MX2009000275A - Metodo para preparar analogos de insulina con extremo de cadena b dibasico. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para producir un tipo de insulina por ingeniería genética de un precursor de la misma y convertir dicho precursor en una reacción de ligadura catalizada de enzima con lisinamida o argininamida o con lisina o arginina modificada por grupos protectores y opcionalmente posterior hidrólisis, para dar esta insulina.

Description

METODO PARA PREPARAR ANALOGOS DE INSULINA CON EXTREMO DE CADENA B DIBASICO DESCRIPCION La invención se refiere a un método para preparar una insulina con extremo de cadena dibásico por preparación biotecnológica de un precursor de la misma y posterior conversión en una reacción de ligadura catalizada de enzima con lisinamida o argininamida o lisina o arginina modificada por grupos protectores y opcionalmente posterior hidrólisis, para dar esta insulina. Aproximadamente 177 millones de personas en el mundo padece diabetes sacarina. Estos incluyen aproximadamente 17 millones de diabéticos de tipo I para los que el tratamiento restitutivo para la ausencia de secreción de insulina endocrina es el único tratamiento posible actualmente. Los afectados dependen de inyecciones de insulina, normalmente varias veces al día, durante toda la vida. La diabetes de Tipo II contrasta con la diabetes de tipo I en que no siempre hay una deficiencia de insulina pero en un gran número de casos, especialmente en la fase avanzada, el tratamiento con insulina, donde sea apropiado combinado con un antidiabético oral, se considera como el tipo de tratamiento más favorable. En personas sanas, la liberación de insulina está estrictamente ligada a la concentración de glucosa en sangre. Los niveles de glucosa en sangre elevados como los que tienen lugar después de las comidas se compensan rápidamente por un correspondiente aumento en la secreción de insulina. En ayunas, el nivel de insulina en plasma cae a un valor de referencia que es suficiente para asegurar un suministro continuo de glucosa a órganos y tejidos sensibles a la insulina y para mantener la producción de glucosa hepática baja durante la noche. La sustitución de la secreción de insulina endógena por administración normalmente subcutánea, exógena, de insulina, no se aproxima normalmente a la calidad de la regulación fisiológica de glucosa en sangre descrita anteriormente. Son frecuentes las readaptaciones hacia arriba o hacia abajo del nivel de glucosa en sangre y pueden ser potencialmente mortales en sus formas más graves. Sin embargo, además, los niveles de glucosa en sangre elevados que duran durante años representan, incluso sin síntomas iniciales, un considerable riesgo para la salud. El estudio DCCT a gran escala en los EE.UU. (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1.993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986) demuestran inequívocamente que los niveles de glucosa en sangre crónicamente elevados son sustancialmente responsables del desarrollo de complicaciones diabéticas tardías. Las complicaciones diabéticas tardías y el daño micro- y macrovascular que en algunas circunstancias se hacen manifiestos como: retinopatía, nefropatía o neuropatía y conducen a ceguera, insuficiencia renal y pérdida de las extremidades y, además, se asocian con un riesgo superior de trastornos cardiovasculares. Se tiene que deducir de ello que un tratamiento mejorado de la diabetes debe conseguir principalmente mantener la glucosa en sangre tanto como sea posible dentro del intervalo fisiológico. La política del tratamiento intensivo con insulina pretende conseguir esto mediante inyecciones varias veces al día de preparaciones de insulina de acción rápida y lenta. Las formulaciones de acción rápida se dan a las horas de las comidas para compensar el aumento posprandial en la glucosa en sangre. Se desea que las insulinas básales de acción lenta aseguren el suministro básico de insulina especialmente durante la noche sin conducir a hipoglucemia. La insulina es un polipéptido que consta de 51 aminoácidos divididos en 2 cadenas de aminoácidos: la cadena A con 21 aminoácidos y la cadena B con 30 aminoácidos. Las cadenas se unen entre sí por 2 puentes disulfuro. Las preparaciones de insulina se han empleado durante muchos años para el tratamiento de la diabetes. Por otra parte, no sólo se usan insulinas existentes en la naturaleza, sino más recientemente también derivados de insulina y análogos. Los análogos de insulina son análogos de insulinas existentes en la naturaleza, es decir insulina humana o insulinas animales que difieren por la sustitución de al menos un resto aminoácido existente en la naturaleza por otros restos aminoácido y/o la adición/delección de al menos un resto aminoácido de la insulina existente en la naturaleza, por lo demás idéntica, correspondiente. La patente de EE.UU. 5.656.722 por ejemplo describe derivados de insulina des-Phe( B1) Los restos aminoácido que se han añadido y/o sustituido también pueden ser no existentes en la naturaleza.

