TWI440717B - 製備具有二元ｂ鏈端的胰島素類似物之方法 - Google Patents

製備具有二元ｂ鏈端的胰島素類似物之方法 Download PDF

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Description

製備具有二元B鏈端的胰島素類似物之方法 敘述
此發明是關於製備具有二元B鏈端的胰島素類似物之方法，利用生物技術來製備其前驅物，接著轉變成酵素催化連結反應以離胺醯胺(lysinamide)或精胺醯胺(argininamide)，或離胺酸(lysine)或精胺酸(arginine)來對保護基進行修飾，接著進行水解作用即可得到此胰島素。
世界上大約有1.77億名糖尿病患者，其中一億七千萬人是屬於第一類型糖尿病，取代其所缺乏之胰島素分泌是目前唯一可行的治療方法，那些患者需要依賴通常一天要好幾次的胰島素注射，終其一生。不同於第一型糖尿病，第二型糖尿病並非總是缺乏胰島素，但是在大部分的案例中，尤其是在後期階段，用胰島素和口服抗糖尿病藥結合的治療被認為是最有力的治療類型。
在健康的人之中，胰臟貝他細胞(beta cell)所釋放的胰島素與血液中葡萄糖濃度有著嚴謹的關聯。血糖濃度提升，例如用餐後發生的狀況，會快速的被對等量提升分泌的胰島素所補償(compensated)。在饑餓的階段，血漿中的胰島素會降低到一個基本值，以確保持續供給葡萄糖至胰島素敏感之器官與組織，以及在夜間維持肝臟中葡萄糖於低產量。通常由外來皮下注射的胰島素取代內生性的胰島素分泌，多半無法與上述血液中葡萄糖生理調控的品質密切契合。血液中葡萄糖含量上升或下降的擾動是頻繁的，這是對他們最嚴重的形式，且可能是會威脅到生命的。然而，除此之外，血中葡萄糖含量長年升高，既使沒有初始徵兆，也代表健康上相當大的危機。在美國大規模的糖尿病控制及併發症臨床研究計畫(DCCT)(The Diabetes Control and Complications Trial Research Group(1993)N.Engl.J.Med.329,977－986)清楚地證實，慢性血糖含量的提升與後期糖尿病併發症有實質上的關聯。晚期糖尿病併發症和微血管或大血管病變在一些情形中會造成如視網膜病變(retinopathy)、腎病變(naphropathy)、神經病變(neuropathy)，會導致失明、腎衰竭、失去四肢，此外也與增加心血管疾病的風險相關。因此，可以推斷一個改進的糖尿病治療法必須主要針對於盡可能保持血糖在生理的範圍之內。改進的胰島素治療策略試圖藉由一天注射許多次速效與緩效型胰島素調劑已達成此目的。速效型(Fast－acting)的配方是在用餐時間給予，以求補償用餐過後提升的血糖。緩效型(Slow－acting)基本胰島素則是用於確保基本量胰島素的供應，特別是在夜間，避免造成低血糖。
胰島素是由一段51個胺基酸所分成之兩段胺基酸鏈所構成之多肽鏈：A鏈具有21個胺基酸，而B鏈具有30個胺基酸，兩條鏈由二個雙硫鍵相連結。為了糖尿病的治療，胰島素製備已被使用了好幾年，此外，不只是使用天然之胰島素，還包括近年來許多胰島素的衍生物或類似物。
胰島素類似物是天然胰島素，亦即人類胰島素或動物胰島素的類似物，差別在於以其他胺基酸取代至少一個天然的胺基酸，或是增加/刪除至少一個胺基酸在相對應的位置，否則就完全相同的天然胰島素上。舉例來說，美國專利第5,656,722號是在描述des－Phe(B1) －胰島素衍生物。那些被加入和/或被取代的胺基酸可以不是自然發生者。
胰島素衍生物是天然胰島素或胰島素類似物的衍生物，其一個或多個胺基酸或A鏈與B鏈的N端或C端被其他官能基所取代，而官能基是由下列基團所選出，其包括醯胺殘基、胺基殘基、羧基殘基、烷基殘基、醇基殘基以及烷氧基殘基。
一種有效率的胰島素療法使用所謂的基本胰島素(basal insulin)，此模式使緩慢而持續釋放外加調控胰島素成為可能。以這種方式，身體內長時間達到最基本的胰島素濃度對糖尿病患者的生理狀態是最有利的。
重組的胰島素類似物Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人類胰島素(甘精胰島素)為了達到基本的效果－需要被供應給身體每24小時－即一天一個。每天給予一次而使得能改善生活的品質。例如改善的生理狀態導致醣化血色素(Hbalc)含量的減少而且此能被預期改善糖尿病晚期後遺症的出現－若真是如此－之後可認為如此能延長相關的糖尿病患者的生命期望值。
這樣的胰島素類似物的需求相當地高。由於糖尿病患者的數量持續增加，用最低的花費來製備相對應的類似物更具有經濟利益。US 5,656,722描述胰島素類似物的製備可能藉由前胰島素融合蛋白，其是由融合蛋白(前部分)和猴子前胰島素變體組成。其中一個類似物在其位置A(21)是由甘胺酸(glycine)取代天門冬醯胺(asparagine)。相對應的融合蛋白為胜肽前驅物的變體，其是用來製備甘精胰島素。此方法提供了藉由與胰蛋白酶反應來去除此融合蛋白的前部分和C胜肽。EP－A 0 668 292是描述一融合蛋白遵循著相同的原理但比美國5,656,722能讓甘精胰島素以更好的方法來製備。為此，熟悉該項技藝之工作者很清楚在胰島素B鏈和C鏈的邊緣做部分的切除是可能的，此被定義為二元(dibasic)結構Arg－Arg，而且能產生B31單－arg人類胰島素類似物。這不良的產物必須從實際上有興趣的化合物中移除。這將造成產量明顯地虧損。而這個問題能藉由重組的前胰島素製備以及用專一性的蛋白內切酶來反應，例如賴胺醯肽鏈內切酶(lysyl endopeptidase)，以及反應所產生的des－B30人類胰島素(類似物)與三胜肽Thr－Arg－Arg進行半合成的胜肽化學方法而避免。EP－A 0 132 769和WO 2003/044210描述在反應期間需要保護三胜肽的反應基。接著在反應後，保護基會被去除。這個路線所增加的花費與用化學合成製備三胜肽和加上保護基有關。因此，需要有一種方法可以從Arg(B31)人類胰島素前驅物來製備來Arg(B31)、Arg(B32)－胰島素類似物。
