KR20120060170A - 적어도 2가 결합으로서 기재를 흡착제에 선택적으로 결합시키는 방법 - Google Patents

적어도 2가 결합으로서 기재를 흡착제에 선택적으로 결합시키는 방법 Download PDF

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Abstract

기재를 선택적으로 결합시키기 위한, 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 하나 이상의 흡착제를 제조하는 방법으로서,
(i) 합성 또는 천연의 제 1의 기재로부터 흡착제와 결합가능한 두개 이상의 기를 결정하는 단계,
(ii) 제 2의 합성 또는 천연의 기재와 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 하나의 각각의 담체에 각각 적용하여 하나 이상의 흡착제를 형성함으로써, 상기 기가 단계 (i)과 동일한 기이거나 이와 상보적인 기이고, 단계 (ii)의 제 2의 기재가 단계 (i)에 따른 제 1의 기재와 동일하거나 상이하게 하는 단계를 포함하며,
제 2의 기재와의 비공유 결합에 대한 개개의 기의 깁스 에너지 (Gibbs energy)의 기여가 음수 값의 깁스 에너지, △G를 산출하며, 결합 강화가 발생하여 분리되는 하나 이상의 물질에 대하여 개선된 분리 선택성을 초래하도록, 기를 결정함을 특징으로 하는 방법.

Description

적어도 2가 결합으로서 기재를 흡착제에 선택적으로 결합시키는 방법 {METHOD FOR SELECTIVELY BINDING A SUBSTRATE TO SORBENTS BY WAY OF AT LEAST BIVALENT BONDS}
본 발명은 기재를 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기와 선택적으로 결합시키기 위한 하나 이상의 흡착제를 제조하는 방법, 및 상기 흡착제로서 상기 기재를 선택적으로 결합시키는 방법에 관한 것이다. 상기 흡착제는 각각이, 합성 또는 천연 기재를 상기 기를 함유하는 성분들로 절단시킴으로써 획득되는 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기인 표면 상에서 흡착제의 수집물(collection)로부터 결정된다. 특히, 선택적으로 결합시키는 방법은 합성 제제 또는 천연 제재의 분리 및 상기 제제의 작용 및 성질의 특징화 및 확인에 적합하다. 본 발명의 또 다른 과제는 또한 상기 기재의 선택적인 결합에서 수득되는 흡착제/기재 착물이다. 더욱이, 본 발명은 또한 바람직하게는 각각이 결합가능한 기로서 두개 이상의 서로 다른 아미노산 잔부, 당 잔부, 뉴클레오티드 잔부, 뉴클레오시드 잔부, 피리미딘 잔부 및/또는 퓨린 염기 잔부를 갖는, 흡착제 및 기재를 포함하는 조합 라이브러리(combinatorial library)에 관한 것이다. 선택적 결합 방법 및 조합 라이브러리는 기재/수용체 상호작용의 검출, 제제 스크리닝(screening), 이성질체 화합물의 선택적 분리, 기재의 선택적 분리 및 정제를 위해 사용될 수 있다.
생체친화성 크로마토그래피로부터 특정 생분자에 대해 특히 높은 친화력을 갖는 고분자량의 불용성 담체의 표면 상에서 물질을 화학적으로 고정시키는 것은 이미 공지되었다. 이어서, 이들은 상기 생체분자와 결합가능하게 된다.
대부분, 담체 상에 고정되는 물질은 생체중합체이다. 한편으로는, 또한 저분자량의 물질을, 생체중합체의 결합 또는 보유(retention)가 가능한 표면에 부착시키는 것이 가능하다.
이로 인해, 일반적으로, 흡착제 및 기재가 서로 상보적이고 결합을 형성할 수 있는 기를 갖는 경우, 단지 충분하게 높은 친화력을 갖는다. 예를 들어, 상보적인 기는 수소 결합 또는 쌍극자 또는 다극자(polypole)로서 서로 상호작용할 수 있는 친수성 기이며, 이에 의해 결합이 발생한다.
생물학적 시스템이 수개의 분자 접촉 사이트로서 서로 동시에 상호작용할 수 있다는 것이 이미 공지되었다 [M. Withesides et al., Angew. Chem. 1998, 110, 2908-2953].
더욱이, WO 00/32649호로부터 중합체는 기재를 분리시키기 위한 흡착제로서 공지되었으며, 상기 흡착제로서 기재를 분리시키는 방법이 공지되었다. 여기서, 분리는 두개 이상의 서로 다른 유형의 상호작용에 의하여 이루어질 수 있다. 수용체로서 작용하는 결합가능한 흡착제의 기는 단일 유형의 기일 수 있으며, 또한 두개 이상의 서로 다른 유형의 기일 수 있다.
더욱이, 특허문헌 WO 00/32648호, WO 01/38009호 및 WO 00/78825호에서는 적어도 2가로 결합시키기 위한 양호한 조건을 제공하는 흡착제/기재 상호작용을 기술하고 있다.
이들 방법에서, 흡착제의 일부로서 사용되는 경우, 기재를 의도적으로 결합시키기 위해, 또한 적합한 생중합체는 공지된 것이어야 하고 제조가능해야 한다. 반대로, 생중합체가 낮은 분자 기재로서 흡착제 상에 결합되는 경우, 생중합체는 또한 공지된 것이어야 하고, 결합 성질의 변형없이 담체 상에 고정가능해야 한다.
생물학적 또는 약학적 활성 물질을 결합시키기 위해 합성 기를 중합체 화합물 상에 제공하는 방법이 또한 공지되었다. 이를 위해, 생물학적 또는 약제학적 활성 물질인 주형 분자(template molecule)는 중합체 화합물에 고정된다. 반응성 작용기를 기재의 결합을 위한 중합체 화합물에 부착시킨 후에, 주형 분자는 다시 분리된다 [WO 00/13016호].
더욱이, 선택된 유기 화합물을 선택적으로 분리시키는 방법이 또한 공지되었다. 이를 위하여, 기는 분리되는 화합물의 기에 상보적인 담체의 표면 상에 적용된다. 바람직하게는, 분리되는 화합물은 이온성 기를 갖는 거대 분자이다. 담체 표면 상의 결합기는 반대로 거대분자의 기에 채워진다. 그러나, 흡착제 상에 단지 하나의 유형의 기가 존재하며, 이에 의해 결합이 발생한다 [WO 93/19844호].
더욱이, 또한 US 2002/0155509 A1호에서는 마지막으로 기재 혼합물로부터 기재를 선택적으로 분리시키는데 사용될 수 있는 방법을 기술하고 있다. 이를 위하여, 기재 혼합물은 서로 다른 흡착제 및 용출액과 접촉된다. 탈착 분광기에 의해, 강한 기재가 선택된 흡착제/용출액 조합물과 함께 흡착제에 결합되는지의 여부 및 그 정도를 결정할 수 있다. 흡착제 및 용출액은, 기재를 선택적으로 분리시키는데 적합한 흡착제/용출액 조합물이 밝혀지는 동안은 변경될 될 수 있다 (이로 인해, 용어 "흡착제" 및 "기재"는 본 발명의 특허출원을 기초로 하고, 하기에 기술된 정의에서 US 2002/0155509 A1 호에서 사용된 정의와 다른 방식으로 사용된다).
또한, 극성기를 담체 표면 상에서 장쇄 알킬 라디칼과 함께 고정시켜, 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 지닌 흡착제를 제조하는 것이 이미 공지되었다. 여기에서, 제 1의 반응 단계에서, 바람직하게는 C8 - 또는 C18 - 라디칼과 같은 중쇄 또는 장쇄 알킬 라디칼로 치환된 클로로실란은 담체 표면의 OH 기, 예를 들어 실리카 겔의 실리콜기와 결합되어, 상기 알킬 라디칼을 담체의 표면 상에 고정시킨다. 이후, 제 2 단계에서, 담체의 표면은 트리메톡시실란 또는 트리에톡시실란과 반응된 후 알코올의 분리 및 실리콜기의 형성하에서 가수분해 단계를 수행한다. 더욱이, 또한 실리콘 화합물, 예를 들어 옥타데실트리메톡시실란과 같은 알킬트리알콕시실란을 담체 표면의 OH기와 반응시켜, 먼저 알킬 라디칼을 고정시킬 수 있다. 이후 반응하지 않은 알콕시 잔부는 실리콜기의 형성하에서 가수분해되어, 결합가능한 제 2의 기를 발생시킬 수 있다. 특히, 상기 흡착제가 수용액으로부터 기재를 결합시키는데 사용될 수 있는 것으로 여겨진다 [Column Watch, LC*GC Europe, December 2002, page 780-786].
아직 공지되지 않은 구조 및/또는 결합 성질을 지닌 기재가 흡착제로서 분리되는 경우, 종래 기술에 기술된 방법은 일반적으로 특정 흡착제가 기재와 선택적 결합될 수 있는지 또는 되지 않는지의 여부 및 양호한 정도를 의도적으로 예측할 수 없다. 여기서, 대부분 착물 실험에서, 공지된 흡착제가 상기 기재의 선택적 결합에 적합한지 또는 적합하지 않은지의 여부를 분석해야 한다. 이후, 적절한 기재의 발견은 오히려 우연한 일이다.
따라서, 본 발명의 목적은 기재, 바람직하게는 생리학적 활성을 갖는 기재의 의도화된 분리가 기재 혼합물로부터 가능한, 흡착제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 더욱이, 본 발명의 목적은 상기 흡착제로서 기재 혼합물로부터 상기 기재를 의도적으로 분리시키는 방법을 제공하는 것이다.
이들 목적은 기재에서 두개 이상의 기와 상보적으로 2가로 상호작용할 수 있는 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 함유하는 하나 이상의 흡착제로서 해결될 수 있었다. 이를 통하여, 거의 선택적이지 않거나 비선택적인 1가 상호작용과 비교하여, 강화가 발생한다. 표적 화합물이 단지 일가 결합 경쟁자 보다 흡착제에 의해 배수적으로 강력하게 보유되는 결과로서, 이에 의해 상기 경쟁자와 비교하여, 선택적 결합이 달성된다. 다른 다가 경쟁 기재와 비교하여, 선택적 결합은 최적화된 흡착제에 의해 달성될 수 있으며, 이러한 필수적인 특성을 흡착제의 수집물로서 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 기재를 선택적으로 결합시키기 위해, 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 하나 이상의 흡착제를 제조하는 방법으로서,
(i) 제 1의 합성 또는 천연 기재로부터 흡착제와 결합가능한 두개 이상의 기를 결정하는 단계,
(ii) 제 2의 합성 또는 천연 기재와 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 하나의 담체에 각각 적용하여, 하나 이상의 흡착제를 형성시킴으로써, 상기 기가 단계 (i)과 동일한 기이거나 이와 상보적인 기고, 단계 (ii)의 제 2의 기재가 단계 (i)에 따른 제 1의 기재와 동일하거나 상이한 단계를 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 또한 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 기재를 하나 이상의 흡착제에 선택적으로 결합시키는 방법으로서,
(i) 제 1의 합성 또는 천연 기재로부터 흡착제와 결합가능한 두개 이상의 기를 결정하는 단계,
(ii) 제 2의 합성 또는 천연 기재와 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 하나의 담체에 각각 적용하여, 하나 이상의 흡착제를 형성시킴으로써, 상기 기가 단계 (i)과 동일한 기이거나 이와 상보적인 기이고, 단계 (ii)의 제 2의 기재가 단계 (i)에 따른 제 1의 기재와 동일하거나 상이하게 하는 단계,
(iii) (i)에 따른 제 1의 기재와 동일하거나 상이한 하나 이상의 제 2의 기재를 단계 (ii)의 하나 이상의 흡착제와 접촉시키는 단계,
(iv) 단계 (iii)의 하나 이상의 흡착제에 대한 하나 이상의 제 2의 기재의 결합 강도를 시험하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 흡착제와 기재 사이의 결합을 의도적으로 강화시키거나 또한 의도적으로 약화시킬 수 있으며, 이에 의해 기재 혼합물로부터의 분리되는 기재에 대한 흡착제의 결합 선택도는 또한 의도적으로 개선될 수 있다.
결과적으로, 본 발명은 종래 기술의 방법의 분리 원리와 근본적으로 상이한, 기재 혼합물로부터 기재를 위한 신규한 분리 원리를 기초로 한 것인데, 이는 분리되는 임의의 기재 쌍(pair)에 대해 기대되는 분리 선택도를 고안하고 구현하기 때문이다.
본 발명의 분리 원리는 흡착제 및 기재의 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기 사이에 상호작용으로서 형성되는 비공유 결합의 세기의 예측, 정량화 가능한 추정, 또는 측정을 각각 기초로 한다. 종래 기술의 방법의 분리 원리는, 분리가 극성/비극성, 친수성/친유성 각각의 범주로 대략 분류되는 경험적 방법에 의하여 수행된다는 사실을 기초로 하며, 그러므로 이는 무작위적 방법이다. 이는 또한 지금까지 종종 충분치 않던 것을 분리 성공에 의해 확인하였다.
바람직하게는, 단계 (ii)의 기는 단계 (i)의 기와 동일한 기이거나 상기 기와 상보적인 기이다.
본 발명의 의미에서, 용어 기재( substrate )는 선택적으로 결합될 수 있는 천연 또는 합성 기원의 모든 물질을 포함한다. 바람직하게는, 이들 물질은 살아 있는 식물 또는 동물 유기체에서 생리학적 및/또는 생물학적 활성을 갖는 제제, 또는 화합물이다. 대체로, 이들 물질은 결합가능한 두개 이상의 기를 갖는 모든 천연 및 합성 화학적 화합물 및/또는 생물학적 화합물이다. 바람직하게는, 이들은 아미노산, 올리고펩티드, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 단백질, 당단백질, 항원, 항원 결정인자, 항체, 탄수화물, 효소, 공효소, 발효물, 호르몬, 알칼로이드, 글리코시드, 스테로이드, 비타민, 대사산물, 바이러스, 미생물, 식물성 및 동물성 조직의 내용물의 물질, 세포, 세포 분절, 세포 구획물, 세포 분쇄물, 렉틴(lectins), 플라빌륨(flavylium) 화합물, 플라본, 이소플라본 뿐만 아니라 약제 및 식물 보호제와 같은 합성 제제이다.
결합되는 저분자 제제의 경우에 있어서, 문헌에서, 상기 제제는 종종 리간드(ligand)로서 명시된다. 고분자량을 갖는 단백질성 결합 물질은 종종 수용체( receptor )로서 명시된다.
용어 기재는 또한 경우에 따라 추가 변형 후에 제제로서 적합하도록 사전-단계의 것를 포함한다. 이러한 잠재적 제제는 종종, 이들의 결정을 위해, 이들이 사용된 스크리닝법으로부터 유래하는 경우, 히트(hit) 또는 리드(lead)로서 명시되거나, 이들은, 이들이 구조 특징으로부터 유래하는 경우, 골격, 니들(needles) 또는 약물작용발생단(pharmacophore)으로서 명시된다.
더욱이, 상기 용어 기재는 또한 혼합물로부터의 분리, 제거 또는 획득이 경제적 이익일 수 있는 자원을 포함한다. 상기 자원 중에 또한 예를 들어 공정 흐름 또는 폐기 흐름으로부터의 낮은 농도의 자원 및 부산물이 있다. 자원은 펩티드 또는 체액(body liquid)로부터의 대사산물과 같은 유기성, 또는 방사성 금속이온 또는 귀금속의 금속 이온과 같은 무기성일 수 있다.
용어 담체(carrier)는 담체 또는 골격으로서 결합되는 기를 제공하는 물질을 포함한다. 상기 기를 담체에 적용하여, 흡착제가 형성된다. 크로마토그래피 적용에 대해, 흡착제는 또한 정지상으로서 명시된다.
용어 흡착제( sorbent )는 담체 및 기재와 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기의 임의의 조합을 포함한다.
용어 성분( component )은 각각이 결합가능한 하나 이상의 기를 갖는 기재, 바람직하게는 제제의 부분 또는 분절을 의미한다. 예를 들어, 이러한 성분의 예로는 에피토프( epitope)가 있다. 용어 성분은 또한 용어 결합가능한 기와 동일할 수 있다. 하기에서, 기재 내에서 성분의 공간적 배열은 종종 결합 사이트( bonding site)로서 명명된다. 예를 들어, 히스티딘은 결합가능한 기로서 아미딘 도는 이민기를 차례로 함유하는 이미다졸 잔부와 결합가능한 기로서 수행되는 성분이다.
용어 에피토프(epitope)는 기재의 분자 영역을 명명하는 것이다. 예를 들어, 용어 에피토프는 항체와 결합가능한 항원의 분자 영역을 명명한 것이다. 이러한 항원 상에 항체의 결합 사이트는 또한 항체 결정인자로서 명명된다.
용어 결합가능한 (서로 다른) 기는 공유 또는 비공유 상호작용으로서 흡착제 및/또는 기재와 결합가능한 모든 기를 포함한다. 영문 문헌에서, 상기 용어는 또한 결합 사이트 잔부( binding site residue )로 명시된다. 그런데, 이들 기는 문헌에 기술된 비공유 결합을 형성시킬 수 있는 모든 화합물 또는 화합물의 잔부이다. 용어 비공유 결합은 하기에서 설명한다.
바람직하게는, 결합가능한 기는 히드록실, 카르복실, 아미드, 아미노, i-부틸, 페닐, 니트로페닐, 나프틸, 또한 디올, 히드록시페닐, 카르보닐, 이민, 알킬렌, 알키닐, 인돌릴 및 이미다졸릴 잔부이다. 따라서, 결합가능한 기는 하나 이상의 작용기를 함유할 수 있다. 그러나, 결합가능한 기는 작용기로 한정되는 것은 아니다.
결합가능한 기는 또한 하나 이상의 형태의 강력한 상호작용을 수행할 수 있으며, 즉 하나 이상의 유형의 비공유 결합을 수행할 수 있다. 예를 들어, 염기성의 인돌 잔부는 적절한 물질과 동시에 이온성, 반데르 발스, p-p 및 분산 상호작용으로 결합되도록 수행될 수 있다. 그러나, 인덴 잔부는 이온성 상호작용의 능력이 부족하며, 분산 상호작용이 보다 약하게 발달된다.
이로 인해, 결합에 대한 개개의 기여는 또한 용매에 따른다. 이들은 용매의 조성, pH 및 온도의 선택에 의해 의도적으로 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 반데르 발스 상호작용은 수용액 혼합물에서 보다 유기 용매에서 덜 발달된다. 이와 비교하여, 대체로, 비양성자성 용매 중의 수소 결합 상호작용은 물 함량이 증가함에 따라 보다 강력하게 저하된다.
용어 서로 다른(상이한, different)은 기가 서로 다른 기본 조성을 갖거나 동일한 기본 조성에 대해, 기에서 원소가 서로 다르게 연결되거나 기가 서로 다르게 화학적으로 결합됨을 의미한다. 결합가능한 두개 이상 기에 관한 차이는 또한 결합되는 물질과 비교하여 입체적 배열을 포함한다. 이에 관하여, 예를 들어, 배열은 입체이성질체, 특히 부분입체 이성질체 및 거울상 이성질체의 구별과 관련한다. 예를 들어, 시스 배열의 히드록실기는 트랜스 배열의 히드록실기와 다르며, 또한 R 형태의 히드록실기는 S 형태의 것과 다르다. 이러한 차이는 물리적 방법, 예를 들어 NMR 분광기에 의해 검출될 수 있는데, 이는 이러한 기가 NMR 스펙트럼에서 자기적으로 동등하지 않고 서로 다른 공명 신호를 초래하기 때문이다. 검출은 또한 X-선 구조 분석에 의하여 수행될 수 있다. 또한, 이러한 기는 이들이 반응물을 공격하기 위하여 서로 다른 반응성을 가질 수 있음을 특징으로 한다.