Los derivados de insulina son derivados de insulinas existentes en la naturaleza o análogos de insulina en que se sustituye uno o más restos aminoácido y/o el N o el C terminal de la cadena A y/o B por grupos funcionales. Los grupos funcionales se seleccionan de un grupo que comprende: restos amida, restos amina, restos carboxilo, restos alquilo, restos alcohol y restos alcoxi. Un tratamiento de insulina eficaz hace uso de insulinas denominadas básales. Mediante éstas se quiere decir formulaciones que hacen posible la liberación continua, lenta, de la insulina administrada de manera exógena. De esta manera, se consigue durante un periodo prolongado una concentración de insulina de referencia en el cuerpo con efectos ventajosos en el estado fisiológico de la persona que padece diabetes. El análogo insulínico recombinante de insulina humana Gly(A21 ), Arg(B31), Arg(B32) (insulina glargina) es con relación a esto significativo por la necesidad de ser suministrado al cuerpo sólo cada 24 horas - es decir, sólo uno al día - para conseguir un efecto basal. La administración una vez al día conduce a una calidad de vida mejorada. La fisiología mejorada conduce por ejemplo a una reducción del nivel Hbal c y se puede esperar que, debido a esta mejora, aparecerá la secuela tardía de la diabetes - si es que lo hace - considerablemente más tarde, haciendo posible así prolongar la esperanza de vida del diabético pertinente. La demanda de este análogo insulínico es igualmente alto. Puesto que el número de diabéticos está creciendo continuamente, es por otra parte de interés económico minimizar los costes para preparar los análogos correspondientes. La patente de EE.UU. 5.656.722 describe la posible preparación de análogos de insulina mediante una proteína de fusión de preproinsulina que consiste en una porción de fusión ("porción pre") y de una variante de proinsulina de mono. Uno de los análogos descritos comprende glicina en vez de asparagina en la posición A(21). La proteína de fusión correspondiente es una variante del precursor peptídicp para preparar insulina glargina. El método proporciona delección de la porción pre y el péptido C de esta proteína de fusión por reacción con tripsina. La patente europea EP-A 0 668 292 describe una proteína de fusión que sigue el mismo principio pero permite que se prepare insulina glargina por un método que es una mejora sobre la patente de EE.UU. 5.656.722. Es obvio para el experto a este respecto que es posible una escisión parcial en particular en la frontera de la cadena B y cadena C de la insulina, que se define por la estructura dibásica Arg-Arg y conduce a un análogo de insulina humana mono-arg B31. Este producto defectuoso se debe retirar del verdadero compuesto de interés. Esto conduce a una considerable disminución del rendimiento. El problema se puede evitar por preparación recombinante de proinsulinas y reacción de las mismas con una endoproteasa específica tal como, por ejemplo, lisil endopeptidasa y haciendo reaccionar la insulina humana des-B30 resultante (análogo) en una estrategia de química semisintética de péptidos con el tripéptido Thr-Arg-Arg. La patente europea EP-A 0 132 769 y la patente internacional WO 2003/044210 describen la necesidad de proteger los grupos reactivos del tripéptido durante la reacción. Los grupos protectores se eliminan posteriormente a la reacción. Esta ruta se asocia con costes que surgen de la preparación del tripéptido por síntesis química y la introducción de grupos protectores. Así, sería deseable tener un método que permita preparar análogos de insulina Arg(B31), Arg(B32) a partir del precursor de insulina humana Arg(B31). La solicitud de patente alemana No. 10 2005 046 1 13.1 (no publicada) describe un método que incluye la ligadura catalizada de tripsina de aminoácidos con amidación C-terminal a péptidos cuyo aminoácido C-terminal consiste en lisina o arginina. Los rendimientos observados en este caso son sorprendentemente altos y es posible por otra parte llevar a cabo la reacción de acoplamiento sin enmascaramiento con grupos protectores. La reacción tiene lugar en un medio no acuoso. Ahora se ha encontrado sorprendentemente que es posible el acoplamiento de amida arginina o amida lisina a análogos de insulina B31 con altos rendimientos. Es posible por otra parte sorprendentemente controlar la reacción a fin de que haya formación preferente de análogos de insulina de la forma amida de insulina humana Arg(B31), Arg(B32) o de la forma amida de insulina humana Arg(B31 ), Lys(B32). El rendimiento es por otra parte mayor que 60%. El grupo amido se puede eliminar por hidrólisis ácida al final de la reacción. Se ha encontrado asimismo sorprendentemente que es posible como alternativa a lisinamida o argininamida emplear en la reacción arginina o lisina posiblemente con un grupo protector. Los grupos protectores que se pueden mencionar como ejemplo son terc-butiloxicarbonilo (Boc) o dimetoxifenilpropiloxicarbonilo (DZZ). Puesto que hay descripciones en la bibliografía de que pueden ser inestables derivados de arginina protegidos en particular en diversos disolventes, es obvio para el experto que hay un desarrollo continuo de nuevos grupos protectores que presenten el efecto de estabilidad mejorada en la química de péptidos. Es posible una influencia positiva en el rendimiento por la variación de las condiciones de reacción de acuerdo con los grupos protectores o el grupo amido. Esto es conocido para el experto y la invención también se refiere a esto. El producto de escisión parcial insulina humana B(31), que en la preparación de insulina glargina o análogos de insulina Arg(B31), Arg(B32) comparables a partir de precursores de preproinsulina (patente de EE.UU. 5.656.722) llega a estar así disponible para preparar el producto de valor. En este caso no se requiere preparar las proteínas de fusión correspondientes intracelularmente. Es obvio para el experto que también se pueden preparar análogos de proinsulina por expresión bacteriana con secreción posterior en el periplasma y/o en el cultivo sobrenadante. La solicitud de patente europea EP-A 1 364 029 describe esto por medio de ejemplo. La invención también se refiere al uso de precursores de insulina humana Arg(B31) que resultan directamente después de la expresión a partir de dichos métodos bacterianos. Hay además un aspecto técnico adicional del método, al que se refiere asimismo la invención. La solicitud de patente europea EP-A 0 347 781 y las solicitudes de patente europeas EP-A 1 364 030 y EP-A 1 364 032, describen métodos basados en levaduras para preparar miniproinsulinas con altos rendimientos. La extensión de dicho método o uno similar a la preparación de miniproinsulinas con los restos aminoácido descritos en la patente de EE.UU. 5.656.722, es decir Gly, Ala, Val, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp o Glu, en la posición A21 permite que estas miniproinsulinas se conviertan en los análogos de insulina Arg(B31), Arg(B32) inmediatamente después de la escisión en la insulina de dos cadenas. Si tiene lugar la expresión, como se describe en la patente europea EP-A 1 364 032, mediante una proteína de fusión, es ventajoso no eliminar la porción pre con tripsina o endoproteasas similares. En su lugar, se incorpora un sitio de escisión que se reconozca por una endoproteasa específica que no escinda el derivado de insulina, para eliminar la porción pre o de fusión apropiadamente. Se mencionan la enterocinasa (DDDDK) o el factor Xa (IEGR) por medio de ejemplo. La invención también se refiere a ello. Por otra parte es obvio para un experto que las dos reacciones de escisión pueden transcurrir en una reacción en un único paso. Otra posibilidad es eliminar la porción de fusión sólo