德國專利申請編號10 2005 046 113.1(未公開)描述一方法，包括胰蛋白酶－催化胺基酸的連結，此胺基酸具有C－端經醯胺化的胜肽，而胜肽C－端胺基酸是由離胺酸(lysine)或精胺酸(arginine)所組成。這個案例中觀察到的產量意外地高，而且更有可能在不用保護基的屏蔽之下進行偶合反應。反應在非水溶液的培養基中進行。現在已令人驚訝地發現精胺酸醯胺或離胺酸醯胺連接上B31胰島素類似物的偶合反應，是有可能為高產量的。令人驚訝地是更有可能控制反應，使得能優先來形成Arg(B31)，Arg(B32)－人類胰島素醯胺形式或Arg(B31)，Lys(B32)－人類胰島素醯胺形式的胰島素類似物，而且產量大於60%。醯胺基團在反應的最後可以利用酸性水解作用而被去除。同樣令人驚訝地發現選擇利用離胺酸醯胺或精胺酸醯胺在反應精胺酸或離胺酸時，可能具有保護基。可能當作例子的保護基是第三丁氧羰基(Boc)或二甲氧基苯基丙基氧羰基(DZZ)。由於文獻中有些描述特別提到，保護後的精胺酸衍生物在許多溶劑內常常都不穩定，所以技術人員很清楚要持續建立新的保護基是具有改善胜肽化學穩定性的效果，對產率有正面幫助的方法可能可以藉由改變保護基或醯胺基等方式來改變反應條件。這些對技術人員是很熟悉的而且也與本發明有關聯。部分的切割產物B(31)人類胰島素，從前胰島素前驅物(US 5,656,722)來製備甘精胰島素或可比較的Arg(B31)，Arg(B32)－胰島素類似物，將變成可獲得地用來製備有價值的產物。在這個案例中，相對應的融合蛋白不需要在細胞內被製備。熟悉該項技藝之工作者很清楚前胰島素類似物也能藉由細菌表現且分泌到細胞間質和/或到培養的上清液中而製備。歐洲專利申請案EP－A 1 364 029以這例子的方式來描述。本發明也關於Arg(B31)－人類胰島素前驅物的使用是直接從這樣的細菌方法表現之後直接生成。
此外有一更進一步的技術方面的方法，也似與發明相關。歐洲專利申請EP－A 0 347 781和歐洲專利申請EP－A 1 364 030和歐洲專利申請EP－A 1 364 032描述，根據酵母菌的方法來製備高產量的微小前胰島素(miniproinsulins)。這樣的方法或相似的方法之延伸來製備微小前胰島素，其具有的胺基酸殘基描述在美國專利5,656,722，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp或Glu，在位置A21，在二－鏈的胰島素切割之後允許這些微小前胰島素被立即地轉變成Arg(B31)，Arg(B32)－胰島素類似物。
假如表現發生了，如EP－A 1 364 032所描述的，藉由融合蛋白而不需用胰蛋白酶或相似的蛋白內切酶來切除前部分是有利的。反之，藉由不會切胰島素衍生物的專一性的內切酶來辨識切位，能適當地去除前或融合部分，腸激酶(DDDDK)或因子Xa(IEGR)為一例子。本發明也與此相關。熟悉該項技藝之工作者相當地清楚，兩個切割反應能以單槽式(one－pot)反應來進行。更進一步的可能是在下一步驟中只切除融合部分。在這個案例中，融合蛋白的部分可以被選擇成為大量有效地分泌蛋白的衍生物。能被細菌使用的例子有DHFR(二氫葉酸還原酶)、麩胺基硫S－轉移酶和水蛭素。能被用來使酵母菌分泌的例子有白蛋白或其衍生物、超氧化物歧化酵素或其衍生物、介白質素－2或其衍生物和水蛭素或其衍生物。本發明中，使用水蛭素衍生物來作為細菌表現和酵母菌表現的融合部分。令人驚訝地在此結合中已經發現水蛭素的序列能被修改，藉由加入連續的組胺酸的胜肽序列和/或胜肽序列DDDDK(此為腸激酶的辨識位置)，而不會影響微小前胰島素部分的摺疊。可利用親和性色層分析的方法來獲得。本發明也與此相關。
熟悉該項技藝之工作者更進一步熟悉例子中所描述的表現系統只呈現建立重組蛋白製備之寄主/載體系統的一小部分之事實。允許製備目標胜肽的寄主/載體系統，此亦為發明的一部份。
本發明是關於胰島素類似物的製備，胰島素類似物的特徵是從Arg(B31)－人類胰島素前驅物的類似物經過胰蛋白酶催化並與精胺酸或離胺酸連接來生成胺基酸殘基Arg(B31)，Arg(B32)或Arg(B31)，Lys(B32)。熟悉該項技藝之工作者很清楚，因為令人驚訝的反應選擇性，連接反應也能在數個反應循環中被重複，因此進一步具有鹼性胺基酸的離胺酸或精胺酸在位置B31或B32之後之胰島素類似物變得可以獲得。這可以藉由實行偶合反應達成，去醯胺或去末端胺基酸的保護後，利用產物再一次進行適當的反應循環。這樣的產物同樣地能藉由已經具有Arg(B31)，Arg(B32)或Arg(B31)，Lys(B32)之類似物當作前驅物來獲得。同樣地有可能製備包含位置B31及之後為任何一般可編碼之胺基酸而不需要是精胺酸或離胺酸之類似物，但其C端的末端特徵是二元序列Arg－Arg、Arg－Lys、Lys－Lys或Lys－Arg。反應不限制使用胰蛋白酶當作催化劑。熟悉該項技藝之工作者可知，除了市面上已知的老鼠、牛、豬或人的胰蛋白酶或其他的同工酶或衍生物或變體，也有可能使用以下的酵素：來自尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)和來自鏈黴菌(S.griseus、S.exfoliatus、S.erythraeus、S.fradiae和S.albidoflavus)之組織蛋白酶(cathepsin)和胰蛋白酶、胰蛋白酶、mastin、頂體酶(acrosin)、激肽釋放酶(kallikrein)、絲胺酸蛋白酶(hepsin)、絲氨酸蛋白水解酶I(prostasin I)、賴胺醯肽鏈內切酶(Lysin－C)和蛋白內切酶Arg－C(羧菌肽酶(clostripain))。
