도이다.
도 1a는 일부 실시예들에 따른, 펄스 호출자(pulse caller)에 의해 구현되는 알고리즘의 흐름도이다.
도 1b는 일부 실시예들에 따른, 광검출기에 의해 검출되는 시간 빈들에서의 광자들의 수의 분포 및 여기 이후의 시간에 걸친 광자 방출 확률의 플롯(plot)이다.
도 1c는 일부 실시예들에 따른, 방출된 광의 시간 파라미터(들)를 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 결정하기 위한 방법의 흐름도이다.
도 1d는 일부 실시예들에 따른, 방출된 광의 세기 및 시간 특성(들)을 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 결정하기 위한 방법의 흐름도이다.
도 2는 일부 실시예들에 따른, 핵산의 서열분석 동안 시간에 걸쳐 광검출기에 의해 검출되는 광의 세기의 플롯이다.
도 2aa는 일부 실시예들에 따른, 생물학적 및 화학적 표본들의 신속한 모바일 분석을 위해 사용될 수 있는 장치의 블록도 표현이다.
도 2ab는 일부 실시예들에 따른, 집적 디바이스(integrated device) 및 기기의 블록도이다.
도 3은 일부 실시예들에 따른, 베이스 호출자(base caller)에 의해 구현되는 알고리즘의 흐름도이다.
도 3aa는 일부 실시예들에 따른, 집적 디바이스의 개략도이다.
도 3ab는 일부 실시예들에 따른, 픽셀들의 로우(row)에서의 샘플 웰(sample well)들에 커플링되는 여기 에너지 및 센서들을 향해 지향되는 각각의 샘플 웰로부터의 방출 에너지의 개략도이다.
도 4는 일부 실시예들에 따른, 상이한 뉴클레오티드들에 대한 포인트들의 클러스터들을 도시하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트들에 대한 시간 파라미터로서의 세기 대 시간 빈 비율의 플롯이다.
도 5는 일부 실시예들에 따른, 도 4에 도시된 클러스터들에 대한 경계들 및 중심 포지션들을 도시하는 플롯이다.
도 6은 일부 실시예들에 따른, 하나 이상의 교정 기준에 기초하여 뉴클레오티드들을 식별하기 위해 베이스 호출자에 의해 구현되는 알고리즘의 흐름도이다.
도 7은 일부 실시예들에 따른, 상이한 뉴클레오티드들에 대한 중심 포지션들에 대한 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대응하는 포인트의 상대적인 거리들을 예시하는 세기 대 시간 파라미터의 플롯이다.
도 8은 본 명세서에 설명된 기술의 일부 실시예들을 구현하는 데 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨팅 디바이스의 블록도이다.
본 명세서에 설명된 기법들은 DNA 및 RNA와 같은 핵산들의 서열분석에 관한 것으로, 특히 센서로부터 취득되는 데이터에 기초하여 뉴클레오티드들을 식별하기 위한 기법들에 관한 것이다. 핵산 서열분석은 표적 핵산에서 뉴클레오티드들의 순서 및 포지션의 결정을 가능하게 한다. 일부 핵산 서열분석 방법들은, 뉴클레오티드가 표적 핵산에 상보적인 핵산의 새롭게 합성된 가닥에 혼입됨에 따라 뉴클레오티드의 아이덴티티(identity)가 결정되는 합성에 의한 서열분석에 기초한다. 서열분석 동안, 중합 효소(예를 들어, DNA 폴리메라아제(polymerase))는 표적 핵산 분자의 프라이밍 위치에 커플링(예를 들어, 부착)되고 중합 효소의 작용을 통해 프라이머에 뉴클레오티드들을 첨가 또는 혼입할 수 있는데, 이 중합 효소의 작용은 프라이머 신장 반응이라고 일반적으로 지칭될 수 있다.
각각의 뉴클레오티드는, 여기에 반응하여 광을 방출하고, 상이한 타입들의 뉴클레오티드들 간을 구별하기 위해 각각의 타입의 뉴클레오티드를 표지하는 데 사용되는 발광 분자(예를 들어, 형광단)와 연관될 수 있다. 예를 들어, DNA에 존재하는 핵염기들을 표지하기 위해 4개의 표지들의 세트가 사용될 수 있어서 세트의 각각의 마커가 상이한 핵염기와 연관되는데, 예를 들어, 제1 표지가 아데닌(A)과 연관되고, 제2 표지가 시토신(C)과 연관되고, 제3 표지가 구아닌(G)과 연관되고, 제4 표지가 티민(T)과 연관된다. 링커 분자를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 표지를 뉴클레오티드에 결합하는 것을 통해 표지가 뉴클레오티드에 커플링될 수 있다.
프라이머 신장 반응이 발생함에 따라, 뉴클레오티드 및 그의 개개의 발광 표지들은 합성된 상보적인 핵산으로의 뉴클레오티드의 혼입 동안 중합 효소에 의해 보유된다. 발광 표지는 뉴클레오티드가 합성된 핵산에 혼입되고 표지의 광 특성을 방출하는 주기 동안 광의 펄스들에 의해 여기될 수 있다. 일부 실시예들에서, 표지는 링커 분자를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 뉴클레오티드의 말단 포스페이트에 부착되어, 뉴클레오티드의 혼입 동안 중합 효소의 작용(예를 들어, 포스페이트 결합의 분열)을 통해 뉴클레오티드로부터 표지가 분리 또는 방출된다. 여기에 응답하여 발광 표지에 의해 방출되는 광을 감지 및 분석하면 혼입된 뉴클레오티드를 식별하는 것을 가능하게 할 수 있다. 프라이머 신장 반응이 발생함에 따라, 합성된 핵산에 첨가된 각각의 후속 뉴클레오티드에 대해 여기, 감지 및 분석이 수행된다. 표적 핵산의 서열은 합성된 핵산의 상보적인 서열로부터 결정될 수 있다.
발광 표지에 의해 방출되는 광은, 표지를 다른 표지들로부터 구별하고, 따라서 뉴클레오티드를 식별하기 위해 사용될 수 있는 다수의 특성들을 가질 수 있다. 이들 특성들은 세기(예를 들어, 광을 방출할 확률), 시간 특성(예를 들어, 여기 이후의 광자 방출 확률의 감쇠 레이트, 혼입을 위한 펄스 지속기간 및/또는 혼입 이전 및/또는 이후의 인터펄스(interpulse) 지속기간), 스펙트럼 특성(예를 들어, 방출된 광의 파장(들)), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 발광 표지에 의해 방출되는 광은, 이들 특성들 중 하나 이상을 검출할 수 있는 광검출기에 의해 검출될 수 있다. 적합한 광검출기의 예는, 발명의 명칭이 "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS"인 미국 특허 출원 제14/821,656호에 설명되고, 이 미국 특허 출원은 이로써 그 전체가 참조로 포함된다. 거기에 설명된 바와 같이, 광검출기는 광자들의 도달 시간들을 검출하는 능력을 가질 수 있는데, 이는 표지들에 의해 방출되는 광의 시간 특성들을 결정하는 것을 가능하게 할 수 있다. 방출된 광의 시간 특성들을 검출하면 상이한 시간 특성들을 갖는 광을 방출하는 표지들 사이를 구별하는 것을 가능하게 할 수 있다. 시간 특성의 일 예는 휘도 수명이다. 형광단과 같은 발광 분자는 여기에 응답하여 광자들을 방출할 수 있다. 발광 분자가 광자를 방출할 확률은 여기가 발생한 후에 시간 경과에 따라 감소한다. 확률의 감쇠 레이트는 지수적(exponential)일 수 있다. "수명"은 시간에 걸쳐 확률이 얼마나 빨리 감쇠하는지의 특성이다. 빠른 감쇠는 짧은 수명을 갖는다고 하는 한편, 느린 감쇠는 긴 수명을 갖는다고 한다. 발광 분자들에 의해 방출되는 광의 시간 특성들을 검출하면 상이한 수명들을 갖는 발광 분자들을 구별하는 것을 가능하게 할 수 있다. 상이한 수명들을 갖는 발광 분자들로 상이한 뉴클레오티드들을 표지하면 검출된 광의 시간 특성에 기초하여 뉴클레오티드들 사이를 구별하는 것을 가능하게 할 수 있다.
미국 특허 출원 제14/821,656호에 설명된 광검출기는 나노초 또는 피코초 분해능으로 광자들의 도달 시간을 검출할 수 있고, 입사 광자들의 도달을 시간 비닝(time-bin)할 수 있다. 광자들의 방출이 확률적이기 때문에, 표지는 복수 회 여기될 수 있고 임의의 결과적인 광자 방출들은 시간 비닝될 수 있다. 그러한 측정을 복수 회 수행하면 여기 이벤트들 이후에 광자들이 도달한 시간들의 히스토그램을 채우는 것을 가능하게 한다. 이 정보는 분석되어 방출된 광의 시간 특성을 계산할 수 있는데, 이는 시간 특성에 기초하여 표지를 다른 표지로부터 구별하는 것을 가능하게 할 수 있다.
본 명세서에 설명된 기법들은 검출된 광의 특성들에 기초하여 핵산을 서열분석하기 위해 광검출기로부터의 데이터의 스트림을 분석할 수 있다. 이들 기법들은, 서열분석 기기 또는 다른 디바이스의 소프트웨어 및/또는 하드웨어 모듈들일 수 있는 "펄스 호출자" 및 "베이스 호출자"에 의해 구현될 수 있다. 일반적으로, 펄스 호출자는, 염료-공액 뉴클레오티드(dye-conjugated nucleotide)가 폴리메라아제에 의해 올리고뉴클레오티드 가닥에 혼입된다는 것을 나타내는, 표지로부터의 발광 펄스들이 발생할 때의 시간 주기들을 식별하기 위해 데이터의 스트림을 분석한다. "베이스 호출자"는 뉴클레오티드들의 아이덴티티를 결정 또는 "호출"하기 위해 펄스 호출자에 의해 식별되는 시간 주기들 동안 검출되는 광의 특성들을 분석한다.
도 1a는 펄스 호출자에 의해 구현될 수 있는 알고리즘의 흐름도를 도시한다. 단계 S1에서, 수신된 광의 세기 대 시간이 계산된다. 상기에 논의된 바와 같이, 광검출기는 (예를 들어, 레이저 펄스에 의해) 표지를 여기 소스에 노출시키는 것에 응답하여 표지로부터의 입사 광자들의 도달을 시간 비닝할 수 있다. 표지는 반복적으로 여기될 수 있고, 표지로부터의 입사 광자들의 도달은 시간 비닝될 수 있다. 예로서, 10 ms 측정 주기 동안, 레이저 여기 펄스들은 100 MHz의 주파수에서 방출되어 표지를 여기시킬 수 있다. 표지는 낮은 확률로 광자를 방출할 수 있다(예를 들어, 10,000개의 여기들에서 하나의 광자 방출). 표지가 10 ms 주기 내에서 다수 회(예를 들어, 1백만 회) 여기되는 경우, 대략 100개의 광자들이 수신될 수 있다. 일부 경우들에서, 여기 소스에의 노출 이후에 표지가 여기되지 않고 여기 이벤트들 이후에 광자를 방출하지 않을 수 있는데, 이는 낮은 방출 확률에 기여할 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 여기에 대한 입사 광자들의 도달 시간들은 시간 비닝될 수 있다. 광검출기는 각각의 시간 빈에서 광자들의 수를 나타내는 신호들을 제공할 수 있다.
도 1b는 광검출기가 입사 광자들의 도달을 8개의 시간 빈들로 시간 비닝하는 예를 도시한다. 상기에 논의된 바와 같이, 광자 방출 확률은 시간에 걸쳐 감쇠하기 때문에, 보다 이른 시간 빈들은 추후의 시간 빈들보다 더 많은 광자들을 갖는다. 표지를 반복적으로 여기시키고 방출된 광자들의 타이밍을 검출함으로써, 도 1b에 도시된 바와 같이, 시간에 걸친 광자 방출 확률의 감쇠에 근사되는 히스토그램이 채워질 수 있다.
