KR101121403B1 - 히알루론산 수식물, 및 그것을 사용한 약물 담체 - Google Patents

히알루론산 수식물, 및 그것을 사용한 약물 담체 Download PDF

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Abstract

종래의 약물 담체의 문제점을 해소한, 저분자 약물을 효율적으로 봉입하고, 장기적으로 서방기간을 제어할 수 있고, 혈중체류성을 제어할 수 있으며, 수용액 중에서의 분산성이 양호하고, 안전성에 문제가 없는 약물 담체를 제공하는 것. 또한, 입자간 응집이 적은 인젝터블 미립자로 이루어지는 생체 적합성이 우수한 약물 담체를 제공하는 것.
본 발명의 히알루론산 또는 그 유도체와, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물에 의해, 저분자 약물을 효율적으로 봉입하고, 장기적으로 서방기간을 제어할 수 있고, 혈중체류성을 제어할 수 있으며, 수용액 중에서의 분산성이 양호하고, 안전성에 문제가 없는 약물 담체가 제공된다. 또한, 본 발명의 히알루론산 수식물에 의해, 입자간 응집이 적은 인젝터블 미립자로 이루어지는 생체 적합성이 우수한 약물 담체도 제공된다.

Description

히알루론산 수식물, 및 그것을 사용한 약물 담체{HYALURONIC ACID MODIFICATION PRODUCT AND DRUG CARRIER THEREFROM}
본 발명은 신규한 히알루론산 수식물(修飾物), 그것을 사용한 약물 담체에 관한 것이다.
약물의 서방, 타겟팅, 혈중체류성 연장 (스텔스 효과) 등, 약물의 체내 동태 제어를 목적으로 여러가지 고분자의 이용이 검토되고 있다. 이들 중에서, 체내에서 분해되는 생분해성 고분자는 체내에 도입 후에 제거할 필요가 없기 때문에, 많이 사용되고 있다. 실용화된 생분해성 고분자로서 잘 알려진 것으로, 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 락트산?글리콜산 공중합체 (PLGA) 를 비롯한 이들의 공중합체 등이 있다. 이들은 공중합비, 분자량 등으로 분해속도를 제어할 수 있고, 소수성 약물의 담체에 적합한 것인데, 인젝터블 (injectable) 미립자 (마이크로스피어 또는 나노스피어 등) 로 하였을 때에, 소수성이기 때문에 수용액 중에서 응집되기 쉬워, 투여액 중에서의, 또는 투여 후의 체내에서의 분산성에 문제가 있다. 또한, 피하에서 염증, 조직의 흑변화를 일으키는 등, 생체 적합성의 문제도 있다.
변형성 관절증, 만성 관절 류머티즘 등의 관절 질환에 있어서는, 골막염의 발생이 수반되고, 이것이 통증의 원인이 되고 있는 경우가 많다. 이 때문에, 스테로이드나 비스테로이드계 항염증제 등의 약물을 경구, 또는 관절강내에 직접 주입하는 치료방법도 시도되고 있는데, 관절강내의 클리어런스는 신속하고 (비특허문헌 1 및 비특허문헌 2 를 참조), 1 회의 투여로 유효 약효농도를 지속시켜, 염증을 장기간 억제하기는 어렵다. 그래서, 항염증제 등의 약물을 기재에 봉입함으로써 서방하는 시도가 다양하게 보고되어 있다. 예를 들어, 리포솜 (비특허문헌 3 및 비특허문헌 4 를 참조), 알부민 마이크로스피어 (비특허문헌 5 를 참조), 젤라틴/콘드로이틴황산 마이크로스피어 (비특허문헌 6 을 참조), 락트산?글리콜산 공중합체 (PLGA) 마이크로스피어 (비특허문헌 7 을 참조) 에 관한 보고가 이루어져 있다.
그러나, 이러한 기재 그 자체에 기인하는 통증 (Crystal-Induced Pain) 이 야기되는 것도 알려져 있다 (비특허문헌 8 을 참조). 이 통증의 원인은 알 수 없으나, 마이크로스피어의 사이즈, 생체 적합성이 관계하고 있는 것으로 생각된다. 사이즈를 작게 한 PLGA 나노스피어를 사용한 보고도 있는데 (비특허문헌 9 를 참조), 생체 적합성의 문제는 해결되어 있지 않다.
다당류, 콜라겐, 젤라틴 등의 생체 유래 고분자를 사용한 약물 담체도 다수 보고되어 있으나, 친수성 소재이기 때문에 소수성 약물의 담지에는 적합하지 않고, 봉입 효율, 서방 기간의 점에서 PLA, PGA, PCL, PLGA 등에는 못 미친다. 예를 들어, 덱스트란과 PLA 를 결합시킨 화합물을 사용한 나노스피어의 보고도 있는데 (비특허문헌 10 및 비특허문헌 11 을 참조), PLA 는 덱스트란과 에스테르 결합하고 있기 때문에, 체내에서의 결합부의 가수분해는 신속하고 (1 일 정도), 또한 덱스트란 베이스의 소재인 점에서, 약물의 타겟팅, 서방의 목적에는 적합하지 않다.
한편, 히알루론산 (HA) 은 1934년, K. Meyer 에 의해 소의 눈의 유리체로부터 단리된 생체재료 (다당) 로서, 세포 외 매트릭스의 주성분으로서 예로부터 알려져 있다. HA 는 D-글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민이 β(1→3) 글리코시드 결합에 의해 연결된 2 당 단위로 이루어지는 글루코사미드글리칸의 일종이다. HA 는 그 화학적, 물리적 구조에 종 차가 없고, 인간도 대사계를 가지고 있으며, 면역성, 독성의 면에서도 가장 안전한 생체재료 (Biomaterial) 이다. 예를 들어, HA 는 관절액의 주성분의 하나로서, 그 점탄성 효과나 염증 억제 효과에 의해 관절에 있어서 진통 효과를 발휘한다. 실제로, HA 를 주성분으로 한 약물이 변형성 관절증, 만성 관절 류머티즘 등의 관절증 치료약으로서 이미 시판되어 사용되고 있다 (예를 들어, 스베닐 (상품명): 제조판매 중외제약주식회사).
HA 또는 그 유도체로 이루어지는 하이드로겔, 마이크로스피어 등을 약물 서방에 적용한 보고도 다수 있는데 (예를 들어, 비특허문헌 12, 비특허문헌 13, 특허문헌 1, 특허문헌 2, 특허문헌 3 및 특허문헌 4 를 참조), 약물 방출기간은 길어야 수일 이하로서, 아직 실용화 영역에는 이르지 못하고 있다.
HA 와 생분해성 고분자를 조합한 HA 수식물로는, HA 에 PLGA 를 코팅한 필름 (특허문헌 5 를 참조), PLGA 마이크로스피어와 HA 를 혼합한 주사제 (특허문헌 6 을 참조), PLGA 마이크로스피어를 HA 하이드로겔 중에 분산시킨 단백질 서방제제 (특허문헌 7 을 참조), 양이온성 계면활성제를 사용한 폴리카프롤락톤 (PCL) 의 정 전 상호작용에 의한 HA 코트 나노스피어, HA 를 폴리L-리신 측쇄에 결합시킨 HA-PLL (비특허문헌 14 를 참조) 등의 바이오머티리얼, 약물 서방제제도 보고되어 있다.
또한, 다당과, PLA, PGA, PCL, PLGA 등의 생분해성 폴리머를 그래프트 결합시킨 다당 유도체, 및 이 다당 유도체를 사용한 미립자도 보고되어 있고, 이 중에서 다당으로서 HA 를 사용한 예도 개시되어 있는데 (특허문헌 8 을 참조), 구체적으로는 HA 에 PCL 이 에스테르 결합한 것을 합성한 것이 나타나 있을 뿐, 얻어진 HA 유도체의 기능에 관해서는 전혀 나타나 있지 않다.
이상과 같이, 안전성, 생분해성, 체내 안정성 모두가 우수한, HA 와 PLA, PGA 또는 PLGA 를 그래프트 결합한 HA 수식물은 구체적으로는 알려져 있지 않고, 그 조제방법도 알려져 있지 않았다. 또한, 종래의 약물 담체에는, 약물 (특히 저분자 약물) 의 봉입 효율, 그 서방기간, 수용액 중에서의 분산성, 혈중체류성 기간, 또는 안전성 (생체내에서 염증이 일어나는 등) 에 문제가 있었다. 또한, 입자간 응집이 적은 인젝터블 미립자로 이루어지는 생체 적합성이 우수한 약물 담체도 알려져 있지 않았다.
특허문헌 1: 국제공개공보 WO98/43664
특허문헌 2: 국제공개공보 WO00/78356
특허문헌 3: 일본 특허공표공보 평11-513047호
특허문헌 4: 일본 특허공표공보 평2003-525232호
특허문헌 5: 일본 공개특허공보 평8-208706호
특허문헌 6: 국제공개공보 WO01/28591
특허문헌 7: 국제공개공보 WO97/13502
특허문헌 8: 국제공개공보 WO01/88019
비특허문헌 1: Eur. J. Clin. PHArmacol. 42, 301-305(1992)
비특허문헌 2: Clin. PHArmacol. Ther. 39, 313-317(1986)
비특허문헌 3: Biochem. J. 158, 473-476(1976)
비특허문헌 4: J. PHArm. PHArmaco. 45, 576-578(1993)
비특허문헌 5: Int. J. PHArmcol. 39, 129-136(1987)
비특허문헌 6: Arthritis Rhem. 41,21. 85-2195(1998)
비특허문헌 7: Int. J. PHArm. 195, 179-188(2000)
비특허문헌 8: J. Joint Surgery 11, 87-95(1992)
비특허문헌 9: PHArm. Res. 19, 403-410(2002)
비특허문헌 10: J. Biomed. Mater. Res. 50, 557-565(2000)
비특허문헌 11: PHArm. Res. 20, 1284-1292(2003)
비특허문헌 12: Drug Dev. Ind. PHArm. 25(1), 15-20(1999)
비특허문헌 13: Intern. J. PHArm. 87, 21-29(1992)
비특허문헌 14: Bioconj. Chem. 9, 476-481(1998)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
해결하고자 하는 과제는, 종래의 약물 담체의 문제점을 해소한, 저분자 약물을 효율적으로 봉입하여, 장기적으로 서방기간을 제어할 수 있고, 혈중체류성의 제어가 가능하고, 수용액 중에서의 분산성이 양호하고, 안전성에 문제가 없는 약물 담체를 제공하는 것에 있다. 또한, 마찬가지로 종래의 약물 담체의 문제점을 해소한, 입자간 응집이 적은 인젝터블 미립자로 이루어지는 생체 적합성이 우수한 약물 담체를 제공하는 것에도 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자는 이러한 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 진행시킨 결과, 히알루론산 또는 그 유도체와, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물이, 저분자 약물을 효율적으로 봉입하여, 장기적으로 서방기간을 제어할 수 있고, 수용액 중에서의 분산성이 양호하고, 안전성에 문제가 없는 약물 담체가 됨을 발견하고, 또한 이 히알루론산 수식물이 입자간 응집이 적은 인젝터블 미립자를 형성하여, 생체 적합성이 우수한 약물 담체가 됨을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명의 한 측면에 의하면, 히알루론산 또는 그 유도체와, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물이 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에 있어서, 상기 폴리머는 히알루론산 또는 그 유도체의 측쇄로서 그래프트 결합하고 있어도 된다. 또 다른 실시양태에 있어서, 상기 폴리머의 대부분 또는 전부가 그 편(片)말단에서만 히알루론산 또는 그 유도체에 결합하고 있어도 된다. 또한, 본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 상기 폴리머는 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실기에 결합하고 있어도 된다. 또 다른 실시양태에 있어서, 상기 폴리머는 스페이서를 개재하여, 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실기에 아미드 결합으로 결합하고 있어도 된다.
또한, 상기 폴리머는 스페이서를 개재하여, 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실기에 아미드 결합으로 결합하고 있어도 된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 식 (Ⅰ):
Figure 112006011122164-pct00001
(식 중, R1, R2, R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소원자, C1 -6 알킬기 및 C1 -6 알킬카르보닐기에서 선택되고,
Ra 및 Rb 는 각각 독립적으로, 수소원자 및 C1 -6 알킬기에서 선택되고,
Q 는 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 폴리머이고, 이 폴리머는 말단의 카르복실기로 질소원자와 아미드 결합을 형성하고 있고,
A 는 단결합, -(CH2)m-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)m- 또는 -NHCO-(CH2)n-CONH- 이고,
m 은 1～10 의 정수이고, n 은 0～10 의 정수이다)
로 표시되는 반복 구조를 분자내에 적어도 하나 이상 포함하는 히알루론산 수식물이 제공된다. 여기서, C1 -6 알킬기란, 탄소수 1～6 의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 말하며, 구체적으로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, t-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함한다. C1 -6 알킬카르보닐기란, 상기 C1 -6 알킬기를 분자내에 갖는 알킬카르보닐기이며, 구체적으로는 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 발레릴기, 이소발레릴기, 피발로일기 등이 포함된다. 본 발명의 하나의 실시양태에 있어서, Ra 및 Rb 는 모두 수소원자이고, A 는 -(CH2)m-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)m- 또는 -NHCO-(CH2)n-CONH- 이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 스페이서가 독립적으로 치환되어 있어도 되는 2 이상의 아미노기를 가지며, 상기 폴리머의 말단의 카르복실기가 상기 스페이서의 하나의 아미노기와 아미드 결합을 형성하여, 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실기가 상기 스페이서의 별도의 아미노기와 아미드 결합으로 결합하고 있는 히알루론산 수식물이 제공된다. 여기서 아미노기의 치환기로는, 특별히 한정되지 않지만, C1 -6 알킬기, C1 -6 알콕시알킬기, C1 -6 할로알킬기, C3 -8 시클로알킬기 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 히알루론산 유도체가, 식 (Ⅱ):
Figure 112006011122164-pct00002
(식 중, R1, R2, R3, R4, Ra, Rb 및 A 는 이미 정의한 바와 같다)
로 표시되는 반복 구조를 분자내에 적어도 하나 이상 포함하는 상기 히알루론산 수식물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 히알루론산 유도체 및/또는 히알루론산 수식물 자체가 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖고, 예를 들어 포유동물에 있어서 18 시간 이상의 평균 혈중체류시간을 갖는 히알루론산 유도체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 히알루론산 수식물을 함유하는 약물 담체도 제공된다. 여기서, 당해 약물 담체의 형상은, 예를 들어 마이크로스피어 또는 나노스피어 등의 미립자 형상이어도 된다. 또한, 당해 약물 담체는 수용액 중에서, 상기 폴리머가 히알루론산 또는 그 유도체에 피복되어 있는 구조를 가질 수 있다. 또한 입자 직경은 특별히 한정되지 않지만, 니들을 막히게 하지 않고 통과할 수 있도록 하기 위해 200㎛ 이하인 것이 바람직하고, 100㎛ 이하인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 관절 투여의 경우에는, 물리적으로 관절내에서 프릭션을 일으키기 쉽고, 이것이 새로운 염증을 유발하기 때문에, 입자 직경이 5㎛ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 정맥 주사 투여의 경우에는, 말초 혈관을 폐색시키지 않기 위하여 입자 직경이 500㎚ 이하인 것이 바람직하고, 200㎚ 이하인 것이 더욱 바람직하다. 하나의 실시양태에 있어서, 당해 약물 담체는 HA 리셉터에 대한 타겟능; 히알루로니다아제에 대한 내성; 및 점막 부착성 등의 특성을 가질 수 있다. 또한, 당해 약물 담체는 국소 자극성이 저감된 약물 담체가 될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 약물 담체 및 약물을 함유하는 의약 조성물이 제공된다. 하나의 실시양태에 있어서, 당해 의약 조성물은 추가로 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머를 함유하고 있어도 되고, 바람직하게는 당해 폴리머는 히알루론산 수식물에 결합하고 있는 폴리머와 동종의 것이다. 또 하나의 실시양태에 있어서, 상기 약물은 히알루론산 수식물이 형성하는 미립자에 의해 봉입되어 있어도 된다. 여기서, 당해 미립자는 히알루론산 수식물의 폴리머 부분 및/또는 상기 폴리머가 형성하는 소수성 코어를 히알루론산 부분이 피복하는 형상을 갖고 있어도 되고, 바람직하게는 당해 의약 조성물에 있어서, 약물은 당해 소수성 코어 부분에 봉입되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 말단에 카르복실기를 갖는 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 폴리머와, 식 (Ⅱ):
Figure 112006011122164-pct00003
(식 중, R1, R2, R3, R4, Ra, Rb 및 A 는 상기에 정의한 바와 같다)
로 표시되는 반복 구조를 분자내에 적어도 하나 이상 포함하는, 히알루론산 유도체를 반응시키는 공정을 포함하는, 히알루론산 수식물의 제조방법이 제공된다. 상기 폴리머는 N,N'-카르보닐디이미다졸 (CDI), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (EEDQ), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨 (DMT-MM), 2-벤조트리아졸-1,1,3,3-테트라메틸우로늄4불화붕산염 (TBTU), 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄6불화인산염 (PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 등의 축합제를 단독으로 또는 적절히 조합함으로써 도입할 수 있다. 또한, 상기 폴리머의 말단 카르복실기를 반응성이 높은 에스테르 또는 아미드로 변환한 후에 도입할 수도 있다. 또한, 상기 폴리머는 수용액 중에서 미립자를 형성하고 있어도 된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 히알루론산 수식물을 사용하는, 에멀션액중 건조법, 용매 확산법 또는 투석법에 의한 상기 약물 담체의 제조방법도 제공된다.