本發明因此關於製備胰島素類似物或其衍生物之方法，其中將一經醯胺化或具有保護C－端的保護基之自然發生的，鹼性胺基酸，或由天然發生的鹼性胺基酸或類似物或其衍生物和經醯胺化之C－端或具有保護C－端的保護基所組成的胜肽加入於起始的胰島素類似物或其衍生物，其A和/或B鏈的C－端胺基酸是選自包含自然發生的，鹼性胺基酸或類似物或其衍生物之群組，於所述的C－端胺基酸之一上在具有胰蛋白酶的生理活性之酵素存在下，以及純化所產生的經修飾胰島素類似物和選擇性去除醯胺基團或加入的胺基酸的C－端保護基或加入的胜肽。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中胰島素類似物的特徵在一般分子式I 其意義為(A1－A5) 胺基酸殘基位於人類胰島素或動物胰島素A鏈的位置A1到A5(A12－A19) 胺基酸殘基位於人類胰島素或動物胰島素A鏈的位置A12到A19 A21 自然發生的胺基酸殘基(B8－B18) 胺基酸殘基位於人類胰島素或動物胰島素B鏈的位置B8到B18(B20－B26) 胺基酸殘基位於人類胰島素或動物胰島素B鏈的位置B20到B26(A8－A10) 胺基酸殘基位於人類胰島素或動物胰島素A鏈的位置A8到A10 B30 化學鍵或自然發生的胺基酸殘基B1 化學鍵或自然發生的胺基酸殘基B3 自然發生的胺基酸殘基R1 胺基或一到三個自然發生的胺基酸殘基R2 羧基或一到三個自然發生的胺基酸殘基R3 胺基或一到三個自然發生的胺基酸殘基R4 化學鍵或一到三個自然發生的胺基酸殘基，其中C－端生成之胺基酸代表一鹼性胺基酸R5 一或二個鹼性胺基酸殘基，其C端可以是自由或經醯胺化其中C端是連結到R5的N端之胺基酸殘基，是選自包含自然發生，鹼性胺基酸之群組。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中起始的胰島素類似物特徵在一般分子式II 其R1，(A1－A5)，(A8－A10)，(A12－A19)，A21，R2，R3，B1，B3，(B8－B18)，(B20－B26)，B27，B28，B29，B30和R4定義如申請專利範圍第1項，以及B鏈的C－端胺基酸殘基是由選自包括自然發生的，鹼性胺基酸之群組。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中經醯胺化或是具有保護C－端的保護基之自然發生的，鹼性胺基酸是是C－端經醯胺化之精胺酸或以Boc保護基來保護C－端之精胺酸。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中經修飾胰島素類似物是Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人類胰島素，其B鏈的C端係經醯胺化者，起始的胰島素類似物可特別是Gly(A21)，Arg(B31)人類胰島素。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中起始胰島素類似物的製備是藉由重組前驅物蛋白的表現，該前驅物蛋白包含起始胰島素類似物的A鏈和B鏈，特別是這類型的方法，其複製子(replicon)的部分之基因被表現。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中細菌或酵母菌被使用為宿主細胞。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中前驅物蛋白是在表現之後分泌的，特別是前驅物蛋白是分離自細菌或酵母菌細胞的上清液。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中前驅物蛋白係分離自細菌之細胞問題(periplasm)。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中任何所述的申請專利範圍所得之前驅物蛋白係由折疊過程和酵素切割所得到的。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中起始胰島素類似物是利用重組直接表現來製備。
本發明進一步關於上述所描述之方法，其中酵素具有胰蛋白酶的生理活性，其係選自包含人類胰蛋白酶，豬的胰蛋白酶，牛的胰蛋白酶以及人類胰蛋白酶，豬的胰蛋白酶，牛的胰蛋白酶的變體之群組。
本發明更進一步地關於如上所描述的方法，修飾後的胰島素類似物的B鏈的C－端接著在水解反應中被去保護。
本發明更進一步地關於如上所描述的方法，所得之胰島素類似物為Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人類胰島素。
本發明更進一步地關於胰島素類似物或其衍生物，其中A和/或B鏈之C端的胺基酸被醯胺化並當作藥劑。
本發明更進一步地關於胰島素類似物或其衍生物，其可由上述描述的方法獲得，其中A和/或B鏈C端的胺基酸被醯胺化。
本發明藉由以下一些過程的例子之方法更詳細地來解釋。這些過程的例子不具有限制效果。