측정 주기(예를 들어, 10 ms)에 걸쳐 수신되는 광의 세기는 각각의 시간 빈에서 수신되는 광자들의 수를 나타내는 값들을 합산함으로써 펄스 호출자에 의해 계산될 수 있다. 예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같이, 광검출기가 8개의 시간 빈들로 입사 광자들의 도달을 비닝하는 경우, 8개의 시간 빈들에서 수신되는 광자들의 수가 합산되어 세기를 결정한다. 그러나, 임의의 수의 시간 빈들이 사용될 수 있다. 광검출기가 2개의 시간 빈들을 갖는 경우, 시간 빈들 양측 모두에서 수신되는 광자들의 수를 나타내는 값들이 합산되어 세기를 결정한다. 예를 들어, 제1 시간 빈이 100개의 광자들을 가지며 제2 시간 빈이 50개의 광자들을 갖는 경우, 이들 값들이 합산되어 150개의 광자들의 세기를 결정할 수 있다. 대안적으로, 총 광자 세기를 측정할 목적으로 별개의 시간 빈이 존재할 수 있다.
수신된 광의 세기의 결정은 광검출기로부터의 데이터 스트림에서의 후속 측정 주기들에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 광검출기가 10 ms 주기들에서 측정들을 수행하는 경우, 세기는 각각의 10 ms 주기에서 시간 빈들을 합산함으로써 각각의 측정 주기에 대해 결정될 수 있다. 그 결과, 시간에 걸쳐 수신된 광의 세기를 나타내는 데이터가 결정될 수 있다.
도 2는 수신된 광의 세기 대 시간을 나타내는 몇 분의 예시적인 트레이스를 도시한다. 트레이스에는 상당한 베이스라인 및 분산이 있고 진정한 펄스들은 낮은 신호 대 잡음비를 종종 갖기 때문에, 혼입 이벤트들에 대응하는 펄스들을 식별하는 것은 도전과제일 수 있다. 단계 S2에서, 펄스-발견 알고리즘이 세기 대 시간 데이터 상에서 실행되어 혼입 이벤트들에 대응하여 광의 버스트들이 방출될 때의 시간들을 식별한다.
펄스-발견 알고리즘의 경우, 하나의 적합한 접근법은, 신호의 평균 및 분산의 시프트들이 발생할 때, 예를 들어, 백그라운드(즉, 인터펄스)로부터 신호(즉, 펄스)로 그리고 그 반대의 경우로 변경될 때를 결정하는 변경점 알고리즘을 트레이스 데이터 상에서 실행하는 것이다. 각각의 변경점이 식별된 후에, 임계치는 변경점 레벨(예를 들어, 세기)에 기초하여 펄스 영역들로부터 인터펄스 영역들(펄스들 사이의 영역들)을 분리한다. 이 임계치는 히스토그래밍, 커널 밀도 추정, 또는 k-평균 클러스터링을 이용하여 수동으로 결정될 수 있다.
다른 적합한 접근법은, 트레이스의 평균/중앙치 및 분산을 분석한 후에, 특정 수의 표준 편차들의 증가들로서 또는 평균/중앙치보다 더 높은 것으로 펄스들을 정의하는 것이다.
또 다른 적합한 접근법은, 펄스 또는 인터펄스 상태에 있고, 그 2개 사이에서 교번하는 것으로 판단되는, 상태 머신을 사용하는 것이다. 임계치들은 2개의 상태들 사이의 전이들을 정의한다.
일부 실시예들에서, (매우 짧은 펄스들 및 매우 긴 펄스들은 종종 긍정 오류(false positive)들이기 때문에) 최소 또는 최대 지속기간 임계치들을 충족시키지 않는 펄스들을 제거하는 것과 같은, 소위 펄스들의 부가적인 필터링이 발생할 수 있다.
후자의 2개의 접근법들은, 데이터가 취득되고 있을 때 이들이 데이터 상에서 동작될 수 있다는 점에서 부가적인 이익을 갖는 반면, 변경점 알고리즘은 동작하기 위해 모든 데이터를 필요로 할 수 있다.
상기에는 방출된 광의 세기에 기초하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들에 대응하는 펄스들을 식별하기 위한 기법들이 설명되어 있다. 그러나, 방출된 광의 다른 특성들이 세기에 부가적으로, 또는 그에 대한 대안으로서 펄스들을 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 펄스들은 세기를 사용하는 것에 대한 대안으로서 또는 그에 부가적으로 방출된 광의 시간 특성(들)에 기초하여 식별될 수 있다. 상이한 뉴클레오티드들은 상이한 시간 특성들을 갖는 광을 방출하는 분자들로 표지될 수 있고, 시간 특성들이 분석되어 혼입 이벤트들이 시작 및 종료될 때를 결정할 수 있다. 예로서, 상이한 발광 표지들은, 여기에 반응하는 광자 방출의 확률이 시간에 걸쳐 감쇠하는 상이한 "수명들" 또는 레이트들을 가질 수 있다. 측정된 수명의 변경은 혼입 이벤트의 시작 또는 종료를 표시할 수 있다.
도 1c는 혼입 이벤트들에 대응하는 펄스들이 발생할 때를 결정하기 위해 시간 파라미터(들)를 사용하는 방법의 흐름도를 도시한다. 단계 S3에서, 혼입 이벤트들 동안 방출되는 광에 대한 시간 파라미터(들)가 결정된다. 예를 들어, 아래에 논의되는 바와 같이, 시간 특성들은 시간 빈 정보(즉, 하나 이상의 시간 빈으로부터의 또는 이들에 기초하는 정보)에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 실시예들에서, 시간 특성(들)은 베이스 호출자에 의해 결정되어 펄스 호출자에게 제공될 수 있다. 단계 S4에서, 펄스-발견 알고리즘은 시간에 걸쳐 시간 파라미터를 나타내는 데이터 상에서 수행될 수 있다. 펄스-발견 알고리즘은 세기와 관련하여 상기에 논의된 것과 유사하게 동작할 수 있다.
일부 실시예들에서, 세기 및 시간 특성(들) 양측 모두는 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 식별하는 데 사용될 수 있다. 예로서, 시간 특성의 변경들은 세기에 기초하는 펄스들의 식별을 미세화하는 데 사용될 수 있다. 도 1d는 그러한 방법의 흐름도를 도시한다. 단계 S1에서, 광의 세기들은 각각의 혼입 이벤트에 대해 획득될 수 있다. 세기들은, 상기에 논의된 바와 같이, 시간 빈들의 각각의 세트에서 시간 빈들을 합산함으로써 계산될 수 있다. 그러나, 세기들은 시간 빈들을 합산함으로써 획득될 필요가 없고, 상이한 방식으로 측정 및/또는 결정될 수 있다. 단계 S2에서, 펄스-발견 알고리즘이 세기 대 시간 데이터 상에서 실행되어 혼입 이벤트들에 대응하여 광의 버스트들이 방출될 때의 시간들을 식별한다. 단계 S3에서, 혼입 이벤트들 동안 방출되는 광에 대한 시간 파라미터(들)가 결정된다. 단계 S5에서, 단계 S2에서 식별된 펄스들은 시간 파라미터(들)에 기초하여 평가되고 가능하다면 미세화될 수 있다. 예를 들어, 긴 펄스(예를 들어, 임계량보다 더 큰 길이를 가짐)가 식별되는 경우, 펄스 동안 방출된 광의 시간 파라미터(들)가 평가될 수 있다. 시간 파라미터가 펄스 동안 상당히 시프트하는(예를 들어, 임계량, 또는 상이한 뉴클레오티드를 표시할 수 있는 양보다 더 많이 변경되는) 동안, 초기 펄스 호출은 하나의 긴 펄스 대신에 2개의 별개의 펄스들을 식별하도록 정정될 수 있다. 시간 파라미터의 시프트가 발생하는 시간은 2개의 펄스들 사이의 시간 경계에 대응할 수 있다. 시간 파라미터가 펄스 동안 상당히 시프트하지 않는(예를 들어, 비교적 작은 양만큼 변경되거나 또는 변경되지 않는) 경우, 초기 펄스 호출은 변경되지 않은 채로 남아 있을 수 있다. 이에 따라, 세기에 기초하는 초기 펄스 호출의 결과들은 시간 파라미터(들)를 사용하여 평가 및/또는 미세화될 수 있다.
일부 실시예들에서, 초기 펄스 호출은 시간 파라미터(들)를 사용하여 수행될 수 있고, 펄스들은 세기 정보를 사용하여 미세화될 수 있다.
펄스-발견 알고리즘을 실행한 결과, 펄스 호출자는 혼입 이벤트들에 대응하는 펄스들이 발생하는 시간들을 식별한다. 각각의 펄스에 대해, 펄스 호출자는 시작 시간 및 정지 시간, 시작 시간 및 지속기간, 또는 정지 시간 및 지속기간을 식별할 수 있다. 그러한 펄스들이 발생하는 시간들이 분석되어 발광 표지, 그리고 따라서 그것의 연관된 뉴클레오티드를 식별할 수 있다.
광검출기로부터의 데이터의 스트림 상의 펄스 호출자를 호출한 후에, 베이스 호출자는 각각의 혼입 이벤트에 대한 광의 하나 이상의 특성을 분석하도록 호출될 수 있다. 펄스 호출자는 펄스들이 발생하는 시간들을 베이스 호출자에게 전달할 수 있다. 임의로, 펄스 호출자는, 각각의 시간 빈에 수신된 광자들의 수, 각각의 측정 주기에 대한 계산된 세기에 관한 정보, 또는 임의의 다른 적합한 정보와 같은 부가적인 정보를 베이스 호출자에게 전달할 수 있다.
도 3은 뉴클레오티드들을 식별하기 위해 베이스 호출자에 의해 구현될 수 있거나, 및/또는 서열분석 기기를 교정하는 데 사용될 수 있는 알고리즘의 흐름도를 도시한다.
단계 S11에서, 세기들이 각각의 혼입 이벤트에 대해 획득될 수 있다. 세기들은, 상기에 논의된 바와 같이, 시간 빈들의 각각의 세트에서 시간 빈들을 합산함으로써 계산될 수 있다. 대안적으로, 베이스 호출자는 펄스 호출자로부터 세기들을 수신할 수 있다.
세기는 펄스 호출자에 의해 식별된 혼입 이벤트의 지속기간에 대해 정규화될 수 있다. 예를 들어, 혼입 이벤트가 측정 간격의 2배만큼 길게 지속되는 경우, 세기는 2개의 측정 간격들에 대한 시간 빈들을 합산하고 2로 분할함으로써 계산될 수 있다. 예를 들어, 혼입 이벤트가 20 ms 지속되고, 측정 주기가 10 ms이며, 광자들이 2개의 시간 빈들로 그룹화되는 경우, 세기는 제1 측정의 2개의 시간 빈들에서 수집된 광자들뿐만 아니라 제2 측정의 2개의 시간 빈들에서 수집된 광자들을 합산한 후에, 2로 분할함으로써 계산될 수 있다. 그러한 계산은 또한 20 ms 혼입 이벤트에 대한 평균 세기의 계산인 것으로 간주될 수 있다.
단계 S12에서, 시간 파라미터가 각각의 혼입 이벤트에 대해 결정될 수 있다. 시간 파라미터는 여기 이후의 시간에 걸친 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠를 나타낼 수 있다. 임의의 적합한 시간 파라미터가 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 휘도 수명은 시간 빈들(예를 들어, 도 1b 참조)에 지수를 피팅(fitting)함으로써 계산될 수 있고, 휘도 수명은 시간 파라미터로서 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상이한 시간 빈들에 대한 광자 카운트(또는 그것의 대표적인 값)는 시간에 걸친 광자 방출 확률의 감쇠를 나타내는 시간 파라미터를 결정하기 위해 비교될 수 있다. 예를 들어, 입사 광자들의 도달이 2개의 시간 빈들로 비닝되는 경우, 2개의 빈들에 대한 광자 카운트의 비율이 계산될 수 있고, 그 비율은 시간 파라미터로 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 빈들의 비율은 휘도 수명을 계산하기 위한 프록시일 수 있다. 비율은 임의의 적합한 방식으로 계산될 수 있다. 일부 실시예들에서, 2개의 시간 빈들이 사용되는 경우, 여기 이벤트에 대해 시간적으로 가장 가까운 시간 빈에 대한 광자 카운트는 제2 시간 빈에 대한 광자 카운트로 분할되어 비율을 생성할 수 있다. 일부 실시예들에서, 시간 빈들의 광자 카운트 또는 그것의 대표적인 값은 (예를 들어, 시간 빈들의 세트에 걸친 합산된 세기에 의해) 정규화될 수 있고, 정규화된 값들은 시간 파라미터를 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 최대 광자 카운트를 갖는 시간 빈이 시간 파라미터로서 사용될 수 있다. 최대 광자 카운트를 갖는 시간 빈을 결정하기 위해, 시간 빈들에 대한 광자 카운트들이 서로 비교될 수 있다. 2개의 시간 빈들을 갖는 예로서, 제1 시간 빈에 대한 광자 카운트는 제2 시간 빈에 대한 광자 카운트와 비교될 수 있다. 보다 높은 광자 카운트를 갖는 빈은 시간 파라미터로서 선택될 수 있고, 발광 분자들을 구별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 발광 분자는 비교적 짧은 수명을 가질 수 있는데, 이는 최대 광자 카운트를 갖는 제1 시간 빈(여기 이벤트에 대해 시간적으로 가장 가까움)을 발생시킬 수 있고, 다른 발광 분자는 비교적 긴 수명을 가질 수 있는데, 이는 최대 광자 카운트를 갖는 다른 시간 빈(여기 이벤트로부터 시간적으로 더 멀어짐)을 발생시킬 수 있다.