하나의 실시양태에 있어서, 본 발명의 약물 담체의 제조방법은 에멀션액중 건조법을 이용하여 행해지며, 예를 들어 이하의 공정:
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는, 물에 혼화되지 않는 유기상에, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머를 용해시키는 공정;
b) 수상에, 상기 히알루론산 수식물을 용해 또는 분산시키는 공정;
c) 상기 a 공정에 의해 얻어진 폴리머 용액과, 상기 b 공정에 의해 얻어진 히알루론산 수식물 용액 또는 분산액을 혼합하여, 에멀션을 형성시키는 공정; 및
d) 상기 c 공정에 의해 얻어진 에멀션을 액중 건조시켜, 약물 담체 미립자를 형성시키는 공정,
을 포함하고 있어도 되고, 또는 이하의 공정;
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 물에 혼화되지 않는 유기상에, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머를 용해시키는 공정;
b) 상기 a 공정에 의해 얻어진 폴리머 용액을 수상에 혼합하여, 에멀션을 형성시키는 공정;
c) 상기 b 공정에 의해 얻어진 에멀션을 액중 건조시켜, 폴리머 미립자를 형성시키는 공정;
d) 별도의 수상에, 상기 히알루론산 수식물을 용해 또는 분산시키는 공정; 및
e) 상기 c 공정에 의해 얻어진 폴리머 미립자와, 상기 d 공정에 의해 얻어진 히알루론산 수식물 용액 또는 분산액을 혼합하여, 약물 담체 미립자를 형성시키는 공정,
을 포함하고 있어도 된다.
다른 하나의 실시양태에 있어서, 본 발명의 약물 담체의 제조방법은 용매 확산법을 이용하여 행해지며, 예를 들어 이하의 공정;
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 물에 혼화되는 유기상 (단, 물은 포함하지 않는다) 에, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머를 용해시키는 공정;
b) 수상에, 상기 히알루론산 수식물을 용해 또는 분산시키는 공정; 및
c) 상기 a 공정에 의해 얻어진 폴리머 용액을, 상기 b 공정에 의해 얻어진 히알루론산 수식물 용액 또는 분산액에 적하하여, 약물 담체 미립자를 형성시키는 공정,
을 포함하고 있어도 되고, 또는 이하의 공정;
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 물에 혼화되는 유기상 (단, 물은 포함하지 않는다) 에, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머 및 상기 히알루론산 수식물을 용해시키는 공정; 및
b) 상기 a 공정에 의해 얻어진 폴리머?히알루론산 수식물 용액을, 수상에 적하하여 약물 담체 미립자를 형성시키는 공정,
을 포함하고 있어도 된다.
또 하나의 실시양태에 있어서, 용매 확산법에 의한 본 발명의 약물 담체의 제조방법은, 이하의 공정;
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 물에 혼화되는 유기상 (단, 물은 포함하지 않는다) 에, 상기 폴리머를 용해시키는 공정;
b) 상기 a 공정에 의해 얻어진 폴리머 용액을, 수상에 적하하여 폴리머 미립자를 형성시키는 공정;
c) 별도의 수상에, 상기 히알루론산 수식물을 용해 또는 분산시키는 공정; 및
d) 상기 b 공정에 의해 얻어진 폴리머 미립자와, 상기 c 공정에 의해 얻어진 히알루론산 수식물 용액 또는 분산액을 혼합하여, 약물 담체 미립자를 형성하는 공정,
을 포함하고 있어도 된다.
또 하나의 실시양태에 있어서, 본 발명의 약물 담체의 제조방법은 투석법을 이용하여 행해지며, 예를 들어 이하의 공정;
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 물에 혼화되는 유기상 (단, 물은 포함하지 않는다) 에, 상기 폴리머 및 상기 히알루론산 수식물을 용해시키는 공정, 및,
b) 상기 a 공정에 의해 얻어진 폴리머?히알루론산 수식물 용액을, 수상에 대하여 투석하여 미립자를 형성시키는 공정,
을 포함하고 있어도 되고, 또는 이하의 공정:
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 물에 혼화되는 유기상 (단, 물은 포함하지 않는다) 에, 상기 폴리머를 용해시키는 공정;
b) 상기 a 공정에 의해 얻어진 폴리머 용액을, 수상에 대하여 투석하여 폴리머 미립자를 형성시키는 공정;
c) 별도의 수상에, 상기 히알루론산 수식물을 용해 또는 분산시키는 공정; 및
d) 상기 b 공정에 의해 얻어진 폴리머 미립자와, 상기 c 공정에 의해 얻어진 히알루론산 수식물 용액 또는 분산액을 혼합하여, 약물 담체 미립자를 형성하는 공정,
을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기의 약물 담체의 제조방법을 포함하는, 의약 조성물의 제조방법도 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 이하의 공정:
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 유기상 (단, 물은 포함하지 않는다) 에, 상기 히알루론산 수식물을 용해시키는 공정; 및
b) 상기 a 공정에 의해 얻어진 히알루론산 수식물 용액의 용매를, 용매 확산법 또는 투석법을 이용하여 물로 치환하는 공정,
을 포함하는 히알루론산 수식물 수용액 또는 분산액의 조제방법도 제공된다. 하나의 실시양태에 있어서, 상기 조제방법의 b 공정에 있어서 용매 확산법을 이용할 수도 있고, 예를 들어 상기 조제방법은, 이하의 공정:
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 유기상 (단, 물은 포함하지 않는다) 에, 상기 히알루론산 수식물을 용해시키는 공정; 및
b) 상기 a 공정에 의해 얻어진 히알루론산 수식물 용액을, 수상에 적하하여 용매를 물로 치환하는 공정,
을 포함하고 있어도 된다.
또 다른 실시양태에 있어서, 상기 조제방법의 b 공정에 있어서 투석법을 이용할 수도 있고, 예를 들어, 상기 조제방법은 이하의 공정:
a) 하나 이상의 유기 용매를 함유하는 유기상 (단, 물은 포함하지 않는다) 에, 상기 히알루론산 수식물을 용해시키는 공정; 및
b) 상기 a 공정에 의해 얻어진 히알루론산 수식물 용액을, 수상에 대하여 투석하여 용매를 물로 치환하는 공정,
을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 히알루론산 수식물 수용액 또는 분산액의 조제방법을 포함하는, 의약 조성물의 제조방법도 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 식 (Ⅲ):
Figure 112006011122164-pct00004
(식 중, R1, R2, R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소원자, C1 -6 알킬기 및 C1 -6 알킬카르보닐기에서 선택되고,
Ra, Rb, Rc 및 Rd 는 각각 독립적으로, 수소원자 및 C1 -6 알킬기에서 선택되고,
Q 는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프롤락톤 또는 이들의 공중합체에서 선택되는 폴리머이고, 이 폴리머는 말단의 카르복실기로 질소원자와 결합하고 있고,
n 은 0～6 의 정수이다)
로 표시되는 반복 구조를 분자내에 적어도 하나 이상 포함하는 히알루론산 수식물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 말단에 카르복실기를 갖는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프롤락톤 또는 이들의 공중합체에서 선택되는 폴리머와, 식 (Ⅳ):
Figure 112006011122164-pct00005
(식 중, R1, R2, R3, R4, Ra, Rb, Rc, Rd 및 n 은 이미 정의한 바와 같다)
로 표시되는 반복 구조를 분자내에 적어도 하나 이상 포함하는, 히알루론산 유도체를 반응시키는 공정을 포함하는, 상기 히알루론산 수식물의 제조방법도 제공된다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명의 히알루론산 수식물은 히알루론산 (HA) 또는 그 유도체와, 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA) 또는 락트산?글리콜산 공중합체 (PLGA) 에서 선택되는 하나 이상의 폴리머가 결합한 것이다.
본 발명에 있어서, 히알루론산 (HA) 또는 그 유도체와 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA) 또는 락트산?글리콜산 공중합체 (PLGA) 에서 선택되는 폴리머는 정전 상호작용 등의 물리적 상호작용에 의한 결합이 아니라, 화학적으로 공유결합되어 있다. 이 때문에, 투여 후의 염 농도변화, pH 변화 등의 환경변화에 의해서도, HA 또는 그 유도체로부터 상기 폴리머가 탈리되는 일은 없다. HA 또는 그 유도체와 상기 폴리머가 결합할 때에는, 결합을 제어하기 쉽게 하기 위해, 스페이서 부분을 개재하여 결합하고 있어도 된다. 또한, HA 유도체가 폴리머와의 결합을 위한 스페이서 부분을 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, 복수의 아미노기를 갖는 화합물 (디히드라지드 화합물, 디아민 화합물, 히드라진 화합물 등) 을 히알루론산 중의 글루쿠론산 부분의 카르복실기와 반응시킴으로써, 히드라지드기나 아미노기를 갖는 스페이서 부분을 도입할 수 있다. 특정한 실시양태에 있어서는, 식 H2N-(CH2)n-NH2 (식 중, n 은 0～10 의 정수이다), 식 H2N-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-NH2 (식 중, n 은 0～10 의 정수이다.) 로 표시되는 디아민 화합물, 식 H2NNHCO-(CH2)n-CONHNH2 (식 중, n 은 0～10 의 정수이다.) 로 표시되는 디히드라지드 화합물, 또는 식 NH(R10)-NH(R11) (식 중, R10 및 R11 은 독립적으로 수소원자 또는 C1 -6 알킬기이다) 로 표시되는 히드라진 화합물 등을 스페이서 부분으로서 도입할 수 있다.
HA 유도체에 스페이서 부분을 도입한 후에 폴리머를 도입하는 방법을 이용하는 경우, 스페이서에 의한 카르복실산의 수식률과, 폴리머에 의한 스페이서의 수식률을 독립적으로 제어할 수 있다.
HA 또는 그 유도체에 상기 폴리머가 결합하는 부위로는, HA 또는 그 유도체의 말단이어도 되고, 또는 상기 폴리머가 HA 또는 그 유도체의 측쇄로서 도입되어 있어도 된다. HA 는 수용액 중에서 매우 부피가 큰 분자이기 때문에, 일반적으로 상기 폴리머가 말단에 결합한 HA 또는 그 유도체를 사용하여 생체 분해성 미립자를 작성하는 경우에는 HA 층의 두께가 두꺼워진다. 또한, 상기 폴리머가 측쇄로서 그래프트 결합한 HA 또는 그 유도체를 사용하는 경우에는, HA 또는 그 유도체는 루프 형상으로 생분해성 미립자 표면에 코팅되어, HA 층의 두께를 작게 할 수 있다. 이 중, 상기 폴리머가 HA 또는 그 유도체의 측쇄에 그래프트 결합하고 있는 것이 바람직하다.
상기 폴리머 또는 스페이서 부분의, 수식되는 HA 또는 그 유도체로의 도입 위치로는, HA 분자내의 수산기와 카르복실기를 들 수 있다. 이 중, 수산기에 도입하는 경우에는, 활성화한 카르복실기 등과 당해 수산기를 반응시켜 카르복실산에스테르를 형성함으로써 도입할 수 있으며, 또한 이소시아네이트기 등과 당해 수산기를 반응시켜 카르바민산에스테르를 형성함으로써도 도입할 수 있다.
카르복실기에 도입하는 경우에는, 아미드기, 히드라지드기, 디아실히드라지드기, 카르복실산에스테르기를 형성함으로써, 상기 폴리머 또는 스페이서 부분을 도입할 수 있다.
상기 폴리머 또는 스페이서 부분을 도입하는 전술한 방법 중, 카르복실산에스테르를 형성하여 상기 폴리머 또는 스페이서 부분을 도입한 HA 수식물은 투여액내, 생체내에서의 가수분해에 의한 상기 폴리머의 탈리가 비교적 단시간에 발생한다. 따라서, 일반적으로는, 가수분해속도가 느린 카르바민산에스테르, 또는 아미드기, 히드라지드기 등을 개재하여 수식하는 편이 바람직하다.
이 중, 상기 폴리머가 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실기에 결합하고 있는 것이 더욱 바람직하고, 그 중에서도, 상기 폴리머가 아미드기, 히드라지드기 등을 개재하여, 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복실기에 아미드 결합에 의해 결합하고 있는 것이 특히 바람직하다.
HA 또는 그 유도체의 말단에 폴리머를 결합시키는 방법으로는, 예를 들어, HA 또는 그 유도체의 환원 말단의 알데히드와, 상기 폴리머 및 스페이서 부분의 말단에 도입한 히드라지드 (HZ) 기, 아미노 (AM) 기 등의 알데히드기와 반응성을 갖는 관능기에 의해 형성하는 시프 염기를, 수소화붕소나트륨 (NaBH4) 등의 환원제로 처리함으로써 도입하는 방법을 들 수 있다.
HA 또는 그 유도체의 측쇄로서 폴리머를 화학적으로 그래프트 결합시키는 방법으로는, 예를 들어 히드라지드 (HZ) 기, 아미노 (AM) 기 등, 활성 에스테르와 반응성을 갖는 관능기를 포함하는 스페이서 부분을 도입한 HA 유도체를, 테트라부틸암모늄 (TBA) 염에 이온 교환하고, 디메틸술폭사이드 (DMSO) 중에서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)/N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 로 카르복실기를 활성화한 폴리머와 반응시키는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에 있어서는, 스페이서를 도입한 HA 유도체는, 식 (Ⅱ):
Figure 112006011122164-pct00006
(식 중, R1, R2, R3, R4, Ra, Rb 및 A 는 상기에 정의한 바와 같다)
의 반복 구조를 분자내에 포함할 수 있다.
또는 다른 도입방법으로서, 미리 폴리머의 말단 카르복실기를 EDC/NHS 로 활성화하고, 이것과 디아민, 디히드라지드 등을 반응시킴으로써 아미노기, 히드라지드기 말단을 갖는 폴리머를 합성하여, 이것을 직접 HA 또는 그 유도체의 카르복실기에 EDC/NHS 등의 축합제로 결합시키는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에 있어서는, 아미노기, 히드라지드기 말단을 갖는 폴리머로서, 식 (Ⅴ):
Figure 112006011122164-pct00007
(식 중, Ra, Rb, Q 및 A 는 상기에 정의한 바와 같다)
의 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명의 HA 또는 그 유도체에 있어서는, 상기 폴리머의 대부분이 그 편말단에서만 HA 또는 그 유도체에 결합하고 있는 것이 바람직하다. 여기서, 「편말단에서 결합하고 있다」란, 상기 폴리머의 말단 반응기 중의 1 개소에서 결합하고 있는 상태를 가리킨다. 또한, 이 「대부분」이란, 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 그 편말단에서만 HA 또는 그 유도체와 결합하고 있는 폴리머의 양이, 결합하고 있는 전체 폴리머의 양에 대하여 70%w/w 이상인 상태를 가리키며, 바람직하게는 85%w/w 이상인 상태를 가리키고, 특히 바람직하게는 95%w/w 이상인 상태를 가리킨다. 또한, 어느 경우에 있어서도, 폴리머의 양 말단이 HA 또는 그 유도체에 도입되어 있는 비율은 HA 또는 그 유도체 중의 글루쿠론산 당 5몰% 이하 이고, 바람직하게는 3몰% 이하이고, 특히 바람직하게는 1몰% 이하이다. 당연한 일이지만, 본 발명 히알루론산 수식물은, 상기 폴리머가 그 편말단에서만 HA 또는 그 유도체에 결합하고 있는 히알루론산 수식물만으로 구성되어 있어도 된다.
편말단에서만 HA 또는 그 유도체와 결합하고 있는 상기 폴리머의 양의, 결합하고 있는 상기 폴리머의 양 말단이 HA 또는 그 유도체에 도입되어 있는 비율을 정량하는 방법으로는, 프로톤 NMR 에 의해 얻어지는 상기 폴리머의 도입량과, 이들 폴리머를 결합시키는 것에 의한 폴리머 도입 전의 히드라지드 (HZ) 화 또는 아미노 (AM) 화된 HA 유도체 중의 히드라지드기, 또는 아미노기의 실제의 감소량의 비교로부터 구할 수 있다. 예를 들어, 아디프산디히드라지드에서 히드라지드기를 도입한 HA-HZ 의 프로톤 NMR 에 의해 얻어지는 유리 히드라지드기 유래의 피크 (2.2～2.3ppm:측정 용매 DMSO-d6), 또는 에틸렌디아민에서 아미노기를 도입한 HA-AM 의 프로톤 NMR 에 의해 얻어지는 유리 아미노기 유래의 피크 (2.9～3.1ppm:측정 용매 DMSO-d6) 는, 이들 폴리머의 도입률에 비례하여 감소할 것이므로, 이 피크와 HA 유래의 피크 (1.8～1.9ppm:측정 용매 DMSO-d6) 의 비를 실측한다 (X). 한편, 이들 폴리머의 도입이 100% 편말단이라고 가정하고, 폴리머 도입률로부터 비례적으로 계산되는 유리 히드라지드기 또는 아미노기의 피크의, HA 유래의 피크에 대한 비를 계산한다 (Y). 이 실측치의 비가 이론치의 비보다 작아진 비율이 양 말단에서 결합한 폴리머의 비율이 된다. 글루쿠론산에 대한 폴리머의 도입률을 Z%, HA-HZ 의 히드라지드기 도입률 또는 HA-AM 의 아미노기 도입률을 H% 로 하면, 편말단에서만 HA 또는 그 유도체와 결합하고 있는 폴리머 양의 결합하고 있는 전체 폴리머 양에 대한 비율은 1-(HZ)/Z(1-X/Y) 이고, 양 말단이 HA 또는 그 유도체에 도입되어 있는 비율은 글루쿠론산 당 (HZ)×(1-X/Y) 로 표시된다.
본 발명에 사용되는 히알루론산 (HA) 또는 그 유도체는, HA 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 이들을 유도체화한 것이어도 된다.
HA 또는 그 약학적으로 허용되는 염으로는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리금속염을 들 수 있고, 특히 바람직한 염은 의약물으로서 번용되고 있는 나트륨염이다. HA 또는 그 약학적으로 허용되는 염은, 닭의 볏이나 돼지 피하 등의 생물 유래의 것을 추출하는 방법이나 생물 발효법 등의 각종 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 또는 시판 중인 것을 구입하여 (예를 들어, 덴키카가쿠공업주식회사, 주식회사 시세이도, 세이카가쿠공업주식회사 등으로부터) 입수하는 것도 가능하다.