따라서, 특히, 결합가능한 서로 다른 기는 각각이 결합되는 기재 (제 2의 기재)에 대해 상호작용 에너지의 서로 다른 기여로 기여하는 기이다. 상기 상호작용 에너지는 또한 상호작용 깁스 에너지(Gibbs energy), △G로서 명명된다. 반드시, 이러한 기는 이들 구성, 배열 및 형태와 관련하여 동일할 수 있으나, 이들의 상호작용 기여에서 상이할 수 있다. 예를 들어, 글루탐산 유도체에서, 카르복실기는 상이한 상호작용 기여를 가질 수 있다. 또한, 상이하게 결합되는 람노즈(rhamnose) 잔부는 예를 들어 나린진(naringine) 및 루틴(rutine)을 분리시키는데 사용될 수 있는 상이한 상호작용 기여를 가질 수 있다.
차례로, 상호작용 깁스 에너지, △G에 대한 상이한 기여는 각각 상이하게 높은 엔탈피 및 엔트로피 성분을 갖을 수 있다. 그래서, 결합되는 물질에 함유된 카르복실기의 두개의 이온성 상호작용이 실제로 엔탈피 △H 상호작용과 관련하여 거의 동일한 기여로 기여하나, 제 2의 결합 사이트가 비교적 보다 높은 음수의 엔탈피 기여 △S를 갖는 것으로 생각할 수 있다.
반대로, 또한 제 1 및/또는 제 2의 기재에서 결합가능한 두개 이상의 기가 화학적으로 동일하거나 균등하게 인접되게 일어난다. 경우에 따라, 상호작용에 대한 이의 기여는 서로 점진적으로 상이하게 되고, 측정의 정확성 내에서 거의 구별되지 않는다. 이들 중 또는 결합가능한 추가 기와 관련하여 이러한 기의 화학양론 비는 유도체화의 정도에 의하여 흡착제의 제조에서 고려된다. 흡착제의 용액 또는 현탁액에 대해, 상기 유도체화의 정도는 또한 농도 내역에 대한 측정이다.
동일하거나 강력한 근사치의 동등한 결합가능한 기의 축적에 대한 예로는 스테로이드 수용체이다. 에스트라디올 또는 프로게스테론과의 결합 접촉에 대해, 스테로이드 수용체는 7개 이하의 류신 잔부를 함유하고, 이들의 알킬기를 통하여 리간드를 비극성적으로 결합시킨다. 부가적으로, 아르기닌, 글루타민 (글루탐산) 및 히스티딘으로 구성된 세개 이하의 극성 결합 사이트가 존재한다. 본 발명에 따라, 상기 천연 수용체는 메틸발레르산으로부터의 i-펜틸 라디칼, 숙신산 아미드와 같은 극성기, 및 아민 또는 이미다졸과 같은 염기성기를 적절한 농도비로 삽입함으로써 간단히 시뮬레이팅할 수 있다.
이러한 흡착제는 적절한 방법으로 표적 분자 에스트라디올 및 생리학적 시험 및 생체내에서 에스트로겐과 같은 활성을 나타내는 일련의 합성 및 천연 물질과 강하게 결합시킬 수 있다. 이들 물질 중에는, 예를 들어, 디에틸스틸베스트롤 및 게니스테인이 있다.
이로 인해, 바람직하게는, 합성 중합체 수용체로서의 흡착제는 이러한 제제 또는 구조적으로 이와 관련되나, 비활성인 제제, 예를 들어, 타목시펜, 테스토스테론 또는 카테킨으로 보정된다. 실용적인 이익은, 천연 수용체에 잘 결합하는 물질이 또한 흡착제에 강한 결합을 나타내는 경우, 상기 모델에서 이미 약하게 또는 비특이적으로 결합하는 물질과 대조적으로, 실용적인 이익이 제공된다. 구조를 최적화함에 있어서, 결합가능한 기의 비율 이외에, 또한 가교도는 결합 사이트의 범위 및 공간적 조건을 조절하도록 조정된다.
이러한 흡착제는 또한 용해된 물질로부터 생물학적 단백질 모델에서 강하게 결합되는 물질을 지배적으로 또는 심지어 배타적으로 결합시킨다. 따라서, 천연 또는 합성 기원의 물질 혼합물로부터, 잠재적 제제는 빠르고 간단한 방식으로 순수한 형태로 분리될 수 있다.
본 발명의 중요한 양태는 본 발명에 따라 각각 사용되는 방법에서 용매의 대체로 자유로운 선택이다. 강한 결합 물질과 약한 결합 물질 사이의 결합 에너지의 차이의 순위 및 크기는, 수성 용출액에 보다 많은 양의 알코올 및 추가의 산 또는 완충액을 첨가하는 경우, 놀랍게도 대체로 변형되지 않고 유지된다. 바람직하게는, 메탄올의 부가는 분배에 영향을 미치지 않고 강한 결합 물질 및 약한 결합 물질 군으로 보정할 때 사용되는 모든 물질에 대해 결합을 현저하게 약화시킨다. 결과는 크로마토그래피 조건 하에서 상당히 보다 빠른 용출이다. 그래서, 관심을 갖는 물질은 통과가능한 시간에 시험되거나 분리될 수 있는데, 이는 유기 용매의 첨가에 의하여, 결합 상수가 순수한 물 또는 생리학적 완충액과 비교하여 10배 정도 감소되기 때문이다.
용어 비공유 결합( non - covalent bond )은 결합가능한 기가 이온 쌍, 수소 결합, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 전하이동 상호작용, p-p 상호작용, 음이온-p-전자 상호작용, 반데르 발스 상호작용 및 분산 상호작용, 소수성(친유성) 상호작용, 착물 형성, 바람직하게는 전이금속 양이온의 착물 형성을 통하여, 및 상기 상호작용의 조합을 통하여 서로 결합할 수 있음을 의미한다.
용어 상보적( complementary )은 단지 이러한 기가 서로에 적합한 결합을 형성할 수 있음을 의미한다. 이로 인해, 결합을 야기시키는 상호작용은 에너지적으로 선호되어야 한다. 상기 기의 비공유 결합이 서로와 더욱 발달될수록, 기재가 보다 더 강하게 하나 이상의 흡착제에 결합된다. 이로 인해, 또한 다수의 기가 하나의 기에 대해 상보적일 수 있다. 예를 들어, 카르복실기, 아민기 및 아미드기는 히드록실기에 대해 상보적일 수 있다.
용어 상보적인 기( complementary group )는 또한 이러한 기가 구조적으로 상보적인 기와 유사하거나 구조적으로 상기 기와 관련된 기에 의해 대체될 수 있음을 포함한다. 예를 들어, p-p 상호작용을 기초로 한 비공유 결합에서 안트라센 잔부에 의해 나프틸 잔부를 대체시킬 수 있으며, 이로 인해 비공유 결합의 결합 강도에 대한 방향족 탄화수소의 기여가 추가로 각각 변형되고 증가된다. 유사한 물질에서, 아크리딘 잔부에 의해 대체됨으로써 분산 비공유 결합에서 인돌 잔부의 기여를 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 결합상수로서 측정되고 표시될 수 있는, 상보적인 기 간의 상호작용의 강도는 결합가능한 개개의 기의 기여로부터 초래한다. 결합 상수에 대한 이들 개개의 기여는 비공유 상호작용의 유형에 의존하고 서로 상호작용하는 기의 거리 및 배향 (각도) 및 용매의 조성에 의존한다. 상호작용의 개개의 유형은 에너지에서 서로 상당히 상이하며, 이에 의해, 결합 및 이의 깁스 에너지가 상기 기 간의 거리에 따라 상이하게 감소한다.
서로에 대한 상보적인 기는 또한 비공유 결합에 대한 개개의 기의 깁스 에너지의 기여가 음수값을 갖는 (따라서, 높은) 깁스 에너지의 변화, △G를 초래함을 특징으로 한다. 이로 인해, 본 발명에 따르면, 기는 깁스 에너지의 변화, △G가 결합 강화시키는 방식으로 선택되어 개선된 분리 선택성이 분리되는 물질에 대해 초래된다.
일반적으로, 개선된 분리 선택성이, 제조된 흡착제의 선택된 상보적 기와 제 2의 기재 (표적 물질) 간의 결합에 대한 △G 값이 충분한 방식으로 상기 흡착제와 분리되는 물질 간의 △G 보다 더욱 음수인 (또는 보다 음수가 되는) 경우, 발생된다. 크로마토그래피시, 이러한 유형에서, 분리되는 물질이 보다 일찍 용출되면, 상기 물질은 보다 약하게 결합된다. 그러나, 개선된 분리 선택성은, 분리되는 물질이 다른 상보적인 기의 삽입으로서 제 2의 기재 (표적 물질) 보다 더욱 강하게 결합하는 경우, 발생하며, 따라서, 이는 이와 관련된 △G 값의 변화에 기인한다.
본 발명에 따라, 충분한 분리 선택성에 기인한 표적의 분리는 흡착제/기재 착물에서 하나 이상의 상보적인 기가 흡착제와 분리되는 하나 이상의 물질 사이의 착물에서 보다 제 2의 기재와의 결합에 강력하게 참여하는 경우 (예를 들어 입체이성질체에서), 항상 달성된다.
*용매로부터 의존하는 상기 상호작용 깁스 에너지 △G (kJ/mole)의 통상적인 값에 대한 예는 하기와 같다:
- 이온성 상호작용에 대해 -4 내지 -6, 이에 의해 상기 상호작용의 강도 및 범위 각각은 거리에 따라 상호적으로 감소한다. 이러한 상호작용에 대한 예로는 수중에서 카르복실산과 4급 아민 수소 간의 상호작용이다;
- 이온/사극자(quadrupole) 상호작용에 대해 -1, 이에 의해 강도 및 범위 각각은 거리의 3제곱에 따라 감소한다. 예로는 수중에서 암모늄 화합물 중 4급 질소와 아렌기 간의 상호작용이다;
- 분산 상호작용 (유도된 쌍극자)에 대해 -1.75, 이에 의해 범위 및 강도 각각은 6제곱에 따라 감소한다. 예로는 클로로포름 중에서 두개의 아렌기 간의 상호작용이다;
- 수소 결합에 대해 -4 내지 -6, 예로는 클로로포름 중에서 두개의 아미드기 간의 상호작용이다. 카본 테트라클로리드에서, 이러한 기들 간의 상호작용 에너지는 대략 -10이다;
- 수중에서 알칸과 메틸렌 라디칼 간의 상호작용의 결과로서 소수성 효과에 대해 -2.3.
본 발명에 따라, 클로로포름 중에서 히단토인이 암모늄기에 2가로 결합되는 경우, -22 kJ/mole 이하의 △G 값이 측정된다. 그러나, 숙신이미드 유도체의 1가 결합의 경우에, △G 값은 평균적으로 단지 -9 kJ/mole이다. 따라서, 둘 모두의 △G 값의 차이는 대략 13 kJ/mole이며, 분리 선택성에 대한 상응하는 값은 대략 200이다. 상기 데이타는 수소 결합 및, 지배적으로 2가 상호작용의 엔트로피 강화를 제시한다.
제공된 용매 시스템에서, 각각의 유형의 비공유 상호작용에 대해 그리고 제 1 및 제 2의 기재 (수용체/리간드)의 각각의 쌍에 대해, 거리-의존형 깁스 에너지는 엔탈피 및 엔트로피 기여로 상이하게 구성될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 개개의 기여는 결합가능한 1, 2, 3, ..., n개의 기를 함유하는 제 1의 기재와, 예를 들어, 결합가능한 기가 특정 유형의 상호작용과 관련될 수 있는 방식으로 선택되는 제 2의 기재의 세트와의 결합 강도를 분석함으로써 결정된다. 그래서, 사용될 수있는 제 1의 기재는 바람직하게는 아미노, 아세틸, 벤질, 니트로페닐 및 이소펜틸 잔부 및 이의 두개 및 세개 잔부의 조합을 함유한다. 이후, 제 2의 기재는 바람직하게는, 알라닌, 아스파트산 및 글루탐산의 유도체로 구성된다. 바람직하게는, 상기 유도체의 N-말단 보호기는 지방족 또는 방향족이다.
바람직하게는, 결합 에너지는 등용매 HPLC 실험으로부터 k'-값으로서 결정될 수 있다. 제 1의 기재에서, 결합가능한 기의 농도 및 고정 (정지)상과 이동상 간의 상/부피비가 공지된 경우, 결합 상수 KA는 k'-값으로부터 결정될 수 있으며, 차례로, 상기 값으로부터 깁스 에너지의 변화, △G를 결정할 수 있다. 예를 들어, 엔탈피 변화, △H 및 엔트로피 변화, △S는 마이크로칼로리로 결정될 수 있거나 반트 호프 플롯 (van't Hoff plot)으로 명명된 평형 상수의 온도-의존 측정으로서 결정될 수 있다. 그 결과로서, 선택된 수용체 변이체와 리간드 간의 각각의 상호작용 에너지의 비교로서, 상호작용의 기여 범위가 서로 부가되거나, 강화되거나 약화됨을 입증할 수 있다. 결합을 결정하기 위한 방법이 상술된 것으로 제한되지 않는 것은 자명하다. 이외에도, 모든 통상적인 결정 방법, 예를 들어 경쟁적 에세이, 표면 플라즈몬 공명 또는 NMR 적정법이 사용될 수 있다. 상호작용 에너지의 결정은 소형화된 에세이 및 병렬식으로 수행될 수 있다.
입체적으로 선호되는 조건하에서, 결합가능한 기에 대해, 깁스 에너지의 일부는 서로 부가된다. 따라서, 결합 상수에 대한 기여는 서로 곱하여 진다. 더욱이, 협동적인 효과는 추가의 결합 강화에 기여할 수 있다. 또한, 입체적으로 덜 선호되는 조건 하에서, 대부분의 적어도 2가의 결합 강화가 달성될 수 있다. 이는 실용적인 적용에 대해 높은 이익을 갖는데, 이는 결합가능한 잔부의 적합한 선택에 대한 결합 강화가 거의 완전하게 분리되는 물질 (물질/부산물을 동반한)에 대한 개선된 분리 선택성을 초래한다.
용어 비상보적(non-complementary)은, 기가 실제로 서로 상호작용할 수 있으나 상기 기가 상보적인 기 보다 비공유 결합에 보다 약하게 기여함을 의미한다. 따라서, 비상보적인 기들 간의 결합 강도는 상보적인 기들 간의 결합 보다 약하게 발달된다. 본 발명에 따르면, 서로에 대해 상보적이지 않은 기는 상기 기들 간에 형성되는 비공유 결합을 약화시키거나, 각각의 전체 결합 사이트를 약화시키며, 또는 이들이 결합되지 않는다. 이들은 바람직하게는 비공유 결합을 대한 개개의 기의 깁스 에너지의 기여가 제로(0)이거나 양의 값을 갖는 깁스 에너지 변화, △G를 초래한다.
용어 결정( determination )은 의도된 선택, 예를 들어 결합가능한 기의 의도된 선택을 의미한다.
신규한 방법에 따라 제조된 하나 이상의 흡착제는 흡착제/기재 상호작용의 인지(recognition)를 위해 사용될 수 있다. 특히, 인지를 위한 방법으로서, 신규한 방법은 상기 기재를 하나 이상의 상기 흡착제에 선택적으로 결합시키는데 적합하다. 인지를 위한 측정으로서, 결합 강도가 사용될 수 있다. 흡착제와 기재 간의 충분하게 강한 결합의 경우에, 기재의 기 및 흡착제의 기가 서로 결합할 수 있는 정보를 획득한다.
기재의 기가 공지되지 않은 경우, 결합의 경우에서, 결합가능한 기가 기재에서 결합 사이트에 존재할 수 있는 것으로 판단할 수 있다.
그러나, 또한 공지되지 않은 구조의 제 1의 기재의 분자 영역을 적합한 성분, 예를 들어 에피토프로 분리시킬 수 있으며, 흡착제 상에 성분을 적절하게 배열시킴으로써 상기 구조 및 이에 상보적인 구조를 조정할 수 있다.
이로 인해, 분리는 화학적, 물리적, 또는 화학적-물리적 방법 모두에 따라, 예를 들어 화학적 분해 (degradation) 반응에 의해, 또는 초음파에 의해, 또한 가상의 실험에 의해 수행될 수 있다. 상기 가상의 실험에 대해, 또한, 컴퓨터-보조 방법은 기재의 성분들에 존재하는 결합 가능성에 대한 정보를 획득할 수 있음으로써 사용될 수 있다.
분리를 위한 개시점은 상호작용가능한 모든 성분의 세트(set) 및 결합가능한 기의 수가 유한하고 제한적이라는 것이며, 더욱이, 실제적인 문제에 대해, 따라서 제한적일 수 있다. 이러한 기의 각각의 임의의 선택가능한 서브-세트(sub-set)로부터, m 요소 (m=2, 3, 4, ...)와 조합된 임의의 부류 각각을 생성할 수 있다. 예로는 예를 들어, 페닐, 알킬, 아미노, 카르복실 및 아미드기를 지닌 선택 n=5로부터 결합가능한 3개의 기 각각의 모든 가능한 조합을 갖는 부류 3일 수 있다.
이러한 방식으로, 각각의 단백질은 20개의 성분으로 분리될 수 있으며, 따라서 결합가능한 제 1의 대략 n=6 내지 n=9의 기로부터의 아미노산이 제 2의 기재와의 비공유 상호작용에 적절하다. 결합가능한 동일한 기 또는 동등한 기, 예를 들어, 히드록실, 카르복실 및 아미드기 그리고 또한 염기성 기능기가, 라이신, 아르기닌, 트립토판 또는 히스티딘 사이에 점진적인 등급화가 중요하지 않은 경우에, 다수의 아미노산에 함유됨으로써 이러한 감소가 달성된다.
동등한 방식에서, 8개의 이성질체 케토헥소즈 또는 16개의 입체이성질체 알도헥소스 및 이로부터 유도된 피라노시드 및 퓨라노시드는 올리고당을 나타내는 성분으로서 사용될 수 있다.
이는 각각의 임의의 공지되지 않은 기재가 계산될 수 있는 양의 성분으로 구성되고, 차례로, 규정된 양의 결합가능한 기 각각을 함유함을 의미한다. 결합가능한 성분 및 기는 화학적 지식에서 비롯되며, 대체로 유형 및 성질에 따라 공지되었다. 이들이 유기 화학 또는 착물 화학에 부여될 수 있는 경우 이는 주로 적용한다.
이에 상보적이고 동일한 흡착제의 임의의 범위에서 라이브러리와 결합가능한 공지된 성분 및 기의 각각의 조합을 미리 합성할 수 있기 때문에, 공지되지 않은 구조의 제 1의 기재의 분자 영역 또는 결합 사이트로부터의 기본적인 각각의 성분이 이러한 흡착제 라이브러리에 포함되거나 관련될 수 있다. 동일하게 결합가능한 기의 조합에 적용한다.
본 발명에 따른 방법에서, 또한 다수의 흡착제, 따라서 흡착제의 수집물이 수득될 수 있다. 여기에서, 제 1의 기재로부터 상이한 공지되거나 공지되지 않은 제 2의 기재 및 공지된 결합가능한 기를, 상기 흡착제의 수집물과 접촉시킬 수 있으며, 결합 강도를 결정할 수 있다. 이를 통하여, 성분이 제 2의 기재의 결합 사이트에 배열되는 정도 및 결합의 공간적 구조가 배열되는 정도에 대한 정보를 획득한다. 따라서, 신규한 방법은 또한 구조 결정을 위해 사용될 수 있다.