en una etapa posterior. Se puede elegir en este caso que la porción de proteína de fusión sea derivados de un gran número de proteínas segregadas eficazmente. Ejemplos de bacterias que se pueden mencionar son DHFR (dihidrofolato reductasa), glutatión S-transferasa e hirudina. Los ejemplos que se pueden usar para secreción de levaduras son albúmina o derivados de la misma, superóxido dismutasa o derivados, interleucina 2 o derivados e hirudina o derivados. En la presente solicitud, por medio de ejemplo se usa un derivado de hirudina como porción de fusión para tanto expresión bacteriana como para expresión de levaduras. A este respecto se ha encontrado sorprendentemente que se puede modificar además la secuencia de la hirudina por la introducción de una secuencia peptídica de histidinas consecutivas y/o una secuencia peptídica DDDDK que representa el sitio de reconocimiento para la enterocinasa, sin afectar desfavorablemente al plegado de la porción de miniproinsulina. Los métodos de cromatografía de afinidad están así disponibles. La invención también se refiere a ello. El experto está además familiarizado con el hecho de que los sistemas de expresión descritos por medio de ejemplo sólo representan un pequeño segmento de los sistemas /vector desarrollados para la preparación recombinante de proteínas. Los sistemas hospedador/vector que permiten la preparación de los péptidos objetivo también forman parte así de la invención. La invención así se refiere a la preparación de análogos de insulina que se caracterizan por la presencia de los restos aminoácido Arg(B31), Arg(B32) o Arg(B31), Lys(B32) a partir de precursores de insulina humana Arg(B31) de los análogos mediante ligadura catalizada de tripsina con arginina o lisina. Es obvio para el experto en relación con esto que, debido a la sorprende selectividad de la reacción, también se puede repetir la reacción de ligadura por una pluralidad de ciclos de reacción a fin de que lleguen a estar disponibles los análogos de insulina con los aminoácidos básicos adicionales lisina o arginina más allá de las posiciones B31 y B32. Esto se consigue llevando a cabo una reacción de acoplamiento, desamidación o desprotección del aminoácido terminal y empleando el producto de nuevo en un ciclo de reacción posterior apropiado. Dichos productos se pueden obtener asimismo usando un análogo que tenga ya Arg(B31), Arg(B32) o Arg(B31), Lys(B32) como precursor. Es posible asimismo preparar análogos que comprendan en la posición B31 y después cualquier aminoácido genéticamente codificable que no requiera ser arginina o lisina secuencialmente pero cuyo extremo C-terminal se caracterice por la secuencia dibásica: Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys o Lys-Arg. La reacción no está limitada por lo tanto al uso de tripsina como catalizador. Es conocido para el experto que, además de las tripsinas de rata, bovina, porcina o humana, comercialmente disponibles, conocidas u otras isoenzimas o derivados o variantes de las mismas, también es posible usar las siguientes enzimas: catepsina, tripsina a partir de Fusarium oxysporum y a partir de Streptomyces (S. griseus, S. exfoliatus, S. erythraeus, S. fradiae y S. albidoflavus), triptasa, mastina, acrosina, kalikreina, hepsina, prostasina I, lisil endopeptidasa (Lisina -C) y endoproteinasa Arg-C (clostripaina). La invención por lo tanto se refiere a un método para preparar un análogo insulínico o un derivado del mismo, en que: se añade un aminoácido básico existente en la naturaleza que esté amidado o protegido en el C-terminal con un grupo protector o un péptido que conste de aminoácidos básicos, existentes en la naturaleza o análogos o derivados de los mismos y esté amidado o protegido en el C-terminal con un grupo protector, a un análogo insulínico inicial o un derivado del mismo cuyo aminoácido C-terminal de la cadena A y/o B se selecciona de un grupo que comprende aminoácidos básicos, existentes en la naturaleza o análogos o derivados de los mismos, en uno de dichos aminoácidos C-terminales en presencia de una enzima con la actividad biológica de la tripsina y se purifica el análogo insulínico modificado resultante y opcionalmente se elimina el grupo amido o grupo protector C-terminal del aminoácido añadido o del péptido añadido. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde el análogo insulínico se caracteriza por la fórmula general I: R1-(A1-A5)-Cys-Cys- (A8 - A10)- Cys-(A12-A19)-Cys-A21-R2 (cadena A) (i) R3-B1-Val-B3-Gln-His -Leu- Cys- (B8 - B 8) -Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30-R4-R5 (cadena B) en que los significados son: (A1-A5) los restos aminoácido en las posiciones A1 a A5 de la cadena A de insulina humana o insulina animal, (A12-A19) los restos aminoácido en las posiciones A12 a A19 de la cadena A de insulina humana o insulina animal, A21 un resto aminoácido existente en la naturaleza, (B8-B18) los restos aminoácido en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de insulina humana o insulina animal, (B20-B26) los restos aminoácido en las posiciones B20 a B26 de la cadena B de insulina humana o insulina animal, (A8-A10) los restos aminoácido en las posiciones A8 a A10 de la cadena A de insulina humana o insulina animal, B30 un enlace químico o un resto aminoácido existente en la naturaleza, B1 un enlace químico o un resto aminoácido existente en la naturaleza, B3 un resto aminoácido existente en la naturaleza, B27, B28 y B29 un resto aminoácido existente en la naturaleza, R1 un grupo amino o uno a tres restos aminoácido existentes en la naturaleza, R2 un grupo carboxi o uno a tres restos aminoácido existentes en la naturaleza, R3 un grupo amino o uno a tres restos aminoácido existentes en la naturaleza, R4 un enlace químico o uno a tres restos aminoácido existentes en la naturaleza, donde el resto aminoácido existente en el C-terminal representa un aminoácido básico, R5 uno o dos restos aminoácido básicos cuyo C-terminal está bien libre o amidado, donde el resto aminoácido cuyo C terminal está unido al N terminal de R5 se selecciona de un grupo que comprende aminoácidos básicos, existentes en la naturaleza. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde el análogo insulínico inicial se caracteriza por la fórmula general II: S S R1 -(A1-A5)- Cys-Cys- (A8 - A10) -Cys-(A12-A19)-Cys-A21-R2 (cadena A) | S S ~S S (II) R3-B1 -Val-B3-Gln-His-I_eu- Cys- (B8 - B18) -Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30-R4 (cadena B) donde R1 , (A1-A5), (A8-A10), (A12-A19), A21 , R2, R3, B1 , B3, (B8-B18), (B20-B26), B27, B28, B29, B30 y R4 se definen como en la reivindicación 1 y el resto aminoácido C-terminal de la cadena B se selecciona de un grupo que comprende, aminoácidos básicos existentes en la naturaleza. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde el aminoácido básico existente en la naturaleza, que está amidado o protegido en el C terminal con un grupo protector es arginina amidada en el C-terminal o arginina protegida en el C-terminal con un grupo protector Boc. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde el análogo insulínico modificado es insulina humana Gly(A21 ), Arg(B31), Arg(B32) cuyo extremo C-terminal de la cadena B está amidado, siendo el análogo insulínico inicial en particular insulina humana Gly(A21), Arg(B31). La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde se prepara el análogo de insulina inicial por expresión recombinante de una proteína precursora que comprende la cadena A y la cadena B del análogo de insulina inicial, en particular un método de este tipo donde se expresa un gen que es parte de un replicón. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde se usa una bacteria o una levadura como célula hospedadora.