HA 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 유도체화한 HA 유도체로는, 그 글루쿠론산의 카르복실기를 화학적으로 수식한 것을 들 수 있다. 이 때, 글루쿠론산의 카르복실기의 수식 상태에 따라, 체내 동태를 제어하는 것도 가능하다.
HA 유도체의 글루쿠론산 부분의 카르복실기 수식률이 낮으면 (예를 들어 10몰% 이하), 염증 부위나 종양 부위에 대량으로 발현하고 있는 CD44 를 비롯한 HA 리셉터나, HA 의 주요 대사계인 간장, 림프계 조직에 대한 타겟팅 효과를 기대할 수 있다. 예를 들어, 변형성 관절증이나 류머티즘 환자의 염증을 일으킨 골막세포에 대한 타겟팅, 리셉터 의존형 엔도사이토시스에 의한 세포내로의 혼입, 세포내에서의 약물 방출에 의한 염증 치유를 기대할 수 있다.
또한, HA 유도체의 글루쿠론산 부분의 카르복실기 수식률이 높으면, HA 리셉터에 대한 결합이 억제되어, 체내에서 스텔스 효과를 갖는 체류성이 긴 약물 담체 미립자가 된다. 이 경우, EPR 효과를 이용한 종양 세포에 대한 타겟팅 효과도 기대할 수 있다. 또한, 일정 시간 경과 후에 카르복실기의 수식이 끊어지고, 수식기가 HA 에서 탈리하도록 결합 양식을 설계해 두면 (예를 들어, 에스테르나 아미드 결합), EPR 효과로 종양 조직에 수동적 타겟팅한 후, HA 리셉터를 개재한 능동적 타겟팅으로 종양 세포내에 약물이 들어간 본 발명의 미립자를 높은 효율로 운송할 수도 있다.
HA 또는 그 유도체의 글루쿠론산 부분의 카르복실기를 수식하는 방법으로는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 폴리머의 수식 전에 HA 또는 그 유도체의 카르복실기를 N,N'-카르보닐디이미다졸 (CDI), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드록시놀린 (EEDQ), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨 (DMT-MM), 2-벤조트리아졸-1,1,3,3-테트라메틸우로늄4불화붕산염 (TBTU), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄6불화인산염 (PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 등의 축합제를 단독으로 또는 적절히 조합하여 이용하여 활성 에스테르화하고, 이것을 히드라지드기, 아미노기 등의 활성 에스테르와 반응성을 갖는 관능기를 결합시킨 HA 유도체와 반응시켜, 화학적으로 결합시키는 방법을 들 수 있다. 또한, 먼저 HA 또는 그 유도체를 폴리머로 수식하고, 얻어진 히알루론산 수식물의 잔존하고 있는 카르복실기를 동일하게 반응시켜 수식해도 된다.
본 발명에 사용되는 HA 또는 그 유도체의 분자량은, 특별히 한정은 되지 않지만, HA 또는 그 유도체 분자 자체의 수용액 중에서의 크기가 다른 분자에 비하여 매우 크기 (예를 들어, 점도평균분자량 200만달톤의 HA 는 200～300㎚ 의 사이즈가 있다) 때문에, 입자계가 작은 나노스피어 등의 조제에는 분자량이 작은 (예를 들어, 점도평균분자량으로 30만달톤 이하, 예를 들어 5000～10만달톤) HA 또는 그 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA) 또는 락트산?글리콜산 공중합체 (PLGA) 에서 선택되는 폴리머의 분자량은, 특별히 한정은 되지 않지만, HA 또는 그 유도체와의 반응 효율의 면에서, 통상 점도평균분자량 10만달톤이하의 것, 예를 들어 1000～5만달톤의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 폴리머는 Alkermes, BirmingHAM Polymers, Inc, 와코쥰야쿠공업주식회사 등으로부터 구입하는 것도 가능하고, 무촉매 탈수 중축합법 (일본 공개특허공보 소61-28521호) 또는, 고리형 디에스테르 화합물로부터의 촉매를 사용한 개환 중합법 (Encyclopedic Handbook of Biomaterials and Bioengineering Part A Materials, Vol.2, MarcelDekker, Inc. (1995)) 을 이용하여 제조할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 폴리머의 선택은, 예를 들어 타겟팅을 목적으로 한 약물 담체의 경우에는, 타겟 부위에 도달하기까지의 생체내에서의 약물 방출은 최소한으로 억제하고 싶기 때문에, PLA 등의 분해속도 (즉, 약물 방출속도) 가 느린 폴리머를 선택하는 편이 바람직하다. 또한, 체내에서의 약물 서방을 목적으로 하는 경우에는, 목적에 따른 약물 방출속도를 실현하기 위하여, 이들 공중합체를 사용하여 약물 방출속도를 제어할 수 있다.
본 발명에 있어서, HA 또는 그 유도체와 PLA, PGA 또는 PLGA 에서 선택되는 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물 및 그 염은, 도입한 폴리머 (PLA, PGA 또는 PLGA) 의 중량비에 상관없이, DMSO, DMAc, DMF 등의 유기 용매, 및 이들에 충분한 비율로 혼화되는 용매 (예를 들어, 테트라히드로푸란, 메탄올, 에탄올 등) 와의 혼합 용매에는 가용성이지만, 예를 들어 아세토니트릴, 아세톤, 염화메틸렌, 아세트산에틸 등의 유기 용매에 거의 용해되지 않는다.
본 발명에 있어서, HA 또는 그 유도체와 PLA, PGA 또는 PLGA 에서 선택되는 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물 및 그 염을 그대로 물에 용해 또는 분산시킬 때에는, 공유 결합에 의해서 도입하는 폴리머 (PLA, PGA 또는 PLGA) 의 중량비는 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하가 되도록 조절된 히알루론산 수식물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, HA 또는 그 유도체와 PLA, PGA 또는 PLGA 에서 선택되는 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물 및 그 염은, 도입한 폴리머 (PLA, PGA 또는 PLGA) 의 중량비에 상관없이, 일단 DMSO, DMAc, DMF 등의 유기 용매, 또는 이들에 충분한 비율로 혼화되는 용매와의 혼합 용매에 용해시키고, 그 후 투석법이나 용매 확산법 등에 의해 용매를 물로 치환함으로써, 물에 용해 또는 분산시키는 것이 가능하다. 특별히 한정은 되지 않지만, 그 때 히알루론산 수식물은 자발적으로 소수성 폴리머 부분을 코어 부분으로서 집적시키고, 친수성 HA 또는 그 유도체 부분을 표면을 향하게 한 상태에서 수중에 존재하는 것으로 생각된다.
본 발명의 히알루론산 수식물은 약물 담체로서 사용할 수 있다. 통상적인 방법에 따라, 본 발명의 히알루론산 수식물에 약물을 봉입, 포함, 담지 및/또는 분산시키면 된다.
본 발명에 사용되는 약물은 생분해성 고분자에 담지 가능한 약물이면 특별히 한정되지 않고, 저분자 화합물, 단백질, 펩티드 등을 사용하는 것이 가능하다.
저분자 화합물의 예로는, 예를 들어 제암제 (예를 들어, 알킬화제, 대사 길항제, 알칼로이드 등), 면역 억제제, 항염증제 (스테로이드제, 비스테로이드제계 항염증제 등), 항류머티즘제, 항균제 (β-락탐계 항생물질, 아미노글리코시드계 항생물질, 매크로라이드계 항생물질, 테트라사이클린계 항생물질, 신퀴놀론계 항생물질, 설파제 등) 등을 들 수 있다.
단백질, 펩티드의 예로는, 예를 들어 에리스로포이에틴 (EPO), 그래뉼로사이토콜로니 자극인자 (G-CSF), 인터페론-α, β, γ, (INF-α, β, γ), 트롬보포이에틴 (TPO), 시리얼리뉴트로픽팩터 (CNTF), 튜머네크로시스팩터 (TNF), 튜머네크로시스팩터 결합 단백질 (TNFbp), 인터루킨-10 (IL-10), FMS 유사 티로신카이네스 (Flt-3), 성장 호르몬 (GH), 인슐린, 인슐린 유사 성장인자-1 (IGF-1), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 인터루킨-1리셉터앤타고니스트 (IL-1ra), 브레인 유래 뉴로트로픽팩터 (BDNF), 케라티노사이트 성장인자 (KGF), 줄기세포인자 (SCF), 메가카리오사이트 성장분화인자 (MGDF), 오스테오프로테게린 (OPG), 렙틴, 부갑상선 호르몬 (PTH), 염기성 피브로블라스트 성장인자 (b-FGF), 골 형성 단백질 (BMP), 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 (ANP), 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP), C 형 나트륨 이뇨 펩티드 (CNP), 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1), 항체, 다이아보디, 미니보디, 단편화 항체 등을 들 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 양태으로서, 약물 담체가 미립자 형상으로 형성되어 있는 것을 들 수 있다. 본원 히알루론산 수식물은 HA 또는 그 유도체 부분이 친수성이고, 폴리머가 소수성인 점에서, 수용액 중에서는, 폴리머의 표면을 HA 또는 그 유도체가 피복하는 구조를 취하고, 미립자 형상이 된다. 이 미립자 중에 약물을 봉입, 포함, 담지 및/또는 분산시킬 수 있다. 이 약물 담체는 입자표면이 친수성 HA 또는 그 유도체로 피복되어 있기 때문에, 투여 수용액내, 생체내에서의 입자의 응집, 프릭션을 막고, 또한 생체 적합성이 높은 HA 표면을 갖기 때문에, 코어 부분의 폴리머가 생체 조직에 직접 접촉하는 일이 없어, 염증 등의 문제가 완화된다.
미립자 형상의 본 발명 약물 담체의 입자 직경은 니들을 막히게 하지 않고 통과할 수 있도록 하기 위하여 200㎛ 이하인 것이 바람직하며, 100㎛ 이하인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 관절 투여의 경우에는, 물리적으로 관절내에서의 프릭션이 생기기 쉽고, 이것이 새로운 염증을 유발하기 때문에, 입자 직경이 5㎛ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 정맥 주사 투여의 경우에는, 말초 혈관을 폐색시키지 않기 위하여 입자 직경이 500㎚ 이하인 것이 바람직하며, 200㎚ 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 미립자는 생체 적합성이 양호하고, 염증성이 없고, 히알루론산 자체에 점막 부착성이 있는 점에서, 입자 직경을 제어함으로써, 경비, 경폐, 경구 등의 비침습 투여 용도에도 사용 가능하다. 점막 부착성은 HA 의 카르복실산의 양으로 조절하는 것이 가능하며, 그 양은 많은 편이 바람직하고, 스페이서나 폴리머 등에 의한 수식률은 낮은 편이 바람직하다.
본 발명의 미립자 조제방법은, 예를 들어 에멀션액중 건조법, 또는 용매 확산법 (J. Contr. Rel. 83, 365-375(2002)), 투석법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 폴리머 미립자 조제 후에 그 표면에 HA 또는 그 유도체를 화학 결합시켜 폴리머 미립자를 코팅하는 방법, HA 또는 그 유도체의 말단이나 측쇄에 폴리머를 화학적으로 결합시킨 히알루론산 수식물을 미리 합성하고, 이것을 사용하여 에멀션액중 건조법, 용매 확산법, 투석법 등에 의한 미립자를 조제할 때, 미립자 생성시에 자발적으로 HA 로 피복하는 방법, 미립자 조제 후에 자발적으로 HA 로 피복하는 방법을 들 수 있다.
폴리머 미립자 조제 후에 그 표면에 HA 또는 그 유도체를 화학 결합시켜 폴리머 미립자를 코팅하는 경우에는, 통상적인 방법에 따라 폴리머로 이루어지는 미립자를 조제한 후, 입자 표면의 카르복실기를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 등의 축합제로 활성 에스테르화하고, 이것을 히드라지드 (HZ) 기, 아미노 (AM) 기 등의 활성 에스테르와 반응성을 갖는 관능기를 함유하는 스페이서를 도입한 HA 또는 그 유도체와 반응시켜, 화학적으로 결합을 형성함으로써 본원 히알루론산 수식물로 이루어지는 미립자를 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 에멀션액중 건조법에 의해 추가로 PLA, PGA 또는 PLGA 에서 선택되는 하나 이상의 폴리머를 함유하는, 히알루론산 수식물로 피복된 미립자를 조제할 수 있다. 즉, 염화메틸렌, 아세트산에틸 등의 물에 혼화되지 않는 유기 용매 또는 이들에 충분한 비율로 혼화되는 용매와의 혼합 용매에 PLA, PGA 또는 PLGA 를 용해시켜 두고, 한편 본 발명의 히알루론산 수식물은 수상에 용해 또는 분산시키고, 에멀션 조제 후, 액중 건조시킴으로써 본 발명의 히알루론산 수식물로 피복된 미립자를 조제할 수 있다. 특별히 한정은 되지 않지만, 이 조제방법에 있어서, 본 발명의 히알루론산 수식물은 소수부와 친수부를 1 분자내에 갖는 양 친매성 분자이기 때문에, 계면활성작용을 나타내는 것으로 생각된다.
본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 용매 확산법에 의해 추가로 PLA, PGA 또는 PLGA 에서 선택되는 하나 이상의 폴리머를 함유하는, 히알루론산 수식물로 피복된 미립자를 조제할 수 있다. 즉, 아세톤, 아세토니트릴 등의 물에 혼화되는 유기 용매 또는 이들에 충분한 비율로 혼화되는 에탄올, 메탄올 등의 유기 용매와의 혼합 용매에 PLA, PGA 또는 PLGA 를 용해시켜 두고, 수상에 혼합하면 유기 용매가 확산함과 함께 미립자가 생성되는데, 그 수상에 본 발명의 히알루론산 수식물을 용해 또는 분산시켜 사용할 수 있고, 미립자 생성시에 그 미립자를 본 발명의 히알루론산 수식물로 피복할 수 있다.
용매 확산법이나 투석법을 이용하는 경우에서, DMSO, DMAc, DMF 등의 유기 용매, 또는 이들에 충분한 비율로 혼화되는 용매와의 혼합 용매를 사용하는 경우, 본 발명의 히알루론산 수식물은 유기상에 용해시켜 사용할 수도 있다. 유기상에 용해시킨 본 발명의 히알루론산 수식물 또는 PLA, PGA 또는 PLGA 에서 선택되는 폴리머와의 혼합물은, 수상에 대하여 투석 또는 적하됨으로써 용매가 물로 치환될 때에, 소수성 폴리머의 집적에 의한 미립자의 형성과 함께, 친수성 HA 부분은 미립자 표면에 집적함으로써 미립자를 본 발명의 히알루론산 수식물로 피복할 수 있다. 또한, 용매 확산법이나 투석법을 이용하는 경우에서, DMSO, DMAc, DMF 등의 유기 용매, 또는 이들에 충분한 비율로 혼화되는 용매와의 혼합 용매를 사용하는 경우, 본 발명의 히알루론산 수식물을 수상에 용해 또는 분산시켜 사용할 수도 있고, 미립자 생성시에, 그 미립자를 본 발명의 히알루론산 수식물로 피복할 수 있다.
미립자 조제방법에 상관없이, PLA, PGA 또는 PLGA 로 이루어지는 미립자 표면은 소수성인 점에서, 이들 미립자를 본 발명의 히알루론산 수식물을 용해 또는 분산시킨 수용액에 혼합함으로써, 소수성 상호작용에 의한 미립자 표면으로의 흡착이 일어나, 친수성의 본 발명의 히알루론산 수식물로 피복된 미립자를 조제할 수 있다.
본 발명의 미립자 조제에 있어서 사용하는 수상은 물로만 이루어져 있어도 되고, 물에 충분한 비율로 혼화되는 용매와의 혼합 용매로 되어 있어도 된다. 또한 원하는 대로, 당해 기술분야에서 통상 사용되는 첨가물, 예를 들어 계면활성제, pH 조정제나 완충제 등을 함유하고 있어도 되고, pH 나 염농도가 적절히 조절되어 있어도 된다.
본 발명의 히알루론산 수식물만을 사용하여 미립자를 형성할 수 있는데, 당해 기술분야에서 통상 사용되는 첨가물, 예를 들어 계면활성제, pH 조정제, 산화 방지제 등과 함께, 본 발명의 히알루론산 수식물을 함유하는 미립자를 형성할 수도 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에 있어서, 본 발명의 히알루론산 수식물을 함유하는 미립자는, 그 코어 부분에 PLA, PGA 또는 PLGA 에서 선택되는 HA 가 결합되어 있지 않은 폴리머를 함유할 수 있다. 상기 첨가물이나 당해 폴리머를 첨가함으로써, 미립자의 입경 및 약물 담지 능력을 조절할 수 있다.
본 발명의 히알루론산 수식물로 피복된 미립자 중, 특히 CD44 를 비롯한 HA 리셉터에 대한 타겟팅을 목적으로 한 미립자를 조제하는 경우, 그 입자 사이즈는 5㎛이하, 예를 들어 1㎚～5㎛ 인 것이 바람직하며, 그 조제법은 투석법, 용매 확산법, 에멀션액중 건조법 등을 이용할 수 있다. 이 때에 사용하는 히알루론산 수식물은, HA 리셉터에 대한 결합이 억제되지 않도록, HA 의 글루쿠론산 부분의 카르복실산의 수식률이 10몰% 이하, 예를 들어 0.1～10% 인 것이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 수식물로 피복된 미립자 중, 특히 혈중체류성 연장, 종양 조직, 염증 조직으로의 집적성을 목적으로 한 미립자를 조제하는 경우, 그 입자 사이즈는 200㎚ 이하, 예를 들어 1㎚～200㎚ 인 것이 바람직하며, 그 조제법은 투석법, 용매 확산법, 에멀션액중 건조법 등을 이용할 수 있다. 이 때에 사용하는 히알루론산 수식물은 HA 리셉터에 대한 결합이 억제되도록 HA 의 글루쿠론산 부분의 카르복실산이 30～100%, 바람직하게는 50～90% 의 수식률로 수식된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 수식물로 피복된 미립자 중, 국소 자극성의 저감을 목적으로 한 미립자를 조제하는 경우, 그 입자 사이즈는 200㎛ 이하, 예를 들어 1㎚～200㎛ 인 것이 바람직하며, 그 조제법은 투석법, 용매 확산법, 에멀션액중 건조법을 이용할 수 있다.