例子1：在體外折疊完成後，從融合蛋白中製備Arg(B31)，Gly(A21)胰島素美國專利5,663,291描述於例子1，其中可獲得正確折疊的胰島素融合蛋白的結構：MATTSTGNSA RFVNQHLCGS HLVEALYLVC GERGFFYTPK TRREAEDPQV GQVELGGGPG AGSLQPLALE GSLQKRGIVE QCCTSICSLY QLENYCG(SEQ ID NO.1)
此材料根據美國專利5,227,293例子V被轉變，其藉由將雙鏈的胰島素和胰蛋白酶反應，然後Arg(B31)，Arg(B31)，Gly(A21)胰島素和Arg(B31)，Gly(A21)胰島素被分離。
因此，直接獲得Arg(B31)，Arg(B31)，Gly(A21)－胰島素類似物是有可能的，而在以經修飾的精胺酸或離胺酸進行胰蛋白酶－催化連結反應時，Arg(B31)，Gly(A21)副產物能被利用作為前驅物。
例子2：由從分泌獲得而且包含正確折疊的前胰島素之融合蛋白製備Arg(B31)，Gly(A21)胰島素例子1的另一種方法，融合蛋白也能從細菌系統的分泌物中被製備。在此例子中，前胰島素結構如同融合蛋白的一部份能被正確地折疊，而且試管中重新折疊的步驟能被省略。專利申請案WO 02/068660提出一此類型的系統。舉例來說，如果在質體pBpfuHir_Ins中Asn(A21)密碼子被Gly(A21)密碼子所取代，其被描述在此國際專利申請案的例子1中，結果能藉由此例子的方法獲得含有甘精胰島素的融合蛋白，而且Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素能被分離成副產物，如例子1所描述的。
為了要製備一序列，一個新的引子insu_a21_gly_rev具有以下的結構：5'－TTTTTTAAGCTTGTCGACTCATTAGCCGCAGTAGTTCTCCAGCTG－3'(SEQ ID NO.：2)是必須的。
引子以類似專利申請案WO 02/068660，於PCR中與在質體pBpfuHir_ins DNA上的引子pful被利用。從PCR產物中分離出BamH1/Hind3片段是可能的，該片段得根據專利申請案WO 02/068660的例子而被選殖。在表現之後，融合蛋白被分離且根據本發明例1更進一步地被處理。
熟悉該項技藝之工作者可清楚知道，前驅物Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素也能直接地藉由細菌的融合蛋白分泌物來獲得。這也與本發明相關。
例子3：由Arg(B31)，Gly(A21)前驅物與精胺醯胺偶合來製備Arg(B31)，Arg(B32)，Gly(A21)－胰島素將100毫克的21A－Gly－30B L－Arg－胰島素溶於0.95毫升的精胺醯胺溶液中(446克/公升)中，加入0.13毫升醋酸鈉緩衝液(pH 5.8)和2毫升二甲基甲醯胺(DMF)。將反應混合物冷卻至12℃，而且當加入0.094毫升的胰蛋白酶(0.075毫克，羅氏診斷)則開始反應。
經8小時後，加入三氟乙酸(TFA)至pH值2.5來進行反應的終止，並以HPLC來分析，有大於60%之Arg(B31)、Arg(B32)、Gly(A21)人類胰島素形成。加入與US 5,656,722相似的胰蛋白酶抑制劑溶液來純化經醯胺化的類似物。經醯胺化之胰島素類似物在酸存在下被水解數小時，即可得到Arg(B31)，Arg(B32)，Gly(A21)人類胰島素。
例子4：由Arg(B31)，Gly(A21)前驅物與離胺醯胺偶合來製備Arg(B31)，Lys(B32)，Gly(A21)－胰島素將100毫克的21A－Gly－30B L－Arg－胰島素溶於0.95毫升的離胺醯胺溶液中(400克/公升)中，加入0.13毫升醋酸鈉緩衝液(pH 5.8)和2毫升二甲基甲醯胺(DMF)。將反應混合物冷卻至12℃，而且當加入0.094毫升的胰蛋白酶(0.075毫克，羅氏診斷)則開始反應。
經8小時後，加入三氟乙酸(TFA)使pH變成2.5來終止反應，並以HPLC來分析，Arg(B31)，Lys(B32)－NH2，Gly(A21)人類胰島素會被形成，然後加入與US 5,656,722相似的胰蛋白酶抑制劑溶液來純化之。經醯胺化之胰島素類似物在酸存在下被水解數小時，即可得到Arg(B31)，Lys(B32)，Gly(A21)人類胰島素。
例子5：由Arg(B31)，Gly(A21)前驅物與H－Arg(Boc)2－OH偶合來製備Arg(B31)，Arg(B32)，Gly(A21)－胰島素將0.25毫克的Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素與11微升0.1M的吡啶醋酸鹽緩衝液(pH5.6)、60微升的130公克/公升H－Arg(Boc)2－OH x鹽酸的溶液在0.1M吡啶醋酸鹽緩衝液(pH 5.6)和119微升的二甲基甲醯胺(DMF)混合在Eppendorf管中，並與胰蛋白酶(羅氏診斷)在12℃反應數小時。
加入25%水、25%乙腈和50%三氟醋酸的混合物來終止反應進行。將混合物冷凍乾燥，且為了去除保護基，將混合物溶在1毫升的三氟乙酸(TFA)並使其放在室溫大約3小時。Arg(B31)，Arg(B32)－NH2 ，Gly(A21)人類胰島素的純化，可藉由相似於US 5,656,722的例子來進行。
例子6：由Arg(B31)，Gly(A21)前驅物與H－Lys(Boc)－OtBu偶合來製備Arg(B31)，Lys(B32)，Gly(A21)胰島素將50毫克Arg(B31)，－Gly(A21)人類胰島素溶於0.62毫升H－Lys(Boc)－OtBu溶液中(0.5克/公升，pH5)，然後加入1毫升N,N－二甲基甲醯胺(DMF)。將反應混合物冷卻至12℃，並加入2毫克胰蛋白酶(羅氏診斷)。