도 3은 단계 S11이 단계 S12에 앞서 수행되는 것을 도시하고 있지만, 이것은 단지 예시를 위한 것인데, 이는 단계 S12가 단계 S11에 앞서 수행될 수 있거나, 또는 단계 S11 및 단계 S12가 동시에 수행될 수 있기 때문이다.
도 4는 각각의 혼입 이벤트에 대한 세기 및 시간 파라미터가 2차원 공간에서 포인트로서 플롯될 수 있다는 것을 도시하는데, 이때 세기 및 시간 파라미터는 개개의 축들 상에 있다. 이 예에서, 시간 파라미터는 수평(x) 축 상에서 플롯되고 세기는 수직(y) 축 상에서 플롯된다. 4개의 상이한 표지들이 뉴클레오티드들에 대해 사용될 수 있어, 이 뉴클레오티드들이 세기, 시간 파라미터, 또는 이들 양측 모두에 기초하여 서로 구별될 수 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 각각의 혼입 이벤트에 대해 측정된 세기 및 시간 파라미터를 플롯하면 4개의 뉴클레오티드들 A, C, G 및 T에 대응하는 포인트들의 4개의 클러스터들을 발생시킨다.
단계 S13에서, 포인트들은 그룹들(본 명세서에서는 "클러스터들"라고도 또한 지칭됨)에 할당될 수 있다. 일부 실시예들에서, 클러스터링 알고리즘은 각각의 혼입 이벤트에 대한 포인트들을 4개의 클러스터들 중 하나에 할당하기 위해 포인트들 상에서 실행될 수 있다. 예를 들어, 클러스터링 알고리즘은 n차원 공간에서 펄스들의 k-평균 클러스터링을 수행할 수 있고, 여기서 k는 4(A, C, G, T)이고, n은 베이스 호출을 위해 사용되는 메트릭(metric)들의 수이다. 그러나, 일부 실시예들에서 4개 초과의 클러스터들이 할당될 수 있다. 4개 초과의 클러스터들이 할당되는 경우, k가 4보다 더 큰 클러스터링이 수행될 수 있다. 본 발명자들은, 일부 경우들에서 클러스터들이 잘 분해되지 않을 수 있고, 포인트들을 4개 초과의 클러스터들로 그룹화하는 것이 유리할 수 있다는 것을 인식하고 이해하였다. 그러한 경우에, 하나 초과의 클러스터가 동일한 뉴클레오티드에 할당될 수 있다. 일부 실시예들에서, 이상점(outlier)들인 포인트들을 제거하기 위해 필터링이 수행될 수 있다. 예를 들어, 포인트가 예상 범위의 외측에 있는 시간 파라미터 및/또는 세기를 갖는 경우, 그것은 클러스터링 알고리즘으로부터 배제될 수 있거나 및/또는 어떠한 뉴클레오티드 그룹에도 할당되지 않을 수 있다.
50보다 더 큰 것, 100보다 더 큰 것, 500보다 더 큰 것 등과 같은 임의의 적합한 수의 포인트들이 클러스터링 알고리즘에 제공될 수 있다. 클러스터링 알고리즘의 결과는 각각의 포인트를 4개(또는 그 이상)의 클러스터들 중 하나로 그룹화하는 것이다. 도 4의 예에서, 2개의 메트릭들, 즉, 세기 및 시간 파라미터가 사용되기 때문에, n=2이다. 시간 파라미터로서 세기 및 시간 빈 비율을 갖는 2차원 예가 도 4에 플롯되어 있다. 그러나, 다른 메트릭들이 사용될 수 있다.
다른 2차원 예는 시간 파라미터 및 스펙트럼 파라미터 양측 모두를 획득하는 것을 수반하는데, 이때 세기보다는 오히려 스펙트럼 파라미터가 도 4의 수직(y) 축 상에 있다. 이 예에서, 스펙트럼 정보는 각각의 혼입 이벤트에 대해 방출된 광에 관하여 획득되고, 뉴클레오티드들을 구별하는 데 사용된다.
그러나, 2로 제한되지 않는 임의의 수의 메트릭들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예들에서, 세기 및 시간 파라미터에 부가적으로 혼입 이벤트에 대한 스펙트럼 정보가 획득될 수 있는데, 이는 3차원 공간에서 포인트들로서 플롯될 수 있고, 이때 세기, 시간 파라미터, 및 스펙트럼 정보는 개개의 축들 상에 있다.
포인트들을 그룹화한 후에, 잠재적으로는 초기 그룹화 단계에서 사용된 것보다 더 많은 메트릭들로, 그룹들을 추가로 미세화하는 것이 유익할 수 있다. 이 목적을 위해, 서포트 벡터 머신(support vector machine)(SVM) 또는 다른 감독 분류자가 사용될 수 있다. 클러스터링 표지들은 초기 트레이닝 데이터로서 사용될 수 있다. 이 프로세스는 수렴될 때까지 다음 반복에 대한 트레이닝으로서 분류자의 가장 최근 반복으로부터의 결과들을 사용하여 반복될 수 있다.
클러스터링 알고리즘이 포인트들을 클러스터들에 할당하는 데 사용될 수 있지만, 일부 실시예들에서는 클러스터링 알고리즘을 사용하는 일 없이 포인트들이 그룹들에 할당될 수 있다. 일부 실시예들에서, 포인트들의 그룹들 사이의 경계들은 클러스터링 알고리즘을 실행하는 일 없이 결정될 수 있다.
단계 S14에서, 포인트들의 클러스터들은 뉴클레오티드들에 할당될 수 있다. 이 할당은 표지들의 알려진 특성들에 기초하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 도 4의 플롯에서, T에 대한 표지는 높은 세기 및 가장 낮은 수명을 가지며, A에 대한 표지는 낮은 세기 및 적절한 수명을 가지며, G에 대한 표지는 높은 세기 및 적절한 수명을 가지며, C에 대한 표지는 가장 높은 수명 및 높은 세기를 갖는다는 것이 알려져 있을 수 있다. 포인트들의 클러스터들은 서로에 대한 클러스터들의 포지션을 사용하여 베이스들에 할당될 수 있다. 예를 들어, 가장 낮은 수명을 갖는 클러스터가 T에 할당될 수 있고, 가장 높은 수명을 갖는 클러스터가 C에 할당될 수 있고, 가장 낮은 세기를 갖는 클러스터가 A에 할당될 수 있고, 나머지 클러스터가 G에 할당될 수 있다. 각각의 클러스터에서의 포인트들이 이들의 클러스터의 뉴클레오티드에 할당될 수 있다. 세기 및 시간 특성의 각각의 측정이 수행된 시간에 관한 정보를 저장함으로써, 뉴클레오티드 가닥이 서열분석될 수 있다.
이 방법이 서열분석을 수행하는 데 사용되는 경우, 이 방법은 이 포인트에서 종결될 수 있다. 이 방법이 교정을 위해 사용되는 경우, 이 방법은 단계 S15로 계속될 수 있다. 본 발명자들은, 초기 교정이 수행되는 경우, 모든 포인트들을 뉴클레오티드들에 할당하기 위한 클러스터링 알고리즘을 실행할 필요가 없다는 것을 인식하고 이해하였다. 일부 실시예들에서, 포인트를 뉴클레오티드 타입에 할당하기 위해 교정 기준들이 결정될 수 있다. 예로서, 단계 S13에서의 클러스터링 또는 단계 S14에서의 뉴클레오티드들의 할당 이후에, 상이한 타입들의 뉴클레오티드들 사이의 경계들이 결정될 수 있다. 경계들은 도 5에 예시된 바와 같이 페이즈 공간(phase space)의 영역들을 정의하는 함수들일 수 있다. 페이즈 공간의 축들은 여기 레이저 펄스들의 세기, 시간 파라미터, 방출 파장, 및/또는 여기 파장을 포함할 수 있다. 예로서, 도 5에 도시된 바와 같이, 상이한 뉴클레오티드들 사이의 경계들(51)을 기술하는 2차원 공간에서의 라인 세그먼트들 또는 곡선들이 선택될 수 있다. 보다 높은 차원의 공간에서, 경계들은 표면들 또는 보다 높은 차원의 오브젝트들("초평면들"이라고 불림)일 수 있다. 일단 경계들(51)이 결정된다면, 포인트들은 경계들에 대한 이들의 포지션들을 평가함으로써 뉴클레오티드들에 할당될 수 있고, 클러스터링은 수행될 필요가 없다. 이에 따라, 일부 실시예들에서, 서열분석 기기는 경계들(51)을 기술하도록 교정될 수 있다. 교정 프로세스는 핵산의 서열분석 동안과 동일한 세트의 표지들을 사용하여 수행될 수 있다. 단계 S15에서 교정을 수행하는 다른 예로서, 클러스터들의 중심들이 결정될 수 있는데, 이는 어떤 클러스터가 개별 포인트에 가장 가까운 중심을 갖는지에 기초하여 포인트들을 뉴클레오티드들에 할당하는 것을 가능하게 할 수 있다. 결정되는 교정 기준들의 타입에 관계없이, 교정 기준들은 그 후에 추후의 사용을 위해 (예를 들어, 기기의 메모리에) 저장된다.
임의의 적합한 시간에 교정이 수행될 수 있다. 일부 실시예들에서, 기기를 우선 사용하기에 앞서, 새로운 세트의 표지들의 사용 시에, 기기가 사용되는 환경 조건들의 변경 시에, 또는 기기의 컴포넌트들의 노후화를 고려한 사용 주기 이후에 교정이 바람직할 수 있다. 교정은 사용자로부터의 요청에 응답하여, 예컨대 기기 상의 버튼을 누르는 것 또는 다른 디바이스로부터 기기로 교정 커맨드를 전송하는 것에 의해, 또는 자동으로 스케줄에 기초하여 또는 성능이 최적이 아니라고 결정하는 기기 소프트웨어에 응답하여 필요에 따라 수행될 수 있다. 일단 교정 기준들이 획득된다면, 교정 기준들과 관련하여 검출된 포인트들을 평가함으로써 서열분석이 더 신속하게 수행될 수 있다.