La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde la proteína precursora se segrega después de la expresión, en particular donde se aisla la proteína precursora del sobrenadante celular de bacterias o levaduras. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde la proteína precursora se aisla del periplasma de una bacteria. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde la proteína precursora obtenida según cualquiera de dichas reivindicaciones se somete a un proceso de plegado y escisión enzimática. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde se prepara el análogo de insulina inicial por expresión directa recombinante. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde la enzima con la actividad biológica de la tripsina se selecciona de un grupo que comprende: tripsina humana, tripsina porcina, tripsina bovina y una variante de tripsina humana, tripsina porcina y tripsina bovina. La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, donde el extremo C-terminal de la cadena B del análogo de insulina modificado está con posterioridad desprotegido en una reacción de hidrólisis.

La invención se refiere además a un método como se describió anteriormente, en que el análogo resultante de insulina es insulina humana Gly(A21 ), Arg(B31), Arg(B32). La invención se refiere además al uso de un análogo insulínico o de un derivado del mismo cuyo aminoácido C-terminal de la cadena A y/o B está amidado como medicamento. La invención se refiere además a un análogo insulínico o un derivado del mismo obtenible por un método como se describió anteriormente, cuyo aminoácido C-terminal de la cadena A y/o B está amidado. La invención se explica en más detalle a continuación por medio de algunos ejemplos de procedimiento. No desea que estos ejemplos de procedimiento tengan un efecto restrictivo.

EJEMPLO 1 : PREPARACION DE INSULINA ARG(B31), GLY(A21) A PARTIR DE UNA PROTEINA DE FUSION DESPUES DE PLEGADO IN VITRO La patente de EE.UU. 5.663.291 describe en el ejemplo 1 en la misma la obtención de una proteína de fusión de insulina correctamente plegada de la estructura: MATTSTGNSA RFVNQHLCGS HLVEALYLVC GERGFFYTPK TRREAEDPQV GQVELGGGPG AGSLQPLALE GSLQKRGIVE QCCTSICSLY QLENYCG (SEC ID NO.: 1) Este material se convierte de acuerdo con el ejemplo V de la patente de EE.UU. 5.227.293 por reacción con tripsina en insulina de doble cadena y se aislan insulina Arg(B31 ), Arg(B31), Gly(A21) e insulina Arg(B31), Gly(A21 ). Así es posible obtener el análogo insulínico Arg(B31), Arg(B31), Gly(A21 ) directamente, mientras se puede emplear el subproducto de Arg(B31), Gly(A21) como precursor en la ligadura catalizada con tripsina con arginina o lisina modificada.

EJEMPLO 2: PREPARACION DE INSULINA ARG(B31), GLY(A21 ) A PARTIR DE UNA PROTEINA DE FUSION QUE SE HAYA OBTENIDO POR SECRECION Y COMPRENDA PROINSULINA CORRECTAMENTE PLEGADA Como alternativa al ejemplo 1 , también se pueden preparar proteínas de fusión por secreción en sistemas bacterianos. En este caso, la estructura de la proinsulina como parte de la proteína de fusión está correctamente plegada y se puede dispersar con la etapa de replegado 'in vitro'. La solicitud de patente internacional WO 02/068660 propone un sistema de este tipo. Si, por ejemplo, se reemplaza el codón para Asn(A21 ) por un codón para Gly(A21) en el plásmido pBpfuHirJns que se describe en el ejemplo 1 de esta solicitud de patente internacional, el resultado es una proteína de fusión a partir de la cual se puede obtener insulina glargina por medio de ejemplo y por otra parte se puede aislar insulina humana Arg(B31), Gly(A21) como subproducto, como se describe en el ejemplo 1. Para preparar la secuencia, se requiere una nueva matriz insu_a21_gly_rev con la siguiente estructura: 5'-TTTTTTAAGCTTGTCGACTCATTAGCCGCAGTAGTTCTCCAGCTG-3' (SEC ID NO.: 2) Esta matriz se emplea en analogía con la solicitud de patente internacional WO 02/068660 con la matriz pful en ADN del plásmido pBpfuHirJns en una PCR (por sus siglas en inglés). Es posible aislar del producto PCR un fragmento de BamH1/Hind3 que se pueda clonar de acuerdo con el ejemplo de la solicitud de patente internacional WO 02/068660. Después de la expresión, se aisla una proteína de fusión y se trata además de acuerdo con el ejemplo 1 de la presente solicitud. Es obvio para el experto que el precursor de insulina humana Arg(B31), Gly(A21) también se puede obtener directamente por secreción bacteriana de una proteína de fusión. La invención también se refiere a ello.

EJEMPLO 3: PREPARACION DE INSULINA ARG(B31 ), ARG(B32), GLY(A21) A PARTIR DE UN PRECURSOR DE ARG(B31), GLY(A21) POR ACOPLAMIENTO CON ARGININAMIDA Se disuelven 100 mg de insulina 21A-Gly-30B a L-Arg en 0,95 mi de disolución de argininamida (446 g/l) y 0,13 mi de tampón de acetato de Na M (pH 5,8) y se añaden 2 mi de DMF. La mezcla de reacción se enfría a 12°C y se empieza añadiendo 0,094 mi de tripsina (0,075 mg, Roche Diagnostics). Después de 8 h, la reacción se detiene añadiendo TFA a pH 2,5 y se analiza por HPLC. Se forma insulina humana > 60%-Arg(B31), Arg(B32), Gly(A21 ). La adición de disolución inhibidora de tripsina va seguida por la purificación del análogo amidado en analogía con la patente de EE.UU. 5.656.722. Después se hidroliza el análogo insulínico amidado en presencia de ácido durante varias horas para dar insulina humana Arg(B31), Arg (B32), -Gly(A21).

EJEMPLO 4: PREPARACION DE INSULINA HUMANA ARG(B31), LYS(B32), GLY(A21 ) A PARTIR DE UN PRECURSOR DE INSULINA HUMANA ARG(B31), GLY(A21 ) POR ACOPLAMIENTO CON LISINAMIDA Se disuelven 100 mg de insulina 21A-Gly-30B a L-Arg en 0,93 mi de disolución de lisinamida (400 g/l) y 0,13 mi de tampón de acetato de Na M (pH 5,8) y se añaden 2 mi de DMF. La mezcla de reacción se enfría a 12°C y se empieza añadiendo 0,094 mi de tripsina (0,075 mg, Roche Diagnostics). Después de 8 h, la reacción se detiene añadiendo TFA a pH 2,5 y se analiza por HPLC. Se forma insulina humana Arg(B31), Lys(B32)-NH2, Gly(A21 ) y se purifica después de adición de disolución inhibidora de tripsina en analogía con la patente de EE.UU. 5.656.722. Después se hidroliza el análogo insulínico amidado en presencia de ácido durante varias horas, para dar insulina humana Arg(B31), Lys(B32), Gly(A21).

EJEMPLO 5: PREPARACION DE INSULINA ARG(B31), ARG(B32), GLY(A21) A PARTIR DE UN PRECURSOR DE ARG(B31), GLY(A21) POR ACOPLAMIENTO CON H-ARG (BOC)2-OH Se mezclan 0,25 mg de insulina humana Arg(B31), Gly(A21 ) en un recipiente Eppendorf con 11 µ? de tampón de acetato de piridina 0,1 M (pH 5,6), 60 µ? de una disolución de 130 g/l de H-Arg(Boc)2-OH x HCI en tampón de acetato de piridina 0,1 M (pH 5,6) y 1 19 µ? de DMF y se incubó con tripsina (Roche Diagnostics) a 12°C, durante algunas horas. La reacción se detuvo añadiendo una mezcla de 25% de agua, 25% de acetonitrilo y 50% de ácido trifluoroacético. La mezcla se liofiliza y para eliminar el grupo protector, se disuelve en 1 mi de TFA y se deja reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas. La purificación de la insulina humana Arg(B31), Arg(B32)-NH2, Gly(A21 ) tiene lugar por medio de ejemplo en analogía con la patente de EE.UU. 5.656.722.