超過10小時後，藉由加入2毫升50%強度的乙腈/水混合物和1毫升三氟乙酸(100%)來終止反應。將混合物冷凍乾燥，且為了去除Boc保護基，將混合物溶在1毫升三氟乙酸並置於室溫大約3小時。可利用類似US 5,656,722的例子來進行Arg(B31)，Lys(B32)，OH的純化。
例子7：麵包酵母菌之分泌水蛭素Arg(B31)、Gly(A21)胰島素融合蛋白質的基因序列專利申請案EP－A 1 364 032提議使用水蛭素當作融合蛋白，在酵母菌中用來作為製藥上有興趣及價值的蛋白的表現和分泌。
專利申請案EP－A 1 364 032的例子1描述了用來製備水蛭素衍生物和微小前胰島素所組成的融合蛋白之宿主－載體系統。藉由這個例子的方法，這個系統能被使用如US 5,656,722描述的胺基酸來製備位置A21胺基酸為天門冬醯胺的微小前胰島素。
表現載體的建構為專利申請案EP－A 1 364 032中例子的類似物，其將引子insncolrev置換及設計使改變其位置A21的基因密碼。
以下例示引子的合成是來製備能編碼成Arg(B31)，Gly A(21)人類胰島素的序列：ins_gly_a21_rev 5'－TTTTTTCCATGGGTCGACTATCAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG－3'(SEQ ID NO.：3)
在這個例子中，引子完全涵蓋編碼成胰島素類似物的胺基酸A15－A21的基因片段。結合這個引子和從本案的例子1來的引子SEQ ID NO.：4，且使用質體pADH2Hir_ins當作模版，允許由PCR產生的DNA片段在限制酶Kpnl和Ncol切割過後，被插入到相對應被打開的表現載體中，而且包含想要的融合蛋白。
此載體被命名為pADH2Hir_ins_glyA21。依據專利申請案EP－A 1 364 032來表現及處理融合蛋白，即可得到Gly(A21)－微小前胰島素，然後再依據例子2將其轉變成Arg(B31)，Lys(B32)，Gly(A21)人類胰島素。
例子8：麵包酵母菌之直接分泌Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素前驅物的基因序列描述在例子7的質體pADH2Hir_ins_glyA21的DNA被用來製備成載體，建構來直接分泌Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素。
下列之引子被合成。
alpha_insf1 5'－TITTTIGGATCCITTGGAATAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG－3'(SEQ ID NO.：4)其涵蓋alpha因子C端和作成Lys－Arg密碼子的序列，以及微小前胰島素序列N端的序列。
ins_gly_rev2 5'－TTTTTTCCAT GGGTCGCTAT CAGCCACAGTAGTTTTCCAG CTGG－3'(SEQ ID NO.：5)
此引子能與胰島素類似物序列的3'端雜交，將其嵌入質體pADH2Hir_ins_glyA21。使用PCR(標準條件)產生一段DNA序列，經過限制酶KpnI與KcoI的切割作用，嵌入對應解開的表現載體而組成需要的融合蛋白質。在酵母菌株Y79之勝任細胞進行轉型作用，轉型物接著由例子7的描述來表現。Arg(B31)，Gly(A21)－微小前胰島素藉由已知的方法(EP－A 0 229 998)來分離，且如同例子2被轉變成Arg(B31)，Lys(B32)，Gly(A21)人類胰島素。
例子9：酵母菌(Pichia pastoris)之分泌性水蛭素－Gly(A21)，Arg(B31)人類胰島素融合蛋白的基因序列表現載體選殖的發生與專利申請EP－A 1 364 032類似。不是使用序列引子pichia_H_Irev2，在這個案例中，是由引子ins_gly_rev2來建構及以後可能會利用PCR產物來表現Gly(A21)人類胰島素：5'－TTTTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG－3'(SEQ ID NO.：6)所產生的質體被命名為pPich_Hir_ins－GlyA21，純化Arg(B31)，Gly(A21)－微小前胰島素作為起始物來產生帶有二元鏈端的類似物，如所描述來實行。
例子10：酵母菌(Pichia pastoris)之直接分泌Arg(B31)，Gly(A21)前趨物的基因序列適合的表現載體的建構與例子7類似，質體pPich_Hir_ins－GlyA21之DNA以及兩段引子pich_insgly_dirf以及pich_insgly_dirrev是被需要的。
pich_insgly_dirf 5'－TTTTTICTCGAGAAAAGATTIGTTAACCAACACTTGTGTG－3'(SEQ ID NO.：7)
pich_insgly_dirrev 5'－TTITTT GGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCAC－3'(SEQ ID NO.：8)
例子11：從酵母菌分泌且包含正確地折疊的前胰島素的融合蛋白來製備Arg(B31)，Gly(A21)－胰島素，而且此融合蛋白包含HiS6 胺基酸序列質體pADH2Hir_ins_glyA21的DNA當作模版。兩個引子被合成：alpha_LT_H6_hirf和alpha_LT_H6_hirrev alpha_LT_H6_hirf1：5'－GCACCATCATCACCATCACTATACTGACTGCACTGAATC－3'(SEQ ID NO.：9)
