TWI378941B - - Google Patents

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1378941 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於新穎的透明質酸改性物、及 物載體。 【先前技術】 藥物的徐放性、鎖定目標性、血中滯留性S 效果）等，藥物的體內動態控制爲目的之種種ϋ 被討論者。其中體內所分解的生物分解性高分g 內後無須排除’故多被利用。作爲已知的經實月 分解性高分子者可舉出聚乳酸（PLA )、聚甘酉 )、乳酸•甘醇酸共聚物（PLGA)爲主之這些 。這些共聚合比、分子量等可控制分解速度，互 水性藥物之載體’但作爲如血管注射劑之微粒3 或奈米粒球）時’因其爲疏水性故較易於水溶密 投與液體中，或投與後的體內之分散性上產生房 亦有產生皮下發炎、組織黑變化等活體適用性之 對於變形性關節炎、慢性關節風濕等之關窗 膜炎的產生多數成爲适些疼痛之原因。因此，，辖 節腔內直接注入類固醇或非類固醇系抗炎用劑等 療方法雖被試驗過，但關節腔內的淸空較爲快（ 利文獻1及非專利文獻2) ，1次投與後持續其 濃度而常期間抑制發炎即爲困難。因此，有報告 炎藥劑等藥物封入基材中使其緩釋之種種方法。 用其之藥 長（滯留 分子利用 因導入體 化之生物 酸(PGA 共聚物等 適用於疏 (微粒球 中凝集， 題。又， 問題。 疾病，滑 口、或關 藥物之治 參考非專 有效藥效 指出將發 例如，核 -5- (2) (2)1378941 糖核蛋白體（參考非專利文獻3及非專利文獻4)、白蛋 白微粒球（參考非專利文獻5 )、明膠/軟骨素硫酸微粒球 (參考非專利文獻6)、乳酸•甘醇酸共聚物（PLGa ) 微粒球（參考非專利文獻7 )之報告。 然而’已知如此基材本身會引起疼痛（Crystal_ Induced Pain )(參考非專利文獻8)。雖該疼痛的原因 爲未知’但此被認爲與微粒球的尺寸、活體適應性有關。 亦有使用尺寸較爲小之PLGA奈米粒球之報告（參考非專 利文獻9)、但活體適應性之問題未被解決。 亦有多數有關使用多醣類、膠原、明膠等來自活體之 高分子之藥物載體的報告，但因其爲親水性材料故無適用 於疏水性藥物的載體上，因封入效率、緩釋期間點原因會 使PLA、PGA、PCL、PLGA等劣化。例如有使用將葡聚 醣與P L A鍵結之化合物的奈米粒球之報告（參考非專利 文獻10及非專利文獻Π )，但因PL A爲與葡聚醣呈酯鍵 結’故於體內鍵結部位之水解較爲快（1天左右），又， 因葡聚醣漿作爲其材料故無法適用於藥物的標的物、緩釋 目的上。 另一方面，非常久以前即已知透明質酸（HA )爲 1934年由K. Me ye !^由牛眼睛的玻璃體中分離出之活體材 料（多醣），作爲細胞外基體的主成分。HA係由D·葡糖 醒酸與N-乙醯基葡糖胺以；§ (I— 3)葡糖苷鍵結連結之 二糖單位所成之葡萄糖胺葡聚醣之一種。HA並無化學性 貨物理性結構之種類差異，人類亦具有其代謝系統，於免 -6- (3) (3)1378941 疫性、毒性上爲最安全之活體材料（Biomaterial)。例如 ’ HA爲關節液之主成分之一，其黏彈性效果或發炎抑制 效果亦可發揮於關節的止痛效果。實際上，以HA作爲主 成分的藥物已上市作爲變形性關節病症、慢性關節風濕等 關節治療藥劑使用（例如，司貝尼耳（商品名）：製造販 賣中外製藥股份有限公司）。 已有多數有關HA或其衍生物所成之水凝膠、微粒球 等適用於藥物緩釋的報告（例如，參考非專利文獻12、 非專利文獻1 3、專利文獻1 '專利文獻2、專利文獻3及 專利文獻4)’藥物釋出期間既使較爲長亦僅爲數日以內 ，依舊未達到實用水準。 作爲組合Η A與生物分解性高分子之Η A改性物，Η A 中被覆PLGA之薄膜（參考專利文獻2)、混合PLGA微 粒球與HA之注射劑（參考專利文獻6 ) ' PLGA微粒球 分散於Η A水凝膠中之蛋白質緩釋製劑（參考專利文獻7 )、使用陽離子界面活性劑之聚己內酯（PCL)的靜電相 互作用之HA塗佈奈米粒球、將HA鍵結於聚L-賴胺酸側 鏈之HA-PLL (參考非專利文獻14)等生化材料、藥物緩 釋製劑。 又，多醣與 PLA、PGA、PCL、PLGA等生物分解性 聚合物以接枝鍵結之多醣衍生物、及使用該多醣衍生物之 微粒子亦有被報告，其中亦有使用使用HA作爲多醣的例 子（寥考專利文獻8)，具體而言僅揭示合成ha上PCL 以酯鍵結者’對於所得 HA衍生物的功能則完全無揭示 (4) (4)1378941

如上述，具體上具有優良的安全性、生物分解性、體 內安全性，HA與PLA、PGA或PLGA以接枝鍵結之HA 改性物爲未知，其調製方法亦未知。又，過去的藥物載體 中，藥物（特別爲低分子藥物）的封入效率、其緩釋期間 ' 、水溶液中的分散性、血中滯留性期間、或安全性（活體 · 內引起發炎等）上產生問題。且，粒子間凝集較少的血管 注射劑微粒子所成之活體適應性之優良藥物載體亦爲未知 【專利文獻1】 國際公開公報W 0 9 8 /4 3 6 3 4 【專利文獻2】 國際公開公報WOOO/783 5 6 【專利文獻3】 特表平1 1 -5 1 3 047號公報 【專利文獻4】 $ 特表平2003-525232號公報 【專利文獻5】 特開平8 -208706號公報 【專利文獻6】 國際公開公報W Ο 0 1 /2 8 5 9 1 【專利文獻7】 國際公開公報W097/1 3502 【專利文獻8】 -8 (5) (5)1378941 國際公開公報W001/88019 【非專利文獻1】

Eur. J. Clin. PHArmacol. 42，3 0 1 -3 05 ( 1 992 ) 【非專利文獻2】

Clin. PHArmacol. Ther. 39, 313-317 ( 1986) 【非專利文獻3】

Biochem. J. 158， 473-476 ( 1976) 【非專利文獻4】 J. PHArm. PHArmaco. 45, 576-5 78 ( 1 993 ) 【非專利文獻5】

Int. J. PHArmaco. 39, 1 29- 1 3 6 ( 1 987 ) 【非專利文獻6】

Arthritis Rhem. 4 1, 2 1. 8 5 -2 1 95 ( 1 99 8 ) 【非專利文獻7】

Int. J. PHArm. 195, 179- 1 88 ( 2000) 【非專利文獻8】 J. Joint Surgery 11，8 7-9 5 ( 1 992 ) 【非專利文獻9】 PHArm. Res. 19，403-4 1 0 ( 2002 ) 【非專利文獻1 0】 J. Biomed. Mater. Res. 5 0. 5 5 7-5 65 ( 2000 ) 【非專利文獻11】 PHArm. Res. 20，1 294- 1 292 ( 2003 ) 【非專利文獻1 2】 -9 - 1378941

Drug Dev. Ind. PHArm. 25 ( 1 ) . 15-20 ( 1999) 【非專利文獻1 3】

Intern. J. PHArm. 87, 2 1 -29 ( 1 992 ) 【非專利文獻1 4】

Bioconj. Chem. 9, 476-481 ( 1 99 8 ) 【發明內容】 本發明係關於解決過去藥物載體之問題點，提供一種 有效率下封入低分子藥物，可長期控制緩釋期間，可控制 血中滞留性，水溶液中的分散性良好，無安全性問題之藥 物載體。又，同樣地欲解決過去藥物載體的問題點，提供 一種粒子間凝集較爲少之血管注射劑性微粒子所成的活體 適應性優良之藥物載體。 本發明者欲解決相關課題進行詳細硏究結果，發現透 明質酸或其衍生物與選自聚乳酸、聚甘醇酸或乳酸•甘醇 酸共聚物之聚合物鍵結之透明質酸改性物，有效率地封入 滴分子藥物，可控制藥物的緩釋期間，水溶液中的分散性 良好，且無安全性問題之藥物載體。又發現該透明質酸改 性物會形成粒子間較少凝集的血管注射劑用微粒子，成爲 活體適應性優良之藥物載體，而完成本發明。 即，本發明的其中一面爲提供一種透明質酸或其衍生 物與選自聚乳酸、聚甘醇酸或乳酸·甘醇酸共聚物之聚合 物鍵結之透明質酸改性物。本發明的其中一實施型態中， 前述聚合物可作爲透明質酸或其衍生物的側鏈而進行接枝 -10- 1378941 鍵結。又其他實施型態中，大部分或所有前述聚合物，其 僅以片端末端而鍵結於透明質酸或其衍生物上。又，本發 明的其他實施型態而言，前述聚合物可鍵結於透明質酸或 其衍生物的羧基上。又另一實施型態爲，前述聚合物可藉 由間隔物於透明質酸或其衍生物的羧基上以醯胺鍵結合。 又，前述聚合物爲可藉由間隔物於透明質酸或其衍生 物之羧基上以醯胺鍵結合者。 本發明的其他面爲提供一種分子內至少含有1個如式 (I )所示的重複結構之透明質酸改性物。

l\ /

— (式中，R〗、R2、R3及R~4分別獨立表示選自氫原子、 C!-6烷基及Ci.6烷基羰基；

Ra及Rb分別獨立表示選自氫原子及G.6烷基； Q表示選自聚乳酸、聚甘醇酸及乳酸.甘醇酸共聚物 之聚合物，該聚合物爲以末端的羧基與氮原子形成醯胺鍵 A 表示單鍵、一 （CH2) m -、— CH2— CH2— (Ο — -11 - (8) (8)1378941 CH2 - CH2 ) m-或-NHCO- ( CH2 ) n - C Ο N H -； m表示1至10的整數，n表示〇〜i〇的整數）。其 中，Ci-6烷基爲碳數1〜6的直鏈或支鏈烷基，具體而言 含有甲基、乙基、鄭丙基、異丙基、鄭丁基、第二丁基、 異丁基、第三丁基、正戊基 '正戊基等。Cl.6烷基羰基爲 分子內具有前述CL6烷基的烷基羰基，具體而言可舉出 乙醯基 '丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基 、三甲基乙醯基等。本發明的其中一實施型態爲，Ra及 Rb同時表示氫原子，a表示-(CH2) m-、-CH2— CH2 —(〇 - CH2 - CH2 ) m - M - NHCO - ( CH2 ) „ - CONH - o 本發明的另一面爲’提供一種前述間隔物爲具有可獨 立取代之2個以上之胺基，前述聚合物的末端之羧基與前 述間隔物之一的胺基形成醯胺鍵，透明質酸或其衍生物的 羧基與前述間隔物之其他胺基以醯胺鍵鍵結之透明質酸改 性物。其中’作爲胺基取代基並無特別限定，但可舉出 Cl.6院基' C|·6院氧基院基' C|-6齒素焼基、C3-8環院基 等。 本發明的另一面爲提供一種分子內至少含有1個如式 (Π )所示的重複結構之透明質酸改性物； -12- 1378941 ⑼

Rb、

Ra\ xm

(式中，R,、R2、R3、R4、Ra、Rb及A如申請專利範圍 第8項所定義者）。 本發明的另一面爲提供一種前述透明質酸衍生物及/ 或透明質酸改性物本身對於透明質酶之分解具有耐性，例 如於哺乳動物中具有1 8小時以上的平均血中滯留時間之 透明質酸改性物。 本發明的另一面爲提供一種含有前述透明質酸改性物 的藥物載體。其中該載體的形狀，例如可爲微粒球狀或奈 米粒球狀之微粒子狀。又，該藥物載體具有水溶液中前述 聚合物被透明質酸或其衍生物覆蓋之結構者。又，粒子徑 雖無特別限定，但僅可無阻塞且可通過針孔之2 00 # m以 下爲佳’ 1 00 # m以下爲更佳。又，關節投與時較易引起 物理性的關節內摩擦，而誘發出新的發炎症狀，故粒子徑 以5 # m以下爲佳。又，靜脈注射投與時，欲不阻塞末梢 血管以粒子性500nm以下爲佳，200nm以下更佳。其中 一實施型態中，該藥物載體具有對HA受體作爲目標之能 力、對於透明質酸酶之分解具有耐性、及具有黏膜附著性 -13- (10) (10)I37894i 等特性。又，該藥物載體係爲可減低局部刺激性之藥物載 體。 本發明的另一面爲提供一種含有上述藥物載體及藥物 的醫藥組成物。另一實施型態中，該醫藥組成物可含有1 種以上選自聚乳酸、聚甘醇酸或乳酸•甘醇酸共聚物所成 之聚合物。該較佳聚合物爲與於透明質酸改性物鍵結之聚 合物同種類者。且其中一實施型態中，前述藥物可封入透 明質酸改性物所形成的微粒子中。其中該微粒子爲，透明 質酸改性物之聚合物部分及/或前述聚合物所形成的疏水 性中心，其具有覆蓋透明質酸部分之形狀爲佳，較佳爲該 醫藥組成物中，將藥物封入該疏水性中心部分。 本發明的另一面爲提供一種含有將選自末端具有羧基 的聚乳酸、聚甘醇酸或乳酸•甘醇酸共聚物之聚合物、與 分子內含有至少1個式（Π )所示重複結構之透明質酸衍 生物進行反應的步驟之透明質酸改性物的製造方法，

(式中，R〗、R2、R3、R4、Ra、Rb及A如申請專利範圍 -14 - (11) (11)1378941 第8項所定義者）。前述聚合物爲，單獨或適當組合 1^，>1’-羰基二咪唑（€01)、义1^-二環己基碳化二亞胺（ DCC) 、N•乙氧基端基-2-乙氧基- i，2 -二氫Π奎啉（EEDQ) 、4-(4,6-—甲氧基-1，3,5 -三曝）-4-甲基嗎啉（DMT-MM )、2-苯甲三唑-1，1，3,3-四甲基尿鹽4氟化硼酸鹽（TBTU )、3，4_ 二氫-3 -羥基-4·羰基-1，2,3 -苯甲三嗪（HODhbt ) 、苯甲三唑-1-氧基-三-吡咯烷-錢6氟化磷酸鹽（PyBOP )、本甲二哩-1-基·氧基-二（—甲基胺基）phosphanium 六氟磷酸鹽（BOP) 、1-乙基- 3-(3 -二甲基胺基丙基）碳 化二亞胺（EDC )或N-羥基琥珀銑酵亞胺（NHS )等縮合 劑而導入。又，可將前述聚合物的末端羧基轉換成反應性 較高的酯或醯胺後導入。又’前述聚合物可於水溶液中形 成微粒子。 本發明的另一面爲提供一種使用上述透明質酸改性物 ’藉由乳化液中乾燥法、溶劑擴散法或透析法製造出上述 藥物載體之方法。 其中一實施型態爲本發明的藥物載體的製造方法係爲 使用乳化液中乾燥法進行，例如含有以下步驟者； a )含有1種以上有機溶劑，與水不混合之有機相中 ’溶解1種以上選自聚乳酸、聚甘醇酸或乳酸.甘醇酸共 聚物之聚合物的步驟； b )水相中溶解或分散該透明質酸改性物之步驟； c )混合該a步驟所得之聚合物溶液、與該b步驟所 ^之透明質酸改性物溶液或分散液後形成乳化液之步驟； -15- (12) (12)1378941 及 d)液中乾燥該c步驟所得之乳化液後形成藥物載體 微粒子之步驟、 或含有以下步驟者； a)含有1種以上有機溶劑，與水不混合之有機相中 ’溶解1種以上選自聚乳酸、聚甘醇酸或乳酸.甘醇酸共 聚物之聚合物的步驟； b )於水相中混合該a步驟所得之聚合物溶液後形成 乳化液的步驟； c )液中乾燥該b步驟所得之乳化液後形成聚合物微 粒子之步驟； d)將溶解或分散該透明質於其他水相中之步驟；及 e )混合該c步驟所得之聚合物微粒子、與該d步驟 所得之透明質酸改性物溶液或分散液後形成藥物載體微粒 子之步驟。 另一實施型態爲本發明的的藥物載體的製造方法爲使 用溶劑擴散法進行，例如含有以下之步驟者； a)混合於含有1種以上的有機溶劑之水中的有機相 (惟，不含水）中，溶解1種以上選自聚乳酸、聚甘醇酸 或乳酸•甘醇酸共聚物之聚合物的步驟； b )水相中溶解或分散該透明質酸改性物之步驟；及 c )將該a步驟所得之聚合物溶液滴入該b步驟所得 之透明質酸改性物溶液或分散液後形成藥物載體微粒子之 步驟、 -16 - (13) (13)1378941 或亦含有以下之步驟者： a)混合於含有1種以上的有機溶劑之水中的有機相 (惟，不含水）中，溶解1種以上選自聚乳酸、聚甘醇酸 或乳酸.甘醇酸共聚物之聚合物、以及該透明質酸改性物 的步驟；及 b )將該a步驟所得之聚合物.透明質酸改性物溶液 滴入水相中之步驟。 另一實施型態爲藉由溶劑擴散法之本發明的的藥物載 體的製造方法爲含有以下之步驟者； a )混合於含有1種以上的有機溶劑之水中的有機相 (惟，不含水）中，溶解該聚合物的步驟； b )將該a步驟所得之聚合物溶液滴入水相後形成聚 合物微粒子之步驟； c )溶解或分散該透明質酸改性物於其他水相中之步 驟；及 d )混合該b步驟所得之聚合物微粒子、與該c步驟 所得之透明質酸改性物溶液或分散液後形成藥物載體微粒 子之步驟。 且另一實施型態爲使用透析法的本發明之藥物載體製 造方法，例如含有以下之步驟； a)混合於含有1種以上的有機溶劑之水中的有機相 (惟’不含水）中，溶解該聚合物及該透明酸改性物的步 驟；及 b )將該a步驟所得之聚合物·透明質酸改性物溶液 -17- (14) (14)1378941 對水相進行透析後形成微粒子之步驟、或含有以下之步驟 者： a) 混合於含有1種以上的有機溶劑之水中的有機相 (惟’不含水）中，溶解該聚合物的步驟； b) 將該a步驟所得之聚合物溶液對於水相進行透析 後形成聚合物微粒子之步驟； c) 溶解或分散該透明質酸改性物於其他水相中之步 驟；及 d) 混合該b步驟所得之聚合物微粒子、與該c步驟 所得之透明質酸改性物溶液或分散液後形成藥物載體微粒 子之步驟。 本發明的另一面爲亦提供一種含有上述藥物載體製造 方法之醫藥組成物製造方法。 且本發明的另一面爲提供一種含有以下步驟； a) 含有丨種以上的有機溶劑之有機相（惟，不含水 )中溶解上述透明質酸改性物的步驟；及 b) 使用溶劑擴散法或透析法將該a步驟所得之透明 質酸改性物溶液的溶劑取代爲水之步驟的透明質酸改性物 水溶液或分散液之調製方法。 其中一實施型態爲前述調製方法的b步驟中亦使用溶 劑擴散法，例如前述調製方法亦可含有以下步驟者； a )含有1種以上的有機溶劑之有機相（惟，不含水 )中，溶解上述透明質酸改性物的步驟；及 b )將該a步驟所得之透明質酸改性物溶液滴入水相 -18- (15) (15)1378941 中，溶劑由水取代之步驟。 另一實施型態爲前述調製方法的b步驟中使用透析法 ，例如亦可含有以下步驟者： a)含有I種以上的有機溶劑之有機相（惟’不含水 )中，溶解如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之 透明質酸改性物的步驟；及 b )將該a步驟所得之透明質酸改性物溶液對於水相 進行透析，溶劑由水取代之步驟。 本發明的另一面爲提供一種含有上述透明質酸改性物 水溶液或分散液之調製方法的醫藥組成物製造方法。 本發明的另一面爲提供一種透明質酸改性物，其爲分 子內至少含有1個如式（瓜）所示重複結構者。