EJEMPLO 6: PREPARACION DE INSULINA ARG(B31), LYS(B32), GLY(A21) A PARTIR DE UN PRECURSOR DE ARG(B31 ), GLY(A21) POR ACOPLAMIENTO CON H - LYS (BOC)-OTBU Se disuelven 50 mg de insulina humana Arg(B31 ), -Gly(A21 ) en 0,62 mi de disolución de H-Lys (Boc)-OtBu (0,5 g/ml, pH 5) y se añade 1 mi de ?,?-dimetilformamida (DMF). La mezcla se enfría a 12°C y se añaden 2 mg de tripsina (Roche Diagnostics). Después de más de 10 horas, la reacción se detiene por adición de 2 mi de una mezcla acetonitrilo/agua de concentración al 50% y 1 mi de TFA (100%). La mezcla se liofiliza y para eliminar el grupo protector Boc, se disuelve en 1 mi de TFA y se deja reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas. La purificación de la Arg(B31), Lys(B32), OH tiene lugar por medio de ejemplo en analogía con la patente de EE.UU. 5.656.722.

EJEMPLO 7: SECUENCIA GENETICA PARA LA SECRECION DE UNA PROTEINA DE FUSION DE HIRUDINA E INSULINA ARG(B31 ), GLY(A21) POR LEVADURA DE PANADERIA.

La solicitud de patente europea EP-A 1 364 032 propone el uso de hirudina como pareja de fusión para la expresión y secreción de otras proteínas farmacéuticamente interesantes de valor en las levaduras. El Ejemplo 1 de la solicitud de patente europea EP-A 1 364 032 describe el sistema hospedador-vector para preparar una proteína de fusión que consiste en un derivado de hirudina y miniproinsulina. Este sistema se puede usar por medio de ejemplo para preparar miniproinsulinas que en la posición A21 el aminoácido asparagina por aminoácidos como se describe en la patente de EE.UU. 5.656.722. El vector de expresión se puede construir en analogía con el ejemplo de la solicitud de patente europea EP-A 1 364 032 si se sustituye la matriz insncolrev y se diseña a fin de que se modifique el codón en la posición A21. Para preparar la secuencia que codifique insulina humana Arg(B31), Gly A(21), por ejemplo se sintetiza la siguiente matriz: ins_gly_a21_rev 5'- TTTTTTCCATGGGTCGACTATCAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG-3' (SEC ID NO.: 3) La matriz en este caso cubre completamente el segmento génico que codifica los aminoácidos A15-A21 del análogo insulínico. La combinación de esta matriz con la matriz de la SEC ID NO:4 del ejemplo 1 de la solicitud y el uso del plásmido pADH2Hir_ins como matriz iniciadora permite la generación por PCR de un fragmento de ADN que, después de la digestión con las enzimas de restricción Kpnl y Ncol, se inserta en el vector de expresión igualmente abierto y comprende la proteína de fusión deseada. El vector se denomina pADH2Hir_ins_glyA21. La proteína de fusión se expresa y se procesa de acuerdo con la solicitud de patente europea EP-A 1 364 032 para dar miniproinsulina Gly(A21), que se convierte de acuerdo con el ejemplo 2 en insulina humana Arg(B31), Lys(B32), Gly(A21).

EJEMPLO 8: SECUENCIA GENETICA PARA SECRECION DIRECTA DEL PRECURSOR ARG(B31 ), GLY(A21 ) POR LEVADURA DE PANADERIA Se usa ADN del plásmido pADH2Hir_íns_glyA21 descrito en el ejemplo 7, para preparar una construcción del vector para secreción directa de insulina humana Arg(B31), Gly A(21). Se sintetizan las siguientes matrices. alfa insfl (SEC ID NO.: 4) Cubre la secuencia del C terminal del factor-alfa, codones para Lys-Arg y del N-terminal de la secuencia de miniproinsulina. ins_gly_rev2 5' - TTTTTTCCAT GGGTCGCTAT CAGCCACAGT AGTTTTCCAG CTGG -3' (SEC ID NO.: 5) La matriz se híbrida con el extremo 3' de la secuencia del análogo insulínico clonado en el plásmido pADH2Hir_ins_glyA21. Una PCR (condiciones estándar) genera un fragmento de ADN que, después de digestión con las enzimas de restricción Kpnl y Ncol, se inserta en el vector de expresión igualmente abierto y comprende la proteína de fusión deseada. Las células insuficientes de levadura transforman la cepa Y79. Las transformantes se expresan con posterioridad como se describe en el ejemplo 7. La miniproinsulina Arg(B31), Gly(A21) se aisla por métodos conocidos (patente europea EP-A 0 229 998) y se convierte como en el ejemplo 2 en insulina humana Arg(B31), Lys(B32), Gly(A21).

EJEMPLO 9: SECUENCIA GENETICA PARA LA SEGREGACION DE UNA PROTEINA DE FUSION DE HIRUDINA E INSULINA HUMANA ARG(B31), GLY(A21) POR PICHIA PASTORIS La clonación del vector de expresión tiene lugar en analogía con el ejemplo 4 de la solicitud de patente europea EP-A 1 364 032. En vez de la matriz de la secuencia pichia_H_lrev2, en este caso se emplea la matriz ¡ns_gly_rev2 y más tarde permite la posibilidad de expresión de insulina humana Gly(A21) con el producto PCR: 5'-TTTTTGGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCACAGTAGTTTTCCAGCTGG -3' (SEC ID N0 6).

El plásmido resultante se denomina pPich_Hir_ins-GlyA21. La purificación de miniproinsulina Arg(B31), Gly(A21 ) como material de partida para generar un análogo con extremo de cadena dibásico se lleva a cabo como se describe.