引子包含6個組胺酸的密碼子和胺基酸3－8和9個(部分地)Refludan的序列alpha_LT_H6_hirf2：5'－GAAGGGGTACCTTTGGATAAAAGACTTACGCACCATCATCACCATCAC－3'(SEQ ID NO.：10)
引子包含6個組胺酸的密碼子和胺基酸1和2的重組水蛭素(lepirudin)序列和α因子的密碼子，其包括Lys－Arg處理位置且涵蓋限制酶Kpn l的辨認位置。在標準的PCR中，質體pADH2Hir_ins_glyA21的DNA當作模版，alpha_LT_H6_hirf1和來自本發明例子7的ins_gly_a21_rev當作引子。反應的產物被分離且被用來當作第二次PCR的模版，伴隨引子alpha_LT_H6_hirf2和ins_gly_a21_rev。反應的產物如所描述的被Kpnl和Ncol切割，然後選殖。結果是質體pADH2_LT_H6_Hir_ins_glyA21：在質體的DNA轉型到Y79後，融合蛋白被表現。藉由離心將細胞從上清液中分離，然後上清液經由膜過濾網來濃縮，例如從賽多利斯(Sartorius)，然後藉由鎳的親合性色層分析，遵循Invitrogen ProBond TM純化系統的步驟。藉由透析和/或過濾或膠體過濾來移除溶離的緩衝液之後，融合蛋白能被用已知的方式處理，使得到Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素，然後再轉變成甘精胰島素。
例子12：從酵母菌分泌且包括正確折疊的前胰島素的融合蛋白中製備Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素，而且其可藉由酵素腸激酶(enterokinase)將融合蛋白切除以質體pADH2Hir_ins glyA21的DNA當作起始物。使用從本案例子7的引子ins_gly_a21_rev和從申請案WO 02/070722 A1例子1的引子hirf1。為了這個目的，來製備這兩個新的引子：Hir_entero_insf 5'－CTTCAGGACGATGACGATAAATTIGTTAACCAACACTTGTGTGG－3'(SEQ ID NO.：11)
引子涵蓋微小前胰島素序列的胺基酸B1－B7和B8(部分地)，而且含有胺基酸序列Asp－Asp－Asp－Asp－Lys的密碼子，其為腸激酶辨認的位置。
Hir_entero_insrev 5'－TTTATCGTCATCGTCCTGAAGGCTGAAGGTATTCCTCAGGG－3'(SEQ ID NO.：12)
反轉引子則包含有重組水蛭素(lepirudin)序列的胺基酸60－65，而且含有胺基酸序列Asp－Asp－Asp－Asp－Lys(SEQ ID NO.：13)的密碼子，其為腸激酶辨認的位置。首先，先利用引子對hirf1/Hir_entero_insrev和Hir_entero_insf/ins_gly_a21_rev完成兩個PCR。再將反應的產物萃取出來。將分裝的材料混合並用在第三次PCR中，當作引子對hirf1/ins_gly_a21_rev的模版。如先前描述，再將反應之產物進行選殖。結果即為載體pADH2Hir_ins_glyA21。而融合蛋白的製備則如先前所描述的方式。
使用腸激酶來切割融合蛋白。此酵素可從廠商購得。
而切割的反應則是在腸激酶緩衝液中(20 mM Tris/HCI，50 mM氯化鈉，2 mM氯化鈣pH 7.4)進行，所使用的酵素含量則根據廠商的資料。通常切割反應是在宿主細胞移除後進行的，再接以一後續的步驟。然而，在經調整之最佳反應條件下，它也能直接在發酵後的上清液中進行反應。
例子13：從酵母菌分泌且包括正確折疊的前胰島素的融合蛋白中獲得Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素，且可藉由酵素腸激酶將融合蛋白切除，且包含聚組胺酸序列使用質體pADH2_LT_H6_Hir_ins_glyA21的DNA以及引子Hir_entero_insrev、Hir_entero_insf和ins_gly_a21_rev，而引子hirf1則以引子alpha_It_enterof取代，其序列為：5'－GAAGGGGTACCTTTGGATAAAAG－3'(SEQ ID NO.：13)
然後，和例子12相似，載體pADH2_LT_H6_Hir_etero_ins_glyA21包含有重組水蛭素融合蛋白的密碼子，且在位置3N端延長六個組胺酸，而從C端位置72開始，則為序列DDDDK(SEQ ID NO.：14)。
然後，藉由例子11及12所描述的方法，製備出Arg(B31)，Gly(A21)人類胰島素。
例子14：藉由麵包酵母菌所分泌出的水蛭素des－Phe(B1)，Arg(B31)，Gly(A21)胰島素融合蛋白之基因序列類似例子7的方式來進行轉型及表現。
兩個引子序列被合成：Desphef1：5'－CTTCAGGGAAATTCGGCACGAGTTAACCAACACTTGTGTGGTTC－3'(SEQ ID NO.：15)和Desphe_rev1：5'－GAACCACACA AGTGTTGGTT AACTCGTGCCGAATTTCCCT GAAG－3'(sEQ ID NO.：16)