(式中，R,、R2、R3及R4分別獨立表示選自氫原子、 C,-6烷基及C,.6烷基羰基； -19- (16) 1378941

Ra、Rb ' Rc及Rd分別獨立表示選自氫原子及 院基； Q表示選自聚乳酸、聚甘醇酸、聚己內酯或這些 物之聚合物，該聚合物爲以末端的羧基與氮原子鍵ϋ 表示0〜6的整數）。 本發明的另一面爲提供一種含有選自於末端具有 的聚乳酸、聚甘醇酸、聚己內酯或這些共聚物之聚合 與分子內含有至少1個式（IV)所示重複結構之透明 衍生物進行反應之步驟的上述透明質酸改性物製造方 C,-6 共聚 3 5 N 羧基 物、 ΤΓ· 筧酸 法。

以下對本發明作更進一步之說明。 本發明的透明質酸改性物爲，透明質酸（HA ) 衍生物與1種以上選自聚乳酸（PLA)、聚甘醇酸（ )或乳酸.甘醇酸共聚物（PLGA )的聚合物鍵結者。 本發明中透明質酸（HA )或其衍生物與丨種以 或其 PGA 上選 -20- (17) (17)1378941 自聚乳酸（PLA )、聚甘醇酸（PGA )或乳酸•甘醇酸共 聚物（PLGA)的聚合物並未以靜電相互作用等物理相互 作用鍵結，而已化學性共鍵結方式鍵結。因此，既使經由 投與後的鹽濃度變化、P Η變化等環境.變化，前述聚合物 亦不會由ΗΑ或其衍生物中脫離。ΗΑ或其衍生物.與前述 聚合物鍵結時，爲使較易控制其鍵結，介由間隔物部分鍵 結亦可。又，Η Α衍生物可含有欲與聚合物鍵結之間隔物 部分。例如，將具有複數胺基的化合物（二醯肼化合物、 二胺化合物、醯肼化合物等）與透明質酸中的葡糖醛酸部 分之羧基反應，而將具有醯肼基或胺基的間隔物部分導入 。對於特定實施型態，作爲間隔物部分導入式h2N_ (CH2)n-NH2(式中 ’ η 表示 〇 〜10 整數）' 式 H2N-CH2-CH2-(〇-CH2-CH2)n-NH2 (式中，η表示〇〜]〇整數）所表 示的二胺化合物、式H2NNHCO-(CH2)n-CONHNH2(式中 ，η表示0〜10整數）所示的二醯肼化合物、或式NH( Rio ) -NH ( R,,)(式中’ R10及Rn表示獨立的氫原子或 C J ·6烷基）所示醯肼化合物等。 使用於HA衍生物導入間隔物部分後導入聚合物之方 法時’錯由間隔物的羧基改性率、與藉由聚合物的間隔物 改性率可獨立控制。 作爲於HA或其衍生物上前述聚合物所鍵結的部位， HA或其衍生物末端亦可、或前述聚合物亦作爲Ha或其 衍生物的側鏈而導入。HA於水溶液中爲體積非常高的分 卞，故一般使用則述聚合物鍵結於末端的HA或其衍生物 -21 - (18) (18)1378941 而作成活體分解性微粒子時，HA層的厚度會變厚。又， 使用前述聚合物作爲側鏈而接枝鍵結之HA或其衍生物時 ，HA或其衍生物以環狀塗佈於生物分解微粒子表面上， 可使HA層的厚度變小。其中前述聚合物於HA或其衍生 物的側鏈上以接枝鍵結爲佳。 前述聚合物或間隔物部分的作爲經改性的HA或其衍 生物之導入位置，可舉出HA分子內的羥基與羧基。其中 ，導入羥基時，可藉由與經活化的羧基等使該羥基進行反 應後形成羧基酯而導入，又可藉由使異氰酸酯基等與該羥 基進行反應形成胺基甲酸酯而導入。 導入羧基時，藉由形成醯胺基、醯肼基、二醯基醯肼 基、羧酸酯可導入前述聚合物或間隔物部分。 導入前述聚合物或間隔物部分之上述方法中，形成羧 酸醋導入前述聚合物或間隔物部分之HA改性物，於投予 液內、活體內的水解可於叫短時間內使前述聚合物脫離。 因此，一般而言可介由水解速度較慢的胺基甲酸酯、或醯 胺基、醯肼基等進行改性爲佳。 其中’前述聚合物爲，鍵結於透明質酸或其衍生物的 殘基上爲更佳，其中前述聚合物介由醯胺基、醯肼基等於 透明質酸或其衍生物的羧基上以醯胺鍵進行鍵結爲特佳。 作爲HA或其衍生物的末端上與聚合物鍵結的方法， 例如可舉出藉由HA或及衍生物之還原末端的醛基、與前 述聚合物及間隔物部分的末端上導入之醯肼基（HZ)、 胺基（AM )等醛基具有反應性之官能基而形成的席夫鹼 -22- (20) 1378941 衍生物的羧基上以EDC/NHS等縮合劑鍵結的方法。本發 明的一實施型態中’作爲具有胺基 '醯肼基末端之聚合物 ，可使用式（V )：

R—HN

RI-N

V /IV Q (式中’ Ra、Rb、Q及A如上述定義）之化合物。 本發明的HA或其衍生物中，前述聚合物的大部分僅 以該單末端於Η A或其衍生物鍵結爲佳。於此，所謂「以 端末端鍵結」表示於前述聚合物的末端反應基中之一位置 進行鍵結的狀態。又’該「大部分」並無特別限定，但具 體而言，僅於該單末端與Η A或其衍生物所鍵結的聚合物 的量，對於所鍵結的全聚合物量爲7 〇 % w/w以上的狀態 ，較佳爲8 5 % w/w以上的狀態，特佳爲9 5 % w/w以上的 狀態。且於任何情況下，聚合物的兩末端導入Η A或其衍 生物的比率爲’每HA或其衍生物中的葡糖醛酸爲5莫耳 %以下’較佳爲3莫耳％以下，特佳爲1莫耳％以下。由 此可知本發明的透明質酸改性物爲，僅由前述聚合物僅以 該單末端鍵結於HA或其衍生物之透明質酸改性物所構成 〇 作爲僅以單末端與HA或其衍生物鍵結的前述聚合物 之量，其所鍵結的前述聚合物兩末端導入HA或其衍生物 的比率定量方法，以質子NMR所得之前述聚合物的導入 -24- (21) (21)1378941 量，與藉由鍵結這些聚合物的聚合物導入前之經醯肼基（ HZ )化或胺基（AM )化之HA衍生物中的醯肼基相比、 或與胺基的實際減少量相比而求得。例如，以己二酸二醯 肼基導入醯肼基的HA-HZ之質子NMR所得之來自游離醯 肼基之波峰（2_2〜2.3ppm:測定溶劑DMSO-d6)，或以 伸乙烯二胺導入胺基的HA-AM之質子NMR所得之來自 游離胺基的波峰（2_9〜3.1ppm:測定溶劑DMSO- d6)爲 ’因隨著這些聚合物的導入率而成比例地減少，故可實際 測得該波峰與來自 Η A的波峰（1 . 8〜1 · 9 p p m :測定溶劑 DMSO- d6)之比（X)。另一方面，假定這些聚合物的導 入爲1〇〇%單末端，可算出由聚合物導入率成比例地算出 之游離醯肼基或胺基的波峰對於來自HA波峰之比（Y) 。該實際測定値的比爲比理論値小時的比率係爲以兩末端 鍵結的聚合物的比率。對於葡糖醛酸之聚合物導入率作爲 Z%、HA-HZ之醯肼基導入率或HA-AM之胺基導入率作 爲H% ’僅以單末端與HA或其衍生物鍵結的聚合物之量 ，對於所鍵結的全聚合物量之比率爲，1 - ( HZ ) /Z ( 1 -X/Y) ’兩末端導入HA或其衍生物的比率爲，每葡糖醛 酸以（HZ) X ( 1-X/Y)表示。 所謂本發明所使用的透明質酸（Η A )或其衍生物係 指HA或其藥學上可被接受的鹽、或衍生這些者。 作爲HA或其藥學上可被接受的鹽，例如可舉出鈉鹽 、鉀鹽、鋰鹽等鹸金屬鹽，特佳的鹽類爲可作爲醫藥品的 而被泛用的鈉鹽。HA或其藥學上可被接受的鹽類可由萃 -25- (22) (22)1378941 取來自雞冠或豬皮下等生物之方法或生物發酵物等各種公 知的方法而製造，或可購入可購得之商品（例如，電氣化 學工業股份有限公司、資生堂股份有限公司、生化學工業 股份有限公司等）。 作爲HA或其藥學上可被接受的鹽類經衍生化之HA 衍生物，其葡糖醛酸之羧基經化學性改性者。此時可藉由 葡糖醛酸的羧基之改性狀態可控制體內動態。 HA衍生物的葡糖醛酸部分之羧基改性率若降低（例 如10莫耳％以下），可期待發炎部位或腫瘤部位中大量 表現之CD4 4爲主的HA受體、或HA爲主的代謝系統之 肝臟、對淋巴系統組織的鎖定目標效果。例如，可望對引 起變形性關節病症或風濕患者的發炎之滑膜細胞的鎖定目 標、藉由受體依賴型的最終細胞凋亡而插入細胞內，藉由 細胞內的藥物釋出而達到發炎之治療。 又，HA衍生物的葡糖醛酸部分之羧基改性率若提高 ’ HA受體的鍵結會被抑制，會成爲體內具有隱藏效果的 滯留性長之藥物載體微粒子。此時，期待利用EPR效果 的對腫瘤細胞之鎖定目標效果。且經過一定時間後停止羧 基的改性，若能設計爲改性基可由HA脫離之鍵結樣式（ 例如酯鍵結或醯胺鍵）、以EPR效果於腫瘤組織上進行 被動式鎖定目標後，以介由HA受體之主動式鎖定目標， 可於高效率下供給放有藥物的本發明微粒子。 作爲HA或其衍生物的葡糖醛酸部分之羧基改性方法 ’雖無特別限定，例如可舉出聚合物改性前將HA或其衍 -26- (23) (23)1378941 生物之羧基，單獨利用或適當組合利用N;N’-羰基二咪唑 (CDI) 、：N，N’·二環己基碳化二亞胺（DCC ) 、N-乙氧基 羰基·2-乙氧基-1，2-二氫D奎啉（EEDQ) 、4-(4:6-二甲氧 基-1，3,5 -三嗪）-4-甲基嗎啉（DMT-MM) ' 2 -苯甲三唑- 1,1,3,3-四甲基尿鹽4氟化硼酸鹽（TBTU) 、3,4-二氫-3- 羥基-4-羰基-1,2,3-苯甲三嗪（1100111)1) '苯甲三唑-1-氧 基-三-吡咯烷-鱗6氟化磷酸鹽（PyBOP)、苯甲三唑-1- 基-氧基-三（二甲基胺基）phosphanium 六氟磷酸鹽（ BOP ) 、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）碳化二亞胺（ EDC)或N-羥基琥珀銑酵亞胺（NHS)等縮合劑進行活性 酯化，將此與鍵結對醯肼基、胺基等活性酯具有反應性之 官能基的HA衍生物進行反應後，使其進行化學性鍵結方 法。且，亦可首先以聚合物改性HA或其衍生物，將所得 之透明質酸改性物所殘存的羧基進行相同反應而進行改性 〇 本發明所使用的HA或其衍生物的分子量雖無特別限 定’但因HA或其衍生物分子本身於水溶液中之尺寸與其 他分子相比非常大（例如黏度平均分子量爲200萬道爾頓 之 HA尺寸爲200〜300nm)，故粒子較爲小的奈米粒球 等的調製中使用分子量較少（例如黏度平均分子量爲30 萬道爾頓以下，例如5 000〜10萬道爾頓）的HA或其衍 生物爲佳。 本發明所使用的選自於聚乳酸（PLA )、聚甘醇酸（ PGA )、乳酸.甘醇酸共聚物（PLGA )之聚合物的分子 (24) (24)1378941 量雖特別限定，但由與HA或其衍生物的反應效率之面來 看’ 一般爲黏度平均分子量1〇萬道爾頓以下者，例如使 用1000〜5萬道爾頓者爲佳。這些聚合物可由Alkermes 、BirmingHAM Polymers, Inc、和光純藥工業股份有限公 司等購得’可使用無觸媒脫水縮聚法（特開昭61-28521 號公報）、或由環狀二酯化合物之使用處沒的開環聚合法 ( Encyclopedic HAndbook of Biomaterials and Bioengineering Part AMateri als, Vol. 2 , M ar c e 1 D e k k e r，