EJEMPLO 10: SECUENCIA GENETICA PARA SECRECION DIRECTA DEL PRECURSOR ARG(B31 ), GLY(A21 ) POR PICHIA PASTORIS El vector de expresión apropiado se construye en analogía con el ejemplo 7. Se requieren el ADN del plásmido pPich_Hir_ins-GlyA21 y dos matrices pich_insgly_dirf y pich_insgly_dirrev pich_insgly_dirf 5'-TTTTTTCTCGAGAAAAGATTTGTTAACCAACACTTGTGTG-3' (SEC ID NO.: 7) pich_¡nsgly_dirrev 5'-TTTTTT GGCGCCGAATTCACTACTATTAGCCAC-3' (SEC ID NO.: 8) EJEMPLO 11 : PREPARACION DE INSULINA ARG(B31), GLY(A21) A PARTIR DE UNA PROTEINA DE FUSION QUE SE OBTIENE POR SECRECION DE LEVADURAS Y COMPRENDE PROINSULINÁ CORRECTAMENTE PLEGADA Y SU PORCION DE FUSION COMPRENDE UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS HIS6 El ADN del plásmido pADH2Hir_ins_glyA21 sirve como matriz iniciadora. Se sintetizan dos matrices: alfa_LT_H6_hirf y alfa_LT_H6_hirrev alfa_LT_H6_hirf1 : 5'- GCACCATCATCACCATCACTATACTGACTGCACTGAATC -3' (SEC ID NO.: 9) La matriz comprende los codones para 6 histidinas en serie y los aminoácidos 3-8 y 9 (parcialmente) de la secuencia Refludan0 alfa_LT_H6_hirf2: 5'- GAAGGGGTACCTTTGGATAAAAGACTTACGCACCATCATCACCATCAC -3' (SEC ID NO.: 10) La matriz comprende los codones para 6 histidinas en serie, los codones para los aminoácidos 1 y 2 de la secuencia de la lepirudina y las secuencias del factor-alfa que incluyen el sitio de elaboración de Lys-Arg y cubre el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Kpn 1. El ADN del plásmido pADH2Hir_ins_glyA21 sirve como matriz iniciadora en una PCR estándar con las matrices alfa_LT_H6_hirf1 e ins_gly_a21_rev del ejemplo 7 de la presente solicitud. El producto de la reacción se aisla y se emplea una alíquota como matriz iniciadora para una segunda PCR con las matrices alfa_LT_H6_hirf2 e ins_gly_a21_rev. El producto de reacción se elabora como se describe con KPN1 y Nco1 y después se clona. El resultado es el plásmido pADH2_LT_H6_Hir_ins_glyA21 : siguiendo la transformación de Y79 con ADN del plásmido, se expresa la proteína de fusión. Las células se separan del sobrenadante por centrifugación y el sobrenadante se concentra por filtros de membrana, p. ej., de Sartorius y después por cromatografía de afinidad de Ni2+, siguiendo el protocolo para el sistema de purificación Invitrogen ProBond TM. Después de la eliminación del tampón de elución por diálisis y/o filtración o filtración de gel como alternativa, se puede elaborar la proteína de fusión de una manera conocida para dar insulina humana Arg (B31), Gly (A21) y convertirla después en insulina glargina.

EJEMPLO 12: PREPARACION DE INSULINA HUMANA ARG (B31 ), GLY (A21) A PARTIR DE UNA PROTEINA DE FUSION QUE SE OBTIENE POR SECRECION DE LEVADURAS Y COMPRENDE LA PROINSULINA CORRECTAMENTE PLEGADA Y CUYA PROTEINA DE FUSION SE ELIMINA CON LA ENZIMA ENTEROCINASA El ADN del plásmido pADH2Hir_ins_glyA21 sirve como material de partida. Se usan la matriz ins_gly_a21_rev del ejemplo 7 de la presente solicitud e hirfl del ejemplo 1 de la solicitud de patente internacional WO 02/070722 A1. Para este fin, se preparan dos nuevas matrices: Hir_enteroj'nsf 5'- CTTCAG GACGATGACGATAAATTTGTTAACCAACACTTGTGTGG-3' (SEC ID NO.: 11) La matriz cubre los aminoácidos B1 - B7 y B8 (parcialmente) de la secuencia de miniproinsulina y comprende los codones para la secuencia de aminoácidos Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que representa el sitio de reconocimiento para la enterocinasa.

Hir_entero_insrev 5'- TTTATCGTCATCGTCCTGAAGGCTGAAGGTATTCCTCAGGG-3' (SEC ID NO.: 12) La matriz inversa cubre los aminoácidos 60-65 de la secuencia de la lepirudina y comprende los codones para la secuencia de aminoácidos Asp- Asp-Asp-Asp-Lys (SEC ID NO.: 13), que representa el sitio de reconocimiento para la enterocinasa. En primer lugar se llevan a cabo dos PCR con los pares de matrices hirf1/Hir_entero_insrev e Hir_entero_insf/ins_gly_a21_rev. Se aislan los productos de reacción. Se mezclan alíquotas del material y se emplea la mezcla en una tercera PCR como matriz iniciadora para el par de matrices hirfl/ ins_gly_a21_rev. El producto de reacción se clona como se describe. El resultado es el vector pADH2H¡r_ins_glyA21. La proteína de fusión se prepara como se describe. La proteína de fusión se escinde con enterocinasa. La enzima está comercialmente disponible. La reacción de escisión se lleva a cabo en tampón de enterocinasa (Tris/HCI 20 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 2 mM pH 7,4) empleando una cantidad de enzima correspondiente a la información particular del fabricante. La escisión tiene lugar comúnmente después de la eliminación de las células hospedadoras y la siguiente etapa de tratamiento final. Sin embargo, también puede tener lugar directamente en el sobrenadante después de la fermentación, después de que se hayan ajustado las condiciones de reacción óptimas.

EJEMPLO 13: PREPARACION DE INSULINA HUMANA ARG (B31), GLY (A21) A PARTIR DE UNA PROTEINA DE FUSION QUE SE HA OBTENIDO POR SECRECION DE LEVADURAS Y COMPRENDE PROINSULINA CORRECTAMENTE PLEGADA Y CUYA PORCION DE FUSION SE ELIMINA CON LA ENZIMA ENTEROCINASA Y COMPRENDE UNA SECUENCIA DE POLIHISTIDINA Se usa ADN del plásmido pADH2_LT_H6_H¡r_ins_glyA21 y las matrices Hir_entero_insrev, Hir_entero_insf e ins_gly_a21_rev y se reemplaza matriz hirfl por la matriz alfa_lt_enterof con la secuencia siguiente: 5'- GAAGGGGTACCTTTGGATAAAAG - 3' (SEC ID NO.: 13) Después, en analogía con el ejemplo 12, se construye un vector pADH2_LT_H6_Hir_etero_ins_glyA21 que codifica una proteína de fusión cuya porción de fusión de hirudina se ha extendido por seis histidinas empezando con la posición en 3 N-terminal y en C-terminal a partir de la posición 72 por la secuencia DDDDK (SEC ID NO.: 14). Después se prepara insulina humana Arg(B31), Gly(A21 ) combinando el método descrito en los ejemplos 1 1 y 12.