來自例子7的質體pADH2Hir_ins_glyA21的DNA當作模版。獨立地進行兩個聚合酶連鎖反應。在反應1，引子Desphe_rev1和來自申請案EP－A 1 364 032的例子1的引子SEQ ID NO：4被使用，然後在反應2，使用來自目前應用的例子7的引子ins_gly_a21_rev和引子Desphef1。兩個反應的反應產物被分離，然後將分裝的產物結合當作第三次反應中的模版，為了來自申請案EP－A 1 364 032的例子1的引子和ins_gly_a21_rev所組成的引子對。第三次反應的反應產物被選殖、被轉型和表現如例子7所描述的。所生成的融合蛋白作為起始的材料來製備相符且帶有二元鏈端的胰島素類似物。
例子15：藉由麵包酵母所分泌的水蛭素Ala(B31)，Arg(B32)，Gly(A21)胰島素融合蛋白的基因序列兩個引子序列被合成：Ala_b31f1：5'－CTTCTACACTCCAAAGACGgctCGTGGTATCGTTGAACAATGTTG－3'(SEQ ID NO.：17)和Alab31rev1：5'－CAACATTGTT CAACGATACC ACGagcCGTCTTTGGAGTGT AGAAG－3'(SEQ ID NO.：18)
來自例子7的質體pADH2Hir_ins_glyA21的DNA當作模版。兩個聚合酶連鎖個別地反應被實行。在反應1，來自申請案EP－A 1 364 032的例子1的引子Ala_b31rev1和引子SEQ ID NO：4被使用，而在反應2，來自目前應用的例子7的引子ins_gly_a21_rev和引子Ala_b31f1被使用。兩個反應的反應產物被分離，且分裝的產物被合併做為模版在第三次反應中，而引子對包括來自申請案EP－A 1 364 032的例子1的引子SEQ ID NO：4和ins_gly_a21_rev。第三次反應的反應產物選殖、被轉型以及被表現如例子7所描述地。結果的融合蛋白當作起始材料，用來製備相對應帶有二元鏈端的胰島素類似物。
例子16：藉由麵包酵母來直接分泌的Lys(B31)前驅物的基因序列兩個引子被合成：Lys_b31f 5'－CTTCTACACTCCAAAGACGAAAGGTATCGTTGAACAATGTTG－3'(SEQ ID NO.：19)和Lys_b31rev 5'－CAACATTGTT CAACGATACC TTTCGTCTTTGGAGTGTAGAAG－3'(SEQ ID NO.：20)
來自申請案WO 02/070722A1的例子1的質體pADH2Hir_ins的DNA，作為兩個聚合酶連鎖反應的模版。在反應1，使用的引子為Lys_b31f1和insncolrev(Seq ID NO：6來自WO 02/070722 A1)，而在反應2，使用本發明例子7的引子Lys_b31rev和alpha_insfl。標準的反應被進行而且結果的PCR片段被分離。兩個分裝的產物被合併且作為第三次反應的模版，伴隨的引子為insncol rev和來自WO 02/070722A1的Seq ID NO：6。所生成的PCR產物被選殖和如同例子8所描述的方式來表現。結果是Lys(B31)－微小前胰島素，其與賴胺醯肽鏈內切酶轉變成B(1－29)－A(1－21)分離的胰島素，而且像是中間產物用來製備B30－精胺醯胺－胰島素或B30離胺醯胺－胰島素，其之後能被轉變成個別的二元類似物。
例子17：用賴胺醯肽鏈內切酶切割如DE3844211所描述的，胰島素前驅物和賴胺醯肽鏈內切酶(LEP)(例子1)反應。為了這個目的，將10毫克的Lys(B31)－微小前胰島素溶於Tris緩衝液(pH 8.0)，加入來自Lysobacter enzymogenes的LEP(在水中0.01毫升在水中的1毫克/毫升濃度的溶液，Merckbiosciences)。在室溫進行兩小時的反應，然後藉由RP－HPLC(Nucleosil 120－5管柱)來純化。結果為B(1－29)－A(1－21)分離的胰島素。
例子18：藉由B(1－29)－A(1－21)分離的胰島素的前驅物與精胺醯胺的偶合來製備Arg(B30)－胰島素將100毫克B(1－29)－A(1－21)分離的胰島素溶於0.95毫升精胺醯胺溶液中，然後加入0.13毫升的M醋酸鈉緩衝液(pH 5.8)和2毫升的二甲基甲醯胺。將反應混合物冷卻至12℃，而且當加入0.094毫升的胰蛋白酶(0.075毫克，羅氏診斷)則開始反應。
經8小時後，加入三氟乙酸(TFA)至pH2.5來停止反應，並以HPLC來分析，有大於60%之－Arg(B30)－胰島素醯胺形成。加入胰蛋白酶抑制劑溶液，接著用類似於US 5,656,722的方式來純化經醯胺化的類似物。經醯胺化之胰島素類似物在酸存在下被水解數小時，即可得到Arg(B30)胰島素，或者直接使用醯胺當作藥劑。
例子19：藉由B(1－29)－A(1－21)分離的胰島素的前驅物與離胺醯胺的偶合來製備Lys(B30)－胰島素將100毫克B(1－29)－A(1－21)分離的胰島素溶於0.93毫升離胺醯胺溶液中(400克/公升)，然後加入0.13毫升M醋酸鈉緩衝液(pH 5.8)和2毫升二甲基甲醯胺。將反應混合物冷卻至12℃，而且當加入0.094毫升的胰蛋白酶(0.075毫克，羅氏診斷)則開始反應。在8小時後，藉由加入三氟乙酸至pH2.5來停止反應，然後用來HPLC分析。Lys(B30)－離胺醯胺被形成，而且加入胰蛋白酶抑制劑溶液後，接著用類似於US 5,656,722的方式來純化。經醯胺化之胰島素類似物在酸存在下被水解數小時，即可得到Lys(B30)－胰島素，或直接地被用來當作藥劑。
<110> 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司
<120> 製備具有二元B鏈端的胰島素類似物之方法
<130> DE2006/025