더욱이, 상기 기재를 선택적으로 결합시키기 위한 신규한 방법은 제제의 개발, 바람직하게는 약물의 개발을 위해 특별히 가치가 있다. 약물의 효과가, 생리적 조건하에서 예를 들어, 호르몬 또는 효소일 수 있는 천연 수용체에 결합됨을 기초로 한다는 것은 일반적으로 공지된 것이다. 상술된 방식으로 천연 수용체의 결합 사이트를 분리시키고, 흡착제의 수집물을 발생시킬 수 있다. 이후, 상기 흡착제의 수집물로부터의 각각의 흡착제는 상기 결합 사이트의 규정된 성분 (일부 또는 부분)을 함유한다. 바람직하게는, 이로 인해, 성분의 공간적 배열, 더욱 바람직하게는 전체 결합 사이트 성분의 공간적 배열이 모방된다. 각각이 천연 수용체의 다른 구조적 부분을 나타내는 것으로부터 상기 합성 수용체 부분 각각에 대한 임의의 기재, 예를 들어, 약물의 결합 강도를 결정하는 경우, 상기 기질이 일반적으로 천연 수용체와 잘 상호작용할 수 있는 지의 여부의 정보를 결합 데이타로부터 획득하며, 그러한 경우, 공간적으로 배열된 수용체 기를 갖는다. 이후, 적당한 화학적 개질에 의해, 기질, 즉 개발되는 약물은 수용체에 대한 최대 결합이 제공될 때까지 최적화될 수 있다.
바람직하게는, 방법은 공지되지 않거나 단지 현재까지 특정 작용에 대해 요구되는 생체중합체, 바람직하게는 단백질 또는 당단백질을 분리시키고, 이들 특성에 따라 상기 단백질 또는 당단백질을 확인하는데 적합하다.
동등한 방식으로, 상 디스플레이(display)로부터의 펩티드, 즉 혼합물로부터 직접적으로 제제 분자를 분리시키는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 다른 매트릭스에 대해 상보적인 흡착제 구조물을 합성함을 생각할 수 있다.
반대로, 흡착제 표면 상에 제제에 대해 통상적인 구조 부분의 고안에 의해, 기재 혼합물로부터 각각의 상응하는 기재를 결합시키고 이를 특징화시키는 것을 생각할 수 있다. 예를 들어, 이러한 기재는 수용체이다.
단계 (i)에서, 흡착제에 대해 제 1의 합성 또는 천연 기재를 결합시킬 수 있는 두개 이상의 서로 다른 기의 선택은 제 1의 합성 또는 제 1의 천연 기재로부터 상기 기를 결정함으로써 수행된다. 흡착제에 대해 제 1의 합성 또는 천연 기재를 결합시킬 수 있는 두개 이상의 서로 다른 기의 결정은 임의의 생각해낼 수 있는 방식으로 수행될 수 있으며, 즉 임의의 기가, 이들 기가 결합가능한 한, 임의의 방법에 의해 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 선택은 기재와 예상되는 비공유 상호작용에 상응하여 수행된다.
본 발명의 상기 구체예에서, 바람직하게는 단계 (i)에 따른 결정은 합성 또는 천연의 제 1의 기재를 흡착제와 결합가능한 두개 이상의 기를 갖는 두개 이상의 성분으로 분리시킴을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 제 1의 기재가 적어도 제 2의 기재와 동일한 기재이며, 각각의 제 2의 기재와 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기는 단계 (i)에서 결정되는 기에 대해 상보적인 기 중에서 선택됨을 구상한다.
본 발명의 다른 구체예는 하나 이상의 제 1의 기재가 하나 이상의 제 2의 기재와 상이하며, 제 2의 기재와 결합가능한 두개 이상의 기 각각이 단계 (i)에서 선택된 기에 대해 상보적인 기들 중에서 선택됨을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예는 또한 하나 이상의 제 2의 기재와 결합가능한 두개 이상의 기가 단계 (i)에 따라 결정된 기, 즉, 제 1의 기재의 상응하는 기에 대해 상보적인 결합가능한 제 2의 기재의 기들 중에서 선택된다.
본 발명의 범위 내에서, 한 구체예에서, 단계 (i)에서, 합성 또는 천연 기재를 결합가능한 각각의 기를 갖는 두개의 성분으로 분리시킬 수 있으며, 이에 의해 단계 (ii)에서, 단지 하나의 흡착제가 수득될 수 있다.
그러나, 합성 또는 천연 기재를 세개의 성분으로 분리시켜 짝(pairwise) 조합이 단계 (ii)에서 세개의 흡착제를 초래할 수 있다.
네개의 성분으로의 분리에서, 6개의 흡착제는 단계 (ii)에서 짝 조합에 의해 수득된다.
그러나, 또한 단계 (ii)에서 짝 조합 이외에 세개의 서로 다른 성분의 경우에, 상기 세개의 성분은 흡착제 상에 삼중항(triplet)으로서 함께 적용될 수 있다. 상술된 세개의 흡착제 이외에, 부가적으로 제 4의 흡착제가 수득된다.
유사한 방식으로, 제 6개의 흡착제에서 초래되는 단계 (ii)에서 짝 조합 이외에 네개의 서로 다른 성분의 경우에, 부가적으로 세개의 서로 다른 성분 각각을 함유하는 네개의 흡착제가 수득될 수 있으며, 사중항(quartet)로서 모두 네개의 성분을 함유하는 다른 흡착제가 수득될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 단계 (i)에서 합성 또는 천연의 제 1의 기재로부터 흡착제와 결합가능한 두개 이상의 기의 결정이 흡착제와 결합가능한 하나 이상의 기를 각각 갖는 두개의 성분을 산출하며, 단계 (ii)에서, 하나의 흡착제가 수득되며; 또는 단계 (i)에서 합성 또는 천연의 제 1의 기재로부터 흡착제와 결합가능한 두개 이상의 기의 결정이 흡착제와 결합가능한 하나 이상의 기를 각각 갖는 세개의 성분을 산출하고, 단계 (ii)에서, 세개 이상의 흡착제가 수득되며; 또는 합성 또는 천연의 제 1의 기재로부터 흡착제와 결합가능한 두개 이상의 기의 결정은 흡착제와 결합가능한 하나 이상의 기를 각각 갖는 네개의 성분을 산출하고, 단계 (ii)에서, 6개 이상의 흡착제가 수득된다.
마찬가지로, 또한 보다 큰 수의 i 성분으로부터 n 성분을 선택하고 결합가능한 m 기 각각으로부터 다중항으로 조합시킴을 생각할 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산의 세트로부터, 성분 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 아스파트산, 아스파라긴, 세린, 라이신, 트립토판 및 히스티딘 (n=9)을 선택할 수 있으나, 대부분의 중요한 유형의 비공유 상호작용을 포함할 수 있다. 상기 선택으로부터 결합가능한 m=4의 서로 다른 기 각각의 조합은 또한 결합 목적 및 결합 연구를 위한 조합 방식 또는 검정법에서 사용될 수 있는 126개의 서로 다른 변이체의 흡착제를 산출한다.
각각의 상기 m의 비공유 상호작용의 기여는 개개의 흡착제에 대해 결합되는 기재와의 전체 상호작용에 대한 특정된 값을 제공한다. 각각의 결합가능한 기 (m=1)의 개개의 기여는 적용에 대해 무시될 수 있는 범위내에서 결합되는 임의의 기재에 대해 실험적으로 용매 의존적으로 결정된다. 마찬가지로, m=2를 갖는 이중항 상호작용에 대한, m=3을 갖는 삼중항 상호작용 등에 대한 측정 데이타를 산출할 수 있다.
이로 인해, 에너지 증가의 포괄적인 세트는 비공유 상호작용의 서로 다른 형태 및 조합을 위해 수득되며, 이후 두개의 임의의 기재 또는 성분 간의 결합 강도를 예상한다. 이로 인해, 또한 서로 다른 비공유 상호작용이 용매 및 pH에 의존한다는 사실이 사용된다. 그래서, 수소 결합 상호작용이 비양성자성 비극성 유기 용매에서 강한 영향력을 가지나, 양성자성 극성 용매 및 물에서 거의 영향을 미치지 않는다. 염기성 잔부와 함께, 카르복실기는 유기 용매 중에서 강한 이온 결합을 갖으나, 대체로, 수중에서 단지 비교하여 보다 낮은 엔트로피-유래 상호작용이 검출된다.
전형적으로, 상기 상호관계는 상이한 흡착제로의 아미노산 유도체의 결합 측면에서 기술하였다. 이로 인해, 이미 개략된 바와 같이, 크로마토그래피 측정의 k'-값으로부터, 흡착제 또는 공지된 결합가능한 기에 부착된 성분의 농도를 제공하는 결합 상수 KA에 대해 결론낼 수 있다. 이를 통하여, 빠른 방법은 이들이 착물 혼합물에 존재하는 경우, 결합 사이트와 경쟁하는 기재로부터 결합 상수를 수득하기 위하여 병렬로 사용될 수 있음을 제공한다.
다가 상호작용의 조합을 위해 산출될 수 있는 결합 상수 및 결합 에너지의 값으로부터, 상술된 방식에서 결합되는 구조적으로 공지되지 않은 기재의 결합가능한 기의 유형 및 수를 결정하거나, 다른 기의 부재를 가정할 수 있다. 그래서, 결과는 결합된 아미노산 유도체 또는 펩티드 중에 카르복실기, 염기성기 또는 지방족 또는 방향족 잔부의 수와 관련될 수 있다.
마찬가지로, 결합가능한 이들 기가 공지되자 마자, 추정되는 구조적 의존에 대한 결론 또는 공지되지 않은 구조를 갖는 두개의 기재 간의 가능한 결합 행동에 대한 결론을 얻을 수 있다. 이는 단지 아미노산의 조성이 공지되는 경우, 펩티드 또는 단백질 분절에 적용시킬 수 있다.
마찬가지로, 상기 기재가 선택된 용매 시스템에서 안정한 공간적 구조를 갖는 경우, 공지되지 않은 구조의 두개의 기재 간의 결합 행동을 예상하거나 기술함을 생각할 수 있다. 하나 이상의 결합 사이트에서 서로 상호작용하는 규정된 3차 구조를 갖는 두개의 단백질 또는 당단백질은 서로 상보적인 흡착제의 라이브러리의 각각의 일원과 유사한 강도 또는 순위의 상호작용을 수행할 것이다.
다른 중요한 적용은 단백질 또는 당단백질에서 결합 사이트에 대해 상보적인 결합가능한 기의 모든 조합의 완전한 세트를 나타내는 흡착제의 제조를 기술한다. 이후, 상기 흡착제의 라이브러리는 예를 들어, 단백질 결합 사이트에 정확하게 결하가능한 두개, 세개 및 네개의 기의 모든 조합을 나타내는 리간드의 완전한 세트와 함께 시험된다. 이후, 결합가능한 이들 기들은 각각이 가장 강력한 결합을 갖는, 바람직하게는 개발되는 제제에 함유될 수 있는 흡착제에 정위된다. 또한 단백질이 상보적인 기에 대해 모델로서 제공되는 상기 흡착제에 결합될 수 있는 것은 자명하다.
유사한 방식으로, 파지(phage) 검정에 의해 수득되는 환형 펩티드의 결합 패턴으로부터, 각각의 단백질 표적에서 결합 사이트를 결론지을 수 있다. 더욱이, 상기 펩티드에 상응하는 적합한 배열 및 형태를 갖는 신규한 제제의 발견을 위해 흡착제-지지 매트릭스를 펩티드의 상보적인 맵핑(mapping)에 의해 생성시킬 수 있음을 생각할 수 있다.
이를 위하여, 상기 방법은 비공지된 단백질 표적 및 비상보적이거나 개질되는 활성 제제에 대한 결합 사이트의 결합, 특성화 및 확인에 사용될 수 있다. 더욱이, 강성 구조내에서 펩티드와 같은 가요성 및 불안정한 제제를 만족스런 관리 가능성을 지니도록 구현시킬 수 있다.
모든 언급된 경우에서, 구조 예측은 기재가 적합한 선택의 흡착제와 접촉되고, 결합 데이타가 측정됨으로써 가능하다. 이로 인해, 상보적인 기재 구조의 추론에 대해, 없어지거나 약한 상호작용은 강한 결합 만큼 중요하다. 예를 들어, 기재가 아미노산을 함유한 경우, 카르복실기를 함유하는 흡착제에 대한 결합은 히드록실기 또는 아미노기를 수행하는 흡착제와 동일한 기재의 결합 보다 특정된 양에 대해 보다 높을 것이다.
필수적으로 상기 접근법의 실용적인 값은 대부분 생각할 수 있는 결합의 가능성을 제외함으로써 가능한 결합 조합의 추가 조사가능한 수에 대한 적어도 작업의 한계가 발생한다. 동일한 원리는 스크리닝, 이에 함유된 미리결정된 구조 특징을 갖는 기재에 대한 기재 혼합물의 시험에서 사용된다. 이로 인해, 고도의 실용적인 이익은 추가 작업없이 거의 대부분 사용되지 않는 기재를 제외함으로써 달성된다.
바람직하게는, 성분의 절단은 천연 또는 합성 기재의 결합 사이트에 직접 공간적으로 근접한 성분이 수득되는 방식으로 수행된다. 결합 사이트의 공간적 배열은 상기 성분의 선형 배열에 의해 두개의 성분으로, 삼각형 배열에 의해 세개의 성분으로, (뒤틀린) 사각형에 의해 네개의 성분으로 절단시킴으로써 특징될 수 있다.
상기 결합 사이트가, 상기 결합 사이트에 바람직하게는 세개 또는 네개의 성분이 예를 들어, 라세믹 혼합물로 존재하며, 일반적으로 상이하게 강력하게 결합된 입체이성질체 기재 각각과 결합가능한 하나 이상의 기와 함께 존재하도록 형성된다.
따라서, 또한 입체이성질체 기재는 본 발명에 따른 하나 이상의 흡착제로서 본 발명에 따른 방법에 따라 상이하게 강력하게 결합될 수 있다. 이러한 성질은 제제 개발에 이용될 수 있는데, 이는 입체이성질체 화합물이 상이한 생리학적 활성을 갖을 수 있는 것으로 공지되기 때문이다.
따라서, 신규한 방법은 입체이성질체 화합물의 혼합물로부터 하나 이상의 입체이성질체 화합물의 선택적 분리를 위해 가치있는 방법이다. 예를 들어, 라세믹을 분해하는데 사용될 수 있다.
선택적으로 결합될 수 있는 입체이성질체 화합물로서, 부분입체이성질체, 이형태체, 기하학적 이성질체, 예를 들어 시스(cis) 및 트랜스(trans) 이성질체 화합물, 에피머, 및 아노머, 예를 들어 α- 및 β-글리코시드 당이 언급될 수 있다.
그러나, 입체이성질체 화합물, 및 구조 이성질체, 즉 동일한 원소 조성을 갖으나 원소는 서로에 대해 상이하게 상대적으로 배열되는 화합물은 신규한 방법에 의해 선택적으로 결합될 수 있다.
예를 들어, 동일한 실험식을 갖으나 탄소 고리의 연결 유형이 상이한 융합된 방향족 시스템을 분리시키는 것을 생각할 수 있다.
하기에 기술되는 바와 같은 방법에 따라 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 단계 (ii)의 담체에 각각 적용함에 있어서, 일반적으로, 하나 이상의 형성된 흡착제에서, 요망되는 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기가 통계적 분포에서 공존하는 결합 영역이 발생되며, 필수적으로 동일한 기가 존재하는 영역 또는 상기 기가 많은 영역이 발생되는 것을 막을 수 없다. 그러나, 이러한 영역은 상기 기재의 선택적 분리를 방해하지 않는데, 이는 일반적으로 이러한 영역이 두개 이상의 서로 다른 기를 함유하는 영역 보다 덜 약하게 결합하기 때문이다. 대개, 결합가능한 하나의 유형의 기를 필수적으로 함유하는 이러한 영역은 상기 기재를 밀어낸다. 특히, 이러한 영역은, 비-상보적인 기가 서로 마주보는 관계를 갖는 경우, 반발력이 존재한다.
일반적으로, 전체적으로, 서로 마주보는 관계를 갖는 비-상보적인 기들은 제 1 및 제 2의 기재에서 결합을 약화시킬 것이다. 상기 효과는 이미 2가 결합과 함께 발생한다. 예를 들어, 결합가능한 기로서, 한편으로는 카르복실 잔부, 다른 한편으로는 아민 잔부가, 및 한편으로는 페닐 잔부, 다른 한편으로는 플루오레닐 잔부가 선택되는 경우, 각각의 공간적 배열은 강력하게 비교적 덜 선호될 수 있는데, 여기서 하나 이상의 극성 잔부는 비극성 잔부와 마주하는 관계를 갖는다. 중합체 사슬의 이동가능한 배열로 인해, 흡착제에 결합되는 제 2의 기재는 최대 가능한 깁스 에너지가 획득되는 방식으로 동시에 부착될 것이다.
일반적으로, 흡착제에서, 한 쌍의 상보적인 기가 결합가능한 한 쌍의 기와 마주하는 관계이어야만 한다는 사실을 나타낼 수 있다. 흡착제와 리간드 사이의 결합은, 모든 관련된 기가 서로 쌍으로 또는 다중항으로 각각 상보적으로 배열될 수 있는 경우, 이의 최대 강도에 도달한다.
이미 두개의 기재의 2가의 매칭(matching)에서, 방향 의존은 명백하다. 상기 입체적 유도는 3가 및 4가 상호작용으로의 변경으로 현저하게 강화될 것이다. 고수율의 강력한 최적 결합 사이트에 대해, 특히 높은 형태적 이동능력을 지닌 중합체 유도체가 필요하다. 이로 인해, 공중합체가 생각될 수 있는데, 상호작용가능한 결합된 기들 사이에서, 고도의 형태적 이동능력을 갖는 부-영역은 예를 들어, 알킬 사슬과 통합된다.
하나 이상의 흡착제에 적용되는 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기의 몰비 및 국부적인 농도비 각각은 기재의 선택적 결합에 대해 엄청나게 중요하다. 바람직하게는, 겨합되는 기재에서 각각의 기는 또한 흡착제에서 결합가능한 기를 발견해야만 한다.
따라서, 바람직하게는, 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기는 결합되는 기재의 구조적 요구사항에 최적으로 상응하는 몰비로 적용된다.
바람직하게는, 제 1 또는 제 2의 기재의 기와 동일하거나 이에 상보적인 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기는 흡착제 상에 몰비로 적용되는데, 이는 또한 결합되는 기재에 존재하거나 모사된 제 1의 기재에 존재하기 때문이다. 이로 인해 바람직한 사용된 제조방법은 하기에 서술하였다.
단계 (i)의 합성 또는 천연 기재는 저분자량을 갖을 수 있으며, 바람직하게는 1000 Da 이하의 분자량을 갖을 수 있다. 이로 인해, 상기 기재는 또한 올리고머 또는 중합체, 바람직하게는 생중합체일 수 있다.
바람직하게는, 하나의 기재는 저분자량을 가지며 다른 기재는 생중합체이다.
바람직하게는, 결합가능한 하나 이상의 흡착제, 바람직하게는 생물학적 기재는, 이러한 구조의 중요한 부분의 특성에서 또는 이의 결합을 위해 일어나는 구조의 결합의 원인이 되고, 기재와 상호결합할 수 있는 결합가능한 하나의 기를 갖으며, 바람직하게는 생물학적 기재이다. 하기에서, 기들은 또한 수용체 또는 수용체 기로서 명시된다.
바람직하게는, 결합가능한 두개 이상의 기는 작용기를 갖는 성분의 일부, 또는 이의 기재의 일부 또는 분절이다. 이로 인해, 여기서, 특히 효소 기, 당 산 기 및 올리고당 기, 및 이의 유도체, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드가 언급된다. 다른 적합한 기재는 피리미딘 염기 및 퓨린 염기, 예를 들어, 시토신, 우라실, 티민, 퓨린 아데닌, 구아닌, 우레산, 히포크잔틴, 6-티오퓨린, 6-티오구아닌, 크잔틴이다.
분자의 분절은 예를 들어, 페닐, 페놀 또는 페닐 알라닌으부터의 인돌 잔부, 티로신 또는 트립토판, 및 히드록시, 카르복실, 아미노 및 아미드 기이다. 다만, 언급된 기에 대해, 자연계에서 발견되는 기재와 수용체의 결합 원리가 유지되거나 근접하여, 신규한 방법으로서, 예를 들어 합성 효소, 항체의 결합 도메인 또는 다른 생리학적 에피토프, 즉 분자 영역, 완전한 숙주, 펩티드, 글리코펩티드, 단백질의 에피토프, 당단백질, 및 올리고뉴클레오티드가 필수적으로 적용된다.