본 발명의 히알루론산 수식물로 피복된 미립자 중, 점막 부착성을 갖고 비침습 투여 용도를 목적으로 한 미립자를 조제하는 경우, 그 입자 사이즈는 200㎛ 이하, 예를 들어 1㎚～200㎛ 인 것이 바람직하며, 그 조제법은 투석법, 용매 확산법, 에멀션액중 건조법을 이용할 수 있다. 사용하는 히알루론산 수식물은 점막 부착성을 갖도록 HA 의 카르복실산의 수식률은 낮은 것이 바람직하다.
약물을 이들 미립자에 봉입하는 방법은, 통상 약물을 폴리머에 봉입하는 방법이 이용된다. 예를 들어, 미립자 조제시에 폴리머를 DMSO 등의 유기 용매에 용해하였을 때에 약물도 공존시켜 두고, 그대로 미립자를 조제하면 된다. 약물의 수용성이 높은 경우 등에는, 약물을 물에 대한 용해성이 낮은 염으로 변경하거나, W/0/W 에멀션법을 이용하거나 함으로써 봉입 효율을 올릴 수 있다.
조제한 미립자가 동결 건조 후에 재분산되기 어려운 경우에는, 트레할로스, 만니톨 등의 분산제를 공존시켜 동결 건조를 행할 수도 있다.
본 발명 히알루론산 수식물의 용도에 맞추어, 본 발명 히알루론산 수식물의 혈중체류시간은, HA 자체의 혈중체류시간에 비하여 연장되어 있어도 된다. 여기서, 혈중체류시간이 연장된 본 발명 히알루론산 수식물을 얻기 위해, 원료로서 혈중체류시간이 연장된 히알루론산 유도체를 사용할 수 있다. 혈중체류시간은, 평균 혈중체류시간 (이하, MRT 라고도 함), 혈중반감기 (이하, t1/2 라고도 함), 혈중클리어런스 (이하, Cl 이라고도 함) 등의 공지된 대표적인 파라미터를 이용하여 적절히 비교할 수 있다. 본 발명의 히알루론산 수식물에 스텔스 효과를 기대하는 경우, 인간을 포함한 포유류에 있어서의 혈중체류시간은 실용면에서 평균 혈중체류시간 (MRT) 이 18 시간 이상인 것이 바람직하며, 30 시간 이상인 것이 보다 바람직하다.
또한, 다른 측면에 의하면, 본 발명 히알루론산 수식물은, 그 용도에 맞추어, HA 자체에 비하여 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 것이어도 된다. 여기서, HA 자체에 비하여 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 본 발명 히알루론산 수식물을 얻기 위해, 원료로서 HA 자체에 비하여 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 히알루론산 유도체를 사용할 수 있다. 「히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는다」란, HA 자체와 본 발명 히알루론산 수식물 또는 원료인 히알루론산 유도체를 각각 히알루로니다아제에 의해 효소분해시켰을 때에, HA 자체보다 분해속도가 느리거나 또는 분해가 진행되지 않는 성질을 갖는 것을 가리킨다. 예를 들어, 일정 시간 히알루로니다아제 처리하였을 때에, HA 자체에서는 관찰되는 2 당 분해 피크가 관찰되지 않으면 「분해가 진행되지 않는」성질을 갖는다 (즉, 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는다) 라고 판정할 수 있다. 또한, HA 의 분해속도나 분해상태는 겔 침투 크로마토그래피 (이하, GPC 라고도 함) 등의 통상적인 방법을 이용하여 관찰할 수 있다.
발명의 효과
본 발명에 의해, 히알루론산 또는 그 유도체와, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물이 제공된다. 당해 히알루론산 수식물을 사용하여, 저분자 약물을 효율적으로 봉입하여, 장기적으로 서방 기간을 제어할 수 있고, 혈중체류성을 제어할 수 있고, 수용액 중에서의 분산성이 양호하고, 안전성에 문제가 없는 약물 담체가 제공된다. 또한, 본 발명의 히알루론산 수식물에 의해, 입자간 응집이 적고, 입자 직경의 제어가 가능하며, 게다가 인젝터블 미립자로 이루어지는 생체 적합성이 우수한 약물 담체도 제공된다.
[도 1] 도 1 은, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 마이크로스피어를 SEM 으로 촬영한 사진의 일례이다.
[도 2] 도 2 는, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 마이크로스피어를 3D 레이저 현미경으로 촬영한 사진의 일례이다.
[도 3] 도 3 은, 비교예로서의 PLGA 마이크로스피어를 SEM 으로 촬영한 사 진의 일례이다.
[도 4] 도 4 는, 비교예로서의 PLGA 마이크로스피어를 3D 레이저 현미경으로 촬영한 사진의 일례이다.
[도 5] 도 5 는, 본 발명의 히알루론산 수식물을 GPC 로 측정한 결과의 일례이다.
[도 6] 도 6 은, 본 발명의 히알루론산 수식물을 NMR 로 측정한 결과의 일례이다.
[도 7] 도 7 은, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 나노스피어의 분산 용액 (HA(25k달톤)-PLA 나노스피어) 을 1 개월 4℃ 에서 보존한 후의 사진의 일례이다.
[도 8] 도 8 은, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 나노스피어의 분산 용액 (HA(190k달톤)-PLA 나노스피어) 을 1 개월 4℃ 에서 보존한 후의 사진의 일례이다.
[도 9] 도 9 는, PLA 나노스피어의 분산 용액 (비교예) 을 1 개월 4℃ 에서 보존한 후의 사진의 일례이다.
[도 10] 도 10 은, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 나노스피어의 분산 용액 (HA(25k달톤)-PLA나노스피어) 을 1 개월 4℃ 에서 보존한 후의 SEM 사진의 일례이다.
[도 11] 도 11 은, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 나노스피어의 분산 용액 (HA(190k달톤)-PLA나노스피어) 을 1 개월 4℃ 에서 보존한 후의 SEM 사진의 일례이다.
[도 12] 도 12 는, PLA 나노스피어의 분산 용액 (비교예) 을 1 개월 4℃ 에서 보존한 후의 SEM 사진의 일례이다.
[도 13] 도 13 은, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 나노스피어의 분산 용액의 수용액 중에서의 프로톤 NMR 스펙트럼의 일례이다.
[도 14] 도 14 는, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 나노스피어의 분산 용액의 수용액 중에서의 프로톤 NMR 스펙트럼의 일례이다.
[도 15] 도 15 는, 실시예 4-1 에 있어서 얻어진 HA-HZ 의 NMR 스펙트럼의 일례이다.
[도 16] 도 16 은, 실시예 4-1 에 있어서 얻어진 HA-HZ 에 대한 히알루로니다아제 SD 에 대한 분해성 시험 결과 및, 미수식 HA 를 동일 조건으로 히알루로니다아제 SD 처리한 경우의 결과의 일례이다.
[도 17] 도 17 은, 실시예 5-1 에 있어서 얻어진 HA-AM 의 프로톤 NMR 스펙트럼의 일례이다.
[도 18] 도 18 은, 실시예 5-1～5-3 에 있어서 얻어진 HA-AM 에 대한 히알루로니다아제 SD 에 대한 분해성 시험 결과 및, 미수식 HA 를 동일 조건으로 히알루로니다아제 SD 처리한 경우의 결과의 일례이다.
[도 19] 도 19 는, 실시예 6-2 에서 얻은 HA-HZ-PLA 의 GPC 크로마토그램의 일례이다.
[도 20] 도 20 은, 실시예 6-2 에서 얻은 HA-HZ-PLA 의 프로톤 NMR 스펙트 럼의 일례이다.
[도 21] 도 21 은, 실시예 6-3 에서 얻은 HA-HZ-PLA 의 GPC 크로마토그램이다.
[도 22] 도 22 는, 실시예 6-3 에서 얻은 HA-HZ-PLA 의 프로톤 NMR 스펙트럼의 일례이다.
[도 23] 도 23 은, 실시예 7-7 에서 얻은 HA-AM-PLA 의 프로톤 NMR 스펙트럼의 일례이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 더욱 상세히 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다. 또한, 이하에 있어서는, 결합 양식을 막론하고, HA 와 PLA 가 결합한 것을 총칭하여 HA-PLA 라 칭한다. 또한, 스페이서 분자로서 디히드라지드 화합물을 포함하는 경우에는 HA-HZ-PLA, 디아민 화합물을 포함하는 경우에는 HA-AM-PLA 라 칭하는 경우도 있다.
트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 에 의한 아미노기의 정량은 「학회출판센터 생물화학실험법12 단백질의 화학수식 <상> 초판」37페이지에 기재된 방법 (TNBS법) 을 따랐다. 단, TNBS 용액은 0.5M 으로 조제하고, 히드라지드기를 정량하기 위하여 500㎚ 의 흡광도를 측정하였다.
또한, NMR 측정은 NMR 분광계로서 JNM-ECA500 (500㎒ 분광계) 을 사용하여, 이하의 조건 (파라미터) 으로 측정을 행하였다.
NMR 조건
Data points (X point): 16384
Spectral width (X sweep): 15ppm
Acquisition time (X acq time): 1.749s
Pulse delay (Relaxation delay): 30s
Transients (Scans): 64
온도: 실온
〔실시예 1〕 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제
(실시예 1-1) 히드라지드기 (HZ) 가 도입된 히알루론산 (HA-HZ) 의 합성
분자량 2.5×104달톤의 히알루론산 (HA)(덴키카가쿠공업주식회사 제조) 100㎎ 을 1% 농도로 증류수에 용해시키고, 5N 염산으로 pH 를 4.7～4.8 로 조제하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)(시그마-알드리치사 제조) 와 아디프산디히드라지드 (ADH)(시그마-알드리치사 제조) 를, 사용하는 히알루론산에 함유되는 글루쿠론산 (카르복실기) 에 대하여 몰비로 5 배의 EDC 및 40 배의 ADH 를 첨가하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7～4.8 로 유지하면서 실온에서 2 시간 반응시켰다. 100mM 염화나트륨 수용액, 25% 에탄올 수용액으로 투석 (스펙트라포어 7, 분획 분자량 (MWCO):12k-14k달톤) 하고, 동결 건조시켜 표제의 히드라지드기 (HZ) 가 도입된 히알루론산 유도체 (HA-HZ) 88㎎ 을 얻었다.
얻어진 HA-HZ 중의 HZ 도입률을 프로톤 NMR 법 (측정 용매:D2O) 으로 정량한 결과, HA 의 카르복실산의 65% 가 HZ 화되어 있었다 (HA:N-아세틸기, 2.1ppm, HZ: 아디프산 부분의 메틸렌기, 1.7ppm, 2.4ppm). 또한, TNBS 법으로 정량한 결과, 34.9% 였다.
(실시예 1-2) PLGA 마이크로스피어의 조제
PLGA7510 (와코쥰야쿠공업:분자량 1만달톤) 을 염화메틸렌 (쥰세이화학) 10㎖ 를 첨가하여 용해시켜 10%(w/v) 의 용액을 조제하였다. 이것을 1% 폴리비닐알코올, (87-89% 가수분해된, 분자량 13000-26000) 수용액 (PVA 수용액) 90㎖ 에 1:9(v/v) 가 되도록 혼합하고, 스터러로 약 700rpm 으로 교반시켜 수중유(oil-in-water (O/W)) 에멀션을 얻었다. 이 에멀션을 1% PVA 수용액 900㎖ 중에 넣고 약 200rpm 으로 하룻밤 교반하고, 용매를 증류 제거시킴으로써 마이크로스피어의 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 1000rpm, 4℃ 에서 10 분간 원심시켜 상청을 제거하고, 물로 충분히 세정하여, 동결 건조시킨 것을 마이크로스피어로서 회수하였다. SEM 화상 해석에 의한 입경 측정의 결과, 30～80㎛ 정도의 입자 직경의 마이크로스피어가 얻어졌다.
(실시예 1-3) 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제
실시예 1-2 의 PLGA 마이크로스피어의 표면 카르복실산을 EDC 및 Sulfo-NHS (N-히드록시술포숙신이미드)(피아스사 제조) 를 사용하여 활성화하고 (PLGA/EDC/Sulfo-NHS=1/5/5몰비, 100mM 인산 완충액 (pH 5.8) 중에서 실온에서 1 시간 교반), 실시예 1-1 의 HA-HZ 수용액 (0.1%, 100mM 인산 완충액 (pH 7.0)) 에 투입, 실온에서 2 시간 교반 후, 100mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 세정하여, 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어를 얻었다. 얻어진 히알루론산 피복 PLGA 마 이크로스피어의, SEM 및 3D 레이저 현미경의 사진을 도 1 및 도 2 에 나타낸다. SEM 사진 (건조 상태)(도 1) 에 의하면, HA 코트에 의해 PLGA 마이크로스피어 표면이 매끄럽게 되었음을 알 수 있다. 3D 레이저 현미경 사진 (도 2) 에 의하면, 수용액 중에서는, 얻어진 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어는 PLGA 입자가 HA 의 겔 형상의 쉘로 피복되어 있음을 알 수 있다.
〔실시예 2〕 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제
(실시예 2-1) PLA 가 도입된 히알루론산 (HA-PLA) 의 합성
실시예 1-1 과 동일한 방법으로 얻어진 HA-HZ 100㎎ 을 20㎖ 의 물에 녹이고 (0.5% 농도), H 형으로 한 양이온 교환 수지 (Dowex 50WX8-400, 4.8meq/g) 4㎖ 를 첨가 (HA 의 카르복실기의 100 배의 이온 교환능) 실온에서 3 일 방치하였다. 상청을 회수, 0.22㎛ 필터를 통과시켜, 1M TBA-OH (테트라-N-부틸암모늄히드록시드) 용액을 150㎕ 첨가, pH 8 로 조정한 후, 동결 건조시켰다. 동결 건조시킨 HA-HZ-TBA 에 함유되는 글루쿠론산 (카르복실기) 에 대하여, 각각 몰비로 5 배가 되는 양의 PLA0005 (분자량 5000달톤), EDC, NHS 를 10㎖ 의 DMSO 에 녹여, 실온에서 2 시간 방치, PLA 의 카르복실기를 활성 에스테르화하였다. 한편, HA-HZ-TBA 를 20㎖ 의 DMSO 에 녹여, 이들을 혼합, 실온에서 하룻밤 방치하였다. 이 반응액을 DMSO 에 대하여 투석 (MWCO:25000, 실온, 10 일간) 함으로써 활성화 시약을 제거하고, 다음으로 물에 대하여 투석 (MWCO:12000-14000, 실온, 3 일간) 을 행하고, 얻어진 백탁 용액 (25K달톤의 HA 유래의 HA-PLA 를 함유하는 나노스피어 분산 용액) 을 동결 건조시켰다 (또한, 얻어진 백탁 용액에 대하여 GPC 으로 정량한 결과 HA-PLA:PLA 는 약 1:9 였다.). 미반응의 PLA 를 제거하기 위하여, 이 동결 건조품을 아세톤 중에 투입하고 불용물을 아세톤 세정, 건조시켜 HA-PLA 를 얻었다. 겔 침투 크로마토그래피 (GPC) 의 측정 데이터 (용매:DMSO) 를 도 5 에 나타낸다. 피크 위치로부터 HA-TBA 를 스탠다드로 분자량을 어림하면, PLA 의 결합에 의해, 분자량이 당초의 25K달톤에서 97K달톤으로 되어 있음이 확인되었다. 얻어진 HA-PLA 의 프로톤 NMR 을 도 6 에 나타낸다. HA-PLA 중의 PLA 도입률을 프로톤 NMR 법 (측정 용매:DMSO-d6) 으로 정량한 결과, HA 의 카르복실산의 43몰% 가 PLA 화되어 있었다 (HA:N-아세틸기, 1.5-1.9ppm, PLA:PLA:카르보닐기의 α 위치의 메틴프로톤 (단, OH 말단은 제외한다), 5.0-5.6ppm).
GPC 조건
용출액: DMSO 또는 5m㏖/L NaNO3 을 함유하는 DMSO
유속: 1.0㎖/분
검출기: RI, UV (280㎚)
칼럼: TOSOH TSKgel GMHHR-H
칼럼 온도: 40℃
샘플 실온: 25℃
샘플 농도: 10㎎/㎖, 50㎕
(실시예 2-2) 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 투석법에 의한 조제
실시예 2-1 의 순서에 있어서, 물에 대한 투석 후에 얻어지는 백탁 용액을 25K달톤의 HA 유래의 HA-PLA 를 함유하는 나노스피어 분산 용액으로서 사용하였다.
한편, 분자량이 190K달톤의 HA 를 사용하여, 당해 HA 를 0.5% 농도로 증류수에 용해시킨 것 이외에는 실시예 1-1 과 동일한 방법에 의해 HA-HZ 를 조제하고, 실시예 2-1 과 동일한 방법으로 조제한 DMSO 투석 후의 반응액을 물에 대하여 투석 (MWCO:25000, 실온, 3 일간) 하여, 190K달톤의 HA 유래의 HA-PLA 를 함유하는 나노스피어 분산 용액을 조제하였다.
얻어진 분산 용액은 모두 정제 조작 후에는 백탁되어 있었다 (침전물은 보이지 않았다). 이것을 100 배 희석하여 DLS (Nicomp370) 에 의해 입경을 측정한 결과, 190k달톤의 HA 를 사용한 것에서 263.8㎚, 25k달톤의 HA 를 사용한 것에서 243.8㎚ 였다. 얻어진 분산 용액을 4℃ 에서 1 개월간 보존해도 응집 침전물은 거의 없었다. 보존 1 개월 후의 사진을 도 7 및 도 8 에 SEM 사진을 도 10 및 도 11 에 나타낸다.
