TWI373475B - Recombinant triplex scaffold-based polypeptides - Google Patents

Description

1373475 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於一種具支架蛋白質複合物，且特別有關於 一種具有三重螺旋支架之蛋白質複合物，其可使用於抗腫 瘤、感染性疾病與免疫調節（immunomodulatory)的應用上。 【先前技#f】 鲁蛋白質結合試劑（protein-based binding reagent)於治療 或診斷應用上具有多種用途《抗體就是個極佳的範例，許 多單株抗體（monoclonal antibodies，mAbs)(以下簡稱 mAbs)已經成功地用來治療癌症、感染性疾病與發炎疾病 (inflammatory diseases) (Adams et al., Nat. Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1147-57.)。 藉由基因重組 DNA技術（recombinant DNA technonlogy)，包括轉植化（chimerization)與人源化 # (humanization)，增強了鼠科動物mAbs的功效與安全性。 然而使用 CDR (互補決定區 ’ complementarity determining • region)(以下簡稱CDR)移植來進行人源化時，其結合親 和力低於鼠科動物的對應物。抗體的親和力是試劑成功與 否的一關鍵因子。具有高親和力的抗體可使抗體與天然的 配體（ligand)對目標受器（targeted receptor)有效地競爭以減 少劑量、毒性與花費。親和力也影響抗體的藥物動力學 (pharmacokinetics) ’例如其分佈與分泌於一目標組織與宿 主循環之内。/« v/w?對一有效單株抗體的必要條件為對目

0648-A22020TWF(N2) ：P 13940023TW 5 1373475 ·· 標抗原具有極強的親和力且對非相關蛋白質無非專一性結 合。抗原結合位（antigen binding site)的多元聚合 (multimerization)已被證實是增加抗體對一抗原結合之整 體強度的有效方式，其中抗體對抗原結合之整體強度定義 為抗體親和力（antibody avidity)(功能性親和力（functional affinity)) (Miller et al., J Immunol 170:4854-4861, 2003; Rheinnecker et al., J Immunol 157:2989-2997, 1996; Shopes, J Immunol 148:2918-2922, 1992; Shuford et al., Science ^ 252:724-727, 1991; Wolff et al., J Immunol 148:2469-2474, 1992)。Wvo 它們增加了抗腫瘤活性（antitumor activity)(Liu et al., Int Immunopharmacol 6:791-799, 2006; Wolff ei a/·, Cancer Res 53:2560-2565，1993)。由於免疫球 蛋白G(immnoglobin G，IgG)(以下簡稱IgG)分子結構之 二價（bivalent)的本質，不能用來結合同時結合多於兩個以 上不同之抗原。因此需要多價（multi-valent)或多重專一 (multi-specific)蛋白質結合試劑。 B 在一些實例中，為了減少刺激細胞分裂副作用 (mitogenicity side-effect)，必須藉由設計Fc區域來避免作 用功能（effector function) ’例如抗體依賴型細胞媒介細胞毒 子生作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)以及補體依賴型細胞毒杀曼作用（complement dependent cytotoxicity, CDC)。例如，鼠科動物抗-人類 CD3 單株抗體（正純種系（〇rthoclone)OKT3，莫羅莫那-CD3 (Muromonab-CD3))是一個以人類T細胞上的T-細胞受器

0648-A22020TWF(N2)：Pl3940023TW 6 1373475 * /CD3 複合物（T-cell receptor (TCR)/CD3complex)為目標之 強而有力的免疫抑制試劑，已有二十年的時間。其用來預 防或治療器官移植排斥（allograft rejection)( Cosimi ei α/., N Engl J Med 305:308-314, 1981; Group, N Engl J Med 313:337-342, 1985; Kung et al., Science 206:347-349, 1979)。然而使用這種治療的一個主要缺點是細胞激素 (cytokine)，例如TNF-α、IL-2與IFN-γ的全身性釋放，其 導致一系列有害的促絲裂作用（mitogenic effects)，包括感 ’冒類似症狀（flu-like symptoms)、呼吸窘迫（respiratory distress)、神經症狀（neurological symptoms)與急性腎小管 壞死（acute tubular necrosis ) (Abramowicz et al., Transplantation 47:606-608, 1989; Chatenoud et al., N Engl J Med 320:1420-1421, 1989; Goldman et al., Transplantation 50:158-159, 1990; Toussaint et al., Transplantation 48:524-526, 1989)。因為 OKT3 與其他抗-CD3 mAbs 的促 絲裂作用依賴經由與帶有Fc接受子之細胞（FcR-positive _ cell)(例如單核細胞（monocyte))之大量的TCR/CD3交聯 (cross-linking)，因此最近有許多研究都希望藉由改變與 FcR結合，發展抗-CD3抗體的非促絲裂作用型 (nonmitogenic forms)。由以上說明可知，目前亟需一種具 有高親和力、低促絲裂作用作用與hWw?高穩定性之蛋白 質結合試劑。 【發明内容】 本發明提出一種具有高親和力、低有絲分裂作用與h

0648-A22020TWF(N2)；P13940023TW 1373475 -VZVO高穩定性的蛋白質複合物結合試劑（pr〇tein complex-based binding reagent)。本發明之試劑也可為多價 (multi-valenyt)或多重專一性(multi-specific)。 - 在一方面’本發明係關於一被分離的基因重組蛋白 質’其包括一第一融合多胜肽鏈，包括一第一支架區域與 一第一異源性（heterologous)區域讀框内（in_frame)融合至 該第一支架區域的一端、一第二融合多胜肽鏈，包括一第 二支架區域，以及一第三融合多胜肽鏈，包括一第三支架 •區域。上述第一、第二與第三支架區域互相排列以形成一 三重螺旋線圈。又上述第一支架區域與第一異源性區域被 讀框内融合且在相同的胜肽鏈上。 上述異源性區域可包括一酵素性區域或一螢光蛋白質 的序列。螢光蛋白質的例子包括GFP與dsRed與其變異型 (variant)。酵素性區域的例子包括榖胱胺S-轉移酵素 (glutathione S-transferase)、螢光酵素（iuciferase)、半乳 糖甘酶（尽-galactosidase)與乙内醯胺酶（/5—iactamase)。 上述異源性區域可包括一結合區域（例如，一配體 (ligand)結合區域、一配體、一受器（receptor)、一親和性標 籤或一醣蛋白（proteoglycan))其結合至一結合搭檔(binding partner)。“結合搭檔”意指對於感興趣目標化合物的一部 分（例如，一蛋白質）具有專一、共價或非共價親和性的 任何分子。結合搭4當的例子包括抗原/抗體配對、蛋白質/ 抑制物配對、受器/配體配對（例如，細胞表面或細胞核受 器/配體配對）、酵素/受質配對（例如，激酶（kinase)/受質

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 8 1373475 配對）、凝集素（lectin)/碳水化合物（carbohydrate)配對、 寡聚（oligomeric)或異寡聚（heterooligomeric)蛋白質配對、 DNA 結合蛋白（DNA binding protein)/DNA 的結合位（dan binding site)配對與RNA/蛋白質配對。結合區域的例子也 包括親和性標籤的序列，例如，組胺酸-標藏 (histidine-tag)、myc標籤（myc tag)或血球凝集素標籤 (hemagglutin tag) 〇 上述第一異源性區域可包括一免疫球蛋白的一個或多 個CDR。因此異源性區域可包括一抗體的抗原結合部分， 例如一 VH區域與Fab。在一實施例中第一異源性區域包括 一抗原結合片段或一單鏈抗體的序列，例如其專一於集群 名稱(Cluster Designation 3，CD3)(以下簡稱 CD3 )或表皮 生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR) (以下簡稱EGFR )。上述第一多胜肽鏈可更包括一第二 異源性區域讀框内融合至上述第一支架區域的另一端。如 上述第一支架區域，第二異源性區域也可包括一結合區域 其與一結合搭檔結合。第一與第二異源性區域可彼此相同 或不同。它們可與一相同的結合搭檔或兩個不同的結合搭 檔結合。例如，第一異源性區域與第二異源性區域可分別 包括一第一單鏈抗體與一第二單鏈抗體的序列，上述兩抗 體分別與CD3與EGFR專一性結合。 在上述蛋白質複合物中，第二多胜肽鏈可以包括一第 三異源性區域讀框内融合至上述第二支架區域的一端、一 第四異源性區域讀框内融合至第二支架區域的另一端或兩

0648-A22020TWF(N2)；P13940023TW 9 1373475 個區域讀框内融合至該兩端。同樣地，前述之第三融合多 胜肽鏈可包括一第五異源性區域讀框内融合至第三之架區 域的一端或一第六異源性區域讀框内融合至第三之架區域 . 的另一端或兩者皆有。如同上述第一與第二異源性區域， 這四個異源性區域的每個也可包括一結合區域其與一結合 搭檔結合。全部六個異源性區域可彼此相同或不同。因此 它們可與1、2、3、4、5或6個結合搭檔結合。換句話說， 此蛋白質複合物可以是單、雙、三、四、五或六價。 > 為了讓第一、第二與第三支架區域形成一三重螺旋線 圈，三個支架區域的每個包括一個或多個三重螺旋重複單 元，每個重複單元包括下列公式的一序列：（Xl-X2-X3)n， 其中XI是一甘胺酸(Gly)殘基，X2或X3是任何胺基酸殘 基，較佳為胺基酸脯胺酸（proline)或羥基脯胺酸 (hydroxproline);以及η大於或等於5。例如，第一、第二 或第三支架區域可包括（GPP)10或一個或多個人類補體 Clq、膠凝素(collectin)或一膠原蛋白多胜肽鏈的三重螺旋 •重複。 在一實施例中，前述第一、第二與第三融合多胜肽為 實質上相同，具有至少75% (例如任何數字介於75%與 100%之間，包括75%與100% )的序列彼此相同。一藉由 三個相同的多胜肽形成之複合物為一同元三聚體 (homotrimer)。上述三個融合多胜肽可以是“功能等同物 (functional equivalent)” 。“功能等同物”意指一般多胜肽 的多胜肽衍生物，例如，一蛋白質具有一個或多個點突變、