도 6은 하나 이상의 교정 기준에 기초하여 뉴클레오티드들을 식별하기 위해 베이스 호출자에 의해 사용될 수 있는 알고리즘의 흐름도를 도시한다. 광의 파라미터들(예를 들어, 세기 및 시간 파라미터)은 단계 S11 및 단계 S12에서 결정될 수 있는데, 이는 도 3에 도시된 것들과 동일할 수 있고, 단계 S11 및 단계 S12는, 상기에 논의된 바와 같이, 임의의 순서로 수행될 수 있다. 단계 S33에서, 뉴클레오티드들은 저장된 교정 정보를 사용하여 광의 측정된 파라미터들(예를 들어, 세기 및 시간 파라미터)을 평가함으로써 식별될 수 있다. 예를 들어, 저장된 교정 정보가 뉴클레오티드 클러스터들 사이의 하나 이상의 경계를 포함하는 경우, 포인트들을 경계들과 비교함으로써 포인트들이 뉴클레오티드들에 할당될 수 있는데, 이는 클러스터링을 수행하는 것보다 더 계산적으로 효율적이다. 다른 예로서, 뉴클레오티드 클러스터들의 4개의 중심들 각각에 대한 포인트의 거리를 계산한 후에, 가장 가까운 중심을 갖는 뉴클레오티드에 포인트를 할당함으로써, 포인트들이 뉴클레오티드들에 할당될 수 있다. 이 기법은 도 7에 예시되어 있는데, 이 도 7은 측정된 세기 및 시간 파라미터를 나타내는 포인트(61)를 도시한다. 또한 도 6에는 4개의 뉴클레오티드들에 대응하는 표지들의 중심들이 도시되어 있다. 어떤 중심이 가장 가까운지를 결정하기 위해, 포인트(61)로부터 4개의 중심들 각각까지의 거리가 계산될 수 있고, 중심이 포인트(61)로부터 가장 짧은 거리가 되는 뉴클레오티드가 포인트(61)에 할당된다. 도시된 바와 같이, 포인트(61)는 뉴클레오티드 "A"에 대응하는 표지에 대해 중심에 가장 가깝다. 이에 따라, 포인트(61)는 뉴클레오티드 "A"에 대응하는 것으로 결정된다.
일부 실시예들에서, 뉴클레오티드들을 식별하는 것은, 혼입 이벤트들과 연관된 포인트들의 제1 부분 상에서 클러스터링을 수행하는 것 그리고 포인트들의 제2 부분 상에서 베이스 호출들을 수행하기 위해 교정 기준들을 사용하는 것을 포함한다. 제1 부분은, 교정 기준들에서 원하는 레벨의 정확도를 제공하기 위한 임의의 적합한 수의 포인트들을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에서, 포인트가 특정 타입의 뉴클레오티드에 대응하는 신뢰성 레벨(confidence level)이 결정될 수 있다. 예로서, 도 5에 도시된 중심들과 같은, 영역의 중심으로부터의 포인트의 거리는 포인트에 대한 신뢰성 레벨을 결정하는 데 사용될 수 있다. 중심에 대해 짧은 거리를 갖는 포인트들은 포인트가 뉴클레오티드에 대응하는 것으로서 올바르게 식별될 가능성이 매우 높음을 표시하는 높은 신뢰성 레벨을 가질 수 있는 한편, 중심으로부터 더 멀리 있는 거리를 갖거나, 또는 하나의 중심에 대해 다른 것보다 거의 더 가깝지 않은 포인트들은 올바르게 식별될 가능성이 보다 적다. 이 예에서, 신뢰성 레벨은 포인트와 중심 사이의 거리에 기초하여, 또는 포인트와 중심 사이의 거리를 포인트와 하나 이상의 다른 중심 사이의 거리와 비교하는 것에 기초하여 정량화될 수 있다. 다른 예로서, 교정 기준들이 클러스터들 사이의 하나 이상의 경계를 포함하는 경우, 신뢰성 레벨은 포인트와 하나 이상의 경계 사이의 거리를 결정함으로써 정량화될 수 있다. 경계에 보다 가까운 포인트들은 보다 낮은 신뢰성 레벨이 제공될 수 있다. 일부 실시예들에서, 각각의 뉴클레오티드 식별물에 대한 신뢰성 레벨은 뉴클레오티드 식별물 자체를 저장하는 것에 부가적으로 저장될 수 있다.
일부 실시예들에서, 신뢰성 레벨은 교정 기준들 및 그 교정 기준들이 교정 데이터에 얼마나 잘 피팅하는지에 의존한다. 교정 기준들이 교정 데이터에 더 정확하게 피팅할수록, 상이한 포인트들에 대한 신뢰성 레벨들이 높아질 수 있다.
일부 실시예들에서, 신뢰성 레벨은 펄스 호출자에 의해 식별된 펄스의 신호 대 잡음비에 의존할 수 있기 때문에, 신뢰성 레벨은 포인트와 연관된 혼입 이벤트의 시간 지속기간에 의존할 수 있다. 예로서, 긴 시간 지속기간은, 펄스 호출자가 동일한 뉴클레오티드 타입의 혼입 이벤트들과 같은 2개의 후속 혼입 이벤트들을 식별하지 못했음을 표시할 수 있다. 일부 실시예들에서, 베이스 호출자는 펄스 호출자와 통신하여 펄스 호출자가 혼입 이벤트의 시간 지속기간을 재평가하도록 요청할 수 있다.
일부 실시예들에서, 이전에 유도된 경계들(예를 들어, SVM 모델)이 새로운 펄스 호출들에 적용되어 각각의 펄스 호출 이벤트에서 혼입되는 적절한 뉴클레오티드를 결정할 수 있다. 펄스 호출 메트릭들이 우선 스케일링된 후에, 이전에 유도된 경계들이 적용되어 그 혼입 이벤트를 분류할 수 있다.
다수의 픽셀들로부터의 펄스 호출 데이터에 걸쳐 일반화되는 경계들을 유도하기 위해, 어레이에서의 각각의 픽셀로부터의 펄스 호출 데이터의 각각의 세트를, 이들 데이터를 교정 데이터 세트에 포함하기에 앞서, 스케일링(또는 정규화)할 필요가 있을 수 있다. 세기에 대해서만 클러스터링하고 세기의 평균 또는 중앙치로서 이들 클러스터들 중 하나 이상을 사용함으로써 세기 메트릭을 스케일링함으로써, 모든 인커밍 펄스 호출들의 세기 메트릭을 정규화할 수 있다. 이 스케일링 또는 정규화는 교정 페이즈 동안뿐만 아니라, 저장된 교정 데이터를 사용하는 베이스 호출 페이즈 동안 양측 모두에서 적용된다. 이것은 어레이에서의 각각의 픽셀에 대해 경계들이 생성되기를 요구하지 않는다는 이익을 갖는데, 이는 성능 개선이고, 모든 데이터가 전형적으로 RAM에 한 번에 피팅되지 않을 수 있는 매우 큰 어레이들로 스케일링하는 것을 가능하게 한다. 추가의 이익은 런타임의 감소인데, 이는 보다 작은 수의 펄스들이 세기에 의해 분리되고 교정 데이터 세트에 대해 스케일링 또는 정규화될 필요가 있을 것이기 때문이다. 이 접근법은 또한, 스케일링 또는 정규화 인자들을 확립하기에 앞서, 보다 적은 펄스들이 저장 및 그룹화되는 것을 가능하게 하여, 따라서 데이터가 픽셀 어레이로부터 취득될 때 거의 실시간으로 베이스 호출들을 출력하는 것을 가능하게 한다.
서열분석 기기의 서열분석 및/또는 교정을 수행하기 위해 펄스 호출자 및 베이스 호출자에 의해 구현될 수 있는 기법들을 설명하였지만, 적합한 서열분석 기기의 예가 이제 설명될 것이다. 일부 실시예들에서, 기기는 픽셀들의 어레이를 포함하는 집적 디바이스와 인터페이싱하도록 구성된다. 집적 디바이스의 표면은 복수의 샘플 웰들을 가지며, 여기서 샘플 웰은 집적 디바이스의 표면 상에 배치되는 표본으로부터의 샘플을 수용하도록 구성된다. 표본은 다수의 샘플들을, 그리고 일부 실시예들에서는, 상이한 타입들의 표본들을 함유할 수 있다. 복수의 샘플 웰들은 샘플 웰들의 적어도 일부분이 표본으로부터의 하나의 샘플을 수용하도록 적합한 사이즈 및 형상을 가질 수 있다. 일부 실시예들에서, 샘플 웰 내의 샘플들의 수가 샘플 웰들 간에 분포될 수 있어서, 일부 샘플 웰들은 하나의 샘플을 함유하는데, 이때 다른 것들은 제로, 2개 또는 그 이상의 샘플들을 함유한다.
일부 실시예들에서, 표본은 다수의 단일 가닥 DNA 주형들을 함유할 수 있고, 집적 디바이스의 표면 상의 개별 샘플 웰들은 단일 가닥 DNA 주형을 수용하기 위해 사이징 및 형상화될 수 있다. 단일 가닥 DNA 주형들은 집적 디바이스의 샘플 웰들 중 적어도 일부분이 단일 가닥 DNA 주형을 함유하도록 집적 디바이스의 샘플 웰들 간에 분포될 수 있다. 표본은 또한 태깅된 dNTP들을 함유할 수 있는데, 이 태깅된 dNTP들은 그 후에 샘플 웰에 진입하고 뉴클레오티드가 샘플 웰에서의 단일 가닥 DNA 주형에 상보적인 DNA의 가닥에 혼입될 때 그 뉴클레오티드의 식별을 가능하게 할 수 있다. 그러한 예에서, "샘플"은 폴리메라아제에 의해 현재 혼입되는 태깅된 dNTP와 단일 가닥 DNA 양측 모두를 지칭할 수 있다. 일부 실시예들에서, 표본은 단일 가닥 DNA 주형들을 함유할 수 있고, 샘플 웰 내의 DNA의 상보적인 가닥에 뉴클레오티드들이 혼입될 때 태깅된 dNTP들이 샘플 웰에 후속하여 도입될 수 있다. 이러한 방식으로, 뉴클레오티드들의 혼입의 타이밍은 태깅된 dNTP들이 집적 디바이스의 샘플 웰들에 도입될 때 제어될 수 있다.
여기 에너지는 집적 디바이스의 픽셀 어레이로부터 분리되어 위치된 여기 소스로부터 제공된다. 여기 에너지는 샘플 웰 내의 조명 영역을 조명하기 위해 하나 이상의 픽셀을 향해 적어도 부분적으로 집적 디바이스의 요소들에 의해 지향된다. 그 후에, 표지는 조명 영역 내에 위치될 때 그리고 여기 에너지에 의해 조명되는 것에 응답하여 방출 에너지를 방출할 수 있다. 일부 실시예들에서, 하나 이상의 여기 소스는, 집적 디바이스 및 기기의 컴포넌트들이 하나 이상의 픽셀을 향해 여기 에너지를 지향시키도록 구성되는 시스템의 기기의 일부이다.
그 후에, 샘플에 의해 방출되는 방출 에너지는 집적 디바이스의 픽셀 내에서 하나 이상의 센서에 의해 검출될 수 있다. 검출된 방출 에너지의 특성들은 방출 에너지와 연관된 마킹을 식별하기 위한 표시를 제공할 수 있다. 그러한 특성들은, 센서에 의해 검출되는 광자들의 도달 시간, 센서에 의해 시간에 걸쳐 누적된 광자들의 양, 및/또는 2개 이상의 센서들에 걸친 광자들의 분포를 포함하는 임의의 적합한 타입의 특성을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 센서는 샘플의 방출 에너지(예를 들어, 형광 수명)와 연관된 하나 이상의 타이밍 특성의 검출을 가능하게 하는 구성을 가질 수 있다. 센서는 여기 에너지의 펄스가 집적 디바이스를 통해 전파된 후의 광자 도달 시간들의 분포를 검출할 수 있고, 도달 시간들의 분포는 샘플의 방출 에너지의 타이밍 특성(예를 들어, 형광 수명에 대한 프록시)의 표시를 제공할 수 있다. 일부 실시예들에서, 하나 이상의 센서는 표지에 의해 방출되는 방출 에너지의 확률(예를 들어, 형광 세기)의 표시를 제공한다. 일부 실시예들에서, 복수의 센서들은 방출 에너지의 공간 분포를 캡처하도록 사이징 및 배열될 수 있다. 그 후에, 하나 이상의 센서로부터의 출력 신호들은 복수의 표지들 간에서 표지를 구별하는 데 사용될 수 있고, 여기서 복수의 표지들은 표본 내의 샘플을 식별하는 데 사용될 수 있다.