Inc. ( 1 99 5 ))而製造。 本發明所使用的聚合物之選擇，例如以鎖定目標爲目 的之藥物載體時，因欲使到達目標部位爲止之活體內藥物 釋出可抑制至最小極限，選擇使用PLA等分解速度（即 ，藥物釋出速度）較慢的聚合物爲佳。又，以體內藥物緩 釋爲目的時，欲實現對應目的之藥物釋出速度，可使用這 些共聚物控制藥物釋出速度。 本發明中，HA或其衍生物與選自PLA、PGA或 P L G A的聚合物鍵結之透明質酸改性物及其鹽並未取決於 經導入的聚合物（PLA、PGA或PLGA)之重量比，雖對 DMSO、DMAc ' DMF等有機溶劑、或於這些中混合充分 比率的溶劑（例如，四氫呋喃、甲醇、乙醇等）之混合溶 劑具有可溶性，但於乙腈 '丙酮 '二氯甲烷、乙酸乙酯等 有機溶劑中幾乎不溶解。 本發明中，與選自 HA或其衍生物與PLA、PGA或 P L G A之聚合物鍵結的透明質酸改性物及其鹽直接溶解或 -28 - (25) (25)1378941 分散於水中時’使用調節爲藉由共鍵結所導入的聚合物（ PLA、PGA或PLGA)之重量比爲50%以下，較佳爲3〇% 以下之透明質酸改性物爲佳。 本發明中，HA或其衍生物與選自pla、PGA或 PLGA的聚合物鍵結之透明質酸改性物及其鹽並未取決於 經導入的聚合物（PLA、PGA或PLGA)之重量比，一曰 溶解於DMSO、DMAc、DMF等有機溶劑、或溶解這些中 混合充分比率的溶劑之混合溶劑後，藉由透析法或溶劑擴 故法等以水取代溶劑而可溶解或分散於水中。雖無特別限 定’但推測此時的透明質酸改性物，可自發性地將殊水性 聚合物部分做爲中心部分而聚集，親水性的HA或其衍生 物部分以向著表面的狀態存在於水中。 本發明的透明質酸改性物可作爲藥物載體使用。依據 常法’將藥物封入 '包入、載持及/或分散於本發明的透 明質酸改性物即可。 本發明所使用的藥物僅爲可載持於生物分解性高分子 之藥物即可而無特別限定，可使用低分子化合物' 蛋白質 、肽等。 作爲低分子化合物的例子’例如可舉出抗癌劑（例如 ’烷基化劑、代謝拮抗劑、生物鹼等）、免疫抑制劑、抗 發炎劑（類固醇劑、非類固醇劑系統抗發炎劑等）、抗風 濕劑、抗菌劑（/5 ·內醯胺系抗生素、胺糖苷系抗生素、 大環內酯系抗生素、四環素系抗生素 '新曈啉系抗生素、 磺胺劑等）。 -29- (26) (26)1378941 作爲蛋白質、肽的例子，例如可舉出促紅細胞生成素 (EPO )、顆粒球（G-CSF)、干擾素·α 、召、r (INF-α ' β、ύ )、血小板生成素（ΤΡΟ)、神經營養因子（ CNTF )、腫瘤壞死因子（TNF )、腫瘤壞死因子結合蛋 白質（TNFbp )、間白素-10 ( IL-10 ) 、FMS類似酪胺酸 激酶（Flt-3)、成長賀爾蒙（GH)、胰島素、胰島素類 似成長因子-1 (IGF-1)、來自血小板成長因子（PDGF) 、間白素-1受體對抗物（IL-1 ra )、腦源性神經營養因素 (BDNF )、角化細胞成長因子（KGF )、幹細胞因子（ SCF )、巨核細胞成長分化因子（MGDF )、蝕骨抑制蛋 白（OPG )、萊普亭、副甲狀腺激素（PTH)、鹼性成纖 維細胞成長因子（b-FGF )、骨形成蛋白質（BMP )、心 房性鈉利尿肽（ANP )、腦性鈉利尿肽（BNP ) 、C型鈉 利尿肽（CNP )、擬胰高血糖肽-1 ( GLP-1 )、抗體、 diabody、minibody、斷片化抗體等° 作爲本發明中最佳型態，可舉出藥物載體形成微粒子 狀者。本案的透明質酸改性物爲HA或其衍生物部分爲親 水性’聚合物爲疏水性，故其爲水溶液中聚合物的表面以 HA或其衍生物所覆蓋之結構的微粒子狀。因該藥物載體 爲粒子表面以親水性HA或其衍生物被覆，故可防止投予 水溶液內、活體內之粒子的凝集、摩擦，且具有活體適應 性高之HA表面，故可防止中心部分的聚合物直接與活體 組織接觸，與緩和發炎等問題。 微粒子狀的本發明藥物載體之粒子徑爲了不會阻塞於 -30- (27) (27)1378941 針孔中而可順利通過，以2 00 μ m以下爲佳，1 〇〇 " m以 下爲更佳。又，關節投予時，因較易引起物理性關節內之 摩擦，引發新的發炎，故粒子徑以5/zm以下爲佳。又， 靜脈注射投予時，爲阻止莫梢血管之阻塞，粒子徑以 500nm以下爲佳，以200nm以下爲更佳。 又，本發明的微粒子爲活體適性良好，無發炎且於透 明質酸本身上具有黏膜附著性，故可控制粒子徑，可使用 於經鼻 '經肺、經口等非侵襲性投予用塗上。黏膜附著性 可由HA的羧酸量來調整，其量較多爲佳，而藉由間隔物 或聚合物等改性率較低爲佳。 本發明的微粒子調製方法例如可舉出乳化液中乾燥法 、或溶劑擴散法（J. Contr. Rel. 83，365-375 ( 2002)) 、透析法等。具體而言，可舉出調製聚合物微粒子後，其 表面上HA或其衍生物以化學鍵結被覆聚合物微粒子的方 法、HA或其衍生物的末端或側鏈上化學性鍵結聚合物預 先合成透明質酸改性物，使用此藉由乳化液中乾燥法、溶 劑擴散法、透析法等調製微粒子時，微粒子生成時自發性 地以HA被覆之方法、微粒子調製後自發性地以HA被覆 之方法。 調製聚合物微粒子後其表面上HA或其衍生物以化學 鍵結被覆聚合物微粒子之情況爲，依據常法調製出由聚合 物所成之微粒子後，粒子表面的羧基以1-乙基-3- ( 3-二 甲基胺基丙基）碳化二亞胺（EDC )或N-羥基琥珀銑酵 亞胺（NHS )等縮合劑進行活性酯化，將此與導入含有具 -31 - (28) (28)1378941 有與醯骈基（HZ)、胺基（AM)等活性酯反應活性之官 能基的間隔物之HA或其衍生物進行反應，形成化學性鍵 結而製造出本案透明質酸改性物所成之微粒子。 本發明的另一實施型態中，藉由乳化液中乾燥法可調 製出含有1種以上選自PLA、PGA或PLG之聚合物，以 透明質酸改性物被覆之微粒子。即，二氯甲烷、乙酸乙酯 等不與水混合之有機溶劑、或與於此中混合充分比率的溶 劑之混合溶劑中溶解PLA、PGA或PLGA，另一方面，本 發明的透明質酸改性物溶解或分散於水相中，調製成乳化 液後，藉由液中乾燥調製出以本發明的透明質酸改性物被 覆之微粒子。雖無特別限定，但該調製方法中，本發明的 透明質酸改性物爲1分子內具有疏水部與親水部之兩性分 子，故可想爲顯示界面活性劑。 本發明的另一實施型態中，藉由溶劑擴散法可調製出 含有1種以上選自PLA、PG A或PLG之聚合物，以透明 質酸改性物被覆之微粒子。即，丙酮、乙腈等於水混合之 有機溶劑或於此中以充分比率混合之乙醇、甲醇等有機溶 劑之混合溶劑中溶解PLA、PGA或PLGA，混合於水相時 有機溶劑進行擴散的同時亦生成微粒子，其水相中亦可溶 解或分散本發明的透明質酸改性物而使用，生成微粒子時 ，本發明的透明質酸改性物可被覆該微粒子。 使用溶劑擴散法或透析法中，使用DMSO、DM Ac、 DMF等有機溶劑、或使用這些中以充分比率混合之溶劑 的混合溶劑時，本發明的透明質酸改性物可溶解於有機相 -32- (29) 1378941 中使用。溶解於有機相的本發明透明質酸改性物 PLA、PGA或PLGA之聚合物的混合物，藉由對 透析或滴入後溶劑由水取代時，疏水性聚合物的 成微粒子的同時，親水性的HA部分聚集於微粒 使本發明的透明質酸改性物被覆微粒子。又，使 散法或透析法時，使用DMSO、DMAc、DMF等 、或使用這些中以充分比率混合之溶劑的混合溶 發明的透明質酸改性物亦可溶解於有機相中使用 粒子時，本發明的透明質酸改性物可被覆該微粒 無論任何微粒子調製方法，因PLA、PGA或 成的微粒子表面爲疏水性，將這些微粒子混合於 散本發明透明質酸改性物之水溶液時，藉由疏水 用會引起對微粒子表面之吸附，調製出以親水性 透明質酸改性物被付之微粒子。 調製本發明的微粒子中所使用的水相，不僅 成，亦可由於水中以充分比率混合溶劑之混合溶 據所需，可含有該技術領域中常用之添加物，例 性劑、pH調整劑或緩衝劑等，可適宜地調節pH 〇 僅使用本發明的透明質酸改性物可形成微粒 形成含有該技術領域中常用之添加物，例如界面 P Η調整劑、抗氧化劑等的同時，亦含有本發明 酸改性物之微粒子。本發明的其中實施型態中， 明的透明質酸改性物之微粒子，其中心部分可含 或與選自 水相進行 聚集而形 子表面可 用溶劑擴 有機溶劑 劑時，本 ’生成微 子。 PLGA 所 溶解或分 性相互作 的本發明 可由水所 劑。又依 如界面活 或鹽濃度 子，亦可 活性劑、 的透明質 含有本發 未與選 -33- (30) (30)1378941 自PL A、PGA或PLG A之HA鍵結之聚合物。添加前述添 加物或該聚合物，可調節微粒子的粒徑或藥物載持能力。 本發明的透明質酸改性物所被覆的微粒子之中，特別 爲調製以CD44爲始的鎖定HA受體爲目的之微粒子時， 其粒子的尺寸以.5//m以下，例如lnm〜5/im以下爲佳， 其調製法可使用透析法、溶劑擴散法、乳液中乾燥法。此 時所使用的透明質酸改性物以不會抑制對HA受體的鍵結 下’ HA的葡糖醛酸部分的羧酸之改性率爲1〇莫耳％以下 ，例如以0 . 1〜1 0 %爲佳。 以本發明的透明質酸改性物被覆之微粒子中，特別調 製以對血中滯留性延長、腫瘤組織、發炎組織之聚集性爲 目的的微粒子時，其粒子尺寸以200nm以下，例如lnm 〜2Ό 0 n m爲佳，其調製法可使用透析法、溶劑擴散法、乳 液中乾燥法。此時所使用的透明質酸改性物以不會抑制對 HA受體的鍵結下，HA的葡糖醛酸部分的羧酸以3〇〜ι〇〇 %、較佳爲5 0〜9 0 %的改性率進行改性者爲佳。 以本發明的透明質酸改性物被覆之微粒子中，調製出 以減低局部性刺激性爲目的之微粒子時，其粒子尺寸以 200 /z m以下’例如inm〜200 // m爲佳，其調製法可使用 h析法、彳谷劑擴散法、乳液中乾燥法。 以本發明的透明質酸改性物被覆之微粒子中，調製出 以具有黏膜附著性之非侵襲性投予用途之微粒子時，其粒 子尺寸以200/im以下，例如inm〜200ym爲佳，其調製 法可使周透析法、溶劑擴散法、乳液中乾燥法。所使用的 (31) 1378941 透明質酸改性物欲使其具有黏膜附著性，而以HA的 改性率較低爲佳。 將藥物封入這些微粒子的方法，使用通常使用於 聚合物的方法。例如，調製微粒子時將聚合物溶 DM SO等有機溶劑時使藥物亦共存於其中，而直接調 微粒子即可。藥物的水溶性較高時，藥物可改爲對於 溶解性較爲低之鹽類，或使用 W/0/W乳化法而提高 效率。 所調製出的微粒子經冷凍乾燥後難以再次分散時 與海藻糖、甘露糖醇等分散劑共存下進行冷凍乾燥。 配合本發明的透明質酸改性物之用途，亦可爲本 的透明質酸改性物之血中滯留時間，與HA本身之血 留時間相比下可延長者。其中欲獲得血中滯留時間經 的本發明透明質酸改性物，作爲原料可使用血中滯留 經延長的透明質酸衍生物。血中滞留時間爲，利用平 中滯留時間（以下亦稱爲MRT )、血中半衰期（以 稱爲t! /2 )、血中淸除率（以下亦稱爲CI )等公知代 的參數而作適當比較。對於本發明的透明質酸改性物 形效果，含人類的哺乳類之血中滯留時間由實用面來 1 8小時以上的平均血中滞留時間（MRT )者爲佳。上 小時以上爲更佳。 又，另一方面配合本發明的透明質酸改性物之用 與HA本身相比對於透明質酸酶之分解具有耐性者亦 其中欲得到與HA本身相比對於透明質酸酶之分解具 羧酸 封入 解於 製出 水的 封入 ，可 發明 中滯 延長 時間 均血 下亦 表性 的隱 看以 I 30 途， 可。 有耐 -35- (32) (32)1378941 性的本發明透明質酸改性物，做爲原料可使用與HA本身 相比對於透明質酸酶之分解具有耐性的透明質酸衍生物。 所謂「對於透明質酸酶的分解具有耐性」係指HA本身與 本發明透明質酸改性物或原料之透明質酸衍生物分別由透 明質酸酶分解時’比HA本身相比具有較慢分解速度或無 法進行分解之性質者。例如，一定時間進行透明質酸酶處 理時’僅未觀察到HA本身時觀察到之雙糖分解波峰時即 判斷爲具有「無法進行分解」之性質（即，對透明質酸酶 的分解具有耐性）。且HA的分解速度或分解狀態可使用 凝膠浸透層析法（以下亦稱爲GPC )等常法而進行觀察。 【發明的效果】 本發明亦提供一種藉由透明酸或其衍生物 '與1種以 上選自聚乳酸、聚甘醇酸或乳酸•甘醇酸共聚物之聚合物 鍵結之透明質酸改性物。使用該透明質酸改性物可有效率 地封入低分子藥物’可長時間控制該徐放期間，可控制血 中滞留性、於水溶液中的分散性優良，且爲無安全性問題 之藥物載體。又’本發明提供一種藉由透明質酸改性物可 使粒子間較少凝集’可控制粒子徑且爲血管注射劑微粒子 所成的優良活體適應性之藥物載體。 【實施方式】 【實施例】 以下對於本發明的較佳實施例作更詳細之說明，但本 -36- (33) (33)1378941 胃明Μ未限定於' il些實施例Φ °且以下無論任何鍵結形式 ’ ΗΑ與PLA鍵結者總稱爲HA-PLA。又，作爲間隔物分 子而含有酸耕基化合物時稱爲HA-HZ-PLA，含胃二 合物時稱爲ha-am-pla。 藉由三硝基苯磺酸（TNBS )之胺基的定量爲依據「 學會出版中心生物化學實驗法12蛋白質的化學改性〈 上〉初版」之第3 7頁所記載的方法（tnB S法）進行。 但TNBS溶液調製成0_5M，測定500nm的吸光度而定量 醯肼基。 且，NMR測定爲使用JNM-ECA500 ( 500MHz分光計 )作爲NMR分光計，以下述條件（參數）進行測定。 NMR條件

Data points(X point):1 63 8 4 Spectral width(X sweep);15ppm Acquisition t i m e (X acq time): 1 .749s Pulse del ay (Relaxation d e 1 ay ) : 3 0 s Transients(Scans):64 溫度：室溫 〔實施例1〕以透明質酸被覆之PLGA微粒球的調製 (實施例1-1 )導入醯肼基（HZ)的透明質酸（HA-HZ) 之合成

將100mg的分子量2·5χ104道爾頓之透明質酸（HA )(電化學工業股份有限公司製）以1 %濃度溶肖？ &胃@ -37- (34) (34)1378941 水中，以5N鹽酸將pH調爲4.7〜4.8。將卜乙基- 3-(3-二甲基胺基丙基）碳化二亞胺（EDC) ( sigma- Aldrich 公司製作）與己二酸二醯肼基（ADH ) ( sigma- Aldrich 公司製作）中，添加對於含於所使用的透明質酸之葡糖醛 酸（羧基）而言爲5倍莫耳比之EDC及4〇倍莫耳筆的 ADH，以5N鹽酸將pH保持於4.7〜4.8下於室溫下進行 2小時反應。以lOOmM氯化鈉水溶液、25%乙醇水溶液 進行透析（spectrpore7、部分分子量（MWCO ): 12k~14k道爾頓），經冷凍乾燥後得到88mg的導入醯肼 基（HZ)的透明質酸（HA-HZ)之標題物。 所得之HA-HZ中的HZ導入率以質子NMR法（測定 溶劑：D20)進行定量時，HA的羧酸之65%被HA化（ HA: N -乙醯基、2.1ppm、HZ:己二酸部分的伸甲基' 1 . 7 pp m ' 2.4 ppm )。又，以 TNBS 法定量時得至!J 34.9%。 (實施例1-2) PLGA微粒球的調製 PLGA7510C和光純藥工業：分子量 1萬道爾頓）溶 解於10mL的二氯甲烷（純正化學）中調製出10% ( w/v )的溶液。將此混合成1%聚乙烯醇、90ml的（87-89% 水解、分子量13000〜26000)水溶液（PVA水溶液）成1 :9 ( v/v )，以攪拌器約7〇〇rpm下攪拌得到〇il-in-water (O/W )乳化劑。該乳化劑放入1 % PVA之900ml的水溶 液中以約200rpm進行一晚攪拌。將溶劑餾去後得到微粒 球的懸浮液。該懸浮液以I OOOrpm，4°C下進行1 0分鐘離 -38- (35) (35)1378941 心後除去澄淸液’以水充分洗淨後冷凍乾燥者作爲微粒球 而回收。藉由S Ε Μ顯像解析測定粒徑的結果得到粒徑爲 30〜80yni程度的微粒球。 (實施例1-3)以透明質酸被覆之PLGA微粒球的調製 將實施例1-2的PLGA微粒球之表面羧酸使用EDC 及Sulfo-NHS(N-羥基琥珀銑酵亞胺）（比亞司公司製作 )活化（PLGA/EDC/Sulf〇-NHS=l/5/5 莫耳比，l〇〇mM 磷 酸緩衝液（pH5 . 8 )中於室溫下攪拌1小時）、投入實施 例1-1的HA-HZ水溶液（0.1%，lOOmM磷酸緩衝液（ ρΗ7·0))中，於室溫下攪拌2小時後，以l〇〇mM磷酸緩 衝液（p Η 7 · 0 )進行洗淨，得到以透明質酸被覆之PLGA 微粒球。所得之以透明質酸被覆的PLGA微粒球之SEM 及3 D雷射顯微鏡照片如圖1及圖2所示。由SEM照片（ 乾燥狀態）（圖1 )得知，藉由HA被覆後PLGA微粒球 表面變較爲光滑。由3 D雷射顯微鏡照片（圖2 )得知， 水溶液中所得之以透明質酸被覆之 PLGA微粒球爲， PLGA粒子由HA的膠體狀外殻所被覆。 〔實施例2〕以透明質酸被覆之PLA奈米粒球的調製 (實施例2-])導入PLA的透明質酸（HA-PLA)的合成 將1 0 0 m g的實施例1 -1相同方法所得之H A - Η Z溶解 (0.5%濃度）於20mL的水，添加4mL的Η型陽離子交 換樹脂（Dowex 50WX8-400’ 4_8meq/g) (HA 的羧基之 -39- (36) (36)1378941 100倍的離子交換能）於室溫中放置3天。回收澄淸液通 過 〇.22//m 濾器，添加 150"L 的 1M TBA-OH (四-N-丁 基銨氫氧化物），調整爲pH 8後冷凍乾燥。對於含於經 冷凍乾燥的HA-HZ-TBA之葡糖醛酸（羧基），將各莫耳 比爲5倍量之PLA0005 C分子量5000道爾頓）、EDC、 NHA溶解於l〇mL的DMSO，於室溫下放置2小時，進行 PLA的羧基活性酯化。另一方面將HA-HZ-TBA溶解於 20m L的DMSO中，將此混合室溫下放置一晚。對DM SO 透析（MWCO: 25000，室溫、10天）該反應液而除去活 性試藥，其次進行對水透析（MWCO: 12000-14000，室 溫、3天），冷凍乾燥所得之白濁溶液（含有來自25K道 爾頓的HA的HA-PLA之奈米粒球分散溶液）（且，對於 所得之白濁溶液以GPC進行定量時HA-PLA : PLA爲約1 ： 9 )。欲除去未反應的PLA，將該冷凍乾燥品投入丙酮 中，並以丙酮洗淨不溶物，經乾燥得到HA-PLA。凝膠浸 透層析法（GPC )的測定數據（溶劑：DMSO )如圖5所 示。由波峰的位置來看HA-TBA以標品來評估其分子量， 藉由PLA的鍵結，可確認分子量由當初的25k道爾頓至 97k道爾頓。所得之HA-PLA之質子NMR如圖6所示。 HA-PLA中的PLA導入率以質子 NMR法（測定溶劑： DMSO-d6 )定量時，HA的羧酸之43莫耳％被PLA化（ HA: N·乙醯基，1.5 〜1.9ppm，PLA: PLA:羰基之 α 位 置之甲川質子（惟，ΟΗ末端除外），5.0〜5.6ppm)。 -40 - (37) 1378941 GPC條件

溶離液：DMSO或5mmol/L含有NaN03的DMSO 流速：1 . 0 m L /分鐘 檢測器：RI、UV ( 2 8 0nm )