0648-A22020TWF(N2) ：P 13940023TW 10 1373475 ，· 插入（insertion)、刪除（deletion)、截斷（truncation)、一融合 蛋白或上述之結合，與大體上維持形成一三重螺旋的能力 與異源性區域的活性，例如與一配體結合。 異源性多胜肽、核酸或基因是源自一外來種，或即使 來自同種，也從其原始型經過實質上修飾。兩個融合區域 % 或序列是彼此為異源性，即使在自然產生的蛋白質或核酸 中它們並不相互連接。例如多胜肽序列並非自然發生的人 類迷你膠原蛋白（minicollagen)(第XXI型）、膠凝素 _ (collectin)家族蛋白或補體（complement)lq ( Clq )的一部 份，則該多胜肽序列對於人類蛋白質的一區域而言是異源 性的。 本發明的另一特色是一被分離的重組融合多胜肽，其 包括⑴一用以形成三重螺旋線圈的支架區域與（ii)一第一 異源性區域讀框内融合至上述支架區域的一端或一第二異 源性區域讀框内融合至上述支架區域的另一端。支架區域 可以包括一個或多個前述三重螺旋重複單元，例如人類 ^ Clq或膠原蛋白多胜肽。異源性區域可包括上述結合區域 之一與可以藉由許多本技術領域與所認定的方法來獲得， 例如噗菌體展示篩選(phage display screening)。 被分離的多胜肽或蛋白質複合物意指一多胜肽或蛋白 質複合物實質上由自然相關的分子分離，即由乾重計算具 有至少75% (即任何數字介於75%與100%之間，包括75 %與100% )的純度。純度可藉由任何適當的方法測量， 例如藉由管柱層析（column chromatography)、聚丙稀酿胺膠

0648-A22020TWF(N2) ：P J 3940023TW 1373475 體電泳(polyacrylamide gel electrophoresis)或高效能液相層 析法（high performance liquid chromatography, HPLC)分 析。本發明之被分離的多胜肽或蛋白質複合物可由自然來 源分離或藉由重組DNA技術製造。 本發明也關於一被分離的核酸，此被分離的核酸包括 一序列編碼出前段所述之融合多胜肽或此序列之互補序 列。一核酸指一 DNA分子（例如一 cDNA或基因體DNA )、 一 RNA分子（例如一 mRNA )或一 DNA或RNA類似物。 一 DNA或RNA類似物可由核苷酸類似物合成。此核酸分 子可以是單股或雙股，但以雙股DNA較佳。 “被分離的核酸”是一核酸其結構不與任何自然發生 的核酸或任何自然發生的基因體核酸片段相同。因此該用 語包含，例如(a) — DNA其具有自然發生基因體dnA分子 的一部分序列，但不與在生物體的基因體中自然發生於其 兩側之編碼序列鄰接；（b)—核酸在某種程度上併入於一載 體（vector)或一原核細胞或真核細胞的基因體中，由此所形 成的分子不與任何自然發生的載體或基因體DNA相同；（c) 一分離的分子’例如一 cDNA、一基因體片段、一藉由聚 合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)所產生的片 段或一限制片段(restriction fragment);與（d)—重組核苦酸 序列其為一雜交基因（即一基因其編碼出一融合蛋白質） 的一部份。上述核酸可使用來表現本發明之多胜肽。為達 此目的，可將上述核酸連接至適合的調控序列以產生一表 現載體。

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 12 1373475 載體指是一核酸分子，其具有轉植另一核酸至其連接 處的此力。載體具有自主性複製（aut〇n〇rnous replication) 或插入至一宿主DNA的能力。載體的例子包括一質體 (plasimd)、^^^(cosmid)或一病毒載體(virai vect〇r)。本 發明之載體包括一核酸，其在—適合於宿主細胞内表現的 形式。較佳為载體包括一個或多個調控序列，其與被表現 核I序列連接。一 “調控序列，，包括啟動子（pr〇in〇ter)、增 強子（enhancer)與其他表現控制要素（例如多聚腺嘌呤訊息 (polyadenylation signal ))。調控序列包括那些指示一核苷 酸序列的基本表現與組織專一調控及/或可誘導的序列。表 現載體的設計可依據下列因素如將被轉殖之宿主細胞的選 擇、需要蛋白質表現的程度與諸如此類。可引入表現載體 至宿主細胞以製造本發明之多胜肽。一宿主細胞其包括上 述酸也在本發明之範圍内。例子包括大腸桿菌（五細 胞、昆蟲細胞（例如使用果蠅S2細胞或桿狀 病毒(baculovirus)細胞）、酵母菌細胞或哺乳類細胞（例如 小鼠骨髓瘤（myeloma) NS0細胞）。請參閱，例如Goeddel， (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press，San Diego, CA.。 為了製造本發明之融合多胜肽，在准許一多胜肽表現 的情況下培養一宿主細胞於培養基中，其中上述多胜肽是 藉由本發明核酸所編碼，以及從被培養的細胞或該細胞的 培養基中純化上述多胜肽。或者，於b 可轉錄與轉譯 本發明之核酸，例如使用T7啟動子調控序列與T7聚合酶。

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 13 1373475 :· 為了製造本發明之蛋白質複合物，可於准許多胜肽表 現與一三重螺旋線圈形成的情況下培養一宿主細胞，宿主 細胞包括一第一、第二與第三酸分別編碼出上述第一、第 ，， 二與第三融合多胜肽，其中上述多胜肽是藉由該三個核酸 所編碼，以及從被培養的細胞或該細胞的培養基中純化上 述蛋白質複合物。而較佳的是上述宿主細胞為一真核細胞 (eukaryotic cell)，其包括使一脯胺酸殘基經基化 (hydroxylate)的酵素活性。 ® 為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更 明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳 細說明如下： 【實施方式】 本發明是因（至少一部份）意外發現一異源性蛋白質 結合區域讀框内融合至一人類三重螺旋線圈支架區域，其 保留結合活性以及產生的融合多胜肽形成一三重螺旋線 • 圈。第1圖所顯示的是一本發明之蛋白質複合物的例子。 如圖所示，三重螺旋線圈蛋白質複合物的六個端分別讀框 内融合至六個異源性蛋白質結合區域，即單鏈抗體（scFv) 的Fv片段。 本發明之蛋白質複合物相較於一般抗體有許多優點。 一方面而言，當上述六個區域之兩個或多個彼此相同時， 蛋白質複合物可具有2-6個結合區域其專一於一結合搭檔 (例如抗原），與一般抗體比較，其只具有兩個這種區域。 換句話說，不像一般抗體對於一抗原只具雙價，此蛋白質

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複合物，1以是雙、三、四、五或六價。因而，可將其制 造為具有各種親和力’親和力高於—般抗體。因為較高= 親和力，所以比起一般抗體而言，需要較少的蛋白質複人 物的量與較短的反應時間來達成期望的目標。例如，'療二 (therapeutic effects)，由此降低治療成本與縮小副作用’（例 如’非期望的免疫反應)。在另一方面，當上述六個區域的 兩個或多個互相不同時’本發明之蛋白質複合物可以具有 2-6個結合區域，其專一於2-6個不同的結合搭擋。聯合不 同專一性的結合搭檔位成為一個單 i I 搭謝-起的能力以及因此具有令:滿意有:= 療、組織重建(tissue reconstruction)與在奈米層次活性蛋白 質機械（active protein machinery)(例如一多次單元酵素） 的集合。 為了於人類Wvo使用’本發明之蛋白質複合物為一 人源(human origin)較佳。例如，其可包括一人源化單鏈抗 體序列讀框内融合至人源的螺旋線圈支架，像是人類 C1 q ’膠凝素家族蛋白質或似膠原蛋白多胜肽鏈。因為人 類Clq與膠原蛋白兩者在血液中皆非常穩定，所以此蛋白 質複合物比起一般治療型鼠源抗體而言更加穩定。 膠原蛋白是出現於哺乳類動物中最充足的蛋白質。其 為一細胞外基質蛋白（extracellular matrix protein)包括重複 三個一組的序列甘胺酸（Gly)-Xl-X2以及這種三個一組的 出現允許三個膠原蛋白多胜肽鏈（α-鏈）折疊成一三重螺 旋構造。在三個一組的序列甘胺酸-Χ1-Χ2中，Χ2位置的

0648-A22020TWF{N2)；P13940023TW 15 1373475 ·· 胺基酸常為脯胺酸，而為了穩定膠源蛋白的三重螺旋結 構，常藉由膠原蛋白鏈的後轉譯修飾將其4-羥基化 (hydroxylated)。缺少脯胺酸經基化，膠原蛋白的必須三重 . 螺旋構造在低於生理上正常的溫度（physiological temperature)下是熱不穩定的（thermally unstable)( Berg and Prockop, Biochem Biophys Res Commun 52:1 15-120, 1973; Rosenbloom et al., Arch Biochem Biophys 158:478-484, 1973)。許多具有膠原蛋白三重螺旋區域（collagenous > domain)的類膠原蛋白蛋白質出現於人類血清中，在保護防 止其他感染性生物上扮演先天性免疫系統（innate immune system)的角色。這些包括補體蛋白質Clq、膠凝素家族蛋 白質-甘露醣結合凝集素（mannose binding lectin, MBL)、 介面活性蛋白質（surfactant protein) A與D ( SP-A與 SP-D)。而這些類膠原蛋白蛋白質共同的結構特徵為多蛋 白質單位，由膠原蛋白區域的三重螺旋集合構成，且三聚 體分子互相堆疊或鏈間形成雙硫鍵鍵結。因此，這些“防 > 禦膠原蛋白”分子結合區域的功能性親和力藉由多元聚合 (multimerization)大中畐增力ο 。 本發明之蛋白質複合物或多胜肽可以藉由重組技術獲 得。可將編碼出此複合物之多胜肽的核酸引入一宿主細胞 中，並且在准許表現多胜肽的情況下表現多胜肽，此多胜 肽是由前述核酸所編碼，以及在多胜肽間形成一三重螺旋 線圈。為了促進三重螺旋線圈支架的形成，可在宿主細胞 中共表現（co-express) 脯氨酸 4-經化酶（prolyl