(실시예 2-3) 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 용매 확산법에 의한 조제
실시예 2-1 의 25k달톤의 HA 를 사용한 것 중, 아세톤 재침전에 의한 정제 전의 분산 용액 (HA-PLA:PLA 가 약 1:9) 을 동결 건조시킨 것, 및 아세톤 재침전 후의 HA-PLA 를 각각 20㎎ 을 칭량 채취하여, 1.0㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 4.0㎖ 의 물에 교반하면서 적하한 결과, 모두 연백색 반투명 용액이 되었다. 이 혼합 용액을 투석 튜브 (MWCO:12000-14000, Spectra/Por 4) 에 옮겨, 물에 대하여 투석을 행하였다 (실온, 3 일간). 얻어진 나노스피어 분산 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과 나노스피어의 입경은 정제 전의 것에서 17.6㎚, 정제 후의 것에서 15.2㎚ 였다. 또한, 이 나노스피어 분산 용액을 D2O 에 대하여 투석을 행하고 (4℃, 2 일간), 프로톤 NMR 측정 (JNM-ECP500 FT NMR SYSTEM, JOEL, 측정 용매:D2O) 을 행한 결과 (정제 전: 도 13, 정제 후: 도 14), 모두 HA-HZ 유래의 프로톤 피크가 확인된 점에서, 나노스피어의 표면이 HA 분자에 의해 피복되어 있음이 시사되었다.
〔실시예 3〕 디클로페낙 봉입 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제
(실시예 3-1) 조제방법
?용매 확산법
실시예 2-2 와 동일한 조작에 의해 조제한 25k달톤의 HA 유래의 HA-PLA 를 함유하는 나노스피어 분산 용액 (HA-PLA:PLA 가 약 1:9) 을 동결 건조시킨 것 40㎎ , 디클로페낙 (시그마사에서 구입한 것을 염산 재침전으로 H 형으로 이온 교환하고, 순수(純水)로 세정, 건조시킨 것) 10㎎ 을 각각 칭량 채취하고, 1.0㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 4.0㎖ 의 물에 교반하면서 적하한 결과 연백색 반투명 용액이 되었다. 이 혼합 용액을 투석 튜브 (MWCO:12000-14000, Spectra/Por 4) 에 옮겨, 물에 대하여 투석을 행하였다 (3 일, 실온). 얻어진 수용액을 원심 (1000rpm×10 분) 에 의해 침전과 상청을 분리, 상청을 회수하여, 동결 건조시켰다.
?투석법
실시예 2-2 와 동일한 조작에 의해 조제한 25K달톤의 HA 유래의 HA-PLA 를 함유하는 나노스피어 분산 용액 (HA-PLA:PLA 가 약 1:9) 을 동결 건조시킨 것 40㎎ , 디클로페낙 10㎎ 을 각각 칭량 채취하여, 1.0㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 투석 튜브 (MWCO:12000-14000, Spectra/Por 4) 에 옮겨, 물에 대하여 투석을 행한 결과, 즉시 백탁되고 침전도 생겼다 (3 일, 실온). 얻어진 수용액을 원심 (1000rpm×10 분) 에 의해 침전과 상청을 분리, 상청을 회수하여, 동결 건조시켰다.
(실시예 3-2) 나노스피어 중의 디클로페낙 정량
?표준용액의 조제
디클로페낙, 5.13㎎/㎖-아세토니트릴의 2 배 희석열 (6 열) 을 조제하였다 (A). 내부 표준 (IS) 용액으로서, n-헵틸4-히드록시벤조에이트, 2.60㎎/㎖-아세토니트릴 용액을 조제하였다 (B). 200㎕ (A) 와 20㎕ (B) 를 혼합하여, 디클로페낙 정량용 표준용액으로 하였다 (C).
?나노스피어로부터의 디클로페낙의 추출?샘플 조제
용매 확산법?투석법에 의해 조제한 나노스피어를 각각 4.91㎎, 5.45㎎ 칭량 채취하여, 1.0㎖ 의 아세토니트릴에 용해하였다. 충분히 교반한 후, 원심 (1500rpm×5 분) 함으로써, 샘플 중의 디클로페낙을 추출하고, 상청을 회수하였다 (D). 200㎕ (D) 와 20㎕ (B) 를 혼합하여, 디클로페낙 정량 샘플로 하였다 (E).
?RPHPLC 에 의한 디클로페낙의 정량
(C) 및 (E) 에 대하여 RPHPLC 측정을 행하고, IS 법에 의한 디클로페낙의 정량을 행하였다.
HPLC 조건
용출액: 0.1% TFA 60% MeCNaq
검출기: UV (280㎚)
칼럼: Intakt Cadenza CD-C18
유속: 1.0㎖/분
샘플 주입량: 10㎕
이 결과, 디클로페낙 봉입율은 용매 확산법으로 4.9중량%, 투석법으로 1.4중량% 였다.
〔비교예 1〕 PLA 나노스피어의 조제
(비교예 1-1) PLA 나노스피어의 조제
PLA 를 DMSO 에 녹이고 (0.316g/㎖ DMSO), 실시예 2-3 과 동일한 방법으로 물에 대하여 투석하였다. 백탁 수용액이 얻어졌으나, 침전물도 확인되었다. 분산 용액의 입경을 측정한 결과, 273.3㎚ 였다. 4℃ 에서 1 개월간 보존하였지만, 보존 1 일 후에 대부분이 응집 침전되었다. 보존 1 개월 후의 사진을 도 9 에, 동일 SEM 사진을 도 12 에 나타낸다. 입자가 응집되어 있음을 알 수 있다.
〔실시예 4〕 히드라지드기의 도입에 의한 스텔스성 히알루론산 수식물의 합성 및 기능 평가
(실시예 4-1) HZ 기가 도입된 히알루론산 (HA-HZ) 의 합성
HA (덴키카가쿠공업주식회사:점도평균분자량 25k달톤) 840㎎ 을 0.1% 농도로 증류수/EtOH=50/50 에 용해하였다. HA 의 유닛:EDC:ADH=1:4:40몰비가 되도록 첨가하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7～4.8 로 유지하면서 실온에서 2 시간 반응시켰다. 대과잉량의 100mM 염화나트륨 용액, 25% 에탄올 용액, 증류수에 대하여 순차적으로 투석 (MWCO:12000-14000) 하고, 동결 건조시켜 히드라지드기가 도입된 히알루론산 (HA-HZ) 86.6㎎ 을 얻었다. 얻어진 HA-HZ 의 D2O 중에서의 NMR 스펙트럼 측정 결과를 도 15 에 나타낸다. HZ 기 도입률을 ADH 도입률로 하여 프로톤 NMR 법으로 정량한 결과, HA 유닛 (2 당(糖)) 에 대하여 63.0% 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm, HZ:ADH 유래의 4 개의 메틸렌프로톤, 1.5, 2.1 및 2.25ppm).
(실시예 4-2) HA-HZ 의 효소 내성 평가
실시예 4-1 에서 얻어진 HA-HZ 를 0.5㎎/㎖ 농도로 0.1M 인산 완충액 (pH 6.2) 에 용해하였다. 이 용액 80㎕ 에 히알루로니다아제 SD (세이카가쿠공업주식회사 제조) 0.5U/㎖ 용액 32㎕ 를 첨가하여 37℃ 에서 24 시간 인큐베이트하였다. 대조로서 효소 비첨가군도 동일하게 행하였다 (데이터 생략). 각각 겔 침투 크로마토그래피 (이하, GPC 라고도 함) 에 제공하여 HA-HZ 의 분자량의 변화, 분해산물의 생성 패턴을 관찰하였다. GPC 의 조건을 이하에 나타낸다.
GPC 조건
GPC 칼럼: Superdex 200 10/300GL, Superdex 75 HR 10/30, Superdex Peptide HR 10/30 (모두 아마샴바이오사이언스주식회사 제조)(3 개 연결)
이동상: PBS (pH 7.4)
용출 모드: 동용매
유속: 0.4㎖/분
샘플 주입량: 50㎕
검출기: UV, Abs. at 232㎚
효소 분해산물의 GPC 프로파일을 도 16 에 나타내었다. 검토에 있어서의 GPC 조건 하, HA-HZ 의 피크 톱은 유지시간 약 75 분에, 효소 분해산물인 2 당은 유지시간 약 130 분에 관찰된다.
실시예 4-1 에서 얻어진 시료는, 효소 분해에 의한 분자량의 저하가 현저히 억제되었음이 나타났다.
(실시예 4-3) 약물 동태 시험을 위한 FITC 화 HA-HZ 의 합성
실시예 4-1 에서 얻어진 HA-HZ (38.9㎎) 를 2.0㎎/㎖ 의 농도로 50mM 탄산 완충액 (pH 9.0) 에 용해하였다. HA 의 유닛에 대하여 0.15몰배의 플루오레세인이소티오시아네이트 (이하, FITC 라고도 함)(피어스사 제조) 를 HA-HZ 용액의 1/10 용량의 디메틸술폭사이드 (이하, DMSO 라고도 함) 용액으로서 첨가하여 실온에서 1 시간 교반하였다. 탈염 칼럼 PD-10 (아마샴바이오사이언스사 제조) 으로 미반응의 FITC 를 제거한 후, HA 의 유닛에 대하여 40몰배의 무수숙신산 (와코쥰야쿠공업사 제조) 을 PD-10 로 조정제한 용액의 1/10 용량의 DMSO 용액으로 하여 첨가하였다. 실온에서 1 시간 교반하여 반응시킨 후, 대과잉량의 물에 대하여 투석하여 정제하고, 동결 건조시켜 실시예 4-1 의 HA-HZ 를 FITC 표지한 형광 표지 HA-HZ (380㎎) 를 얻었다.
이렇게 해서 얻어진 형광 표지 HA-HZ 를 0.25㎎/㎖ 의 농도로 50mM 탄산 완충액 (pH 9.0) 에 용해하고, 그 용액의 494㎚ 에 있어서의 흡광도로부터 FITC 농도를 정량하고, 이하의 연립방정식을 풀어 각 유닛의 농도를 산출하였다. 또한, 몰분률로의 변환, HA 수식물 중의 HA 유래의 중량분률 산출을 행하였다.
미수식 HA 유닛: x ㎚o1/㎖
HA-SUC 유닛: y ㎚o1/㎖ (잔존 HZ 가 무수숙신산 처리된 유닛)
식 1: (379.3×x)+(635.57×y)+(924.88×(FITC 농도))=250㎎
식 2: x/(y+(FITC 농도))=(100-HZ(%))/HZ(%)
실시예 4-3 의 형광 표지 HA-HZ 는 HZ 63%, FITC 1.5% 의 도입률임이 나타났다.
(실시예 4-4) 약물 동태 시험에 의한 스텔스성 평가
?HA 투여 래트 혈장 샘플
실시예 4-3 의 형광 표지 HA 유도체를 히알루론산 환산 10㎎/kg 의 용량으로 래트 정맥내에 단회 투여하고, 투여 전 및 투여 후 0.25, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 54 시간에 채혈 (헤파린 처리) 하고, 원심분리에 의해 혈장을 얻었다. 이 혈장 샘플은 측정까지 -20℃ 이하에서 동결 보존하였다.
?측정방법
GPC 에 의해 검량선용 표준시료 및 측정용 시료의 분석을 행한다. 이하 에 조건을 나타낸다.
GPC 조건
GPC 칼럼: TSKgel G6000PWXL
이동상: PBS (pH 7.4)
용출 모드: 동용매
유속: 0.5㎖/분
샘플 주입량: 40㎕
검출기: 형광 (EX:490, EM:518)
?검량선용 시료: 각 형광 표지 HA 유도체를 PBS (pH 7.4) 로 희석하고, 1, 5, 10, 50, 100, 500㎍/㎖ 및 0㎍/㎖ (대조, PBS (pH 7.4)) 의 표준액을 조제한다. 이 표준액에 등용량의 정상 래트 혈장을 첨가하여 검량선용 시료를 조제하였다.
?측정용 시료의 조제: HA 수식물 투여 래트 혈장 샘플에 등용량의 PBS (pH 7.4) 를 첨가하여 측정용 시료를 조제하였다.
?혈장 중의 HA 수식물 농도의 산출: 해석 소프트 Millenium 을 사용하여 피크 면적을 산출하였다. 각 표준시료의 피크 면적에서 얻어진 검량선으로부터 혈장 중의 HA 수식물 농도를 산출하였다.
?약물 동태 데이터
실시예 4-3 의 형광 표지 HA 유도체의 혈중 농도 추이의 데이터에 대하여, WinNonlin Ver 3.3 (Pharsight 사) 로 약물 동태학적 파라미터를 산출하였다. 각 개체의 최종 측정점 3 점의 데이터를 사용하여 모델 비의존적 해석을 행하여, 반감기 (t1/2), 평균 혈중체류시간 (MRT) 을 산출하였다. 산출한 약물 동태학적 파라미터를 표 1 에 나타낸다.
FITC 표지화 HA 유도체의 약물 동태학적 파라미터
HAMw
(k달톤)		 HZ
(%:NMR)		 Cl
(㎖/hr/㎏)		 MRT(h) t1/2(h)
실시예 4-3 25 63 4.03±0.3 32.8±1.7 25.2±2.0
형광 표지 HA 유도체를 사용한 약물 동태시험에 의해, 히드라지드기를 도입한 HA 유도체는, 미수식 HA 와 비교하여, 래트 단회 정맥내 투여 후의 혈중체류시간이 개선됨이 확인되었다. 미수식의 HA 의 혈중 반감기 (t1/2) 는 수 분 정도인 데 대하여, 히드라지드기를 도입함으로써 혈중 반감기가 25.2±2.0 (시간) 이 되었다.
〔실시예 5〕아미노기의 도입에 의한 스텔스성 히알루론산 수식물의 합성?기능 평가
(실시예 5-1) AM 기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 의 합성-1
테트라부틸암모늄 (TBA) 염화한 DOWEX 50WX8-400 (알드리치사 제조) 을 사용하여 TBA 염화한 HA-TBA (HA:덴키카가쿠공업주식회사:점도평균분자량 19k달톤) 305.2㎎ 을 2㎎/㎖ 농도로 DMSO 에 용해하였다. HA 의 유닛:BOP (와코쥰야쿠공업사 제조):에틸렌디아민 (EDA)(시그마-알드리치사 제조)=1:1.1:50몰비가 되도록 EDA, BOP 의 순서로 첨가하고, 실온 하에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후 80㎖ 를 분취하고, 1M NaCl 수용액을 1/2 양의 40㎖ 첨가한 후, 5N HCl 로 pH 3 까지 저하시키고, 다시 2N NaOH 로 중화를 행하였다. 대과잉량의 물에 대하여 투석 정제하여 (스펙트라 포어 7, MWCO:12000-14000달톤), 한외 여과 후, 동결 건조시켜 표제의 아미노기가 도입된 히알루론산 110㎎ 을 얻었다. 얻어진 HA-AM 의 D2O 중에서의NMR 스펙트럼 측정 결과를 도 17 에 나타낸다.
HZ 기 도입률을 AM 도입률로 하여 프로톤 NMR 법으로 정량한 결과, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 94.0% 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm, AM:EDA 유래의 1 개의 메틸렌프로톤, 2.98ppm). 또한, NMR 측정은 NMR 분광계로서 JNM-ECA500 (500㎒ 분광계) 을 사용하여, 실시예 4-1 과 동일한 조건 (파라미터) 에서 측정을 행하였다.
(실시예 5-2) AM 기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 의 합성-2
TBA 염화한 HA-TBA (HA:덴키카가쿠공업주식회사:점도평균분자량 200k달톤) 를 사용하여, HA 의 유닛:BOP:에틸렌디아민(EDA)=1:1.08:50 의 몰비 이외에는 실시예5-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 을 얻었다. 프로톤 NMR 법 (측정 용매:D2O) 으로 정량한 결과, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 68.0% 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.89ppm, HZ:AM 유래의 1 개의 메틸렌프로톤, 3.00ppm).
(실시예 5-3) AM 기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 의 합성-3
HA 의 유닛 BOP:2,2-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민)(EDOBEA)(시그마-알드리치사 제조)=1:1.0:50 의 몰비 이외에는 실시예 5-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 을 얻었다. 프로톤 NMR 법 (측정 용매:D2O) 으로 정량한 결과, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 58.0% 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.89ppm, HZ:AM 유래의 1 개의 메틸렌프로톤, 3.05ppm).
(실시예 5-4) HA-AM 의 효소 내성 평가
실시예 5-1～5-3 에서 얻어진 HA-AM 을 2㎎/㎖ 농도로 물에 용해하였다. 이 용액 55㎕ 에 0.2M 인산 완충액 (pH 6.2) 132㎕ 및 물 77㎕ 를 첨가하고, 히알루로니다아제 SD (세이카가쿠공업주식회사 제조) 1U/㎖ 용액 (0.01% BSA 를 함유하는 0.05M 인산 완충액 (pH 6.2)) 44㎕ 를 첨가하여 37℃ 에서 24 시간 인큐베이트하였다. 대상으로서 효소 비첨가군도 동일하게 행하였다 (데이터 생략). 각각 겔 침투 크로마토그래피 (이하, GPC 라고도 함) 에 제공하여 HA-AM 의 분자량의 변화, 분해산물의 생성 패턴을 관찰하였다. 또한, GPC 는 실시예 4-2 와 동일한 조건 (파라미터) 에서 측정을 행하였다.
효소 분해산물의 GPC 프로파일을 도 18 에 나타내었다. 본 검토에 있어서의 GPC 조건 하, 효소 분해산물인 2 당은 유지시간 약 130 분에 관찰된다. 실시예 5-1～5-3 에서 얻어진 시료는, 효소 분해에 의한 분자량의 저하가 현저히 억제되었음이 나타났다.