<140> 096124845
<141> 2007-07-09
<150> DE 10 2006 031 955.9
<151> 2006-07-11
<160> 20
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 胰島素-融合蛋白
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工的
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<212> DNA
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<220>
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<223> Erkennungssequenz
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<212> DNA
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<220>
<223> 引子Lys_b31rev
<400> 20

Claims (17)

  1. 一種製備胰島素類似物或其衍生物之方法，其中胰島素類似物的特徵在一般分子式I 其意義為 該方法包含：加入經醯胺化或具有保護C-端之保護基的一自然發生鹼性胺基酸，於起始的胰島素類似物或其衍生物，其A和/或B鏈的C-端胺基酸是選自包含自然發生的鹼性胺基酸或類似物或其衍生物之群組，於所述的C-端胺基酸之一上且於具有胰蛋白酶的生理活性之酵素存在下，純化所產生的經修飾胰島素類似物，以及選擇性去除醯胺基團或加入的胺基酸的C-端保護基或加入的胜肽。
  2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中起始的胰島素 類似物特徵在一般分子式II 其R1，(A1-A5)，(A8-A10)，(A12-A19)，A21，R2，R3，B1，B3，(B8-B18)，(B20-B26)，B27，B28，B29，B30和R4定義如申請專利範圍第1項，以及B鏈的C-端胺基酸殘基是選自包括自然發生的鹼性胺基酸之群組。
  3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中經醯胺化之或是具有保護C-端的保護基之自然發生的鹼性胺基酸是C-端經醯胺化之精胺酸。
  4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中經修飾胰島素類似物是Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人類胰島素，其B鏈的C端是經醯胺化者。
  5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中起始的胰島素類似物是Gly(A21)，Arg(B31)人類胰島素。
  6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中起始胰島素類似物的製備是藉由重組前驅物蛋白的表現，該前驅物蛋白包含起始胰島素類似物的A鏈和B鏈。
  7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中複製子(replicon) 的部分之基因被表現。
  8. 根據申請專利範圍第7項之方法，其中細菌或酵母菌被使用為宿主細胞。
  9. 根據申請專利範圍第6至8項中任一項之方法，其中前驅物蛋白是在表現之後分泌的。
  10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中前驅物蛋白是分離自細菌或酵母菌細胞的上清液。
  11. 根據申請專利範圍第8項製備經修飾胰島素類似物或其衍生物之方法，其中前驅物蛋白是分離自細菌的細胞間質(periplasm)。
  12. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中任何所述的申請專利範圍所得之前驅物蛋白係由折疊過程和酵素切割所得到的。
  13. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中起始胰島素類似物是利用重組直接表現來製備。
  14. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中酵素具有胰蛋白酶的生理活性，其係選自包含人類胰蛋白酶，豬的胰蛋白酶，牛的胰蛋白酶以及人類胰蛋白酶，豬的胰蛋白酶，牛的胰蛋白酶的變體之群組。
  15. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中酵素具有賴胺醯肽鏈內切酶活性。
  16. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中修飾後的胰島素類似物的B鏈的C-端接著在水解反應中被去保護。
  17. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中所得之胰島素 類似物為Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人類胰島素。
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