바람직하게는, 아미노산으로서 하기 산이 언급된다:
- 지방족 잔부를 갖는 아미노산, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신;
- 하나 이상의 히드록시기를 포함하는 지방족 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어, 세린, 트레오닌;
- 방향족 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판;
- 염기성 측쇄를 포함하는 아미노산, 예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘;
- 산성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어, 아스파트산, 글루탐산;
- 아미드 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민;
- 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어, 시스테인, 메티오닌;
- 개질된 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, ?-카르복실 글루타메이트, O-포스포세린;
- 상기 언급된 아미노산의 유도체, 또는 임의적으로 추가의 아미노산의 유도체, 예를들어, 카르복실기 상에 또는 예를 들어, 임의적으로 적합하게 치환된 알킬 또는 아릴 라디칼을 지닌 카르복실기 상에 에스테르화된 아미노산.
아미노산 대신에, 또한 하나 이상의 디펩티드 또는 올리고펩티드의 사용이 생각될 수 있으며, 여기서, 특히 베타, 감마 또는 다른 구조적으로 이성질체의 아미노산 및 이로부터 유래된 펩티드, 예를 들어 뎁시펩티드(depsipeptide)가 사용될 수 있다.
이로 인해, 또한 하나의 성분을 지닌 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기가 동시에 삽입될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 또한 하나의 성분이 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기에서 수행됨을 특징으로 한다.
4개 이상의 결합가능한 기가 동일한 흡착제에 부착되는 경우, 바람직한 구체예는 규정된 공간적 배열로 이미 완전한 성분으로서 결합가능한 두개 이상의 상기 기를 각각 조합적으로 삽입시키는 것으로 구성된다. 이로 인해, 바람직하게는, 이러한 결합가능한 기는 제 1의 기재에 항상 근접하게 존재하는 성분에 부착된다.
수개의 적어도 2가 성분을 연속적으로 또는 동시에 흡착제에 삽입하며, 더욱이 상기 성분들을 1가 성분과 조합하는 것을 생각하는 것은 자명한 것이다.
2가 성분에 대한 간단한 예로는 Fmoc 글루타민으로서 명시된 플루오레닐 메톡시카르보닐 글루타민이 있다. 여기서, 카르복실기는 흡착제에 결합하기 위해 사용되며, 아미드 라디칼은 리간드의 극성 결합을 가능하게 하며, 플루오레닐 기는 p-p 상호작용의 원인이 된다. 유사한 내용으로, 올리고펩티드가 사용될 수 있으며, 또한 올리고머의 빗살-모양 유도체가 사용될 수 있다.
바람직하게는, 하나 이상의 흡착제에 대한 상기 기재의 결합은 아미노당, 당, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 및 흡착제 상에 존재하는 피리미딘 염기 및 퓨린 염기의 라디칼 또는 기를 통해 발생한다.
결론적으로, 본 발명은 또한 하나 이상의 흡착제의 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기가 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 또는 퓨린 염기의 일부인 기들 중에서 선택됨을 특징으로 한다.
다른 구체예에서, 하나 이상의 제 2의 기재의 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기는 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 또는 퓨린 염기의 일부인 기들 중에서 선택된다.
천연 또는 합성 기원, 특히 합성 기원을 갖는 추가의 기를 삽입함으로써, 흡착제의 비공유 결합 능력은 의도적으로 변경될 수 있으며, 특히 강화될 수 있다.
예를 들어, 합성 보호기와 함께 제공되는 아미노산은 신규한 방법에 적용될 수 있다. 예를 들어, 플루오레닐 잔부로 보호된 아미노산이 적용될 수 있다. 플루오레닐 잔부 이외에, 또한 안트라세닐 또는 나프틸기와 같은 잔부가 적용될 수 있다. 이를 통하여, 보호기의 방향족 고리와 기재의 결합기 사이에 추가의 비공유 결합을 형성시킴으로써, 결합 성질의 강화가 달성될 수 있다. 추가의 예로서, p-p 상호작용을 형성시킬 수 있는, 니트로페닐 잔부 및 올리고-플루오로페닐 잔부 및 다른 전자-부유 및 전자-부족 방향족 시스템이 언급된다.
바람직하게는, 단계 (ii)의 흡착제는 무기 물질, 유기 물질, 또는 무기 및 유기물질로부터 제조될 수 있는 담체를 포함한다. 담체 물질로로서, 적합한 방법에 의해 단계 (i)로부터 두개 이상의 서로 다른 기 상으로 적용될 수 있는 모든 물질이 적합하다.
담체 물질이 고체인 경우에, 이의 표면은 평평한 표면, 예를 들어 유리 또는 금속판일 수 있거나, 또는 굽은 표면 또는 다공성 물질로 삽입된 표면, 예를 들어, 관형 또는 스폰지 표면, 제올라이트, 실리카 겔 또는 셀룰로즈 비드일 수 있다. 더욱이, 담체 물질은 천연 또는 합성 성질을 지닐 수 있다. 특히, 예를 들어, 젤라틴, 콜라겐 또는 아가로즈가 언급된다. 또한 다공성 또는 비-다공성 수지 및 플라스틱 또는 세라믹 표면이 사용될 수 있다.
그러나, 또한 담체로서 하나 이상의 액체, 바람직하게는 높은 점도를 갖는 하나 이상의 액체를 사용될 수 있다. 바람직하게는, 적합한 화합물은 높은 점도를 갖는 실리콘 오일이다.
바람직하게는, 단계 (i)의 두개 이상의 서로 다른 기는 중합체에 공유 결합된 형태로 담체 상에 각각 존재한다.
이로 인해, 용어 "중합체"는 중합체 화학에서 "올리고머"로서 특정되는 보다 높은 분자량을 갖는 화합물을 포함한다. 이로 인해, 또한 중합체 및 중합체의 혼합물이 사용될 수 있다.
특정 중합체로 한정하려 하지 않는 한, 가능한 중합체로서, 특히 하기 중합체가 언급될 수 있다:
- 다당류, 예를 들어 셀룰로즈, 아밀로즈 및 덱스트란;
- 올리고당류, 예를 들어 시클로덱스트린;
- 키토산;
- 폴리비닐 알코올, 폴리트레오닌, 폴리세린;
- 폴리에틸렌 이민, 폴리알릴 아민, 폴리비닐 아민, 폴리비닐 이미다졸, 폴리아닐린, 폴리피롤, 폴리라이신;
- 폴리(메트)아크릴산(에스테르), 폴리이타콘산; 폴리아스파라긴;
- 폴리시스테인.
마찬가지로, 동종중합체 및 공중합체, 특히 블록 공중합체 및 랜덤 공중합체는 대개 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다. 여기서, 코-스티렌 또는 코-에틸렌과 같은 비-작용화된 성분을 지닌 공중합체, 및 코-피롤리돈과 같은 공중합체가 언급될 수 있다.
상기 중합체는 단계 (i)로부터 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기로서 중합체에 공유 결합될 수 있는 동일하거나 상이한 두개 이상의 기를 갖는다.
그러므로, 본 발명의 한 구체예는 단계 (ii)의 두개 이상의 서로 다른 기가 중합체에 각각 공유 결합됨을 특징으로 한다.
언급될 수 있는 두개 이상의 동일하거나 상이한 작용기를 지닌 중합체 중의 바람직한 작용기는 특히, OH기, 임의적으로 치환된 아민기, SH기, OSO3H기,SO3H기, OPO3H2기, OPO3HR기, PO3H2기, PO3HR기, COOH기, 및 이들 두개 이상의 혼합물이며, 여기서, R은 바람직하게는 알킬 라디칼이다. 마찬가지로, 두개 이상의 동일하거나 상이한 작용기를 갖는 중합체는 또한 추가의 극성 기, 예를 들어, -CN를 함유할 수 있다.
이로 인해, 한 구체예에서, 단계 (ii)에서 먼저 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 두개 이상의 동일하거나 상이한 작용기를 통하여 상기 중합체에 삽입함으로써, 상기 기로 유도체화된 중합체를 형성시킬 수 있다. 이후 상기 유도체화된 중합체는 담체 상에 적용될 수 있다.
두개 이상의 기로 작용화된 중합체의 유도체화는 공지된 방법에 따라, 동종상 및 이종상 둘 모두에서 수행될 수 있다.
이종상에서의 유도체화는 고형상 반응에 의해 수행될 수 있다.
두개 이상의 동일하거나 상이한 작용기를 갖는 중합체가 동종의 액체 상에서 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기와 유도체화되는 경우, 바람직하게는 혼합된 작용성 또는 대안적으로, 사전 유도체화된 중합체는 최적의 용해도를 달성하기 위해 적용된다. 이들의 예로는, 예를 들어 하기에 기술된 것이 언급될 수 있다:
- 부분적으로 또는 완전하게 실릴화되거나, 알킬화되거나 아실화된 셀룰로즈;
- 폴리비닐 아세테이트/폴리비닐 알코올;
- 폴리비닐 에테르/폴리비닐 알코올;
- N-부틸폴리비닐 아민/폴리비닐 아민.
마찬가지로, 중합체/공중합체 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 모든 적절한 중합체/공중합체 혼합물은 본원에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기에서 이미 언급된 중합체 및 공중합체의 혼합물이 사용될 수 있으며, 여기서, 특히 하기에 언급된 것이 사용될 수 있다:
- 폴리(아크릴산-코-비닐 아세테이트);
- 폴리(비닐 알코올-코-에틸렌);
- 폴리(옥시메틸렌-코-에틸렌);
- 개질된 폴리스티렌, 예를 들어, 스티렌과 (메트)아크릴산(에스테르)와의 공중합체;
- 폴리비닐 피롤리돈 및 이의 폴리(메트)아크릴레이트와의 이의 공중합체.
바람직하게는, 두개 이상의 동일하거나 상이한 작용기를 갖는 중합체는 두개 이상의 서로 다른 기와 유도체화되기 전에, 활성화제와 반응된다. 이러한 제제 및 이의 적용 방법은 예를 들어, WO 00/32649호에 기술되었다.
예를 들어, 활성화제로서, 숙신이미드의 구조적 원소로부터 유도된 화합물을 사용함으로써, N-결합된 수소원자가 -OCO-Cl 기로 대체된다. 이러한 예로 하기 화합물이 있다:
Figure pat00001
여기서, R3 내지 R10은 바람직하게는 수소, 알킬, 아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클릭 잔부이다. 잔부 R3 내지 R10이 수소인 경우, 하기에서, 화합물은 또한 ONB-Cl로서 명시된다.
두개 이상의 작용기를 갖는 중합체가 동일하거나 상이한 경우, 활성화제와 반응된 후, 상기 반응 산물은 상기 기재와 결합시키기 위해 요망되는 기를 갖는 적합한 화합물과 반응될 수 있다.
또한 동일하거나 상이한 두개의 작용기를 갖는 중합체를 두개 이상의 적절한 활성화제의 혼합물과 반응시킴을 생각할 수 있다. 상기 활성화제는 중합체와 동시에 반응될 수 있다. 마찬가지로, 두개 이상의 활성화제는 연속적으로 중합체와 반응될 수 있다.
여기서, 대체로, 활성화된 중합체와 반응할 수 있으며, 요망되는 중합체를 직접 또는 간접적으로 초래한 후 유도체화될 수 있는, 모든 화합물이 사용될 수 있다. 유도체화를 위해, 특히 하나 이상의 친수성기를 갖는 화합물이 사용될 수 있다.
또 다른 가능성은 활성화된 중합체를 일가 알코올 또는 다가 알코올, 메르캅탄 각각을 함유하는 아미노산기와 반응시키는 것이다. 두개 이상의 작용기를 함유하는 중합체가 예를 들어, ONB-Cl과 함께 활성화되는 경우, 일가 또는 다가 알코올 함유 아미노기 또는 일가 또는 다가 메르캅탄 함유 아미노기는 아미노기와 선택적으로 반응할 것이다. 따라서, 중합체에 삽입되는 OH 또는 SH기는 차례로, 추가 단계에서, 예를 들어 상술된 활성화제 중 하나와 함께 활성화될 수 있으며, 이에 의해 사슬 연장 및 가지화가 기본적으로 사용되는 알코올 또는 메르캅탄의 작용성에 따라 촉진된다.
다른 구체예에서, 또한 각각이 결합가능한 하나 이상의 서로 다른 기를 갖는 화합물을 먼저 활성화제와 반응시킨 후, 상기 반응으로부터 수득된 생성물을 상기 중합체와 반응시킬 수 있다.
바람직하게는, 아미노기, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 및 퓨린 염기의 활성화된 유도체가 동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기를 갖는 중합체와 반응된다. 이로 인해, 바람직한 구체예에서, 차례로, 화합물은 ONB-Cl 또는 상기 구조적 유형의 화합물과 함께 활성화된다.
상기 반응은 중합체 가교, 중합체 안정화 및 중합체 가지화를 위해 사용될 수 있다.
더욱이, 상기 반응은 광범위한 공간적 배열을 갖는 중합체 유도체를 제조할 수 있으며, 따라서 상기 공간적 배열이 결정적인 중요성을 갖는 다수의 적용에 사용될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 모상 봉(hairy rods), 빗모양 중합체, 그물, 바구니, 접시, 튜브, 깔대기 또는 케이지(cage)로서 구성되는 배열을 구현시킬 수 있다.
이로 인해, 반응은 비양성자성 쌍극자 및/또는 극성-양성자성 용매 또는 용매 혼합물, 예를 들어 수성 용매 혼합물에서 수행될 수 있다. 반응되는 중합체 유형 및 사용되는 활성화제 및/또는 결합가능한 두개 이상의 기를 갖는 화합물에 따라, 물 이외에 상이한 추가의 용매가 상기 용매 혼합물에 존재할 수 있다. 여기서, 특히, 비양성자성-쌍극자 용매, 예를 들어, DMSO, DMF, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 테트라히드로푸란 또는 메틸-t-부틸에테르가 사용될 수 있다.
상기 반응을 위해 선택되는 pH는 일반적으로 4 내지 14의 범위이며, 바람직하게는 8 내지 12의 범위이며, 특히 8 내지 10의 범위이다. 특정 pH의 조정을 위하여, 적절한 완충용액이 사용될 수 있다.
용매 및 pH에 의하여, 네트워크의 팽창 및 수축 성질이 의도적으로 조정됨으로써, 네트워크에 의해 흡착제에 대한 기재의 처리가 영향을 받을 수 있다.
중합체의 유도체화 정도, 즉 작용화된 중합체가 결합가능한 두개 이상의 기와 함께 유도체화될 수 있는 정도는 기재와의 최대 가능한 상호작용이 달성되는 방식으로 영향을 받을 수 있다.
1 내지 70%의 유도체화 정도가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 3 내지 60%이며, 특히 바람직하게는 5 내지 50%이다.
이로 인해, 또한 동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기가 유도체화되어 이들이 수용체 기로서 기재와 상호작용할 수 있으며, 기재-특이적이지 않은 하나 이상의 작용기 및/또는 작용기를 갖지 않은 단량체 유닛이 두개의 상기 유도체화된 기들 사이에 적합하고, 이에 의해 작용기가 서로 동일하거나 상이하고 상술된 기로부터 선택될 수 있다.
또한, 중합체에서 비유도체화된 형태로 존재하는 기가 기재와의 상호작용에 기여함을 생각할 수 있다.
또한, 동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기를 갖는 중합체의 유도체를 사용할 수 있는데, 여기서 기재-특이적이지 않은 다른 작용기는 말단-캡핑 기와 함께 유도체화된다.
말단-캡핑 기의 적절한 선택으로서, 또한 말단-캡핑 기 또는 말단-캡핑 기들을 갖는 중합체 유도체의 용해도에 영향을 미치고 상기 유도체를 가능한 이후의 반응의 요구사항으로 조절할 수 있다.
일반적으로, 말단-캡핑기로서, 각각의 기는 작용기를 비활성이 되도록 선택되거나 기재와의 상호작용이 가능한한 비활성이 되도록, 선택될 수 있다. 본 문맥에서, 용어 "비활성"은 기재가 말단-캡핑 기와 유도체화된 하나 이상의 작용기와 수행되는 상호작용과 비교하여, 기재가 유도체화된 중합체의 수용체 기와 수행되는 상호작용이 너무 강하여 기재가 수용체 기를 통하여 필수적으로 결합됨을 의미한다.
예를 들어, 크로마토그래피 방법에서 기재와 수용체 기 사이의 상호작용을 통하여 두개 이상의 서로 다른 기재를 분리시키는 경우, 상술된 바와 같이, 가능한 상호작용에 대한 작용기 비활성을 완전하게 형성시키기 위하여 말단-캡핑 기가 필요치 않다. 이러한 경우에, 예를 들어, 말단-캡핑 기가 분리 방법에 대해 중요하지 않는 분리되는 두개 이상의 기재와 충분히 약하거나 비특이적 상호작용을 수행하는 경우, 충분하다.
말단-캡핑 기로서, 일반적으로 임의의 기는 종래 기술에 따라 사용될 수 있다. 기재에 따라서, 예를 들어 말단-캡핑기로서 기는 H-공여체가 아닌 것으로 선택됨을 생각할 수 있다. 바람직하게는,
Figure pat00002
이 본원에서 사용되며, 특히 바람직하게는
Figure pat00003
이 사용된다.
동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기를 갖는 중합체에서, 수용체로서 상술된 각각의 잔부는 중합체와 각각이 하나 이상의 친핵성기를 포함하는 두개 이상의 활성화된 유도체화 제제의 반응에 의해, 또는 활성화된 중합체와 두개 이상의 이러한 유도체화 제제의 반응에 의해 수득되도록 삽입될 수 있다.
동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기를 갖는 중합체의 유도체가 바람직하며, 상술된 바와 같이, 두개 이상의 수용체는 화합물의 잔부 또는 화합물에서 결합의 원인이 되는 기를 포함하며, 화합물이 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 및 퓨린 염기를 포함하는 기로부터 선택된다.
작용기를 갖는 중합체를 언급된 화합물, 상기 화합물의 유도체 또는 상기 화합물을 함유하는 기 또는 이의 혼합물과 함께 유도체화하기 위하여, 상술된 방법에 따라 처리할 수 있다. 그래서, 먼저 예를 들어 아미노산 화합물과 적합한 활성화제의 반응을 수행한 후 반응 산물과 중합체를 반응시킴을 생각할 수 있다. 마찬가지로, 먼저 중합체와 적합한 활성화제를 반응시킨 후 아미노산과 반응시킴을 생각할 수 있다. 물론, 또한 중합체, 아미노산 및 활성화제를 직접적으로 배합시킴을 생각할 수 있다.
당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 및 퓨린 염기의 잔부, 또는 상기 화합물 또는 이의 혼합물에 함유된 결합기의 삽입은 유사한 방식으로 가능하다.
아미노산, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 및 퓨린 염기, 상기 화합물에 함유된 각각의 잔부 또는 유도체 또는 결합기의 선택에 따라, 보호기로 유도체화 및/또는 활성화되는 동안 본원에서 함유된 작용기를 가능한한 보호시키는 것이 필수적이다. 이를 위하여, 모든 적합한 보호기는 종래 기술로부터 공지된 것이 가능하다. 유도체화 후에 중합체의 추후의 용도에 따라, 상기 보호기는 아미노산 잔부, 당 잔부, 뉴클레오티드 잔부, 뉴클레오시드 잔부, 피리미딘 염기 잔부 또는 퓨린 염기 잔부에 잔류할 수 있거나, 이들이 다시 분리될 수 있다.
아미노산 대신에, 또한 하나 이상의 올리고펩티드의 사용이 생각될 수 있다.
기재와의 상호작용을 최적화하기 위하여, 액체 중합체 유도체 또는 용매 또는 용매 혼합물에 용해된 중합체 유도체는 본원에서 주형으로서 작용하는 기재의 존재하에 변형될 수 있다.