〔실시예 6〕 PLA 가 도입된 히알루론산의 합성?용해성 평가
(실시예 6-1) HZ 기가 도입된 히알루론산 (HA-HZ) 의 TBA 염화
실시예 4-1 과 동일한 방법으로 얻어진 HA-HZ 1000㎎ 을 1000㎖ 의 증류수에 녹이고 (0.1% 농도), H 형으로 한 양이온 교환 수지 (Dowex 50WX8-400, 2.1meq/g) 37.5㎖ 를 첨가 (HA 의 카르복실기의 100 배의 이온 교환능) 실온에서 하룻밤 방치하였다. 상청을 회수, 0.22㎛ 필터로 여과한 후, 40wt% TBA-OH 수용액을 1.85㎕ 첨가함으로써, pH 7.0 로 조정하고, 얻어진 수용액을 동결 건조시킴으로써 TBA 염화 HA-HZ 의 백색 분말을 얻었다. 수량은 932.8㎎ 이었다.
(실시예 6-2) PLA (점도평균분자량 5k달톤) 가 도입된 히알루론산 (HA-HZ-PLA) 의 합성
PLA 농도 25㎎/㎖, PLA/EDC/NHS=1/1/1 (몰비) 가 되도록, PLA-0005 (와코쥰야쿠공업:점도평균분자량 5k달톤, 수평균분자량 2.83k달톤), EDC, NHS 를 무수 DMSO 에 녹여, 밀봉마개 하, 실온에서 3 시간 교반함으로써, PLA 의 말단 카르복실기를 활성 에스테르화하였다. 한편, 실시예 6-1 에서 조제한 TBA 염화 HA-HZ 를 5㎎/㎖ 가 되도록 무수 DMSO 에 녹였다. TBA 염화 HA-HZ 용액에 무수 DMSO, 활성 에스테르화 PLA 용액을 표 2(a～j) 에 나타내는 비율로 순차적으로 첨가하고 (최종적인 TBA 염화 HA-HZ 농도, 1.5㎎/㎖), 이들을 혼합, 밀봉마개 하, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 이 반응액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:12000-14000, 실온, 3 일간) 을 행하고, 얻어진 백탁 용액을 동결 건조시켰다. 이 동결 건조물을 과잉의 아세톤으로 세정, 다음에 과잉의 에탄올로 세정하여 불용물을 감압 건조시켜 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 얻었다. DMSO 를 용매로 하였을 때의 GPC 크로마토그램을 도 19 에 나타낸다. GPC 의 조건은 이하에 나타내는 바와 같다.
GPC 조건
GPC 칼럼: GMHHR-H (TOSOH 제조)
이동상: 10mM NaNO3 (pH 7.4)
용출 모드: 동용매
유속: 1.0㎖/분
샘플 주입량: 50㎕
검출기: UV, Abs. at 280㎚
샘플 농도: 5.0㎎/㎖
피크 위치가 고분자측으로 시프트되어 있어 PLA 가 도입됨으로써 분자량이 증가되었음이 시사되었다. 얻어진 HA-HZ-PLA 의 DMSO-d6 중에서의 프로톤 NMR 을 도 20 에 나타낸다. HA-HZ-PLA 중의 PLA 도입률을 NMR 법으로 정량한 결과, 표 3 에 나타내는 바와 같이, PLA 의 분자량 분포가 원료와 도입된 것에서 변하지 않는다고 가정한 경우, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 1.0～46.1% 였다. 또한 HA-HZ-PLA 분자 중의 PLA 의 중량비는 5.7～73.4%w/w 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm;PLA:카르보닐기의 α 위치의 메틴프로톤 (단, OH 말단은 제외한다), 5.0-5.6ppm).
Figure 112006011122164-pct00008
Figure 112006011122164-pct00009
(실시예 6-3) PLA (점도평균분자량 20k달톤) 가 도입된 히알루론산 (HA-HZ-PLA) 의 합성
실시예 6-2 의 PLA-0005 를 PLA-0020 (와코쥰야쿠공업:점도평균분자량 20k달톤, 수평균분자량 8.73k달톤) 으로 변경, TBA 염화 HA-HZ 용액과 무수 DMSO, 활성 에스테르화 PLA 용액의 혼합비를 표 4(k～t) 로 변경하고, 기타는 실시예 6-2 와 동일한 방법으로 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 얻었다. 이 때의 GPC 크로마토그램을 도 21 에, 프로톤 NMR 을 도 22 에 나타낸다. HA-HZ-PLA 중의 PLA 도입률을 NMR 법 (측정 용매: DMSO-d6) 으로 정량한 결과 표 5 에 나타내는 바와 같이, PLA 의 분자량 분포가 원료와 도입된 것에서 변하지 않는다고 가정한 경우, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 0.9～12.8% 였다. 또한 HA-HZ-PLA 분자 중의 PLA 의 중량비는 13.5～69.9%w/w 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm;PLA:카르보닐기의 α 위치의 메틴프로톤 (단, OH 말단은 제외한다), 5.0-5.6ppm).
Figure 112006011122164-pct00011
(실시예 6-4) HA-HZ-PLA 의 물 및 DMSO 에 있어서의 분산성 또는 용해성
실시예 4-1 과 동일한 방법으로 얻어진 HA-HZ, 실시예 6-2, 및 실시예 6-3 에 있어서 합성한 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 각각 약 5㎎ 칭량 채취하여, 5㎎/㎖ 가 되도록 증류수를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 교반을 정지시키고, 그 후 3 일간 실온에 있어서 정치하였을 때의 외관을 육안에 의해 확인한 결과를 표 6 에 나타낸다. 이 결과, HA-HZ-PLA 는 PLA 의 중량비 5.7～19.6%w/w 의 범위에 있어서 물에 균일하게 분산되기 쉽고, 이 이상의 PLA 중량비에 있어서는 물에 분산되기 어려움이 시사되었다. 또한, 침전물이 보이지 않은 것에 대해서는, 각각의 용액을 원심 (1500g, 10 분) 한 결과, HA-HZ 수용액을 제외하고, 모두 백색의 침전물이 보였다. 이 결과, HA-HZ-PLA 는 실시예 6-2 및 6-3 에서 실시한 범위 (PLA 의 중량비 5.7～73.4%w/w) 에 있어서 수 중에 용해되기 어렵고, 또한 분산되더라도 그 분산 안정성은 낮음이 시사되었다.
다음으로, 실시예 4-1 과 동일한 방법으로 얻어진 HA-HZ, 실시예 6-2, 및 실시예 6-3 에 있어서 합성한 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 각각 약 5㎎ 칭량 채취하여, 5㎎/㎖ 가 되도록 DMSO 를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 그 때의 용해성을 육안에 의해 확인한 결과를 표 6 에 나타낸다. 그 결과, HA-HZ-PLA 는 적어도 PLA 의 중량비 5.7～73.4%w/w 의 범위에 있어서 DMSO 에 용해성을 가짐이 시사되었다.
실시예 6-2 및 6-3 에서 얻은 HA-HZ-PLA 의 용액 또는 분산액의 외관
샘플 PLA 중량비(%W/W) 수용액(5mg/mL)
외관(교반후, 정치)		 수용액(5mg/mL)
외관(원심후)		 DMSO용액(5mg/mL)
외관
HA-HZ 0.0 무색투명 무색투명 무색투명
a 5.7 연백색 연백색(백색침전물 있음) 무색투명
b 10.6 연백색 연백색(백색침전물 있음) 무색투명
c 19.6 연백색 연백색(백색침전물 있음) 무색투명
d 30.0 연백색(백색침전물 있음) - 무색투명
e 42.5 연백색(백색침전물 있음) - 무색투명
f 44.6 연백색(백색침전물 있음) - 무색투명
g 50.4 연백색(백색침전물 있음) - 무색투명
h 55.3 연백색(백색침전물 있음) - 무색투명
i 67.9 무색투명(백색침전물 있음) - 무색투명
j 73.4 무색투명(백색침전물 있음) - 무색투명
k 13.5 연백색 연백색(백색침전물 있음) 무색투명
l 17.2 연백색 연백색(백색침전물 있음) 무색투명
m 23.4 연백색(백색침전물 있음) - 무색투명
n 33.2 연백색(백색침전물 있음) - 무색투명
o 41.2 연백색(백색침전물 있음) - 무색투명
p 47.2 무색투명(백색침전물 있음) - 무색투명
q 49.9 무색투명(백색침전물 있음) - 무색투명
r 54.5 무색투명(백색침전물 있음) - 무색투명
s 63.7 무색투명(백색침전물 있음) - 무색투명
t 69.9 무색투명(백색침전물 있음) - 무색투명
(실시예 6-5) 용매 치환에 의한 HA-HZ-PLA 의 물에 대한 가용화
실시예 4-1 과 동일한 방법으로 얻어진 HA-HZ, 실시예 6-2, 및 실시예 6-3 에 있어서 합성한 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 각각 약 5㎎ 칭량 채취하여, 5㎎/㎖ 가 되도록 DMSO 에 용해시켰다. 이 DMSO 용액 0.6㎖ 를 2.4㎖ 의 증류수에 혼합하고, 추가로 증류수에 대하여 투석 (MWCO:12000-14000, 실온, 3 일간) 한 결과, 얻어진 수용액은 전부 무색 투명 용액이었다. 이 수용액을 원심 (40000g, 10 분) 한 결과 침전물은 보이지 않았다. 이 결과, HA-HZ-PLA 는 PLA 의 중량비5.7～73.4%w/w 의 범위에 있어서, 일단 DMSO 에 용해시키고, 그 후 용매를 물로 치환함으로써 물에 용해시킬 수 있음이 시사되었다.
〔실시예 7〕히알루론산 피복 PLA (PLGA) 미립자 조제법 검토를 위한, PLA 가 도입된 히알루론산 수식물의 합성
(실시예 7-1) 인택트 HA 의 기능을 잔존시킨 HA-HZ 의 합성
HA (덴키카가쿠공업주식회사: 점도평균분자량 23k달톤) 1012.7㎎ 을 0.1% 농도로 증류수/EtOH=50/50 에 용해시켰다. HA 의 유닛:EDC:ADH=1:0.1:40몰비가 되 도록 첨가하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7～4.8 로 유지하면서 실온에서 2 시간 반응시켰다. 대과잉량의 100mM 염화나트륨 용액, 25% 에탄올 용액, 증류수에 대하여 순차적으로 투석 (MWCO:12000-14000) 하였다. HZ 기 도입률 측정용으로 10㎖ 정도 동결 건조시켰다. HZ 기 도입률을 ADH 도입률로 하여 프로톤 NMR 법 (측정 용매:D2O) 으로 정량한 결과, HA 유닛 (2 당) 에 대하여, 9.0% 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm, HZ:ADH 유래의 4 개의 메틸렌프로톤, 1.5, 2.1 및 2.25ppm).
(실시예 7-2) 인택트 HA 의 기능을 잔존시킨 HA-HZ 의 TBA 염화
실시예 7-1 에서 조제한 HA-HZ 수용액 (약 0.1% 농도) 에, H 형으로 한 양이온 교환 수지 (Dowex 50WX8-400, 2.1meq/g) 50㎖ 를 첨가, 실온에서 하룻밤 방치하였다. 상청을 회수, 0.22㎛ 필터로 여과한 후, 40wt% TBA-OH 수용액을 1150㎕ 첨가함으로써, pH7.0 로 조정하고, 얻어진 수용액을 동결 건조시킴으로써 TBA 염화 HA-HZ 의 백색 분말을 얻었다. 수량은 1113.6㎎ 이었다.
(실시예 7-3) PLA (5k달톤) 가 도입된 인택트 HA 의 기능을 잔존시킨 히알루론산 (HA-HZ-PLA) 의 합성
실시예 7-2 에서 조제한 TBA 염화 HA-HZ 를 사용하여, 실시예 6-2 의 TBA 염화 HA-HZ 용액과 무수 DMSO, 활성 에스테르화 PLA 용액의 혼합비를 표 7 로 변경하고, 기타는 실시예 6-2 와 동일한 방법으로 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 얻었다. HA-HZ-PLA 중의 PLA 도입률을 NMR 법 (측정 용매: DMSO-d6) 으로 정량한 결과, PLA 의 분자량 분포가 원료와 도입된 것에서 변하지 않는다고 가정한 경우, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 8.0% 였다. 또한 HA-HZ-PLA 분자 중의 PLA 의 중량비는 36.7%w/w 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm;PLA:카르보닐기의 α 위치의 메틴프로톤 (단, OH 말단은 제외한다), 5.0-5.6ppm).
(실시예 7-4) PLA (20k달톤) 가 도입된 인택트 HA 의 기능을 잔존시킨 히알루론산 (HA-HZ-PLA) 의 합성
실시예 7-2 에서 조제한 TBA 염화 HA-HZ 를 사용하여, 실시예 6-2 의 PLA-0005 를 PLA-0020 로 변경, TBA 염화 HA-HZ 용액과 무수 DMSO, 활성 에스테르화 PLA 용액의 혼합비를 표 7 로 변경하고, 기타는 실시예 6-2 와 동일한 방법으로 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 얻었다. HA-HZ-PLA 중의 PLA 도입률을 NMR 법 (측정 용매:DMSO-d6) 으로 정량한 결과, PLA 의 분자량 분포가 원료와 도입된 것에서 변하지 않는다고 가정한 경우, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 1.9% 였다. 또한 HA-HZ-PLA 분자 중의 PLA 의 중량비는 29.5%w/w 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85 ppm;PLA:카르보닐기의 α 위치의 메틴프로톤 (단, OH 말단은 제외한다), 5.0-5.6ppm).
(실시예 7-5) PLA (5k달톤) 가 낮은 도입률로 도입된 스텔스성 히알루론산 (HA-HZ-PLA) 의 합성
실시예 6-1 과 동일한 방법으로 조제한 TBA 염화 HA-HZ 를 사용하여, 실시예 6-2 의 TBA 염화 HA-HZ 용액과 무수 DMSO, 활성 에스테르화 PLA 용액의 혼합비를 표 7 로 변경하고, 기타는 실시예 6-2 와 동일한 방법으로 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 얻었다. HA-HZ-PLA 중의 PLA 도입률을 NMR 법 (측정 용매: DMSO-d6) 으로 정량한 결과, PLA 의 분자량 분포가 원료와 도입된 것에서 변하지 않는다고 가정한 경우, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 4.5% 였다. 또한 HA-HZ-PLA 분자 중의 PLA 의 중량비는 21.1%w/w 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm;PLA:카르보닐기의 α 위치의 메틴프로톤 (단, OH 말단은 제외한다), 5.0-5.6ppm)
(실시예 7-6) PLA (5k달톤) 가 높은 도입률로 도입된 스텔스성 히알루론산 (HA-HZ-PLA) 의 합성
실시예 6-1 과 동일한 방법으로 조제한 TBA 염화 HA-HZ 를 사용하여, 실시예 6-2 의 TBA 염화 HA-HZ 용액과 무수 DMSO, 활성 에스테르화 PLA 용액의 혼합비를 표 7 로 변경하고, 기타는 실시예 6-2 와 동일한 방법으로 HA-HZ-PLA 의 백색 분말을 얻었다. HA-HZ-PLA 중의 PLA 도입률을 NMR 법 (측정 용매: DMSO-d6) 으로 정량한 결과, PLA 의 분자량 분포가 원료와 도입된 것에서 변하지 않는다고 가정한 경우, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 30.9% 였다. 또한 HA-HZ-PLA 분자 중의 PLA 의 중량비는 65.1%w/w 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm;PLA:카르보닐기의 α 위치의 메틴프로톤 (단, OH 말단은 제외한다), 5.0-5.6ppm).
Figure 112006011122164-pct00012
Figure 112006011122164-pct00013
(실시예 7-7) PLA (5k달톤) 가 높은 도입률로 도입된 스텔스성 히알루론산 (HA-AM-PLA) 의 합성
실시예 5-1 과 동일한 방법으로 얻어진 HA-AM 의 DMSO 용액을 DMSO 1ℓ 에 대하여 투석을 4 회 행하여 (MWCO:12000-14000, 실온) 미반응 EDA, BOP 등의 불순물을 제거하였다.
또한, PLA 농도 10㎎/㎖, PLA/EDC/NHS=1/1/1 (몰비) 이 되도록, PLA-0005 (와코쥰야쿠공업:점도평균분자량 5k달톤, 수평균분자량 2.83k달톤), EDC, NHS 를 무수 DMSO 에 녹여, 실온에서 20 분 교반함으로써, PLA 의 말단 카르복실기를 활성 에스테르화하였다.
이 활성 에스테르 용액을 HA-AM 의 아미노기에 대하여 카르복실산이 2 배량이 되도록 첨가하여, 실온에서 하룻밤 교반하였다.
이 반응액을 DMSO 에 대하여 투석 (MWCO:12000-14000, 실온, 2 일간) 을 4 회, 물에 대하여 5 회 행하고, 얻어진 백탁 용액을 동결 건조시켰다. 이 동결 건조물을 과잉의 아세톤으로 세정, 다음으로 과잉의 에탄올로 세정하고 불용물을 감압 건조시켜 HA-AM-PLA 의 백색 분말 365.1㎎ 을 얻었다.
얻어진 HA-AM-PLA 의 DMSO-d6 중에서의 프로톤 NMR 을 도 23 에 나타낸다. HA-AM-PLA 중의 PLA 도입률을 NMR 법 (측정 용매: DMSO-d6) 으로 정량한 결과, PLA 의 분자량 분포가 원료와 도입된 것에서 변하지 않는다고 가정한 경우, HA 유닛 (2 당) 에 대하여 87.2% 였다. 또한 HA-AM-PLA 분자 중의 PLA 의 중량비는 86.1%w/w 였다 (HA:N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.85ppm;PLA:카르보닐기의 α 위치의 메틴프로톤 (단, OH 말단은 제외한다), 5.0-5.6ppm)
〔실시예 8〕히알루론산 피복 PLA (PLGA) 미립자 조제법 검토를 위한 HA-HZ-PLA 수용액의 조제
(실시예 8-1) HA-HZ-PLA 수용액의 조제
실시예 7-3 에 있어서 합성한 HA-HZ-PLA 를 250㎎ 칭량 채취하여, 40㎎/㎖ 가 되도록 증류수를 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반함으로써, 용해시켰다. 얻어진 수용액은 아주 엷게 백색을 띤 투명 용액이었다.