0648~A22020TWF(N2)：P13940023TW 16 1373475 4-hydroxylase, P4HA)，其為一在耀原蛋白的生合成中的關 鍵酵素。 異源性蛋白質區域可包括一抗體或一其片段（例如一 其抗原結合片段）。在此處所使用“抗體”意指一免疫球 蛋白分子或其免疫活性部分，即一抗原結合部分。其指一 蛋白質包括最少一個，較佳為兩個重（heavy，H)鏈變異區 域(VH)，以及至少一個較佳為兩個輕（light, L)鏈變異區域 (VL)。可將VH與VL區域更進一步細分為超變異區’稱為 “互補決定區（complementarity determining region) “（CDR) ”與散佈區域，其較保守，稱為架構區域 (framework region)。已經確定義互補決定區與架構區域的 範圍（參閱 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of

Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)。每個 Vh與VL組成三個CDR與四個FR (framew〇rk region)，從 氨基端到缓基端排列的順序為：FIU、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3 ' FR4。 抗體可更包括一重與輕鏈固定區域(constant region)， 由此分別形成一重與輕鏈免疫球蛋白鏈。重鏈固定區域包 括三個區域，CHI、CH2與CH3。輕鏈固定區域包括一區 域，CL。重與輕鏈的變異區域包括一結合區域其與抗原反 應。抗體的固定區域通常協調抗體結合至宿主組織或因 子’因子包括免疫系統的多種細胞（例如效應細胞（effect〇r

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 17 1373475 cell))與典型補體系統的第一補體匚1 q。 此處使用之“免疫球蛋白，，指—蛋白質包括一個或多 個胜肽’其本質上是*免疫球蛋自_所編碼。經認可的 人類免疫球蛋白基因包括d、a(IgAl與_)、⑽⑺、

IgG2、IgG3與IgG4)、δ|%μ固定區域基因與無數的免 疫球蛋白變異區域基因。全長免疫球蛋白“輕鏈”⑽ KDa或2Μ個胺基酸）在ΝΗ2端（約u〇個胺基酸）藉由 -變異區域基因所編碼，與在C(X)H端藉由—m固定 區域基因所編碼。而全長免疫球蛋白“重鏈，， 或446個胺基酸）相似地藉由一變異區域基因（約個 胺基酸）’與其他上述的固定區域基因，例如編碼出 約330個胺基酸）所編碼。 抗體（或“抗體部分”或“片段”）的“抗原結合片 段指一全長抗體的一個或多個片段，其保留專一性結合 至抗原（例如EGFR或CD3多胜肽或其片段）的能力。抗 體的抗原結合片段包括，但不限定為：⑴一 Fab片段，一 單價片段包括VL、VH、CL與CH1區域；（Π) — F(ab，)2片段， 一雙價片段包括兩個Fab片段藉由一雙硫鍵橋在其樞紐區 域（hinge region)連結；（iii)一 Fd片段包括VH與CH1區域； (iv) — Fv片段包括一抗體單股的VL與VH區域；（v) — dAb

片段（Ward β/·，（1989) 341:544-546)，其包括一 vH 區域；（vi) — 被分離的CDR以及（vii) VL或VH區域。更 進一步，雖然Fv片段的兩個區域VL與VH是由分開的基 因所編碼，但使用重組方法可將它們連接，藉由一人造連

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 18 1373475 : 結器可將它們做成一單鏈蛋白質，於其中▽[與vH區域配 對形成一單價分子（已知如單鏈Fv(scFv)，參閱，例如Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) . /Voc. Α^αί/. ΑίζΑ 5W. 85:5879-5883 )。此種單鏈抗體 也包含在一抗體的“抗原結合片段”。這些抗體片段可藉 由本技術領域常見的技術獲得，並以跟完整抗體相同的方 式來篩選應用。 適當的抗體可以是單株抗體。在其他實施例中，抗體 > 可以以重組製造，例如藉由噬菌體展示或組合方法 (combinatorial method)來製造。以嗟菌體展示與組合方法 產生抗體為本技術領域所熟已知（參閱，例如Ladner以<2/.

International International International International International International International International al. (1991) U.S. Patent No. 5,223,409; Kang et al. Publication No. WO 92/18619; Dower et al.

Publication No. WO 91/17271; Winter et al.

Publication WO 92/20791; Markland et al. Publication No. WO 92/15679; Breitling et al. Publication WO 93/01288; McCafferty et al. Publication No. WO 92/01047; Garrard et al.

Publication No. WO 92/09690; Ladner et al.

Publication No. WO 90/02809; Fuchs et

Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) JMol Biol 226:889-896; Clackson et al.

0648-A22020TWF(N2) ：P 13940023TW 1373475 (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982)。 在一實施例中，抗體為一完全人類抗體（例如，一抗 體在一小鼠中製造，此小鼠為經基因工程改造，製造從人 類免疫球蛋白序列而來的抗體）或非人類抗體，例如一齧 齒類動物（小鼠或大鼠）、山羊、靈長類動物（例如猴子）、 駱駝抗體。非人類抗體較佳為齧齒類動物（小鼠或大鼠抗 體）。製造齧齒類動物抗體的方法已為本技術領域所周知。 可以藉由使用遺傳工程小鼠執行人類基因來製造人類 單株抗體，而不是使用小鼠的系統。 使用經感興趣之抗原免疫的遺傳工程小鼠脾臟細胞 (splenocytes)來製造融合瘤（hybridoma)，其分泌對一人類蛋 白質之抗原決定位（epitope)具有專一性親和力的mAbs (參 閱，例如 Wood a/. International Application WO 91/00906,

Kucherlapati et al. PCT publication WO 91/10741; Lonberg et al. International Application WO 92/03918; Kay et al. International Application 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 1:33-40] Tuaillon et al, 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al.

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 20 1373475 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326)。 抗體的變異區域或其一部份’例如CDR，可在非人類 物種（例如，大鼠或小鼠）中產生。可使用轉植、CDR移 植與人源化抗體。本發明中在非人類物種（例如，大鼠或 小鼠）產生的抗體’經過修飾（例如在變化架構(variable framework)或固定區域）’以降低在人類的抗原性 (antigenicity)。 可藉由本發明技術領域周知的基因重組DNA技術來 製造轉植抗體(chimeric antibody)。例如—基因，其編碼出 鼠科動物（或其他物種）單株抗體分子的Fc固定區域，以 限制酶將其編碼出鼠科動物F c的區域移除，然在相同位置 以編碼出人類Fc固定區域的基因取代（見，R〇binson βί β/., International Patent Publication PCT/US86/02269; Akira, et al., European Patent Application 184,187; Taniguchi，M.， European Patent Application 171,496; Morrison et al., European Patent Application 173,494; Neuberger et al., International Application WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Patent No. 4,816,567; Cabilly et al., European Patent Application 125,023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cane. Res. 47:999-1005; Wood et al. et al (1985) Nature 314:446-449; and Shaw <3/·，1988,«/. 7WU/ Cartcer //iW. 80:1553-1559) o

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 1373475 人源化或CDR移植抗體具有至少一個或兩個彳旦—妒 為全部三個接受者（recipient)(重或輕免疫球蛋白鍵的> CDR被以一貢獻者CDR取代。抗體可被至少一部份的非 人類CDR取代或只有CDR中的一些被以非人類的CDR取 代。只需取代對於人源化抗體或人源化抗體片段的結合所 須數量的CDR。較佳之貢獻者為一齧齒類動物抗體，例如 一大鼠或小鼠抗體’以及接受者為一人類架構(framework) 或一人類保留架構（consensus framework)。一般而言，提供 CDR的免疫球蛋白稱為“貢獻者”以及提供架構稱的免 疫球蛋白為“接受者（acceptor)” 。在一實施例中，貢獻者 免疫球蛋白是一非人類（例如大鼠）。接受者架構是一自 然發生（例如人類）或一保留架構，或依序列約85%或更 高’較佳為90%、95%、99%或更高相同程度。此處所使 用的“保留序列（consensus sequence)”指一序列，其從一 相關序列的家族中最常發生的胺基酸（或核苷酸）形成（參 閱，例如 Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987 )。一 蛋白質 家族中在保留序列中的每個位置，由此家族於那個位置最 常發生的胺基酸所佔據。若兩個胺基酸發生的頻率相同， 兩者中的任一個皆可包含於保留序列。“保留架構”指架 構區域在保留免疫球蛋白序列之中。 可藉由本技術領域已知的方法將一抗體進行人源化。 藉由取代Fv變異區域的序列可產生人源化抗體，其中Fv 變異區域不直接包含於抗原與人類Fv變異區域之相同序