이로 인해, 예를 들어, 변형은 적절한 용매 또는 용매 혼합물에서, 유도체화된 중합체를 상술된 바와 같이 기재와 배합하고, 중합체를 하나 이상의 에너지-선호 형태를 갖는 방식으로 수행된다.
이로 인해, 또한 유도체화된 중합체를 서로 다른 기재와 배합하고 변형시킴을 생각할 수 있다. 더욱이, 요망되는 경우, 서로 다른 유도체화된 중합체를 하나 이상의 서로 다른 기재와 배합시키고 변형시킴을 생각할 수 있다.
또한, 동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기를 갖는 중합체의 유도체가 주형 없이 변형됨을 생각할 수 있다.
변형 이후에, 주형의 존재하에 변형으로서 형성된 중합체 유도체의 형태는 고정될 수 있다.
여기서, 또한 담체 상에 고정시키 전에 변형된 중합체를 적용시킬 수 있다.
일반적으로, 고정에 대해 모든 생각할 수 있는 방법이 사용될 수 있다. 특히, 본원에서, 온도, 용매, 침전 및 가교의 변경이 언급될 수 있다. 바람직하게는, 형태는 가교에 의해 고정된다.
이로 인해, 필수적으로, 담체 물질 및 담체의 형태는 자유롭게 선택될 수 있으나, 이에 의해 담체 물질은, 중합체가 담체 상에 영구히 적용될 수 있는 방식으로 안정화되어야 한다. 바람직하게는, 담체 물질은 유도체화를 적용시킨 후에, 상호작용을 갖지 않거나 분리되는 물질과 하나 이상의 비특이적 상호작용을 갖는다.
이후 적용 분야에 따라, 담체 물질이 압력-안정성인 것이 필수적이다. 본 문맥에서, 용어 "압력-안정성"은 담체 물질이 100 바(bar)의 압력 이하에서 치수적으로 안정한 것을 의미한다.
상술된 물질은 담체 물질로서 사용될 수 있다. 이로 인해, 담체 물질의 모양은 방법의 요구에 따라 조정될 수 있으며, 이는 제한적이지 않다. 예를 들어, 정제-모양, 볼-모양 또는 가닥-모양 담체가 가능하다.
담체 물질 상에 적용은 거의 자유롭게 선택될 수 있다. 예를 들어, 적용은 주입에 의해, 담체를 적절한 중합체 용액에 적심으로써, 중합체를 담체 상에 분무시킴으로써, 또는 중합체를 증발시켜 농축시킴으로써 가능하다.
또한, 유도체화된 중합체를 서로 다른 적합한 담체 상에 적용할 수 있다. 마찬가지로, 서로 상이한 두개 이상의 유도체화된 중합체를 하나 이상의 적합한 담체 상에 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 다른 구체예에서, 유도체화되고, 변형되고 고정된 중합체는 다공성 물질로 처리된다. 이후, 부가 담체 물질이 필요로 하지 않도록 하기 위해 담체를 동시에 형성시킨다. 이로 인해, 예를 들어, 비드, 부정형 입자, 스폰지, 디스크, 가닥 또는 막이 수득될 수 있다.
이로 인해, 유도체화된 중합체의 한 유형으로부터 형성된 하나의 형태가 고정될 수 있다. 그러나, 마찬가지로, 형태가 서로 상이한 유도체화된 중합체의 두개 이상의 유형에 의해 형성됨을 생각할 수 있다. 여기에서, 용어 "상이한 유형의 유도체화된 중합체"는 예를 들어, 중합체가 염기성 중합체, 또는 활성화제의 유형, 또는 유도체화에 의해 삽입되는 수용체 기의 유형, 또는 활성도, 또는 유도체화 정도, 또는 두개 이상의 이들 특징의 조합과 관련하여 서로 상이함을 의미한다.
본원에서, 예를 들어, 가교는 유도체화된 중합체의 두개 이상의 가닥이 서로 직접 반응함으로써 달성될 수 있다.
이는 유도체화에 의해 삽입되는 기가 상기 기들 사이의 공유 및/또는 비공유 결합이 연결될 수 있는 이러한 특성을 갖음으로써 달성될 수 있다. 매우 일반적으로, 상기 공유 및/또는 비공유 결합은 하나의 중합체에 부착된 기들 사이에 형성되고/되거나 두개 이상의 중합체 가닥에 부착된 기들 사이에 형성됨으로써, 가교로서 두개 이상의 중합체 가닥이 하나 또는 수개의 사이트를 통하여 서로 연결될 수 있다.
마찬가지로, 또한 상술된 바와 같이 기가 중합체 가닥 내에 공유 및/또는 비공유 방식으로 가교될 수 있고/있거나 임의적으로 서로 다른 유도체화된 중합체의 수개의 가닥에 부착되는 방식으로 하나 이상의 적합한 가교제를 가교 결합시키기 위해 적용됨을 생각할 수 있다.
일반적으로, 가교제로서, 모든 적합한 화합물은 종래 기술로부터 공지된 것을 사용할 수 있다. 그래서, 예를 들어, 가교는 공유-가역 방식, 공유-비가역 방식 또는 비공유 방식으로 수행되며. 비공유 방식으로 가교되는 경우, 예를 들어 이온성 상호작용을 통한 가교, 또는 전하/이동 상호작용을 통한 가교가 언급된다.
공유-비가역적 가교를 초래할 수 있는 가교제로서, 특히, 두개 또는 여러개의 요소가 있는 작용성 화합물, 예를 들어, 디올, 디아민 또는 디카르복실산이 언급될 수 있다. 이로 인해, 예를 들어, 2가 가교제는 활성화된 중합체 유도체와 반응하거나 적어도 2가의 활성화된 가교제가 비활성화된 중합체 유도체와 반응된다.
공유-가역적 가교는 예를 들어 황-황 결합을 하나 또는 두개의 중합체 가닥에 부착된 두개의 기들 사이에 디술피드 브릿지에 연결함으로써 구현될 수 있다.
이온성 상호결합을 통한 가교는 예를 들어, 하나가 구조적 유닛으로서 4차 암모늄 이온을 갖으며, 다른 하나가 구조적 유닛으로서 예를 들어 하기 화합물을 갖는 두개의 라디칼을 통하여 일어난다:
Figure pat00004
, 또는
Figure pat00005
.
수소 결합을 통한 가교는 예를 들어 두개의 상보적인 염기짝 사이에서, 예를 들어 하기 구조식을 통하여 형성될 수 있다:
Figure pat00006
매우 일반적으로, 비공유적으로 가교되는 중합체는 상보적인 방식으로 가교 사이트와 관련하여 제조될 수 있으며, 이에 의해 다른 하나에 대한 상보적인 구조적 유닛으로는 예를 들어, 산/트리아민 또는 우라실/멜라민이 있다. 마찬가지로, 비공유적 가교에서, 가교제는 중합체 가닥에서 가교 사이트에 대해 상보적일 수 있다. 예로는 중합체 가닥 상의 아민기이며 가교제로서 디카르복실산이다.
중합체의 아미노기에 대한 아미드 결합은 펩티드 화학으로부터 공지된 커플링 반응물에 의해 카르복실레이트로부터 제조될 수 있다. 동일한 방식으로, 중합체에 공유결합되는 카르복실기는 폴리비닐 아민의 아미노기와 가교되며, 반대로, 결합된 아미노기는 예를 들어, 폴리아크릴레이트로부터의 카르복실기와 가교된다.
필수적으로, 가교도는 임의적으로 선택될 수 있으며, 예를 들어 이후에 기술되는 적용 분야에서 조정될 수 있다.
단계 (ii)에서, 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기와 두개 이상의 기를 갖는 중합체와의 반응은 또한 이종상에서, 즉 중합체의 고체 표면에서 수행될 수 있다. 유리하게는, 상기 중합체는 적용된 중합체에 대해 낮은 용액력(solution power)을 갖는 용매 중에 현탁된다.
중합체의 유도체화 및 담체 상에 수득된 중합체의 적용에 대해, 상술된 활성화 및 유도체화 단계 및 가교 방법 및 코팅 방법이 적용될 수 있다.
한편으로는, 또한 바람직하게는 추가 담체 물질 없이 이종상에서 유도체화된 중합체를 담체로서 사용할 수 있다.
다른 구체예에서, 바람직하게는 동종상 또는 이종상에서 합성되는 상술된 유도체화된 중합체는 여러 단계에서 담체 상에 적용될 수 있다. 이를 위하여, 적어도 하나의 단계에서, 하나 이상의 중합체의 하나 이상의 층이 담체 물질에 결합되며, 적어도 하나의 추가 단계에서, 하나 이상의 중합체의 하나 이상의 추가 층은 담체 물질에 결합된 하나 이상의 중합체 층 상에 적용된다. 적합한 방법은 WO 01/38009호에 기술되었다.
여기서, 하나 이상의 중합체의 단계별 적용은 층상 중합체 구조가 담체 물질 상에 적용되도록 단계당 중합체의 하나 이상의 층을 적용하는 모든 적합한 방법에 따라 구현될 수 있다.
상기 방법의 제 1의 구체예에서, 하나 이상의 중합체의 하나 이상의 층이 담체에 결합되는 적어도 하나의 단계에서, 하나 이상의 중합체의 용액은, 하나 이상의 중합체가 담체 물질 상에 결합하지 않는 반응 조건 하에서 담체 물질과 접촉되고, 이후 반응 조건은 하나 이상의 중합체가 담체 물질에 결합되도록 변경되며, 또는 제 2의 구체예에서, 하나 이상의 중합체의 용액이, 하나 이상의 중합체의 용액이 상기 조건하에서 존재하는 반응 조건하에서 담체 물질과 접촉된다.
여기서,제 1의 구체예에 따라 담체 물질과 접촉되는 용액은 하나 이상의 용매를 지닐 수 있으며, 이에 의해 하나 이상의 중합체가 용매 또는 용매 혼합물 중에 용해되거나, 또한 콜로이드로 용해되거나 예를 들어 나노 현탁액의 형태로 현탁될 수 있다.
이후, 반응 조건은 용액을 먼저 담체 물질에 하나 이상의 중합체의 결합이 발생하지 않는 담체와 접촉되도록, 선택된다. 예를 들어, 상기 반응 조건은 하나 이상의 적합한 용매에 의해 조정된다. 이를 위하여, 바람직하게는 용매는 적어도 중합체가 너무 잘 용해될 수 있어 담체 물질에 대한 결합이 정지되는 것으로 적용된다.
본 발명의 의미에서, 용어 "중합체가 담체 물질에 결합되지 않는다"는 분배 상수의 측정에 의해 필수적으로 결합이 검출되지 않음을 의미한다.
마찬가지로, 상기 반응 조건은 온도의 적절한 선택으로서 달성될 수 있으며, 이에 의해 예를 들어, 용액이 너무 높은 온도에서 담체 물질과 접촉되어 담체 물질로의 하나 이상의 중합체의 결합이 정지되도록 한다.
더욱이, 상기 반응 조건은 담체 물질에 하나 이상의 중합체의 결합이 pH-의존형인 경우에 중합체 용액의 pH의 적합한 조정에 의해 달성될 수 있다.
마찬가지로, 또한 두개 이상의 이들 방법의 적합한 조합으로써 먼저 담체 물질에 하나 이상의 중합체의 결합을 방지함을 생각할 수 있다.
반응 지침의 이들 특정 유형에 의하여, 특히 반응 조건은 용액에 함유되는 하나 이상의 중합체 중에 침전이 방지되도록 달성된다.
*하나 이상의 중합체의 용액과 하나 이상의 담체 물질의 접촉과 관련하여, 일반적으로 모든 적합한 공정 조건이 생각될 수 있다.
그래서, 예를 들어, 하나 이상의 중합체를 함유하는 중합체와 담체 물질을 접촉시킬 수 있다. 마찬가지로, 담체 물질을 하나 이상의 용매와 먼저 접촉시킨 후 하나 이상의 용매에 하나 이상의 중합체를 삽입시킴을 생각할 수 있다. 마찬가지로, 먼저 담체 물질을 하나 이상의 용매와 접촉시킨 후 하나 이상의 중합체를 포함하는 용매를 첨가할 수 있다. 두개 이상의 중합체가 적용되는 경우, 하나의 용매 또는 용매 혼합물 중에 각각의 중합체를 또는 이를 하나 이상의 다른 중합체와 함께 개별적으로 용해시키고, 각각이 하나 이상의 중합체를 포함하는 개개의 용액을 하나 이상의 용매에 이미 용해되거나 콜로이드로 용해되거나 현탁된 담체 물질과 조합적으로 또는 개별적으로 접촉시킴을 생각할 수 있다.
일반적으로, 상술된 담체 물질이 적합하며, 여기에 하나 이상의 중합체가 결합에 의해 적용될 수 있다. 두개 이상의 중합체가 서로 상이하게 적용되는 경우, 중합체 중 하나가 담체 물질 상에 적용되기에 충분하다. 또한 두개 이상의 서로 다른 중합체가 결합에 의해 담체 물질 상에 적용될 수 있음을 생각할 수 있다.
서로 상이한 두개 이상의 중합체 및 서로 상이한 두개 이상의 담체 물질이 적용되는 경우, 특히, 모든 중합체는 모든 담체 물질에 적용됨을 생각할 수 있다. 마찬가지로, 하나 이상의 중합체가 하나 이상의 담체 물질 상에 적용될 수 있으며, 이로부터의 서로 다른 하나 이상의 중합체가 이로부터의 서로 다른 하나 이상의 담체 물질 상에 적용될 수 있음을 생각할 수 있다.
더욱이, 추가의 중합체 및 화합물, 예를 들어, 일반적으로 공지된 첨가제가 적용될 수 있으며, 이로 인해, 담체 물질에 중합체의 결합은 또한 다른 상호작용 및/또는 방법으로서 수행될 수 있다. 더욱이, 용액 중에 존재하는 중합체 및/또는 화합물은 담체 상에 적용될 수 없으며, 예를 들어 용액 중에 잔류할 수 있다. 특히, 추가 단계에서, 상기 중합체 중 적어도 하나는 예를 들어 상기 추가 단계 전에 상기 중합체를 포함하는 용액과 접촉되는 담체 물질 상에 적용됨을 생각할 수 있다.
제 1의 구체예에 따라, 접촉 후에, 반응 조건은, 담체에 하나 이상의 중합체의 결합이 발생하도록 변경된다. 상술된 바와 같이, 두개 이상의 서로 다른 중합체 및/또는 두개 이상의 서로 다른 담체 물질이 적용되는 경우, 중합체가 하나의 담체 물질에 결합됨을 생각할 수 있다.
반응 조건의 변화와 관련하여, 모든 변경은 담체 물질에 하나 이상의 중합체를 결합시키기에 적합한 것으로 생각될 수 있다.
결합이 온도-의존형인 경우에, 예를 들어 온도는 증가하거나 감소시킴을 생각할 수 있으며, 이러한 변경이 결합에 유익하다. 마찬가지로, 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 중합체를 함유하는 용액의 조성은 변경되며, 또는 상기 용액이 천천히 농축된다.
하나 이상의 중합체를 함유하는 용액의 조성 변경과 관련하여, 일반적으로, 모든 방법은 상기 변경으로서 결합하기 적합한 것으로 생각할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 다른 용매는, 하나 이상의 중합체와 관련하여 불량한 용해 성질을 갖는 하나 이상의 중합체가 함유된 용액에 첨가된다.
다른 구체예에서, 용액의 조성은 변경되어 하나 이상의 산성 또는 하나 이상의 염기성 화합물 또는 두개 이상의 이의 혼합물이, 하나 이상의 중합체의 결합이 가능하게 용액의 pH를 변경하도록 첨가된다. 용액의 pH가 하나 이상의 중합체의 결합이 가능한 방법으로 변경하기 위해 하나 이상의 완충 용액을 첨가함은 자명한 것이다.
추가로, 적절한 화합물, 예를 들어, 금속 양이온, 또는 적합한 유기 화합물을 포함하는 염은 중합체 중 하나의 결합을 발생시킴으로서 첨가될 수 있다.
하나 이상의 중합체를 함유하는 용액은 또한 농축되어 담체 물질에 결합되는 하나 이상의 중합체의 농도가 용액 중에 거의 일정하게 유지되도록 한다. 상기 용액의 농도는 중합체 농도가 거의 일정하게 유지됨으로써 적절하게 느린 공정 지침에 의해 발생된다.
추가로, 두개 이상의 상술된 방법은 온도 변경의 포함하에서 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 그래서, 예를 들어, 상술된 바와 같이 용액의 조성을 변경시키고 용액을 충분하게 느리게 농축시키거나/시키고 온도를 적합하게 변경시킴을 생각할 수 있다.
선택된 반응 조건에 따라, 하나의 중합체 또는 서로 상이한 그 이상의 중합체가 담체 물질에 적용됨을 생각할 수 있다. 특히, 서로 상이한 두개 이상의 중합체가 동시에 담체 물질에 적용되도록 반응 조건을 선택함을 생각할 수 있으며, 이에 의해 하나의 층이 서로 상이한 두개 이상의 중합체를 포함하는 담체 물질상에서 발생된다. 서로 상이한 두개 이상의 담체 물질이 사용되는 경우, 각각의 담체 물질 상에 하나의 중합체 또는 서로 상이한 두개 이상의 중합체를 포함할 수 있는 중합체의 하나의 층을 적용함을 생각할 수 있다.
더욱이, 또한 한 단계에서 하나 이상의 중합체의 두개 이상의 층은 담체 물질 상에 적용되며, 이에 의해, 중합체의 제 1 층이 담체 물질에 결합되고, 중합체의 제 2 층이 제 1 층에 결합되고, 임의적으로 중합체의 각각의 추가 층이 각각의 처리층에 결합될 수 있다. 이로 인해, 일반적으로 각각의 층은 하나의 중합체 유형 또는 서로 상이한 두개 이상의 중합체를 포함할 수 있다.
더욱이, 제 2의 구체예에 따라, 하나 이상의 중합체의 용액은 반응 조건하에서 담체 물질과 접촉될 수 있으며, 하나 이상의 중합체의 용액이 상기 조건하에서 존재한다. 상기 구체예와 관련하여, 특히 담체 물질에 하나 이상의 중합체의 적용은 담체 물질과 용액의 접촉 동안 발생한다.
상술된 방법에 따라, 바람직하게는 제 1의 단계에서, 하나 이상의 중합체의 층은 담체 물질에 적용되며, 제 2의 단계에서, 상기 제 1 층 상에 제 2 층을 적용하고, 제 3 단계에서, 제 2 층 상에 임의적으로 제 3 층을 적용한다. 적합한 적용 방법과 관련하여, 참고문헌은 상기에 논의되었다.
용어 "담체에 중합체의 결합"은 하나 이상의 중합체가 담체 물질 또는/및 담체 물질 상에 임의적으로 이미 적용된 중합체 층 또는 중합체 층상에 임의적으로 이미 적용된 중합체층과 상호작용할 수 있는 모든 공유-가역적 , 공유-비가역적 및 비공유 상호작용을 포함한다.
*따라서, 필수적으로 예를 들어, 이러한 비공유 상호작용을 형성시킬 수 있는 모든 중합체가 적용될 수 있다. 여기서, 특히 중합체가 하나 이상의 상기 상호작용을 형성시킴으로서 하나 이상의 작용기가 중합체 가닥 자체 및/또는 중합체 가닥의 적어도 한쪽 사슬에 존재함을 생각할 수 있다.
그러나, 예를 들어, 상호작용은 반데르 발스 상호작용이 이루어짐을 통해 탄화수소 사슬 및 추가의 구조 유닛에 의해 발생할 수 있다.
공유-가역적 상호작용과 관련하여, 특히, 대표적으로 디설피드 브릿징 또는 불안정한 에스테르 또는 이민, 예를 들어 쉬프스 (Schiff's) 염기 또는 엔아민을 통한 결합이 언급된다.
다른 구체예에서, 상술된 모든 중합체 및/또는 공중합체 또는 이의 혼합물은 또한 이들이 상술된 바와 같이, 하나 이상의 담체 물질에 대한 공유 또는/및 비공유 상호작용을 형성시킬 수 있는 한, 비-유도체화된 형태로 담체 상에 적용될 수 있다.