시스템(2-100)의 개략도 개관이 도 2aa 및 도 2ab에 예시되어 있다. 시스템은, 기기(2-104)와 인터페이싱하는 집적 디바이스(2-102)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 기기(2-104)는, 기기(2-104)의 일부로서 집적된 하나 이상의 여기 소스(2-106)를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 여기 소스는 기기(2-104) 및 집적 디바이스(2-102) 양측 모두의 외부에 있을 수 있고, 기기(2-104)는 여기 소스로부터 여기 에너지를 수신하고 그것을 집적 디바이스로 지향시키도록 구성될 수 있다. 집적 디바이스는, 집적 디바이스를 수용하고 그것을 여기 소스와의 정밀한 광학 정렬로 홀딩하기 위한 임의의 적합한 소켓을 사용하여 기기와 인터페이싱할 수 있다. 여기 소스(2-106)는 집적 디바이스(2-102)에 여기 에너지를 제공하도록 구성될 수 있다. 도 2ab에 개략적으로 예시된 바와 같이, 집적 디바이스(2-102)는 다수의 픽셀들을 가지며, 여기서 픽셀들(2-112)의 적어도 일부분은 샘플의 독립적인 분석을 수행할 수 있다. 그러한 픽셀들(2-112)은 "수동 소스 픽셀들"이라고 지칭될 수 있는데, 이는 픽셀이 픽셀로부터 분리된 소스(2-106)로부터 여기 에너지를 수신하기 때문이고, 여기서 소스는 복수의 픽셀들을 여기시킨다. 픽셀(2-112)은, 샘플을 수용하도록 구성되는 샘플 웰(2-108), 및 여기 소스(2-106)에 의해 제공된 여기 에너지로 샘플을 조명하는 것에 응답하여 샘플에 의해 방출되는 방출 에너지를 검출하기 위한 센서(2-110)를 갖는다. 샘플 웰(2-108)은 샘플에의 여기 에너지의 전달 및 샘플로부터의 방출 에너지의 검출에 있어서의 용이성을 제공하기 위해 집적 디바이스(2-102)의 표면에 근접하게 샘플을 보유할 수 있다.
샘플 웰(2-108)에 여기 에너지를 가이드하고 커플링시키기 위한 광학 요소들은 집적 디바이스(2-102) 및 기기(2-104) 양측 모두 상에 위치된다. 그러한 소스 대 웰 요소(source-to-well element)들은, 여기 에너지를 집적 디바이스에 커플링시키기 위해 집적 디바이스(2-102) 상에 위치되는 하나 이상의 격자 커플러, 및 기기(2-104)로부터의 여기 에너지를 픽셀들(2-112)에서의 샘플 웰들에 전달하기 위한 도파관들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 집적 디바이스 상에 위치되는 요소들은 샘플 웰로부터의 방출 에너지를 센서를 향해 지향시키도록 작용할 수 있다. 샘플 웰(2-108), 여기 소스 대 웰 옵틱들의 일부분, 및 샘플 웰 대 센서 옵틱들은 집적 디바이스(2-102) 상에 위치된다. 여기 소스(2-106) 및 소스 대 웰 컴포넌트들의 일부분은 기기(2-104)에 위치된다. 일부 실시예들에서, 단일 컴포넌트는 여기 에너지를 샘플 웰(2-108)에 커플링하는 것 그리고 샘플 웰(2-108)로부터의 방출 에너지를 센서(2-110)에 전달하는 것 양측 모두의 역할을 할 수 있다. 집적 디바이스에 포함시키기 위해, 여기 에너지를 샘플 웰에 커플링하거나 및/또는 방출 에너지를 센서에 지향시키기 위한 적합한 컴포넌트들의 예들이, 발명의 명칭이 "INTEGRATED DEVICE FOR PROBING, DETECTING AND ANALYZING MOLECULES"인 미국 특허 출원 제14/821,688호, 및 발명의 명칭이 "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING, DETECTING, AND ANALYZING MOLECULES"인 미국 특허 출원 제14/543,865호에 설명되어 있고, 이 미국 특허 출원들 양측 모두는 그 전체가 참조로 포함된다.
도 2ab에 예시된 바와 같이, 집적 디바이스는 복수의 픽셀들을 포함하고, 여기서 픽셀(2-112)은 그 자신의 개별 샘플 웰(2-108) 및 적어도 하나의 센서(2-110)와 연관된다. 복수의 픽셀들은 어레이에 배열될 수 있고, 어레이에 임의의 적합한 수의 픽셀들이 있을 수 있다. 집적 디바이스(2-102)에서의 픽셀들의 수는 대략 10,000개의 픽셀들 내지 1,000,000개의 픽셀들의 범위에 있거나 또는 그 범위 내의 임의의 값 또는 값들의 범위일 수 있다. 일부 실시예들에서, 픽셀들은 512개의 픽셀들 × 512개의 픽셀들의 어레이에 배열될 수 있다. 집적 디바이스(2-102) 및 기기(2-104)는, 대형 픽셀 어레이들(예를 들어, 10,000개 초과의 픽셀들)과 연관된 데이터를 핸들링하기 위한 멀티-채널, 고속 통신 링크들을 포함할 수 있다.
기기(2-104)는 집적 디바이스 인터페이스(2-114)를 통해 집적 디바이스(2-102)와 인터페이싱한다. 집적 디바이스 인터페이스(2-114)는, 여기 소스(2-106)로부터의 여기 에너지를 집적 디바이스(2-102)에 커플링하는 것을 개선시키기 위해 집적 디바이스(2-102)를 기기(2-104)에 포지셔닝 및/또는 정렬시키기 위한 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 여기 소스(2-106)는, 적어도 하나의 샘플 웰에 여기 에너지를 전달하도록 배열되는 임의의 적합한 광 소스일 수 있다. 적합한 여기 소스들의 예들이, 발명의 명칭이 "INTEGRATED DEVICE FOR PROBING, DETECTING AND ANALYZING MOLECULES"인 미국 특허 출원 제14/821688호에 설명되어 있고, 이 미국 특허 출원은 그 전체가 참조로 포함된다. 일부 실시예들에서, 여기 소스(2-106)는, 여기 에너지를 집적 디바이스(2-102)에 전달하도록 결합되는 다수의 여기 소스들을 포함한다. 다수의 여기 소스들은 다수의 여기 에너지들 또는 파장들을 생성하도록 구성될 수 있다. 집적 디바이스 인터페이스(2-114)는 집적 디바이스 상에 위치되는 픽셀들에서의 센서들로부터 판독 신호들을 수신할 수 있다. 집적 디바이스 인터페이스(2-114)는 집적 디바이스를 집적 디바이스 인터페이스(2-114)에 고정시킴으로써 집적 디바이스가 기기에 부착되도록 설계될 수 있다.
기기(2-104)는, 기기(2-104)의 동작을 제어하기 위한 사용자 인터페이스(2-116)를 포함한다. 사용자 인터페이스(2-116)는, 사용자로 하여금, 기기의 기능을 제어하는 데 사용되는 커맨드들 및/또는 설정들과 같은 정보를 기기에 입력하게 하도록 구성된다. 일부 실시예들에서, 사용자 인터페이스(2-116)는, 음성 커맨드들을 위한 버튼들, 스위치들, 다이얼들, 및 마이크로폰을 포함할 수 있다. 부가적으로, 사용자 인터페이스(2-116)는, 사용자로 하여금, 집적 디바이스 상의 센서들로부터의 판독 신호들에 의해 획득되는 적절한 정렬 및/또는 정보와 같은, 기기 및/또는 집적 디바이스의 성능에 대한 피드백을 수신하게 할 수 있다. 일부 실시예들에서, 사용자 인터페이스(2-116)는 청각 피드백을 제공하기 위한 스피커, 및 시각 피드백을 제공하기 위한 표시자 광들 및/또는 디스플레이 스크린을 사용하여 피드백을 제공할 수 있다. 일부 실시예들에서, 기기(2-104)는, 컴퓨팅 디바이스(2-120)와 연결하는 데 사용되는 컴퓨터 인터페이스(2-118)를 포함한다. 임의의 적합한 컴퓨터 인터페이스(2-118) 및 컴퓨팅 디바이스(2-120)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 인터페이스(2-118)는 USB 인터페이스 또는 파이어와이어(FireWire) 인터페이스일 수 있다. 컴퓨팅 디바이스(2-120)는 랩톱 또는 데스크톱 컴퓨터와 같은 임의의 범용 컴퓨터일 수 있다. 컴퓨터 인터페이스(2-118)는 기기(2-104)와 컴퓨팅 디바이스(2-120) 사이의 정보의 통신을 용이하게 한다. 기기(2-104)를 제어 및/또는 구성하기 위한 입력 정보는 기기의 컴퓨터 인터페이스(2-118)에 연결되는 컴퓨팅 디바이스(2-120)를 통해 제공될 수 있다. 출력 정보는 컴퓨터 인터페이스(2-118)를 통해 컴퓨팅 디바이스(2-120)에 의해 수신될 수 있다. 그러한 출력 정보는, 센서(2-110)의 판독 신호들로부터의 정보 및 기기(2-104) 및/또는 집적 디바이스(2-112)의 성능에 관한 피드백을 포함할 수 있다. 기기(2-104)는 또한, 센서(2-110)로부터 수신된 데이터를 분석하거나 및/또는 여기 소스(2-106)에 제어 신호들을 전송하기 위한 프로세싱 디바이스(2-122)를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 프로세싱 디바이스(2-122)는 범용 프로세서, 특수 적응 프로세서(예를 들어, 하나 이상의 마이크로프로세서 또는 마이크로제어기 코어와 같은 중앙 프로세싱 유닛(CPU), 필드 프로그래밍가능 게이트 어레이(FPGA), 주문형 집적 회로(ASIC), 커스텀 집적 회로, 디지털 신호 프로세서(DSP), 또는 이들의 조합)를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 센서(2-110)로부터의 데이터의 프로세싱은 프로세싱 디바이스(2-122) 및 외부 컴퓨팅 디바이스(2-120) 양측 모두에 의해 수행될 수 있다. 다른 실시예들에서, 컴퓨팅 디바이스(2-120)는 생략될 수 있고 센서(2-110)로부터의 데이터의 프로세싱은 프로세싱 디바이스(2-122)에 의해서만 단독으로 수행될 수 있다.
픽셀들의 로우를 예시하는 집적 디바이스(3-102)의 단면 개략도가 도 3aa에 도시되어 있다. 각각의 픽셀(3-112)은 샘플 웰(3-108) 및 센서(3-110)를 포함한다. 센서(3-110)가 샘플 웰(3-112) 내의 샘플에 의해 방출된 방출 에너지를 수신하도록 센서(3-110)는 샘플 웰(3-112)에 정렬 및 포지셔닝될 수 있다. 적합한 센서들의 예들이, 발명의 명칭이 "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS"인 미국 특허 출원 제14/821,656호에 설명되어 있고, 이 미국 특허 출원은 그 전체가 참조로 포함된다.
집적 디바이스에 커플링되는 여기 소스는 집적 디바이스(3-102)의 하나 이상의 픽셀에 여기 에너지를 제공할 수 있다. 도 3ab는 여기 소스(3-106)를 집적 디바이스(3-102)에 커플링하여 집적 디바이스(3-102)에 여기 에너지(3-130)(파선들로 도시됨)를 제공하는 것을 예시하는 개략도이다. 도 3ab는 여기 에너지 소스(3-106)로부터 픽셀(3-112)에서의 샘플 웰(3-108)로의 여기 에너지의 경로를 예시한다. 집적 디바이스 밖에 위치된 컴포넌트들이 사용되어 여기 소스(3-106)을 집적 디바이스에 포지셔닝 및 정렬할 수 있다. 그러한 컴포넌트들은, 렌즈들, 미러들, 프리즘들, 애퍼처들, 감쇠기들, 및/또는 광섬유들을 포함하는 광학 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 정렬 컴포넌트의 제어를 가능하게 하기 위한 부가적인 기계적 컴포넌트들이 기기에 포함될 수 있다. 그러한 기계적 컴포넌트들은 액추에이터들, 스테퍼 모터들, 및/또는 노브들을 포함할 수 있다.