EJEMPLO 14: SECUENCIA GENETICA PARA LA SECRECION DE UNA PROTEINA DE FUSION DE HIRUDINA DES-PHE (B1), INSULINA ARG(B31), GLY(A21) POR LEVADURA DE PANADERIA La transformación y la expresión tienen lugar en analogía con el ejemplo 7. Se sintetizan dos secuencias de matriz: Desphefl : 5'-CTTCAGGGAAATTCGGCACGAGTTAACCAACACTTGTGTGGTTC-3' (SEC ID NO.: 15) y Desphe_rev1 : 5'-GAACCACACA AGTGTTGGTT AACTCGTGCC GAATTTCCCT GAAG-3' (SEC ID NO.: 16) El ADN del plásmido pADH2Hir_ins_glyA21 del ejemplo 7 sirve como matriz iniciadora. Se llevan a cabo dos reacciones en cadena de la polimerasa independientemente una de otra. En la reacción 1 , se emplean las matrices Desphe_rev1 y la matriz de la SEC ID NO:4 del ejemplo 1 de la solicitud de patente europea EP-A 1 364 032 y en la reacción 2 se emplean la matriz ins_gly_a21_rev del ejemplo 7 de la presente solicitud y la matriz Desphefl Se aislan los productos de reacción de las dos reacciones y se combinan alíquotas del caudal en una tercera reacción y se emplea como matriz iniciadora para el par de matrices que consiste en las matrices de la SEC ID NO:4 del ejemplo 1 de la solicitud de patente europea EP-A 1 364 032 e ins_gly_a21_rev. El producto de reacción de la tercera reacción se clona, se transforma y se expresa como se describe en el ejemplo 7. La proteína de fusión resultante sirve como material de partida para preparar análogos de insulina correspondientes con extremos de cadena dibásicos.

EJEMPLO 15: SECUENCIA GENETICA PARA LA SECRECION DE UNA PROTEINA DE FUSION DE HIRUDINA ALA (B31), INSULINA ARG(B32), GLY(A21) POR LEVADURA DE PANADERIA Se sintetizan dos secuencias de matrices: Ala b31f1 : 5'-CTTCTACACTCCAAAGACGgctCGTGGTATCGTTGAACAATGTTG-3' (SEC ID NO.: 17) y Ala_b31rev1: 5'-CAACATTGTT CAACGATACC ACGagcCGTC TTTGGAGTGT AGAAG-3' (SEC ID NO.: 18) El ADN del plásmido pADH2Hir_ins_glyA21 del ejemplo 7 sirve como matriz iniciadora. Se llevan a cabo dos reacciones en cadena de la polimerasa independientemente una de otra. En la reacción 1 , se emplean las matrices Ala_b31rev1 y la matriz de la SEC ID NO:4 del ejemplo 1 de la solicitud de patente europea EP-A 1 364 032 y en la reacción 2 se emplean la matriz ins_gly_a21_rev del ejemplo 7 de la presente solicitud y la matriz Ala_b31f1. Se aislan los productos de reacción de las dos reacciones y se combinan alíquotas del caudal en una tercera reacción y se emplea como matriz iniciadora para el par de matrices que consiste en las matrices de la SEC ID NO:4 del ejemplo 1 de la solicitud de patente europea EP-A 1 364 032 e ins_gly_a21_rev. El producto de reacción de la tercera reacción se clona, se transforma y se expresa como se describe en el ejemplo 7. La proteína de fusión resultante sirve como material de partida para preparar análogos insulínicos correspondientes con extremos de cadena dibásicos.

EJEMPLO 16: SECUENCIA GENETICA PARA SECRECION DIRECTA DE UN PRECURSOR LYS(B31) POR LEVADURA DE PANADERIA. Se sintetizan dos matrices: Lys_b31f 5 '-CTTCTACACTCCAAAGACGAAAGGTATCGTTGAACAATGTTG-3 ' (SEC ID NO.: 19) y Lys_b31 rev 5 '-CAACATTGTT CAACGATACC TTTCGTCTTT GGAGTGTAGA AG -3 (SEC ID NO.: 20) El ADN del plásmido pADH2Hir_ins del ejemplo 1 de la solicitud de patente internacional WO 02/070722A1 sirve como matriz iniciadora para dos reacciones en cadena de la polimerasa. En la reacción 1 , se emplean las matrices Lys_b31f1 e insncol rev (Sec ID NO:6 de la patente internacional WO 02/070722A1) y en la reacción 2 se emplean las matrices Lys_b31 rev y alfa_insf1 del ejemplo 7 de la presente solicitud. Se llevan a cabo las reacciones clásicas y se aislan los fragmentos PCR resultantes. Se combinan alíquotas de los dos caudales y sirven como matriz iniciadora para una tercera reacción con las matrices insncol rev y Sec ID NO:6 de la patente internacional WO 02/070722A1. El fragmento PCR resultante se clona y se expresa como se describe en el ejemplo 8. El resultado es miniproinsulina Lys(B31), que se convierte con lisil endopeptidasa en insulina de escisión B(1-29) - A(1-21) y como compuesto intermedio para preparar insulina argininamida B30 o insulina lisisinamida B30, que se puede convertir con posterioridad en el respectivo análogo dibásico.

EJEMPLO 17: ESCISION CON LISIL ENDOPEPTIDASA: Se hace reaccionar el precursor de insulina como se describe en DE3844211 con lisil endopeptidasa (LEP) (ejemplo 1). Para este fin, se disuelven 10 mg de miniproinsulina Lys(B31) en tampón Tris (pH 8,0) y se añade LEP a partir de Lysobacter enzymogenes (0,01 mi de una disolución de conc. 1 mg/ml en agua, Merckbiosciences). Se lleva a cabo la incubación a temperatura ambiente durante 2 h y la purificación es por RP-HPLC (columna Nucleosil 120-5). El resultado es insulina de escisión B(1-29) - A(1-21).

EJEMPLO 18: PREPARACION DE INSULINA ARG(B30) A PARTIR DE UN PRECURSOR DE INSULINA DE ESCISION B(1-29)-A(1-21) POR ACOPLAMIENTO CON ARGININAMIDA Se disolvieron 100 mg de insulina de escisión B(1-29) - A(1-21) en 0,95 mi de disolución de argininamida (446 g/l) y 0,13 mi de tampón de acetato de Na M (pH 5,8) y se añadieron 2 mi de DMF. La mezcla de reacción se enfrió a 12°C y empezó por adición de 0,094 mi de tripsina (0,075 mg, Roche Diagnostics). Después de 8 h, la reacción se detiene añadiendo TFA a pH 2,5 y se analiza por HPLC, Se forma > 60% de insulinamida Arg(B30). La adición de disolución inhibidora de tripsina va seguida por la purificación del análogo amidado en analogía con la patente de EE.UU. 5.656.722. El análogo amidado de insulina se puede hidrolizar después en presencia de ácido durante varias horas para dar insulina Arg(B30) o se puede emplear la amida directamente como medicamento.