담체 상에 적용되는 중합체의 유도체화를 위해, 앞에서 기술된 활성화 및 유도체화 단계가 사용될 수 있으며, 이후 WO 00/32649호 및 WO 00/78825호에 기술된 바와 같이 가교 단계를 수행한다.
상기 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기를 갖는 중합체에 대한 두개 이상의 서로 다른 기의 공유 결합 전에, 상기 중합체가 담체 상에 적용됨을 특징으로 한다.
방법의 다른 특정 구체예에서, 동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기를 갖는 중합체는 또한 두개 이상의 동일하거나 상이한 작용화된 단량체의 중합화 또는 축중합화에 의해 직접적으로 제조될 수 있다.
이로 인해, 바람직하게는, OH기를 함유하는 올레핀성 비치환된 단량체, 임의적으로 치환된 아민기, SH기, OSO3H기, SO3H기, OPO3H2기, PO3H2기, PO3HR기, COOH기, 및 이들 두개 이상의 혼합물 (여기서, R은 바람직하게는 알킬 라디칼임)은 공지된 방법에 따라 담체 물질의 존재하에 다른 하나와 중합될 수 있다. 또한, 단량체는 추가 극성기, 예를 들어, -CN을 함유할 수 있다. 추가의 적합한 단량체는 예를 들어, 에틸렌 이민, 알릴 아민 또는 비닐 피롤리돈이다.
바람직하게는, 중합 기술로서, 유화중합, 현탁중합, 분산중합 및 침전중합이 언급되며, 이에 의해 중합은 담체 또는 담체 물질의 존재하에 수행된다. 중합은 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 아조 화합물 또는 과산화물과 같은 라디칼 개시제에 의해, 양이온성 또는 음이온성 개시제에 의해, 또는 에너지가 풍부한 방사선에 의해 개시될 수 있다.
한 구체예에서, 생성된 중합체 사슬과 담체의 표면 사이에 반응이 일어나지 않도록 중합을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 두개의 단량체 중 적어도 하나로서, 친수성 단량체, 예를 들어, 에틸렌 이민, 알릴 아민 또는 비닐 피롤리돈이 적용되는 경우 상기 구체예가 사용된다. 친수성 담체, 예를 들어 실리카 겔의 존재하에, 일반적으로 제조된 중합체는 담체 표면 상에 강하게 흡착된다.
코팅된 담체의 안정성을 증가시키기 위해, 중합체는 또한 담체와 가교될 수 있다. 바람직하게는, 이는 가열에 의해 달성될 수 있으며, 이로 인해, 먼저 흡착된 중합체의 작용기는 담체와 반응하며, 담체의 작용기는 중합체와 반응하며, 이에 의해, 결합이 발생한다.
그러나, 또한 중합체가 담체의 표면 상에 직접적으로 화학 결합되도록 (공)중합을 수행할 수 있다. 상기 구체예는 특히 안정한 코팅된 담체가 제조되는 경우, 바람직하다. 이를 위하여, 담체는 중합 조건하에서 담체의 표면 상에 형성되는 중합체 사슬과 반응하는 기와 함께 제공될 수 있다. 그러나, 또한 중합체의 작용기는 담체의 표면과 반응할 수 있다. 실리카 겔이 담체 물질로서 사용되는 경우, 예를 들어, 실리카 겔의 표면 상에 존재하는 실리콜기는 두개 이상의 작용화된 단량체의 중합에 참여할 수 있으며, 이에 의해 담체 및 중합체는 서로 커플링된다. 또한 예를 들어 비닐 실란을 담체의 표면에 부착시킬 수 있으며, 이의 비닐기는 두개의 동일하거나 상이한 작용화된 단량체의 공중합에 참여한다.
형성된 정지상의 안정성을 추가로 증가시키기 위해, 두개의 동일하거나 상이한 작용화된 단량체의 중합은 또한 하나 이상의 가교제의 존재하에 수행될 수 있다. 가교제는 예를 들어 디비닐 벤젠 또는 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트와 같은 이작용성 화합물이다.
또한, 바람직하게는 상술된 기를 갖는 두개 이상의 동일하거나 상이한 작용화된 단량체 성분은 공지된 방법에 따라 담체 물질의 존재하에 다른 하나와 축중합될 수 있다.
이로 인해, 또한 ONB-Cl을 기초로 한 방법 및 제제는 WO 00/32649호 및 WO 00/78825호에 기술된 바와 같이 적용될 수 있다.
바람직하게는, 수득된 작용화된 축중합체는 폴리페닐렌, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리에테르 케톤, 폴리에테르 술폰, 폴리우레탄, 또는 폴리실록실 실란 유형일 수 있다. 이러한 반응 유형에서, 또한 혼합된 축중합체는 제조될 수 있다. 이로 인해, 축중합은 용액 및 용융물 중에서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 폴리에스테르 유형의 축중합체가 사용된다. 안정성을 증가시키기 위하여, 이들은 추가의 다작용성 화합물, 예를 들어 트리메틸올프로판, 펜타에리트롤, 또는 당과 같은 다가 알코올의 첨가에 의해 추가로 가교될 수 있다. 또한, 다작용성 이소시아네이트를 통한 가교는 상기 폴리에스테르가 이소시아네이트기와 반응하는 기를 갖는 경우, 가능하다. 예를 들어, 히드록실기 함유 폴리에스테르는 폴리이소시아네이트와 반응될 수 있으며, 이에 의해 폴리에스테르/우레탄 유닛이 도입된다.
예를 들어, 수득된 코팅된 담체 물질은 중합 또는 축중합으로 제조되는 반응 혼합물을 여과시킴으로써 분리될 수 있으며, 담체 물질의 표면 상에 결합하지 않는 중합체 입자 또는 축중합체 입자로부터의 적합한 용매로 린싱(rinsing)시킴으로써 정제될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 동일하거나 상이한 두개 이상의 작용기를 갖는 중합체가 두개 이상의 동일하거나 상이한 작용화된 단량체의 중합 또는 축중합에 의해 담체 상에 직접적으로 제조됨을 특징으로 한다.
또한, 후에 인지되는 기재의 존재하에 공지된 "각인 기술"과 유사하게 담체의 코팅을 초래하는 상술된 중합을 수행할 수 있다. 상기 기술의 언어 사용에서, 용어 기재에 대해 또한 종종 용어 주형으로 사용된다.
상기 중합의 요구사항은 두개 이상의 동일하거나 상이한 작용화된 단량체를 갖는 단량체가 항상 결합가능한 기를 갖는 것이다. 이로 인해, 바람직하게는 각각의 상기 단량체는 상기 기 중 하나를 갖으며, 이에 의해, 기들은 상이하다.
그러나, 또한 항상 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 단량체를 적용할 수 있다.
바람직하게는, 중합은 공극을 형성하는 기재의 존재하에 수행된다.
중합을 수행하기 위하여, 상술된 중합 기술이 사용될 수 있다.
적합한 용매로 기재를 분리시키거나 린싱한 후에, 단계 (ii)에서 하나 이상의 흡착제는 기재에 대해 사전 형성된 상호작용 공간과 함께 수득된다.
바람직하게는, 상기 구체예에 대해, 중합에 사용되는 단량체는, 담체 상에 형성되는 중합체가 강성 또는 가능한한 고도로 가교된 골격을 갖도록 선택됨으로써, 상호작용 공간이 가능한한 안정하다. 그래서, 바람직하게는, 하나 이상의 작용화된 단량체로서, 아크릴산 또는 메타크릴산 또는 이의 유도체 또는 혼합물이 사용되어, 일반적으로 공지된 바와 같이, 유리전이온도에서 중합체 또는 공중체를 형성시킨다. 특히 적합한 단량체는, 예를 들어, 메타크릴산 및 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트이다.
다른 예로는 메타크릴산과 히드록시에틸아크릴레이트의 중합이며, 이에 의해 결합가능한 카르복실 및 히드록실기를 갖는 중합체가 수득된다.
그러나, 또한 이후에 인식되는 기재의 존재하에 담체의 코팅을 초래하는 상술된 축중합을 수행할 수 있으며, 이에 의해 단량체로서 결합가능한 서로 다른 기를 항상 갖는 이러한 화합물이 사용된다. 바람직하게는, 각각의 단량체가 상기 기들 중 하나를 갖으며, 이에 의해 기들은 상이하다.
그러나, 또한 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 항상 갖는 단량체를 사용할 수 있다.
기재를 분리하거나 이를 적합한 용매로 린싱한 후, 단계 (ii)에서 기재에 대해 사전 형성된 상호작용 공간을 갖는 하나 이상의 흡착제가 수득된다.
따라서, 상기 구체예는 또한 중합체가 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 하나 이상의 단량체 또는 각각이 결합가능한 하나 이상의 기를 갖는 두개 이상의 단량체의 중합 또는 축중합에 의해 담체 상에 직접적으로 제조됨을 특징으로 하며, 이에 의해, 상기 기들이 상이하며, 중합 또는 축중합이 이후에 결합되는 기재의 존재하에 발생한다.
바람직하게는, 상기 단량체가 담체의 존재하에 직접적으로 수행되는 구체예에서, 축중합 또는 중합은 결합가능한 기를 갖지 않는 적어도 제 2 또는 제 3의 단량체의 존재하에 수행된다. 이로 인해, 하나 이상의 제 2 또는 제 3의 단량체는 스페이서(spacer)의 기능을 갖는다.
하나 이상의 흡착제에 적어도 2가의 기재의 결합에 대해 필요로하는 두개 이상의 서로 다른 기가 중합체에 결합되는 것은 필수적으로 요구되지 않는다. 또한 단계 (ii)에서 중합체의 사용 없이 담체 표면 상에 기를 직접적으로 고정시킬 수 있다.
*바람직하게는, 고정화는 상기 담체가 무기 물질로부터 이루어지는 경우, 담체 상에 직접적으로 수행된다. 바람직하게는, 무기 물질은 실리카 겔 또는 알루미나이다.
바람직하게는, 고정화는 활성화제 및/또는 실란화제에 의해 수행된다. 담체의 표면에 대한 연결은 또한 스페이서를 사용함으로써 수행될 수 있다.
바람직하게는, 활성화제로서, WO 00/32648호에 기술된 제제가 적용될 수 있다.
바람직하게는, 실란화제는 또한 히드로실릴화 반응을 수행할 수 있는 이러한 규소 화합물을 포함한다.
바람직하게는, 실란화제로서 할로실란, 바람직하게는 클로로실란, 알콕시실란 및 실라잔이 적용된다.
여기서, 한 구체에에서, 기재의 결합을 위해 필요로 하는 기를 갖는 화합물은 먼저, 적합한 실리콘 화합물과 반응될 수 있다. 이후, 생성물은 산소/실리콘의 공유결합의 형성하에서 표면 상에 존재하는 히드록실기로서 담체 상에 고정될 수 있다. 예를 들어, 임의적으로, 예를 들어 아미노, 우레아, 에테르, 아미드 및 카르바메이트기와 치환될 수 있는 알킬 라디칼은 알킬화된 실란을 사용함으로써 표면상에 고정될 수 있다.
예를 들어, 이러한 방식으로 실리콘 원자를 통해 3-아미노프로필 라디칼을 담체 표면 상에 고정시킬 수 있다. 이후, 아미노기는 추가로 예를 들어 산 염화물과 함께 아미드로 반응될 수 있다. 지방족, 그러나 바람직하게는 방향족 산 염화물, 및 활성화된 성분, 특히 WO 00/32649호 및 WO 00/78825호에 기술된 바와 같은 ONB-활성화된 성분이 사용될 수 있다.
알킬 라디칼을 담체 상에 적용시킬 수 있는 실리콘 화합물의 예들로는 메틸트리클로로실란 및 옥틸트리클로로실란이며, 비교적 짧은 사슬, 중간-사슬 알킬 라디칼 각각을 삽입할 수 있는 경우, 및 비교적 긴 사슬을 삽입할 수 있는 경우, 옥타데실트리클로로실란, 도코실트리클로로실란 및 트리콘틸트리클로로실란이다. 예를 들어, 알킬 라디칼 함유 아미노기의 삽입은 3-아미노프로필트리에톡시실란과 함께 가능하다.
추가로, 실릴 글리시딜 에테르의 사용은 가수분해 후에 또한 디올 상으로서 명시되는 디올을 형성시킬 수 있다.
다른 한편으로는, 또한 먼저 담체의 표면을 다른 작용기 또는 하나 이상의 작용기를 갖는 실리콘 화합물과 반응시킬 수 있다. 이후, 담체 상에 고정되는 결합을 위해 선택되거나 결정된 기는 하나 이상의 작용기를 통해 적합한 화합물에 의해 삽입될 수 있다.
예를 들어, 담체 표면 상에 적용하기 위해, 이중 결합을 갖는 실리콘 화합물이 사용될 수 있다. 결합을 위해 의도된 기는 상기 이중 결합을 통해 삽입될 수 있다. 적합한 규소 화합물에 대한 예로는 비닐실란 또는 (메트)아크릴옥시프로필트리메톡시실란이다.
상술된 방법은 또한 조합으로 사용될 수 있다.
임의적으로, 결합을 위해 의도된 기의 커플링은 또한 스페이서를 통해 발생할 수 있으며, 이에 의해, 바람직하게는 짧은-사슬 탄소 사슬이 고정되는 기와 담체 사이에 도입된다. 바람직하게는 담체와 고정되는 기의 연결은 적합한 카르보디이미드, 예를 들어, 디시클로카르보디이미드, 디이소프로필 카르보디이미드, N-시클로헥실-N'-2-(N-메틸모르폴리노)-에틸 카르보디이미드-p-톨루엔 술포네이트, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드-히드로클로리드, 클로로포르미에이트, 카르보닐 디이미다졸, 또는 디이소시아네이트, 예를 들어 헥사메틸렌 디이소시아네이트에 의해 발생할 수 있다. 또한, 동종텔로머(homotelomer) 또는 이종텔로머 폴리에틸렌 글리콜이 사용될 수 있다.
스페이서를 사용함에 있어서, 바람직하게는 솔-형태(brush-formed)의 상은 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기가 바람직하게는 스페이서의 말단에 결합되고/되거나 스페이서의 스페이서에 측면으로 결합된다.
따라서, 상기 구체예는 또한 단계 (ii)에서 제 2의 기재와 결합가능한 두개 이상의 기가 활성화제, 실란화제 및 스페이서에 의해, 또는 두개 이상의 상기 제제의 혼합물을 포함하는 기로부터 선택되는 제제에 의해 담체 상에 적용됨을 특징으로 한다.
결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기로서 종래 기술에서 기재된 기, 즉 실리카 겔 골격으로부터의 히드록실기, 실란화제를 통해 도입되는 실리콜 기 및 알킬기를 갖는 흡착제를 적용하기 위해 기재-특이적 결합에 대해 유익하지 않다는 것이 증명되었다. 따라서, 기 히드록실, 실리콜 및 알킬, 또는 히드록실 및 알킬, 또는 실리콜 및 알킬의 조합은 본 발명으로부터 제외되며, 이에 의해 기는 각각 실리카 겔에 고정된다.
특히, 본 발명의 의미에서 적합한 기는 다른 한편으로, 페닐, 히드록시페닐, 카르복실, 아민, 및 아미드 잔부, 및 히드록실, 인돌, 이미다졸, 및 구아니딘 잔부이다. 바람직하게는, 상기 잔부는 솔-모양 상의 형성하에서 스페이서를 통해 담체의 표면에 결합된다.
따라서, 특히 바람직한 구체예는 단계 (ii)에서 제 2의 기재와 결합가능한 두개의 서로 다른 기가 페닐, 히드록시페닐, 카르복실, 아민, 아미드, 히드록실, 인돌, 이미다졸 및 구아니딘 잔부로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 전술된 방법에 따라 제조된 하나 이상의 흡착제는 통상적인 방법에 따라 호일, 필름, 마이크로 여과판, 또는 나노 비드로 처리될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (ii)의 하나 이상의 흡착제는 나노 형태로 제조되고 사용된다.
결합되는 기재, 기재 혼합물로부터 선택적으로 결합되는 기재는 단계 (iii)에서 하나 이상의 흡착제와 접촉된다. 이로 인해, 기재 또는 기재 혼합물은 고체상, 액체상 또는 기체상 또는 두개 이상의 상기 상의 혼합물에 존재할 수 있다.
바람직하게는, 기재 또는 기재 혼합물 각각은 액체상에 존재한다. 이로 인해, 기재 또는 기재 혼합물 각각의 용액 및 현탁액 또는 분산액이 사용될 수 있다. 액체로서, 물 및 유기 용매 둘모두, 유기 용매의 혼합물 및 물 및 유기 용매를 포함하는 혼합물이 사용될 수 있다. 모든 경우에서, 완충액, 염, 산, 염기 또는 개질제, 예를 들어, 이온-쌍 제제가 액체에 임의의 농도로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 농도가 액체 1 리터에 대해 10 mmole 내지 2 molar이다. 바람직하게는, 결합되는 기재는 수성 형태로, 예를 들어 액체로서 존재한다.
흡착제에 기재의 결합 행동의 결합 시험을 위해, 공지된 방법 및 방법들이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 흡착제와 기재 사이의 결합은 비공유 결합이다.
바람직하게는, 상술된 상호작용은 비공유 결합이다.
그러나, 또한 하나 이상의 기재가 하나 이상의 흡착에 공유-가역적이거나 공유-비가역적으로 결합될 수 있다.
바람직하게는, 단계 (iv)에서, 단계 (iii)의 하나 이상의 흡착제에 하나 이상의 제 2의 기재의 결합 강도를 시험하기 위해, 크로마토그래피법 및 해석법이 적합하다. 특히, 상기 방법은 컬럼 크로마토그래피법, 예를 들어, 공지된 HPLC 방법이다. 이를 위하여, 하나 이상의 흡착제가 컬럼의 정지상으로서 사용된다. 용출되는 기재의 순서로부터, 사용된 흡착제 각각에 대해 이의 결합 강도는 직접적으로 결정될 수 있다. 가장 강하게 결합된 기재는 마지막 기재로서 용출된다.
분리되는 기재 혼합물의 희석된 용액이 연속적으로 정지상으로 적용되는 전단 분석을 수행할 수 있다. 가장 강하게 결합된 기재는 이러한 방법에서 보다 덜 강하게 결합된 기재로부터 구별될 수 있는데, 이는 후자가 먼저 용출액으로 도달하기 때문이다.
그러나, 또한 공지된 용출 기술이 수행될 수 있으며, 여기서 비교적 농축된 기재 혼합물의 용액은 컬럼 해드(head) 상에 적용된 후 용출액과 함께 용출된다. 약하게 결합된 기재는 먼저 용출액으로 도달한다. 가장 강하게 결합된 기재는 이러한 경우로서, 또한 보다 강하게 용출되는 용출액을 사용함으로써 흡착제로서부터 탈착된다.
바람직하게는, 또한 마이크로 열랑계가 사용될 수 있다. 여기서, 흡착열은 흡착제에 기재의 결합 동안 방출되는 것으로 측정된다.
유리하게 적용될 수 있는 다른 방법은 표면 플라즈몬 공명법으로, 여기가능한 전자의 공명 진동수는 기재의 장벽층 및 흡착제의 물리적 성질에 따라 결정되며, 따라서 또한 결합 강도에 따른다.
바람직하게는, 또한 시험 방법에 따라 형광 레이블링(labeling)이 사용될 수 있으며, 이에 의해 이후 형광 염료로 레이블링된 기재는 이들이 상보적인 수용체와 상호작용하는 경우, 형광을 낸다.
다른 방법은 효소결합 면역흡수 검정법 (엘리사, Elisa)으로서, 예를 들어, 흡착제에 결합되는 항원이 면역제제로 처리됨으로써 검출될 수 있다. 또한 경쟁적 검정 및 비경쟁적인 검정이 사용가능하며, 이들 중 방사 에세이(radio assay)가 있다.