柱子：TOSOH TSKgel GMHhr-H 柱子溫度：4 0 °C 樣品室溫：2 5 °C 樣品濃度：10mg/mL，50M1 (實施例2-2 )藉由以透明質酸被覆之PLA奈米粒球的透 析法之調製 於實施例2 · 1的順序中，對於水之透析後所得的白濁 溶液，使用含有25k道爾頓之來自HA的HA-PLA作爲奈 米粒球分散溶液使用。 另一方面，使用分子量爲190k道爾頓之HA，該HA 溶解於蒸餾水中至0.5 %濃度，其他與實施例1 -1相同方 法調製出HA-HZ，與實施例2-1相同方法所調製之DMSO 透析後的反應液進行對水之透析（M W C 0 : 2 5 Ό 0 0，室溫 ，3天）調製出含有190k道爾頓之來自ΗΑ的HA-PLA之 奈米粒球分散溶液。 所得之分散溶液皆於純化操作後爲白濁狀（未見到沈 澱物）。將此稀釋至1 0 0倍後以D L S ( N i c 〇 m p 3 7 0 )測定 粒徑時，使用190k道爾頓之HA者爲263.8nm，使用25k 道爾頓之HA者爲243.8nm。所得之分散溶液於4°C下既 -41 - (38) (38)1378941 使保存1個月亦幾乎無凝集沈澱物。保存i個月後的照片 如圖7及圖8所示，SEM照片如圖1 0及圖Π所示。 (實施例2-3 )藉由以透明質酸被覆之PLA奈米粒球的溶 劑擴散法之調製 使用於實施例2-1的25k道爾頓之HA者中’分別坪 取2 Omg的冷凍乾燥藉由丙酮再沈澱之純化前分散溶液（ HA-PLA ： PLA約1: 9)所得者，及經丙酮再沈澱後之 HA-PLA，溶解於l.OmL的DMSO。將此於4_0mL的水中 邊攪拌邊滴入的同時成爲淡白色半透明溶液。將該混合溶 液移至透析試管（1^\^00:12000 〜14000，5?6(^^/?(^4 )，進行對水之透析（室溫，3天）。對於所得之奈米粒 球分散溶液進行D L S測定（N i c 〇 mp 3 7 0 )時奈米粒球的粒 徑於純化前爲1 7 · 6 n m，純化後者爲1 5.2 n m。又，該奈米 粒球分散溶液對D20進行透析（4°C，2天），進行質子 NMR 測定（.TNM-ECP500 FT NMR SYSTEM，JOEL，測定 溶劑：D 2 Ο )時（純化前：圖]3，純化後：圖14)，同 時確認出來自HA-HZ的質子波峰，故表示奈米粒球的表 面由HA分子所被覆。 〔實施例3〕二克氯吩（Diclofenac )封入以透明質酸之 PLA奈米粒球的調製 (實施例3 -1 )調製方法 •溶劑擴散法 -42- (39) 1378941 與實施例2_2相同方法之操作所調製的4〇mg 乾燥含有25k道爾頓之來自ha的HA-PLA之奈米 散溶液（HA-PLA: PLA約爲1: 9)者、l〇mg的 吩（將由Sigma公司所購得者以鹽酸再沈澱經離子 Η型’經純水洗淨乾燥所得者），溶解於1 .〇mL的 中。將此於4.〇mL水中邊攪拌邊滴入的同時成爲淡 透明溶液。將該混合溶液移至透析試管（MWCO 〜 14000，Spectra/Por4)，進行對水之透析（室潘 )。所得之水溶液以離心（lOOOrpm X 10分鐘）進 與澄淸液分離後回收澄淸液再進行冷凍乾燥》 •透析法 與實施例2-2相同方法之操作所調製的4〇mg 乾燥含有25k道爾頓之來自HA的HA-PLA之奈米 散溶液（HA-PLA : PLA約爲1 : 9 )者、1 〇mg的 吩，溶解於l.OmL的DMSO中。將該混合溶液移 試管(MWCO ： 1 2000 〜1 4000, Spectra/Por 4)， 水之透析時，馬上產生白濁沈澱（室溫’ 3天）。 水溶液以離心（10 OOrpm xlO分鐘）進行沈澱與澄 離後回收澄淸液再進行冷凍乾燥。 (實施例3-2)奈米粒球中的二克氯吩定量 •標準溶液的調製 調製出（Α)二克氯吩的5.l3mg/ml-乙腈之2 經冷凍 粒球分 二克氯 交換成 DMSO 白色半 ：12000 卜3天 行沈澱 經冷凍 粒球分 二克氯 至透析 進行對 所得之 淸液分 倍稀釋 -43- (40) 1378941 列（6列）。作爲內部標準（IS )調製出正庚基 4-羥基 苯甲酸酯之2.60mg/mL的乙腈溶液（B)。混合200"L( A)與20/zL(B)作爲二克氯吩定量的標準溶液（c)。 •由奈米粒球的二克氯吩之萃取.樣品的調製

秤取各4.91mg、5.45mg的藉由溶劑擴散法·透析法 所調製的奈米粒球，溶解於1 .OmL的乙腈。充分攪拌後以 離心（ 1500rpmx5分鐘）由樣品中萃取出二克氯吩，回 收澄淸液（D )。混合200 // L ( D )與20 # L ( B )作爲二 克氯吩定量樣品（E )。 •藉由RPHPLC的二克氯吩定量 對（C )及（E )進行RPHPLC測定，記由IS法進行 二克氯吩定量。 HPLC條件

溶離液：0.1%TFA 60%MeCNaq 檢測器：UV( 280nm)

柱子：Intakt Cadenza CD-C18 流速：1 .OmL/分鐘 樣品注入量：1 〇以L 該結果爲，二克氯吩封入率以溶劑擴散法爲4.9重量 % ’透析法爲1.45重量％。 -44- (41) (41)1378941 〔比較例1〕PLA奈米粒球之調製 (比較例1 -1 ) P L A奈米粒球支調製 將 PLA 溶解於 DMSO 中（0.316g/mL DMSO)，與實 施例2 - 3相同方法進行對水之透析。雖得到白濁水溶液但 無沈澱物。測定分散溶液的粒徑結果爲2 73.3 nm。於4°C 下保存1個月’保存1天後幾乎無凝集沈澱。保存1個月 後的照片如圖9所示，同SEM照片如圖1 2所示。可得知 粒子呈凝集現象。 〔實施例4〕導入醯肼基的隱藏性透明質酸改性物之合成 及功能評估 (實施例4-1)導入HZ基之透明質酸（HA-HZ)的合成 將840mg的HA (電化學工業股份有限公司：黏度平 均分子量爲25k道爾頓）溶解於蒸餾水/Et〇H= 5 0/5 0中 成濃度。添加至HA的單位：EDC:ADH=1:4: 40莫耳比爲止，以5N鹽酸保持PH爲4.7〜4.8下於室溫 中反應2小時。對過剩量的i 00ηιΜ氯化鈉溶液、2 5 %的 乙醇溶液、蒸餾水之順序進行透析（M W C 0 : 1 2 0 0 0〜 14〇〇〇)，經冷凍乾燥後得到86.6mg的導入醯肼基的透明 質酸（HA-HZ)。所得之HA-HZ的於D20中之NMR光譜 測定結果如圖1 5所示。以Η Z導入率作爲基A D Η導入率 由質子NMR法進行定量時，得到對HA單位（雙糖）爲 63.0% (HA:N-乙醯基的甲基質子，i.85ppm，來自HZ :ADH 之 4 個甲川質子，1.5、2.1 及 2_25ppm)。 (42) 1378941 (實施例4-2) ΗA-HZ的酵素耐性評估

由實施例4-1所得之HA-HZ溶解於0.1M磷酸緩衝液 (ρΗ6·2 )至0.5mg/mL濃度。該溶液80yL中添加32//L 的透明質酸酶之〇.5U/mL溶液，於37°C下恆溫培養24小 時。作爲對照組對於酵素未添加群亦進行相同操作（省略 數據）。提供餘個凝膠浸透層析法（以下又稱爲GPC)中 ，觀察HA-HZ的分子量變化、分解產物的生成形式》 GPC的條件如下。 G P C條件 GPC 柱子· Superdex 2 0 0 1 0/3 00 GL、Superdex 75 HR 10/30、Superdex Peptide HR 10/30 (皆爲 Amersham Biosiences股份有限公司製作）（3條連結） 移動相：PBS ( ρΗ7·4 )

溶離方式：Isocratic 流速：0.4mL/分鐘 樣品注入量：5 0 " L 檢測器：UV、Abs. at 2 3 2nm 酵素分解產物的GPC表圖如圖16所示’ GPC條件下 觀察到HA-HZ之波峰頂點的保持時間約75分鐘，酵素分 解產物之雙糖的保持時間約130分鐘。 由上得知實施例4-1所得之試料藉由酵素分解的分子 量降低顯著被抑制。 -46- (43) (43)1378941 (實施例4-3)藥物動態試驗之FITC化HA-HZ的合成 實施例4-1所得之HA_HZ ( 38.9mg)以2.0mg/mL濃 度溶解於50mM碳酸緩衝液（pH9.0)。將對於HA的單 位爲0.15莫耳倍之螢光異硫氰酸酯（以下亦稱爲fitC) (比亞司公司製作）加入HA-HZ溶液之1/10容量的二甲 基亞硯（以下亦稱爲DM SO )溶液於室溫下攪拌1小時。 脫鹽柱子 PD-l〇(Amersham Biosiences股份有限公司製 作）中除去未反應的FITC後，添加對HA單位爲40莫耳 倍之琥珀酸酐（和光純藥工業公司製作）以PD- 1 0粗純化 之溶液的1 /1 〇容量之D M S Ο溶液。室溫下攪拌1小時使 其反應後，對於過剩量水進行透析並純化，經冷凍乾燥後 得到ΗΑ-ΗΖ經FITC標識的螢光標識HA-HZ ( 3 80mg)。 將如此所得之螢光標識HA-HZ以0.25mg/mL的濃度 溶解於 50mM碳酸緩衝液（pH9.0 )中，由該溶液的 494nm之吸光度定量F1TC濃度，由以下的立方程式算出 各單位濃度。且進行莫耳分率的換算，算出HA改性物中 的來自HA的重量分率。

未修飾HA單位：X nmol/mL HA-SUC單位：y nmol/mL (殘存HZ係爲無水琥珀酸 酐處理之單位） 式 l:(379.3xx) + (635.57xy) + (924.88x(FITC 濃度））= 250mg 式 2 : x/(y+ (FITC 濃度））=(100— HZ ( % ) ) /HX ( % ) -47- (44) (44)1378941 實施例4-3的螢光標識ΗΛ-HZ以HZ 63%，FITC 1.5 %的導入率表示。 (實施例4 - 4 )對藥物動態試驗的隱藏性評估 •投與Η A的老鼠血漿樣品 將實施例4-3的螢光標識HA衍生物以透明質酸 l〇mg/kg的用量單次投與於老鼠靜脈內，投與前及投與後 以 0_25、 1、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24、 30、 54 小時採血 (肝素處理）經離心分離得到血漿。冷凍保存至該血漿樣 品測得爲-20°C以下。 •測定方法 藉由GPC進行校正曲線用標準試料及測定用試料的 分析。條件如下所示》 GPC 柱子：TSKgel G6000PWXL 移動相：PBS ( ρΗ7·4 )

溶離方式：Isocratic 流速：0.5m L/分鐘 樣品注入量：4 0 μ L 檢測器：螢光（ΕΧ : 490、ΕΜ : 518) *檢量線用試料：各蛋光標識Ha衍生物以PBS( PH7.4)稀釋，調製出 1、5、10、50、100、5 00 # g/mL 及 0以g/mL (對照，PBS ( ρΗ7·4 ))的標準液。該標準液中 添加等容量之正常老鼠血漿調製出校正曲線用試料。 -48- (45) 1378941 •測定用試料的調製：投與HA改性物之老鼠血漿樣 品中添加等容量的PBS ( pH7.4)調製出測定用試料。 •血漿中的HA改性物濃度之計算：使用解析軟體 Millenium算出波峰面積。由各標準試料的波峰面積所得 之校正曲線算出HA改性物濃度。 藥物動態數據 對於實施例4-3的螢光標識HA衍生物的血中濃度推 移數據，WinNonlin Ver 3.3 ( Pharsight公司）中算出藥 物動態學參數。利用各個體的最終測定點之3點進行模型 非依賴性解析，算出半衰期（t1/2 )，平均血中滯留時間 (MRT )。所算出的藥物動態學參數如表1所示。 表1 . FITC標識化HA衍生物之藥物動態性參數 HAMw (k道爾頓） Hz (%:NMR) Cl (mL/hr/kg) MRT(h) tl/2(h) 實施例4_3 25 63 4·03±0·3 32·8±1·7 25·2±2_0

藉由使用螢光標識HA衍生物之藥物動態試驗，導入 醯肼基的HA衍生物，與未改性的HA比較時，確認老鼠 單次靜脈投與後的血中滯留時間已改善。對於未改性的 HA之血中半衰期（t1/2)爲數分鐘的程度而言，導入醯肼 基使血中半衰期爲25.2 ±2.0 (小時）。 -49- (46) (46)1378941 〔實施例5〕藉由胺基酸的導入之隱藏性透明質酸改性物 的合成•功能評估 (實施例5-1 )經AM基導入的透明質酸（HA-AM )之合 成 1 將使用四丁銨（TBA)經氯化的DOWEX 50WX8-400 (Aldrich公司製作）再經TBA氯化之HA-TBA ( HA :電 化學工業股份有限公司：黏度平均分子量19k道爾頓） 3〇S.2mg，溶解於 DMSO 至 2mg/mL 濃度。以 EDA、BOP 的順序添加至HA的單位：BOP (和光純藥工業公司製作 ):伸乙基二胺（EDA) (sigma- Aldrich 公司製作）=1 :1·1 : 50莫耳比，室溫下反應一晚。其後取出80mL，加 入1/2量即40mL的1M NaCl水溶液後，以5N HC1使pH 降至3，再以2N NaOH進行中和。對大量過剩水進行透 析純化（光譜孔7、MWCO: 12000〜14000道爾頓）、極 限過濾後，經冷凍乾燥後得到1 1 〇mg的標題之導入胺基 的透明質酸。所得之HA-AM之D20中之NMR光譜測定 結果如圖1 7所示。 以HZ基導入率作爲AM導入率以質子NMR法定量 時，對於HA單位（雙糖）爲94.0% ( HA : N-乙醯基的 甲基質子、1 .85ppm，AM :來自 EDA的1個伸甲基質子 ’ 2_98ppm )。且 NMR 測定爲使用 JNM-ECA5 00 ( 5 00MHZ分光計）作爲NMR分光計，進行與實施例4-1 相同條件（參數）之測定。 -50- (47) (47)1378941 (實施例5-2)導入AM基的透明質酸（HA-AM)之合成-2 使用經TBA氯化之HA-TBA ( HA :電化學工業股份 有限公司：黏度平均分子量200k道爾頓），除HA的單 位：BOP (和光純藥工業公司製作）：伸乙基二胺（EDA )=1 : 1. 08 : 50莫耳比以外，其他與實施例5-1的方法 相同下，得到導入胺基的透明質酸（HA-AM)。以質子 NMR法（測定溶劑：D20 )定量時，對於HA單位（雙糖 )爲 68.0% ( HA : N-乙醯基的甲基質子、1 _89ppm，HZ :來自AM的1個伸甲基質子，3.00ppm)。 (實施例5-3)導入AM基的透明質酸（HA-AM)之合成-3 使用（實施例5-2)導入AM基的透明質酸（HA-AM)之 合成-2 除HA的單位：BOP: 2,2-(伸乙基二氧基）雙（乙 胺）（EDOBEA ) ( sigma- Aldrich 公司製作）=1 : 1. 〇 :5 0莫耳比以外，其他與實施例5 -1的方法相同下，得 到導入胺基的透明質酸（HA-AM)。以質子NMR法（測 定溶劑：D20 )定量時，對於HA單位（雙糖）爲58.0% (HA: N-乙醯基的甲基質子、i.89ppm，HZ:來自AM的 1個伸甲基質子，3.05ppm)。 (實施例5_4 ) HA-AM的酵素耐性評估 由實施例5 -1〜5 - 3所得之 H A - A Μ溶解於水中至 2mg/mL濃度。55#L的該溶液中加入132"L之0.2Μ磷 -51 * (48) (48)1378941 酸緩衝液（pH6.2 )及77 // L的水，添加44 v L的透明質 酸酶SD (生化學工業股份有限公司製作）lU/mL溶液（ 含有0.01%的BSA之0.05M磷酸緩衝液（pH6.2))後進 行37°C的24小時恆溫培養。對於酵素未添加群亦進行相 同操作（省略數據）。各提供於凝膠浸透層析法（以下亦 稱爲GPC )下觀察其HA-AM分子量的變化、分解產物的 生成形式。且GPC以與實施例4-2相同條件（參數）下 進行測定。 酵素分解產物的GPC結果如圖18所示。於該GPC條 件下，酵素分解物的雙糖之保持時間觀察到約爲130分鐘 。實施例5-1〜5-3所得之試料中，得知藉由酵素分解之 分子量降低顯著被抑制。 〔實施例6〕對於導入PLA之透明質酸的合成·溶解性之 評估

(實施例6-1)導入HA基之透明質酸（HA-HZ)的TBA 氣化 將lOOOmg的與實施例4-1相同方法所得之HA-HZ 溶解於1 000mL的蒸餾水中（0.1%濃度），添力卩37.5mL 的經 Η型之陽離子交換樹脂（Dowex 50WX8-400、 2.1meq/g) ( HA的羧基之]0 0倍離子交換能）於室溫下 放置一晚。回收澄淸液，以0.2 2 // m過濾器進行過濾後， 添力口】.85yL的40wt% TBA-OH水溶液而調整爲pH7.0 。所得之水溶液進行冷凍乾燥得到TBA氯化HA-HZ的白 -52- (49) (49)1378941 色粉末。收量爲93 2.8mg。 (實施例6·2)導入PLA (黏度平均分子量5k道爾頓） 之透明質酸（HA-HZ-PLA)之合成 欲使 PLA 濃度到達 25mg/mL，PLA/EDC/NHS = 1/1/1 (莫耳比），將PLA-0005 (和光純藥工業：黏度平均分 子量5k道爾頓，數平均分子量爲2.83k道爾頓）'EDC 、NHS溶解於無水DMSO中，密封下於室溫中攪拌3小 時’使PLA的末端羧基進行活性酯化。另一方面，實施 例6-1所調製的TBA氣化HA-HZ溶解於無水DMSO中至 5mg/mL。TBA氯化HA-HZ溶液中添力口如表2(a〜j)所示 的比率下添加無水D M S 0、活性酯化P L A溶液之順序（最 終T B A氯化H A - Η Z濃度爲1 · 5 m g / m L )，將此經混合、 密封下室溫中攪拌一晚。該反應液對蒸餾水進行透析（ MWCO: 12000-14000，室溫’ 3天），冷凍乾燥所得之白 濁溶液。該冷凍乾燥物以過剩的丙酮洗淨，再以剩下的乙 醇洗淨，減壓乾燥不溶物得到白色粉末的HA-HZ-PLA。 當DMSO作爲溶劑時的GPC層析法如圖19所示。GPC的 條件如下》 GPC條件 GPC 柱子：GMHHR-H ( TOSOH 製作） 移動相：10mMNaNO3(pH7.4) 溶離方式：Isocratic -53- (50) (50)1378941

流速：l.GmL /分鐘 樣品注入量：50// L 檢測器：UV、Abs. at 280nm 樣品濃度：5.0mg/mL 由波峰位置移至高分子得知PLA經導入後分子量會 增加。所得之HA-HZ-PLA之DMS〇-d6中的質子NMR如 圖20所示。HA-HZ-PLA中的PLA導入率以NMR法定量 結果如表3所示，假設PL A的分子量分佈依舊爲原料與 經導入者時，對於HA單位（雙糖）爲丨.0〜46.1%。又 ’ HA-HZ-PLA分子中的PLA重量比爲57〜73.4% w/w ( HA: N-乙醯基之甲基質子，丨，8 5pPm ’ PLA :羰基的α位 置之甲基質子（惟除去0Η末端）’ 5·0〜5.6Ppm )。 -54 - (51) (51)1378941 表2.實施例6-2中HA-HZ-PLA之合成條件 樣品 當量比 (PLA/HA unit) TBA HA-HZ 溶液使用量 (mL) 無水DMSO 使用量〇L) 活化pla溶 液使用量 (mL) a 1.3 6.0 13.92 0.08 b 2.6 6.0 13.84 0.16 c 6.5 6.0 13.61 0.39 d 13.0 6.0 13.21 0.79 e 26.0 6.0 12.42 1.58 f 39.0 6.0 11.64 2.36 g 52.0 6.0 10.85 3.15 h 65.0 6.0 10.06 3.94 i 130.0 6.0 6.12 7.88 j 195.0 6.0 2.18 11.82 -55- (52) 1378941 表3.實施例6_2所得之hA-HZ-PLA之合成結果 樣品 收量（mg) PLA導入率（％) PLA重量比（％w/w) a 15.3 1.0 5.7 b 15.8 2.0 10.6 c 19.6 4.1 19.6 d 22.2 7.3 30.0 e 25.8 12.5 42.5 f 28.3 13.6 44.6 g 26.9 17.1 50.4 h 29.8 20.8 55.3 i 32.6 35.4 67.9 __j 35.3 46.1 73.4