집적 디바이스는, 집적 디바이스에서의 픽셀들을 향해 여기 에너지(3-130)를 지향시키는 컴포넌트들을 포함한다. 각각의 픽셀(3-112) 내에서, 여기 에너지는 픽셀과 연관된 샘플 웰(3-108)에 커플링된다. 도 3ab는 픽셀들의 로우에서의 각각의 샘플 웰에 커플링되는 여기 에너지를 예시하고 있지만, 일부 실시예들에서, 여기 에너지는 로우에서의 모든 픽셀들에 커플링되지 않을 수 있다. 일부 실시예들에서, 여기 에너지는 집적 디바이스의 픽셀들의 로우에서의 픽셀들 또는 샘플 웰들의 일부분에 커플링될 수 있다. 여기 에너지는 샘플 웰 내에 위치된 샘플을 조명할 수 있다. 샘플은 여기 에너지에 의해 조명되는 것에 응답하여 여기 상태에 도달할 수 있다. 샘플이 여기 상태에 있을 때, 샘플은 방출 에너지를 방출할 수 있고, 방출 에너지는 센서에 의해 검출될 수 있다. 도 3ab는 샘플 웰(3-108)로부터 픽셀(3-112)의 센서(3-110)로의 방출 에너지(3-140)(실선들로 도시됨)의 경로를 개략적으로 예시한다. 픽셀(3-112)에서의 센서(3-110)는 샘플 웰(3-108)로부터의 방출 에너지를 검출하도록 구성 및 포지셔닝될 수 있다. 일부 실시예들에서, 센서(3-110)는 다수의 서브-센서들을 포함할 수 있다.
분석될 샘플은 픽셀(3-112)의 샘플 웰(3-108)에 도입될 수 있다. 샘플은 생물학적 샘플 또는 화학적 샘플과 같은 임의의 다른 적합한 샘플일 수 있다. 샘플은 다수의 분자들을 포함할 수 있고, 샘플 웰은 단일 분자를 분리하도록 구성될 수 있다. 일부 경우들에서, 샘플 웰의 치수들은 샘플 웰 내에서 단일 분자를 한정하도록 작용하여, 측정들이 단일 분자 상에서 수행되게 할 수 있다. 여기 소스(3-106)는 샘플 또는 샘플에 부착된 적어도 하나의 발광 마커를 여기시키도록 샘플 웰(3-108)에 여기 에너지를 전달하도록 구성될 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 샘플이 샘플 웰(3-108) 내의 조명 구역 내에 있는 동안 샘플과 연관될 수 있다.
여기 소스가 샘플 웰에 여기 에너지를 전달할 때, 웰 내의 적어도 하나의 샘플이 발광할 수 있고, 결과적인 방출이 센서에 의해 검출될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "샘플이 발광할 수 있다" 또는 "샘플이 방사선을 방출할 수 있다" 또는 "샘플로부터의 방출"이라는 어구들은, 발광 태그, 마커, 또는 리포터, 샘플 그 자체, 또는 샘플과 연관된 반응 생성물이 방출된 방사선을 생성할 수 있다는 것을 의미한다.
집적 디바이스의 하나 이상의 컴포넌트는 방출 에너지를 센서를 향해 지향시킬 수 있다. 방출 에너지 또는 에너지들은 센서에 의해 검출되고 적어도 하나의 전기 신호로 변환될 수 있다. 전기 신호들은 도 2ab에 도시된 기기(2-104)의 집적 디바이스 인터페이스(2-114)와 같은 집적 디바이스 인터페이스를 통해 기기에 연결되는 집적 디바이스의 회로부에서의 전도 라인들을 따라 송신될 수 있다. 전기 신호들은 후속하여 프로세싱 및/또는 분석될 수 있다. 전기 신호들의 프로세싱 또는 분석은, 도 2ab에 도시된 컴퓨팅 디바이스(2-120)와 같은, 기기(2-104) 상에 또는 기기 밖에 위치된 적합한 컴퓨팅 디바이스 상에서 발생할 수 있다.
동작 시에, 샘플 웰들 내의 샘플들의 병렬 분석들은 여기 소스를 사용하여 웰들 내의 샘플들을 여기시키고 센서들로 샘플 방출로부터의 신호들을 검출함으로써 수행된다. 샘플로부터의 방출 에너지는 대응하는 센서에 의해 검출되고 적어도 하나의 전기 신호로 변환될 수 있다. 결과적인 신호 또는 신호들은 일부 실시예들에서 집적 디바이스 상에서 프로세싱되거나, 또는 프로세싱 디바이스 및/또는 컴퓨팅 디바이스에 의한 프로세싱을 위해 기기로 송신될 수 있다. 샘플 웰로부터의 신호들은 다른 픽셀들과 연관된 신호들과 독립적으로 수신 및 프로세싱될 수 있다.
일부 실시예들에서, 샘플은 하나 이상의 마커로 표지될 수 있고, 마커들과 연관된 방출은 기기에 의해 구별가능하다. 예를 들어, 센서는 특정 마커로부터의 방출 에너지에 의존하는 수명을 구별하는 데 사용될 수 있는 전기 신호를 형성하기 위해 방출 에너지로부터의 광자들을 전자들로 변환하도록 구성될 수 있다. 샘플들을 표지하기 위해 상이한 수명들을 갖는 마커들을 사용함으로써, 센서에 의해 검출된 결과적인 전기 신호에 기초하여 특정 샘플들이 식별될 수 있다.
샘플은 다수의 타입들의 분자들을 함유할 수 있고 상이한 발광 마커들은 분자 타입과 고유하게 연관될 수 있다. 여기 동안 또는 그 이후에, 발광 마커는 방출 에너지를 방출할 수 있다. 방출 에너지의 하나 이상의 특성은 샘플에서의 하나 이상의 타입의 분자들을 식별하는 데 사용될 수 있다. 분자들의 타입들 간을 구별하는 데 사용되는 방출 에너지의 특성들은 형광 수명 값, 세기, 및/또는 방출 파장을 포함할 수 있다. 센서는 방출 에너지의 광자들을 포함하는 광자들을 검출할 수 있고, 이들 특성들 중 하나 이상을 표시하는 전기 신호들을 제공할 수 있다. 일부 실시예들에서, 센서로부터의 전기 신호들은 하나 이상의 시간 간격에 걸쳐 광자 도달 시간들의 분포에 관한 정보를 제공할 수 있다. 광자 도달 시간들의 분포는 여기 에너지의 펄스가 여기 소스에 의해 방출된 후에 광자가 검출될 때에 대응할 수 있다. 시간 간격에 대한 값은 시간 간격 동안 검출된 광자들의 수에 대응할 수 있다. 다수의 시간 간격들에 걸친 상대 값들은 방출 에너지의 시간 특성(예를 들어, 수명)의 표시를 제공할 수 있다. 샘플을 분석하는 것은, 분포 내의 2개 이상의 상이한 시간 간격들에 대한 값들을 비교함으로써 마커들 간을 구별하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 세기의 표시는 분포에서 모든 시간 빈들에 걸쳐 광자들의 수를 결정함으로써 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "핵산"이라는 용어는 일반적으로, 하나 이상의 핵산 서브유닛을 포함하는 분자를 지칭한다. 핵산은, 아데노신(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U), 또는 이들의 변이체들로부터 선택되는 하나 이상의 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 또는 이들의 유도체들이다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 원형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "뉴클레오티드"라는 용어는 일반적으로, A, C, G, T 또는 U, 또는 이들의 변이체들 또는 유사체들을 포함할 수 있는 핵산 서브유닛을 지칭한다. 뉴클레오티드는, 성장하는 핵산 가닥에 혼입될 수 있는 임의의 서브유닛을 포함할 수 있다. 그러한 서브유닛은, A, C, G, T, 또는 U, 또는 하나 이상의 상보적인 A, C, G, T 또는 U에 특정되거나, 또는 퓨린(즉, A 또는 G, 또는 이들의 변이체 또는 유사체들) 또는 피리미딘(즉, C, T 또는 U, 또는 이들의 변이체 또는 유사체들)에 상보적인 임의의 다른 서브유닛일 수 있다.
뉴클레오티드는 일반적으로 뉴클레오시드 및 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상의 포스페이트(PO3) 그룹들을 포함한다. 뉴클레오티드는 핵염기, 5-탄소 당(리보스 또는 데옥시리보스), 및 하나 이상의 포스페이트 그룹을 포함할 수 있다. 리보뉴클레오티드들은, 당이 리보스인 뉴클레오티드들이다. 데옥시리보뉴클레오티드들은, 당이 데옥시리보스인 뉴클레오티드들이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 모노포스페이트 또는 뉴클레오시드 폴리포스페이트일 수 있다. 뉴클레오티드는, 검출가능한 표지들(예를 들어, 형광단들)을 포함하는, 예를 들어, 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP) 및 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP) dNTP들로부터 선택될 수 있는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트와 같은 데옥시리보뉴클레오시드 폴리포스페이트일 수 있다.
일부 실시예들에서, 본 명세서에 설명된 기법들은 하나 이상의 컴퓨팅 디바이스를 사용하여 수행될 수 있다. 실시예들은 임의의 특정 타입의 컴퓨팅 디바이스로 동작하는 것으로 제한되지 않는다.
도 8은 예시적인 컴퓨팅 디바이스(1000)의 블록도이다. 컴퓨팅 디바이스(1000)는 하나 이상의 프로세서(1001) 및 하나 이상의 유형(tangible)의 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체(예를 들어, 메모리(1003))을 포함할 수 있다. 메모리(1003)는, 실행될 때, 상술된 기능성 중 임의의 것을 구현하는 컴퓨터 프로그램 명령어들을 유형의 비일시적 컴퓨터 기록가능 매체에 저장할 수 있다. 프로세서(들)(1001)는 메모리(1003)에 커플링될 수 있고, 그러한 컴퓨터 프로그램 명령어들을 실행하여 기능성이 실현 및 수행되게 할 수 있다.
컴퓨팅 디바이스(1000)는, 컴퓨팅 디바이스가 (예를 들어, 네트워크를 통해) 다른 컴퓨팅 디바이스들과 통신할 수 있게 하는 네트워크 입/출력(I/O) 인터페이스(1005)를 또한 포함할 수 있고, 컴퓨팅 디바이스가 출력을 사용자에게 제공할 수 있게 하고 입력을 사용자로부터 수신할 수 있게 하는 하나 이상의 사용자 I/O 인터페이스(1007)을 또한 포함할 수 있다. 사용자 I/O 인터페이스들은 키보드, 마우스, 마이크로폰, 디스플레이 디바이스(예를 들어, 모니터 또는 터치 스크린), 스피커들, 카메라, 및/또는 다양한 다른 타입들의 I/O 디바이스들과 같은 디바이스들을 포함할 수 있다.
상술된 실시예들은 수많은 방식들 중 임의의 것으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 실시예들은 하드웨어, 소프트웨어 또는 이들의 조합을 사용하여 구현될 수 있다. 소프트웨어로 구현될 때, 소프트웨어 코드는, 단일 컴퓨팅 디바이스에 제공되든 또는 다수의 컴퓨팅 디바이스들 간에 분산되든 간에, 임의의 적합한 프로세서(예를 들어, 마이크로프로세서) 또는 프로세서들의 집합 상에서 실행될 수 있다. 상술한 기능들을 수행하는 임의의 컴포넌트 또는 컴포넌트들의 집합은 상기에 논의된 기능들을 제어하는 하나 이상의 제어기로서 일반적으로 간주될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하나 이상의 제어기는 수많은 방식들로, 예컨대 상기에 언급된 기능들을 수행하기 위해 마이크로코드 또는 소프트웨어를 사용하여 프로그래밍되는 범용 하드웨어(예를 들어, 하나 이상의 프로세서)로, 또는 전용 하드웨어로 구현될 수 있다.
이와 관련하여, 본 명세서에 설명된 실시예들의 하나의 구현은, 하나 이상의 프로세서 상에서 실행될 때, 하나 이상의 실시예의 상기에 논의된 기능들을 수행하는 컴퓨터 프로그램(즉, 복수의 실행가능 명령어들)으로 인코딩되는 적어도 하나의 컴퓨터 판독가능 저장 매체(예를 들어, RAM, ROM, EEPROM, 플래시 메모리 또는 다른 메모리 기술, CD-ROM, 디지털 다기능 디스크들(DVD) 또는 다른 광 디스크 스토리지, 자기 카세트들, 자기 테이프, 자기 디스크 스토리지 또는 다른 자기 스토리지 디바이스들, 또는 다른 유형의 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체)를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 컴퓨터 판독가능 매체는 저장되는 프로그램이 본 명세서에서 논의된 기법들의 양태들을 구현하기 위해 임의의 컴퓨팅 디바이스 상에 로딩될 수 있도록 전송가능할 수 있다. 부가적으로, 실행될 때, 상기에 논의된 기능들 중 임의의 것을 수행하는 컴퓨터 프로그램에 대한 참조는 호스트 컴퓨터 상에서 실행되는 애플리케이션 프로그램으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 오히려, 컴퓨터 프로그램 및 소프트웨어라는 용어들은, 본 명세서에서 논의된 기법들의 양태들을 구현하기 위해 하나 이상의 프로세서를 프로그래밍하도록 채용될 수 있는 임의의 타입의 컴퓨터 코드(예를 들어, 애플리케이션 소프트웨어, 펌웨어, 마이크로코드, 또는 임의의 다른 형태의 컴퓨터 명령어)를 참조하기 위해 일반적인 의미로 본 명세서에서 사용된다.