0648'-A2202QTWF(N2)：P13940023TW 22 1373475 列結合的作用中。對於產生人源化抗體的方法由Morrison， S. L., 1985, Science 229:1202-1207 > Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214 > Queen et al. US 5,585,089 ' US 5,693,761與US 5,693,762所提供。那些方法包括分離、 操作與表現核酸序列’其中核酸序列從至少一重或輕鏈之 一編碼出免疫球蛋白Fv變異區域的全部或一部份。此種核 酸的來源於本技術領域中已眾所周知，以及例如可從一融 合瘤中獲得，其117此融合瘤製造一抗體抵抗一感興趣的多 胜肽或其片段。可轉植(clone)—重組DNA至一適當的表現 載體，其中此重組DNA編碼出人源化抗體或其片段。 也可融合人源化抗體至支架，於人源化抗體中，特殊 胺基酸已被取代、刪除或增加。較佳的人化抗體具有胺基 酸替代於架構區域中’如此以改善對抗原的結合。例如一 人源化抗體具有架構殘基相同於貢獻者的架構殘基或其他 胺基酸除了接受者的架構殘基。為了產生此種抗體，藉由 對應的貢獻者胺基酸可取代一經過選擇之少數接受者人源 化免疫球蛋白鏈的架構殘基。較佳的取代位置包括胺基酸 殘基鄰接於CDR或其具有與CDR反應的能力。從貢獻者 選擇胺基酸的標準敘述於us 5,585,〇89。將抗體人源化的 其他技術敘述於Padlan扣EP 519596 A1。 本發明也包括一核酸其編碼出一融合多胜肽形成本發 明之一蛋白質複合物。核酸可從噬菌體展示篩選出或從表 現上述適合的抗體或抗體衍生物的細胞株中分離 (例如 RT-PCR)。可功能性連接核酸至一表現載體。可使用經核

0648-A22020TWF(N2)；Pi394〇〇23TW 23 1373475 酸或載體轉植的細胞來製造本發明之融合多胜肽或蛋白質 複合物。用以製造抗體之有用的細胞包括昆蟲細胞與哺乳 類動物細胞（例如，cho或淋巴細胞（iymPhatic ce丨1))。

可將本發明之蛋白質複合物與具療效成分（therapeutic moiety)進行結合，例如一細胞毒素（cytotoxin)、一治療試 劑或一放射性離子（radioactive ion)。一細胞毒素或細胞毒 性試劑包括任何對細胞有害的試劑。例子包括太平洋紫杉 醇（taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素 D(gramicidin D)、溴化乙鍵：（ethidium bromide)、吐根驗 (emetine)、絲裂黴素（mitomycin)、滅必治（etoposide)、鬼臼 。塞吩武（tenoposide)、維克思丁（vincristine)、敏伯斯登 (vinblastine)、秋水仙驗（colchicin)、阿霉素多柔比星 (doxorubicin)、柔紅黴素（daunorubicin) 、(dihydroxy anthracin dione)、米托（mitoxantrone)、普卡黴素 (mithramycin)、放線菌素 D(actinomycin D)、去氫睪丸素 (Ι-dehydrotestosterone)、糖皮質素（glucocorticoids)、普魯 卡因（procaine)、得特卡因（tetracaine)、利多卡因 (lidocaine)、恩特來（propranolol)、°票呤黴素核苷酸 (puromycin)、美登素（maytansinoids)，例如，美登醇 (maytansinol)(見，US Patent No. 5,208,020)、CC-1065 (見 US Patent Nos. 5,475,092, 5,585,499，5,846,545)與其類似 物或同源物。治療試劑包括，但不限定為，抗代謝劑 (antimetabolites)(例如，滅殺除癌（methotrexate)、狒嘌吟 (6-mercaptopurine)、6-硫鳥嗓呤核苷（6-thioguanine)、賽達

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 24 1373475

命（cytarabine)、（5-fluorouracildecarbazine))、烧化基藥劑 (alkylating agents)(例如，氮芥氣（mechlorethamine)、 thioepa chlorambucil、CC-1065、美法备（melphalan)、卡莫 司汀（carmustine，BSNU)與洛莫司汀（lomustine, CCNU)、 (cyclothosphamide)、補束姓（busulfan)、二溴甘露醇 (dibromomannitol)、鏈脲佐菌素（streptozotocin)、絲裂徽素 C(mitomycin C)與順鉑帝爾（cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin ))、四環黴素（anthracyclines)(例如， 柔紅黴素（daunorubicin)(之前稱為daunomycin))、抗生 素（例如，可美淨（dactinomycin)(之前稱為actinomycin)、 撲類惡（bleomycin)、普卡黴素（mithramycin)與氨菌徽素 (anthramycin, AMC))以及抗有絲分裂劑（anti-mitotic agents) (例如，維克思丁（vincristine)、敏伯斯登（vinblastine)、太 平洋紫杉醇(taxol)與美登素（maytansinoids))。放射性離子 包括但不限制為埃（iodine)、紀（yttrium)與镨 (praseodymium) ° 可利用結合來修飾一已知的生物反應，藥物部分(drug moiety)不被設計為限制為典型化學治療試劑。例如，藥物 部分可以是一蛋白質或多胜肽，其具有一生物活性。這種 蛋白質可包括，例如一毒素，如雞母珠毒蛋白（abrin)、蓖 麻蛋白 A (ricin A)、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin) 或白喉毒素（diphtheria toxin); —蛋白質，例如腫瘤壞死因 子（tumor necrosis factor)、〇:-干擾素（α-interferon)、/3-干擾 素 〇3-interferon)、才申、經生長因子（nerve growth factor)、血小

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 25 1373475 板衍生生長因子(platelet derived growth factor)、組織胞衆 素原激活素（tissue plasminogen activator);或生物反應調節 劑（biological response modifier)，例如，淋巴激素 (lymphokines)、細胞白介素-l(interleukin-l,”IL-l")、細胞 白介素-2(interleukin-2，，，IL-2”)，細胞白介素 -6(interleukin-6，nIL-6”）、顆粒球-巨噬細胞之聚落刺激因子 (granulocyte macrophage colony stimulating factor，"GM-CSFn)、顆粒球聚落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor ,’'G-CSF")或其他生長因子。 前述蛋白質與結合依據其真源性區域的專一性，可用 來治療多種失調，包括癌症、發炎疾病（inflammation disease)、代謝疾病（metabolism disease)纖維化疾病（fibrosis disease)與心血管循環器官疾病（cardiovascular disease)。因 此本發明以治療此種失調為特徵，例如，藉由把本發明蛋 白質複合物之一有效量（effective amount)給予需要的病 患。可認定被治療的病患具有以失調為特徵的情況或是處 於此風險中。此方法可單獨表現或與其他藥物或治療結合。 因為本發明蛋白質複合物多重專一的特色，可以使用 其來連接於一般情況下並不互相結合之分子或細胞。此特 徵特別對於細胞療法（cell-based therapy)有用。在一實施例 中’蛋白質複合物中的異源性區域具有活化細胞毒素性細 胞（cytotoxic cell)(例如毒殺性 T 細胞（cytotoxic T cell)) 的能力，藉由與位於細胞毒素性細胞上的反應因子抗原 (effector antigen)專一性結合，而其他異源性區域則專一性

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 26 1373475 : 結合至位於將被破壞的病原體或有害細胞的目標抗原。在 此方法中，蛋白質複合物可用來治療因病原體或有害細胞 所導致的失調。 ，_ 經由本發明蛋白質複合物與細胞毒素性細胞上當作反 • 應因子抗原的CD3抗原結合，可活化細胞毒素性細胞。其 他淋巴樣細胞（lymphoid cell)相關之反應因子抗原包括人 類CD16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、CD2抗原、 CD28抗原、CD25抗原、CD64抗原與CD89抗原。與這 ® 些反應因子抗原結合使效應細胞活化，效應細胞例如，單 核球（monocyte)、嗜中性粒細胞（neutrophilic granulocyte) 與樹突細胞（dendritic cell)。這些被活化的細胞之後會施加 一細胞毒性或細胞凋亡影響（apoptotic effect)於目標細胞。 一目標抗原為一抗原其獨特地表現於一與死亡情況相 關的細胞上，但是其不表現於或表現低程度或是不可達到 於細胞健康的情況下。這些與有害細胞相關的目標抗原的 例子包括 EpCAM、CCR5、CD19、HER-2 neu、HER_3、 • HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1 (黏液素(mucin))、 MUC2、MUC3、MUC4、MUC5.sub.AC、MUC5.sub.B、 MUC7 ' .beta.hCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神經 節糖甘 CD3(ganglioside GD3)、9-0_Acetyl-GD3、GM2、 Globo H、fucosyl GM1、Poly SA、GD2、碳脫水酶 (Carboanhydrase IX (MN/CA IX)) 、CD44v6、音速小子 (Sonic Hedgehog (Shh)) 、Wue-1、質聚細胞抗體（Plasma Cell Antigen)、（membrane-bound) IgE、黑色素細胞瘤硫化

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 27 1373475 ： 軟骨蛋白多醣（Melanoma Chondroitin Sulfate Proteoglycan (MCSP)) 、CCR8、TNF-alpha 前驅物、STEAP、間皮素 (mesothelin)、A33抗原、攝護線幹細胞抗原（Prostate Stem Cell Antigen (PSCA)) 、Ly-6;第四型固定膠（desmoglein 4)、約黏附素E新抗原決定位（E-cadherin neoepitope)、胎 兒乙酿膽驗受器（Fetal Acetylcholine Receptor)、CD25、 CA19-9標誌(marker)、CA-125標誌與米勒抑制受質受器 第 II 型（Muellerian Inhibitory Substance (MIS) Receptor type 鲁 II)、sTn (唾液酸化 Τη 抗原（sialylated Τη antigen; TAG-72) )、FAP (纖維組織母細胞活化抗原（fibroblast activation antigen))、内皮唾（液）酸蛋白（endosialin)、 EGFRvIII、LG、SAS 與 CD63。 “治療”定義為將一組合物給予病患，以治癒' 減輕、 緩和、治療、避免或改善失調、失調的症狀、對於失調的 疾病狀態第二期或傾向於疾病的體質為目的。“有效量” 為組合物的量其具有產生一醫藥上令人滿意的結果，例如 ®上述於-被治療的病患。 h Wvo的方式為將一有療效的組合物（例如，包含本 發明蛋白質複合物之組合物）給予病患。一般而言，將複 合物懸浮於一藥學上可接受的載體(carrier)(例如生理食鹽 水）與將其以口服給藥或藉由靜脈内（intravenous)注入或注 射或灌入皮下（subcutaneous)、肌肉内（intramuscular)、虫知蛛 膜下腔（intrathecal)、腹腔内（intraperitoneal)、直腸内 (intrarectal)、陰道内（intravaginal)、鼻内（intranasal)、胃内