(實施例6-3)導入PLA (黏度平均分子量爲2 0k道爾頓 )之透明質酸（HA-HZ-PLA)的合成 實施例6-2的PLA-0005變爲PLA-0020 C和光純藥工 業：黏度平均分子量20k道爾頓，數平均分子量爲8.73k 道爾頓），TBA氯化HA-HZ溶液與無水DMSO、活性酯 化PLA溶液的混合比變爲表4 ( k〜t )，其他與實施例6-2相同方法得到HA-HZ-PLA的白色粉末。此時的GPC光 譜如圖21所示，質子NMR如圖22所示。定量HA-HZ-PLA中的PLA導入率以NMR法（測定溶劑：DMSO-d6) 定量結果如圖5表不’假設PLA的分子量分佈依舊爲原 -56- (53) (53)1378941 料與經導入者時，對於HA單位（雙糖）爲0.9〜12.8% 。又，HA-HZ-PLA分子中的PLA重量比爲13.5〜69.9% w/w (HA: N-乙醯基之甲基質子，i.85ppm; PLA:羰基 的α位置之甲基質子（惟除去OH末端），5.0〜5.6ppm 表4.實施例6-3上HA-HZ-PLA之合成條件 樣品 當量比 (PLA/HA unit) TBA HA-HZ 溶液使用量 (mL) 無水DMSO 使用量（mL) 活化PLA溶液 使用量（mL) k 1.3 12.0 27.52 0.48 1 2.6 12.0 27.04 0.96 ΠΊ 6.5 12.0 25.59 2.41 η 13.0 12.0 23.18 4.82 0 19.5 12.0 20.77 7.23 Ρ 26.0 12.0 18.37 9.63 q 32.5 12.0 15.96 12.04 Γ 39.0 12.0 13.55 14.45 s 52.0 12.0 8.73 19.27 t 65.0 12.0 3.92 24.08 •57- (54) (54)1378941 表5.實施例6-3所得之HA-HZ-PLA收量、PLA導入量、 P L A重量比。 樣品 收量（mg) PLA導入率（％) PLA重量比（％w/w) k 40.2 0.9 13.5 1 25.2 1.1 17.2 m 44.1 1.7 23.4 η 48.0 2.7 33.2 0 52.2 3.9 41.2 Ρ 55.4 4.9 47.2 q 58.7 5.5 49.9 r 62.1 6.6 54.5 s 57.7 9.7 63.7 t 75.3 12.8 69.9 (實施例6-4)對HA-HZ-PLA的水及DMSO之分散性或 溶解性 秤取各5mg的與實施例4-1相同方法所得之HA-HZ 、實施例6-2、及實施例6-3所合成的HA-HZ-PLA之白色 粉未，添加蒸餾水至5mg/mL，室溫下攪拌一晚。停止攪 拌後靜置於室溫下3天以目視觀察並確認其結果如表6所 示。該結果爲HA-HZ-PLA中PLA的重量比爲5_7〜19.6 % w/w之範圍下對水較能均勻分散，但對於此以上的PL A 重量比則顯示較難分散於水中。且對於未見到沈澱物者， -58- (55) 1378941 各溶液進行離心（1500g’ 1〇分鐘）後除去HA-HZ水溶 液，看到全白之沈澱物。其結果得知HA-HZ-PLA於實施 例6-2及6-3之實施範圍（PLA的重量比爲5.7〜73.4% w/w )下較難溶解於水中，既使分散該分散安定性亦低。

其次’秤取各5mg的與實施例4_丨相同方法所得之 HA-HZ'實施例6-2、及實施例6-3所合成的HA-HZ-PLA 之白色粉末’添加DMSO至5mg/mL，室溫下攪拌一晚。 此時以目視觀察並確認其結果如表6所示。該結果爲HA_ HZ-PLA中PLA的重量比至少爲5 7〜73 4 %w/w之範圍 下對DMSO具有溶解性。

-59 - (56)1378941 表6.實施例6-2及6-3所得之HA-HZ-PLA的溶液或分散 液外觀 衞口 RA講匕 (?ίλνΑν) 锻、纖 7j^^(5n#nL) 夕讎已後

ΗΑ-ΉΖ 0.0 a 5.7 b m c m d 30.0 e 4Z5 f 44.6 g 50.4 h 553 i 619 j 73.4 k 135 1 172 m 23.4 n 332 0 412 P 472 q 49.9 r 545 s 63.7 t 6.9.9

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-60- (57) (57)1378941 (貫施例6-5)藉由溶劑取代ha-hZ-PLA之對水的可溶 化 坪取各5mg的與實施例4-1相同方法所得之HA-HZ 、實施例6-2、及實施例6-3所合成的ha-HZ-PLA之白色 粉末’溶解於DMSO至5mg/mL。〇.6mL的該DMSO溶液 與2.4mL的蒸餾水混合，且對蒸餾水進行透析（MWCO: 1 2000〜1 4000 ’室溫’ 3天）所得之水溶液皆爲無色透明 溶液。該水溶液進行離心（4 0 〇 〇 g，I 〇分鐘）後未看到沈 源物。其結果得知HA-HZ-PLA中PLA的重量比爲5.7〜 7 3.4%w/w範圍下’一旦溶解於DMSO中，其後溶劑由 水取代後可溶解於水中。 〔賓施例7〕欲討論以透明質酸被覆的PLA ( PLGA )微 粒子調製法時之PLA被導入的透明質酸改性物之合成 〔實施例7-1〕殘留感應HA功能之HA_HZ合成 將1012.7mg的HA (電化學工業股份有限公司：黏度 平均分子量23k道爾頓），溶解於蒸餾水/EtOH= 50/50 至濃度爲0.1%。使其爲HA的單位：EDC: ADH=1: 0.1 :40之莫耳比，以5N鹽酸使pH保持於4.7〜4.8下室溫 中反應2小時。以對過剩量的100mM鹽酸鈉溶液、25% 乙醇溶液、蒸餾水的順序進行透析（MWCO : 1 2000〜

1 4 000 )。冷凍乾燥約1 OmL使用於HZ基導入率測定上。 HZ基導入率作爲ADH導入率以質子NMR法（測定溶劑 :D20 )進行定量，對於HA單位（雙糖）爲9.0% ( HA -61 - (58) (58)1378941 :N-乙醯基的甲基質子，1 .85ppm，HZ :來自 ADH的4 個伸甲基質子，1.5、2.1及2.25ppm)。 (實施例7-2 )殘留感應HA功能之HA-HZ的TBA氯化 實施例7-1所調製之HA-HZ水溶液（約〇·1 %濃度） 中添加50mL的陽離子交換樹脂（Dowex 50WX8 -400 ’ 2.1 meq/g )作爲Η型，室溫下放置一晚。回收澄淸液’以 0.22 g m過濾器進行過濾後添加1 150 " L的40wt% ΤΒΑ-OH水溶液，調整成pH爲7.0，冷凍乾燥所得之水溶液得 到TBA氯化HA-HZ之白色粉末。收量爲1113.6mg。 (實施例7-3 ) PLA ( 5k道爾頓）被導入之殘留感應HA 功能的透明質酸（HA-HZ-PLA)之合成 使用實施例7-2所調製之TBA氯化HA-HZ，實施例 6-2的TBA氯化HA-HZ溶液與無水DMSO、活性酯化 P L A溶液的混合比變更爲如表7所示，其他與實施例6 - 2 相同方法得到HA-HZ-PLA的白色粉末。HA-HZ-PLA中的 PLA導入率以NMR法（測定溶劑：DMSO-d6 )進行定量 時’假定PL· A的分子量分佈爲未經更改的原料與被導入 者之情況下’對HA單位（雙糖）爲8.0%。又，HA-HZ-PLA分子中的PLA重量比爲36.7w/w(HA: N -乙醯基之 甲基質子，1 .85ppm，PLA :羰基的α位之甲川質子（惟 ’ ΟΗ 末端除外），5.0 〜5.6ppm)。 -62- (59) (59)1378941 (實施例7-4 ) P LA ( 20k道爾頓）被導入之殘留感應HA 功能的透明質酸（HA-HZ-PLA)之合成 使用實施例7-2所調製之TBA氯化HA-HZ，實施例 6-2 的 PLA-0005 改爲 PLA-0020，TBA 氯化 HA-HZ 溶液 與無水DMSO、活性酯化PLA溶液的混合比變更爲如表7 所示，其他與實施例6-2相同方法得到HA-HZ-PLA的白 色粉末。HA-HZ-PLA中的PLA導入率以NMR法（測定溶 劑；DMSO-d6)進行定量時，假定PLA的分子量分佈爲 未經更改的原料與被導入者之情況下，對HA單位（雙糖 )爲 1 .9 %。又，HA-HZ-PLA分子中的 PLA重量比爲 29‘5w/w(HA:N-乙醯基之甲基質子，1.85ppm，PLA:羰 基的α位之甲基質子（惟，OH末端除外），5.0〜5.6ppm (實施例7-5 )以低導入率將PLA ( 5k道爾頓）導入之隱 藏性透明質酸（HA-HZ-PLA)之合成 使用與實施例6-〗相同方法所調製之TBA氯化HA-HZM，實施例6-2的TBA氯化HA-HZ溶液與無水DMSO ''活性酯化PLA溶液的混合比變更爲如表7所示，其他 與實施例6-2相同方法得到HA-HZ-PLA的白色粉末。 HA-HZ-PLA中的PLA導入率以NMR法（測定溶劑： DMS〇-d6 )進行定量時，假定PLA的分子量分佈爲未經 更改的原料與被導入者之情況下，對HA單位（雙糖）爲 4·5%。又，HA-HZ-PLA分子中的PLA重量比爲21.1w/w -63- (60) (60)1378941 (HA: N-乙醯基之甲基質子，丨·85 PPm，PLA:羰基的α 位之甲川質子（惟’ OH末端除外），5.0〜5 · 6ppm )。 (實施例7-6)以高導入率將PL A ( 5k道爾頓）導入之隱 藏性透明質酸（HA_HZ-PLA)之合成 使用與實施例6-1相同方法所調製之TBA氯化HA-HZM，實施例6-2的TBA氯化HA-HZ溶液與無水DMSO '活性酯化PL A溶液的混合比變更爲如表7所示，其他 與實施例6-2相同方法得到 HA-HZ-PLA的白色粉末。 HA-HZ-PLA中的 PLA導入率以NMR法（測定溶劑： DMSO_d6)進行定量時，假定PLa的分子量分佈爲未經 更改的原料與被導入者之情況下，對HA單位（雙糖）爲 30_9 % 。又，ha-HZ-PLA分子中的 PLA重量比爲 65，1%/你（1_1八：〜乙醯基之甲基質子，1.85??111，？1^:羰 基的α位之甲川質子（惟’ OH末端除外），5.0〜5.6ppm -64 - (61)1378941 表7 · 實施例7-3至7- 6 中 HA- ΗΖ-PLA之合成條件 樣品 ΗΖ (%) PLA 分子量 (k道爾頓） 當量比 (PLA/ HA unit) TBA HA-HZ溶液 (mL) 無水 DMSO (mL) 活化PLA 溶液（mL) 實施例 9.0 5 10.0 80.0 179.5 7.5 7-3 實施例 9.0 20 10.0 80.0 164.2 22.8 7-4 實施例 n c 63.0 5 6.5 100.0 226.4 6.6 ! -J 實施例 63.0 5 130.0 100.0 101.7 131.3 7-6 表 8.; 賣施例7-3至 7-6 的 HA-HZ- P L A之合成結果 樣 α OP 收量（mg) PLA導入率（％) PLA重量比（％w/w) 實 施 331.6 8.0 36.7 例 7-3 實 施 313.1 1.9 29.5 例 7-4 實 施 420.1 4.5 21.1 例 7-5 實 施 750.0 30.9 65.1 例 7-6 -65 - (62) (62)1378941 (實施例7·7 )以高導入率將PLA ( 5k道爾頓）導入之隱 藏性透明質酸（HA-AM-PLA )之合成 將與實施例5-1相同的方法所得之HA-AM之DMSO 溶液對 1L的DMSO進行透析 4次（MWCO: 12000〜 14000，室溫）除去未反應EDA、BOP等雜質。 又，將PLA-0005 C和光純藥工業：黏度平均分子量 5k道爾頓，數平均分子量爲2.83k道爾頓）、EDC、NHS 溶解於無水 DMSO 至 PLA 濃度爲 10mg/mL 、 PL A/EDC/NHS= 1/1/1 (莫耳比），室溫下攪拌20分鐘， 將PLA的末端羧基活性酯化。 添加該活性酯溶液至對HA-AM的胺基而言羧基爲2 倍量，於室溫下攪拌一晚。 該反應液對DMSO進行透析（MWCO: 12000〜14000 ’室溫’ 2天）4次，對於水進行5次，所得之白濁溶液 進行冷凍乾燥。該冷凍乾燥物以過剩的丙酮進行洗淨，其 此再以過剩的乙醇進行洗淨將不溶物經減壓乾燥後得到 356.1mg的HA-AM-PLA之白色粉末。 所得之HA-AM-PLA的DMSO-d6中之質子NMR如圖 23所示。HA-AM-PLA中的PLA導入率以NMR法（測定 溶劑：DMSO-d6)進行定量時，假定PLA的分子量分佈 爲未經更改的原料與被導入者之情況下，對HA單位（雙 糖）爲87.2%。又，HA-AM-PLA分子中的PLA重量比爲 86.1W/W(HA:N-乙醯基之甲基質子，1.85ppm，PLA:羰 基的α位之甲川質子（惟，〇H末端除外），5.0〜5.6ppm -66- (63) 1378941 [實施例8]檢討以透明質酸被覆之pla (PLGA)微粒子 調製法時之HA-HZ-PLA水溶液的調製 (實施例8-1) HA-HZ-PLA水溶液的調製 秤取250mg的於實施例7-3所合成的HA-HZ-PLA， 添加蒸館水至40mg/mL，室溫下攪拌一晚使其溶解，所得 之水溶液呈現薄白色之透明溶液。 (實施例8-2 )藉由DMSO溶劑擴散法之HA_HZ_PLA水 溶液調製-1

秤取250mg的於實施例7-4所合成的HA-HZ-PLA， 添加DMSO至5.0mg/mL使其溶解。混合該加入的DMSO 4倍量的蒸餾水後，對於蒸餾水進行透析（M W C 0 : 1 0 0 0 0 ，室溫，1天）。所得之水溶液呈現透明溶液。該水溶液 以 5 _ 0 # m的過濾器進行過濾後以極限過濾（V i ν a sp i η 2 0 MWCO: 10000，Vivascience)進行濃縮。由冷凍乾燥所 得之濃縮溶液200 /z L後，測定其乾燥粉末重量所得之濃 縮定量爲5.7mg/mL，再添加蒸餾水至2.0mg/mL後仔細攪 拌。 (實施例8-3)藉由DMSO溶劑擴散法之HA-HZ-PLA水 溶液的調製-2 秤取150mg的於實施例7-5所合成的HA-HZ-PLA， -67- (64) 1378941 添加DMSO至5 .Omg/mL使其溶解。混合該加入的DMSO 4倍量的蒸餾水後，對於蒸餾水進行透析（MWCO: 10000 ，室溫，3天）。所得之水溶液呈現無色透明溶液。該水 溶液以 5.0 v m的過濾器進行過濾後以極限過濾（ Vivaspin20 MWCO : 10000，Vivascience)進行濃縮。由

冷凍乾燥所得之濃縮溶液2 0 0 v L後，測定其乾燥粉末重 量所得之濃縮定量爲 7.2mg/mL，再添力|]蒸餾水至 2.Omg/mL後仔細攪拌。 (實施例8-4)藉由DMSO溶劑擴散法之HA-HZ-PLA水 溶液的調製-3