본 발명의 다양한 양태들은 단독으로, 조합하여, 또는 전술한 것에 설명된 실시예들에서 구체적으로 논의되지 않은 다양한 배열들에서 사용될 수 있고, 그에 따라 그것의 적용에 있어서 전술한 설명에 제시된 또는 도면들에 예시된 컴포넌트들의 세부사항들 및 배열로 제한되지 않는다. 예를 들어, 일 실시예에서 설명된 양태들은 다른 실시예들에서 설명된 양태들과 임의의 방식으로 조합될 수 있다.
또한, 본 발명은 예가 제공된 방법으로서 구체화될 수 있다. 방법의 일부로서 수행된 행위(act)들은 임의의 적합한 방식으로 순서화될 수 있다. 이에 따라, 예시된 실시예들에서 순차적인 행위들로서 도시되어 있지만, 일부 행위들을 동시에 수행하는 것을 포함할 수 있는, 예시된 것과는 상이한 순서로 행위들이 수행되는 실시예들이 구성될 수 있다.
청구항 요소를 수식하기 위한 청구범위에서의 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어들의 사용은 그것만으로는 방법의 행위들이 수행되는 시간 순서 또는 하나의 청구항 요소의 다른 청구항 요소에 대한 임의의 우선순위, 선행(precedence), 또는 순서를 내포하는 것이 아니라, 청구항 요소들을 구별하기 위해, 특정 명칭을 갖는 하나의 청구항 요소를, (서수 용어를 사용한 것을 제외하고는) 동일한 명칭을 갖는 다른 요소로부터 구별하기 위한 표지들로서 단지 사용된다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 어구 및 전문용어는 설명의 목적을 위한 것이며 제한적인 것으로 간주되어서는 안 된다. 본 명세서의 "포함하는(including)", "포함하는(comprising)", 또는 "갖는(having)", "함유하는(containing)", "수반하는(involving)", 및 그 변형들의 사용은 그 이후에 열거된 항목들 및 그 등가물들뿐만 아니라 부가적인 항목들을 포괄하도록 의도된다.
Claims (35)
- 방법으로서,
제1 발광 표지(first luminescent label)의 여기(excitation)들에 응답하여 상기 제1 발광 표지가 광을 방출하는 시간들에 관한 제1 시간-빈 정보(first time-bin information)를 수신하는 단계;
상기 제1 시간-빈 정보에 기초하여 제1 광 세기 정보를 계산하는 단계;
제2 발광 표지의 여기들에 응답하여 상기 제2 발광 표지가 광을 방출하는 시간들에 관한 제2 시간-빈 정보를 수신하는 단계;
상기 제2 시간-빈 정보에 기초하여 제2 광 세기 정보를 계산하는 단계; 및
상기 제1 및 제2 광 세기 정보를 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계는 펄스 식별 알고리즘을 사용하여 수행되는, 방법. - 제2항에 있어서,
상기 펄스 식별 알고리즘은 변경점 알고리즘(changepoint algorithm), 연속 평균/중앙치(running mean/median) 및 분산 알고리즘(variance algorithm) 또는 상태 머신 알고리즘을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 광 세기 정보를 계산하는 단계는 상기 제1 시간-빈 정보를 합산하는 단계를 포함하고, 상기 제2 광 세기 정보를 계산하는 단계는 상기 제2 시간-빈 정보를 합산하는 단계를 포함하는, 방법. - 방법으로서,
제1 발광 표지의 여기들에 응답하여 상기 제1 발광 표지가 제1 광을 방출하는 시간들에 관한 제1 시간-빈 정보를 수신하는 단계;
상기 제1 시간-빈 정보에 기초하여 상기 제1 광의 제1 시간 특성을 계산하는 단계 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 상기 제1 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -;
제2 발광 표지의 여기들에 응답하여 상기 제2 발광 표지가 제2 광을 방출하는 시간들에 관한 제2 시간-빈 정보를 수신하는 단계;
상기 제2 시간-빈 정보에 기초하여 상기 제2 광의 제2 시간 특성을 계산하는 단계 - 상기 제2 시간 특성은 여기 이후의 상기 제2 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
상기 제1 및 제2 시간 특성들을 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계는 펄스 식별 알고리즘을 사용하여 수행되는, 방법. - 제6항에 있어서,
상기 펄스 식별 알고리즘은 변경점 알고리즘, 연속 평균/중앙치 및 분산 알고리즘 또는 상태 머신 알고리즘을 포함하는, 방법. - 방법으로서,
여기 이후의 하나 이상의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타내는 하나 이상의 시간 특성을 결정하는 단계; 및
적어도 하나의 시간 특성을 사용하여 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제8항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들이 발생하는 시간들을 계산하는 단계는 상기 하나 이상의 발광 표지에 의해 방출된 광의 세기를 사용하여 또한 수행되는, 방법. - 방법으로서,
발광 표지의 여기들에 응답하여 상기 발광 표지가 광을 방출하는 시간들에 관한 시간-빈 정보를 수신하는 단계;
상기 시간-빈 정보에 기초하여 광 세기 정보를 계산하는 단계; 및
상기 광 세기 정보를 사용하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 혼입 이벤트가 발생하는 시간을 계산하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제10항에 있어서,
상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 혼입 이벤트가 발생하는 시간은 상기 광의 시간 특성을 사용하여 또한 수행되는, 방법. - 뉴클레오티드들을 식별하는 방법으로서,
뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 상기 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계 - 상기 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해:
i) 상기 광의 시간 특성 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
ii) 상기 광의 세기 특성
을 포함함 -; 및
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계 - 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -; 및
상기 포인트들의 그룹들을 개별 뉴클레오티드들에 할당하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제12항에 있어서,
상기 시간 특성은 상이한 시간 빈들에서 검출된 광자들의 비율 또는 휘도 수명을 포함하는, 방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 포인트들을 그룹화하는 단계는 클러스터링 알고리즘에 의해 수행되는, 방법. - 제14항에 있어서,
상기 클러스터링 알고리즘은 k가 4 이상인 k-평균 클러스터링을 수행하는, 방법. - 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포인트들의 개별 그룹들은 상기 발광 표지들의 미리 결정된 광-방출 특성들에 기초하여 개별 뉴클레오티드들에 할당되는, 방법. - 서열분석 기기(sequencing instrument)를 교정(calibrating)하는 방법으로서,
뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계 - 상기 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해:
i) 상기 광의 시간 특성 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
ii) 상기 광의 세기 특성
을 포함함 -;
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계 - 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -;
포인트들의 개별 그룹들을 개별 뉴클레오티드들에 할당하는 단계;
상기 포인트들의 그룹들을 구별하는 하나 이상의 기준을 결정하는 단계; 및
상기 하나 이상의 기준을 저장하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제17항에 있어서,
상기 하나 이상의 기준은 상기 포인트들의 그룹들 사이의 하나 이상의 경계를 포함하는, 방법. - 제17항 또는 제18항에 있어서,
상기 하나 이상의 기준은 상기 포인트들의 그룹들의 중심들을 포함하는, 방법. - 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 기준은 비휘발성 메모리에 저장되는, 방법. - 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포인트들을 그룹화하는 단계는 상기 포인트들 상에서 클러스터링 알고리즘을 실행하는 단계를 포함하는, 방법. - 뉴클레오티드들을 식별하는 방법으로서,
뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 상기 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계 - 상기 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해:
i) 상기 광의 시간 특성 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
ii) 상기 광의 세기 특성
을 포함함 -; 및
상기 발광 표지들에 대한 광의 특성들 사이를 구별하는 서열분석 기기에 대한 저장된 기준들을 고려하여 상기 시간 특성 및 상기 세기 특성을 평가함으로써 뉴클레오티드들에 상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 할당하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제22항에 있어서,
상기 저장된 기준들은 상이한 뉴클레오티드들에 대한 상기 발광 표지들의 특성들 사이의 하나 이상의 경계를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 할당하는 단계는 상기 시간 특성 및 상기 세기 특성을 나타내는 포인트를 상기 하나 이상의 경계와 비교하는 단계를 포함하는, 방법. - 제22항 또는 제23항에 있어서,
상기 하나 이상의 저장된 기준은 포인트들의 그룹들의 중심들을 포함하고, 각각의 그룹은 개개의 뉴클레오티드에 대응하고, 상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 할당하는 단계는,
혼입 이벤트에 대한 상기 시간 특성 및 상기 세기 특성을 나타내는 포인트 내지 상기 중심들 사이의 거리들을 결정하는 단계; 및
상기 포인트에 가장 가까운 중심을 갖는 뉴클레오티드에 상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트를 할당하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저장된 기준들은 비휘발성 메모리에 저장되는 교정 기준들인, 방법. - 뉴클레오티드들을 식별하는 방법으로서,
뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 상기 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계 - 상기 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해:
i) 상기 광의 시간 특성 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
ii) 상기 광의 제2 특성
을 포함함 -; 및
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계 - 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -; 및
상기 포인트들의 그룹들을 개별 뉴클레오티드들에 할당하는 단계
를 포함하는, 방법. - 서열분석 기기를 교정하는 방법으로서,
뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계 - 상기 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해:
i) 상기 광의 시간 특성 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
ii) 상기 광의 제2 특성
을 포함함 -;
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들을 포인트들의 그룹들로 그룹화하는 단계 - 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 적어도 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -;
포인트들의 개별 그룹들을 개별 뉴클레오티드들에 할당하는 단계;
상기 포인트들의 그룹들을 구별하는 하나 이상의 기준을 결정하는 단계; 및
상기 하나 이상의 기준을 저장하는 단계
를 포함하는, 방법. - 뉴클레오티드들을 식별하는 방법으로서,
뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 상기 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계 - 상기 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해:
i) 상기 광의 시간 특성 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
ii) 상기 광의 세기 특성
을 포함함 -; 및
상기 발광 표지들에 대한 광의 특성들 사이를 구별하는 서열분석 기기에 대한 저장된 기준들을 고려하여 상기 시간 특성 및 제2 특성을 평가함으로써 뉴클레오티드들에 상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들을 할당하는 단계
를 포함하는, 방법. - 방법으로서,
뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계 - 상기 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해:
i) 상기 광의 시간 특성 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
ii) 상기 광의 세기 특성
을 포함함 -; 및
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들의 그룹들을 구별하는 하나 이상의 기준을 결정하는 단계 - 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 시간 특성 및 세기 특성을 나타냄 -
를 포함하는, 방법. - 제29항에 있어서,
상기 그룹들을 개개의 뉴클레오티드들에 할당하여 상기 그룹들에 대한 뉴클레오티드 할당들을 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제30항에 있어서,
상기 그룹들에 대한 상기 뉴클레오티드 할당들 및 상기 하나 이상의 기준에 기초하여 상기 포인트들을 뉴클레오티드들에 할당하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 방법으로서,
뉴클레오티드 혼입 이벤트들 동안 뉴클레오티드들과 연관된 발광 표지들로부터 검출된 광의 특성들을 획득하는 단계 - 상기 특성들은, 각각의 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대해:
i) 상기 광의 시간 특성 - 상기 시간 특성은 여기 이후의 발광 표지에 의한 광자 방출 확률의 감쇠 속도를 나타냄 -; 및
ii) 상기 광의 제2 특성
을 포함함 -; 및
상기 뉴클레오티드 혼입 이벤트들의 특성들을 나타내는 포인트들의 그룹들을 구별하는 하나 이상의 기준을 결정하는 단계 - 개별 포인트들은 대응하는 뉴클레오티드 혼입 이벤트에 대한 상기 시간 특성 및 상기 제2 특성을 나타냄 -
를 포함하는, 방법. - 프로세서에 의해 실행될 때, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 명령어들을 저장하는, 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체.