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 28 1373475 : (intragastrical)、氣管内（intratracheal)或肺内 (intrapulmonary)。 劑量要求是依據所選擇的給藥途徑；配方性質；病患 . 疾病的性質；病患體型、體重、表面積、年紀與性別；病 患被給予的其他藥物與主治醫師的判斷。適當的劑量範圍 « · 在0.01-100.0 mg/kg。在可得成分的多樣化與多種給藥途徑 的不同功效的觀點下，劑量需求的多樣性是被期待的。例 如，口服給藥比靜脈内注射給藥被期待為需要較高的劑 籲 量。可調整這些劑量程度的多樣性利用標準經驗程序 (standard empirical routines)以最佳化’而此為本發明領域 所周知。概括成分於一適當的傳送運載工具（vehicle)(例 如聚合微粒子（polymeric microparticles)或植入裝置 (implantable devices))，可增加傳送的效率，特別是對於 口服傳送而言。 本發明範圍亦涵蓋一藥學組合物，其包括一藥學上可 接受的載體與一有效量之本發明蛋白質複合物。可使用此 ® 藥學組合物來治療上列症狀。藥學上可接受之載體包括一 溶劑、一分散媒(dispersion medium)、一套膜(coating)、一 抗i)與抗真菌試劑與一等渗透壓與吸收延遲（absorption delaying)試劑。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將 要學組合物配置成劑型（dosage form)。 可鑑定本發明一組合物的功效於b v/vo與h vz7ro兩 者。對於k Wvo的研究，可注射組合物於一動物（例如， 一小鼠模型），以及之後記錄其治療功效。根據這個結果，

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 29 可決定適當的劑量範圍與給藥方式。 【貫施例1】 將M13嗟囷體展示資料庫（phage display library)進行 篩選以鑑定人類單鏈變化片段(scFv)，其與EGFR專一性結 合。並對一些複製體（cl0ne)進行鑑定。在藉由西方墨點 (Western Blotting)與酵素免疫分析法（Enzyme-linked immunoassay，ELIS A)(以下簡稱ELIS A )確認後為了進一 步的實驗’選出一個複製體，erb_scFv。獲得一個編碼出 erb_scFv的cDNA與藉由標準方法將其連接至一表現載 體。erb_scFv的多胜肽序列為序列識別號：i(SEQ ID:1)與 編碼出其之核苷酸序列為序列識別號：2(SEQ ID:2)。 序列識別號：1

MetAlaGluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGl yGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTy rAlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSer

AspIleGlyAlaSerGlySerAlaThrSerTyrAlaAspSerValLysGlyA

rgPheThrlleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetA

snSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysSerThrT hrThrPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGl yGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerThrAspIleGl nMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThr

IleThrCysArgAlaSerGlnSerlleSerSerTyrLeuAsnTrpTyrGlnGl nLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrAspAlaSerAlaLeuGln

SerGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThr 0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 30

LeuThrlleSerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGln

GlnTyrAlaAspTyrProThrThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleL ysArg 序列識別號：2

ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCT

TGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA

GCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTG

GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC

TCAGATATTGGTGCTTCTGGTTCTGCTACATCTTACGCA

GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACA

ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTG

AGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATC

TACTACTACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGG

TCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGG

TGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATG

ACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA

CAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTA

GCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAA

GCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCGCTTTGCAA

AGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGG

GACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTG

AAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTATGCTGATT

ATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATC 0648-A22020TWF(N2>: P 丨 3940023TW 31

AAACGG 之後將表現載體在昆蟲細胞株果蠅S2 中表現。純化抗-EGFR erb_scFv以及進行西方墨點分析與 ELIS A來確認其專一性抵抗EGFR。 實行RT-PCR來從融合瘤細胞株中獲得cDNA其編碼 出抗-CD3單株抗體0KT3的重鏈變異區域(VH)與輕鏈變異 區域(VL)。之後將兩個cDNA連結以產生一融合序列，其 編碼出一 0KT3的VH-VL之融合蛋白質。此融合蛋白質之 序列為序列識別號：3(SEQID:3)與將其編碼出的cDNA序 列為序列識別號：4(SEQ ID:4)。 序列識別號：3

ValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAlaSerVal

LysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrArgTyrThrMetHis

TrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyTyrlleAsnP roSerArgGlyTyrThrAsnTyrAsnGlnLysPheLysAspLysAlaThr

LeuThrThrAspLysSerSerSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeu

ThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysAlaArgTyrTyrAspAspHis

TyrCysLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGly

GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleVal

LeuThrGlnSerProAlalleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrM etThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLy

sSerGlyThrSerProLysArgTrpIleTyrAspThrSerLysLeuAlaSer 0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 32 1373475

GlyValProAlaHisPheArgGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuT hrlleSerGlyMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTr pSerSerAsnProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluLeuLysAr g 序列識別號：4

GTCCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGAC

CTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGC

• TACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACA GAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTA ATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCA AGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAG CACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGG ACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATC ATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTG

• GCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTAACCCAG TCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGT CACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACA TGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAA AAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAG TCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCT TACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGC TGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCAT (s

0648-A22020TWF(N2)：Pl3940023TW 33 1373475

TCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACG

A 執行相同的步驟來獲得cDNA其編碼出抗-EGFR單株 抗體528之VH與VL以及一融合序列其編碼出抗-EGFR 528 的VH- VL之融合蛋白質。528單株抗體與EGFR結合於細 胞膜，例如於人類下皮細胞癌（epidermoid carcinoma)A431 細胞上。528單鏈抗體的序列為序列識別號：5(SEQ ID:5) 與將其編碼出的cDNA序列為序列識別號：6(SEQID:6)。 序列識別號：5

ValLysLeuGlnGluSerGlySerGluMetAlaArgProGlyAlaSerVal

LysLeuProCysLysAlaSerGlyAspThrPheThrSerTyrTrpMetHis

TrpValLysGlnArgHisGlyHisGlyProGluTrpIleGlyAsnlleTyrPr oGlySerGlyGlyThrAsnTyrAlaGluLysPheLysAsnLysValThrLe uThrValAspArgSerSerArgThrValTyrMetHisLeuSerArgLeuTh rSerGluAspPheAlaValTyrTyrCysThrArgSerGlyGlyProTyrPhe

PheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGly

GlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerMetThrGlnThrPro

LeuSerLeuProValSerLeuGlyAspGlnAlaSerlleSerCysArgSerS erGlnAsnlleValHisAsnAsnGlylleThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGl nArgProGlyGlnSerProLysLeuLeuIleTyrLysValSerAspArgPhe

SerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThr

LeuLysIleSerArgValGluAlaGluAspLeuGlylleTyrTyrCysPheG

InGlySerHisHisProProThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlu 0648-A22020TWF(N2):P13940023TW 34 1373475 序列識別號：6

GTCAAGCTGCAGGAGTCAGGGTCTGAGATGGCGAGGC

CTGGAGCTTCAGTGAAGCTGCCCTGCAAGGCTTCTGGC « ·

GACACATTCACCAGTTACTGGATGCACTGGGTGAAGCA

GAGGCATGGACATGGCCCTGAGTGGATCGGAAATATTT

ATCCAGGTAGTGGTGGTACTAACTACGCTGAGAAGTTC

AAGAACAAGGTCACTCTGACTGTAGACAGGTCCTCCC

• GCACAGTCTACATGCACCTCAGCAGGCTGACATCTGAG GACTTTGCGGTCTATTATTGTACAAGATCGGGGGGTCC CTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCA CCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGG CTCTGGCGGTGGCGGATCGATGACCCAAACTCCACTCT CCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCT TGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATAATAATGGAATC ACCTATTTAGAATGGTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTC

• TCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTT CTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGG GACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTAGAGGCT GAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACAT CATCCTCCCACGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAA

cDNA 其編碼出上述抗-EGFR scFv03、OKT3 VH-VL 與 抗-EGFR VH- VL分別讀框内融合至人類迷你膠原蛋白XXI

(S

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 35 cDNA，其包括一短樞紐序列於5 ’端以及一組胺酸標籤序 列於3’端。人類迷你膠原蛋白XXI之多胜肽與cDNA序列 分別為序列識別號：7(SEQ ID:7)與序列識別號：8(SEQ ID:8)。 序列識別號：7

GlyGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys

ProArgSerlleProGlyProProGlyProIleGlyProGluGlyProArgGI yLeuProGlyLeuProGlyArgAspGlyValProGlyLeuValGlyValPr

oGlyArgProGlyValArgGlyLeuLysGlyLeuProGlyArgAsnGlyG luLysGlySerGlnGlyPheGlyTyrProGlyGluGlnGlyProProGlyPr oProGlyProGluGlyProProGlylleSerLysGluGlyProProGlyAsp

ProGlyLeuProGlyLysAspGlyAspHisGlyLysProGlylleGlnGly

GlnProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCysPheSerVallleA laArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyrSerLeuAspAspSer

SerHisHisHisHisHisHisSerSerGly (註：Pro=脯胺酸或羥基脯胺酸殘基） 序列識別號：8

GGCGGCCGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA

CATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCT

GGTCCGATAGGCCCAGAGGGTCCCAGAGGATTACCTGG

TTTGCCAGGAAGAGATGGTGTTCCTGGATTAGTGGGTG

TCCCTGGACGTCCAGGTGTCAGAGGATTAAAAGGCCTA

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 36 1373475

' CCAGGAAGAAATGGGGAAAAAGGGAGCCAAGGGTTT GGGTATCCTGGAGAACAAGGTCCTCCTGGTCCCCCAGG TCCAGAGGGCCCTCCTGGAATAAGCAAAGAAGGTCCT CCAGGAGACCCAGGTCTCCCTGGCAAAGATGGAGACC ATGGAAAACCTGGAATCCAAGGGCAACCAGGCCCCCC • r

AGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGC CAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTATAGT CTAGACGACAGCAGCCATCATCACCATCACCATAGCAG ® CGGC 將產生的三個表現載體共轉植（co-transfected)至果蠅 *S2)細胞。培養這些細胞於保米黴素 (blasticidin)存在的情形下，以篩選出抗保米黴素的細胞。 收集細胞培養懸浮物以及藉由西方墨點與ELISA來篩選出 抗EGFR與CD3之抗體。發現一些複製體的細胞穩定地表 現三重螺旋複合物。這些三重螺旋複合物，如.人類迷你膠 原蛋白XXI為抗熱與胃蛋白酶(pepsin)。更重要的是，其專 一性與EGFR及CD3兩者結合。 【實施例2】 在此實施例中，生成三個融合多胜肽： OKT3_scFv-Col、erb_scFv-Col 與 erb_NSPD。 噬菌體資料庫的篩選 藉由篩選一人類單折scFv噬菌體展示圖書館 (Tomlinson I + J； kindly provided by I. M. Tomlinson and G.

0648-A22020TWF(N2)；P13940023TW 37 1373475 - Winter, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)，來分離erb嘆質體(phagemid)，其包括一表皮生長因 子受器細胞外區域（epidermal growth factor receptor .extracellular domain，EGFR-ECD)結合變異片段(scFv)。使 • ψ 用免疫管（immunotube) (Maxisorp; Nunc, Roskilde, • r

Denmark)來執行篩選，其中免疫管以10 /xg經純化重組的 EGF 受器（EGFR-ECD; Research Diagnostics, Inc.)的細胞外 區域包覆。根據製造商使用手冊來進行封鎖(blocking)、淘 ® 洗(panning)、清洗、沖提(elution)與沖提出之嗟菌體的再增 幅（reamplification)。 重組質體的建造 從erb噬質體將編碼出erb之scFv的cDNA以PCR進 行增幅。藉由從OKT3融合瘤（ATCC, CRL-8001)的反轉錄 產物，獲得一序列其編碼出鼠科動物的IgG2a抗-CD3 mAb(Ortho Pharmaceutical Corporation)。根據公開的核苷 酸序列藉由RT-PCR獲得OKT3之VL與VH之cDNA。藉 • 由以一甘胺酸連接器（glycine-linker)(GGGS)3連接VH與VL 鏈來生成erb與OKT3的scFv PCR融合。 為了生成scFv-Col，scFv-Col的編碼區域包括一 N端 scFv核苷酸序列與C端人造的膠原蛋白支架基因編碼出一 EPKSCDKTHTCPPCPRSIP(GPP)i〇GICDPSLCFSVIARRDP FRKGPNY的胜肽序歹ij，其包括一人類igG的框紐區域、 一膠原蛋白區域（晝底線）與一膠原蛋白XXI型的NC1 區域。人造的膠原蛋白支架多胜肽與cDNA序列分別為序

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 38 1373475 - 列識別號：9(SEQ ID:9)與序列識別號：l〇(SEQ ID:10)。 序列識別號：9 . GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSer IleProGlvProProGlvProProGlvProProGlyProProGlvProProGl > ψ yProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlylleCvs

AspProSerLeuCysPheSerVallleAlaArgArgAspProPheArgLys

GlyProAsnTyr 序列識別號：10

GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC

CGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCCCCA

GGTCCTCCAGGACCCCCAGGGCCCCCAGGCCCCCCCG

GGCCGCCTGGACCCCCAGGGCCACCAGGCCCCCCAGG

CATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCA

GAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTAT 此人造序列（SEQ ID: 10)是藉由部分重疊的PCR與複 製體兩側具有Notl與Xhol位之PCR產物至載體 pSecTag2/Hygro (Invitrogen)的相同位置來製備。複製體erb 與OKT3讀框内至上述包括C端膠原蛋白支架的建構載體 (construct)於 AscI 與 Notl 位置以分別製作 erb_scFv-Col 與 OKT3_scFv-Col 的表現建構載體（expression construct)。 之後生成erb_NSPD-scFv°NSPD-scFv的編碼區域包

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 39 括N端人類介面活性蛋白質D(SPD)(膠凝素家族的一成 員）的254個胺基酸與一 scFv位於C端。N端人類介面活 性蛋白質D之254個胺基酸的多胜肽與cDNA序列分別為 序列識別號：11(SEQIDN0: 11)與序列識別號：12(SEQID NO: 12) 序列識別號：11

MetLeuLeuPheLeuLeuSerAlaLeuValLeuLeuThrGlnProLeuGl yTyrLeuGluAlaGluMetLysThrTyrSerHisArgThrMetProSerAl

aCysThrLeuValMetCysSerSerValGluSerGlyLeuProGlyArgA spGlyArgAspGlyArgGluGlyProArgGlyGluLysGlyAspProGly

LeuProGlyAlaAlaGlyGlnAlaGlyMetProGlyGlnAlaGlyProVal

GlyProLysGlyAspAsnGlySerValGlyGluProGlyProLysGlyAs pThrGlyProSerGlyProProGlyProProGlyValProGlyProAlaGly

ArgGluGlyProLeuGlyLysGlnGlyAsnlleGlyProGlnGlyLysPro

GlyProLysGlyGluAlaGlyProLysGlyGluValGlyAlaProGlyMe tGlnGlySerAlaGlyAlaArgGlyLeuAlaGlyProLysGlyGluArgGl yValProGlyGluArgGlyValProGlyAsnThrGlyAlaAlaGlySerAl aGlyAlaMetGlyProGlnGlySerProGlyAlaArgGlyProProGlyLe uLysGlyAspLysGlylleProGlyAspLysGlyAlaLysGlyGluSerGl

yLeuProAspValAlaSerLeuArgGlnGlnValGluAlaLeuGlnGlyG

InValGInHisLeuGInAlaAlaPheSerGInTyrLysLysValGluLeuP

he 0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 40 序列識別號：12

ATGCTGCTCTTCCTCCTCTCTGCACTGGTCCTGCTCAC

ACAGCCCCTGGGCTACCTGGAAGCAGAAATGAAGACC

TACTCCCACAGAACAATGCCCAGTGCTTGCACCCTGGT

CATGTGTAGCTCAGTGGAGAGTGGCCTGCCTGGTCGC

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AGGGGACAATGGCTCTGTTGGAGAACCTGGACCAAAG

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CTGGAGACAAAGGAGCAAAGGGAGAAAGTGGGCTTC

CAGATGTTGCTTCTCTGAGGCAGCAGGTTGAGGCCTTA

CAGGGACAAGTACAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCA

GTATAAGAAAGTTGAGCTCTTC 將N端SPD cDNA複製體至表現載體pSecTag2/Hygro (Invitrogen)於Nhel與AscI位置。erb的scFv讀框内複製

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 41 1373475 ·- 體至上述包括N端SPD的建構載體於AscI and Xhol位置 以製作erb_NSPD-scFv的表現建構載體。 每個 erb_scFv-Col、erb_NSPD-scFv 與 OKT3_scFv-Col . 的開放讀碼區（open reading frame)包括序列，其編碼出N 端先導序列（leader sequence)以及以分泌、偵測與純化為目 的的C端抗原決定位/聚組胺酸(p〇lyhistidine)標籤。 表一為藉由上述表現建構載體所編碼出之多種重組蛋白質 /抗體。 表1、於本研究中使用的多種抗體 抗體 標的 形式 抗體來源 erb_scFv-Col EGFR-ECD CSA1 人類 erb_scFv-Fc EGFR-ECD scFv-Fc 人類 erb_scFv EGFR-ECD scFv 人類 erb_NSPD-scFv EGFR-ECD CSA 人類 OKT3_scFv-Col CD3 CSA 鼠科動物 0KT3 CD3 IgG 鼠科動物 膠原蛋白支架抗體 抗體的表現與純化 為了生成重組蛋白質/抗體’根據製造商使用手冊使用 Effectene (Qiagen)將前述建構載體轉植至小鼠骨趙瘤 (myeloma) NS0細胞。在以效高黴素(hygromycin)篩選4週

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 42 1373475 後’將每個穩定的複製體（clone)培養於一震盪燒瓶内以起 始接種密度為2x105細胞/ml於包括2%胎牛血清的限定培 養基（chemically-defined medium) HyQCDM4NS0 (Hyclone) 中。培養維持在150 rpm 5天於37°C。為了使那些帶有表 現載體的細胞編碼出蛋白質’每天加入維生素C化鈉 (Sodium ascorbate) (80 pg/ml)於培養基中，其中上述蛋白 質包含前述抗體區域與膠原蛋白支架區域，即勝原蛋白支 架抗體（CSA)。 為 了純化 erb scFv、erb_scFv-Fc、erb scFv-Col 或 OKT3一scFv-Col蛋白質或蛋白質複合物，提供每種過濾細 胞培養基約2L至一 T-凝膠管柱（1.5 X 8 cm, Pierce)以 50mM的Tris-HCl緩衝溶液(pH8)60ml/小時的流速下。在 以相同的緩衝溶液清洗後，.以50mM的醋酸鈉緩衝溶液 (pH4)沖提出蛋白質或蛋白質複合物。在280nm監測其UV 吸收’並將其提供高峰部分置於一硫酸鋅螯合Sepharose