秤取150mg的於實施例7-6所合成的HA-HZ-PLA， 添加DMSO至5 .Omg/mL使其溶解。混合該加入的DMSO 4倍量的蒸餾水後，對於蒸餾水進行透析（MWCO : 1 0000 ，室溫，3天）。所得之水溶液呈現無色透明溶液。該水 溶液以 5.0 /Z m的過濾器進行過濾後以極限過濾（ Vivaspin2〇 MWCO : 10000，Vivascience)進行濃縮。由 冷凍乾燥所得之濃縮溶液200 v L後，測定其乾燥粉末重 量所得之濃縮定量爲6.5mg/mL，再添力[|蒸餾水至 2.Omg/mL後仔細攪拌。 (實施例8-5 )藉由DMSO溶劑擴散法之HA-AM-PLA水 溶液的調製 砰取20mg的於實施例7-7所合成的HA-AM. - PLA，添 -68- (65) (65)1378941 加DMSO至5.0mg/mL使其溶解。混合該加入的DMSO 4 倍量的蒸餾水後，對於蒸餾水進行透析（M WCO : 1 0000 ，室溫，3天）。所得之水溶液呈現無色透明溶液。該水 溶液以 5.0 m的過濾器進行過濾後以極限過濾（ Vivaspin20 MWCO : 10000，Vivascience)進行濃縮。.由 冷凍乾燥所得之濃縮溶液200 // L後，測定其乾燥粉末重 量所得之濃縮定量爲 l〇.4mg/mL，再添加蒸餾水至 2.0mg/mL後仔細攪拌。 〔實施例9〕鎖定CD44爲目的之以透明質酸被覆的PLA (PLGA)微粒子之調製 (實施例9-1)藉由DMSO透析法之以透明質酸被覆的 PLA微粒子之調製 秤取 12mg的實施例 7-4所合成之HA-HZ-PLA、 108mg的PLA-0005，溶解於3mL的DMSO。將此對蒸飽 水進行透析（MWCO: 10000’室溫’ 3天），以 32//m 篩子過濾透析液將凝集塊除去後’離心（150〇g，10分鐘 )，除去澄淸液後添加蒸餾水，如此洗淨操作重複3次’ 回收沈澱物（以透明質酸被覆的PLA微粒子）並進行冷 凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲53.2mg。該白色粉末 以過剩的丙酮仔細洗淨後’進行離心（1 0 0 0 0 g ’ 1 0分鐘 )，除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-pLA ) ’其重量 爲 153/ig (微粒子中的 HA-HZ-PLA 比爲 0.29%w/w)。 粒徑的測定以透明質酸被覆的PLA微粒子之白色粉末再 (66) (66)1378941 分散於蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個微 粒子進行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲1·0±0·1 μ m 0 (實施例9-2 )藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PLA微粒子之調製-1 秤取40mg的PLA-0005溶解於lmL的DMSO。於攪 拌器攪拌下滴入·混合於4mL的實施例8-1所調製的HA-HZ-PLA水溶液，所得之混合溶液對蒸餾水進行透析（ MWCO: 10000，室溫，3天），以5_0//m過濾器過濾透 析液將凝集塊除去後，離心（40000g，10分鐘）’除去 澄淸液後添加蒸餾水，如此洗淨操作重複3次，回收沈澱 物（以透明質酸被覆的PLA微粒子）並進行冷凍乾燥。 所得之白色粉末的收量爲140mg。該白色粉末以過剩的丙 酮仔細洗淨後，進行離心（1 0000g，10分鐘），除去澄 淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )，其重量爲60 μ g ( 微粒子中的HA-HZ-PLA比爲0.43%w/w)。對於透析液 進行 DLS測定（Nic〇mp3 70 ),得到粒徑的測定値爲 2 2 5 . 3 n m 〇 (實施例9-3 )藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PLA微粒子之調製-2 砰取40mg的PLA-0005溶解於lmL的DMSO。於攪 拌器攪拌下滴入·混合於4mL的蒸餾水，所得之混合溶 -70- (67) (67)1378941 液對蒸餾水進行透析（MWCO: 10000，室溫，3天），以 5.Oym過濾器過濾透析液將凝集塊除去後，滴入.混合 於4mL的實施例8-1所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪拌 15分鐘後，離心（40000g，10分鐘），除去澄淸液後添 加蒸餾水，如此洗淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明 質酸被覆的PL A微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色 粉末的收量爲23.9mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗 淨後，進行離心（1〇〇〇 〇g，1〇分鐘），除去澄淸液減壓 乾燥不溶物（HA-HZ-PLA)，其重量爲22/zg (微粒子中 的HA-HZ-PLA比爲0.09%w/w)。對於透析液進行DLS 測定（N i c 〇 m p 3 7 0 )，得到粒徑的測定値爲3 0 8.9 n m。 (實施例9-4)藉由DM SO溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PLA微粒子之調製_3 秤取4mg的實施例7-4中所合成的HA-HZ-pLA、 36mg的PLA-0005溶解於lmL的DMSO。於攪拌器攪拌 下滴入•混合於4 m L的蒸餾水’所得之混合溶液對蒸餾 水進行透析（MWCO: 10000’室溫’ 3天）’以5.〇Mm 過濾器過濾透析液將凝集塊除去後’離心（4〇〇〇〇g ’ 10 分鐘），除去澄淸液後添加蒸餾水’如此洗淨操作重複3 次，回收沈澱物（以透明質酸被覆的PLA微粒子）並進 行冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲3 _7mg。該白色粉 末以過剩的丙酮仔細洗淨後，進行離心（〗〇〇〇〇g，】〇分 鐘），除去澄淸液減壓乾燥不溶物（ha-hz_pla)，其重 -71 - (68) (68)1378941 量爲7〇M g (微粒子中的HA-HZ-PLA比爲〗·89% W/W)。 對於透析液進行D L S測定（N i c o m p 3 7 Ο ) ’得到粒徑的測 定値爲288.2nm。 (實施例9-5 )藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PLA微粒子之調製-4 秤取40mg的PLA-0005溶解於lmL的DMSO。於攪 拌器攪拌下滴入.混合於4 m L的實施例8 - 2所調製的Η A -HZ-PLA水溶液，所得之混合溶液對蒸餾水進行透析（ MWCO: 10000，室溫，3天），以5.〇em過濾器過濾透 析液將凝集塊除去後，離心（40000g，10分鐘）’除去 澄淸液後添加蒸餾水，如此洗淨操作重複3次’回收沈澱 物（以透明質酸被覆的PLA微粒子）並進行冷凍乾燥。 所得之白色粉末的收量爲16.7mg。該白色粉末以過剩的 丙酮仔細洗淨後，進行離心（l〇〇〇〇g，1〇分鐘）’除去 澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )，其重量爲1 β g (微粒子中的HA-HZ-PLA比爲 0.01%w/w)。對於透析 液進行D L S測定（N i c 〇 m p 3 7 0 )，得到粒徑的測定値爲 2 2 0.2 n m 〇 (實施例9-6 )藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PL/A微粒子之調製-5 秤取40mg的PLA-0005溶解於lmL的DMSO。於攪 拌器攪拌下滴入·混合於4mL的蒸餾水，所得之混合溶 -72- (69) (69)1378941 液對蒸餾水進行透析（MWCO: 10000，室溫，3天），以 5.0^m過濾器過濾透析液將凝集塊除去後，滴入•混合 於4mL實施例8-2所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪拌15 分鐘後，離心（4〇〇〇 〇g，10分鐘），除去澄淸液後添加 蒸餾水，如此洗淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明質 酸被覆的PLA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉 末的收量爲26.3 mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨 後，進行離心（l〇〇〇〇g，1〇分鐘），除去澄淸液減壓乾 燥不溶物（HA-HZ-PLA)，其重量爲7/zg (微粒子中的 HA-HZ-PLA比爲0.03% w/w)。對於透析液進行DLS測 定（N i c 〇 m p 3 7 0 )，得到粒徑的測定値爲1 9 6.9 n m。 (實施例9 - 7 )藉由丙酮溶劑擴散法之以透明質酸被覆的 PLA微粒子之調製_1 秤取40mg的PLA-0005溶解於lmL的丙酮。於攪拌 器攪拌下滴入.混合於4mL實施例8-1所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪拌1 5分鐘後，所得之混合溶液進行蒸發 將丙酮去除。以5.0^m過濾器過濾透析液將凝集塊除去 後，離心（40GO0g，10分鐘），除去澄淸液後添加蒸餾 水，如此洗淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明質酸被 覆的PLA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的 收量爲14.5ing。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨後， 進行離心（10G00g，10分鐘），除去澄淸液減壓乾燥不 溶物（HA-HZ-PLA )，其重量爲104 /ig (微粒子中的 -73- (70) (70)1378941 HA-HZ-PLA比爲0.72% w/w )。對於經蒸發後的溶液進行 D L S測定（N i c 〇 m p 3 7 0 )，得到粒徑的測定値爲 3 6 7 · 8 n m (.實施例9-8 )藉由丙酮溶劑擴散法之以透明質酸被覆的 PLA微粒子之調製-2 秤取40mg的PLA-0005溶解於lmL的丙酮。於攪拌 器攪拌下滴入•混合於4 mL的蒸餾水’攪拌15分鐘後’ 所得之混合溶液進行蒸發去除丙酮。以5.0/xm過濾器過 濾透析液將凝集塊除去後，滴入•混合於4mL實施例8-1 所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪拌15分鐘後，離心（ 4 0 0 0 0 g，1 0分鐘），除去澄淸液後添加蒸餾水，如此洗 淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明質酸被覆的PLA 微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲 2 0 . 1 m g。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨後，進行離心 ( 10000g，10分鐘），除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )，其重量爲99#g (微粒子中的HA-HZ-PLA比 爲0.49% w/w )。對於經蒸發後的溶液進行DLS測定（ Nicomp3 7 0 )，得到粒徑的測定値爲3 3 6.9nm。 (實施例9 - 9 )藉由丙酮溶劑擴散法之以透明質酸被覆的 PLA微粒子之調製-3 秤取40mg的PLA-0 005溶解於lmL的丙酮。於攪拌 器攪拌下滴入•混合於4mL實施例8-2所調製的HA-HZ· -74- (71) (71)1378941 PLA水溶液，攪拌15分鐘後，所得之混合溶液進行蒸發 去除丙酮。以5.0/im過濾器過濾透析液將凝集塊除去。 離心（40000g，10分鐘），除去澄淸液後添加蒸餾水， 如此洗淨操作重複3次，回收沈源物（以透明質酸被覆的 PL A微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲 2 0.9 1 mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨後，進行離 心（1 00 00g，10分鐘），除去澄淸液減壓乾燥不溶物（ HA-HZ-PLA )，其重量爲 18" g (微粒子中的 HA-HZ-PLA比爲0.09% w/w)。對於經蒸發後的溶液進行DLS測 定（Nic〇inp3 70 )，得到粒徑的測定値爲3 2 8 . 3 n m。 (實施例9- 1 0 )藉由丙酮溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PLA微粒子之調製-4 秤取40mg的PLA-0005溶解於lmL的丙酮。於攪拌 器攪拌下滴入•混合於4mL的蒸餾水，攪拌15分鐘後， 所得之混合溶液進行蒸發去除丙酮。以5.0 # m過濾器過 濾透析液將凝集塊除去後，滴入•混合於4mL實施例8-2 所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪拌15分鐘後，離心（ 40000g，10分鐘），除去澄淸液後添加蒸餾水，如此洗 淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明質酸被覆的PLA 微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲 2 2.9mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨後，進行離心 ( 10000g，10分鐘），除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )，其重量爲27yg (微粒子中的HA-HZ-PLA比 -75- (72) (72)1378941 爲〇 . 1 2 % w/w )。對於經蒸發後的溶液進行D L S測定（ N i c o m p 3 7 Ο )，得到粒徑的測定値爲3 2 8 . 1 n m。 (實施例9 -1 1 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製-1 秤取80mg的PLGA-7520 (和光純藥工業：黏度平均 分子量20k道爾頓，Lactide比爲75%mol/mol)溶解於 2mL的二氯甲烷。將此與實施例8-1所調製的HA-HZ-PLA水溶液 8mL混合，使用迴轉式均質機（POLYTRON PT3100)進行乳化（lOOOOrpm，5分鐘）。該乳濁液於開 放系統下以攪拌機攪拌一晚，除去二氯甲烷。以32 μ m 篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（1 500g，10分鐘）除 去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操作重複進行3次，回 收沈澱物（以透明質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍 乾燥。所得的白色粉末的收量爲62.1 mg。該白色粉末以 過剩丙酮仔細洗淨後，進行離心（l〇〇〇〇g，1〇分鐘）’ 除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ_PLA )後，其重量爲 675yg (微粒子中的 HA-HZ-PLA 比爲 1.09% w/w )。粒 徑的測定係將以透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末 再分散於蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個 微粒子進行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲2·7± 1 . 1 " m。 (實施例9 · 1 2 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 -76- (73) (73)1378941 的PLGA微粒子之調製-2 秤取80mg的PLGA-7520溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的】％ w/v PVA水溶液混合，使用迴轉式均質 機(POLYTRON PT3100 )進行乳化(lOOOOrpm » 5 分鐘 )。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪拌一晚，除去二氯 甲烷。以 3 2 // m篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（ 1 5 OOg，10分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操 作重複進行3次，作爲沈澱物所得之PLGA微粒子與實施 例8-1所調製的HA-HZ-PLA水溶液8mL混合，攪拌約15 分鐘後，再次進行離心（1500g，10分鐘）除去澄淸液， 添加蒸餾水，如此洗淨操作重複進行3次，回收沈澱物（ 以透明質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得 的白色粉末的收量爲61.3mg。該白色粉末以過剩丙酮仔 細洗淨後，進行離心（l〇〇〇〇g ’ 1〇分鐘）’除去澄淸液 減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA)後’其重量爲140/ig( 微粒子中的 HA-HZ-PLA比爲0.23% w/w)。粒徑的測定 係將以透明質酸被覆的pLGA微粒子之白色粉末再分散於 蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個微粒子進 行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲丨·21^0.2^111。 (實施例9-1 3 )藉由乳化液中乾燥法之以透日月質酸被覆 的PLGA微粒子之調製_3 秤取80mg的PLGA-7 5 2 0溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與實施例8 - 2所調製的H A _ H Z _ P L A水溶液8 m L混合 -77- (74) 1378941 ’使用迴轉式均質機（POLYTRON PT3100)進行 1 0000rpm，5分鐘）。該乳濁液於開放系統下以攪 拌一晚’除去二氯甲烷。以32#m篩子過濾除去 後’進行離心（】 5 00g，10分鐘）除去澄淸液，添 水，如此洗淨操作重複進行3次，回收沈澱物（以 酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得的 末的收量爲 55. Omg。該白色粉末以過剩丙酮仔細 ，進行離心（lOOOOg，1〇分鐘），除去澄淸液減 不溶物（HA-HZ-PLA)後，其重量爲251;/g (微 的HA-HZ-PLA比爲 0.46%w/w)。粒徑的測定係 明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散於蒸 ，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個微粒子進行 析，求得其平均値及標準偏差爲3.0±1.2/z m。 (實施例9-1 4 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質 的PLGA微粒子之調製-4 秤取80mg的PLGA-7520溶解於2mL的二氯 將此與8mL的1 % w/v PVA水溶液混合，使用迴轉 機(POLYTRON PT3100)進行乳化（lOOOOrpm， )。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪拌一晚’除 甲烷。以 3 2 // m篩子過濾除去凝集塊後，進行 1 5 0 0 g，1 0分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此 作重複進行3次’作爲沈源物所得之PLGA微粒子 例8 · 2所調製的H A - Η Z - P L G A水溶液8 m L混合， 乳化（ 拌機攪 凝集塊 加蒸餾 透明質 白色粉 洗淨後 壓乾燥 粒子中 將以透 餾水中 影像解 酸被覆 甲烷。 式均質 5分鐘 去二氯 離心（ 洗淨操 與實施 攪拌約 -78- (75) (75)1378941 15分鐘後，再次進行離心（1 5 00g，10分鐘）除去澄淸液 ，添加蒸餾水，如此洗淨操作重複進行3次，回收沈澱物 (以透明質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所 得的白色粉末的收量爲56.3mg。該白色粉末以過剩丙酮 仔細洗淨後，進行離心（1 0 0 0 0 g，1 0分鐘），除去澄淸 液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLGA)後，其重量爲608/zg (微粒子中的HA-HZ-PLGA比爲1.08% w/w )。粒徑的測 定係將以透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散 於蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個微粒子 進行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲1 . 7 ± 0.4 // m 〔比較例2〕PLGA微粒子的調製 (比較例2-1 )藉由乳化液中乾燥法之PLGA微粒子之調 製 秤取80mg的PLGA-7520溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的]% w/v PVA水溶液混合，使用迴轉式均質 機(POLYTRON PT3100)進行乳化(lOOOOrpm > 5 分鐘 )。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪拌一晚，除去二氯 甲烷。以 32 /i m篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（ 1 5 00g，1 0分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操 作重複進行3次，回收沈澱物（PLGA微粒子）並進行冷 凍乾燥。所得的白色粉末的收量爲57.3mg。粒徑的測定 係將以透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散於 -79- (76)1378941 蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個微粒子進 行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲1.7±0.3# m。