따라서, 본 발명의 상기 구체예는 단계 (iv)에서 흡착제에 대한 기재의 결합 강도를 시험하기 위한 방법이 크로마토그래피, 마이크로 열량계, 표면 플라즈몬 공명, 형광 레이블링, 방사 에세이를 포함하는 경쟁적 및 비경쟁적 에세이, 및 엘리사를 포함하는 군으로부터 선택된 것을 사용함을 특징으로 한다.
결합 강도로부터, 흡착제 또는 이에 적용되는 기가 기재의 결합에 대해 원인이 되는 정보를 산출할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 상기 기재를 분리시키고, 식별하고 특징화할 수 있다. 따라서, 기재의 작용 및 성질의 확인이 가능하다.
따라서, 상기 기재를 선택적으로 결합시키기 위한 방법은 또한 부가적으로 단계 (v)를 포함함을 특징으로 한다:
(v) 하나 이상의 제 2의 기재를 분리하는 단계.
더욱이, 상기 기재를 선택적으로 결합시키기 위한 방법은 또한 부가적으로 단계 (vi)을 포함함을 특징으로 한다:
(vi) 하나 이상의 제 2의 기재를 특징화하고 확인하는 단계.
특히, 신규한 방법에 따라 제조된 흡착제는 천연 기재 또는 천연 제제 및 합성 제제의 선택적인 결합에 적합하다. 상기 기재 및 제제에 대해 이들이 약물작용발생단을 통상적으로 갖으며, 따라서 기의 공간적 배열은 생존하는 유기체에서 생물학적 효과에 대한 근거를 형성한다. 약물작용발생단은 천연 수용체의 결합 포켓에 제제를 부착한다. 약물작용발생단은 영문 문헌에서 또한 골격( scaffold )으로 명시되는 뼈대에 부착된다.
바람직하게는, 천연 기재 및 제제는 아미노산, 올리고펩티드, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 단백질, 당단백질, 항원, 항원 결정인자, 항체, 탄수화물, 효소, 공효소, 발효효소, 호르몬, 알칼로이드, 글리코시드, 스테로이드, 비타민, 대사산물, 바이러스, 미생물, 식물성 및 동물성 조직에 함유된 물질, 세포, 세포 분절, 세포 구획, 세포 분열, 레시틴, 플라빌륨(flavylium) 화합물, 플라본, 및 이소플라본을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 약리학적 활성을 갖는 천연 수용체 및 효소 또는 다른 단백질을 절단하고, 이들의 보조물과 함께 본 발명에 따라 흡착제의 수집물을 발생시키고, 본 발명에 따라 상기 흡착제를 사용하는 것에 대해 특히 관심을 갖는다. 바람직하게는, 상기 수용체는 합성 또는 천연 제제를 결합시킬 수 있는 세포내 또는 막-정위된 단백질이다.
세포내 수용체는 세포질 및 세포핵으로부터 수득될 수 있다. 이러한 수용체 또는 상기 수용체의 두개 이상의 결합기를 갖는 흡착제는 스테로이드 호르몬, 예를 들어, 글루코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 안드로겐, 에스트로겐, 게스타겐, 비타민 D 호르몬 및 레티노이드 또는 갑상선 호르몬을 선택적으로 결합시키기는데 사용될 수 있다.
막-정위된 수용체, 본 발명에 따라 흡착제 상에 적용될 수 있는 기는 구아닌/뉴클레오티드/단백질-커플링된 수용체, 이온 채널 수용체 및 효소-관련 수용체이다.
특히, 의학적 치료법에 대해, 구아닌/뉴클레오티드/단백질-커플링된 수용체는 중요한 신경전달물질 수용체, 예를 들어, 아데닌 수용체 및 아드레날린 수용체, ATP-(P2Y) 수용체, 도파민 수용체, GABAB 수용체, (영양변경) 글루타메이트 수용체, 히스타민 수용체, 무스카린 수용체, 오피오이드 수용체, 및 세레토닌 수용체이다. 또한 상기 기 중에는 아디우레틴, 글리코겐, 소마토스타틴 및 프로스타글란딘으로부터의 호르몬 수용체 및 매개체 수용체가 있다.
이온 채널 수용체는 ATP-(P2X) 수용체, GABAB 수용체, (이온자극) 글루타메이트 수용체, 글리신 수용체, 5-HT3 수용체, 및 니코틴 수용체를 포함한다.
효소-관련 수용체 중에는 티로신 키나제 활성을 지닌 수용체, 관련된 티로신 키나제를 지닌 수용체, 구아닐레이트 시클라제 활성을 지닌 수용체 및 수용체/세린/트레오닌 키나제가 있다.
바람직하게는, 합성 제제는 약제 및 식물보호제를 포함한다.
예를 들어, 약제는 신경계에 영향을 미치는 물질 (정신작용제, 바르비튜레이트(barbiturate), 각성제, 진통제, 국부 및 전신 마취제, 근육 이완제, 항경련제, 항파킨슨제, 안티메틱스(antimetics), 신경절 활성제, 교감 활성제, 부교감 활성제); 호르몬계에 영향을 끼치는 물질 (시상하부, 뇌하수체, 티로이드, 파라티로이드 및 신장 호르몬, 흉선 호르몬, 췌장의, 부신의 및 생식샘의 내분비 부분에 영향을 미치는 제제); 매개체에 영향을 끼치는 물질 (히스타민, 세로토닌, 에이코사노이드, 혈소판-활성화 인자, 키닌); 심장-혈관계에 영향을 끼치는 물질; 기도에 영향을 끼치는 물질 (항천식제, 진해제, 거담제, 계면활성제); 위장관에 영향을 끼치는 물질 (소화 효소, 간장약); 신장 및 보다 낮은 요로에 영향을 끼치는 물질 (이뇨제); 눈에 영향을 끼치는 물질 (안약); 피부에 영향을 끼치는 물질 (피부치료제); 감염질환의 예방 및 치료를 위한 물질 (항균작용을 지닌 조제약, 항균제, 바이러스 및 원충성 질환을 위한 화학요법제, 구충제); 악성 종양에 영향을 끼치는 물질 (대사길항물질, 세포증식 억제제, 위상 이성질화 효소 억제제, 유사분열 억제제, 세포증식 억제작용을 갖는 항균제, 호르몬 및 호르몬 길항제); 면역계에 영향을 끼치는 물질 및 면역학적 영향을 끼치는 물질 (혈청, 면역조정제, 면역억제제)이 있다.
식물보호제는 예를 들어, 살충제, 제초제, 농약, 및 살균제가 있다.
합성 제제의 대표적인 화합물 및 화합물 부류는 페노티아진 및 이의 유사체, 부티로페논 및 디페닐부틸피페리딘, 벤자민, 벤조디아제핀, 히드록시트립토판, 카페인, 암페타민, 오피오이드 및 모르핀, 페티딘 및 메타돈, 살리실산 유도체 및 아세틸살리실산 유도체, 아리프로판산 유도체, 안트라닐산 유도체, 아닐린 유도체, 피라졸 유도체, 술파피리딘, 히드록시클로로퀸 및 클로로퀸, 페니실라민, N-메틸화된 바르비투레이트 및 티오바르비투레이트, 디프로필아세트산, 히단토인, 도파민, 노르아드레날린 및 아드레날린, 에르고트 알칼로이드, 카르바민산 유도체, 아인산 에스테르, 벨라돈나 알칼로이드, 히포프탈라무스 호르몬, HVL 호르몬, 뇌하수체 호르몬, 티오우라실 및 메르캅토이미다졸, 술포닐우레아, 히스타민, 트립탄, 프로스타글란딘, 디피라디몰, 히루딘 및 히루딘 유도체, 티아지드, 프소랄렌, 벤질퍼옥시드 및 아젤라산, 비타민 A, 비타민 K, 비타민 B1, B2, B6, 니코틴산 아미드, 비오틴, 비타민 B12, 비타민 C, 할로 화합물, 알데히드, 알코올, 페놀, N-함유 헤테로사이클, 피레트린 및 피레트로이드, 아인산의 에스테르, 티오아인산의 에스테르, 카르바민산의 에스테르, β-락탐, 아미노글리코시드, 테트라시클린, 플루오로키놀론, 옥사졸리디논, 디아미노벤질피리미딘, 피라진아미드, 그리세오풀빈, 아지리딘, 악티노마이신, 안트라시클린, 시토킨, 단일 클론 및 다중 클론 항원이 있다. 추가로, 항원 결정인자, 레시틴, 플라빌륨 화합물, 플라본 및 이소플라본 및 단당류 및 올리고당류가 언급될 수 있다.
합성 제제는 또한 천연 제제를 이용함으로써 제조될 수 있다. 추가로, 상기 용어는 또한 잠재적 제제, 약물작용발생단을 갖는 물질 및 약물작용발생단이 부착된 뼈대 (골격)를 포함한다.
이미 초기에 언급한 바와 같이, 특히, 상기 기재를 선택적으로 분리하기 위한 신규한 방법은 임의의 기재가 일반적으로 천연 수용체와 상호작용할 수 있는지의 여부에 대한 정보를 산출하는데 적합하다. 반대로, 또한 예를 들어 기재 인식과 관련된 모든 기를 사용하여 합성 분자 영역의 라이브러리, 즉 에피토프를 생산할 수 있는데, 이들 일부 각각은 두개, 세개 또는 그 이상의 서로 다른 상호작용 사이트를 함유한다. 예를 들어, 공지된 제제와 상기 합성 수용체 라이브러리가 접촉되는 경우, 확률 정보는 천연 수용체에서 결합 사이트의 유형에 대하여 산출된다.
따라서, 신규한 상보적인 원리는 화합물 또는 화합물에 결합의 원인이 되는 기 각각으로부터의 두개 이상의 서로 다른 잔부에서 수용체 또는 흡착제 각각의 면(side) 상에, 및 기재의 면 상에 포함되는 본 발명에서 사용된다. 바람직하게는, 이로 인해, 화합물은 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 및 퓨린 염기을 포함하는 군으로부터 선택된다.
그러나, 이들 중에서 상기 2가 분자 영역의 모든 가능한 조합으로부터, 단지 작은 선택은 양립가능하게 상보적이며, 즉 이의 상호작용에서 에너지-선호적이다. 다수의 조합, 한편으로는 소수성 잔부이고, 다른 한편으로는 친수성 잔부인 모든 쌍, 또는 서로 반발하는 모든 잔부는 에너지-비선호적이다.
예를 들어, 아미노/알킬 잔부와 함께 OH/페닐과 결합가능한, 그러나 알킬/아미노 잔부와 OH/페닐과 결합가능하지 않은 짝기의 조합은 양립가능한데, 이는 단지 친수성 OH 및 아미노 잔부, 및 소수성 페닐 및 알킬 잔부가 서로 결합하기 때문이다. 추가로 양립가능한 조합은 예를 들어 카르복실/아미노와 아미노/카르복실 잔부, 및 이미다졸/히드록실 및 아미드/아미드 잔부이다. 히드록실/페닐과 알킬/아미노 잔부의 조합은 상기 고려사항의 의미에서 비양립가능한데, 이는 소수성 잔부가 친수성 잔부와 결합하지 않기 때문이다.
12개의 천연의 아미노산과 관련하여, 각각 결합가능한 하나 이상의 기를 갖는 한쌍(doublet)의 성분에 대해, 모두 380개의 변이체를 초래할 것이다. 그러나, 단지 의미 있는 구조적 변이체를 포함하는 라이브러리에 대해, 한쌍의 수용체( doublet receptor )로서 또한 명시되는 상기 합성의 한쌍의 성분이 필수적으로 보다 덜 필요한데, 이는 일련의 아미노산에서, 트레오닌과 세린에 대한, 글루타민과 아스파라긴에 대한, 발린, 이소류신 및 류신 등에 대한 작용성이 동일하기 때문이다. 그러므로, 일반적으로 상기 12 개의 아미노산, 바람직하게는 7개 이하의 아미노산으로부터 사용하기에 충분하다.
합성 수용체에서 이동가능한 부착된 수용체 기가 기재의 요구사항에 따라 이들의 공간 좌표를 변경시킬 수 있기 때문에, 요망되는 결합 목적을 위해 종종 이들과 상이한 긴 사슬을 갖는 아미노산이 필요하며, 상호작용에 대한 원리가 필요로 한다. 이러한 의미에서, 단지 염기의 작용이 필요한 경우, 예를 들어, 아르기닌, 라이신, 트립토판 및 히스티딘의 작용은 아미노산에 의해 간단하게 나타낼 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 의미에서, 7개의 아미노산으로부터 단지 4개의 아미노산 또는 상기 아미노산의 원리가 사용되는 경우, 간단히 35개의 상이한 한쌍의 수용체의 조합이 교환 후에 초래될 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 또한 각각이 두개 이상의 상이한 기를 갖는 하나 이상의 기재에서 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 흡착제의 수집을 포함하는 조합 라이브러리이며, 이에 의해 흡착제 및 하나 이상의 기재의 두개 이상의 서로 다른 기는 서로에 대해 상보적이다.
*바람직하게는, 상기 조합 라이브러리는 흡착제의 두개 이상의 서로 다른 기 및 하나 이상의 기재의 두개 이상의 서로 다른 기는 서로 다른 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 또는 퓨린 염기의 일부인 군 중에서 선택된다.
다른 구체예에서, 조합 라이브러리는 흡착제의 제조가 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함함을 특징으로 한다:
(i) 흡착제에 제 1의 합성 또는 천연 기재의 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 결정하는 단계,
(ii) 제 2의 합성 또는 천연 기재의 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 각각의 담체에 적용시켜, 하나 이상의 흡착제를 각각 형성시킴으로써, 기가 단계 (i)과 동일한 기이거나 이와 상보적인 기이며, 단계 (ii)의 제 2의 기재가 단계 (ii)에 따른 기재와 동일한 기재이거나, 단계 (i)에 따른 제 1의 기재와 상이하게 하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 또한 기재의 선택적 분리에서 수득된 흡착제/기재 착물이다. 상기 흡착제/기재 착물은 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 지닌 하나 이상의 흡착제 및 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 하나 이상의 기재를 포함하며, 이에 의해 하나 이상의 흡착제의 결합가능한 기 및 하나 이상의 기재의 기는 서로에 대해 상보적이다.
바람직하게는, 하나 이상의 흡착제의 두개 이상의 서로 다른 기 및 하나 이상의 기재의 두개 이상의 서로 다른 기는 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 또는 퓨린 염기의 일부인 상이한 기를 포함한다.
흡착제/기재 착물에서, 하나 이상의 흡착제와 기재 사이의 결합은 비공유, 공유-가역적 또는 공유-비가역적 결합으로 존재한다. 바람직하게는, 결합은 비공유-가역적이다.
본 발명의 다른 목적은 또한 적어도 2가의 결합으로서 흡착제에 기재를 선택적으로 결합시키는 신규한 방법의 용도 및 조합 라이브러리의 용도이다.
적용 가능성은 수용체/제제 상호작용의 검출 및 제제 스크리닝이다.
바람직하게는, 수용체/제제 상호작용의 검출 및 제제 스크리닝에 대해, 상기 제제 중 각각 나열된 제제 부류가 사용된다.
또한, 신규한 제제 후보 (선두 물질)의 개발을 위해, 본 발명은 유리하게 사용될 수 있다. 상기 선두 물질은 신규한 방법 또는 조합 라이브러리를 사용함으로써 이들의 활성도, 선택도, 생체이용성, 약물동력학 및 독성과 관련하여 최적화될 수 있다.
*이로 인해, 또한 제제 후보가 생물학적 결합 사이트의 하나의 구역과 상호작용함을 생각할 수 있다. 생물학적 결합 사이트의 두개 이상의 구역에서 결합되는 두개 이상의 이러한 제제 후보의 조합 및 연결로서, 신규한 제제를 간단하게 발견할 수 있다. 이러한 제제 조사는 또한 고도로 병렬적인 방법 구현을 사용하여 작업한다.
다른 적용 가능성은 입체이성질체 화합물 및 이성질체 구조를 지닌 화합물의 분리이다.
추가로, 기재 및 기재 혼합물의 정제 및/또는 분리가 가능하다.
바람직하게는, 정제 및/또는 분리는 크로마토그래피법으로서 수행된다. 전기영동, 전기포커싱(electrofocusing), 겔전기영동, 평판형 겔전기영동, 병렬 크로마토그래피, 병렬 플래시 크로마토그래피 및 모세관 기술이 추가의 적합한 방법으로 언급될 수 있다. 충분히 높은 선택도의 경우에서, 또한 기재는 흡착제의 부가에 의해 용해된 혼합물로부터 직접적으로 흡착될 수 있으며, 교반하고, 흡착제/기재 착물의 형태로 여과할 수 있다.
추가의 적용 가능성은 물질 혼합물로부터 해로운 물질 및 분해 산물의 제거이며, 이에 의해 이러한 물질은 또한 매우 낮은 농도로 존재할 수 있다.
바람직하게는, 해로운 물질 및 분해 산물은 신체 액상, 예를 들어 혈액으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 상기 해로운 물질 및 분해 산물은 대사산물 또는 대사물로서 중독성으로 존재한다. 이들은 생명에 기원하는 특성일 수 있거나 신체 자체에서 형성될 수 있으나, 이들은 상기 신체에 예를 들어, 피부를 통해, 구강 점막을 통해 또는 주사를 통해 외부적으로 혈액 스트림으로 적용될 수 있다. 해로운 물질 및 분해 산물 중에는 또한 뱀의 독 및 취하게 하는 물질이 있다.
바람직하게는, 신규한 흡착제가 투석 장치에 적용될 수 있다.
더욱이, 용매, 처리수, 및 음식물 제조 공정으로부터의 해로운 물질의 제거가 가능하다.
본 발명에 의해, 또한 특히 물질대사 및 생체적합성을 위한 약물 동력학 시험이 수행될 수 있다.
선택적 결합을 위한 신규한 방법은 또한 유리하게는 동적 조합 라이브러리의 고갈에 대해 사용될 수 있다. 이를 위하여, 유리하게는, 다수의 추출물, 또는 요망되는 기재, 바람직하게는 제제 이외에 함유하는 혼합물로부터, 후자는 본 발명에 따라 분리된다. 여기에 있어서, 혼합물 중에서, 평형은 추가 기재의 형성 하에서 재조정된다. 분리 방법은 추가의 기재가 형성되지 않을 때까지 종종 반복된다.
상술된 바와 같이, 신규한 방법은 하나 이상의 추가 기재를 지닌 혼합물로부터 기재를 표적화되고 선택적으로 분리하기 위해 사용된다.
따라서, 본 발명에 따라, 용어 선택적 결합은 기재가 하나 이상의 추가의 동반되는 기재를 지닌 혼합물로부터 분리됨을 의미하며, 이로 인해 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 기재가 동반되는 기재 보다 흡착제의 두개 이상의 서로 다른 기와 더욱 강한 결합을 형성한다.
본 발명과 함께, 처음으로, 특히, 상호작용 사이트 및 상호작용 유형은 하기 방법으로서 정확하게 정의될 수 있으며, 하기 예의 측면에서 명확하게 된다:
- 수용체에서 결합사이트를 요망되는 농도 및 조합으로 의도적으로 삽입시킴,
- 수용체 및 시험 기재에 개개의 결합 사이트를 생략하거나, 부가하거나, 변경시키거나, 차단시킴으로써, 결합 강도에 대한 효과가 각각 정확하게 (=강력하게) 결정됨,
- 흡착 등온선을 분광학적으로 시험하고 결정함.
예를 들어, 각각의 비공유 결합 유형의 문헌에 공지된 개개의 기여와 비교함으로써, 다가결합의 전반적인 상호작용은 놀랍게도 매우 잘 예측될 수 있다. 각각의 결합 에너지가 예상되는 양으로 결정되는 경우, 반대로, 결합에서 관련된 기에 대한 결정이 가능하다.
따라서, 처음으로, 선택성은 임의로 선택된 분리 문제와 관련하여 의도적으로 생성될 수 있다.