HighTrap 管柱（1-ml in bed volume，GE Healthcare)，在 60ml/ 小時的流速下以包含0.5M NaCl的50mM的Tris-HCl緩衝 溶液(pH8)平衡。先以20mM的^^(iinidazole)清洗，之後 以0.25M的咮唑於相同的緩衝溶液沖提出鍵結的蛋白質。 最後的製備為以50mM’ ρΗ7·0的Hepes緩衝溶液進行透析。 之後使用具有MOPS之10%NuPAGE bis-Tris聚丙稀 醯胺膠體或7% SDS/Tris-醋酸聚丙烯醯胺膠體以醋酸鈉 作為電泳緩衝溶液（running buffer) (Invitrogen)執行 SDS-PAGE。之後將蛋白質以考馬斯亮藍（Coomassie

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 43 1373475 ’· brilliant blue)R-250進行染色。藉由密度儀利用 Chemilmager 5500 (Alpha Innotech, San Leandro, CA)以 Alpha EaseFC (v. 4.0; Alpha Innotech)軟體來定量蛋白質條 . 紋（band)的密度。 為了驗證三重螺旋的本質，將經純化的 erb_scFv-Col(lmg/ml)置於37°C在DTT缺少或存在的情況 下培養1小時。一份經DTT處理過的樣本，更進一步與 50mM N-乙基順 丁烯二酿亞胺（N-ethyl-maleimide, NEM)反 B 應30分鐘於室溫下以永久地妨礙自由硫化氫根（suifhydryj) 與三聚體的再形成。將每個樣本的蛋白質取等量於7% SDS/Tris-醋酸聚丙烯醯胺膠體以醋酸鈉作為電泳緩衝溶液 進行電泳。以考馬斯藍（Coomassie blue)進行膠體染色。發 現經純化的CS A為同三聚體(homotrimer)或鏈間雙硫鍵六 / 聚體(heximer) ’在輕微的還原環境下其可被分離成兩個三 聚體。 測試erb_scFv-Col之三聚體結構的熱穩定度。在含有 2M 尿素（urea)的 50mM Tris-HCl(pH8)中，經純化的 erb_scFv-Col 於室溫下以缺少或存在 10ηιΜ tris(2-carboxyethyl)ph〇sphine (TCEP)進行處理。於室溫將 還原的樣本以50 mM的NEM進行院化（alkylate)。與SDS 載入膠片緩衝溶液（loading buffer)混合之前將每個樣本取 等量蛋白質於35、45、55、65、75與85。(：下加熱10分鐘。 於非還原狀態下樣本在1〇%NuPAGE bis-Tris聚丙烯醯胺 膠體與MOPS緩衝溶液進行電泳。以考馬斯藍（c〇〇massie

0648-A22020TWF(N2) ：P 13940023TW 44 1373475 ' blue)進行膠體染色。結果顯示erb_scFv-Col三聚體具有高 熱穩定度。在經65°C處理10分鐘之後仍然保留多於50% 的三聚體。且發現了 erb_scFv-Col膠原蛋白區域的三聚體 .. 結構被脯胺酸化(prolyl hydroxylate)。 結合研究 使用 BIAcore X biosensor (BIACORE, Inc.，Uppsala, Sweden)於缓衝液 HBS-EP (10 mM HEPES，pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20)中測量 erb • 抗體之變體對EGFR-ECD的結合動力學。簡單來說，將 EGFR-ECD固定於一 C1感應晶片經由胺（amine)連結至 1700反應單位（response units, RU)的程度以及在10μ1/分鐘 的流速下注乂不同濃度之經純化的抗體。藉由注入5μ1 10mM甘胺酸-鹽酸(glycine-HCl)(pH3,5)復原表面。在每個 濃度取得感應譜（sensorgram)與使用程式BIA Evaluation 3.2來沖提感應譜。結合數據與1:1 Langmuir結合模型配合 來計算親和力常數，其被定義為分離率（dissociation rate) ® (k&ss)/結合率（association rate) (U的比值。結果顯示於表 2 °

表2、erb抗體的多種形式與固定化的EGFR-ECD結合 之結合動力學 0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 45 1373475 机體 Kss KD M^s'1 s*1 nM erb_scFv_Col 1.72 8.22 4.78 erb_scFv-Fc 0.909 94.4 104 erb scFv 0.15 741 4960 如表2所示，erb_scFv_Col對EGFR-ECD的結合親和 鲁 力分別幾乎為雙價（erb_scFv-Fc)與單價（erb_scFv) mAb的 20 與 1000 倍。 穩定度與藥物動力學(Pharmacokinetic)分析 為了血清穩定度分析，藉由培養人類血清於37°C來測 量 erb_scFv_Col 、erb—scFv-Fc 或 erb_scFv 的多種形式的 穩定度。藉由定量EILSA來測量在培養時間的不同時期之 後存留之活化抗-EGFR的量。以使用重組EGFR-ECD (當 作捕捉試劑（capturereagent))與抗-c-myc mAb(9E 10, Sigma 鲁 Chemical Co.) ’之後再以一 HRP結合的親合力純化的多株 山羊抗小鼠IgG與化學冷光受質（chemiluminescent substrate) (Pierce Biotechnology, Inc.) 來執行ELISA。為了 藥物動力學分析，使用三隻BALB/c裸鼠來分析 erb_scFv_Col清除（clearance)。簡單而言，在事先採血之 後，每隻小鼠被皮下（subcutaneously，s.c.)注射 25/ig ( 2mg/ 體重Kg)的erb_scFv_Col。在接下來的70小時中，收集 週期性的血液樣本與藉由EILSA來評估他們erb_scFv_Col

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 46 1373475 : 的含量。結果發現此蛋白質相當穩定。 T細胞增生（proliferation)分析與混合淋巴球反應 (Mixed Lymphocyte Reaction) _ 實行漠化去氧尿嘲α定核苦（5-bromo-2'-deoxyuridine,

BrdU)細胞增生分析。簡單地說，將人類周邊血液單核細胞 (peripheral blood mononuclear cell)置於一黑色 96 孔平底組 織培養盤（flat bottom tissue culture plate)中，在 100 μΐ 包括 10%FBS的RPMI-1640培養基中具有2χ105細胞/孔，於 ® 37°C 在 10 倍連續稀釋的 OKT3(eBioscience，Inc.)或 OKT3_scFv-Col存在下培養66小時。之後將細胞以lOjitM 的BrdU進行脈衝6小時。在移除培養基後，以FixDenat 混合細胞與將DNA變性於一個步驟。之後將細胞與一過氧 化酶（peroxidase)標定抗-BrdU 抗體（anti-BrdU POD, Fab fragments)於室溫一起培養1.5小時。使用微盤式冷光儀 (microplate-luminometer) (Hidex, CHAMELEON detection platform，Finland)來進行化學冷光偵測與定量。 ® 於單向混合淋巴球反應評估T細胞增生與免疫抑制 (immunosuppression)如下。從兩個健康的捐獻者（刺激者 (stimulator)與反應者（responder))獲得人類周邊血液單核細 胞。於37C在包含5% C02的潮濕的空氣中，以25/xg/ml 絲裂黴素C(Sigma-Aldrich)於完全培養基（RPMI 1640補 充10%人類AB血清（human AB serum)、2 mM麵醯胺酸 (glutamine)、50nM2-硫醇乙醇（2-mercaptoethanol)與盤 尼西林（penicillin)與鏈黴素（streptomycin)各 100 單位/ml)

0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 47 1373475 處理刺激者或反應者細胞30分鐘，接著在RPMI 1640中 清洗三次。將反應者細胞單獨培養或與經絲裂黴素C處理 的刺激者或絲裂黴素C反應者細胞以1:1的比例混合，以 200 μΐ的完全培養基中具有2xl05細胞/孔進行培養。在反 應者細胞置入後，立即以不同濃度加入經純化的 OKT3_scFv-Col或ΟΚΤ3於培養基中。5天後將細胞以 ΙΟμΜ的BrdU進行脈衝與在24小時後收取細胞。之後以 上述方法進行細胞增生分析。 結果發現，當表現可忽略的有絲分裂活性刺激T細胞 生長時，〇KT3_scFv-Col於免疫抑制細胞增生更為有效。 細胞激素測量 將人類周邊血液單核細胞以在〇_lml包括l〇%FBS的 RPMI-1640培養基中具有2χ105細胞/孔，於37°C在10倍 稀釋的 OKT3(eBioscience，Inc.)或 OKT3_scFv-Col 存在下 進行培養。收集懸浮物於不同的時間點，以及使用一人類 細胞激素免疫分析套組（eBioscience，Inc.)來測量多種細胞 激素。結果指出，與鼠科動物OKT3 mAb相較而言， OKT3_scFv-Col的實行導致輕微細胞激素釋放。 抗體取代分析