-80- (77)1378941 【表9】實施例9爲綜合所調製的微粒子之調製方法、調製條件 '調製結果者 微粒子調製 方法 有機相 HA-HZ-PLA PLA重量比 (w/w%) HA被覆方法 (HA-HZ-PLA 之使 用方法） 微粒子 平均 粒徑 HA-HZ-PLA含量 (%w/w) 實施例9-1 透析法 DMSO 29.5 有機相中溶解ΗA-HZ-PLA、微粒子生 成時，被覆 1.0μ m 0.29 實施例9-2 溶劑擴散法 DMSO 36.7 水相中溶解ΗΑ-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 225.3n m 0.43 實施例9-3 溶劑擴散法 DMSO 36.7 微粒子調製後、添 力卩HA-HZ-PLA水 溶液 308.9n m 0.09 實施例9-4 溶劑擴散法 DMSO 29.5 有機相中溶解HA-HZ-PLA、微粒子生 成時，被覆 288.2nm 1.89 實施例9-5 溶劑擴散法 DMSO 29.5 水相中溶解ΗA-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 220.2 n m 0.01 實施例9-6 溶劑擴散法 DMSO 29.5 微粒子調製後、添 力Π HA-HZ-PLA 水 溶液 196.9nm 0.03 實施例9-7 溶劑擴散法 丙酮 36.7 水相中溶解HA-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 367.8nm 0.72 實施例9-8 溶劑擴散法 丙酮 36·7 微粒子調製後、添 加 HA-HZ-PLA 水 溶液 336.9nm 0.49 實施例9-9 溶劑擴散法 丙酮 29.5 水相中溶解ΗA-HZ-PLA '微粒子生 成時，主動被覆 328.3nm 0.09 實施例9-10 溶劑擴散法 丙酮 29.5 微粒子調製後、添 加 HA-HZ-PLA 水 溶液 328.lnm 0.12 實施例9_11 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 36.7 水相中溶解HA-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 2.7μπι ].09 實施例9_]2 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 36.7 微粒子調製後、添 力□ HA-HZ-PLA 水 溶液 1.2μ m 0.23 實施例9-13 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 29.5 水相中溶解ΗA-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 3.0μ m 0.46 實施例9-14 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 29.5 微粒子調製後、添 加 HA-HZ-PLA 水 溶液 1.7μ m 1.08 -81 - (78) (78)1378941 〔實施例1 0〕以對血中滯留性延長、腫瘤組織、發炎組 織之聚集性爲目的的以透明質酸被覆之PLA奈米粒球的 調製 (實施例10-1)藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被 覆之PLA奈米粒球的調製-1 秤取4mg的實施例7-6所合成之HA-HZ-PLA、36mg 的PLA-0005，溶解於lmL的DMSO。於攪拌器攪拌下滴 入·混合於4mL的蒸餾水，所得之混合溶液對蒸餾水進 行透析（MWCO: 10000，室溫’ 3天）’以5_0jtzm過濾 器過濾透析液將凝集塊除去後，離心（4000Og，10分鐘 )，除去澄淸液後添加蒸餾水，如此洗淨操作重複3次， 回收沈澱物（以透明質酸被覆的PLA微粒子）並進行冷 凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲27.8mg。該白色粉末 以過剩的丙酮仔細洗淨後，進行離心（1 〇〇〇〇g，1 〇分鐘 )，除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )，其重量 爲 2178"g (微粒子中的 HA-HZ-PLA 比爲 7.82% w/w)。 粒徑的測定，對於透析液進行DLS測定（Nic〇raP3 70 )得 到 3 0 4.0 n m 〇 (實施例10-2)藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被 覆之PLA奈米粒球的調製-2 秤取40mg的PLA-0005溶解於lmL的DMSO。於攪 拌器攪拌下滴入·混合於4mL的實施例8-3所調製的HA-HZ-PLA水溶液，所得之混合溶液對蒸餾水進行透析（ -82 - (79) (79)1378941 MWCO: 10000，室溫’ 3天）’以5.0"m過灑器過滤运 析液將凝集塊除去後，離心（4〇〇〇〇g，10分鐘）’除去 澄淸液後添加蒸餾水，如此洗淨操作重複3次，回收沈澱 物（以透明質酸被覆的PLA微粒子）並進行冷凍乾燥。 所得之白色粉末的收量爲240mg。該白色粉末以過剩的丙 酮仔細洗淨後，進行離心（i〇00〇g，分鐘），除去澄 淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ_PLA) ’其重量爲1 25 7 /zg (微粒子中的HA-HZ-PLA比爲5.24% W/W)。粒徑的測 定，對於透析液進行 DLS測定（Nicomp3 70 )得到 1 6 6 · 9 n m 〇 (實施例1 0-3 )藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被 覆之PLA奈米粒球的調製-3 秤取40mg的PLA-0005，溶解於lmL的DMSO。於 攪拌器攪拌下滴入·混合於4mL的蒸餾水’所得之混合 溶液對蒸餾水進行透析（MWCO : 1 0000 ’室溫，3天）， 以5.過濾器過濾透析液將凝集塊除去後，滴入•混 合於4mL的實施例8-3所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪 拌約1 5分鐘，離心（4 0 0 0 0 g，1 0分鐘），除去澄淸液後 添加蒸餾水，如此洗淨操作重複3次，回收沈激物（以透 明質酸被覆的P L A微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白 色粉末的收量爲26.6mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細 洗淨後，進行離心（1 0 0 0 0 g，1 0分鐘），除去澄淸液減 壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA)，其重量爲841//g (微粒 -83- (80) (80)1378941 子中的HA-HZ-PLA比爲3.16%w/w)。粒徑的測定，對 於透析液進行DLS測定（Nicomp3 70 )得到1 98.3nm ° (實施例10-4)藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被 覆之PLA奈米粒球的調製-4 评取40mg的PLA-0005溶解於lmL的DMSO。於攪 拌器攪拌下滴入.混合於4mL的實施例8-4所調製的HA-HZ-PLA水溶液，所得之混合溶液對蒸餾水進行透析（ MWCO: 10000，室溫，3天），以5.0/zm過濾器過濾透 析液將凝集塊除去後，離心（4000〇g’ 10分鐘），除去 澄淸液後添加蒸餾水’如此洗淨操作重複3次’回收沈澱 物（以透明質酸被覆的PLA微粒子）並進行冷凍乾燥。 所得之白色粉末的收量爲3 5.0 m g。該白色粉末以過剩的 丙酮仔細洗淨後’進行離心（1 0 0 0 0 g ’ 1 0分鐘）_’除去 澄淸液減壓乾燥不溶物（HA_HZ-PLA)，其重量爲3581 (微粒子中的HA-HZ-PLA比爲10.23% w/w )。粒徑 的測定，對於透析液進行DLS測定（NicomP3 70 )得到 1 8 3 · 5 nm 〇 (實施例10-5)藉由DMSO溶劑擴散法之以透明質酸被 覆之PLA奈米粒球的調製-5 秤取40mg的PLA-0005，溶解於lmL的DMSO。於 攪拌器攪拌下滴入·混合於4 m L的蒸餾水’所得之混合 溶液對蒸餾水進行透析（MWC0: 10000，室溫，3天）， • 84 - (81) (81)1378941 以5.0//m過濾器過濾透析液將凝集塊除去後，滴入•混 合於4mL的實施例8-4所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪 拌約15分鐘，離心（40000g，10分鐘），除去澄淸液後 添加蒸餾水，如此洗淨操作重複3次，回收沈澱物（以透 明質酸被覆的PLA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白 色粉末的收量爲28.2mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細 洗淨後，進行離心（l〇〇〇〇g，1〇分鐘），除去澄淸液減 壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA) ’其重量爲3 42 #g (微粒 子中的HA-HZ-PLA比爲1.2 1% w/w)。粒徑的測定，對 於透析液進行DLS測定（Nic〇mp3 70 )得到70.4ηηι。 (實施例1 0-6 )藉由丙酮溶劑擴散法之以透明質酸被覆 之P L A奈米粒球的調製-1 秤取10mg的PLA-0005溶解於2mL的丙酮。於攪拌 器攪拌下滴入.混合於2mL實施例8-3所調製的HA-HZ· PLA水溶液，攪拌1 5分鐘後，所得之混合溶液進行蒸發 將丙酮去除。以5.0/zm過濾器過濾透析液將凝集塊除去 後，離心（40000g，10分鐘）’除去澄淸液後添加蒸餾 水，如此洗淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明質酸被 覆的PLA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的 收量爲7.9mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨後，進 行離心（1 〇 〇 〇 G § ’ 1 0分鐘）’除去澄淸液減壓乾燥不溶 物（HA-HZ-PLA)，其重量爲882/zg (微粒子中的HA-HZ-PLA比爲1 ] · 1 5 % w/w )。對於經蒸發後的溶液進行 -85- (82) (82)1378941 DLS測定（Nicomp3 70 )，得到粒徑的測定値爲198.3nm (實施例10-7)藉由丙酮溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PLA奈米粒子之調製-2 秤取10mg的PLA-0005溶解於2mL的丙酮。於攪拌 器攪拌下滴入·混合於2mL的蒸餾水，攪拌1 5分鐘後， 所得之混合溶液進行蒸發去除丙酮。以5.O/zm過濾器過 濾透析液將凝集塊除去後，滴入•混合於2mL實施例8-3 所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪拌15分鐘後，離心（ 40000g，10分鐘），除去澄淸液後添加蒸餾水，如此洗 淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明質酸被覆的PLA 微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲 3 6mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨後，進行離心 (lOOOOg，10分鐘），除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA)，其重量爲137//g (微粒子中的 HA-HZ-PLA 比爲3.83% w/w)。對於經蒸發後的溶液進行DLS測定（ Nicomp3 70 )，得到粒徑的測定値爲I95.6nm。 (實施例1 0-8 )藉由丙酮溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PLA奈米粒子之調製-3 秤取10mg的PLA-0005溶解於2mL的丙酮。於攪拌 器攪拌下滴入·混合於2 m L實施例8 - 4所調製的H A - Η Z -P LA水溶液’攪拌1 5分鐘後，所得之混合溶液進行蒸發 -86- (83) (83)1378941 去除丙酮。以5.O/zm過濾器過濾透析液將凝集塊除去。 離心（40000g，10分鐘），除去澄淸液後添加蒸餾水， 如此洗淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明質酸被覆的 PL A微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲 7.2 mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨後，進行離心 ( 10000g，10分鐘），除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA)，其重量爲 1 063以g (微粒子中的 HA-HZ-PLA 比爲14.85%w/w)。對於經蒸發後的溶液進行DLS測定 (Nicomp3 70 )，得到粒徑的測定値爲1 6 3 · 1 n m。 (實施例1 0-9 )藉由丙酮溶劑擴散法之以透明質酸被覆 的PLA奈米粒子之調製-4 秤取10mg的PLA-0005溶解於2mL的丙酮。於攪拌 器攪拌下滴入•混合於2mL的蒸餾水，攪拌1 5分鐘後， 所得之混合溶液進行蒸發去除丙酮。以5.0 μ m過濾器過 濾透析液將凝集塊除去後，滴入·混合於4mL實施例8-4 所調製的HA-HZ-PLA水溶液，攪拌15分鐘後，離心（ 4000 Og，10分鐘），除去澄淸液後添加蒸餾水，如此洗 淨操作重複3次，回收沈澱物（以透明質酸被覆的PLA 微粒子）並進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲 7.9mg。該白色粉末以過剩的丙酮仔細洗淨後，進行離心 (10000g，10分鐘），除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )，其重量爲 398//g (微粒子中的 HA-HZ-PLA 比爲5.04% w/W)。對於經蒸發後的溶液進行DLS測定（ •87- (84) (84)1378941 N i c o m p 3 7 Ο )，得到粒徑的測定値爲1 8 2 · 1 n m。 表1 〇 .實施例1 〇所調製之微粒子調製方法、調製條件及調 製結果 微粒子調製 方法 有機相 HA-HZ-PLA PLA重量比 (w/w%) HA被覆方法 (HA-HZ-PLA 之使 用方法） 微粒子 平均 粒徑 HA-HZ-PLA含量 (%w/w) 實施例]0-1 溶劑擴散法 DMSO 65.1 有機相中溶解HA-HZ-PLA、微粒子生 成時，被覆 304.0μπΐ 7.82 實施例10-2 溶劑擴散法 DMSO 21.1 水相中溶解HA-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 166.9n m 5.24 實施例10-3 溶劑擴散法 DMSO 21.1 微粒子調製後、添 加 HA-HZ-PLA 水 溶液 198.3n m 3.16 實施例10-4 溶劑擴散法 DMSO 65.1 水相中溶解HA-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 183.5 η m 10.23 實施例〗0-5 溶劑擴散法 DMSO 65.1 微粒子調製後、添 力Π HA-HZ-PLA 水 溶液 70.4nm 1.21 實施例10-6 溶劑擴散法 丙酮 21.1 水相中溶解ηα· HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 198.3nm 11.15 實施例】0-7 溶劑擴散法 丙酮 21.1 微粒子調製後、添 力□ HA-HZ-PLA 水 溶液 195.6nm 3.83 實施例]0-8 溶劑擴散法 丙酮 65.1 水相中溶解HA-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 163.lnm 14.85 實施例]0-9 溶劑擴散法 丙酮 65.1 微粒子調製後、添 力□ HA-HZ-PLA 水 溶液 182.Inm 5.04 -88- (85) (85)1378941 〔實施例1 1〕以減低局所刺激爲目的之以透明質酸被覆 的PLGA微粒球之調製 (實施例11-1)藉由透析法的以透明質酸被覆的PLGA微 粒球之調製-1 與實施例1相同順序調製。 (實施例1 1 - 2 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製-1 秤取80mg的PLGA-7 5 2 0溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與實施例8-1所調製的HA-HZ-PLA水溶液8mL混合 ，使用機械式均質機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化（ 4 0 0rpm，15分鐘）。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪 拌一晚，除去二氯甲烷。以300 μιη篩子過濾除去凝集塊 後，進行離心（1 5 0 0g，10分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾 水，如此洗淨操作重複進行3次，回收沈澱物（以透明質 酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得的白色粉 末的收量爲5 2.4 m g。該白色粉末以過剩丙酮仔細洗淨後 ，進行離心（1 〇 〇 〇 〇 g，1 〇分鐘）’除去澄淸液減壓乾燥 不溶物（HA-HZ-PLA)後，其重量爲28// g (微粒子中的 HA-HZ-PLA比爲0.05 % w/w )。粒徑的測定.係將以透明質 酸被覆的PLA微粒子之白色粉末再分散於蒸餾水中’以 光學顯微鏡觀察後隨意選出5 〇個微粒子進行影像解析’ 求得其平均値及標準偏差爲6_8±3_6"m。 -89- (86) (86)1378941 (實施例1 1 -3 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製-2 秤取80mg的PLGA- 7 5 20溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的l%w/v PVA水溶液混合，使用機械式均質 機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化（400rpm，15 分鐘） 。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪拌一晚，除去二氯甲 烷。以 3 00 β m篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（ 1 5 00g，10分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操 作重複進行3次，作爲沈澱物所得之PLGA微粒子與實施 例8-1所調製的HA-HZ-PLA水溶液8mL混合，攪拌約15 分鐘後，再次進行離心（1 5 00 g，10分鐘）除去澄淸液， 添加蒸餾水，如此洗淨操作重複進行3次，回收沈澱物（ 以透明質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得 的白色粉末的收量爲58.8mg。該白色粉末以過剩丙酮仔 細洗淨後，進行離心（l〇〇〇〇g，10分鐘），除去澄淸液 減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )後，其重量爲188 // g ( 微粒子中的HA-HZ-PLA比爲0.32%w/w)。粒徑的測定 係將以透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散於 蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個微粒子進 行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲7.4±2.7以m。 (實施例1 1 -4 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製-3 秤取80mg的PLGA-7520溶解於2mL的二氯甲烷。 -90- (87) (87)1378941 將此與實施例8-2所調製的hA-HZ-PLA水溶液8mL混合 ，機械式均質機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化（ 4 0 0rpm，15分鐘）。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪 拌一晚，除去二氯甲烷。以3 00 //m篩子過濾除去凝集塊 後，進行離心（1 5 00g，10分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾 水，如此洗淨操作重複進行3次，回收沈澱物（以透明質 酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得的白色粉 末的收量爲55.4mg。該白色粉末以過剩丙酮仔細洗淨後 ’進行離心（l〇〇〇〇g ’10分鐘），除去澄淸液減壓乾燥 不溶物（HA-HZ-PLA)後，其重量爲83/zg (微粒子中的 HA-HZ-PLA比爲0.15% w/w)。粒徑的測定係將以透明質 酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散於蒸餾水中，以 光學顯微鏡觀察後隨意選出5 0個微粒子進行影像解析， 求得其平均値及標準偏差爲6.8 ±3.3/αηι。 (實施例1 1 -5 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製-4 秤取80mg的PLGA-7520溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的l%w/v PVA水溶液混合，使用機械式均質 機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化（400rpm，15 分鐘） 。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪拌一晚，除去二氯甲 烷。以 3 00 # m篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（ 1 5 0 0 g，1 0分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操 作重複進行3次，作爲沈澱物所得之PLGA微粒子與實施 -91 - (88) (88)1378941 例8-2所調製的HA-HZ-PLGA水溶液8mL混合，攪拌約 1 5分鐘後，再次進行離心（1 5 OOg，1 0分鐘）除去澄淸液 ，添加蒸餾水，如此洗淨操作重複進行3次’回收沈澱物 (以透明質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所 得的白色粉末的收量爲60.8mg。該白色粉末以過剩丙酮 仔細洗淨後，進行離心（1〇〇 〇〇g ’ 1〇分鐘）’除去澄淸 液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLGA)後，其重量爲83//g (微粒子中的HA-HZ-PLGA比爲0.14%w/w)。粒徑的測 定係將以透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散 於蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個微粒子 進行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲7.8±5.4Vm (實施例11-6)藉由透析法的以透明質酸被覆的PLGA微 粒球之調製-1 秤取12mg的實施例7-6所合成的HA-HZ-PLA、 108mg的PLA-0005，溶解於3mL的DMSO。對於蒸餾水 進行透析（M W C 0 : 1 0 0 0 0，室溫’ 3天）、透析液體以 32 μ m篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（1500g，10分 鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操作重複進行3 次，回收沈澱物（以透明質酸被覆的PLA微粒子）並進 行冷凍乾燥。所得的白色粉末的收量爲9K7mg。該白色 粉末以過剩丙酮仔細洗淨後，進行離心（1 〇〇〇0g 0分 鐘），除去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA_HZ-pLA )後，其 -92- (89) 1378941 重量爲2560；c/g (微粒子中的HA-HZ-PLA比爲2_79%w/w )。粒徑的測定係將以透明質酸被覆的PLA微粒子之白 色粉末再分散於蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出 5 0個微粒子進行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲 1 · 6 ± 0.4 /z m。

(實施例1 1 · 7 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製·5

秤取80mg的PLGA-7520溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的實施例8-3所調製之HA-HZ-PLA水溶液混 合，使用機械式均質機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化 (40 0rpm，1 5分鐘）。該乳濁液於開放系統下以攪拌機 攪拌一晚，除去二氯甲烷。以3 00 // m篩子過濾除去凝集 塊後，進行離心（1 500g，10分鐘）除去澄淸液’添加蒸 餾水，如此洗淨操作重複進行3次’回收沈澱物（以透明 質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得的白色 粉末的收量爲580mg »該白色粉末以過剩丙酮仔細洗淨後 ，進行離心（l〇〇〇〇g，1〇分鐘）’除去澄淸液減壓乾燥 不溶物（HA-HZ-PLA)後，其重量爲261// g (微粒子中 的HA-HZ-PLA比爲0.45% w/w)。粒徑的測定係將以透 明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散於蒸餾水中 ，以光學顯微鏡觀察後隨意選出5 0個微粒子進行影像解 析，求得其平均値及標準偏差爲6.1 ±6.2// m。 -93- (90) (90)1378941 (實施例11-8)藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製·6 秤取80mg的PLGA-7 5 20溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的l%w/v PVA水溶液混合，使用機械式均質 機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化（400rpm，15 分鐘） 。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪拌一晚，除去二氯甲 烷。以 300 " m篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（ 1 5 00g，10分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操 作重複進行3次，作爲沈澱物所得之PLGA微粒子與8mL 的實施例8-3中所調製的HA-HZ-PLA水溶液進行混合， 攪拌約15分鐘後，再次離心（1 5 00g，10分鐘），除去 澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操作重複進行3次，回收 沈澱物（以透明質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾 燥。所得的白色粉末的收量爲58.6m g。該白色粉末以過 剩丙酮仔細洗淨後，進行離心（1 〇〇〇 〇g，1 〇分鐘），除 去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )後，其重量爲 158/zg (微粒子中的 HA-HZ-PLA 比爲 0.27% w/w )。粒 徑的測定係將以透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末 再分散於蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個 微粒子進行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲7.7± 5 ·Ί μ m ° (實施例Π -9 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製-7 -94* (91) (91)1378941 秤取80mg的PLGA-75 2 0溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的實施例8-4所調製之HA-HZ-PLA水溶液混 合，使用機械式均質機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化 (4〇Orpm ’ 1 5分鐘）。該乳濁液於開放系統下以攪拌機 攪拌一晚，除去二氯甲烷。以300/zm篩子過濾除去凝集 塊後’進行離心（1 5 00g，1 0分鐘）除去澄淸液，添加蒸 餾水，如此洗淨操作重複進行3次，回收沈澱物（以透明 質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾燥。所得的白色 粉末的收量爲57.5mg。該白色粉末以過剩丙酮仔細洗淨 後，進行離心（lOOOOg，10分鐘），除去澄淸液減壓乾 燥不溶物（HA-HZ-PLA )後，其重量爲3 06 8 /zg(微粒子 中的 HA_HZ-PLA比爲5.34%w/W)。粒徑的測定係將以 透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散於蒸餾水 中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出5 0個微粒子進行影像 解析，求得其平均値及標準偏差爲6.9±3_5 μ m。 (實施例1 1 -1 〇 )藉由乳化液中乾燥法之以透明質酸被覆 的PLGA微粒子之調製-8 秤取80mg的PLGA-7520溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的1 % w/v PVA水溶液混合，使用機械式均質 機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化（4 0 0 r p m，1 5 分鐘） 。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪拌一晚，除去二氯甲 烷。以 3 00 // m篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（ I 5 0 0 g，1 0分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操 -95- (92) (92)1378941 作重複進行3次，作爲沈澱物所得之PLGA微粒子與8mL 的實施例8-4中所調製的HA-HZ-PLA水溶液進行混合， 攪拌約1 5分鐘後，再次離心（1 5 0 Og，1 0分鐘）’除去 澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操作重複進行3次，回收 沈澱物（以透明質酸被覆的PLGA微粒子）並進行冷凍乾 燥。所得的白色粉末的收量爲65.0mg。該白色粉末以過 剩丙酮仔細洗淨後，進行離心（l〇〇〇〇g，10分鐘）’除 去澄淸液減壓乾燥不溶物（HA-HZ-PLA )後，其重量爲 390/zg (微粒子中的 HA-HZ-PLA 比爲 0.60%w/w)。粒 徑的測定係將以透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末 再分散於蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個 微粒子進行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲5.6 ± 2.3 // m 〇 〔比較例3〕PLGA微粒球的調製 (比較例3 - 1 )藉由乳化液中乾燥法之PLGA微粒球之調 製 秤取80nig的PLGA-7520溶解於2mL的二氯甲烷。 將此與8mL的1 % w/v PVA水溶液混合，使用機械式均質 機（EYEL4，MAZERA Z )進行乳化（ 400rpm，15 分鐘） 。該乳濁液於開放系統下以攪拌機攪拌一晚，除去二氯甲 烷。以3 00 /z m篩子過濾除去凝集塊後，進行離心（ 1 5 00g，10分鐘）除去澄淸液，添加蒸餾水，如此洗淨操 作重複進行3次，回收沈澱物（PLGA微粒子）並進行冷 -96- (93) (93)1378941 凍乾燥。所得的白色粉末的收量爲53.9mg。粒徑的測定 係將以透明質酸被覆的PLGA微粒子之白色粉末再分散於 蒸餾水中，以光學顯微鏡觀察後隨意選出50個微粒子進 行影像解析，求得其平均値及標準偏差爲5.3 ±2.5 v m。