- 장치로서,
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 구성되는 프로세서를 포함하는, 장치. - 서열분석 기기로서,
서열분석 반응 동안 발광 표지들로부터의 광을 수신하도록 구성되는 광검출기; 및
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 구성되는 프로세서
를 포함하는, 서열분석 기기.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662343997P | 2016-06-01 | 2016-06-01 | |
| US62/343,997 | 2016-06-01 | ||
| PCT/US2017/035420 WO2017210413A1 (en) | 2016-06-01 | 2017-06-01 | Pulse caller and base caller |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190015371A true KR20190015371A (ko) | 2019-02-13 |
| KR102425257B1 KR102425257B1 (ko) | 2022-07-27 |
Family
ID=59055317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020187037813A KR102425257B1 (ko) | 2016-06-01 | 2017-06-01 | 펄스 호출자 및 베이스 호출자 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10711299B2 (ko) |
| EP (2) | EP4009330A1 (ko) |
| JP (1) | JP6931665B2 (ko) |
| KR (1) | KR102425257B1 (ko) |
| CN (1) | CN109313925B (ko) |
| AU (1) | AU2017274412B2 (ko) |
| BR (1) | BR112018074572B1 (ko) |
| CA (1) | CA3026061A1 (ko) |
| MX (1) | MX2018014856A (ko) |
| TW (1) | TWI755400B (ko) |
| WO (1) | WO2017210413A1 (ko) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9759658B2 (en) | 2014-08-08 | 2017-09-12 | Quantum-Si Incorporated | Integrated device for temporal binning of received photons |
| US10441174B2 (en) | 2016-02-17 | 2019-10-15 | Tesseract Health, Inc. | Sensor and device for lifetime imaging and detection applications |
| CA3025431A1 (en) * | 2016-06-01 | 2018-01-18 | Quantum-Si Incorporated | Integrated device for detecting and analyzing molecules |
| MX2019007247A (es) | 2016-12-19 | 2019-08-16 | Quantum Si Inc | Carga de moleculas en pocillos para muestra para su analisis. |
| MX2019007530A (es) | 2016-12-22 | 2019-08-16 | Quantum Si Inc | Fotodetector integrado con agrupamiento de pixeles directo. |
| US11120104B2 (en) | 2017-03-01 | 2021-09-14 | Stmicroelectronics (Research & Development) Limited | Method and apparatus for processing a histogram output from a detector sensor |
| CA3059211A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Quantum-Si Incorporated | Substrates having modified surface reactivity and antifouling properties in biological reactions |
| WO2019136376A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Illumina, Inc. | High-throughput sequencing with semiconductor-based detection |
| KR102239487B1 (ko) | 2018-01-08 | 2021-04-14 | 일루미나, 인코포레이티드 | 반도체-기반 검출을 사용한 고-처리율 서열분석 |
| WO2019147904A1 (en) | 2018-01-26 | 2019-08-01 | Quantum-Si Incorporated | Machine learning enabled pulse and base calling for sequencing devices |
| KR20210022688A (ko) | 2018-06-22 | 2021-03-03 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 가변 검출 시간의 전하 저장 빈을 갖는 집적 광검출기 |
| EP3844486A1 (en) * | 2018-08-29 | 2021-07-07 | Quantum-Si Incorporated | System and methods for detecting lifetime using photon counting photodetectors |
| US11210554B2 (en) | 2019-03-21 | 2021-12-28 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| US11347965B2 (en) | 2019-03-21 | 2022-05-31 | Illumina, Inc. | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| US11593649B2 (en) | 2019-05-16 | 2023-02-28 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
| WO2021072245A1 (en) | 2019-10-11 | 2021-04-15 | Quantum-Si Incorporated | Surface modification in the vapor phase |
| JP2023510577A (ja) | 2020-01-14 | 2023-03-14 | クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド | 寿命特性評価のための集積センサ |
| JP2023510578A (ja) | 2020-01-14 | 2023-03-14 | クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド | 寿命およびスペクトル特性評価用センサ |
| WO2021168353A2 (en) | 2020-02-20 | 2021-08-26 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based many-to-many base calling |
| WO2021178438A1 (en) | 2020-03-02 | 2021-09-10 | Quantum-Si Incorporated | Integrated sensor for multi-dimensional signal analysis |
| KR20220165754A (ko) | 2020-04-08 | 2022-12-15 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 스큐가 감소된 통합 센서 |
| CA3199745A1 (en) * | 2020-10-27 | 2022-05-05 | Quantum-Si Incorporated | Calibration of single-molecule detection system |
| US20220336054A1 (en) | 2021-04-15 | 2022-10-20 | Illumina, Inc. | Deep Convolutional Neural Networks to Predict Variant Pathogenicity using Three-Dimensional (3D) Protein Structures |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5674743A (en) * | 1993-02-01 | 1997-10-07 | Seq, Ltd. | Methods and apparatus for DNA sequencing |
| US20090024331A1 (en) * | 2007-06-06 | 2009-01-22 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and processes for calling bases in sequence by incorporation methods |
| US20130023423A1 (en) * | 2011-07-20 | 2013-01-24 | Finnzymes Oy | Transposon nucleic acids comprising a calibration sequence for dna sequencing |
| US20150299767A1 (en) * | 2012-06-18 | 2015-10-22 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
| WO2016022998A2 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Quantum-Si Incorporated | Integrated device for temporal binning of received photons |
| US20160041095A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Quantum-Si Incorporated | Optical system and assay chip for probing, detecting and analyzing molecule |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19744490A1 (de) * | 1997-10-08 | 1999-04-15 | Temp Rite International Gmbh | Trinkwasseraufbereitungsanlage |
| JP4566299B2 (ja) * | 1998-04-09 | 2010-10-20 | シスメックス株式会社 | 赤芽球の分類計数方法 |
| WO2000009753A1 (en) * | 1998-08-11 | 2000-02-24 | Caliper Technologies Corp. | Methods and systems for sequencing dna by distinguishing the decay times of fluorescent probes |
| DE19844931C1 (de) * | 1998-09-30 | 2000-06-15 | Stefan Seeger | Verfahren zur DNS- oder RNS-Sequenzierung |
| US7056661B2 (en) * | 1999-05-19 | 2006-06-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
| GB2382648B (en) * | 2001-12-11 | 2003-11-12 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | System and method for time correlated multi-photon counting measurements |
| WO2005120204A2 (en) * | 2004-06-07 | 2005-12-22 | The Regents Of The University Of California | Method for single molecule fluorescence analysis |
| ES2588908T3 (es) | 2007-11-21 | 2016-11-07 | Cosmosid Inc. | Sistema de identificación de genoma |
| US20110165652A1 (en) * | 2008-01-14 | 2011-07-07 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods and systems for single molecule sequencing |
| US8592158B2 (en) * | 2009-07-10 | 2013-11-26 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Detecting multinucleotide repeats |
| US9670243B2 (en) * | 2010-06-02 | 2017-06-06 | Industrial Technology Research Institute | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
| WO2012177792A2 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of a genetic variation |
| JP5790242B2 (ja) * | 2011-07-25 | 2015-10-07 | 富士ゼロックス株式会社 | 故障予測装置及びプログラム |
| AU2013240166A1 (en) * | 2012-03-30 | 2014-10-30 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and composition for sequencing modified nucleic acids |
| WO2014190230A1 (en) * | 2013-05-23 | 2014-11-27 | Iphenotype Llc | Phenotypic integrated social search database and method |
| US10048208B2 (en) | 2013-11-17 | 2018-08-14 | Quantum-Si Incorporated | Integrated device with external light source for probing detecting and analyzing molecules |
| CN105980578B (zh) | 2013-12-16 | 2020-02-14 | 深圳华大智造科技有限公司 | 用于使用机器学习进行dna测序的碱基判定器 |
| EP3143537B1 (en) | 2014-05-12 | 2023-03-01 | Roche Diagnostics GmbH | Rare variant calls in ultra-deep sequencing |
| BR112017002501B1 (pt) | 2014-08-08 | 2022-06-07 | Quantum-Si Incorporated | Dispositivos integrados, sistemas, método de detecção de presença de molécula em amostra, método de formação de dispositivo integrado e método de análise de espécime |
| US10185803B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-01-22 | Deep Genomics Incorporated | Systems and methods for classifying, prioritizing and interpreting genetic variants and therapies using a deep neural network |
| US9922285B1 (en) | 2017-07-13 | 2018-03-20 | HumanCode, Inc. | Predictive assignments that relate to genetic information and leverage machine learning models |
-
2017
- 2017-06-01 CN CN201780034484.3A patent/CN109313925B/zh active Active
- 2017-06-01 BR BR112018074572-3A patent/BR112018074572B1/pt active IP Right Grant
- 2017-06-01 EP EP21199556.8A patent/EP4009330A1/en active Pending
- 2017-06-01 JP JP2018562554A patent/JP6931665B2/ja active Active
- 2017-06-01 WO PCT/US2017/035420 patent/WO2017210413A1/en unknown
- 2017-06-01 TW TW106118155A patent/TWI755400B/zh active
- 2017-06-01 EP EP17730003.5A patent/EP3465503B1/en active Active
- 2017-06-01 KR KR1020187037813A patent/KR102425257B1/ko active IP Right Grant
- 2017-06-01 CA CA3026061A patent/CA3026061A1/en active Pending
- 2017-06-01 AU AU2017274412A patent/AU2017274412B2/en active Active
- 2017-06-01 US US15/611,573 patent/US10711299B2/en active Active
- 2017-06-01 MX MX2018014856A patent/MX2018014856A/es unknown
-
2020
- 2020-06-02 US US16/889,917 patent/US20200291467A1/en active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5674743A (en) * | 1993-02-01 | 1997-10-07 | Seq, Ltd. | Methods and apparatus for DNA sequencing |
| US20090024331A1 (en) * | 2007-06-06 | 2009-01-22 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and processes for calling bases in sequence by incorporation methods |
| US20130023423A1 (en) * | 2011-07-20 | 2013-01-24 | Finnzymes Oy | Transposon nucleic acids comprising a calibration sequence for dna sequencing |
| US20150299767A1 (en) * | 2012-06-18 | 2015-10-22 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
| WO2016022998A2 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Quantum-Si Incorporated | Integrated device for temporal binning of received photons |
| US20160041095A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Quantum-Si Incorporated | Optical system and assay chip for probing, detecting and analyzing molecule |
| US20160133668A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-05-12 | Quantum-Si Incorporated | Integrated device for temporal binning of received photons |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112018074572B1 (pt) | 2024-02-27 |
| WO2017210413A1 (en) | 2017-12-07 |
| EP4009330A1 (en) | 2022-06-08 |
| CA3026061A1 (en) | 2017-12-07 |
| CN109313925B (zh) | 2022-09-02 |
| TWI755400B (zh) | 2022-02-21 |
| US10711299B2 (en) | 2020-07-14 |
| JP6931665B2 (ja) | 2021-09-08 |
| AU2017274412B2 (en) | 2022-07-21 |
| CN109313925A (zh) | 2019-02-05 |
| EP3465503B1 (en) | 2021-09-29 |
| EP3465503A1 (en) | 2019-04-10 |
| BR112018074572A2 (pt) | 2019-03-12 |
| AU2017274412A1 (en) | 2018-12-06 |
| TW201800739A (zh) | 2018-01-01 |
| US20200291467A1 (en) | 2020-09-17 |
| KR102425257B1 (ko) | 2022-07-27 |
| US20170349944A1 (en) | 2017-12-07 |
| MX2018014856A (es) | 2019-03-07 |
| JP2019529865A (ja) | 2019-10-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102425257B1 (ko) | 펄스 호출자 및 베이스 호출자 | |
| TWI812671B (zh) | 用於識別核酸之核苷酸之方法、系統及非暫時性電腦可讀儲存媒體以及用於訓練深度學習模型之方法及系統 | |
| RU2736384C1 (ru) | Секвенирование с помощью одиночного источника света и двух оптических каналов | |
| US20220238389A1 (en) | Sample well fabrication techniques and structures for integrated sensor devices | |
| AU2023255041A1 (en) | Sample well fabrication techniques and structures for integrated sensor devices | |
| US20240177807A1 (en) | Cluster segmentation and conditional base calling | |
| WO2024059852A1 (en) | Cluster segmentation and conditional base calling |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |