TWI353880B - Verfahren zur selektiven bindung eines substrats a - Google Patents

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1353880 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種製造至少一種 担w &人 附劑之方法，其可選 擇性、具有至少兩個具有結合能力之不同基圓之基質， 及利用該吸附劑選擇性結合該基質 主工L、 土貝炙方法。該吸附劑係自 表面上分別具有至少兩個具有結合 刀之不冏基團之吸附 劑來口庫中檢測到，且該等基團係藉由分解合成或天然基 質形成含有此等基團之組成元件中而得。選擇性結合法特 別適合單離合成或㈣活性成分及較與判別活性成分之 功能與特性。本發明另〜項目的為選擇性結合基質所形成 之之吸附劑基質·複合物，本發明亦有關包含吸附劑與基質 之組合集合庫，其最好分別具有至少兩個不同胺基酸-、糖_、、 核替酸m咬_與/或„票吟驗基_之殘基作為具有处 合能力之基團。選擇性結合之方法及組合集合庫可用於檢 測基質-受體-交互作用，謠還％ 士、八 π用師選活性成分，選擇性分離異構性 化合物’選擇性分離與純化基質。 【先前技術1 自生物親和性層析法已知，可在無法溶解之高分子擔體 物質表面上，以化學法固定具有特別高親和性之特定生物 分子物質。因此可能結合或滯留。 固定在該擔體上之材料主要為生物性生物性聚合物。另 一方面，亦可在其表面上固定低分子材料，以結合或保留 生物性聚合物。 ” 當吸附劑與基質出現互補基團時，—般具㈣高之親和 92216.doc 1353880 性供互相結合。互補基團實例為親水性基團，其利用氫鍵 或偶級或多極交互作用，而成功結合。 已知生物系統可同時利用多個分子接觸位置而交互作用 (M. Whitesides 等人，Angew. Chem. 1998, 110, 2908-2953)。 亦自WO 00/32649中已知，可利用聚合物作為吸附劑來分 離基質，及藉助此等吸附劑分離基質之方法。該分離法利 用至少兩種不同交互作用。吸附劑中具有結合能力之基團 可作為受體，其可為單一種基團，或亦可為兩種或多種不 同基團。 專利案 WO 00/32648、WO 01/38009與 WO 00/78825 中亦 證實，吸附劑/基質-交互作用為至少二價鍵之先決條件。 此等方法中，當採用該基質作為吸附劑之一部份時，針 對此等基質之結合作用目的，必須認知合適生物性聚合物 且可以製造。反之，若吸附劑上之生物性聚合物利用低分 子材料結合時，後者同樣必須已認知且不需改變所固定擔 體之結合特性。 亦已知一種在聚合性化合物上提供合成基團之方法，可 供結合生物性或結合藥物性活性物質。作為生物性或藥學 性有效物質之模板分子即可固定在聚合性化合物上。待反 應性官能基與聚合性化合物偶合而與基質結合後，可再溶 解出模板分子（WO 00/13016)。 此外亦已知一種選擇性分離特定有機化合物之方法。其 作法為在擔體表面上承載與所要分離之化合物互補之基 團。所分離之化合物最好為具有可離子化基團之大分子。 92216.doc 1353880 在擔體表面上進行結合之基團與該大分子之電價相反。在 吸附劑上僅有一種基團可成功結合（W〇 93/19844)。 此外US 2002/0155509 A1中亦揭示一種可自基質混合物 中選擇性分離基質之方法。其係由基質混合物與各種不同 吸附劑及溶離劑接觸。藉由解吸光譜測法即可判斷該基質 在所選用之吸附劑/溶離劑組合下是否與吸附劑結合及其 結合強度。吸附劑與溶離劑可以變化，直到找到適合選擇 性分離基質之吸附劑/溶離劑組合為止（有關吸附劑與基質 之見解可能與US 2002/0155509 A1中之定義相異，該專利案 之揭示内容己以引用之方式併入本文中 亦已知一種由極性基團與長鏈烷基共同固定在擔體表面 上，所形成吸附劑具有至少兩個具有結合能力之不同基 團。第一個反應步驟中，最好具有中鏈或長鏈烷基取代基， 例如：（^-或^8·烷基之氯矽烷，與擔體表面上之基團， 例如：矽膠之矽烷醇基反應，使該烷基固定在擔體之表面 上。第二個步驟中，由擔體之表面與三f氧基-或三乙氧基 •矽烷反應，在冰解階段中被醇裂解，形成矽烷醇基。亦可 由矽化合物如，例如：烷基三烷氧基矽烷，如，例如：十 八碳烷基三甲氧基矽烷，與擔體表面之〇沁基團反應，其中 首先固定烷基。未反應之烷氧基即在水解形成矽烷醇基團 之反應下產生第二個具有結合能力之基團。此等吸附劑應 特別用於結合水溶液中之基質（Column Watch，LC*GC：

Europe，2002年 12月，第 780-786 頁）。 若尚未知其結構與/或結合特性之基質利用吸附劑分離 92216.doc I353880 時，相關技藝上已知方法.s & 、商入…“士入 通㊉無法預期該指定吸附劑是否 適擇性l合基質及其 転度。因此大多耗費在尋求 已知吸附劑對選擇性結合 a 只基貝疋否適當。因此尋求合 適之吸附劑則需靠運氣。 【發明内容】 本發明之目的為提供一種贺 禋ι&可針織目標，自基質混合 物中分離所需基質之吸附劑 . 附劑之方法，較佳為分離具有生理 活性之基質。本發明亦提供一 捉保種利用該吸附劑自基質混合 物中分離該基質之方法。 此等目的可藉助於至少—插 ^種具有至少兩個具有結合能力 之不同基團之吸附劑達成，马·笙Α 忒等基團可與基質上至少兩個 互補之一價基團交互作用。此作用比供、g 1ω s 1F用比低選擇性至無選擇性 之單價交互作用更強。因此曰萨仆人& u此目徐化合物與吸附劑之結合力 量比同時競爭結合之單價化合物更強數倍，因而達到選擇 性結合之目的。反之’藉由一種已利用吸附劑集合庫檢測 出所必要之特性之最適化吸附劑，即可在同時競爭結合之 其他多價基質中達成選擇性結合之目的。 本發明目的在於製造至少一種具有至少兩個具有結合能 力之不同基團之吸附劑之方法，供選擇性結合基質，其特 徵包括下列步驟⑴至（π): ω自合成或天然之第一基質中檢測至少兩個可與吸附劑 結合之基團， (11)使至少兩個可與合成或天然之第二基質結合之不同其 團’分别承載在擔體上，形成至少一種吸附劑，其中 92216.doc 1353880 該基團與步驟⑴之基團才目同或亦可與該基團互補或不 互補，且步驟⑴）之第二基質可與步驟⑴第一基質之相 同或相異。 人本發明另-項目的亦為—種使至少—種吸附劑選擇性結 »具有至少兩個具有結合能力之不同基團之基質之方法， 其特徵包括下列步驟⑴至（iv): ⑴自合成或天然之第一基質中檢測至少兩個可與一種吸 附劑結合之基團， ⑻使至少兩個可與合成或天然之第二基質結合之不同基 團刀別承載在擔體上，形成至少一種吸附劑，其中該 基團與步驟⑴之基團相同或亦可互補或不互補，且步 驟⑻之第二基質與步驟⑴之第一基質相同或相显， ㈣由至少-種第二基質(其可與⑴項之第一基質相同或 相異）與步驟（n)之至少_種吸附劑接觸， ㈣檢測該至少-種第二基質與步驟㈣之至少一種吸附 劑之結合強度。 本發明可加㈣附劑結合或較目標結合所需基質，藉 以在相對於其他基質下與吸附劑選擇性結合…基質： 合物中分離，亦可改善選擇目標之準確性。 本發明自基質混合物中分離基質之新原理基礎與目前分 離技術原理不同，因為复可达， 马其可為任何需分離之一對基質設計 且達到有效之選擇性分離法。 β 本發明之分離原理将Λ 理係U由至少兩個來自吸附劑之且有灶 合能力之基團.分別與基質之間所建立之非共價鍵之’交互： 92216.doc -10- 1353880 用所進行之預測、定量估算或強度測定為依據。目前分離 技術之原理之依據為自一群涉及極性/非極性或親水性/疏 ^生之粗略5式驗法分離，因此隨機會變化。經常亦無法成 功分離。 較佳者’步驟（ϋ)中基團與步驟⑴基團相同或互補。 本發明定義中，基質指可選擇性結合之所有天然或合成 來原之材料。較佳為活性成分，亦即在活的植物或動物生 物體内具有生理與/或生物性效力之化合物。原則上具有兩 個或多個具有結合能力之基團之所有天然與合成之化學與 生物性化合物均可。較佳為胺基酸、寡肽、核甞酸、核 I、蛋白質、醣蛋白、抗原、抗原決定原、抗體、碳水化 合物、酵素、輔酶、酶、激素、植物驗、糖菩、類固醇、 維生素、代謝物、病毒、微生物、植物性與動物性組織之 内含材料、細胞、細胞片段、細胞器、溶胞物、外源凝集 素、黃素化合物、黃酮與異黃_，及合成性活性成分，如1 醫藥與植物保護劑。 若所結合之话性成分為低分子時，其在文獻中亦常稱為 配位體。進行結合之材料為*白質或高*子，通常稱為受 基質之定義亦包括前M，其可視需要丨進一步修㈣ 作為活性成分。#⑯此加強之活性&分用於定量筛選 時，經常稱為Hit^lLeads，或當用於判別結構特徵時^ 作為骨架、針狀體或藥物團》 ’ 基質之定義中，亦包括其自有經濟利 θ刃用饧值之混合物 92216.doc • 11 - 1353880 離、分離或取得之有效成分。其包括例如：來自加工物流 或廢物流中之低濃度有效成分與副產物。該有效成分可為 有機物，如：肽，或來自體液之物質交換產物，或為無機 物，如.放射性金屬離子或貴金屬之金屬離子。 擔體指固定可作為進行結合之基團之底板或骨架之材 料將此專基團引進擔體上後，即形成吸附劑。當該吸附 劑用於層析法時，亦可作為固相。 吸附劑包括擔體與至少兩個可與一種基質結合之不同基 團之各種組合。 组成元件指基質之-部份或片段，較佳為活性成分，其 至少具有一個結合能力之基團。此等組成元件之實例為抗 ，決定基。組成元件之定義亦可與具有結合能力之基團之 疋義相同》基質内組成元件之三度空間配置經常於下文中 稱為結合位置。組成元件實例可為組胺酸，其帶有咪唑基 作為具有結合能力之基團時，進㈣成脒基或亞胺基，作 為具有結合能力之基團。抗原決定基指基質之分子。抗原 =定基之實例為可與抗體結合之抗原分子。抗原上之此等 抗體結合位置亦成為抗原決定基。 (不同之）具有結合能力之基團定義包括所有可利用共價 或非共價交互作用，與吸附劑與/或基質結合之基團。在英 語文獻中’此定義亦以bindingsiteresidue(結合位置殘基） 表示。其他基團包括文獻中說明適合用於形成 1 所有化合物或化合物之殘基。非共價鍵將於下文中進一半 說明。 / 92216.doc -12- 1353880 具有結合能力之基團較佳為經基、羧基、醯胺、胺基、 異丁基、苯基、破苯基、萘基，但亦可為二醇、經苯基、 羰基、亞胺、伸烷基、炔基、吲哚基與咪唑基。具有結合 能力之基困亦可至少包含-個官能基。但具有結合能力之 基團並不限於官能基。 具有結合能力之基團亦可呈多種能量交互作用形式，亦 即其可進行多種非共價鍵結。例如：。引嗓基基本上在適當 時，可同時以離子鍵、凡得瓦力、w鍵及分散性交互作 用與物質結合。反之茚基可進行離子性交互作用，分散性 交互作用則較弱。 溶劑亦會影響結合性。可藉由選擇溶劑組合達成所需PH 值與溫度。-般而言，有機溶劑中之凡得瓦力交互作用低 於在水性溶劑混合物中。反之，在非質子性溶劑中主要之 氫鍵交互作用會隨水含量增加而顯著下降。 不同意指該基團所含組成元素不同，或組成元素相同但 口方式不同之基團或進行不同化學結合之基團。其相異 處涉及至少兩個具有結合能力之基團，亦包括其與所結合 物質之立體配置。相關之配置實例為不同之立體異構物， 尤指非對映異構物與對映異構物。其實例為順式經基相對 ;反式經|或R型經基相對於s型經基。此等相異性可利 用物^性方法檢測，例如：利用NMR·光譜，因為此等基團 之磁#不同’且得到不同共振訊號之N廳_光譜。亦可採用 X-射線結構分析法進行檢測。此等基團亦可對反應試劑具 有不同反應性。 92216.doc -13- 1353880 具有結合能力之不同基團特別指彼等對所結合物質（第 一基質）之交-互作用能量分別提出不同影響之基團。此等交 互作用能量以交互作用-吉伯氏（Gibbs)能量表示。此等 基團之組成、組態與構形可能相同’但其交互作用部份不 同。例如：麩胺酸衍生物中之羧基即為不同交互作用部份。 不同結合性之鼠李糖殘基亦具有不同交互作用部份可用 於例如：分離柚皮素與芸香:y：。 交互作用-吉伯氏能量之差異可能進而產生大幅之焓 與熵之差異。因此認為所要結合之含羧基物質中兩種離子 性交互作用所涉及之焓-△ H-交互作用所造成之影響幾乎 相同，而第二個結合位置之熵△ S負值則相對較大。 反之’在第一基質與/或第二基質中具有至少兩個具有結 合能力之基團直接相鄰時，其在化學上相同或等同。其對 交互作用之影響有時候僅能逐漸區分或在無法區分之精確 度範圍内。經由衍化程度製備吸附劑時，應考量此等基團 相互之間或與其他有結合能力之基團之間之化學計量比 例。此等衍化程-度亦指測定吸附劑之溶液或懸浮液之濃度。 例如：由能量相同或相近之有結合能力之同等基團製成 類固醇受體。與雌二醇或孕激素結合接觸之基團包括多達 七個白胺酸殘基，其利用烷基與配位體進行非極性結合。 精胺酸、麩醯胺（麩胺酸）與組胺酸亦有三個極性結合位置。 本發明可採用較簡單之方式模擬此等天然受體，因而可依 適當濃度比例關係，引進甲基戊酸之異戊基與極性基團 如：琥珀酸醯.胺及鹼性基團如：胺或咪唑基。 92216.doc -14- 此等吸附劑不僅可依需要與目標分子雌二㈣力結合， yr由一.系列合成與天然物質用於生理試驗及於活體内 生雌激素作用。其實例為二乙基己稀雖紛與染料木黃綱。 該吸附劑最好經過該等活性成分校準，作為合成性聚人 物受體，但亦可利用其結構但沒有效力之物質，如：㈠ 衫（Tam〇xlfen)、畢_或兒茶酸。相對於對結合性較弱 ^非專一性之物質樣本，實際上可採用與天然受體結合性 亦。吸附劑強力結合之物質。調整具有結合能力 :基團及交聯程度之比例關係基，控制結合位置之大小斑 二間性質，使結構達最適化。 ’、 此等吸附劑會自溶解之物質混合物中優先結合或甚至僅 、”。合亦與生物性蛋白質樣本強力結合之物質。因此，可採 簡單之方式’自天然或合成來源之物質混合物中單 離出有用之活性成分。 早 科明更重要方面為根據本發明方法或用途可廣泛自由 :擇心:卜畲在水性溶離液中添加大量醇與酸或緩衝液 動:強結合性與弱結合性物質之間結合能量之差異順序盘 ==仍驚人地保持不變。添加甲醇時，顯著優先解除用 物^^物質之結合’不會負面影響強結合性與弱結合性 出^ 分配。其結果為可相當早即自層析法中溶離 因此所需物質可在合理之時間内試驗或單離，因 機溶劑時’其結合常數會相對於純水或生理缓衝 液之結合常數降低10%。 非共6鍵意指具有結合能力之基團優先利用離子對、氫 922I6.doc -15- 丄 鍵、偶極-偶極-交互作用 5 . m 用電知轉移-交互作用、；m 作用、陽離子-π-電子-交互作用、 yV AL ^ 凡付瓦力-父互作用盥 刀散性父互作用'疏水性（親脂性）交互作用、錯 y 為過渡金屬陽離子a 較佳 組合。 子之錯化鍵，亦可為此等交互作用之相互 互補意指僅有互相匹配之基 之鍵結之能量必,f m 口。造成交互作用 愈顯著時，基質盘至接 基團之非共價鍵結 其圍_ n 一種吸附劑之結合愈強。因此—個 基團可能與多個基圃5姑、.. 與酿胺基互補。 例如：經基與缓基互補，胺基 :::團亦包括彼等被結構類似互補基團之基團或翹此 ^ 之基®所取代之基團。非共價鍵中，以；Γ1- 父互作用為主之實例為經慈基取代之蔡基，因此芳香環之 影響將調控或提高非共價鍵之鍵結強度。依類似方式"引 °木基對分散之非共價鍵將料絲之取代而提高。 互補基團之間之父互作用強度（例如：以測定之結合常數 表不）即為各有....結合能力之基圏所總合之結果。其對結合常 二之個別影響不僅隨非共價性交互作用型態而異，亦隨該 交互作用所涉及之基團之間距離與取向(角度)及溶劑之组 成份而定。此個別交互作用型態在能量上有很大差昱，因 此此等基圓之間鍵結及吉伯氏能量依不同比例，隨距離下 降。 互補基團亦顯示，單一基團之吉伯氏能量對非共價鍵之 影響會造成吉伯氏能量“改變，產生(相當大)負值。因 92216.doc -16- 1353880 根據柯明所選用基團之吉伯氏能量ag變化可加強鍵 ^因而可在所分離物質中改良其選擇性》 當所製備之吸附劑中選用 < 互補基團與第二基質（目標 貝)之間鍵結之△ G·值負值遠大於此吸附劑與所要分離 物貝之間之△ G_值時，通常即可達到改良之分離選擇性。 依此方式利用層析法溶離出所需分離之物質時，其結合性 較弱。但當需分離之目標物質引進其他互補基團時，亦由 於值之聯合變化使得鍵結強度高於第二基質目標基 質’而改良分離選擇性。 當吸附劑-基質-複合物中至少一個互補基團與第二基質 之結合性高於(例如:立體異構物)吸附劑與至少一個需分離 之物質之間所形成複合物時，根據本發明總是可依據充分 之分離選擇性達到分離之目標。 «互作W伯氏能仟焦耳/莫耳）之典型數值依 溶劑而定： 用實例為羧酸 離子性交互作用時之數值為_4至·6，此時，其交互作用 強度或有效區域隨距離成反比。此等交互作 與四級胺態氮之間於水中之交互作用； ’其強度或有效 物中四級氮與芳 -離子-四級交互作用之數值為·丨，此時 區域隨距離之3次方下降。其實例為銨化合 玉衣基之間於水中之交互用； -分散性交互作用（誘導之偶級）之數值為，175,此時，

其有效區域或強度隨距離之6次方下降。I ^ T例為氯仿中兩 個芳環基之間.之交互作用； 92216.doc 1353880 -氫鍵之數值為·4至·6。其實例為氯仿中兩錢胺基之交 互作用。此等基團在四氯化碳中之交互作 -疏水性效應之數值為·2.3,如:水中烷基與亞甲基之間。 若根據本發明’二價乙内_於氯仿中與錄基結合時， 所測得△0值可達-22❹、耳/莫耳。琥_亞胺衍生物之單

價鍵結則相反，其△(?值平均僅_9仟焦耳/莫耳。兩個AG 值相差、’.勺13仟焦耳/莫耳’分離選擇性所需之數值為約 2〇〇。由此等數值推斷有氫鍵存在，特別因二價交互作用而 提南彌。 各種非共價性交互作用與每一對第一與第二基質（受體_ 配位體）可在指定之溶劑系統中，由焓與熵之不同比例構成 隨距離變化之吉伯氏能量。 根據本發明將利用例如：大量之第二基質，藉由測定含 有所選用之1、2、3，….η個等等具有結合能力之基團之第 一基質之鍵結強度來判斷個別效應之影響，結果可能與特 定之交互作用型態有關。因此可使用之第一基質較佳為含 有胺基-、乙醯-基-、苯曱基…硝苯基-與異苯基之基質，及 其中二者及三者之組合。第二基質較佳為丙胺酸、天冬胺 酸與麩胺酸之衍生物。此等衍生物之Ν_末端保護基團較佳 為脂系或芳香系。 結合能量之測定較佳為自等濃度溶離之HpLC_*析法取 得k’-值。當測得第一基質上具有結合能力之基團濃度及固 定相與移動相之間體積比例關係時，即可由k,_值決定結合 常數KA’再由此等數值決定吉伯氏能量之變化。焓值 92216.doc -18- 1353880 之變化A Η與熵值之變化△ s可利用微量熱計測定或隨溫度 之變化測定平衡常數測定，後者亦可以van，t Hoff圖形表 不。最後比較所選用之受體與配位體之間之交互作用能 量，決定交互作用之影響程度為加成、加強或減弱。咸了 解，鍵結之測定並不限於上述方法。亦可採用方便之測定 法如.競爭性分析法、表面質粒基因組共振法或NMR-滴定 法。交互作用能量之測定法亦可為小型化分析法及平行分 析法。 在立體上適當之鍵結下，由具有結合能力之基團之各吉 伯氏能量部份進行加成。然後乘以結合常數《由此得知可 :步強化鍵結之合作效應。立體上較不適當之鍵結亦大 夕至 > 強化一彳貝鍵。此點對實際用途很有利，因為在相對 於所需分離之物質(同時存在之物質，副成分)改良分離選擇 座時’適當選擇具有結合能力之基團即可強化鍵結強度。 咸了解非互補意指其間之結合可以分離之基團，此等 基團之非共價鍵比互補基團弱。因此非互補基團之間之結 =強度比互補基團之間弱。在本發明+，非互補基團為此 寻基團之間形成之非共價鍵鬆散或所涉及之共同結合位置 減弱，或不結合。其較佳特性為個別基團之吉伯氏能量對 非共價鍵所造成之吉伯氏能量變化為〇或正值。 檢測意指有目的之選拔，你丨士。，t 能力之基團。 心·有目的之選拔具有結合 :據„亥新穎方法，可利用至少一種吸附劑辨識吸附劑基 -父互作用。在至少-種指定吸附劑上選擇性結合特定基 92216.doc -19· Ϊ353880 質之新穎方法特別適用為此辨識法。辨識之指標即為鍵結 強度。若吸.附劑與基質之間具有充分強度結合性，即可判 斷基質中某基團可與吸附劑中某基團結合。 若基質中之基圓為未知者冑，則可在進行結合時推斷基 質t哪一個具有結合能力之基團可能在結合位置上。 a但亦可能在未知結構之第一基質之分子層級上分解成適 當組成元件，例如：抗原決定基，此等結構或其互補結構 可透過組成元件於吸附劑上之適當排列再調整。 該分解法可為化學法、物理法或化學_物理法，如，例如： 利用化學裂解反應或超音波處理，但亦可進行虛擬試驗。 此等虛擬試驗可制電腦支援之方法，藉以取得基質之組 成7G件中可能出現之上述結合可能性。 此等分解法可配合目的需要，針對具體問題，限制最後 所有可進仃交互作用之組成元件數量與具有結合能力之基 團數量。自此等基團中隨機選出部份數量即可組成具有m ’、員（m 2」3, 4，._.)之所需組合等級。例如：3級之組合為 “=5之含例如：苯基_，烷基·，胺基_，羧基-與醯胺：之 、群中k出3個具有結合能力之基團所形成之所有可且 合。 · 弋可使蛋白質分解成20個組成元件，亦即胺基 -，、T有n = 6至η = 9個具有結合能力之基團與第二基質 八〜相近之非共仏性交互作用。當在離胺g楚、精胺酸、 2酸或組胺酸之間驗性強度影響不大時，此等縮減結果 、夕種胺暴酸中含有相同或等效之具有結合能力之基 92216.doc 1353880 團’如’例如：羥基·、羧基-與醯胺基’及一個鹼性基團。 依類似方法，亦可代入8種酮己糖異構物或16種醛己糖立 體異構物及其衍生之„比喃糖甞與呋喃糖甞作為組成元件， 代表募糖。 所需之未知基質係由可數數量之組成元件組成，其中則 包含一定犛量之具有結合能力之基團。組成元件與具有結 合忐力之基團係化學上已知且通常已知其種類與特性。若 其屬於有機化學或錯化物化學時，特別有利用價值。 由於可由互補及同一之吸附劑預先製造已知組成元件與 具有結合能力之基團之各組合之所需範圍集合庫，因此此 等吸附劑集合庫基本上包含或引進來自分子層級之各組成 元件或來自未知結構之第一基質之結合位置之組成元件。 同樣亦可使用具有結合能力之基團之組合。 根據上述本發明，亦可包括更多吸附劑，亦即吸附劑之 集合庫。由已知或未知之第二基質（不同於第一基質且已知 其中具有結合能力之基團）與此等吸附劑之集合庫接觸，測 定其結合強i .«然後即可推斷組成元件如何在第二基質之 結合位置上配置，及結合位置之空間結構特性。因此該新 穎方法亦可用於分析結構。 此外，選擇性結合該基質之新方法亦極有利於發展活性 成分，較佳為發展醫藥。已知醫藥之作用方式係基於其與 天然受體，例如激素或酵素之生理性結合。依上述方式分 解天然受體之結合位置，即完成吸附劑之集合庫。來自此 等吸附劑之集合庫中之各吸附劑將含有此等結合位置之指 92216.doc •21 · !35388〇 定之組成元件(組成部份)。較佳為組成元件之空間配置亦 更佳為調整整個結合位置之虹成元件之空間配置。當檢測 所需基質（例如：醫藥）之結合性相對於各合成受體部份之結 合性強度時1中並顯示其他天·然受體之結構部份時，由 該結合數據即可得到該等基質是否可與天然受體進行良好 之交互作用，若答案是肯定時，則可探討與哪一個空間配 置之受體產生作用。透過相應之化學修飾反應，可將基質 (亦即所要發展之醫_可能最適化，直到與受體達成最高 結合性為止。 。亥方法較適合單離迄今尚未知或可能有特定功能之生物 性聚合物，較佳為蛋白質或酿蛋白，並證實其相關有效.性。 依類似方式，亦可由嗜菌體表現合成肽、寡核苷酸或立 t與吸附劑結構互補之物質，直接自混合物中單離活性成 分分子。 反之’在吸附劑表面上之活性成分典型結構部份可自基 體混合物中同屬性基質結合及判別。此等基質之實例為受 步驟(0中’選拔出至少兩個可使合成或天 與吸附劑结人夕^ ^ m之不同基團，自該合成或天然之第一美 檢測該基團。可Λ+ 土貝中 〃 5成或天，、、':之第-基質與吸附劑結合 :=!個不同基團之檢測法可採用任何所需方法進 選出所：=此等基團具有結合能力，即可經由所需方法 互作用進i 拔法隸據與基質應進行之非共價性交 92216.doc •22- 1353880 本發明具體實施例包括依步驟⑴之檢測法，分解合成或 第基質’形成至少兩種具有至少兩個可與吸附劑 結合之基團之組成元件。 本發明另一項具體實施例中，該至少一種第一基質與至 ,、、 第基質相同且依此等方式選出之該至少兩個可與 第一基質結合之不同基團可與步驟⑴所檢測之基團互補。 本發明另一項具體實施例之特徵在於至少一種第一基質 不同於至少一種第二基質，且依此等方式選出之該至ί兩 個可與第二基質結合之不同基團可與步驟⑴所選出之基團 互補》 本發明另一項具體實施例之特徵在於依據步驟⑴檢測之 基團為至少兩個可與至少一種第二基質結合之基團，亦即 可與第二基質結合之基團可與第一基質之相應基團互補。 ，本發明一方面包括在步驟⑴中，僅分解合成或天然基質 形成兩個各含有一個具有結合能力之基團之組成元件，藉 以在步驟（u)中僅到一種吸附劑。 但亦可能使合成或天然基質分解成三種組成元件，於步 驟（ii)中配對組合成三種吸附劑。 右刀解成四種組成元件時，於步驟（ii)中配對組合成六種 吸附劑。 但除了步驟（ii)之配對組合外，亦可能由三種不同組成元 件共同在吸附劑上形成三元體。除了上述三種吸附劑外， 亦得到第四種吸附劑。 同樣地，除了步驟（ii)之配對組合外，亦可能由四種不同 92216.doc -23- 1353880 組成元件形成六種吸附劑外，再產生四種分別包含三種不 同組成元件之吸附劑，及另一種包含所有四種組成元件形 成四元體之吸附劑。 因此本發明之特徵在於自步驟⑴之合成或天然之第一基 質中檢測至少兩個可與吸附劑結合之基團，形成兩種分別 具有至少一個可與吸附劑結合之基團之組成元件，然後於 步驟（li)中製得一種吸附劑；或自步驟⑴之合成或天然之第 一基質中檢測至少兩個可與結合吸附劑結合之基團，形成 二種分別具有至少一個可與吸附劑結合之基團之組成元 件’然後於步驟（ii)中製得至少3種吸附劑；或自步驟⑴之合 成或天然之第一基質中檢測至少兩個可與結合吸附劑結合 之基圓’形成四種分別具有至少可與吸附劑結合之基團之 組成元件’然後於步驟（ii)中製得至少六種吸附劑。 依類似方式，可自較大數量之i個組成元件中選出n個組 成το件’分別與瓜個具有結合能力之基團組合產生多重體。 例如.可自大量天然胺基酸中選出組成元件苯基丙胺酸' 酪胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、絲胺酸、離胺 酸色胺酸、與組胺酸（η = 9)，藉以遮蔽非共價性交互作 用。由其中選出〇1 = 4個具有結合能力之不同基團所形成之 .、且〇可產生126種不同變化之吸附劑，其亦可依組合方式或 作為分析法達成結合之目的及進行結合性試驗。 此等m個非共價性交互作用效應分別為各單一吸附劑提 供一特定特性，而與所需結合之物質產生共同交互作用。 在核測所需結合物質之試驗中，各具有結合能力之基團（爪 92216.doc •24- 1353880 元體交互作用及 )之此等單效應又所採用溶劑之影響將在可忽略之變 化範圍内。依此類推，亦可得到m = 2之 m = 3之三tl體交互作用之測量數據。 若因此得到一組包括不同型式與組合之非共價交互作用 之能量增量，即可預期兩個所需基質或組成元件之間結合 強度此％可利用不同非共價性交互作用隨溶劑與pH值 之變化。因此㈣子性非極性有機溶劑中之氫鍵交互作用 發揮強力作用’但在極性f子性溶劑或水中則幾乎沒有作 用。缓基在有機溶劑中與驗性殘基形成強力鹽鍵，在水中 則相反，通常可依同樣方式確認交互作用受到網之影響相 對降低。 此等關係以胺基酸衍生物與不同吸附劑之結合性為例說 明。由吸附劑上已知濃度之組成元件或具有結合能力之基 團進行層析法測得之k，·值即可得到結合常數L。藉以快^ 且同時進行分析，取得競爭結合位置之基f之間之結合常 數’此方法亦可用在複雜之混合物中。 依上述方式可由組合之多4賈交互作用得到結I常數與結 合，量數值，依據未知結構之具有結合能力之基團種類與 數量可得知所結合之物質或推斷其他基團之錯誤。例如： 由已結合之胺基酸衍生物或肽中綾基、鹼性基團或脂系或 芳香系殘基數量即可取得結果。 旦已知其具有結合能力之基團時，即可依類似方式， 由兩種未知結構之基質之間與結構相關之預期或可能結合 性關係得到結論。若僅已知胺基酸組成分時，即可測出肤 92216.doc -25· 1353880 或蛋白質片段。 亦咸了解―’當料収溶㈣統具㈣m结構時， 亦可預測或說明該兩種未知結構之基f之間之結合關係。 具有特H结構之兩種蛋白質或时白質（其互相具有 至V個可進盯父互作用之結合位置）將分別與吸附劑之 集合庫中互補物質達成強度或優先次序類似之交互作用。 另一項重要之用途為吸附劑 有結合能力之基團之所有組合 質或醣蛋白之結合位置互補。 之製法’該吸附劑係以一組 為代表，該等基團則與蛋白 此等吸附劑集合庫在接受—

組完整配位體測試，例如：所有二元_、三元_與四元之組合 即可代表蛋白質結合位置上具有結合能力之基團。由吸Z 劑上結合性最強之鍵結將發現該具有結合能力之基團最好 應含在所要探討之活性成分中。咸了解，此等吸附劑上亦 可結合蛋白質，作為互補基團之樣版。 依類似方式，可由經由噬菌體分析法得到之環狀肽封端 之結合樣版，在同屬性蛋白質目標中找出結合位置。因此， 透過此等肽之互補圖形，可產生由吸附劑支撐之母體，供 發掘具有適當（亦即相當於此等肽）之組態與構形之新穎活 性成分。 該方法亦可用於結合、判別與確認未知之蛋白質目標與 非競爭性結合位置或有調節活性之活性成分。此外，亦可 以令人滿意之程度轉化有彈性且不穩定之活性成分，如： 結構堅實之肽。 上述各例中’可由基質與適當選出之吸附劑接觸，經由 922l6.doc -26- !353880 測定結合數據，即可預測結構。此時，所推斷互補基質結 構之部份具有之錯誤或微弱之交互作用均與強力之結合性 —樣重要。當基質含有例如：胺基時，其與含羧基吸附劑 之結合性大於相同基質與帶有羥基或胺基之吸附劑之結合 性。 上述方法之基本利用價值在於排除多數結合可能性，至 少可限制可繼續嘗試之可能結合組合數量。依此相同原理 可用於篩選，利用預定之結合特徵檢測物質混合物中之所 含物質。因此其實際用途在於不需要另外淘汰大量用不到 之物質。 較佳為分解成組成元件結果所得到之組成元件在天然或 合成基質結合位置之空間上直接相鄰。結合位置之空間配 置可藉由此等組成元件之線性配置分解成兩個組成元件， 經由三角形配置分解成三個組成元件，及經由(扭曲)四邊形 配置分解成四個組成元件。 / 务'在該結合位置之配置下 具有結合能力之基團之三或 上之立體異構性基質將如同 出現不同結合強度。

’出現較佳之各具有至少一個 四個組成元件時，該結合位置 其在消旋性混合物中，通常I 因此根據本發明方法亦可利用根據本發明 饯％王7 一禮$ 別’依據本發明方法，在 折 在不同結合強度下與立體異構,丨 貝、合。此等特性可用於 七展活性成分，错以取得不丨 ，力之習知立體異構性化合物。 该新方法提供一種自立體異構性化合物之混合物中〗 92216.doc -27- 1353880 例如：可用 性分離一種或多種立體異構性化合物之方法 於解析消旋物。 其他可選擇性結合之立體異構性化合物為非對映異構 構物、幾何異構物、如:順式與反式異構物、 差向異構物、及變旋異爐你1· 奴呉構物如.α_與β-醣甞類之糖。 藉助該新方法不僅可選擇性結合立體異構性化合物，而 且可結合組成性異構物，亦即元素組成相同但元素相對排 列不同之化合物。 例如：可分離稠合芳香系 結方式不同〇 其實驗式相同，但碳環之鏈 根據本方法步驟（ii)’在擔體上引進至少兩個具有結合能 力之不同基團日寺，將如下文所說明’通常無法避免在至少 一個已構成之吸附劑上不只出現一個希望提供給至少兩個 具有結合能力之不同基團依統計學分佈達到相鄰位置之結 合區域，其所造成之區域反而基本上僅有相同基團或增加 此等基團之數量。選擇性分離法中之此等區域並未干擾該 基質，因為基質中此等區域之結合強度通常比包含至少兩 個不同基團之區域弱。基本上僅有一個具有結合能力之基 團之此等區域大多數會被排斥。尤其當非互補基團相對立 時，此等區域之作用即被排斥。 通吊’第一與第一基質上相對立之非互補基團會減弱總 結合性。此等作用發生在雙價結合上。當所選擇具有結合 能力之基團為例如：羧基與胺基時，及苯基與芴基時，由 於至少一個極性殘基與非極性殘基相對立，因此其相對空 92216.doc -28- 1353880 間配置之能量不適當。由於聚合物鏈之排列可以移動，因 此可依最可能得到之最大吉伯氏能量，在吸附劑 移動，與第二基質結合。 f 此等現象通常亦出現在吸附劑上一對具有結合能力之美 團與一對互補基團相對立時。當所有參與之基圏分別成ί 互補或多重互補配置時，吸附劑與配位體之 到其最高強度。 違 兩個基質之二價配對即顯然會隨方向變化。此等立體 向大幅加強其轉為三價與四價交互作用。能量上最 結合位置大幅項加時，會產生具有特別較高構形變化性之 聚合物衍生物。以共聚物為例，其係由具有高度構形變化 性之具有交互作用能力之基團部份之間結合形成，例如： 烧基鍵。 出現在至少一種吸附劑上之至少兩個具有結合能力之不 同基團之莫耳比例關係或局部濃度比例關係對基質之選擇 性結合性特別重要。各基團最好必須在所結合之基質上及 亦在吸附劑上發現適合結合之基團。 較佳為在吸附劑上所產生至少兩個具有結合能力之不同 基團之莫耳比例關係相當於與所結合基質達最佳結構條件 時之比例。 -較佳為吸附劑上至少兩個具有結合能力之不同基團(其 取好與第-或第二基質之基團相同或互補)所產生之莫耳 比例關係如同其與所結合之基質或與擬似之第一基質之比 例。此時亦最，好採用下文說明之製法。 92216.doc •29, 1353880 步驟（i)之合成或天然基質亦可為低分子量，較佳為分子 量在1000 Da-以下。其亦可為寡聚物或聚合物，較佳為生物 性聚合物。 較佳者為其中一種基質為低分子量，而另一種基質為生 物性聚合物。 適合與生物性基質優先結合之至少一種吸附劑最好展現 具有結合能力之基團，其亦可結合天然結構或結合此等結 構之有決定性之部份，且其最好可與生物性基質進行交互 作用。下文中稱此等基團為受體或受體基團。 至少兩個具有結合能力之基團較佳為具有官能基之基質 中組成元件或部份或片段之組成要素。因此特別指酵素-、 胺基酸-、肽-、糖-、胺基糖-、糖酸-與寡醣-基團或其衍生 物，及核苷與核甞酸。其他合適之基質為嘧啶-與嘌呤鹼 基，如：胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、嘌呤、腺苷、烏嘌 吟、尿酸、次黃漂吟、6 -嗓吟硫醇、6 -硫代鳥°票吟、黃σ票吟 素。分子之>!段為例如：來自苯基丙胺酸、酪胺酸或色胺 酸之苯基-、笨.、·粉-或。引11朵殘基，及經基-、叛基-、胺基-與 醯胺基團。基本上除了上述基團以外，若保留或改變受體 與基質之天然結合原則時，該新方法亦可改用例如：合成 性酵素、抗體或其他生理性抗原決定基之結合功能部位（亦 即分子層級）、製成之宿主、肽、醣肽、蛋白質之抗原決定 基、醣蛋白質及寡核苷酸。 較佳胺基酸可述及： - 具有脂系.基團之胺基酸，如，例如：甘胺酸、丙胺酸、 92216.doc -30- 1353880 纈胺酸、白胺酸、異白胺酸； 具有脂系側鏈之胺基酸’其中包括一個或多個經基， 如，例如：絲胺酸、蘇胺酸； 具有一個芳香系侧鍵之胺基酸’如，例如：苯基丙胺 酸、酪胺酸、色胺酸； 包含鹼性側鏈之胺基酸，如，例如··離胺酸、精胺酸、 組胺酸； 包含酸性側鏈之胺基酸，如，例如：天冬胺酸、楚胺 酸； 天冬醯胺、麵酿 包含醯胺侧鏈之胺基酸，如，例如： 胺； -具有含硫側鏈之胺基酸，如，例如：半㈣酸、甲硫 胺酸； - 經修飾之胺基酸，如，例如· 甘上 例如.羥基脯胺酸、γ_羧基麩 胺酸、〇-磷絲胺酸； - 上述胺基酸之衍生物或目+ β # 4了視吊要使用之其他胺基酸， 例如：可視需要在羧基卜M如上 硬丞上經例如：經適當取代之烷基- 或芳基酯化之胺基醆。 上述胺基酸亦可改用—錄+α ,0 種或夕種二肽或寡肽替代，例 之肽，如， 例如：縮二肽 一個組成元件令亦可 不同基團。 如4、r-或其他結構異構性胺基酸與其所衍生 同時引進至少兩個具有結合能力之 於其中一個組成 因此本發明亦包括-種方法，其特徵在 92216.doc -31 · 1353880 元件帶有至少兩個具有結合能力之不同基團。 當同一吸附劑本身帶有四個以上具有結合能力之基團 時，則較佳具體實施例為至少此二個具有結合能力之基團 共同利用已完成之組成元件進入指定空間配置。其中由具 有結合能力之基團優先形成一組成元件，而依相同方式與 第一基質相鄰》 咸了解，可將多個此等至少二價組成元件依序或同時引 進一吸附劑中，與單價組成元件組合。 二價組成元件之簡單實例為芴基甲氧羰基_麩醯胺，亦以

Fmoc-麵醯胺表示。此時吸附劑採用羧基進行結合，其中醯 胺基可與配位體進行極性結合，而芴基則進行^ 交互作 用。依類似方式，可引進寡肽，但亦可引進梳狀寡聚物衍 生物β 較佳為該基質利用吸附劑上選自胺基酸、糖、核誓酸與 核甞及嘧啶-與嘌呤鹼基之殘基或基團結合至少一種吸附 劑。 因此本發明之特徵亦在於該至少一種吸附劑之至少兩個 具有結合能力之不同基團係選自下列各物組成之群中：胺 基酸、糖、核：y：酸、核：y：、嘧啶_或嘌呤鹼基。 另一項具體實施例中，該至少一種第二基質之至少兩個 具有結合能力之不同基團係選自下列各物組成之群中：胺 基酸、糖、核苷酸、核：y：、嘧啶_或嘌呤鹼基。 藉由引進其他天然或合成基團，特定言之合成基團時， 可改變，特定.言之加強所需吸附劑之非共價鍵結合能力。 92216.doc •32· 1353880 例如：此新方法即可引進具有合成之保護基團之胺基 酸。例如：可引進具有芴基保護基之胺基酸。除了芴基外， 亦可採用葱基_或萘基。此時仍利用基質之保護基團令芳香 %與結合基團之間之非共價鍵來加強結合之交互作用。另 項實例為可形成π-ττ-交互作用之確苯基·與寡氟苯基及 吸電子或疏電子之芳香系。 厂t驟（11)之吸附劑最好包括一擔體，其可由無機或有機材 料製成。擔體材料可為所有可利用適當方法在該擔體上得 到步驟（i)之至少兩個不同基團之材料。 擔體材料可為一種具有平坦表面之固體，如，例如：玻 璃或金屬板或為f曲物體或可包埋在多孔體中，例如：管 狀或似海棉狀’如’例如：彿石、梦蕩土或纖維素小珠。 擔體材料亦可為天然或合成性質。其他實例可述及明膠、 膠原或壞脂糖。亦可採用多孔性或非孔性樹脂與塑料·或陶 瓷表面。 你么亦可&使用—種或多種流體，最好為高黏度之流體， 作為擔體。合適之化合物較佳為高黏度之石夕油。 =最好總是有步驟⑴之至少兩個不同基團與聚合物 共侦鍵結。 因此，”聚合物” β + a 古 亦為聚合物化學中稱為"寡聚物"之較 二广因此除了聚合物外，尚可使用聚合物之 可作為聚合物使用者包括（但不限於）： =如’例如：纖維素、直鏈搬粉與葡聚糖； -寡聽，如，例如：環糊精； 92216.doc •33· 1353880 - 脫乙醯殼多糖； - 聚乙烯醇、聚蘇胺酸、聚絲胺酸； - 聚乙烯亞胺、聚烯丙基胺、聚乙烯胺、聚乙烯咪唑、 聚苯胺、聚吡咯、聚離胺酸； - 聚（甲基）丙烯酸（酯）、聚衣康酸、聚天冬醢胺； - 聚半胱胺酸。 同樣地，該方法中不僅可使用均聚合物，亦可使用共聚 物，特定言之嵌段共聚物，及符合統計原理之共聚物。具 有非官能化單體之共聚物可述及共苯乙烯或共乙烯或如： 共吡咯啶_之共聚物。 該等聚合物具有至少兩個相同或不同基團，藉由此等基 團使來自步驟⑴之至少兩個具有結合能力之不同基團與聚 合物共價鍵結。 因此本發明一項具體實施例之特徵在於步驟（ii)中有至 少兩個不同基團與聚合物共價鍵結。 具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物上可使用之其 他較佳官能基可述及例如：OH-基團，可視需要經取代之胺 基、SH-基團、oso3h-基團、so3h-基團、opo3h2-基團、 0P03HR-基團、Ρ03Η2-基團、P03HR-基團、COOH-基團與 其中兩個或多個基團之混合物，其中R較佳為烷基。同樣 地，具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物上亦可使用 其他極性基團，如，例如：-CN。 一項具體實施例中，可在步驟（ii)中先利用聚合物之至少 兩個相同或不同官能基引進至少兩個具有結合能力之不同 92216.doc -34- 1353880 基團，產生具有該等基團之衍化聚合物。即可將此等衍化 之聚合物承載在擔體上。 經至少兩個基團衍化官能化聚合物之方法可依已知方 式，在均相或不均相下進行。 不均相之衍化法可採用固相反應法。 具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物呈均一液相經 該等至少兩個具有結合能力之不同基團衍化時，為了達到 最佳溶解度，最好使用混合官能化或預先衍化之聚合物。 其實例可述及： - 部份或完全矽烷基化、烷基化或醯基化之纖維素； - 聚乙酸乙烯酯/聚乙烯基醇； - 聚乙烯基醚/聚乙烯基醇； - 正丁基聚乙烯基胺/聚乙烯基胺。 同樣地，亦可使用聚合物/共聚物混合物。因此可使用所 有合適之聚合物/共聚物混合物，例如：上述聚合物與共聚 物之混合物，及其他可述及： - 聚（丙烯酸共乙酸乙烯酯； - 聚乙烯基醇-共乙烯； - 聚氧亞曱基-共乙稀， - 經修飾之聚苯乙烯，如，例如：苯乙烯與（曱基）丙烯 酸（醋）之共聚物； - 聚乙烯基°比咯啶酮及其與聚（甲基）丙烯酸酯之共聚 物。 較佳為由具.有至少兩個相同或不同官能基之聚合物使用 92216.doc -35- 1353880 化J與至少兩個不同基團進行衍化反應。此等試劑與 方法說明於例如·· WO 00/32649。 可採用之活化劑化合物為例如：可產生琥珀醯亞胺結構 者，其係利用_OCO_cl•基團取代氮上之氫原子。其實例為 如下式化合物。

I至R10較隹為氫、烷基、芳基、環烷基與雜環基。當^ 至Rio為氫時，該化合物以ONB-C1表示。 若具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物與活化試劑 反應時，此等反應產物再與具有與該基質結合所必要之基 團之合適化合物反應。 亦咸了解’具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物可 與兩種或多種合適之活化試劑反應。亦可同時與聚合物反 應。同樣地，該兩種或多種活化試劑亦可依序與聚合物反 所有可與活性聚合物反應且可直接或間接形成 所需聚合物，然後再進行衍化之化合物均可使用。亦可使 用具有至少一個親核性基團之其他衍化之化合物。 另一個可能性為由活性聚合物與含胺基之一價或多價醇 或硫醇反應。若含有至少兩個官能基團之聚合物經例如：

92216.doc -36- 1353880 或多價硫醇可與胺基選擇性反應。因此，引進聚合物中之 ΟΗ-或SH-基圓即可繼續經例如：上述活化試劑活化，依每 次所使用醇或硫醇之價數，藉以加長鏈結及分支化。 另一項具體實施例為先由各具有至少一個具有結合能力 之不同基團之化合物活化試劑反應，然後再與指定之聚合 物反應。 較佳為由胺基酸、糖、核芬酸、核站、嘧啶-與嘌呤鹼基 之活性衍生物謝至少兩個㈣或不时能基“合： 反應。因此較佳實施方式為使用0NB_C1或具有此等結構之 化合物進行活化。 該反應可用於進行聚合物交耳葬、聚合物*定化與聚合物 分支化。 該反應亦可形成具有不同空間配置之聚合物衍生物，因 此可用於依賴此等空間配置之多種用途中。 此等配置實例為例如：毛狀桿、梳狀聚合物、網狀 '藍 狀、碟狀、管狀、漏斗狀或籠狀。 | 該反應可於.非質子性·兩極性與/或極性_質子性溶劑或 溶劑混合物中進行，如，例如：水性溶劑混合物。依所反 應之聚合物種類與所使用之活化試劑與旧該具有至少兩 個具有結合能力之不同基團之化合物而定，此等溶劑混合 物中除了水以夕卜’尚可包含其他溶劑。較佳溶劑為，如， 例如：非質子性-兩極性溶劑如，例如：DMs〇、DMF、二 甲基乙醯胺、N_甲基吡咯啶酮、四氫呋喃或甲基-第三丁美 峻。 土 92216.doc -37· 1353880 該反應所選用之pH_值通常在4至14之範圍内，較佳為8 錢之範⑽及特難為在8錢之範_。可使用合適緩 衝劑調整至一定pH範圍。 利用/合劑與ΡΗ·值’可構成具有所需放大與收縮特性之網 狀結構，藉由此網狀結構來控制進入吸附劑之基質流量： 控制聚合物之衍化程度，亦即具有至少兩個具有结合能 力之基團之官能化聚合物之衍化程度生物，即可與基質 到與最佳交互作用。 、 較佳衍化程度在！至鳩之範圍内，特別佳為3至6〇%之範 圍内’尤指5至50%之範圍内。 因此亦可由至少兩個相同或不同官能基進行衍化，使其 作為與基質交互作用之受體基團，且在此兩個衍化之基團 之，至少有一個非基質專一性之官能基與/或沒有官能基 之早體早70 ’且該相同或相異官能基係選自上述基團。 亦咸了解，出現在未衍化型聚合物中之官能基亦會影響 其與基質之交互作用。 曰 亦可使用具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物之衍 ^物’其切基質專_性之官能基亦可經末端封端基團衍 藉由適當選用末端封端基團，亦可影響具有末端封端基 團(群)之聚合物衍生物之溶解度並配合接續反應之需求。 所可作為末端封端基團使用之基團原則上可選自所有對基 貝之乂互作用呈惰性或顯著惰性之基團。本文中之"惰性" 基質與衍化之聚合物之受體基團之交互作用強度高於 92216.doc -38- 1353880 此等基質與-個或多個經過末端封端基團純之宫能基之 生物交互作用強度，以致基質基本上僅利用受體基團結土合。 因此若希望透過基質與受體基團之間之交互作用，可分 離出兩種或多種不同基質，例如：利用層析法分離時如 上述末端封端基團與官能基之交互作用可能不完全惰性。 此情況適用於例如：當末端封端基團與兩種或多種要分離 之基質之交互作用程度夠弱或不具專一性交互作用因而 不影響分離過程時。 適合作為末端封端基團之各基團依所採用技術之條件而 定。例如：依基質而異，所選用之末端封端基團可能不是 Η -供體。較佳為

^ch3 ’特別佳為 〜〇、 cn - 〇 ···；·〇 可在具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物中引進上 述各殘基作為受體，其係透過聚合物與各包含一親核性基 團之至少兩種活性之衍化試劑反應，或透過活性之聚合物 與至少兩種此等衍化試劑之反應達成。 如上述具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物之衍生 物最好在該至少兩個受體中包含化合物之殘基或在化合物 中負責結合之基團，此時該化合物係選自下列各物組成之 92216.doc -39- 1353880 群中：胺基睃、糖、核铝酸、核苷、嘧啶-與嘌呤鹼基。 為了使具有官能基之聚合物經上述化合物、此等化合物 或包含此等化合物之族群之衍生物、或其混合物進行衍 化，因此可進行上述方法。咸了解，首先由例如：胺基酸 化合物與合適之活化試劑反應，然後由反應產物與聚合物 反應。同樣地，亦可先由聚合物經合適之活化試劑活化後， 再與胺基酸反應。當然亦可直接由聚合物、胺基酸與活化 試劑共同反應。 亦可依類似方式引進糖、核嘗酸、核替、鳴咬-與票呤驗 基或含在該化合物中之結合性基團，或其混合物。 依所選用之胺基酸、糖、核甞酸、核茫、嘧啶-與嘌呤鹼 基或同等之殘基或衍生物或此等化合物中所含之結合性基 團而定，必須在衍化與/或活化反應期間使用保護基團事先 保護官能基。所有相關技藝上已知之合適保護基團均可使 用。依該聚合物後續之用途而定，可在胺基酸-、糖-、核甞 酸-、核苷-、嘧啶-與嘌呤鹼基之衍化反應後保留或分解保 護基團。 亦可改用一種或多種寡肽替代胺基酸。 為了與基質達最佳交互作用，可由液態聚合物衍生物或 溶於溶劑或溶劑混合物中之聚合物衍生物在作為模板之底 材之存在下變形。 其變形法為例如：在適當溶劑或溶劑混合物中共同添加 如上述之經衍化聚合物與基質，使聚合物有機會形成一種 或多種能量上.有利之構形。 92216.doc -40- 二種經衍化之聚合物亦可與不同之基質共同添加及變 /右而要時，亦可由不同之經衍化聚合物舆一種或多種 不同基質共同添加及變形。 具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物之衍生物亦可 不使用模板變形。 :變形之後，可使聚合物衍生物之構形固定，該構形係 在拉板之存在下達成變形。 固定後之變形聚合物亦可承載在擔體上。 4固定化法基本上為所有可採用之方法。特定言之，可述 法、溶劑交換法、沉殿法與交聯法。較佳為利用交 耳外法固定》 擔體材料與擔體形狀可以有相當大選擇自由，但所取得 2體材料必須使聚合物堅固地留在擔體上。衍化之聚合 ^ 付上之後，最好與所要分離之物質沒有交 互作用或僅有一種或多種非專一性交互作用。 依以後之應用範圍而定，可能要求擔體材料需具有耐塵 /耐壓性”意指該擔體材料在_巴>1力下仍保持不變. 形0 可採用前述材料作為擔體材料。擔體材料之形狀可 ::體並沒有特別限制。例如:其可能呈― 引至擔，材料上之承載法亦有很大選擇性。其可能實例 ’利用〜包法承载、由擔體於相應之聚合物溶液中進行 交換、聚合物噴霧法或聚合物旋轉法。 92216.doc •41- 1353880 經何化之聚合物亦可承載在多種不同適當擔體上。同樣 地，亦可由兩種或多種不同之經衍化聚合物承載在—種或 夕種合適之擔體上。本發明另—項具體實施例中，由該經 衍： ' 變形且固定化之聚合物加工製成多?L性材料。其可 同時形成擔體，因此不需要再使用其他擔體材料。此時可 形成例如.珠狀、不規則形物體、海綿狀、>5狀、帶狀或 膜狀。 / 可由一種經衍化之聚合物固定形成一種構形。同樣地， 亦可由兩種或多種不同種類之經衍化聚合物形成構形。••不 同種類之經衍化聚合物"意指該聚合物在例如：基礎聚合物 或活化試劑種類或進行衍化法引進受體基團之方式或活化 程度或衍化程度或此等特性中兩者或多者之組合等方面 差異。 交勒法可制例如：由兩條或多條經衍化之聚合物直接 相互反應達成。 經由所得之已衍化基團之間之共價與/或非共價鍵可達 成聯結。通常由..側接在一條帶狀聚合物上之基團之間，與/ 或側接在兩條或多條帶狀聚合物上之基團之間形成共價鍵 與/或非共價鍵’因此兩條或多條帶狀聚合物即可利用一個 或多個位置相互聨結。 同樣地’亦可添加一種或多種適當交聯劑，如上述，使 帶狀聚合物内之基團，及/或側接在多條可視需要不同之％ 合物上之基團依共價與/或非共價方式性進行交聯。 原則上可採月相關化合物之相關技藝上已知之所有合適 92216.doc -42- 、進行父聯。因此，該交聯法每 不可逆性波俨上聡 只1為可逆性共價交聯法、 例為例如：利用離w乂聯去，非共價交聯法實 用之交聯法。 或利用電價轉移之交互作 用於進行不可逆性共價交聪a + 個或多個η 父、去之交聯試劑可述及具有兩 尺夕個Β忐基之化合物，如 碳酸。例如.士工/ 丨如.二兀醇、二胺或二 由s w、I , /舌生t合物衍生物反膺，哎 由至少兩價活性交聯試劑盘 1玍物汉應次 可逆/、卩活性來合物衍生物反應。 J W生共價交聯法實例 合物上函細I瞭 用側接在—條或兩條帶狀聚 口物上兩個基團之間之硫^ Μ Μ w： -- IL ’ ）成二硫橋鍵。 才J用離子性交互作用之 成，並巾^ 1法為例如：利用兩個殘基完 取具中一個為作為結構單 為結構單元之例如： 之四級録離子，另-個為作 -coo 或-S〇3-。 利用氫鍵之交聯法實 如：下列結構： 為由兩個互補驗基對形成，例 Η

Η7 交聯聚合物衍生物係由互 :酸/三胺或尿哺咬/蜜胺。 試劑亦與帶狀聚合物上交 通常與交聯位置有關之非共價 補構成’該互補結構單元為例如 同樣地，非共價交聯法中之交聯 92216.doc •43- 1353880 聯位置互補。其實例可述及帶狀聚合物上之胺基與可作為 交聯試劑之二碳酸。 由羧酸酯利用肽化學上習知之偶合試劑，可與聚合物上 之胺基形成醯胺鍵結。相同方式，可由聚合物上共價結合 之羧基與聚乙烯基胺之胺基交聯或反之，由已結合之胺基 與羧基’例如：聚丙烯酸酯之羧基交聯。 父聯程度可依需要選擇’及例如：依下文中說明之應用 範圍分割。 步驟（11)中，至少兩個具有結合能力之不同基團與含該至 少兩個基團之聚合物之反應亦可在不均相中進行，亦即在 聚合物之固相表面上進行。適當時，由該聚合物懸浮於對 該聚合物具低溶解性之溶劑中。 聚合物之衍化法及所製成聚合物承載在擔體上之方法可 採用上述活化-及衍化步驟及交聯_與塗覆法進行。 另一方面，亦最好在不均相之經衍化聚合物中進行，不 需要使用其他擔體材料作為擔體。 另一項具體實施例中，最好由上述依均相或不均相製成 之經衍化聚合物分段承载在擔體上。其係在至少一個步驟 中，使至少一種聚合物之至少一個位置結合在擔體材料 上，亚在接續之至少一個步驟中，由至少一種聚合物之至 少另一個位置承载在與擔體材料結合之聚合物位置上。該 方法說明於WO 01/38009。 可依類似方式在至少一種聚合物上之分段承載法，但應 確保在每階段.之前產生至少一個聚合物之承載位置，以便 92216.doc 1353880 在擔體材料上形成提供承載位置之聚合物結構。 -種 ，由 依此方法可在至少—個階段中，與擔體材料上至少 聚合物之至少一個位置結合，在第一項具體實施例中 該至少-種聚合物之溶液與擔體材料在不會使至少一種聚 合物結合在擔體材料上之反應條件下接觸，最後再改變反 應條件，使至少一種聚合物結合在擔體材料上，或於第二 項具體實施例中，由至少一 種聚合物之溶液與擔體材料於 鍵結之反應條件 可使该至少一種聚合物之溶液於產生g 下接觸。 依據第一項具體實施例與擔體材料接觸之溶液中可包含 -種或多種通當溶劑’藉以使至少一種聚合物溶於溶劑或 溶劑混合物I或亦可形成膠體溶液或懸浮液，例如·形 成奈米懸浮液。 所選用之反應條件應使與擔體材料接觸之溶液中該至少 一種聚合物先不與擔體材料形成鍵結。此等反應條件可例 如·’使用一種或多種適當溶劑來調整。最好添加此等相關 溶劑，使至少…合物完全溶解，以致無法與擔體材料 鍵結。 本發明中"不與擔體材料鍵結之聚合物"意指利用分配系 數測定時，實質上沒有測得鍵結。 同樣地，亦可透過選擇適當溫度達成此等反應條件，例 如：當溶液與擔體材料於高溫下接觸時，至少一種聚合物 無法與擔體材料鍵結。 此外，若該.至少一種聚合物與擔體材料之鍵結係依 92216.doc -45· 1353880 值決定時，該等反應條件亦可藉由適當調整聚合物溶液之 pH-值來達成^ ' 同樣地，上述兩種或多種方法之適當組合亦可先阻止該 至少一種聚合物與擔體材料之鍵結。 μ 利用此等特定反應方法’亦可避免發生其他可能使溶液 中所含至少一種聚合物沉澱之反應條件。 由至少-種聚合物之溶液與至少—種擔體材料進行接觸 之方法原則上可採用所有合適之方法進行。 其可能實例為由包含至少—播取人仏 “ 1料合物之溶液與擔體材料 接觸。同樣地，亦可先由擔體材料與至少_種溶劑接觸；^ 然後再於至少一種溶劍中 亦可先由擔體材料鱼至少一種、々舰=聚合物。同樣地’ “ 。至夕種溶劑接觸，然後再添加包含 乂種令口物之洛液。若添加兩種或多種聚合物時，苴 可为開或共同與一種或多 混合物中，其他I物刀別於溶劑或溶劑 ί丑因七八然後由各包含至少一種聚合物之單-:至:、二"刀開與擔體材料接觸’該擔體材料可視需要於 —種溶針溶解或形成膠體溶液或_^

原則上上述可i M U 料均適用，若：=結而承載至少-種聚合物之擔體材 聚合物可利用鍵L而承:多在種不同聚合物時’當其中-種 解，可使兩種或多Ό種不门體材料上時即可。亦咸了 上。 —種同聚合物利用鍵結承載在擔體材料 若使用兩種弗 料時，亦可由所有平入聚合物與兩種或多種不同擔體材 有聚合物承载在所有擔體材料上。同樣地， 92216.doc -46- 之二载其他聚合物與化合物’如，例如:習知 用與/或方法達2物與擔體材料之鍵結亦利用其他交互作 可不承 Α外，含有聚合物或/與化合物之溶液亦 中至小—擔體上，其例如：殘留在溶液中。此等聚合物 之牛2種可先與包含此等聚合物之溶液接觸，再於接續 v驟中承載在例如：擔體材料上。 依據該第一項具體實施例’需在接觸後改變反應條件， 使至少-種聚合物與擔體材料結合。如上述，若添加兩種 或多種不同聚合物或/與兩種或多種不同擔體材料時，會有 一種聚合物與擔體材料鍵結。 至於反應條件可依需要完全改變，以使至少一種聚合物 可與擔體材料鍵結。 若該鍵結依溫度而定時，其可例如：配合鍵結之變化， 依需要提高或降低溫度。同樣地，較佳具體實施例為改變 包含至少一種聚合物之溶液甲之成分或慢慢濃縮溶液。 包含至少一種聚合物之溶液成分原則上可使用任何方法 改變’但此等變化應需達到鍵結之目的。 較佳具體實施例中，在包含至少一種聚合物之溶液中添 加至少另一種對其中至少一種聚合物之溶解性差之溶劑。 另一項具體實施例中’改變溶液成分之方法為添加至少 一種酸性或至少一種驗性化合物或其申兩種或多種之混入 92216.doc • 47- 物，以改變溶液之仲值，使至少—種聚合物成功鍵结。咸 解添加種或多種緩衝液時，亦可改變溶液之pH值， 使至少一種聚合物成功鍵結。 此外可添加適當化合物，如，例如：鹽類，包括例如： 金屬陽離子之鹽類，或適當之有機化合物，藉由此等添加 物使至少一種聚合物成功鍵結。 I 3至夕#聚合物之溶液亦可經濃縮，使應與擔體材 料鍵結之該至少一種聚合物於溶液中之濃度保持怪定。此 等各液之濃縮法可利用—種相當緩慢之方法進行，以持續 保持聚合物之丨互定濃度。 此外，亦可在溫度變化《影響下，㈣當方式組合上述 一種或多種方法。例如：不僅可改變溶液之成分，並可持 續k /辰lig >谷液與/或依適當方式改變溫度。 依所選用之反應條件而定，可使一種或多種不同聚合物 承載在擔體材料上。此外，所選用之反應條件使兩種或多 種不同聚合物同時承載在擔體材料上時，可在擔體材料上 形成一個包含兩種或多種不同聚合物之位置。若使用兩種 或多種不同擔體材料時，各擔體材料可分別具有一個包含 一種或兩種或多種不同聚合物之聚合物位置。 此外，亦可在一個步驟中使擔體材料上產生至少一種聚 合物之兩個或多個位置，由該聚合物之第一個位置與擔體 材料鍵結，再由聚合物之第二個位置與該第一個位置鍵 結，可視需要再由聚合物之下一個位置分別與前一個位置 鍵結。因此每個位置原則上包含單一種聚合物或兩種或多 922l6.doc -48· 種不同聚合物。 依據第二項具體實施例， c. 種♦合物之溶液與擔體 2接觸之反應條件可使該至少—種聚合物之溶液產生e. ^ ^ ^ ^種奴合物特別適合在該溶 液與擔體材料接觸期間承载在擔體材料上。 依據上述方法’在第—階段中，在擔體村料上產生一個 置2ΓΓ物之位置，再於第二階段中，在此第一個位 帛-個位置’再依需要，於第三個階段中，在第 二固:立置上產生第三個位置，依此類推。適當之承載方法 可參見上述討論。 、”聚合物與擔體之鍵結，，意指完整之可逆性共價性、不可 逆^共價性及非共價性交互作用。利用此等作用，可使至 :::聚合：與擔體材料或/與一種可視需要已承載在擔 /上之聚合物位置或可視需要已承载在聚合物位置上 之聚合物位置交互作用。 非it措本上可添加全部聚合物，例如：於該位置形成 二私性交互作用。此外，該帶狀聚合物本身與/或該帶狀 之至；一條側鏈中應包含至少-個可用於與聚合物 產生父互作用之官能基。 然而’該交互作用亦可利用例如：碳氫鏈結與其他可利 用凡得瓦交互作精構成之結構單it達成。 ㈣之可逆性共價性交互作用實例為利用二硫鍵或利用 穩疋之酉曰或亞胺之鍵結’例如：希夫氏⑽涵驗 烯胺。 92216.doc -49- 1353880 另一項具體實施例中 物或其混合物依未衍化 如上述與至少一種擔體 即可。 亦可使上述所有聚合物或/與共聚 之型式承載在擔體上，只要確保可 材料共價或/與非共價性交互作用 ,承載在單體上之聚合物之衍化法中，可採用上述活化與 衍化反應步驟’接著再進行交聯步驟，其說明於_侧 與 WO 00/78825 中。 此具體實施例中’本發明方法之特徵在於由至少兩個不 同基團與具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物共價結 合之A ’先由確聚合物承載在擔體上。 另一項特定具體實施例中，由該具有至少兩個相同或不 同官能基之聚合物利用聚合作用或聚縮合作用，直接在擔 體上產生至少兩個相同或相異之官能化單體。 較佳為由烯系不飽和單體（其中最好包含〇H_基團，可視 需要經取代之胺基、SH_基團、〇s〇3H·基團、s〇3H基團、 〇P〇3H2-基團、〇p〇3hr·基團、p〇3h2基團、？〇姐-基團、 COOH-基團與其中兩個或多個之混合物，其中尺較佳為烷 基）’依習知方法，於擔體材料之存在下進行聚合。該單體 亦可包含極性基團，如，例如·· _C]S^其他適當單體為例如： 乙二亞胺、烯丙基胺或乙稀基n比洛唆酮。 較佳聚合技巧為乳液-、懸浮液_、勻散液_與沉澱聚合法， 其中該聚合法係在擔體或擔體材料之存在下進行。該聚合 法可依習知方法’利用例如：自由基起始物如：偶氮化合 物或過氧化物’經由陽離子或陰離子性起始物或利用能量 922l6.do, -50- 1353880 照射啟動進行β -項具體貧施例中，該聚合物可以不在聚合物鏈結與擔 表面之間發生反應。此等具體實施例較適用於至少兩個 單體中之—含有親水性單體時，#，例如：乙二亞胺、稀 丙基胺或乙烯基吡咯啶網。當含有親水性擔體，如，例如： 夕夥時，所形成之聚合物通常可強力吸附在擔體表面上。 六為了提同有塗層之擔體之安定性’亦可由聚合物與擔體 又聯。其較佳作法為加#，使先吸附之聚合物上之官能基 與擔體反應或由擔體之官能基與聚合物反應，藉以產 結。 然而亦可進行（共）聚合法，其係由聚合物直接在擔體表 面進行化學性結合。此等具體實施例較適用於需要製備特 別安定之有塗層之擔體時。此時擔體上具有之基團可在聚 合條件下，與在擔體表面上所形成之聚合物鏈結反應。亦 可由聚合物之官能基與擔體表面反應。若使用矽膠作用擔 體材料時，可由例如：矽膠表面上之矽烷醇_基團參與具^ 至少兩個官能基之單體之聚合作用，互相固定擔體與聚合 物°亦可例如：由乙稀基石夕烧中之乙烯基參與具有至少兩 個相同或相異官能基之單體之共聚合反應，固定在擔體表 面上。 為了進一步提高所形成固定相之安定性，可由具有兩個 相同或相異官能基之單體於一種或多種交聯劑之存在下進 行聚合。具交聯作用之物質實例為雙官能基化合物，例如： 二乙烯基苯或.乙二醇二丙烯酸酯。 92216.doc -51 - 1353880 最好帶有上述基團之具有至少兩個相同或不同官能基之 單體組成元件亦可依已知方法，於擔體材料之存在下相互 聚縮合。 其中可依WO 00/32649與WO 00/78825中之說明，採用以 ONB-C1為主之方法與試劑。 所形成之官能化聚縮合物最好為聚伸苯基型、聚酯型、 聚醢胺型、聚醚型、聚醚酮型、聚醚颯型、聚尿烷型、或 聚矽烷氧基矽烷型。亦可由此等反應型態產生混合聚縮合 物。該聚縮合法可於溶液中或熔融態進行。 聚縮合物最好使用聚酯型。其亦可藉由添加其他多官能 基化合物，如，例如··多價醇，例如：三經曱基丙烧、季 戊四醇或糖，進一步交聯，來提高安定性。若含有對異氰 酸酯基團具有活性之聚酯基時，該交聯法亦可利用多官能 基之異氰酸酯進行。可使用例如：含經基之聚醋與聚異氰 酸酯反應，使尿烷單元進入聚酯中。 所形成之有塗層擔體材料即可例如：利用過濾法，自聚 合或聚縮合法所產生之反應混合物中單離出，並使用適當 溶劑洗除擔體表面材料上未結合之聚合物-或聚縮合物顆 粒0 因此，根據本發明方法之特徵在於由具有至少兩個相同 或相異官能基之單體直接在擔體上經由聚合作用或聚縮合 作用產生具有至少兩個相同或不同官能基之聚合物。 上述聚合法中，亦可在擔體上塗覆，其係類似已知之"莽 跡技術"，於供以後辨識之基質之存在下進行。在慣用語法 92216.doc -52- 1353880 中’此基質通常以”模板”表示。 兩個相同或相異官能基之 。各單體最好帶有其中一 此聚合法之前提為該具有至少 單體已帶有具有結合能力之基團 個相異基團。 之不同基團之單 亦可添加已具有至少兩個具有結合能力 體。 b 聚合法最好在多孔性物質中進行。 可採用前文曾述及之聚合技術進行聚合。 使用適當溶劑溶離或洗出基質後，即可在步驟⑼令產生 具有至少-個預先形成，供與基質交互作用之空間 劑。 ,較佳具體實施例為選出用於聚合法之單體，使擔體上所 製成聚合物具有-個儘可能最高硬度與交聯度之架構，使 該交互作用空間儘可能保持最大安定性。因此最好使用丙 烯酸或f基丙烯酸或其衍生物或混合物作為至少—種官能 化之單體，咸了解’其可製成具有高度玻璃態化溫度之聚" 合產物或共聚物產物。特別適合此目的之單體實例為甲基 丙稀酸與乙二醇二甲基丙烯酸酯。 其他實例可述及甲基丙烯酸與羥乙基丙烯酸酯之聚合 法，所產生之聚合物將含有具有結合能力之羧基與羥基。 上述用於塗覆擔體之聚縮合法亦可在下文中說明之基質 之存在下進行，其甲作為單體之化合物為已包含具有結合 能力之不同基團之化合物。各單體所含之該基團最好相異。 所使用之單.體亦可已具有至少兩個具有結合能力之不同 92216.doc •53- 1353880 使用適當溶劑溶離或洗滌基質後，於步驟（ii)中製備至+ 一種具有預先形成與基質進行交互作之空間之吸附劑。 因此此具體實施例之特徵在於由至少一種具有至少兩個 有結合能力之不同基團之單體，或由至少兩種各具有至I、 一個具有結合能力之基團之單體（其中該等基團相異）利用 聚合作用或聚縮合作用直接在擔體上形成聚合物，該聚合 法或聚縮合法係於以後要結合之基質上進行。 較佳具體實施例中，由該 於至少一種沒有具結合能力 在下進行聚合法或聚縮合法 因此具有間隔基之功能。 單體直接在擔體之存在下，及 之基團之第二或第z單體之存 。該至少一種第二或第三單體 至少二價之基質與至少一種吸附劑之結合性不一定需要 有至^兩個不同基團與聚合物鍵結。步驟（H)甲，基團亦。 不使用聚合物即直接固定在擔體表面可 較佳為當該擔體係由無機材料製成時，可在擔 進行固定。錢無餐料切膠或氧化紹。 間隔基與 較佳固定法為活化_與/或矽烷化反應。亦可利用 擔體表面聯結。 較適用之活化試劑說 矽烷化試劑最好亦包括 較佳石夕烷化試劑為齒 與矽胺烷。 在一項具體實施例令 明於 WO 00/32648 中》 可進行氫矽烷化反應之矽化合物。 石夕燒’更佳為氯石夕貌、烷氧基矽炫 含有與基質結合時所需基團之化 922l6.doc •54- !35388〇 合物先與適當矽化合物反應。其產物最後再與擔體表面上 之羥基形成共價之氧-矽-鍵結而固定。例如：烷基（其亦可 視需要經取代’例如：經胺基-、尿素_、醚_、醯胺_與胺甲 酸酯基團取代）’使用烷基化矽烧’依此方式固定在表面上。 依此方式，可例如：由3-胺丙基利用擔體表面上之矽原 子固定。該胺基可進一步反應，例如：與醯基氯反應形成 酿胺。可使用脂系，但較佳為芳香系醯基氣，與活性組成 元件，特定言之ONB-活性組合成元件，其說明於w〇 〇〇/32649 與 WO 00/78825。 可用於將烷棊引至擔體上之矽化合物實例為甲基與辛 基三氯矽烷’藉以引進低碳數或中碳數烷基，或十八碳烧 基一十一破烧基-與一十二碳烧基三氣石夕烧，以引進相當 長鏈。例如：可使用3·胺丙基_三乙氧矽烷引進含胺基之短 鏈烷基。 此外亦可使用矽烷基甘胺醯基醚，其水解後形成二元 醇’亦稱為二元醇相。 另方面，亦可先由擔體表面與具有一個或多個官能基 之矽化合物反應。最後，應固定在擔體上之選拔或檢測用 結合性基團可利用合適化合物引進一個或多個官能基。 例如：可使用雙價矽化合物承載在擔體表面上。藉由該 雙扣即可引進所需結合之基團。適當矽化合物實例為乙烯 基矽烷或（甲基）丙烯基氧丙基三甲氧基矽烷。 上述方法亦可組合使用。 亦可視需要.利用間隔基聯結所需結合之基團，其中較佳 92216.doc 1353880 為在所要固定之基團與擔體之間嵌入短鏈碳鏈。擔體與所 而固疋基團之間之聯結較佳為利用適當碳化二亞胺，如， 例如.二環碳化二亞胺、二異丙基碳化二亞胺、N-環己基-2 (N-甲基嗎琳基）·乙基碳化二亞胺-對—甲苯續酸酯、n_ 乙基-N’-(3-二甲胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽、氯甲酸酯、 羰基二咪唑或二異氰酸酯，如六亞曱基二異氰酸酯進行。 亦可使用均-或雜-遠螯合（h〇mo·或heterotelechele)聚乙二 醇b 使用間隔基時’優先形成刷子型，其中該至少兩個具有 結合能力之不同基團最好鍵結在間隔基之末端與/或側邊。 因此該具體實施例之特徵亦在於步驟（ii)中，至少兩個可 結合第二基質之不同基團利用選自下列各物組成之群中之 试劑承載在擔體上：活化試劑、矽烷化試劑與間隔基，或 其中兩種或多種試劑之混合物。 對基質專一結合性不利之條件為所使用之吸附劑中所含 至少兩個具有結合能力之不同基團為相關技藝上已知之基 團’亦即來自矽膠架構之羥基或經由矽烷化試劑引進之石夕 烷醇基與烷基。因此本發明不包括分別固定在矽膠上之下 列基團之組合：羥基、矽烷醇與烷基或羥基與烷基或矽烷 醇與烷基。 反之’特別適合本發明之基團為苯基、羥笨基、敌其、 胺基與醯胺基，及羥基、吲哚基、咪唑基與胍基。較佳為 此等殘基利用間隔基在擔體表面上形成刷子狀。 因此特別佳之具體實施例之特徵在於步驟（ii)中，該至+ 92216.doc -56- 比 3880 兩個可έ士人筮-甘沐 ° 〇第一基質之基團係選自下列各物組成之群中： 笨基、搜苯基、羧基、胺基、醯胺基、羥基、吲哚基、咪 唑基與胍基。 依上述方法製成之至少一種吸附劑最好依習知方法加工 成名片膜片、微滴定板或奈米小珠。較佳為由步驟⑴) 中之至少一種吸附劑製成奈米形式及應用。 所要結合之基質或自基質混合物中選擇性結合之基質可 ;v驟（iii)中與至少一種吸附劑接觸。其中該基質或基質混 °物可呈固相、液相或氣相’或亦可為其中兩相或多相之 處合物0 基貝或基質混合物最好呈液相。可使用基質或基質混合 2之冷液與懸洋液或勻散液。可使用之液體為水及有機溶 d、有機溶劑之混合物，及包含水與有機溶劑之混合物。 液體中可含有所需濃度之緩衝劑、鹽、酸、驗或修飾劑， 如，例如：離子對試劑。較佳濃度為一升液體中使用10毫 、農度至2莫耳/農度。戶斤需結合之基質最好呈水溶液，例 如：體液。 、、質在吸附劑上之結合性或結合關係可採用已知過程與 方法檢視。吸附劑與基質之間之較佳鍵結為非共價鍵。/、 因此較佳非共價鍵即如本文初所說明之交互作用。 T而亦可由至少-種基質與至少一種吸附劑進行可逆性 共價或不可逆性共價性結合。 較佳為在步驟㈣中以層析法與數據分析法檢視至少一 種第二基質與.步驟㈣中至少-種吸附劑之結合強度。特定 92216.doc -57· 1353880 3之可述及官柱層析法，例如：已知之HpLC*。該至少— 種吸附劑此時即作為管柱之固相。由基質之溶離順序即可 直接推斷每次所使用吸附劑之結合強度。結合強度最高之 基質係最後一個溶離出。 ，可先進行預備試驗’取需分離之基質混合物之溶液稀釋 後，連續加至固相上。結合強度最高之基質即會與結合強 度較弱之基質分開，因此後者會出現在溶出液中。 亦可進行已知溶離技術，其中由相當濃縮之基質混合物 $液加至管柱頂端，然後使用溶離液溶離。結合性弱之基 質先出現在溶出液中。結合性強之基質即可視需要利用更 強之溶離液，自吸附劑上解析溶出。 亦可使用微4熱計。其巾係敎基質與吸賴之結合性 解除時之吸附熱。 另種可利用之方法為表面質粒基因組共振法，測定可 激發之電子之共振頻率’其係隨基質與吸附劑之間交界層 之物理特性而變化。 曰 亦可採用螢光標記法作為檢視法，其中使㈣記榮光物 之基質，僅在與其互補之受體交互作用時才發出螢光。 另種方法為酵素聯結免疫吸附分析法⑻isa)，其係例 如利用與吸附劑結合之抗原，透過免疫試劑處理證實。 亦可心用競爭性與㈣爭性分析，如放射性分析法。 因此，本發明具體實施例之特徵在於步驟（iv)中，採用一 人、自下列各物組成之群中之方法檢視基質與吸附劑之結 強度.層析法、微量熱法、表面質粒基因組共振法、螢 92216.doc •58- 1353880 放射性分析法與Elisa 光標記法、競爭性與非競爭性分析如 法0 · 由結合強度即可判斷哪一 責與基質結合。此等^了種，附劑或其所承載之基團負 質。因此可狀基質之需之基 貝又功月b與特性價值。 因此選擇性結合該基質 (). <万忐之特徵在於另包括步驟 (v)單離出至少一種第二基質。 之方法之特徵在於另包括步驟 此外選擇性結合該基質 (vi): (vi)鑑定及判別至少—種第二基質。 依據該新方法所產生之明叫澈丨4士 座生之吸附劑特別適用於選擇性結合天 然基質或天然活性成分及合祕活性成分。此等基質°與活 性成分之共通點在於具有藥效基團，φ即可在活生物體内 產生生物效應之基團之空間配置。藥效基團使活性成分固 定在天然受體之結合口上，藥效基團即固定在英文文獻 中稱之為scaffo丨d(骨架）之架構上。 天然基質與活性成分最好包括胺基酸、寡肽、核甞酸、 核苷、蛋白質、醣蛋白、抗原、抗原決定基、抗體、碳水 化合物、酵素、辅酶、酶、激素、植物鹼、糖甞、類固醇、 維生素、代謝物、病毒、微生物、植物性與動物性組織之 内容物、細胞、細胞片段、細胞器、溶胞物、外源凝集素、 花鲜化合物、黃酮與異黃酮。 本發明範圍中，特別有利於分解具有有效藥理性之天然 92216.doc •59- 1353880 受體與酵素或其他蛋白質，根據本發明即藉此之助製成吸 附劑之集合庫，用於本發明。此等受體較佳為可與合成或 天然活性成分結合之細胞内或膜類蛋白質。 細胞内受體可來自細胞質與細胞核。可使用包含至少兩 個受體之結合性基團之此等受體或吸附劑選擇性結合類固 醇激素，如：糖皮質激素、礦物皮質激素、雄激素、雌激 素、姓娠激素、維生素-D -激素，及類視黃素或甲狀腺激素。 具有可根據本發明承載在吸附劑上之基團之膜類受體為 鳥嘌呤-核苷酸-蛋白質-偶合受體、離子通道-受體及與酵素 結合之受體。 鳥嘌呤-核甞酸-蛋白質-偶合受體之族群中，對藥物療法 特別重要之神經遞質受體可述及腺苷受體與腎上腺素激導 性受體、ATP-(P2Y-)受體、多巴胺受體、GABAb-受體、（趨 代謝性）麩胺酸鹽受體、組織胺受體、蕈毒鹼受體、類鵪片 受體、與血清素受體。亦包括激素受體與調節劑受體，例 如：Adiuretin、胰增血糖素、生長激素釋放抑制因子與前 列腺素。 -·· 離子通道受體包括ATP-(P2X-)受體、GABAa-受體、（趨 離子性）麩胺酸鹽受體、甘胺酸受體、5-HT3受體、與菸鹼 受體。 與酵素結合之受體可述及具酪胺酸激酶活性之受體、與 酪胺酸激酶結合之受體、具鳥嘌呤核苷酸環化酶活性之受 體、及受體-絲胺酸-/蘇胺酸激酶。 合成活性成分較佳為包括藥物及植物保護劑。 92216.doc •60- 1353880 藥物為例如：對神經系統具有效力之物質（精神病用藥、 安眠藥、興奮劑、止痛劑、局部與全身麻醉劑、肌肉鬆他 劑、解痙攣劑、抗巴金森氏劑、抑制劑、神經節作用物質、 交感神經作用物質、副交感神經作用物質）;對激素系統具有 效力之物質（下視丘_、腦垂體_、甲狀腺_、副曱狀腺-與腎 激素、胸腺激素、胰島素、腎上腺激素、影響生殖腺之物 質），對調節劑具有效力之物質（組織胺、血清素、類花生酸、 血小板活化因子、激動素）；對心血管系統具有效力之物 質；對呼吸道具有效力之物質（抗氣喘藥、止咳藥、祛痰劑、 界面活性劑>;對胃腸道具有效力之物質（消化酵素、肝臟藥 物）;對腎臟與尿道具有效力之物質（利尿劑）；對眼睛具有效 力之物質（眼藥）；對皮膚具有效力之物質（皮膚藥物）；對傳 染性疾病具有預防與治療效力之物質（抗細菌有效之藥 物、抗黴菌劑、病毒-原生蟲疾病之化療劑、抗蠕蟲藥广對 惡性腫瘤具有效力之物質（抗代謝劑、細胞抑制劑、拓樸異 構酶·抑制劑二有絲分裂抑制劑、抑制細胞發展之有效抗生 素、激素與激素拮抗劑）；對免疫系統具有效力之物質與免 疫有效成分（血清、免疫調節劑、免疫抑制劑）。 植物保護劑例如：殺昆蟲劑、除草劑、殺有害生物劑與 殺真菌劑。 〃 合成性活性成分之化合物與化合物族群實例為酚噻畊與 酚嘧畊類似物'丁醯笨與二笨基丁基六氫咣啶、苯醯胺了 苯並二十乎、經基色胺酸、咖啡因、安非它命、類鸦片劑 與嗎啡、費替定（Phetidine)美沙酮（Methad〇ne)、水揚酸與 92216.doc -61 - 1353880 乙酿基水楊酸衍生物、方基丙酸衍生物、胺茵酸衍生物、 苯胺衍生物、吡唑衍生物、磺基吡啶、羥基氣查與氣奎、 青徽胺、N-甲基巴比妥酸鹽與硫代巴比妥酸鹽、二丙基乙 酸、乙内醯脲、多巴胺、去甲基腎上腺素與腎上腺素、麥 角植物鹼、胺曱酸衍生物、磷酸酯、巔茄植物驗、下視丘 激素、HVL-激素、腦垂體後葉激素、硫代尿嘴咬與氫硫基 咪嗤、磺醯基脲、組織胺、三甲基丁烷、前列腺素、雙鳴 胺醇、水蛭素與水蛭素衍生物、噻畊化物、補骨脂素、笨 曱醯基過氧化物與壬二酸、維生素A、維生素κ、維生素Βι、 B2、Βό、菸酸酶胺、生物素、維生素匕2、維生素c、鹵素 化合物、醛、醇、苯酚、含氮雜環、除蟲菊酯與擬除蟲菊 酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、胺甲酸酯、卜内醯胺、胺基葡 糖甞、四環素、氟喳啉、噚唑啶酮、二胺基苯甲基嘧啶、 "比畊醯胺、灰黃黴素、氮丙啶、放線菌素、蒽環型藥、細 胞素、單株與多株抗體。其他為抗原決定基、外源凝集素、 花銲化合物、黃酮與異黃鋼，及單耱與寡醣。 合成性活性成分亦可經過天然活性成分處理^其亦包括 帶有藥效基團之有潛力之活性成分與活性物質，及與該藥 效基團固定之架構（scaffold)。 如本文初所述，本新方法特別適合選擇性分離該等基 質，其所得之資料可判斷所需基質是否可與天然受體進行 交互作用。反之，亦可製造合成性分子層級（亦即抗原決定 基）之相關基團集合庫，用於例如：辨識基質，其 別具有兩種'三種或更多種不同交互作用。當例如成：： 92216.doc •62· 1353880 種已知活性成分與此等合成受體集合庫接觸時，可得 關該天然受體結合位置之可能性結果。 因此本發明採用一種新的互補關係原則，其在受體或吸 附劑方面及某暫卞·工# 買方面各具有至少兩個在化合物中負責進行 ，’’》口之不同化合物殘基或基團d該化合物最好選自下列各 物組成之群I胺基酸、糖、核#酸、料、料與_ 驗基® 7 此二價分子範圍之所有可能組合中當然僅選擇可相容之 互補’亦即具有有利交互作用能量者。有許多組合之能量 上並不利，例如：由疏水性殘基與親水性殘基組合成對者， 或互相排斥之殘基組合。 奸可相容之纽合為例如：成對之具有結合能力之基團⑽ 本基與胺基規基之組合，但不可使用〇H/苯基與烧基/胺基 之，’且σ，因為僅有親水性〇11與胺基及疏水性苯基與烷基會 互相結合。其他互補組合實例為例如：缓基/胺基與胺基/ 缓基之組合及咪唾基/經基與酿胺基/醯胺基之組合。此時不 可相容者為經基/苯基與烧基/胺基之組合，因為親水性基團 不會與疏水性基團結合。 由20種天然胺基酸產生成對之組成元件，其中各含有至 少-個具有結合能力之基團時，共有38〇種變化。在集合庫 中’只包括有意義之結構變化，因為有—系列胺基酸具有 相同功能，亦即蘇胺酸與絲胺酸、楚酿胺與天冬酿胺、顯 胺酸、異白胺酸與白胺酸’等等，因此實際上僅需使用其 中邊種合成之成對組成件’亦稱為成對受趙。因此通常 92216.doc •63· 1353880 由此等20種胺基酸中使用至多7種即已足夠。 由於安置在合成性受體中可移動性受體基團之空間配置 可配合基質需求變化，因此 子所兩之結合目的而言，經常 不需要本身具有不同鏈長之胺基酸，反而僅需要符合交互 則。此時，例如··精胺酸、離胺酸、色胺酸與組胺 2 :純利用胺基提供官能基’但其限制條件為其僅需要 驗性官能基。 右例如.僅由7種胺基酸令選用4種胺基酸或依據本發明 中此等胺基酸之原則，根據排列法僅共有35種不同成對受 體組合。 本發月另一項目的亦為一種組合集合庫，其包含所 ^集之各具有至少兩個不同基團之吸附劑，該基團適合結 合至少-種具有至少兩個不同基團之基質，其中吸附劑中 各至少兩個不同基團與至少一種基質之基團互補。 盘此：：合庫較佳特徵在於，吸附劑之至少兩個不同基團 〇 基質中至少兩個不同基團係選自下列各物組成 之群中·胺基酸、糖、核嘗酸、核誓、似·或嗓呤驗基。 , 、具體實細*例令，該組合庫之特徵在於該吸附劑之 製法包括步驟⑴與（ii): ⑴檢測至少兩個不同基團，其有能力使合成或天然之第 一基質與吸附劑結合， (0使各至少兩個有能力結合合成或天然之第二基質之不 同基團分別承载在擔體上，形成至少一種吸附劑，其 中步驟⑴涉及之基團相同或互補，且步驟（ii)之第二基 92216.doc -64- 1353880 質與步驟⑴中第一基質相同或相異。 本發月;^ $目的亦為一種可選 某質遴人札· 伴汪刀離基質之吸附劑 土貝-複5物。此吸附劑·基質_複合物包括至少一種具 少兩個具有結合能力之不同基團之吸附劑與至少—種 至少兩個具有結合能力之不同基團之基質，其中該至：一 種吸附劑中具有結合能力之基團與該至少-種基質中之其 團互補。 < 暴 該至少-㈣„之至少兩個不同基團與該至少一種基 質之至乂兩個不同基團最好包括選自下列各物組成之群中 之不同基n基酸、糖、、核#酸、料、心令票吟驗 基。 曲吸附劑-基質-複合物係由至少一種吸附劑與基質依非共 仏性、可圯性共價性或不可逆性共價性鍵結組成。較佳鍵 結為可逆性共價鍵結。 本發明另-項目的亦為本新賴方法之用⑨，其係經由至

少二價鍵，使基質與吸附劑選擇性結合，與組合集合庫之 用法。 一種用途可能性為檢測受體_活性成分_交互作用及篩選 活性成分。 車乂佳為利用上述活性成分或活性成分種類來檢測受體· 活性成分-交互作用及篩選活性成分。 本發明亦有利於發展新穎活性成分候選物（前導物質）。 利用於本新方法或組合集合庫，可使此等前導物質之作 用、選擇性、生物利用性、藥物動力學與毒性等方面達最 92216.doc -65-

I 1353880 佳條件。 亦咸了解，活性成分候選物中僅由生物性結合位置中― 個節段涉及交互作用。透過至少兩個此等可與生物性結合 位置中至少兩個節段結合之活性成分候選物之組合與化 合’可以簡單方式發現㈣活性成分。此等尋找活性成分 之功能亦可利用高度平行進行之方法達成。 另一種用途可能性為分離立體異構性與結構異構性化合 物。 ° 此外亦可用於純化與/或分離基質與基質混合物。 較佳為利用層析法進行純化與/或分離。其他適當方法為 電泳法、聚焦電泳法、平板凝膠電泳法、平行層析法、平 仃急驟層析法與毛細管技術。當逹到夠高之選擇性時，可 經由添加吸附劑，直接自已溶解之混合物中吸附基質，攪 拌後’呈吸附劑-基質-複合物之型式濾出。 其他用途可能性為用於自物質混合物中分離出濃度非常 低之有害物質與分解產物。 較佳為用於分離來自體液（如血液）中之有害物質與分解 產物。此等有害物質與分解產物呈物質交換產物或代謝 物’造成中毒。其可能由生物自然產生及可由身體自行製 造，但亦會自外界進入，例如、經由皮膚、口腔黏膜或經 由注射至例如：血道。有害物質與分解產物可述及蛇毒愈 母'品0 該吸附劑最好用於透析純化法。 此外’可自溶劑、加工用水及自加工過程中分離出有宝 922l6.doc -66- 1353880 物質’供製造民生用品。 藉由本發明之助亦可進行藥物 封代謝性與生物可利用性。 力千研九，特…探 该選擇性结合之新方法有利 1更用縮减動態組合之集合 犀。，、目的在於依據本發％ 人θ自除了許多離析物外，尚包 含所需党質（較佳為活性成分 规刀）之此合物分離出後者。因此可 在平衡組成下添加新基質至、、日 物中。分離過程可重覆至 不再有基質形成為止。 如上述，該新方法可使用 ^植其他基質自混合物中 專一且選擇性分離基質。 因此根據本發明，選擇性 〜葙口忍扣使用至少一種其他同 ^存在之基質自混合物中分 同夷之其… τ刀離-種基質’含有至少兩個不 人二 現在吸附劑上之至少兩個不同基團之結 °強度两於該同時存在之基質。 ::發明前述說明，先利用下列過程明確定義交互作用 種類與交互仙型態，如下列實例說明： 依所需濃度與組合，針對目的引進受體之結合位置。 -經由删除、補充、改變或封阻受體及試驗物質之單— 結合位置’其中明確測定對結合強度（能量值）之影塑， •進行光譜分析與測定吸附熱。 i例如·經由與文獻上已知各非共價鍵種類之單一影響 較’可預知多僧献夕敫 a 貝鍵之整體交互作用驚人地良好。反之，— ®玄各結合能量達所箱如 a 預期之咼值時，則可推斷該基團可能參 與鍵結。 > 92216.doc -67- 1353880 =此先依所選用之分離問題，針對 二 ==基:)之一括依：_ 物質)區分非共價交互作用足广用競子性基質(同時存在之 本發明上述方法中， a M .. 中.4不向度分離選擇性，亦簡稱為揖 擇性。該分離選擇性 間稱為選 之基質之鍵結中=自吸附劑上選擇性分離 在之A質之播姓常數或谷1因數與吸附劑上同時存 土貝之鍵、，·°結合常數之商數。 =:當删除—基質上—個縣，使數值達到35以 即達成分離選擇性。將芳 所得數值為10。 ％系改用二㈣替代時， 藉由該新方法’可使其分離選擇性達到工業規模， 目前技術相比，具古螫Αώ '、兴 八雜…/具有驚人地焉度選擇性，且可成為常見之 刀離法，此點係層析法迄今尚無法達成者。 較佳分離選擇性α應大於14，在此選擇性下，可利用至 少-種吸附劑’使具有至少兩個可結合至少一種吸附劑之 不同基團之選擇性結合之基質自基質混合物中分離。 較佳分離選擇性α為大於2，更佳為大於4，亦更佳為大 於8 〇 亦較佳分離選擇性α為大於1G，亦更佳為大於 以習此相關技藝之人士已知之吉伯氏能量測定法測定 時，除了直接取得結合常數外，亦得知吉伯氏能量與分離 選擇性之間關係。非共價鍵之吉伯氏能量△ G變化負值愈大 時，表示相互結合之基團之互補特性愈強，因此在同時存 92216.doc •68· 1353880 在之物質中產生之分離選擇性亦愈大，高gegentiber Begleitstoffen, die sich durch die Ein-fiihrung der hier in Rede stehenden zur結合（mit den Ziel物質）befa-higten基團 nicht nennenswert bzgi. der吉伯氏能量 n (zu diesen基團 bzw. den吸附劑）vertinderm。 因此依所需成對基質產生之選擇性即足以再於吸附劑中 再加一個具有結合能力之基團，只要此等基團不是這兩個 需分離基質中之一之互補對象即可。 依上述方法亦可證明，是否同時發生鍵結（亦即增加效 價）及發生哪一種鍵結。然而，當該基質透過誘發配合至少 包含部份空間或適應受體之構形，才有可能得到此等增加 效價，特定言之計晝達到之結合常數與吉伯氏理論值。 此等適應過程特別適用於聚合物網狀結構，其中聚合奈 米膜所選用之交聯程度足使基質結構產生隨構形變化之彈 性及適應性。聚合網狀結構中最好包含分子量在1000道耳 吞以下之小型基質。較大基質，如，例如：肽或蛋白質最 好與聚合物網中凹處有限之接受面結合，可進行多價交互 作用，但避免封入造成過強鍵結。 為了實現構築選擇性多價結合位置之觀念，經常必須在 可移動之構形空間中提供所需結合點。因此必須透過夠強 之結合傾向，以適應（誘發配合）構型。該至少兩個必要之交 互作用位置特別需要在該空間中形成較高濃度，以便依據 較多數量之構形變化達成所需結合結果。 【實施方式】 92216.doc •69· 1353880 本發明將利用下列實例說明。 實例1 ··以N-封端胺基酸作為基質，利用至少二價鍵與以聚 乙烯基胺/矽膠為主之吸附劑之選擇結合性 探討8種不同胺基酸衍生物（表1中基質）於4種以聚乙烯 基胺/矽膠為主之不同吸附劑（表2中吸附劑）上之滯留特 性，其中選用層析法作為分析法。該吸附劑將在下文實例 中以固相、合成性受體或受體表示。 所使用之胺基酸衍生物為麩醯胺-(1-4)與麩胺酸衍生物 (5-8)，其各胺基分別具有4種不同封端保護基：乙醯基 -(Ac)、第三丁氧羰基-(Boc)、苯甲基氧羰基-(Z)與芴基曱氧 基幾基-(Fmoc)。

表1 :使用之基質 麵醯胺衍生物 麩胺酸衍生物 N-保護基 Η 0 Η 0 ΌΗ 〇乂^2 。入OH Ac-Gln 1 Ac-Glu 5 Ac 〇 H3C 人 AS Boc；Gln 2 Boc-Glu 6 Boc ch3〇 H3Cj T HaC^^O^^AS 92216.doc -70- Z-Gln 3 Z-Glu 7 z 〇 矿人 Fmoc-Gln 4 Fmoc-Glu 8 Fmoc 1353880 所使用之受體相稱為聚乙烯基胺，係粒子大小20微米與 孔徑1000埃之球形矽膠。第一塗層為胺基相A。經衍化之受 體相B至D則.由胺基相A依已知方法，在固相上合成。 表2 :所使用受體相之結構 名稱 組成 結構 A BV 02043 K1000-PVA-FA-2-5-Dod 胺基相 νη2 B ND 03001#2 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-Ac-100 乙酿基相 ΗΝ、 /0 r ch3 C ND 02031 K1000-PVA-FA-2-10-Dod-MVS- 100 4-甲基戊基相 ΗΝγΟ H3C^Ssv-CH3 92216.doc -71 - D ND 03017 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-BzlO- ........丫 100 苯甲基氧羰基相 Y ό 1353880 所有受體相均另具有呈質子化態之游離胺基可與基質之 適當陰離子基團例如：羧酸根進行離子性交互作用。受體c 與D另含可進行親脂性交互作用之殘基。 受體之胺基含量可採用層析法，使用10 mM 4-甲苯磺酸 之DMF溶液溶離定量。每克受體相中胺基量示於表3。 表3 :受體相之胺基含量 合成性受體 胺基毫莫耳/克 A BV 02043 0.60 B ND03001#2 0.03 C ND 02031 0.13 ND 03017 0.16 基質1至8之層析法所使用移動相為pH 7.5水性Tris-HCl-緩衝液。以缓衝液濃度10至500 mM進行等濃度溶離。 由於各緩衝液中基質與受體之間交互作用強度比例與裝 置無關，因此採用相對溶離強度k'(容量因數）。其計算法為 以最高峰時之溶離體積與管柱靜體積之差值除以管柱靜體 積，如下列公式： 92216.doc -72· 1353880 k,=溶離體積-管柱靜體積 .. 管柱靜體積 基質在10或50 mM Tris-HCl-緩衝液中之k，值示於表4與 表4:基 •質在pH 7.5之10 mM Tris-HCl-緩衝液中之k，值 受體 基質之相對溶離值k’ — Ac Boc Z Fmoc 1 5 2 6 3 7 4 8 A 9.5 433 8.8 411 15 >715 85 >715 B 0.1 0.2 0.1 0.3 0.3 0.3 0.2 1.6 C 1.3 25.7 3.6 127 12.5 575 419 >715 D 1.4 26.1 2.1 41.9 9.7 263 297 >715 表5 :基質在卩只7.5之5〇1^1^^匚1-緩衝液中之k’值 受體 基質之相對溶離值k’ Ac Boc Z Fmoc 1 5 2 6 3 7 4 8 A 2.3 33.2 2.2 34.4 3.6 62.9 20.3 478 B 0 0 0 0 0 0.1 0.2 0.2 C 0.2 - 23 0.9 9.9 3.4 ^ 37.6 111 562 D 0.3 2.6 0.5 0.5 2.5 20 78.4 >715 比較表4與5之内與之間k’-值後，得到下列觀察結果與說明： 1.觀察結果：乙醯基化受體相B(ND 03001#2)在最低緩衝液 濃度下沒有與任何基質出現顯著之結合（kSl.6)。 觀察結果之說明：此等受體中可與基質之羧酸根進行離 子性交互作用之胺基數量很少。受體相之乙醯基或聚乙 烯胺鏈均不會進行顯著親脂性交互作用。 92216.doc • 73- 1353880 2. 觀察結果：具有兩個羧酸根之基質（5-8)於l〇 mM緩衝液 中之結合強度比僅具有一個缓酸根之相應基質（1 _4)高約 20至40倍。在50 mM中，二羧酸根之結合強度又比單竣 酸根高10至25倍。 觀察結果之說明：基質之缓酸根與受體之胺基之間顯著 具有離子性交互作用。基於二緩酸根之二價交互作用， 使得其交互作用遠比僅利用一個缓基與基質結合之強度 更高。醯胺基在水性介質中沒有顯著之結合性。 3. 觀察結果：將緩衝液濃度自1 〇 mM提高至50 mM時，會使 結合強度下降’單缓酸根之下降因數為約4，二缓酸根為 約10。 觀察結果之說明.由此等結果可知其離子性交互作用隨 緩衝液濃度升高而減弱。此減弱效應顯然係由緩衝鹽與 基質之叛酸根競爭受體上之錢基所致。基質之強力結 合性使得緩衝液鹽之競爭性更強，因為其中涉及兩個羧 酸根。 4·觀察結果：兩種相同基質之k，·值隨其仏保護基之有機殘 基大小大幅提高》結合性增量則與緩衝液濃度無關。 觀察結果之說明：由其中可見，基質之羧酸根與受體之 録基之間除了離子性交互作用以外，尚包含基質與受體 之間之親脂性父互作用。因此，N_保護基中由小至大之 有機殘基在叉體相C與D中，特別能影響結合強度上升， 該叉體相中之受體基團特別適合親脂性交互作用。 ，、·。順.由上.述貫驗可知，該合成性受體可同時與相應基 92216.doc -74- 1353880 質進行2或3種結合交互作用，但其前提為受體與基質之 相應官能基應互補。 因此，配合目標物設計一種互補受體時，很容易分離同 時存在之物質或副產物。分離可能性比例以k'-比值商數代 表選擇性α，如下列公式： 選擇性：a = f/k〆 以苯甲基-胺基-受體相D為例：以10 mM Tris-HCl-缓衝液 (pH 7.5)為移動相層析分離Z-Gln(3)與Z-Glu(7)時，α值約 25(263/9.7)。 由此可知各所需引進之分子殘基與結合強度之間具有可 定量之相關性。 實例2 :以黃酮類之柚皮素作為基質時，利用至少二價鍵與 instAction公司之受體相之結合性 柚皮素（圖1)與instrAction公司之7種不同受體相（表6與7) 之交互作用係以乙腈作為溶劑測定。此測定法係採用所謂 "攪拌瓶研究法”直接進行之平衡測定法

92216.doc -75- 1353880 表6 :使用之固相 受體相 組成 胺基 毫莫耳/克 A BV 02051 K1000-PVA-FA-2-5-Dod 0.54 C ND02048#2 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-MVS-100 0.16 D ND03017#3 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-BzlO-100 0.10 E ND03033#2 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-ImAc-100 0.53 F ND 03049 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-Acrid9Car- 100 0.29 G ND 03050 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-NaphCar- 100 0.23 H ND 03062 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-iNic-100 0.35

攪拌瓶研究法係取準確稱重之受體相（各約100-300毫 克）懸浮於準確測得體積之溶劑（15毫升）中。於此等懸浮液 中分批添加準確稱重之柚皮素（例如：10毫升之1 〇 mM乙 腈溶液）。柚皮素將隨動力平衡之調整，分溶於受體相與溶 劑之間。 隨即確實檢測平衡狀態，其中利用高效液相層析法 (HPLC)測定溶劑中柚皮素濃度。即可直接得到液相（乙腈） 中柚皮素含量。受體相上柚皮素含量之計算法為所添加柚 皮素量與溶液中柚皮素含量之差值。每次攪拌瓶研究法均 逐漸提高系統中柚皮素濃度，進行多次（6-12次）檢測。柚皮 素與溶劑之增減用量將經過仔細平衡及詳細計算。 92216.doc -76· 1353880

922l6.doc •77- 1353880 每次平衡調整時，可得到一個吸附等溫點（與受體結合之 柚皮素[RS]相對;於溶液中柚皮素[S]作圖）。採用Langmuir-吸附等溫線模式，由下列非線性迴歸公式計算結合性（KA) 與最大負荷量（R〇)之平衡常數

Langmuir-等溫線：[RS] = [R。] X [S] / (1/KA + [S]) 交互作用特別弱者不適用此非線性方法。此時將利用線 性迴歸分析，依Scatchard曲線（[RS]/[S]相對於[RS]作圖）檢 測、與R。。

Scatchard曲線顯示，Langmuir等溫線為直線。

Scatchard線性：[RS]/[S] = -KAx [RS] + KAx [R。] 依據Scatchard曲線發現之一項重要優點為其偏離線性之 程度很小。此表示受體相在同一結合位置之結合強度友結 合量不同。 結合常數KA與最大負荷量R。示於表8。 表8 :結合常數ΚΑ與最大負荷量R〇 受體相 衍生物 ·:： 交互作用 強 弱 Ka2 R〇2 κΑ1 R〇i A BV 02051 100%胺基 2121 14,7 931 22tl C ND 02048#2 MVS-100 1302 48.4 760 66,3 D ND03017#3 BzlO-lOO - - 329 29,2 E ND 03033#2 ImAc-100 6194 4,9 - - F ND 03049 Acrid9Car-100 2961 19,5 65 243 G ND 03050 NaphCar-100 1943 38.5 379 91 H ND 03062 iNic-100 - - 778 21.7 92216.doc •78- 1353880 觀察結果與觀察結果之說U皮素可利用其紛系經基 基團與㈣相A之-級胺基進行極性交互作用，f子性二 劑中，以乙猜極適用於測定此等交互作用。由上述強U 與弱(fCA1)結合位置可見，柚皮素顯然可能利用三個存在之 酚基，進行單價、二價與三價極性結合。 又體相C、D與G中’大多為經親脂系殘基衍化之A相之一 級胺基。若此等殘基未參與柚皮素之結合作用時，此等相 中負荷量必定隨有限之胺基數量下降。其平衡常數保持約 ㈣’因為交互作用型態本身未改變。事實上，有部份負 荷量顯著增加’例如：萘醯基衍化之受體（受體相A與G)則 由14.7上升至38.5毫莫耳/克受體相。此等結果只能解釋為 柚皮素與何化基團之間另有其他交互作用。這三種受體基 團之共通能力為可進行親脂性交互作用。柚皮素本身同樣 具有可參與此等交互仙之親脂性分子部份。 因此，柚皮素可與受體相c、；0與（3 八 亦即與殘留之胺基結合，及與受體基團謂、二或 NaPhCμ進行親·脂性結合。應注意，此等親脂性結合作用係 ;有機〜(乙如）中進行。其表示，袖皮素與親脂性受體基 團之間接觸時，盆能| . /、罝上不受親脂性基團與有機溶劑之溶 合化反應之影響。 ’、X體相C、D與G之結合常數Ka係由極性與親脂性結合 八5冓成其、5吊數一律低於胺基相A。該親脂性結合 顯然比極性結合弱，+ $ + 此再度證貫可使用極性相當高之有機 溶劑（乙腈）。 92216.doc -79- 1353880 受體相E、F與Η包含之受體基團可同時參與親脂性及極 性結合，其均含有胺基，部份包埋在芳香系結構中。在成 體相Ε與F上發現最高κΑ值。此表示當受體c、〇與g利用胺 基引進親脂性受體基團_，特別適合由極性與親脂性結合 部份共同合作發生作用。 結論：由此等實例可知，溶齊！中之基質（抽皮素）可與對 應之受體相發生不同結合作用。在適當選擇固相之受體基 團時，可同時活化與基質之極性及親脂性交互結合作用二 同樣亦可配合特定基質或基質基團之結合性製備受體相， 同時進行不同結合可能性，因而產生選擇性交互作用空間。 實例3:以結構同系物之苯衍生物作為基質，利用至少二價 鍵與來自instrAction公司之受體相之結合性 於非極性有機溶劑混合物中測定結構同系物之苯衍生物 與一種 instrAction 受體相 C (ND 〇2〇48#2, K1〇〇〇 pvA_ FA-2-5-D〇d-MVS-100)之間之交互作用。受體相ε中除了 4· 甲基戊酸根（MVS)以外，尚包含〇·16毫莫耳/克胺基。所使 用之溶劑為甲基-第三丁基醚/庚烷之混合物（體積比1/3)。此 非極性溶劑混合物令，主要發生極性交互作用，且可完全 溶解試驗物質。 採用所謂"擾拌瓶研究法”測定受體相與試驗物質之間交 互作用之結合常數（ΚΑ)與最大負荷量（R。）。 授摔瓶研究法係取準確稱重之受體相（各約2〇〇_35〇毫克） 懸洋於準確測得體積之溶劑（15毫升）中。於此等懸浮液中分 批添加準確稱重之基質。該試驗基質將隨動力平衡之調 92216.doc -80- 1353880 整，分溶於受體相與溶劑之間。隨即確實檢測平衡狀態《 其中利用高效液相層析法（HPLC)測定溶劑中基質濃度。即 可直接得到溶劑中基質含量。受體相上基質含量之計算法 為基質添加量與溶液中基質含量之差值。每次攪拌瓶研究 法均逐漸提高系統中基質濃度，進行多次（6-12次）檢測。基 質與溶劑之增減用量將經過仔細平衡及詳細計算。 每次平衡調整時，可得到一個吸附等溫點（與受體結合之 基質[RS]相對於溶液中基質[S]作圖）。採用Langmuir-吸附 等溫線模式，由下列非線性迴歸公式計算結合性（KA)與最 大負荷量（R。)之平衡常數

Langmuir-等溫線：[RS] = [R。] X [S] / (I/KA+ [S]) 交互作用特別弱者不適用此非線性方法。此時將利用線性 迴歸分析，依Scatchard曲線（[RS]/[S]相對於[RS]作圖）檢測 KA與 R0。

Scatchard曲線顯示，Langmuir等溫線為直線。

Scatchard線性：[RS]/[S] = -KA X [RS] + KA X [R。] 所得之交互作用參數KA與R。及試驗基質共同示於表9。 92216.doc -81 - 1353880

92216.doc •82- 1353880 觀察結果：由表9可見，卩結合常數κΑ代表之試驗物質與 受體相之間交互作用隨苯環上取代基數量增加而提高。 僅具有-個取代基之苯衍生物之結合常數在4G升/莫耳 以下，此數值係上述測定法之檢測限值。 苯環上第二個取代基將另—種交互作用可能性引進試驗 分子中。這兩種微弱之交互作用可以合作，使二取代苯衍

生物之結合常數極接近單取代笨之結合常數乘積。因此κΤ 值為400至1 〇〇〇升/莫耳。 A 笨環上第三個取代基為二取代苯之結合常數與其本身相 當微弱交互作用潛力（]^約2〇_4〇升/莫耳）之乘積，因此三= 代苯之結合常數為17722升/莫耳β 一 4-胺基-3-硝基笨基氰之Scatchard曲線示於圖2。

92216.doc -83- 1353880 圖2 : 4-胺基-3-硝基笨基蘯 +丞鼠之不冋基質濃度[S]之

Scatchard 曲線 其中 a:三價交互作用範圍 [S] = 0.0044 - 0.043 mM KA3 = 17722 升/莫耳 R。3 = 3.5微莫耳/克相 b :三價與二價過度範圍 [S] = 0.086 - 〇.3〇 KA2 = 2350升/莫耳 汉。2 = 16微莫耳/克相 c :二價交互作用範圍 [S] = 0.40 - 0.98 mM KA1 = 855升/莫耳 R〇i = 33微莫耳/克相 由Langmuir等溫線不僅可以結合常數^方式取得交互作 用強度，而且可得知交互作用位置數量作為最大負荷量 R〇。该二價父互作用之最大負荷量比二價交互作用R。低約5 倍。因為合成性受體相提供給三種同時進行之交互作用之 結合位置少於兩種或僅有一種交互作用時。4-胺基-3-硝基 苯基氰中除了三價結合位置以外，尚具有雙價及單價結合 位置；咸了解’此等結合位置之相應結合強度（KA)較低， 及最大負荷量（R。)較高。 圖2說明在極低基質濃度下測定之參數κΑ與R。時，主要觀 92216.doc -84- 1353880 察到強力之二價交互作用（ΚΑ3與R。3)。微弱之單價與二價結 合位置仍無法在此等稀釋溶液中測得。使用較高基質濃度 測定〖八與尺。時，可得到較微弱且較多數二價結合位置之交 互作用強度（例如：KA1與R。!）。強力結合位置已在此等基質 》辰度下飽和，僅對吸附等溫線有恒定之影響。單價交互作 用未示於圖2中。 通常，當Scatchard曲線中等溫線向左上升彎曲時，表示 同時出現不同之強力結合位置。 結論：由所得實驗結果可見，受體相c(結構K1〇〇〇_ PVA-FA-2-5-Dod-MVS-100)不僅可利用3_胺基·4·硝基苯基 氰達成強力三價交互作用，而且可進行較微弱之單價與二 價交互作用。 同一種受體相中，當基質之取代基數量較少時，其表現 亦相同’亦即最大結合強度隨基質分子中取代基數而定。 結合強度因此會受基質分子隨取代基變化之持久且經誘 發之偶極影響。 實例4 :以類固醇作為基質，利用至少二價鍵與來自 instr Action公司之受體相之結合性 採用梯度HPLC，使用僅含一個胺基之受體相a(SBV 01044 VD/4,管柱PV 02007)及27%經分支烷基（4-甲基戊酸） 衍化之C相（ND 02001/1，管柱pv 02001)，測定雌二醇與睪 固酮之結合性（滯留時間）。 梯度-HPLC所使用之條件如下： 中性溶離： 92216.doc -85- 1353880 溶離液A: 1份體積比二曱基曱醯胺+9份體積比水 溶離液B :二甲基甲醯胺 酸性溶離： 溶離液A : 10 mM三氟乙酸（TFA)t i份體積比二甲基甲 醯胺+9份體積比水溶液 溶離液B: 10mM三氟乙酸之二甲基甲醯胺溶液 梯度圖形：5分鐘恆定使用溶離液A，流速〇 2毫升/分 鐘，然後依0.6毫升/分鐘，與B混合2%/分鐘，至物質 完全溶離出為止》 當移動相令溶解過程之吉伯氏能量剛好超過受體_基質· 結合能量時，即可梯度溶離出物質。受體-溶劑交互作用之 吉伯氏能量ΔΟ—樣要達成能量平衡：溶離基質之過程中 (解吸作用）’由於解吸出較多較小之溶劑分子，因此通常熵 值AS會下降，且交互作用焓值△11為適當之負值。 針對目的構成之受體相在基質結合（吸附）期間，溶劑吸 附作用之交互作用焓值△負值程度低於受體與基質之 間多價交互作甩焓值△Η之負值程度。 由於所探討之物質於水中溶解性差，但於dmf令之溶解 ί良好因此必須使用含DMF之移動相進行粗略但簡單溶 離，以便快速比較多種基質對受體之結合強度。 由雖二醇及睪_與受體相之烧基進行親脂性交互作用 時’雌二醇亦可進行類似鹽型之苯齡_胺結合鍵。受體相 C(ND 0200m，管柱ρν〇2〇〇1)含有之4_甲基戊酸根參與親 脂性結合之部份應比胺基相Α大幅加強。 92216.doc -86- 1353880 應可預期，雌二醇與睪固酮相反，前者可以一部份離子 性及一部份親脂性進行二價鍵結。此時，在所使用之溶劑 梯度中，雌二醇自受體相c中溶出之時間應比睪固酮晚。使 用受體相A時，則反而顯著縮短整體之滞留時間，且睪固酮 與雌二醇之溶離關係差異性縮小。 表10為打斷受體-基質結合時所需移動相中DMF所占比例 表10 :雌二醇與與睪固仝之梯度溶離 基質 水-DMF-梯度 lOmMTFA 水-DMF-梯度 胺基相A PV 02007 受體相C PV 02001 胺基相A PV 02007 受體相c PV 02007 雌二醇 131 % 46.7 %% 11.3% 36.6% 睪固酮 10.0% 18.5% 10.0% 27.3% 1. 觀察結果：其結果顯示，雌二醇於胺基相A (PV 02007) 上之結合性比睪固酮強，表示其另可利用離子性交互作 用。在烷基化之受體相C(PV 02001)上，使用46.7% DMF時， 先溶離出雌二醇，相對於基本組需增加33.6%。由DMF之溶 離力量得知結合性大幅提高之結果。睪固酮之結合性則反 而僅需適度提高18.5 % DMF。 2. 觀察結'果如所預期，當利用固相上胺基之質子化作 用造成之離子性交互作用被大幅封阻時，雌二醇之結合性 下降，此時則在移動相中添加10 mM三氟乙酸。 睪固酮之結合性反而在C相之酸性介質中大幅加強，但在 A相中保持不變。這兩種受質中，由於溶離液中所含三氟乙 酸造成受體上之銨基進行另一種交互作用，而無法利用胺。 整體而言，當採用兩種不同非共價性交互作用時，與受 體相之結合強度會大幅下降。僅經由擴大脂系分子部份之 92216.doc -87- ^1353880 親脂性接觸表面所加強之結合性效果不大。 •支持該發現之另—項結果為比較雌二醇分子結構元素之 π留時間特性《此等分子探針可快速進行大規模册似式 驗因此2-萘醯基對c型相之結合性比蔡高，亦進而比 四氫萘齡^由此等關係可知其中應有離子性結合作用而 醇系0Η·基團於水性溶劑中則無法進行極性結合作用。 、’·°淪·含烷基-與胺基之€相（PV 〇2〇〇1)上酚系類固醇之 一仏鍵有利於與非芳香系類固醇分離。其係在等濃度之分 離條件下，當α -值（分離選擇性）達1〇時完成分離。 弱疏水性離子交換劑A (PV 〇2〇〇7)之分離效果則無法達 到令人滿意之程度。 此等原理可用於一般分離中性或鹼性脂系及芳香系之酚 系物質。因此亦可分離多價苯酚。 實例5:以内酿胺作為基質，利用至少二價鍵與來自 instrAction公司之受體相之結合性 於預備分析法中，由甲基_苯基乙内醯脲（MPh) 1、二苯基 乙内酿脲（DPH)2與甲基-苯琥珀醯亞胺3自氯仿中結合形成 含有80%胺基與14%苯甲基（交聯度5〇/〇)之受體相（例如：pV 99047 、 PV 00010)。 以逐漸提高濃度之基質溶液通過填充受體相之HPLC管 柱（40 X 4 mm) ’至飽和平衡為止。由溶出速率、物質溶離 出之時間及物質濃度，在已知之恆定基質濃度[s] = [s。] 下’可分別計算出結合基質上之濃度[RS]。由所測定1〇_12 種基質濃度之溶離曲線，可由吸附等溫線或Scatchard曲線 92216.doc -88 - 1353880 測得結合常數ΚΑ與飽和濃度[R。]，藉以檢測二價與單價結 合範圍。 -

由選擇之溶劑即可確定其中包括相當高極性交互作用， 特定言之氫鍵結合作用。 典型測定值如下列a)至c): a) MPH與矽膠上6層交聯聚（苯甲基-N-烯丙基-胺曱酸 酯）（PAA-OBzll4-2Dod，PV 99047)之鍵結： 二價鍵範圍： KA = 12703 Μ'1 A G= 5.50仟卡/莫耳 R。·二12.0微莫耳/克 單價鍵範圍： KA= 221 Μ'1 △ G = 3.14仟卡/莫耳 R〇= 301.4微莫耳/克 b) DPH與矽膠上6層交聯聚（苯甲基-N-烯丙基-胺曱酸 酯）（PAA-OBzll4-2Dod，PV 00010)之鍵結： 二價鍵範圍： 92216.doc -89· 1353880 Κα=19880 Μ'1 -Δ G = 5.76仟卡/莫耳 R。= 4.6微莫耳/克 單價鍵範圍：

Ka=201 Μ'1 △ G = 3.09ff 卡 /莫耳 R。= 226·7微莫耳/克 c) MPS與矽膠上3層交聯聚（苯甲基_N_烯丙基_胺甲酸 酉旨）（PAA-OBzll4-2Dod，PV 99047)之鍵李士 . '單價鍵範圍：

Ka=75-78 Μ'1 R。=96·5 - 97.4微莫耳 / 克 1·觀察結果：兩種乙内醯脲1與2(熥1>11與DPH)在大規模 檢測系列中，對二價結合常數Ka在6〇〇〇與23〇〇〇 之間 之多種受體相（例如：PV99047、PV 00010)檢測到飽和度R〇 為3微莫耳/克相至12.6微莫耳/克相之間❶其顯示與胺形成 兩個氫鍵。單價結合常數為1〇9至2U m-i(r。239 _ 3〇1微莫 耳/克）之間。琥珀醯亞胺衍生物之單價結合常數則反而僅75 至78 Μ ，截和度R。為96微莫耳/克。其表示破珀醯亞胺僅 形成一個氫鍵，因此僅能進行單價鍵結。 2·觀察結果：二價鍵之結合常數相當符合單價鍵結合常 數之乘積。其單價吉伯氏能量亦接近其加值。5環内醯 胺基團之單一氫鍵於25〇c氣仿中之吉伯氏能量△ 〇為2.5至 3.14仟卡/莫耳之間，二價氫鍵則在5.〇6至5.仟卡/莫耳之 92216.doc -90- 1353880

間。此等數值超過文獻上已知其在氣仿溶劑中之數據(MpH KA = 6014 W，△ G = 5.06仟卡/莫耳，R。=3 2微莫耳/克； 赃KA= 7171 …5.16仔卡/莫耳，r。…微莫 耳/克與KA=145 ，△〇 = 2·90仟卡/莫耳，r。：⑽〇微 莫耳/克）。 結論：當基質與受體各具有兩個同樣互補殘基（結合位置 殘基）進行類似螯合鏈之交互作用時，亦可加強二價鍵結。 此時可述及基質之酿胺基與受體之胺基。其吉伯氏能量接 近其加值，結合常數則接近其乘積。依此原則特別用在發 展受體相上，可分離同系物質或具有不同價數官能基之物 質（例如：1至6價醇，如：糖）。 實例6:以幾種C-封端之胺基酸作為基質時，利用至少二價 鍵與以聚乙烯基胺/矽膠為主之吸附劑之結合性 採用層析法，在7種不同固相上（合成性受體）探討18種不 同胺基酸衍生物（表11之基質）之滞留特性。 所採用之胺基酸衍生物（1-18)呈丙胺酸、白胺酸、捕胺 酸、離胺酸、組胺酸、苯基丙胺酸、路胺酸與色胺酸之酯 型°所選用之酯排除不期望發生之可離子化之羧基官能基 交互作用。甲酯對交互作用沒有顯著影響，反之苯曱酯則 有影響。. 922I6.doc -91 - 1353880 922l6.doc 表11作為基質之胺基酸衍生物 基質 名稱 結構式 1 H-Ala-OMe 0 y~{ HgC 0—0¾ 2 H-Ala-OBzl O h3c 0-’ 3 H-Leu-OMe H,N 0 H3Cp~<〇-c, Η3(/ 4 H-Leu-OBzl yK夕 h3c 5 H-Pro-OMe CK-CH3 6 H-Pro-OBzl ckP 7 _ .Z-Lys-OMe djXL HjN 8 H-Lys(Z)-OMe / ：___.\ H2N 0 )rl 0 92- 1353880 92216.doc 9 , Boc-Lys-OMe c H3〇— c / Η：Ν % —〇 /-’ 0—0«3 10 H-Lys(Boc)- OMe ( H3C— C H2N ,0 /-f 0—0*3 y—nh 〇 11 H-His-OMe H2N 0 jfyyA.cH, H 12 Bzl-His-OMe q_ V/ 13 H-Phe-OMe HaN 0 Q^M〇-ch3 14 H-Phe-OBzl 15 H-Tyr-OMe HW HO—^ 〇—CH3 16 H-Tyr-OBzl _ hw Q H〇_^yy^〇_/ -93-

1353880 所使用之受體相為聚乙稀基胺’係粒子大小微米及孔 徑1000埃之矽膠。在塗覆過程中首先使用胺基相A。經衍化 之受體相B至K則依已知方法，經由胺基相A之固相合成法 製成。各相之說明示於表12。

92216.doc -94-

D , ND 03017#3 - KlOOO-PVA-FA-20-Dod-BzlO-lOO 笨甲基氧羰基相 ΗΝγ° 6 I ND 02061#2 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-BSr-100 琥珀酸相 ,·····^γ^·····： HNW° HO^^O J K1000-PVA-FA-2-5-Dod-MVS-50- ND 03096 BSr-50 ,NH HN\ /0 r r 具有4-曱基戊酸根與琥珀酸根之相 HaC^^CHa K K1000-PVA-FA-2-5-Dod-Bz!0-50- ........w'. ND 03088 BSr-50 具有苯曱基氧羰基-與琥珀酸根之相 。丫NH _丫。 6 〇X 1353880 層析法所使用之移動相為pH 7.5之水性10 mM Tris-HCl-缓 衝液。 採用與裝置無關之相對溶離度k’（容量因數）作為各種緩衝 液中，基質與受體之間交互作用強度之測定值。以最高峰時 之溶離體積與管枉體積之差值除以管柱體積之商數表示 溶離體積-管柱體積 k'=_ 管柱體積 92216.doc -95- 1353880 基質於10 mM Tris-HCl-緩衝液中之k·值示於表13。 表13 :基質於10 mM Tris-HCl-缓衝液中之k'值 基質 受體相之k’值 A B c D I J K 1 H-Ala-OMe 0.0 0.0 0.0 0,2 13.7 8.7 11.6 2 H-Ala-OBzl 0.0 0,0 0.2 2.1 17.4 13,4 23,9 3 H-Leu-OMe 0,0 0.0 00 0,3 12.5 7.1 10.4 4 H-Leu-OBzl 0.0 01 63 10.0 13.1 18.6 41.7 5 H-Pro-OMe 0.0 〇,〇 0,0 0.4 - 11.9 15,9 6 H-Pro-OBzI 0.0 〇，l 0.2 3,6 21,7 16.6 34,4 7 Z-Lys-OMe 0,0 0.1 0.0 2,4 19 J 20.9 61.5 8 H-Lys(Z)-OMe 0.0 0,1 0,6 6,5 12,0 11.5 30.2 9 Boc-Lys-OMe 0,0 0.0 0,0 0.4 14,3 11.9 20.2 10 H-Lys(Boc)- OMe 0.0 0,0 0,1 0,5 9,0 5,3 9.8 11 H-His-OMe 0,0 0,0 0.0 0,3 18.2 5.7 13,8 12 Bzl-iiis-OMe 0.0 0.0 0,5 1.2 4.5 1.9 3,7 13 H-Phe-OMe 0,0 0,0 0.1 0.2 6S5 1.7 3,2 14 H-Phe-OBzl 0.1 0,1 12,6 39,0 7,3 12,3 39A 15 H-Tyr-OMe 0.0 0,2 0J 1.0 8.7 4.8 6,5 16 H-Tyr-OBzl 0.1 0.3 16.7 20.3 9,4 16.3 16^ 17 H-Trp-OMe 0,5 0.2 1.0 4,4 12.5 10.7 17f7 18 H-Trp-OBzl 0.8 0.3 49,6 55.4 16.6 49.5 186,4 • 96- 92216.doc 1353880 1.觀察結果：實例1中探討胺基相上具有羧酸根之胺基酸衍 生物之k'值…實例1之單羧酸根Ac_Gln 1與Boc_Gln 2於胺基 相（BV 02042)上得到之k'值為9.5與8.8。本實例ό之簡單一元 胺，如：H-Ala-OMe 1與H-Leu_0Me 3於羧酸酯相上之让，值 為 13.7與 12.5。 觀察結果之說明：基質與受體相之交互作用基團交換時， 僅微幅改變k1值。因為結合強度應與結合方向無關。有計晝 嵌插交互作用基團時，應注意不論該基團係固定在受體上 或於基質中移動’均會發生類似之結合。 2·觀察結果：联基相A與乙醯胺相B均無法使基質滯留。 觀察結果之說明：受體相八與6沒有可在所選用之緩衝液中 與基質產生顯I交互作用之受體基團。，值相對地為〇。 此等受體相在相對交互作用量表上作為零點。聚合物架構 之親脂性影響可在結合平衡上忽略。 3. 觀察結果··所有基質在缓酸醋相1上均顯著滯留。其^，值 為4.5至21.7之間。 、 觀察結果之說明··所有探討之基f均具有至少—個胺基。 此等胺基於pH 7.5下會大幅質子化，可與受體相之羧酸根 陰離子進行強烈離子性交互作用。 4. 觀察結果：具有—個親脂性部份結構之基質(例如：2、6、 7、8、15或17)在受體相上之滞留性报低。具有至少2 個較大親脂性分子部份之基質（如：4、14、16與⑻之滯留 性較強（k，值>8)。#中與芳香系受體相D之結合性大與院基 受體相之結合性。 92216.doc -97- 1353880 觀察結果之說明··受體相（^與d僅@ $ 片 值此進仃親脂性交互作用。 此專結合性比離子性交互作用漫 1 ㈣補。於所選用緩衝液中之 早知親脂性交互作用經常在檢測邊 ^ 具有兩個延長之親 脂性殘基之基質在親脂性接觸面上之滯留性即提高。 5.觀察結果：|質之最大k，值主要出現在受體相^ 觀察結果之說明：受體相K含有約相 — 昊耳浪度之羧酸根與 本f基氧躲，亦即供進行料性與親祕交互作用之受 體基團。因為交互作用基團總數量相當於各純型受體相c、 D或卜因此遇合受體相Rki值應在喻相之k，值之間。混 合受體相所得.向k’值顯示其同時發咮雜工以^ j吋贫生離子性與親脂性鍵 結’因而出現混合之二價結合模式。 使得所有具有一個芳香 結合性高於與具有分支 基於芳香系之間之7Γ - 7Γ -接觸， 糸殘基之基質與含苯甲基之K相之 烷基之J相之結合性。 结論：由上述實驗可知，針對㈣適當選擇純型受體基團 Z聯結或排除基質與受體相之間交互作用。亦可藉由^^ 洛劑組成之離子強度與pH值來調整親和性與選擇性。 當基質具有兩個親脂性分子部份時，即可與受體相進行 一 4貝交互作用，顯著加強其結合性。此時即涉及相同具 之二價交互作用。 ^ 匕亦發現，當受體相及基質均具有相應之互補基團時，可 能出現不同型態之二價交互作用（離子性與親脂性）。亦可能 加強結合選擇性。 藉由針對目標物質設計相應之互補受體，很容易即可自 92216.doc • 98- 1353880 其分離之可能性係以k， 同時存在之物質或副產物中分離 值之商數表示，即選擇性α。 選擇性：a = k^./k^· 例如·利用苯甲基-受體相D幾乎很難以層析法分離 Boc-Lys-OMe (9)與 H-Lys(Boc)-OMe (10)。在緩酸 i旨受體 相I上之α值為1.59。混合受體相J與K之〇：值為2.25與 2.06。此表示藉由適當設計受體相即可顯著改善混合物 之層析分離可能性。 92216.doc 99·

Claims (1)

1353880 年”月 3修(更)正本 第093108126號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(1〇〇年3月）β 十、申請專利範圍： 丨 ___ 1. 一種製造至少一種吸附劑之方法，該吸附劑具有至少兩 個有結合能力且可選擇性結合一種基質之不同基團其 特徵在於包括步驟⑴至（ii): (0自合成或天然之第一基質中檢測至少兩個可與一種 吸附劑結合之基團， (11)使至少兩個可與合成或天然之第二基質結合之不同 基團刀別承載在擔體上，形成至少一種吸附劑，其 中該基團與步驟⑴之基團相同或互補，且步驟（ii)之 第二基質與步驟⑴之第一基質相同或不同 其中所檢測之基團中，單一基團之吉伯氏能量 (Gxbbs-Energy)對與第二基f之非共價鍵之影響造成負值 之吉伯氏能量△〇’此點可加強結合強度，在至少一種需 要分離之物質中改善其分離選擇性。 2. -種由具有至少兩個可與至少一種吸附劑結合之不同基 團之基質進行選擇性結合 ⑴至（iv): <方法，其特徵在於包括步驟 ⑴自合成或天然之链_ , 、’'第基質中檢測至少兩個可虫一藉 吸附劑結合之基團， 一禋 (Π)使至少兩個可盥人 ，、δ成或天然之第二基質 基團分別承裁右栖脚t 負、。口之不同 錢在擔體上’形成至少一種 十該基團與步驟 基質與步驟⑴之第一基質相同或不同。 (iii)由至少一種第一其防 一基質（其可與⑴項之第一基質相同 92216-1000317.doc 1353880 或相異）與步驟（Η)之至少一種吸附劑接觸， ㈣檢測該至少一種第二基質與步驟（Hi)之至少一種吸 附劑之結合強度， ，'中所仏測之基團中，單—基團之吉伯氏能量對與第二 基質之非共價鍵之影響造成負值之吉伯氏能量Δ(3,此點 〇強。σ強度，在至少—種需要分離之物質中改善其 分離選擇性。

3.根據申請專利範圍第…項之方法，其特徵在於步驟⑴ 之檢測法包括裂解合成或天Μ_基質形成至少兩個具 有至少兩種可與吸附劑結合之基團之組成元件。 4·根據申請專利範圍第】或2項之方法，其特徵在於該組成 儿件具有至少兩個有結合能力之不同基團。 5·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其特徵在於該至少 -種第-基質與該至少一種第二基質相同，且所選出之

該至乂兩個可與第二基質結合之不同基團分別與步驟⑴ 所檢測之基團互補。 6·根據申請專利範圍第1或2項之方法，其特徵在於該至少 一種第-基質不同於至少-種第二基質，且所選出之該 至少兩個可鱼第-其暂4士人> ”弟一基質結合之不同基團分別與 檢測之基團互補。 7·根據申請專利範圍第1或2項之方法，該至少兩個可斑至 少：種第二基質結合之基團係自根據步驟⑴ 團中選出。 丞 其特徵在於步驟⑴ 8.根據申請專利範圍第丨或2項之方法 92216-1000317.doc 1353880 中自合成或天然第一基質中選出至少 义田芏少兩個可與一種吸附 劑結合之基團，形成兩種分別且右 J，、有至少一個可與吸附劑 結合之基團之組成元件，於步驟塑 ’娜U丨）¾成一種吸附劑；或 於步驟（i)t自合成或天然第一基皙φ.登山s , 签資1P選出至少兩個可與 -種吸附劑結合之基團’形成三種分別具有至少一個可 與吸附劑結合之基團之組成元件，於步驟⑼製成至少三 種吸附劑；或於步驟⑴中自合成或天然第—基質中選出 至少兩個可與一種吸附劑結合之基團，形成四種分別具 有至少-個可與吸附劑結合之基團之組成㈣，於步驟 (11)製成至少六種吸附劑。 9. 根據申請專利範圍第i或2項之方 々次其特徵在於該至少 一種吸附射至少兩個有結合能力之不同基團係選自下 列各物組成之群中：胺基酸、糖、核誓酸、核嘗、痛。定_ 與嘌呤驗基。 10·根據申請專利範圍第i或2項之 唄又万法，其特徵在於該至少 -種第二基質中至少兩個有結合能力之不同基團係選自 下列各物組成之群中：胺基酸、糖、料酸、核替、嘴 啶-與嘌呤鹼基。 11. 根據申請專利範圍第1或2頊夕士、+ ^ 矛飞項之方法，其特徵在於步驟（ii) 中該至少兩個不同基團分別與聚合物共價鍵結。 12. 根據申請專利範圍第丨丨項 ^ 万在其特徵在於該聚合物 係利用至少一種單體（該單體 丹有至少兩個具有結合能力 之不同基團）或至兩種單體（該單體分別具有至少-個具 有結合能力之基團）之聚合你田+ & μ λ 作用&聚縮合作直接承載在擔 92216-1000317.doc 體上製成，其中該等基團相異。 13.根據申請專利範圍第…項之方法，其特徵在於步驟⑻ 中該至；兩個可與第二基質結合之不同基團係利用選 自下列各物組成之群中之試劑承載在擔體上：活化試 劑石夕院化試劑與間隔基，或此等試劑中二種或多種之 >昆合物。 14·根據中請專利範圍第13項之方法，其特徵在於步驟⑼中 1至乂兩個不同可與第二基質結合之不同基團係選自下 列各物組成之群中：苯基、經苯基、録、胺基、酿胺 基、羥基、吲哚基、咪唑基與胍基。 以根據申請專利範圍第2項之方法，其特徵在於另包括步驟 (v): (V)單離至少一種第二基質。 16.根據巾請專利範圍第15項之方法，其特徵在於另包括步 驟（Vi): (Vi)判別及鑑定至少一種第二基質。 1 7.根據申清專利範圍第丨或2項之方法，其特徵在於該基質 為選自下列各物組成之群中之一種或多種天然活性成 为.胺基酸、寡肽、核：y：酸、蛋白質、醣蛋白、抗原、 抗體、碳水化合物、酵素、辅酶、激素、植物驗、類固 醇、病毒、微生物、植物性與動物性組織之内含材料、 細胞、細胞片段、細胞器、溶胞物、外源凝集素、黃素 化合物、黃酮與異黃酮，或—種或多種選自下列各物組 成之群中之合成性活性成分：對神經系統具有效力之物 92216-1000317.doc 1353880 質；對激素系統具有效力之物質；對調節劑具有效力之 f;對心血有效力之物質；對呼吸道具有效 力之物質，對胃腸道具有效力之物哲 令及刀之物質；對腎臟與尿道具 有效力之物質；對眼睛且右# Λ 有效力之物質；對皮膚具有效 力之物質；對傳染性疾症且右箱（5女& 疾病具有預防與治療效力之物質； 具有效力之物 、殺有害生物 18. 一種吸附劑/基質-複合物，立自括$ J关巳枯至少—種吸附劑與至少 -種具有至少兩個不同基團之基質，其中該吸附劑具有 至少兩個不同之第一基團，可與具有至少兩個不同第二 基團之至少-種基質進行非共價鍵結，其中所選用之該 至少兩個不同之第一基團中’單一第一基團之吉伯氏能 量對其與至少兩個不同之第二基團之非共價鍵結之整體 景> 響造成吉伯氏能量△ G呈負值，此點可加強結合強度， 在至少一種需要分離之物質中改善其分離選擇性。 19. 對惡性腫瘤具有效力之物質；對免疫系統 質與免疫有效成分，及殺昆蟲劑、除草劑 劑與殺真菌劑。 一種根據申請專利範圍第2至17項中任一項之方法之用 途，其係用於檢測受體/活性成分之交互作用、筛選活性 成分、發展前導物質、分離基質、純化基質、分離異構 化合物、分離有害物質以純化液體、縮減動態組合之集 合庫。 92216-1000317.doc