所有接下來的步驟皆在4°C進行。將人類T細胞以 ΙχΙΟ6的密度懸浮於FCM緩衝溶液（磷酸生理食鹽水 (phosphate-buffered saline)與 2 °/〇 FBS 與 0.1%疊氮化鈉 (sodium azide))。細胞以小鼠全 IgG(total IgG) (2 g/mi, Jackson ImmunoResearch Laboratories)處理 30 分鐘與之後 0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 48 1373475 *- 與連續稀釋的OKT3_scFv-Col或0KT3抗體一起培養1小 時。直接加入一 FITC-連結的 0KT3 (0.25 g /ml, purchased from eBioscience, Inc.)的固定飽和量。在培養 1 小時後，將細胞以FCM缓衝溶液清洗以及藉由流式細胞儀 争 · 於一 FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA)上進行免疫 螢光分析。結果顯示為最大螢光強度的抑制百分比，其被 定義為藉由將具有OKT3-FITC的T細胞進行染色於缺少阻 礙抗體(blocking antibodies)的情況下，所獲得的平均螢光 •強度。 結果指出OKT3_scFv-Col與人類CD3 + T細胞結合強 於自然鼠科OKT mAB。 藉由 Bradford 分析（Coomassie plus reagent，來自 Pierce Biotechnology, Inc.)使用人類IgG當作標準，來測量蛋白 質濃度。對於胺基酸分析，將經純化的erb_scFv-Col以 50mM醋酸進行透析、在6NHC1，110°C進行水解24小時 之後以Waters Pico .Tag® system進行胺基酸分析。 ® 這些結果證明膠原蛋白支架抗體在抗腫瘤與免疫調節 (immunomodulatory)的應用上對於治療性的抗體設計是一 理想的結構。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 和範圍内，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 0648-A22020TWF(N2)：P13940023TW 49 1373475 【圖式簡單說明】 第1圖顯示一蛋白質複合物其具有一迷你膠原蛋白三 重螺旋線圈支架，來自人類XXI型膠原蛋白。三重螺旋線 圈的六個端讀框内融合至六個Fv片段其分別具有單鏈抗 體（scFv)的VL與VH區域。 第2A與2B圖分別為第2A圖顯示一蛋白質複合物其 具有一三重螺旋線圈支架，其三個N端分別讀框内融合至 三個單鏈抗體0KT3 (抗-CD3)、528 (抗-EGFR)以及 erb_scFv (抗-EGFR)與第2B圖顯示蛋白質複合物之西方 墨點結果的照片。將從穩定轉殖果蠅S2細胞的培養基於非 還原狀態下在SDS-PAGE進行電泳與之後以一單株抗體免 疫墨點結合至XXI型膠原蛋白（3E2)的C端。T :鍵間雙硫 鍵三體；Mt :單體包括鍵間雙硫鍵三體。 第3圖顯示一蛋白質複合物其具有一三重螺旋線圈支 架。上述三重螺旋線圈支架的三個N端讀框内融合至三個 0KT3單鏈抗體；三個c端讀框内融合至三個528單鏈抗 第4A與4B圖顯示不同形式抗體的圖式：第4A圖顯 示膠原蛋白支架抗體：scFv-Col (左圖）包括一氨基端 scFv、一人類IgG樞紐(hinge)區、一膠原蛋白區域(GPP)1〇 與一 XXI型膠原蛋白羧基端NC1區域；NSPD-scFv(右圖） 包括一介面活性蛋白質D(surfactant protein D, SPD)膠凝 素的氨基端部分與一 scFv於羧基端。第4B圖由左到右分 別顯示免疫球蛋白G(IgG)、嵌合的（scFv-Fc)與單鏈抗體

0648-A22020TWF(N2) ；P 13940023TW 50 1373475 (scFv)與它們個別大約的分子量。灰色區域顯示VH與VL 片段；虛線：鏈間雙硫鍵。 【主要元件符號說明】 … 101〜迷你膠原蛋白 ^ 401'ί框紐區域 403〜（GPP) 10的膠原蛋白區域 405〜膠原蛋白XXI型之NC1區域或其他目標結合區 • 域 407〜膠凝素之Ν端區域 409〜膠凝素之類膠原蛋白（collagen-like)區域 411〜膠凝素之α螺旋頸部區域

0648-A22020TWF(N2):P13940〇23TW 51

Claims (1)

1373475 第 95146830 號 申請專利範圍 d年U月/曰修(更)正本 公告本 » 多正本 1. 一種重組蛋白質複合物，包括： 一第一融合多胜肽鏈，包括一第一支架區域與一第一 異源性（heterologous)區域融合至該第一支架區域的一端， 其中s亥弟一異源性區域包括一結合區域(binding domain)， 或包括一酵素性區域或一螢光蛋白質的序列；

一第二融合多胜肽鏈，包括一第二支架區域；以及 一第三融合多胜肽鏈’包括一第三支架區域； 其中該第一、第二或第三支架區域包括一個或多個三 重螺旋重複單元，每個重複單元係由下列公式的一序列所 組成：（Xl-X2-X3)n，其中XI是一甘胺酸(Giy)殘基，χ2 或X3是任何胺基酸殘基’ η大於或等於5，且， 其中該第一、第二與第三支架區域因此互相排列形成 一自身三聚體化之三重螺旋線圈（helix c〇il)。

2. 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白質複合物， 其中該結合區域包括一配體(ligand)結合區域、一配體、一 受器（receptor)、一親和性標籤（affinity tag)或一醣蛋白 (proteoglycan) ° 3. 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白質複合物， 其中該結合區域包括一免疫球蛋白的一個或多個互補決定 區（complementarity determining region)。 4. 如申請專利範圍第3項所述之重組蛋白質複合物， 其中該結合區域包括一抗原結合片段的序列。 5. 如申請專利範圍第4項所述之重組蛋白質複合物， 1373475 第$146830號 修正日期:99.11.25 修正本 其中該抗原結合片段與CD3或EGFR專—性結合。 6.如申請專利範圍第4項所述之重組蛋白質複合物， 其中該抗原結合片段包括一單鏈抗體的序列。 7·如申睛專利範圍第1項所述之重組蛋白質複合物， 其，中該第-齡多雌鏈更包括_第二異源性區域融合至 該第一支架區域的另一端。 8.如申請專利範圍第7項所述之重組蛋白質複合物， 其中該結合區域包括—第一單鏈抗體的序列，且該第 鏈抗體與CD3專一性結合。 复9.如申請專利範圍第7項所述之重組蛋白質複合物， 其中該第二異源性區域包括—第二單鏈抗體的序列，且該 弟二單鏈抗體與EGFR專一性結合。 人 其ία，申請專利範圍第7項所述之重組蛋白質複合物， 該第二融合纽肽鏈包括—第三異源性區域融合至該 一'支架區域的一端。 物，1it申請專利範圍第1G項所述之重組蛋白質複合 合至，該第二融合多胜肽鏈更包括—第四異源性區域融 Ί一支架區域的另一端。 物，^申請專利範圍第11項所述之重組蛋白質複合 至”該第三融合纽肽鏈包括—第五異祕區域融合 落第二支架區域的一端。 物，1專利範圍第12項所述之重組蛋白質複合 至該第-1融合多胜狀鍵包括一第六異源性區域融合 一支架區域的另一端。 1373475 第 95146830 號 修正本 修正日期:99.11.25 14. 如申請專利範圍第！項所述之重組蛋白質複合物， 其=該第-、第二或第三支架區域包括—個或多個叫、 膠凝素（collectin)或一膠原蛋白多胜肽鏈的三重螺旋重複。 15. 如申請專利範圍第丨項所述之重組蛋白質複合物， 其中Μ是一脯胺酸(pr〇line)或經基脯胺酸(hydr〇xp 16. 如申請專利·第〗項所述之重組蛋白質複合物， 鲁其中每個重複單元包括一（GPP)】。的序列。 17. 如申請專職圍第丨項所述之重組蛋白質複合物， 其中該第一、第二與第三融合多胜肽為實質相同。 18. —種重組融合多胜肽，包括： 一支架(1域’用以形成—自身三聚體化之三重螺旋線 圈，其中該支架區域包括一個或多個三重螺旋重複單元， 每個重複單元係由下列公式的—序列：（χι_χ2·χ3)η所組 成，其中X1是一甘胺酸(Gly)殘基，χ2或χ3是任何胺基 鲁酸殘基與η大於或等於5 ;以及 一第一異源性區域融合至該支架區域的一端，其中該 異源性區域包括一配體結合區域、一配體、一受器或一多 _ 類（polysaccharide)。 19. 如申請專利範圍第18項所述之重組融合多胜肽， 其中X3是一脯胺酸或羥基脯胺酸殘基。 20. 如申請專利範圍第18項所述之重組融合多胜肽， /、更包括一第二異源性區域融合至該支架區域的另一端。 21. 如申請專利範圍第18項所述之重組融合多胜肽， 1373475 第 95146830 號 修正日期:99.11.25 修正本 其中該支架區域包括一個或多個Clq、膠凝素或一膠原蛋 白多胜肽鏈的三重螺旋重複。 22. 如申請專利範圍第18項所述之重組融合多胜肽， 其中該異源性區域是藉由噬菌體展示篩選（phage display screening)獲得。 23. —種被分離的核酸，包括一序列其編碼出申請專利 範圍第18項所述之一融合多胜肽或一其互補序列。 24. —種宿主細胞，包括一申請專利範圍第23項所述 之核酸。 25. 如申請專利範圍第24項所述之宿主細胞，其中該 細胞是哺乳類動物或昆蟲細胞。 26. 如申請專利範圍第25項所述之宿主細胞，其中該 哺乳類動物細胞為小鼠骨髓瘤（myeloma) NS0細胞。 27. —種表現載體(expression vector)，包括一申請專利 範圍第23項所述之核酸。 28. —種生產融合多胜肽的方法，包括： 於准許一多胜肽表現的情況下培養申請專利範圍第24 項所述之該宿主細胞，其中該多胜肽是藉由該核酸編碼， 以及 從該被培養的細胞或該細胞的培養基中純化該多…胜 肽。 29. —種生產申請專利範圍第1項所述之蛋白質複合物 的方法，包括： 於准許多胜肽表現與一三重螺旋線圈形成的情況下培 1373475 第95146830號 修正曰珣:99.11.25 修正本 養一宿主細胞，該宿主細胞包括： 一第一核酸其編碼出該第一融合多胜肽鏈； 一第二核酸其編碼出該第二融合多胜肽鏈；與 一第三核酸其編碼出該第三融合多胜肽鏈，其中該多 胜肽是藉由該三個核酸所編碼；以及 從該被培養的細胞或該細胞的培養基中純化該蛋白質 複合物。 30.如申請專利範圍第29項所述之生產蛋白質複合物 的方法，其中該宿主細胞為一真核細胞（eukaryotic cell)， 其包括一使一脯胺酸殘基經基化(hydroxylate)的酵素活性。