(실시예 8-2) DMSO 용매 확산법에 의한 HA-HZ-PLA 수용액의 조제-1
실시예 7-4 에서 합성한 HA-HZ-PLA 를 250㎎ 칭량 채취하고, 5.0㎎/㎖ 가 되도록 DMSO 를 첨가하여, 용해시켰다. 이것을 첨가한 DMSO 의 4 배량의 증류수에 대하여 혼합한 후, 증류수에 대하여 투석 (MWC0:10000, 실온, 1 일간) 하였다. 얻어진 수용액은 무색 투명 용액이었다. 이 수용액을 5.0㎛ 의 필터로 여과한 후, 한외 여과 (Vivaspin20 MWCO:10000, Vivascience) 에 의해 농축하였다. 농도 정량은 얻어진 농축 용액 200㎕ 를 동결 건조시켜, 건조 분말의 중량을 측정함으로써 행한 결과 5.7㎎/㎖ 이고, 추가로 2.0㎎/㎖ 가 되도록 증류수를 첨가하여, 잘 혼합하였다.
(실시예 8-3) DMSO 용매 확산법에 의한 HA-HZ-PLA 수용액의 조제-2
실시예 7-5 에서 합성한 HA-HZ-PLA 를 150㎎ 칭량 채취하고, 5.0㎎/㎖ 가 되도록 DMSO 를 첨가하여, 용해시켰다. 이것을 첨가한 DMSO 의 4 배량의 증류수에 대하여 혼합한 후, 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하였다. 얻어진 수용액은 무색 투명 용액이었다. 이 수용액을 5.0㎛ 의 필터로 여과한 후, 한외 여과 (Vivaspin20 MWCO:10000, Vivascience) 에 의해 농축하였다. 농도 정량은 얻어진 농축 용액 200㎕ 를 동결 건조시켜, 건조 분말의 중량을 측정함으로써 행한 결과, 7.2㎎/㎖ 이고, 추가로 2.0㎎/㎖ 가 되도록 증류수를 첨가하여, 잘 혼합하였다.
(실시예 8-4) DMSO 용매 확산법에 의한 HA-HZ-PLA 수용액의 조제-3
실시예 7-6 에서 합성한 HA-HZ-PLA 를 150㎎ 칭량 채취하고, 5.0㎎/㎖ 가 되도록 DMSO 를 첨가하여, 용해시켰다. 이것을 첨가한 DMSO 의 4 배량의 증류수에 대하여 혼합한 후, 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하였다. 얻어진 수용액은 무색 투명 용액이었다. 이 수용액을 5.0㎛ 의 필터로 여과한 후, 한외 여과 (Vivaspin20 MWCO:10000, Vivascience) 에 의해 농축하였다. 농도 정량은 얻어진 농축 용액 200㎕ 를 동결 건조시켜, 건조 분말의 중량을 측정함으로써 행한 결과, 6.5㎎/㎖ 이고, 추가로 2.0㎎/㎖ 가 되도록 증류수를 첨가하여, 잘 혼합하였다.
(실시예 8-5) DMSO 용매 확산법에 의한 HA-AM-PLA 수용액의 조제
실시예 7-7 에서 합성한 HA-AM-PLA 를 20㎎ 칭량 채취하고, 5.0㎎/㎖ 가 되도록 DMSO 를 첨가하여, 용해시켰다. 이것을 첨가한 DMSO 의 4 배량의 증류수에 대하여 혼합한 후, 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하였다. 얻어진 수용액은 무색 투명 용액이었다. 이 수용액을 5.0㎛ 의 필터로 여과한 후, 한외 여과 (Vivaspin20 MWCO:10000, Vivascience) 에 의해 농축하였다. 농도 정량은 얻어진 농축 용액 200㎕ 를 동결 건조시켜, 건조 분말의 중량을 측정함으로써 행한 결과, 10.4㎎/㎖ 이고, 추가로 2.0㎎/㎖ 가 되도록 증류수을 첨가하여, 잘 혼합하였다.
〔실시예 9〕 CD44 에 대한 타겟팅을 목적으로 한 히알루론산 피복 PLA (PLGA) 미립자의 조제
(실시예 9-1) DMSO 투석법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제
실시예 7-4 에서 합성한 HA-HZ-PLA 를 12㎎, PLA-0005 를 108㎎ 칭량 채취하여, 3㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간), 투석액을 32㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하고 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 53.2㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 153㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.29%w/w) 이었다. 입경의 측정은 히알루론산 피복 PLA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 1.0±0.1㎛ 였다.
(실시예 9-2) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-1
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 8-1 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간), 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 140㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 60㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.43%w/w) 이었다. 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 225.3㎚ 였다.
(실시예 9-3) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-2
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 4㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하였다. 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 실시예 8-1 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 23.9㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 22㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.09%w/w) 이었다. 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 308.9㎚ 였다.
(실시예 9-4) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-3
실시예 7-4 에서 합성한 HA-HZ-PLA 를 4㎎, PLA-0005 를 36㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 4㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하고, 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 3.7㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 70㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 1.89%w/w) 이었다. 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 288.2㎚ 였다.
(실시예 9-5) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-4
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 8-2 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간), 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 16.7㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 1㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.01%w/w) 이었다. 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 220.2㎚ 였다.
(실시예 9-6) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-5
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 4㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하였다. 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 실시예 8-2 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 26.3㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 7㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.03%w/w) 이었다. 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 196.9㎚ 였다.
(실시예 9-7) 아세톤 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-1
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 8-1 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 14.5㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 104㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.72%w/w) 이었다. 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 367.8㎚ 였다.
(실시예 9-8) 아세톤 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-2
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 4㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 실시예 8-1 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 20.1㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 99㎍ 미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.49%w/w) 이었다. 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 336.9㎚ 였다.
(실시예 9-9) 아세톤 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-3
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 8-2 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 20.9㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 18㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.09%w/w) 이었다. 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 328.3㎚ 였다.
(실시예 9-10) 아세톤 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 미립자의 조제-4
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 4㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 실시예 8-2 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 22.9㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 27㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.12%w/w) 이었다. 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 328.1nm 였다.
(실시예 9-11) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 조제-1
PLGA-7520 (와코쥰야쿠공업: 점도평균분자량 20k달톤, 락티드(Lactide) 비 75%㏖/㏖) 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 실시예 8-1 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 회전식 호모게니저 (폴리트론 PT3100) 를 사용하여 유화 (10000rpm, 5 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 32㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 62.1㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 675㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 1.09%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 2.7±1.1㎛ 였다.
(실시예 9-12) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 조제-2
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 8㎖ 의 1%w/v PVA 수용액과 혼합하여, 회전식 호모게나이저 (폴리트론 PT3100) 를 사용하여 유화 (10000rpm, 5 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 32㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물로서 얻어진 PLGA 미립자와 실시예 8-1 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 다시 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 61.3㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 140㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.23%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균값 및 표준편차를 구한 결과, 1.2±0.2㎛ 였다.
(실시예 9-13) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 조제-3
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 실시예 8-2 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 회전식 호모게나이저 (폴리트론 PT3100) 를 사용하여 유화 (10000rpm, 5 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 32㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 55.0㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하고 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 251㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.46%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 3.0±1.2㎛ 였다.
(실시예 9-14) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 조제-4
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 8㎖ 의 1%w/v PVA 수용액과 혼합하여, 회전식 호모게나이저 (폴리트론 PT3100) 를 사용하여 유화 (10000rpm, 5 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 32㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물로서 얻어진 PLGA 미립자와 실시예 8-2 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 다시 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 56.3㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 608㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 1.08%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 1.7±0.4㎛ 였다.
〔비교예 2〕 PLGA 미립자의 조제
(비교예 2-1) 에멀션액중 건조법에 의한 PLGA 미립자의 조제
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 18㎖ 의 1%w/v PVA 수용액과 혼합하여, 회전식 호모게나이저호모게나이저 PT3100) 를 사용하여 유화 (10000rpm, 5 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 32㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 57.3㎎ 이었다. 입경의 측정은, PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 1.7±0.3㎛ 였다.
실시예 9 에 있어서 조제한 미립자의 조제 방법, 조제 조건, 조제 결과
미립자조제방법 유기상 HA-HZ-PLA
PLA의
중량비(%W/W)		 HA피복방법(HA-HZ-PLA의 사용방법) 미립자 평균 입경 HA-HZ-PLA
함량
(%W/W)
실시예
9-1		 투석법 DMSO 29.5 유기상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 1.0 ㎛ 0.29
실시예
9-2		 용매확산법 DMSO 36.7 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 225.3 ㎚ 0.43
실시예
9-3		 용매확산법 DMSO 36.7 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 308.9 ㎚ 0.09
실시예
9-4		 용매확산법 DMSO 29.5 유기상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 288.2 ㎚ 1.89
실시예
9-5		 용매확산법 DMSO 29.5 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 220.2 ㎚ 0.01
실시예
9-6		 용매확산법 DMSO 29.5 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 196.9 ㎚ 0.03
실시예
9-7		 용매확산법 아세톤 36.7 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 367.8 ㎚ 0.72
실시예
9-8		 용매확산법 아세톤 36.7 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 336.9 ㎚ 0.49
실시예
9-9		 용매확산법 아세톤 29.5 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 328.3 ㎚ 0.09
실시예
9-10		 용매확산법 아세톤 29.5 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 328.1 ㎚ 0.12
실시예
9-11		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 36.7 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 에멀션 생성시에 자발적으로 피복 2.7 ㎛ 1.09
실시예
9-12		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 36.7 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 1.2 ㎛ 0.23
실시예
9-13		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 29.5 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 에멀션 생성시에 자발적으로 피복 3.0 ㎛ 0.46
실시예
9-14		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 29.5 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 1.7 ㎛ 1.08
〔실시예 10〕혈중체류성 연장, 종양 조직, 염증 조직으로의 집적성을 목적으로 한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제
(실시예 10-1) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-1
실시예 7-6 에서 합성한 HA-HZ-PLA 를 4㎎, PLA-0005 를 36㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 4㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하고, 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 27.8㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 2178㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 7.82%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 함으로써 행한 결과, 304.0nm 였다.
(실시예 10-2) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-2
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 8-3 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간), 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 240㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 1257㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 5.24%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 함으로써 행한 결과, 166.9㎚ 였다.
(실시예 10-3) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-3
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 4㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하였다. 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 실시예 8-3 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 26.6㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 841㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 3.16%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 함으로써 행한 결과, 198.3㎚ 였다.
(실시예 10-4) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-4
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 8-4 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간), 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 35.0㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 3581㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 10.23%w/w) 이었다. 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 183.5㎚ 였다.
(실시예 10-5) DMSO 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-5
PLA-0005 를 40㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 4㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하고, 얻어진 혼합 용액을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간) 하였다. 투석액을 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 실시예 8-4 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 4㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하고 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 28.2㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 342㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 1.21%w/w) 이었다. 투석액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 70.4㎚ 였다.
(실시예 10-6) 아세톤 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-1
PLA-0005 를 10㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 8-3 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 2㎖ 에 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 7.9㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 882㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 11.15%w/w) 이었다. 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 198.3㎚ 였다.
(실시예 10-7) 아세톤 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-2
PLA-0005 를 10㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 2㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 실시예 8-3 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 2㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 36㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 137㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 3.83%w/w) 이었다. 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 195.6㎚ 였다.
(실시예 10-8) 아세톤 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-3
PLA-0005 를 10㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 8-4 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 2㎖ 에 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 7.2㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 1063㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 14.85%w/w) 이었다. 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 163.1㎚ 였다.
(실시예 10-9) 아세톤 용매 확산법에 의한 히알루론산 피복 PLA 나노스피어의 조제-4
PLA-0005 를 10㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 2㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 5.0㎛ 의 필터로 여과하여 응집 덩어리를 제거한 후, 실시예 8-4 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 2㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 원심 (40000g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 7.9㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 398㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 5.04%w/w) 이었다. 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 을 행한 결과, 입경의 측정치는 182.1㎚ 였다.
실시예 10 에 있어서 조제한 미립자의 조제 방법, 조제 조건 및 조제 결과
미립자조제방법 유기상 HA-HZ-PLA
PLA의 중량비
(%W/W)		 HA피복방법(HA-HZ-PLA의 사용방법) 미립자
평균 입경		 HA-HZ-PLA
함량
(%W/W)
실시예
10-1		 용매확산법 DMSO 65.1 유기상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 304.0㎛ 7.82
실시예
10-2		 용매확산법 DMSO 21.1 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 166.9 ㎚ 5.24
실시예
10-3		 용매확산법 DMSO 21.1 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 198.3 ㎚ 3.16
실시예
10-4		 용매확산법 DMSO 65.1 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 183.5 ㎚ 10.23
실시예
10-5		 용매확산법 DMSO 65.1 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 70.4 ㎚ 1.21
실시예
10-6		 용매확산법 아세톤 21.1 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 198.3 ㎚ 11.15
실시예
10-7		 용매확산법 아세톤 21.1 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 195.6 ㎚ 3.83
실시예
10-8		 용매확산법 아세톤 65.1 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 163.1 ㎚ 14.85
실시예
10-9		 용매확산법 아세톤 65.1 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 182.1 ㎚ 5.04
〔실시예 11〕국소 자극 저감을 목적으로 한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제
(실시예 11-1) 투석법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-1
실시예 9-1 과 동일한 순서로 조제하였다.
(실시예 11-2) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-1
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 실시예 8-1 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 52.4㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 28㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.05%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 6.8±3.6㎛ 였다.
(실시예 11-3) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-2
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 8㎖ 의 1%w/v PVA 수용액과 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물로서 얻어진 PLGA 미립자와 실시예 8-1 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 다시 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 58.8㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 188㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.32%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 7.4±2.7㎛ 였다.
(실시예 11-4) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-3
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 실시예 8-2 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 55.4㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 83㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.15%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 6.8±3.3㎛ 였다.
(실시예 11-5) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-4
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 8㎖ 의 1%w/v PVA 수용액과 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물로서 얻어진 PLGA 미립자와 실시예 8-2 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 다시 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 60.8㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 83㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.14%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 7.8±5.4㎛ 였다.
(실시예 11-6) 투석법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-1
실시예 7-6 에서 합성한 HA-HZ-PLA 를 12㎎, PLA-0005 를 108㎎ 칭량 채취하여, 3㎖ 의 DMSO 에 용해시켰다. 이것을 증류수에 대하여 투석 (MWCO:10000, 실온, 3 일간), 투석액을 32㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 91.7㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 2560㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 2.79%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 1.6±0.4㎛ 였다.
(실시예 11-7) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-5
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 실시예 8-3 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 580㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 261㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.45%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 6.1±6.2㎛ 였다.
(실시예 11-8) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-6
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 8㎖ 의 1%w/v PVA 수용액과 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물로서 얻어진 PLGA 미립자와 실시예 8-3 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 다시 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 58.6㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 158㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.27%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 7.7±5.7㎛ 였다.
(실시예 11-9) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-7
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 실시예 8-4 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 57.5㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 3068㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 5.34%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 6.9±3.5㎛ 였다.
(실시예 11-10) 에멀션액중 건조법에 의한 히알루론산 피복 PLGA 마이크로스피어의 조제-8
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 8㎖ 의 1%w/v PVA 수용액과 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물로서 얻어진 PLGA 미립자와 실시예 8-4 에 있어서 조제한 HA-HZ-PLA 수용액 8㎖ 와 혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 다시 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (히알루론산 피복 PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 65.0㎎ 이었다. 이 백색 분말을 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 불용물 (HA-HZ-PLA) 을 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 390㎍ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 0.60%w/w) 이었다. 입경의 측정은, 히알루론산 피복 PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 5.6±2.3㎛ 였다.
〔비교예 3〕PLGA 마이크로스피어의 조제
(비교예 3-1) 에멀션액중 건조법에 의한 PLGA 마이크로스피어의 조제
PLGA-7520 을 80㎎ 칭량 채취하여, 2㎖ 의 염화메틸렌에 용해시켰다. 이것을 18㎖ 의 1%w/v PVA 수용액과 혼합하여, 미케니컬스터러 (EYEL4, MAZERA Z) 를 사용하여 유화 (400rpm, 15 분) 시켰다. 이 유탁액을 개방계에서 하룻밤 스터러로 교반함으로써, 염화메틸렌을 제거하였다. 300㎛ 의 체에 걸러 응집 덩어리를 제거한 후, 원심 (1500g, 10 분), 상청 제거, 증류수 첨가의 세정 조작을 3 회 정도 반복하여, 침전물 (PLGA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 53.9㎎ 이었다. 이 입경의 측정은, PLGA 미립자의 백색 분말을 증류수에 대하여 재분산시키고, 광학 현미경 관찰에 의해 무작위로 50개의 미립자를 추출하여 화상 해석함으로써, 그 평균치 및 표준편차를 구한 결과, 5.3±2.5㎛ 였다.