-97- (94) (94)1378941 【表11】實施例1 1爲綜合所調製的微粒子之調製方法、 調製條件、調製結果者 微粒子調製 方法 有機相 HA-HZ-PLA PLA重量比 (w/w%) HA被覆方法 (HA-HZ-PLA 之使 用方法） 微粒子 平均 粒徑 ΗΑ-ΗΖ-PLA含量 (%w/w) 實施例1M 透析法 DMSO 29.5 有機相中溶解HA-HZ-PLA '微粒子生 成時，被覆 1.0μ m 0.29 實施例11-2 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 36.7 水相中溶解ΗΑ-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 6.8 μ m 0.05 實施例11-3 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 36,7 微粒子調製後、添 力□ HA-HZ-PLA 水 溶液 7.4μ m 0.32 實施例11-4 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 29.5 水相中溶解ΗΑ-HZ-PLA '微粒子生 成時，主動被覆 6.8μ πι 0.15 實施例〗1-5 乳化液中 乾燥法 二氯甲院 29.5 微粒子調製後、添 加 HA-HZ-PLA 水 溶液 7.8μ m 0.14 實施例11-6 透析法 二氯甲烷 65·】 有機相中溶解ΗΑ-HZ-PLA、微粒子生 成時，被覆 1.6μ m 2.79 實施例1】·7 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 21.1 水相中溶解ΗΑ-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 ό.ίμηι 0.45 實施例 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 21.1 微粒子調製後、添 力□ HA-HZ-PLA 水 溶液 7.7μτη 0.27 實施例11-9 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 65.1 水相中溶解HA-HZ-PLA、微粒子生 成時，主動被覆 6.9μ m 5.34 實施例]1-10 乳化液中 乾燥法 二氯甲烷 65.1 微粒子調製後、添 加 HA-HZ-PLA 水 溶液 5.6μ m 0.60 -98- (95) (95)1378941 〔實施例12〕封入太平洋紫衫醇（paclitaxel，PTX)於 以透明質酸被覆PLA奈米粒球 (實施例12-1)藉由丙酮溶劑擴散法之調製-1 秤取10mg的太平洋紫衫醇（以下亦稱爲PTX)( Natural Pharmaceuticals, Inc. Lot No. 1 50206602- 1 )溶解 於2mL的丙酮。秤取9.0mg的PLA-0005添加於PTX的 丙酮溶液中進行溶解。將此於攪拌器的攪拌下滴下.混合 於2mL的與實施例7-6相同方法合成之與實施例8-1的相 同方法所得之HA-HZ-PLA水溶液，攪拌約1 5分鐘後，所 得之混合溶液經由蒸發使丙酮除去。其後以脫鹽柱（PD-1〇)進行純化，進行離心（40000g，1〇分鐘），回收沈 澱物（封入PTX的以透明質酸被覆之PLA微粒子）進行 冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲8 . 3 m g。粒徑的測定 ，對於經蒸發後的溶液進行DLS測定（Nicomp3 70 )，得 到粒徑的測定値爲9 9 · 0 ± 4 1 · 3 n m。秤取6.8 m g的所得之白 色粉末’以過剩的丙酮進行洗淨後，進行離心（1 〇 〇 〇 〇 g， 1 〇分鐘）除去澄淸液再進行減壓乾燥，得到重量爲1 . 3 m g (微粒子中的HA-HZ-PLA比爲19.1%w/w)。 PTX的定量爲使用逆相層析法（RP_hPLC)之內標準 物質（IS)法進行。IS溶液爲以約〇.7m g/mL的正己基對 羥基苯甲酸鹽之乙腈溶液所調製者。製成校正曲線所使用 的標準溶液爲由10m g/mL的PTX乙腈溶液調製出5倍稀 釋列（8列）。又，秤取1 · 5 m g的封入ρ τ X的以透明質酸 被覆之PLA微粒子白色粉末，添加的乙腈後仔細攪 -99- (96) (96)1378941 拌後，離心（l〇00〇g，10分鐘）’澄淸液作爲PTX濃度 定量用溶液。對於標準溶液及ΡΤΧ濃度定量用溶液400 // L而言，混合25 // L的IS溶液’進行RP-HPLC測定後得 到奈米粒球中的PTX含量爲9.9% w/w。RP-HPLC的測定 條件如下。 RP-HPLC 條件 柱：Cadenza— C— 18C ( Imtakt ) 流速：〇.75mL/分鐘 溶離液： A: MeCN、B:超純水（MilliQ 水） A : B = 50: 50 ( 0 — 10 分鐘，等位（isocratic)) 5 0 : 5 0 — 0 : 1 00 ( 1 〇 — 1 2 分鐘，線性（linear gradient )) 0: 100(12— 19 分鐘，等位） 0 : ] 00— 50 : 5 0 ( 1 9 — 2 0 分鐘，線性） 5 0 : 5 0 ( 20 — 2 5分鐘，等位）合計2 5分鐘 檢測器：UV ( 23 0nm ) 柱子溫度：4(TC 樣品溫度：4 °C 樣品注入量：I 〇 Μ 1 (實施例12-2)藉由丙酮溶劑擴散法之調製·2 -100- (97) (97)1378941 秤取10mg的PTX溶解於2mL的丙酮。秤取9.0mg 的PLA-0005添加於PTX的丙酮溶液中進行溶解。將此於 攪拌器的攪拌下滴下•混合於2mL的蒸餾水，攪拌約15 分鐘後，所得之混合溶液經由蒸發使丙酮除去。其後，滴 下·混合於2m L的與實施例7-6相同方法合成之與實施 例8-4相同方法所得之HA-HZ-PLA水溶液，攪拌約15分 鐘後，脫鹽柱（PD-10 )進行純化，進行離心（40000g， 10分鐘），回收沈澱物（封入PTX的以透明質酸被覆之 PL A微粒子）進行冷凍乾燥。所得之白色粉末的收量爲 8.4mg。粒徑的測定，對於經蒸發後的溶液進行DLS測定 (Nicomp3 70 )，得到粒徑的測定値爲1 4 2.7 ± 4 4 · 4 n m。秤 取6.9mg的所得之白色粉末，以過剩的丙酮進行洗淨後， 進行離心（100 〇〇g，10分鐘）除去澄淸液再進行減壓乾 燥，得到重量爲 〇.7mg (微粒子中的 HA-HZ-PLA比爲 10.7%w/w) 。PTX的定量與實施例12-1的方法相同得到 奈米粒球中的PTX含量爲9.9% w/w。 產業上可利用性 本發明係提供藉由透明質酸或其衍生物與選自聚乳酸 、聚甘醇酸或乳酸·甘醇酸共聚物之聚合物所鍵結之透明 質酸改性物，有效率地封入低分子藥物後可長期控制其緩 釋時間，且可控制血中滯留性，於水溶液中的分散性良好 ’無安全性問題之藥物載體。又，提供藉由本發明透明質 酸改性物，粒子間的凝集較少且血管注射劑之微粒子所成 -101 - (98) (98)1378941 的活體適用性優良之藥物載體。 【圖式簡單說明】 【圖1】圖1表示本發明的透明質酸改性物所成之微 粒球以SEM攝影後之一照片例子。 【圖2】圖2表示本發明的透明質酸改性物所成之微 粒球以3 D雷射顯微鏡攝影後之一照片例子。 【圖3】圖3表不作爲比較例之PLGA微粒球以SEM 攝影後之一照片例子。 【圖4】圖4表示作爲比較例之PLGA微粒球以3D 雷射顯微鏡攝影後之一照片例子。 【圖5】圖5表示以GPC測定本發明的透明質酸改性 物之其中一結果例子。 【圖6】圖6表示以NMR測定本發明的透明質酸改 性物之其中一結果例子。 【圖7】圖7表示將本發明的透明質酸改性物所成之 奈米粒球的分散溶液（HA ( 25k道爾頓）-PLGA奈米粒球 )經1個月4 °C保存後之一照片例子。 【圖8】圖8表示將本發明的透明質酸改性物所成之 奈米粒球的分散溶液（HA ( 190k道爾頓）-PLGA奈米粒 球）經1個月4 °c保存後之一照片例子。 【圖9】圖9表示PLG A奈米粒球的分散溶液（比較 例）經1個月4 °C保存後之一照片例子。 [圖1 0】圖1 〇表示將本發明的透明質酸改性物所成 -102- (99) (99)1378941 之奈米粒球的分散溶液（HA ( 25k道爾頓）-PLGA奈米粒 球）經1個月4°C保存後之一SEM照片例子。 【圖11】圖11表示將本發明的透明質酸改性物所成 之奈米粒球的分散溶液（HA(190k道爾頓）-PLGA奈米 粒球）經1個月4°C保存後之一 SEM照片例子。 【圖12】圖12表示PLGA奈米粒球的分散溶液（比 較例）經1個月4°C保存後之一 SEM照片例子。 【圖1 3】圖1 3表示本發明的透明質酸改性物所成之 奈米粒球的分散溶液的水溶液中質子NMR光譜之一例子 〇 【圖1 4】圖1 4表示本發明的透明質酸改性物所成之 奈米粒球的分散溶液的水溶液中質子NMR光譜之一例子 〇 【圖1 5】圖1 5表示實施例4-1中所得之HA-HZ的 NMR光譜之一例子》 【圖16】圖16表示實施例4-1中所得之HA-HZ對於 透明質酸酶S D的分解性試驗結果、及未改性Η A於同條 件下以透明質酸酶SD處理時的結果之一例子。 【圖17】圖17表不實施例5-1中所得之HA-AM的 質子NMR光譜之一例子。 【圖1 8】圖1 8表示實施例5 -1〜5 - 3中所得之Η A -AM對於透明質酸酶SD的分解性試驗結果、及未改性HA 於同條件下以透明質酸酶SD處理時的結果之一例子。

【圖19】圖19表示實施例6-2所得之HA-HZ-PLGA -103- (100) 1378941 的GPC層析法之一例子。 【圖20】圖20表示實施例6-2所得之HA-HZ-PLGA 的質子NMR光譜之一例子。 【圖21】圖21表示實施例6-3所得之HA-HZ-PLGA 的GPC層析法之一例子。 【圖22】圖22表示實施例6-3所得之HA-HZ_PLGA 的質子NMR光譜之一例子。 【圖23】圖23表示實施例7-7所得之HA-HZ-PLGA 的質子NMR光譜之一例子。 -104 -

Claims (1)

1378941 公告本 401. - 年月曰修JL本 第093127171專利申請案中文申請專利範圍修正本 民國101年9月4日修正 十、申請專利範圍 1. 一種透明質酸改性物，其爲於透明質酸或其衍生物 的葡糖醛酸部分導入1個以上的聚合物之透明質酸改性物 ，其特徵爲該聚合物選自聚乳酸、聚甘醇酸及乳酸·甘醇 酸共聚物； 前述透明質酸改性物與未被改性的透明質酸相比，對 於透明質酸酶之分解較有耐性； 前述聚合物與透明質酸或其衍生物的羧基介著間隔物 而藉由醯胺鍵結合，形成式（I):

(式中’1、112、113及114各獨立表示選自氫原子、（：1-6 院基及CU6烷基羰基， 尺3及Rb各獨立表示選自氫原子及Ci 6烷基， Q爲選自聚乳酸、聚甘醇酸及乳酸.甘醇酸共聚物的 聚合物’該聚合物爲以末端之羧基與氮原子形成醯胺鍵， A 爲單鍵、-(cH2) m-、-CH2-CH2- ( 〇-CH2-CH2) 1378941 m-或-NHCO- ( CH2) n-CONH-， m爲1〜10的整數、及 η爲0〜10的整數）所示重複結構； 式（I)所示重複結構係含於前述透明質酸改性物的 分子内； 前述透明質酸衍生物爲可將式（Π):

(式中、及R4各獨立爲選自氫原子、<^-6烷 基及Cl-6院基羯基* Ra及Rb各獨立爲選自氫原子及（^.6烷基， A 爲單鍵、-(CH2)m-、-CH2-CH2-(0-CH2-CH2)m-或-NHCO-(CH2)n-CONH-， m爲1〜10的整數、及 η爲0〜10的整數）所示重複結構含於分子内：及 透明質酸或其衍生物的葡糖醛酸部分之羧基係以50 %以上的改性率下改性成如式（I )或（II )所示重複結 構。 2.如申請專利範圍第1項之透明質酸改性物，其中 -2- 1378941 Ra及Rb同時表示氫原子，a表示—（CH2) _ CH2 ~CH2- ( ο - CH2 - CH2 ) m - m - NHCO - ( CH2 ) „ -C〇NH-。 3-如申請專利範圍第1項或第2項之透明質酸改性 % ’其於哺乳動物中具有18小時以上的平均血中滯溜時 間。 4.如申請專利範圍第1項或第2項之透明質酸改性物 ’其爲分子內至少含有1個如式（Π )所示的重複結構者 Rb、

(式中’ Ri、r2、R3、r4、Ra、Rb及A如申請專利範圍 第8項所定義者）。 5·如申請專利範圍第1項或第2項之透明質酸改性物 ’ 明質酸或其衍生物的葡糖醛酸部分之羧基係以 5 8 %〜9 4 %的改性率被改性。 6 ·如1 $請專利範圍第1項或第2項之透明質酸改性物 ’ #41¾明質酸或其衍生物的葡糖醛酸部分之羧基係以 -3- 1378941 58%〜90%的改性率被改性。 7.一種如申請專利範圍第1項或第2項之透明質酸改 性物的製造方法，其特徵爲含有將選自末端具有竣基的聚 乳酸、聚甘醇酸或乳酸•甘醇酸共聚物之聚合物、與分子 內含有至少1個式（Π )所示重複結構之透明質酸衍生物 進行反應的步驟； R\

(式中，Rl、R2、R3、R4、Ra、Rb及A如申請專利範圍 第1項所定義者）。 8.—種透明質酸改性物之作爲醫藥可被接受的鹽，其 φ.爲於透明質酸或其衍生物的葡糖醛酸部分導入1個以上的 聚合物之透明質酸改性物，其特徵爲該聚合物選自聚乳酸 、聚甘醇酸及乳酸·甘醇酸共聚物； 前述透明質酸改性物與未被改性的透明質酸相比’對 於透明質酸酶之分解較有耐性； 前述聚合物與透明質酸或其衍生物的羧基介著間隔物 而藉由醯胺鍵結合，形成式（I): 1378941 R' >°

(式中，Ri、R2、R3及r4各獨立表示選自氫原子、c!-6 院基及Ci-6院基羯基’ Ra及Rb各獨立表示選自氫原子及Cu烷基， Q爲選自聚乳酸、聚甘醇酸及乳酸·甘醇酸共聚物的 聚合物，該聚合物爲以末端之羧基與氮原子形成醯胺鍵， A 爲單鍵、-.(CH2) m-、-CH2-CH2-(0-CH2-CH2) m-或-NHCO- ( CH2) n-CONH-， m爲1〜10的整數、及 η爲0〜10的整數）所示重複結構；

• 式（I )所示重複結構係含於前述透明質酸改性物的 分子内； 前述透明質酸衍生物爲可將式（II): Rb\

1378941 (式中、Ι^、Ι12、Ι13及R4各獨立爲選自氫原子、<^-6烷 基及Ci.6烷基羰基， Ra及Rb各獨立爲選自氫原子及烷基， ’ A 爲單鍵、-(CH2)m-、-CH2-CH2-(〇-CH2-CH2)m-或- NHCO-(CH2)n-CONH-， m爲1〜10的整數、及 η爲0〜10的整數）所示重複結構含於分子内；及 透明質酸或其衍生物的葡糖醛酸部分之羧基係以50 %以上的改性率下改性成如式（I )或（II )所示重複結 構。 9.如申請專利範圍第8項之透明質酸改性物之作爲 醫藥可被接受的鹽，其中Ra及Rb同時表示氫原子，Α表 示-(CH2) m —、—CH2 — CH2— ( 〇 — CH2 — CH2) m —或 -NHCO- ( CH2 ) n-CONH-。 1 〇.如申請專利範圍第8項或第9項之透明質酸改性 物之作爲醫藥可被接受的鹽’其於哺乳動物中具有18小 時以上的平均血中滯溜時間。 1 1 .如申請專利範圍第8項或第9項之透明質酸改性 物之作爲醫藥可被接受的鹽’其爲分子內至少含有1個如 式（II)所示的重複結構者： 1378941

(式中，R!、R2、R3、R4、、Rb及A如申請專利範圍 · 第8項所定義者）。 1 2 .如申請專利範圍第8項或第9項之透明質酸改性 物之作爲醫藥可被接受的鹽，其中透明質酸或其衍生物的 葡糖醛酸部分之羧基係以58%〜94%的改性率被改性。 1 3 .如申請專利範圍第8項或第9項之透明質酸改性 物之作爲醫藥可被接受的鹽，其中透明質酸或其衍生物的 葡糖醛酸部分之羧基係以58%〜90%的改性率被改性》 14.一種如申請專利範圍第8項或第9項之透明質酸 · 改性物之作爲醫藥可被接受的鹽的製造方法，其特徵爲含 有將選自末端具有羧基的聚乳酸、聚甘醇酸或乳酸•甘醇 酸共聚物之聚合物、與分子內含有至少1個式（II)所示 重複結構之透明質酸衍生物進行反應的步驟； 1378941

(式中，Ri、R2、R3、R4、Ra、Rb及 A如申請專利範圍

φ 第8項所定義者）。

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