EJEMPLO 19: PREPARACION DE INSULINA LYS(B30) A PARTIR DE UN PRECURSOR DE INSULINA DE ESCISION B(1-29)-A(1-21) POR ACOPLAMIENTO CON LISINAMIDA Se disolvieron 100 mg de insulina de escisión B(1-29) - A(1-21) en 0,93 mi de disolución de lisinamida (400 g/l) y 0,13 mi de tampón de acetato de Na M (pH 5,8) y se añadieron 2 mi de DMF. La mezcla de reacción se enfría a 12°C y empieza añadiendo 0,094 mi de tripsina (0,075 mg, Roche Diagnostics). Después de 8 h, la reacción se detiene añadiendo TFA a pH 2,5 y se analiza por HPLC. Se forma insulinamida Lys(B30) y se purifica después de adición de disolución de inhibidor de tripsina en analogía con la patente de EE.UU. 5.656.722. El análogo amidado de insulina se puede hidrolizar después en presencia de ácido durante varias horas para dar insulina Lys(B30) o se puede emplear directamente como medicamento.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. - Un método para preparar un análogo ¡nsulínico o un derivado del mismo, en que: se añade un aminoácido básico, existente en la naturaleza, que está amidado o protegido en el C-terminal con un grupo protector o un péptido que consiste en aminoácidos básicos, existentes en la naturaleza o análogos o derivados de los mismos y esté amidado o protegido en el C-terminal con un grupo protector, a un análogo de insulina inicial o un derivado del mismo cuyo aminoácido C-terminal de la cadena A y/o B se selecciona de un grupo que comprende aminoácidos básicos, existentes en la naturaleza o análogos o derivados de los mismos, en uno de dichos aminoácidos C-terminales en presencia de una enzima con la actividad biológica de la tripsina y se purifica el análogo insulíníco modificado resultante y opcionalmente se elimina el grupo amido o grupo protector C-terminal del aminoácido añadido o del péptido añadido.
2. 2. - El método según la reivindicación 1 , donde el análogo insulíníco se caracteriza por la fórmula general I: S S R1-(A1-A5)- Cys-Cys- (A8 - A10) -Cys-(A12-A19)-Cys-A21-R2 (cadena A) I I (I) R3-B1-Val-B3-Gln-H¡s- Leu- Cys- (B8 - B18) -Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30-R4-R5 (cadena B) en que los significados son: (A1-A5) los restos aminoácido en las posiciones A1 a A5 de la cadena A de insulina humana o insulina animal, (A12-A19) los restos aminoácido en las posiciones A12 a A19 de la cadena A de insulina humana o insulina animal, A21 un resto aminoácido existente en la naturaleza, (B8-B18) los restos aminoácido en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de insulina humana o insulina animal, (B20-B26) los restos aminoácido en las posiciones B20 a B26 de la cadena B de insulina humana o insulina animal, (A8-A10) los restos aminoácido en las posiciones A8 a A10 de la cadena A de insulina humana o insulina animal, B30 un enlace químico o un resto aminoácido existente en la naturaleza, B1 un enlace químico o un resto aminoácido existente en la naturaleza, B3 un resto aminoácido existente en la naturaleza, B27, B28 y B29 un resto aminoácido existente en la naturaleza, R1 un grupo amino o uno a tres restos aminoácido existentes en la naturaleza, R2 un grupo carboxi o uno a tres restos aminoácido existentes en la naturaleza, R3 un grupo amino o uno a tres restos aminoácido existentes en la naturaleza R4 un enlace químico o uno a tres restos aminoácido existentes en la naturaleza, donde el resto aminoácido existente en el C-terminal representa un aminoácido básico, R5 uno o dos restos aminoácido básicos cuyo C-terminal está bien libre o amidado, donde el resto aminoácido cuyo C-terminal está unido al N terminal de R5 se selecciona de un grupo que comprende aminoácidos básicos, existentes en la naturaleza.
3. 3.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el análogo de insulina inicial se caracteriza por la fórmula general II: S R1-(A1-A5)- Cys- Cys- (A8 - A10) -Cys-(A12-A19)-Cys-A21-R2 (cadena A) | S S ~S S (N) R3-B1 -Val-B3-Gln-His- Leu- Cys- (B8 - B18) -Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30-R4 (cadena B) donde R1 , (A1-A5), (A8-A10), (A12-A19), A21 , R2, R3, B1 , B3, (B8-B18), (B20-B26), B27, B28, B29, B30 y R4 se definen como en la reivindicación 1 y el resto aminoácido C-terminal de la cadena B se selecciona de un grupo que comprende, aminoácidos básicos, existentes en la naturaleza.
4. 4.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el aminoácido básico, existente en la naturaleza, que está amidado o protegido en el C-terminal con un grupo protector es arginina amidada en el C-terminal o arginina protegida en el C-terminal con un grupo protector.
5. 5. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el análogo de insulina modificado es insulina humana Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32) cuyo extremo C-terminal de la cadena B está amidado.
6. 6. - El método según la reivindicación 5, en que el análogo de insulina inicial es insulina humana Gly(A21), Arg(B31).
7. 7. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el análogo de insulina inicial se prepara por expresión recombinante de una proteína precursora que comprende la cadena A y la cadena B del análogo de insulina inicial.
8. 8. - El método según la reivindicación 7, donde se expresa un gen que es parte de un replicón.
9. 9. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, donde se usa una bacteria o una levadura como célula hospedadora.
10. 10. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la proteína precursora se segrega después de la expresión.
11. 11. - El método según la reivindicación 10, donde la proteína precursora se aisla del sobrenadante celular de bacterias o levaduras.
12. 12. - El método para preparar análogos de insulina modificados según la reivindicación 9, donde la proteína precursora se aisla del periplasma de una bacteria.
13. 13. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde la proteína precursora obtenida según cualquiera de dichas reivindicaciones se somete a un proceso de plegado y escisión enzimática.
14. 14. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el análogo de insulina inicial se prepara por expresión directa recombinante.
15. 15. - El método según una o más de las reivindicaciones 1 a 14, donde la enzima con la actividad biológica de la tripsina se selecciona de un grupo que comprende: tripsina humana, tripsina porcina, tripsina bovina y una variante de tripsina humana, tripsina porcina y tripsina bovina.
16. 16. - El método según una o más de las reivindicaciones 1 a 14, donde la enzima tiene actividad de lisil endopeptidasa.
17. 17. - El método según una o más de las reivindicaciones 1 a 15, donde el extremo C-terminal de la cadena B del análogo de insulina modificado se desprotege con posterioridad en una reacción de hidrólisis.
18. 18. - El método según una o más de las reivindicaciones 1 a 17, en que el análogo de insulina resultante es insulina humana Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32).
19. 19. - El uso de un análogo insulínico preparado según las reivindicaciones 1-16 o de un derivado del mismo cuyo aminoácido C-terminal de la cadena A y/o B está amidado como medicamento.
20. 20. - Un análogo insulínico o un derivado del mismo obtenible según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, cuyo aminoácido C-terminal de la cadena A y/o B está amidado.