실시예 11 에 있어서 조제한 미립자의 조제 방법, 조제 조건 및 조제 결과
미립자조제방법 유기상 HA-HZ-PLA
PLA의 중량비(%W/W)		 HA피복방법 (HA-HZ-PLA의 사용방법) 미립자 평균
입경		 HA-HZ-PLA함량(%W/W)
실시예
11-1		 투석법 DMSO 29.5 유기상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 1.0 ㎛ 0.29
실시예
11-2		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 36.7 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 6.8 ㎛ 0.05
실시예
11-3		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 36.7 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 7.4 ㎛ 0.32
실시예
11-4		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 29.5 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 6.8 ㎛ 0.15
실시예
11-5		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 29.5 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 7.8 ㎛ 0.14
실시예
11-6		 투석법 DMSO 65.1 유기상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 1.6 ㎛ 2.79
실시예
11-7		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 21.1 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 6.1 ㎛ 0.45
실시예
11-8		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 21.1 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 7.7 ㎛ 0.27
실시예
11-9		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 65.1 수상에 HA-HZ-PLA를 용해, 미립자 생성시에 자발적으로 피복 6.9 ㎛ 5.34
실시예
11-10		 에멀션
액중건조법		 염화메틸렌 65.1 미립자 조제후, HA-HZ-PLA수용액을 첨가 5.6 ㎛ 0.60
〔실시예 12〕히알루론산 피복 PLA 나노스피어로의 파클리탁셀 (PTX) 봉입
(실시예 12-1) 아세톤 용매 확산법에 의한 조제-1
파클리탁셀 (이하, PTX 라고도 함)(Natural Pharmaceuticals, Inc. Lot No.150206602-1) 10㎎ 을 칭량 채취하여 2㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. PLA-0005 를 9.0㎎ 칭량 채취하여, PTX 의 아세톤 용액에 첨가하여 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 실시예 7-6 과 동일한 방법으로 합성하여 실시예 8-4 와 동일한 방법으로 얻은 HA-HZ-PLA 수용액 2㎖ 에 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 그 후, 탈염 칼럼 (PD-10) 에 의한 정제를 행하고, 원심 (40000g, 10 분), 침전물 (PTX 봉입 히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 8.3㎎ 이었다. 입경의 측정은, 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 함으로써 행한 결과, 99.0±41.3㎚ 였다. 얻어진 백색 분말 6.8㎎ 을 칭량 채취하여, 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 1.3㎎ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 19.1%w/w) 이었다.
PTX 의 정량은, 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC) 를 사용한 내표준물질 (IS) 법에 의해 행하였다. IS 용액은 약 0.7㎎/㎖ n-헥실-p-하이드록시벤조에이트의 아세토니트릴 용액을 조제하였다. 검량선 작성을 위한 표준용액은 10㎎/㎖ 의 PTX 아세토니트릴 용액의 5 배 희석열 (8 열) 을 조제하였다. 또한, PTX 봉입히알루론산 피복 PLA 미립자의 백색 분말을 1.5㎎ 칭량 채취하여, 1㎖ 의 아세토니트릴을 첨가, 잘 교반한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 PTX 농도 정량용 용액으로서 사용하였다. 표준용액 및 PTX 농도 정량용 용액 400㎕ 에 대하여 IS 용액 25㎕ 의 비율로 혼합하여, RP-HPLC 측정을 행한 결과, 나노스피어 중의 PTX 함량은 9.9%w/w 였다. RP-HPLC 의 측정 조건을 이하에 나타낸다.
RP- HPLC 조건
칼럼: Cadenza-C-18C (Imtakt)
유속: 0.75㎖/분
용출액:
A:MeCN, B:초순수 (MilliQ 수)
A:B=
50:50 (0-10 분, 동용매)
50:50→0:100 (10-12 분, 선형구배)
0:100 (12-19 분, 동용매)
0:100→50:50 (19-20 분, 선형구배)
50:50 (20-25 분, 동용매) 계 25 분
검출기: UV (230㎚)
칼럼 온도: 40℃
샘플 온도: 4℃
샘플 주입량: 10㎕
(실시예 12-2) 아세톤 용매 확산법에 의한 조제-2
PTX 10㎎ 을 칭량 채취하여 2㎖ 의 아세톤에 용해시켰다. PLA-0005 를 9.0㎎ 칭량 채취하여, PTX 의 아세톤 용액에 첨가하여 용해시켰다. 이것을 스터러 교반 하, 2㎖ 의 증류수에 대하여 적하?혼합하여, 15 분 정도 교반한 후, 얻어진 혼합 용액을 에바포레이션함으로써 아세톤을 제거하였다. 그 후, 실시예 7-6 과 동일한 방법으로 합성하여 실시예 8-4 와 동일한 방법으로 얻은 HA-HZ-PLA 수용액 2㎖ 에 적하?혼합, 15 분 정도 교반한 후, 탈염 칼럼 (PD-10) 에 의한 정제를 행하여, 원심 (40000g, 10 분), 침전물 (PTX 봉입 히알루론산 피복 PLA 미립자) 을 회수하여 동결 건조시켰다. 얻어진 백색 분말의 수량은 8.4㎎ 이었다. 입경의 측정은 에바포레이션 후의 용액에 대하여 DLS 측정 (Nicomp370) 함으로써 행한 결과, 142.7±44.4㎚ 였다. 얻어진 백색 분말 6.9㎎ 을 칭량 채취하여, 과잉의 아세톤으로 잘 세정한 후, 원심 (10000g, 10 분), 상청을 제거하여 감압 건조시킨 결과, 그 중량은 0.7㎎ (미립자 중의 HA-HZ-PLA 비, 10.7%w/w) 이었다. PTX 의 정량은 실시예 12-1 과 동일한 방법으로 행한 결과 나노스피어 중의 PTX 함량은 9.9%w/w 였다.
본 발명의 히알루론산 또는 그 유도체와, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물에 의해, 저분자 약물을 효율적으로 봉입하여, 장기적으로 서방기간을 제어할 수 있고, 혈중체류성을 제어할 수 있으며, 수용액 중에서의 분산성이 양호하고, 안전성에 문제가 없는 약물 담체가 제공된다. 또한, 본 발명 히알루론산 수식물에 의해, 입자간 응집이 적은 인젝터블 미립자로 이루어지는 생체 적합성이 우수한 약물 담체가 제공된다.

Claims (48)

  1. 히알루론산 유도체와, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머가 결합한 히알루론산 수식물(修飾物)에 있어서,
    상기 히알루론산 유도체가, 식 (Ⅱ):
    Figure 112011051311513-pct00041
    (식 중, R1, R2, R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소원자, C1-6 알킬기 및 C1-6 알킬카르보닐기에서 선택되고,
    Ra 및 Rb 는 각각 독립적으로, 수소원자 및 C1-6 알킬기에서 선택되고,
    A 는 단결합, -(CH2)m-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)m- 또는 -NHCO-(CH2)n-CONH- 이고,
    m 은 1～10 의 정수이고, n 은 0～10 의 정수이다)로 표시되는 반복 구조를 분자내에 적어도 하나 이상 포함하는 히알루론산 수식물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    식 (Ⅰ):
    Figure 112011051311513-pct00014
    (식 중, R1, R2, R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소원자, C1-6 알킬기 및 C1-6 알킬카르보닐기에서 선택되고,
    Ra 및 Rb 는 각각 독립적으로, 수소원자 및 C1-6 알킬기에서 선택되고,
    Q 는 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 폴리머이고, 이 폴리머는 말단의 카르복실기로 질소원자와 아미드 결합을 형성하고 있고,
    A 는 단결합, -(CH2)m-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)m- 또는 -NHCO-(CH2)n-CONH- 이고,
    m 은 1～10 의 정수이고, n 은 0～10 의 정수이다)
    로 표시되는 반복 구조를 분자내에 적어도 하나 이상 포함하는 히알루론산 수식물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    Ra 및 Rb 가 모두 수소원자이고, A 는 -(CH2)m-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)m- 또는 -NHCO-(CH2)n-CONH- 인 히알루론산 수식물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 히알루론산 수식물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    포유동물에 있어서 18 시간 이상의 평균 혈중체류시간을 갖는 히알루론산 수식물.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 히알루론산 유도체가 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 것인 히알루론산 수식물.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 히알루론산 유도체가 포유동물에 있어서 18 시간 이상의 평균 혈중체류시간을 갖는 히알루론산 수식물.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 기재된 히알루론산 수식물을 함유하는 약물 담체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    미립자 형상인 약물 담체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    입자 직경이 200㎛ 이하인 약물 담체.
  11. 제 8 항에 있어서,
    히알루론산 리셉터에 대한 타겟능을 갖는 약물 담체.
  12. 제 8 항에 있어서,
    히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 약물 담체.
  13. 제 8 항에 있어서,
    국소 자극성이 저감되어 있는 약물 담체.
  14. 제 8 항에 있어서,
    점막 부착성을 갖는 약물 담체.
  15. 제 8 항에 기재된 약물 담체 및 약물을 함유하는 의약 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    추가로 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 하나 이상의 폴리머를 함유하는 의약 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 폴리머가 히알루론산 수식물에 결합하고 있는 폴리머와 동종의 것인 의약 조성물.
  18. 제 15 항에 있어서,
    상기 약물이 히알루론산 수식물이 형성하는 미립자에 의해 봉입되어 있는 의약 조성물.
  19. 제 15 항에 있어서,
    수용액 중에서 상기 히알루론산 수식물의 폴리머 부분이 형성하는 소수성 코어를 히알루론산 부분이 피복하는 형상의 미립자를 함유하는 의약 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 약물이 상기 히알루론산 수식물의 폴리머 부분에 의해 형성된 소수성 코어 부분에 봉입되어 있는 의약 조성물.
  21. 제 15 항에 있어서,
    상기 히알루론산 수식물의 폴리머 부분, 상기 폴리머, 또는 상기 히알루론산 수식물의 폴리머 부분 및 상기 폴리머가 수용액 중에서 형성하는 소수성 코어를 히알루론산 부분이 피복하는 형상의 미립자를 함유하는 의약 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 약물이 상기 히알루론산 수식물의 폴리머 부분, 상기 폴리머, 또는 상기 히알루론산 수식물의 폴리머 부분 및 상기 폴리머에 의해 형성되는 소수성 코어 부분에 봉입되어 있는 의약 조성물.
  23. 말단에 카르복실기를 갖는 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 락트산?글리콜산 공중합체에서 선택되는 폴리머와, 식 (Ⅱ):
    Figure 112011051311513-pct00016
    (식 중, R1, R2, R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소원자, C1-6 알킬기 및 C1-6 알킬카르보닐기에서 선택되고,
    Ra 및 Rb 는 각각 독립적으로, 수소원자 및 C1-6 알킬기에서 선택되고,
    A 는 단결합, -(CH2)m-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)m- 또는 -NHCO-(CH2)n-CONH- 이고,
    m 은 1～10 의 정수이고, n 은 0～10 의 정수이다)로 표시되는 반복 구조를 분자내에 적어도 하나 이상 포함하는 히알루론산 유도체를 반응시키는 공정을 포함하는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 기재된 히알루론산 수식물의 제조방법.
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200307011A (en) * 2002-04-18 2003-12-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Hyaluronic acid modifier
US7816316B2 (en) * 2002-11-21 2010-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Sustained release drug carrier
TW200612991A (en) * 2004-09-07 2006-05-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Process for producing water-soluble hyaluronic acid modification
US20080139501A1 (en) * 2004-12-30 2008-06-12 Novozymes Biopolymer A/S Hyaluronic Acid Linked With a Polymer of an Alpha Hydroxy Acid
WO2006113668A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 University Of South Florida A method of transdermal drug delivery using hyaluronic acid nanoparticles
US9180229B2 (en) * 2005-05-19 2015-11-10 Ethicon, Inc. Antimicrobial polymer compositions and the use thereof
US9149558B2 (en) 2005-05-19 2015-10-06 Ethicon, Inc. Antimicrobial polymer compositions and the use thereof
EP1926459B1 (en) 2005-09-19 2015-01-07 Histogenics Corporation Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof
ES2377479T3 (es) * 2005-09-27 2012-03-28 Universite Joseph Fourier - Grenoble 1 Hidrogel funcionalizado con una porción polimerizable y sus utilizaciones como biosensores o biorreactores.
EP1951761B1 (en) * 2005-11-22 2011-01-05 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) New derivatives of hyaluronic acid, their preparation process and their uses
EP1991587B1 (en) * 2006-03-07 2013-07-24 ProChon Biotech Ltd. Hydrazido derivatives of hyaluronic acid
CA2657823A1 (en) * 2006-08-04 2008-02-07 Novozymes Biopolymer A/S Branched hyaluronic acid and method of manufacture
KR100957125B1 (ko) * 2008-01-14 2010-05-11 한국과학기술원 생체 고분자와 난용성 물질의 접합체 및 그의 제조방법
ITRM20080636A1 (it) * 2008-11-28 2010-05-29 Univ Palermo Procedimento per la produzione di derivati funzionalizzati dell acido ialuronico e relativi idrogeli.
EP2213315A1 (en) * 2009-01-30 2010-08-04 Mero S.r.L. Antibacterial hydrogel and use thereof in orthopedics
US9649331B2 (en) * 2009-08-27 2017-05-16 Ara Medical Llc Sprayable polymers as adhesion barriers
JP5607241B2 (ja) 2010-05-21 2014-10-15 ケミリア・エービー 新規ピリミジン誘導体
IT1401498B1 (it) * 2010-07-30 2013-07-26 Mero Srl Idrogelo a base di acido ialuronico e suo uso in ortopedia
WO2012118189A1 (ja) * 2011-03-03 2012-09-07 中外製薬株式会社 アミノ－カルボン酸により修飾されたヒアルロン酸誘導体
BR112013024378A2 (pt) 2011-03-24 2016-12-13 Chemilia Ab novos derivados de pirimidina
JP2013067709A (ja) * 2011-09-21 2013-04-18 Gunze Ltd ヒアルロン酸修飾物
WO2014059558A1 (zh) * 2012-10-19 2014-04-24 Hu Oliver Yaopu 长效止痛药癸二酰双那布扶林酯-plga控释剂型
CZ2012842A3 (cs) 2012-11-27 2014-08-20 Contipro Biotech S.R.O. Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
ITMI20130682A1 (it) * 2013-04-24 2014-10-25 Giuliani Spa Forme di dosaggio per la somministrazione orale di sostanze attive
FR3015286B1 (fr) * 2013-12-24 2015-12-25 Adocia Nanoparticules comprenant un copolymere dibloc ha-pla
US10077420B2 (en) 2014-12-02 2018-09-18 Histogenics Corporation Cell and tissue culture container
CN106480537A (zh) * 2016-12-21 2017-03-08 哈尔滨理工大学 一种明胶接枝plga电纺纤维的方法
EP3712181B1 (en) 2017-11-15 2022-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hyaluronic acid derivative modified with polyethylene glycol
CN113286623A (zh) * 2018-12-21 2021-08-20 高德美控股有限公司 包封固体颗粒的水凝胶组合物
CN111269332A (zh) * 2020-03-27 2020-06-12 广州古泉生物科技有限公司 一种壳聚糖-海藻酸钠水凝胶的制备和应用
EP4190801A1 (en) * 2020-07-29 2023-06-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring pharmacokinetics of drug labeled with non-radioactive substance
WO2022063312A1 (zh) * 2020-09-28 2022-03-31 吾奇生物医疗科技(江苏)有限公司 透明质酸水凝胶和透明质酸膜及其制备方法和应用
CN113230451A (zh) * 2021-04-02 2021-08-10 长春圣博玛生物材料有限公司 一种可注射的皮肤填充剂及其制备方法
WO2024055132A1 (es) * 2022-09-12 2024-03-21 Universidad De Talca Método para la síntesis de un copolímero ramificado de ácido hialurónico y ácido poli(láctico-co-glicólico)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09188705A (ja) * 1995-11-07 1997-07-22 Seikagaku Kogyo Co Ltd グリコサミノグリカン誘導体およびその製造法
JPH1072375A (ja) * 1996-06-26 1998-03-17 Takeda Chem Ind Ltd 徐放性製剤
WO2001088019A1 (fr) * 2000-05-16 2001-11-22 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S) Materiau a base de polymeres biodegradables et son procede de preparation

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3104170A1 (de) 1980-09-29 1982-05-13 Günter 5608 Radevormwald Helmdach Lastaufnehmendes gruendungselement, insbesondere aus stahlbeton
IT1243390B (it) * 1990-11-22 1994-06-10 Vectorpharma Int Composizioni farmaceutiche in forma di particelle atte al rilascio controllato di sostanze farmacologicamente attive e procedimento per la loro preparazione.
JPH06188705A (ja) 1992-12-22 1994-07-08 Matsushita Electric Works Ltd スイッチング回路
DE69508985T2 (de) * 1994-02-21 1999-08-19 Takeda Chemical Industries Ltd Polyester Matrix für eine pharmazeutische Zusammensetzung mit verzögerter Freigabe
JPH1072735A (ja) * 1996-06-24 1998-03-17 Teijin Ltd 熱収縮特性の改善された複合仮撚糸、その製造方法、およびミルドウーステッド調織物
US6264970B1 (en) * 1996-06-26 2001-07-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained-release preparation
US6229009B1 (en) * 1997-08-29 2001-05-08 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) Polycarboxylic based cross-linked copolymers
ITPD980169A1 (it) * 1998-07-06 2000-01-06 Fidia Advanced Biopolymers Srl Ammidi dell'acido ialuronico e dei suoi derivati e processo per la loro preparazione.
DE60133744T2 (de) 2000-07-28 2009-05-14 Anika Therapeutics, Inc., Woburn Bioabsorbierbare kompositmaterialien aus derivatisierter hyaluronsäure
DE60118575T3 (de) * 2000-08-07 2011-05-19 Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. Milchsäurepolymer und verfahren zu dessen herstellung
TW200307011A (en) 2002-04-18 2003-12-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Hyaluronic acid modifier

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09188705A (ja) * 1995-11-07 1997-07-22 Seikagaku Kogyo Co Ltd グリコサミノグリカン誘導体およびその製造法
JPH1072375A (ja) * 1996-06-26 1998-03-17 Takeda Chem Ind Ltd 徐放性製剤
WO2001088019A1 (fr) * 2000-05-16 2001-11-22 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S) Materiau a base de polymeres biodegradables et son procede de preparation

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