분리되는 표적 화합물 (기재)과 관련하여, 신규한 교시는 경쟁 기재 (동반된 물질)와의 비공유 상호작용과 충분히 구별되는 목적-지향 비공유 다가 상호작용의 구성을 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 간단히 선택도로 명시되는 분리 선택도에 대한 높은 값을 나타낸다. 이로인해, 분리 선택도는 흡착제에 선택적으로 분리되는 기재의 결합의 결합 상수 또는 용량 인자, 및 흡착제에 동반된 기재의 결합의 결합 상수 각각의 지수로서 정의된다.
예를 들어, 기재에서 단일 카르복실기의 생략에 있어서, 분리 선택도는 35 이상의 값에 도달한다. 방향족의 하나의 고리 시스템을 세개의 고리 시스템으로 교환함에 있어서, 10의 값이 수득된다.
신규한 방법과 함께, 기술 스케일 분리 선택도는 종래 기술과 비교하여, 놀랍게도 높으며, 종종 크로마토그래피적으로 가능하지 않을 때까지 분리할 수 있다.
바람직하게는, 하나 이상의 흡착제에 결합가능한 두개 이상의 기를 갖는 선택적으로 결합되는 기재는 하나 이상의 흡착제를 사용함으로써 기재 혼합물로부터 분리됨에 의한, 분리 선택도, a는 1.4 이상이다.
바람직하게는, 분리 선택성 a는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 4 이상이고, 가장 바람직하게는 8 이상이다.
더욱 바람직하게는 10 이상, 더욱 바람직하게는 35 이상의 분리 선택도를 갖는다.
*더욱이, 결합 상수가 당업자에게 공지된 깁스 에너지의 결정으로 직접적으로 보정되기 때문에, 또한 상호관계는 깁스 에너지와 분리 선택도 사이로 제공된다. 비공유 결합에 대해 깁스 에너지의 변화, △G가 음수일 수록, 서로의 결합이 발달되는 기의 상보적 특징이 보다 강하며, 또한 (표적 기재와) 결합가능한 기를 삽입함으로써 동반되는 기재에 대한 분리 선택도가 높아질수록 (상기 기 또는 흡착제에 대한) 깁스 에너지와 관련한 현저한 변화가 없다.
더욱이, 임의의 기재 쌍과 관련하여 선택도를 생성시키기 위해, 상기 기가 분리되는 기재 둘 모두 중 하나에 대해 상보적인 파트너를 갖지 않는 한, 흡착제에 결합가능한 하나의 기를 부가적으로 부착하기에 충분하다.
기술된 방식에서, 또한 결합 유형이 동시에 (즉, 다가로) 존재하는지의 여부 및 결합 유형을 검출할 수 있다. 상기 다가, 특히 결합 상수 및 깁스 에너지에 대한 달성되는 세트 값은, 기재가 수용체에 간단히 유도되거나 형태적으로 개작됨으로써 적어도 부분적으로 삽입될 수 있는 경우, 가능하다.
상기 개작은 바람직하게는 중합체 네트워크와 함께 가능하며, 이에 의해 중합체 나노 필름의 가교도는 충분한 형태적 이동능력 및 이와 함께 기재 구조에 대한 개작 용량이 제공되도록 선택된다. 바람직하게는, 1000 Da 이하의 몰량을 갖는 작은 기재는 중합체 네트워크내에 완전히 삽입된다. 바람직하게는, 펩티드 또는 단백질과 같은 보다 큰 기재는 다가 상호작용이 너무 강한 결합을 포함함으로써 방지되도록 중합체 그물에 깊어지면서 제한된 접촉으로 결합된다.
선택적 다가 결합 사이트의 구조에 대한 개념을 구현하기 위하여, 공간에서 형태적으로 이동가능한 요망되는 결합 사이트를 제공하는 것이 종종 필요하다. 더욱이, 형태적 개작 (적당히 유도됨)을 달성하기 위하여 기재에 의한 충분히 강한 결합 경향을 제공하는 것이 필요하다. 최근에, 두개 이상의 필수적인 상호작용 사이트는 형태 변경을 기초로 하여 다수의 요망되는 결합 결과를 구현하기 위하여 고농도로 공간을 미리-조직화하여야만 한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 기술된다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 적어도 2가 결합으로서 폴리비닐 아민/ 실라카 겔을 기본으로 하는 흡착제에 기재로서 N-차단된 아미노산의 선택적 결합
8개의 서로 다른 아미노산 유도체 (표 1의 기재)의 보유 성질을 폴리비닐 아민/실리카 겔을 기초로 하는 4개의 서로 다른 흡착제 (표 2의 흡착제)에서 시험하였으며, 시험 방법으로서 크로마토그래피를 선택하였다. 하기에서 또는 다른 실시예에서, 흡착제를 또한 고정상으로서 명시하였고, 합성 수용체를 또한 수용체로서 명시하였다.
아미노산 유도체는 글루타민 (1-4) 및 글루타메이트 (5-8)의 유도체로서, 이의 아미노기를 4개의 서로 다른 보호기, 아세틸 (Ac), 3차-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐 (Z) 및 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 각각으로 차단하였다.
Figure pat00007
Figure pat00008
사용된 수용체 상은 입자크기가 20 ㎛이고, 공극직경이 1000 Å인 폴리비닐 아민-코팅된 구형 실리카 겔이었다. 코팅 방법 동안, 먼저 아미노 상 A를 제조하였다. 유도체화된 수용체 상 B 내지 D를 공지된 방법에 따른 고체상 합성에 의해 아미노 상 A로부터 합성하였다.
Figure pat00009
Figure pat00010
모든 수용체 상은 여전히 기재의 적절한 음이온 기, 예를 들어 카르복실레이트기와 양자화된 상태에서 이온성 상호작용을 수행할 수 있는 자유 아미노기의 측정가능한 함량을 지녔다. 부가적으로, 수용체 C 및 D는 친유성 상호작용에 적절한 잔부를 함유하였다.
수용체의 아미노기 함량을 크로마토그래프 격변 곡선(breakthrough curve)으로부터 DMF 중 10 mM의 4-톨루엔술폰산으로 측정하였다. 측정된 수용체 상 그램당 아미노 기의 양은 하기 표 3에 요약하였다.
Figure pat00011
기재 1 내지 8에서 크로마토그래피 시험을 위해, pH가 7.5인 수성 트리스-HCl-완충액을 이동상으로 사용하였다. 용출을 등용매 조건하에서 10 내지 500 mM의 완충액 농도로 수행하였다.
각각의 완충 용액에서 기재와 수용체 사이의 상호작용의 강도에 대한 측정으로서, 장치-독립형 상대 용출 인자 k' (용량 인자)를 사용하였다. 이는 하기 수학식에 기술된 바와 같이, 최대 피크에서의 용출 부피와 컬럼 무용 부피의 차를 컬럼 무용 부피로 나누어서 계산될 수 있다.
Figure pat00012
각각 10 mmole, 50 mmole의 트리스-HCl-완충액 중 기재의 k'-값을 하기 표 4 및 표 5에 요약한다.
Figure pat00013
Figure pat00014
표 4 및 표 5 내에서 및 이들 간의 k'-값의 비교는 하기 관찰 및 관찰의 해석을 제공하였다:
1. 관찰: 아세틸화된 수용체 상 B (ND 03001#2)는 가장 낮은 완충액 농도에서조차 현저한 양의 기재와 결합하지 않았다 (k'=1.6).
관찰의 해석: 상기 수용체는 기재의 카르복실레이트기와 가능한 이온 상호작용을 위한 단지 매우 적은 아미노 기를 함유한다. 수용체 상의 아세틸기 및 폴리비닐아민 사슬 둘 모두는 중요한 친유성 상호작용을 수행할 수 없다.
2. 관찰: 10 mmole의 완충액에서, 두개의 카르복실레이트기를 갖는 기재 (5-8)는 단지 하나의 카르복실레이트기 (1-4)를 지닌 상응하는 기재 보다 대략 20 내지 40 배 더욱 강하게 결합하였다. 50 mmole에서, 디카르복실레이트의 결합은 모노카르복실레이트의 결합 보다 10 내지 25 배 더욱 강력하였다.
관찰의 해석: 명확하게, 기재의 카르복실레이트기와 수용체의 아미노기 사이의 이온성 상호작용이 존재한다. 2가의 상호작용을 기초로 하여, 디카르복실레이트에 대해, 상기 상호작용은 단지 하나의 카르복실기를 갖는 기재에 대한 것 보다 더욱 강력한 결합을 초래한다. 수성 매질에서, 아미드기는 현저한 결합에 기여하지 않는다.
3. 관찰: 완충액 농도가 10 mmole에서 50 mmole로 증가함에 따라, 결합 강도는 모노카르복실레이트에 대해 대략 4 배 정도 감소하였으며, 디카르복실레이트에 대해 대략 10 배 정도 감소하였다.
관찰의 해석: 이러한 결과는 또한 보다 높은 완충액 농도에 대해 약화되는 이온성 상호작용으로부터 설명될 수 있다. 명백하게는, 이러한 약화는 수용체의 암모늄기에 대해 완충액 염과 기재의 카르복실레이트기의 경쟁으로부터 초래한다. 기재 (5-8)의 강한 결합의 경우에서, 완충액 염의 경쟁은 보다 강력한 효과를 갖는데, 이는 이의 두개의 카르복실레이트기가 영향을 받기 때문이다.
4. 관찰: 그밖의 동일한 기재에 대해, k'-값은 N-보호기의 유기 잔부의 크기에 따라 대폭 증가하였다. 상기 결합 상승의 정도는 완충액 농도로부터 독립적이었다.
관찰의 해석: 이와 함께, 기재의 카르복실레이트기와 수용체의 암모늄기 사이의 이온성 상호작용 이외에, 부가적으로 친유성 상호작용이 기재와 수용체 사이에 존재함을 나타낸 것이다. 따라서, N-보호기에서 작은 유기 잔부로부터 큰 유기 잔부로의 전이에서, 특히 결합 강화는 수용체 상 C 및 D에 영향을 미치고, 이의 수용체기가 특히 친유성 상호작용에 적합하다.
결론: 상술된 실험에 따라, 수용체 및 기재가 이들 작용기와 관련하여 상보적인 경우, 합성 수용체가 동시에 적절한 기재와 두개 또는 세개의 결합 상호작용을 수행할 수 있다는 것이 명확하게 입증될 수 있다.
그러므로, 표적 물질에 적절하게 상보적인 수용체의 고안에 의해, 동반되는 물질 또는 부산물이 용이하게 분리될 수 있는 것으로 판단될 수 있다. 분리의 구현을 위한 척도는 k'-값으로부터의 지수, 하기 식으로 특정되는 선택도 알파(alpha)이다:
Figure pat00015
예를 들어, 알파는 이동상으로서 10 mmole 트리스-HCl-완충액 (pH 7.5)으로 Z-Glu (3) 및 Z-Glu (7)의 크로마토그래피 분리에 대해 벤질/아미노 수용체 상 D에서 대략 25 (263/9.7)이었다.
이와 함께, 정량가능한 상호관계가 각각의 의도적으로 삽입된 분자 잔부와 결합 강도 사이에 존재함을 알 수 있었다.
실시예 2: 적어도 2가 결합으로서 컴퍼니 인스트랙션(company instrAction)의 수용체 상에 기재로서 플라바논 나린제닌의 결합
나린제닌 (도 1)과 컴퍼니 인스트랙션의 7개의 서로 다른 수용체 상 (표 6 및 7) 사이의 상호작용을 용매로서 아세토니트릴 중에서 측정하였다. 상기 측정을 위하여, 소위 "교반된 비이커 실험(stirred beaker experiment)"에서 평형 결정의 직접법을 사용하였다.
Figure pat00016
Figure pat00017
교반된 비이커 실험을 위하여, 정확한 중량의 수용체 상 (각각 대략 100 내지 300 mg)을 정확하게 측정된 부피의 용매 (15 ml) 중에 현탁시켰다. 이들 현탁액에, 부분적으로, 정확하게 측정된 양의 나린제닌을 첨가하였다 (예를 들어, 아세토니트릴 중 10 mmole 용액 1.0 ml). 나린제닌을 동적 평형을 설정하면서 수용체 상과 용매로 분배하였다.
고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 용매 중에 나린제닌 농도를 결정함으로써, 평형 상태를 정확하게 결정할 수 있었다. 이로부터, 액상 (아세토니트릴) 중 나린제닌의 물질의 양을 직접 수득하였다. 수용체 상에서 나린제닌의 물질양을 첨가된 나린제닌과 용액 중의 나린제닌 사이의 차로서 계산하였다. 각각의 교반된 비이커 실험에서, 평형을 시스템에서 나린제닌 농도를 증가시키면서 반복적으로 (6 내지 12회) 결정하였다. 얻어진 나린제닌, 및 용매 첨가 및 제거를 위해, 물질 양의 계산을 위하여 균형을 조심스럽게 이루고 고려하였다.
Figure pat00018
Figure pat00019
각각의 평형을 설정하기 위하여, 흡착 등온선 (수용체-결합된 나린제닌 [RS] 대 용액 중 나린제닌 [S]의 플롯) 상에서 한점을 획득하였다. 흡착 등온선에 대한 랭뮤어(Langmuir) 모델을 사용함으로써, 결합(association)에 대한 평형 상수 (KA) 및 최대 충전도(chargebility) [R0]를 비선형 회귀로 계산하였다.
Figure pat00020
특히 약한 상호작용에 대해, 비선형 회귀법은 실패하였다. 상기 상황에서, KA 및 R0를 스캐차드 (Scatchard) (플롯팅된 [RS]/[S] 대 [RS])에 따른 다이아그램으로부터의 선형 회귀로 결정하였다.
스캐차드에 따른 플롯에서, 간단한 랭뮤어 등온선은 직선이다:
Figure pat00021
스캐차드 플롯의 중요한 장점은 선형성으로부터의 편차를 용이하게 검출할 수 있다는 것이다. 이러한 편차는 상이한 결합 강도의 결합 사이트 및 결합 수를 동시에 갖는 수용체 상을 지시할 수 있다.
결합 상수 (KA) 및 최대 충전도 (R0)에 대한 값은 하기 표 8에 나타낸다:
Figure pat00022
관찰 및 관찰의 해석: 이의 페놀성 히드록실기를 기초로 하여, 나린제닌은 아민 상 A의 1차 아미노기와 극성 상호작용을 형성할 수 있었다. 비양성자성 용매 아세토니트릴에서, 상기 상호작용은 잘 측정될 수 있었다. 강한 결합 사이트 (KA2) 및 약한 결합 사이트 (KA1)의 존재는 나린제닌이 명확하게 세개의 존재하는 페놀기에 상응하는 1가, 2가 및 3가 극성 결합을 형성시킬 수 있는 가능성을 갖는 것으로 해석될 수 있다.
수용체 상 C, D 및 G에서, 상 A의 대부분의 1차 아미노기를 친유성 잔부로 유도체화시킨다. 상기 잔부가 나린제닌의 결합에 기여하지 않는 경우, 상기 상의 충전도 R0는 보다 낮은 아미노기 함량에 상응하게 감소해야만 할 것이다. 평형 상수는 대략 동일하게 유지되는데, 이는 상호작용의 유형이 여전히 변경되지 않을 것이기 때문이다. 실제로는, 충전도는 부분적으로 명확하게 증가하였는데, 예를 들어 나프토일-유도체화된 수용체 (수용체 상 A 및 G)에 대해 14.7 내지 38.5 mmole/g 상으로 증가하였다. 상기 결과는 나린제닌과 유도체화 기 사이에 부가적인 상호작용으로 설명될 수 있다. 상기 자유 수용체 기는 통상적으로 친유성 상호작용을 수행할 수 있다. 이의 부분에서, 나린제닌은 또한 이러한 상호작용을 공유하기 위하여 친유성 분자 부분을 또한 지닌다.
이로부터, 나린제닌은 수용체 상 C, D 및 G와, 즉 여전히 잔류하는 아미노기와 극성 결합을, 그리고 수용체 기, MVS, BzlO, NaphCar 각각과 친유성 결합을 동시에 구현할 수 있었다. 이러한 상황은 상기 친유성 결합이 유기 용매 (아세토니트릴) 에서 관찰될 수 있어 주목할 만하다. 이는 나린제닌과 친유성 수용체기 사이의 접촉이 친유성 기와 유기 용매의 용매화로 에너지적으로 경쟁을 발생시킴을 의미한다.
그러므로, 수용체 상 C, D 및 G와의 결합 상수 KA는 극성 및 친유성 결합의 기여로부터 이루어진다. 시종, 결합 상수는 아미노 상 A를 지닌 것 보다 낮다. 명확하게는, 친유성 결합은 극성 결합 보다 약하며, 이는 사용된 비교적 극성인 유가 용매 (아세토니트릴)로 인한 것일 수 있다.
수용체 상 E, F 및 H는 친유성 및 극성 결합 둘 모두에 참여하는 수용체 기를 함유하며, 즉 세개 모두는 부분적으로 연장된 방향족 구조물에 삽입된 아미노기를 함유한다. 게다가, 가장 높은 KA-값 둘 모두는 수용체 상 E 및 F에서 발견될 수 있다. 여기서 동시작동하는 극성 및 친유성 결합 기여의 공동작용은 특히 선호되는 반면, 수용체 C, D 및 G에서 친유성 수용체기는 아미노기를 소모시켜서 포함되는 것으로 추정될 수 있다.
결과: 본 실시예에서, 하나의 용매에서 기재 (나린제닌)는 적절한 수용체 상에 대해 상이한 결합을 갖을 수 있음을 알 수 있었다. 정지상에서 수용체 기의 적절한 선택에서, 기재의 결합을 위한 극성 및 친유성 상호작용은 동시에 활성화될 수 있다. 따라서, 특정 기재 또는 기재 기의 결합을 최적화하는 수용체 상이 합성될 수 있는데, 이는 서로 다른 결합 가능성이 동시에 존재하며, 이로 인해 선택적 상호작용 공간이 생성될 수 있기 때문이다.
실시예 3: 적어도 2가 결합으로서 컴퍼니 인스트랙션의 수용체 상에 기재로서 구조적으로 관련된 벤젠 유도체의 결합
구조적으로 관련된 벤젠 유도체와 인스트랙션 수용체 상 C (ND 02048#2, K1000-PVA-FA-2-4-Dod-MVS-100) 사이의 상호작용을 비극성 유기 용매 혼합물 중에서 측정하였다. 4-메틸발레르산기 (MVS) 이외에, 수용체 상 C는 또한 0.16 mmole/g 아미노기를 함유하였다. 용매는 메틸-t-부틸 에테르/헵탄의 혼합물 (1 부피부/3 부피부)이었다. 상기 비극성 용매 혼합물에서, 한편으로는, 지배적인 극성 상호작용이 예상되며, 다른 한편으로는, 시험되는 모든 물질이 여기에 매우 가용성이었다.
수용체 상과 시험 물질 사이의 상호작용에 대한 결합 상수 (KA) 및 최대 충전도 (R0)를 소위 "교반된 비이커 실험"에서 결정하였다.
교반된 비이커 실험에서, 정확한 중량의 수용체 상 (각각 대략 200 내지 350 mg)을 정확하게 측정된 부피의 용매 (15 ml) 중에 현탁시켰다. 상기 현탁액에, 정확하게 측정된 기재의 양을 부분적으로 첨가하였다. 시험되는 기재를 동적 평형을 설정하면서 수용체 상과 용매로 분배하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 용매 중의 기재 농도를 결정함으로써 평형 상태를 정확하게 결정할 수 있었다. 여기서, 용매 중의 기재의 물질 양을 직접적으로 수득하였다. 수용체 상에서 기재의 기재 양을 첨가된 기재와 용액 중의 기재 사이의 차로서 계산하였다. 각각의 교반된 비이커 실험에 대해, 시스템에서 기재 농도를 증가시키면서 반복적으로 (6 내지 12회) 평형을 결정하였다. 기재 및 용매 첨가와 제거에 대해 균형을 조심스럽게 유지하고 물질 양의 계산에 대해 고려하였다.
각각의 평형을 설정하기 위하여, 흡착 등온선 (수용체-결합된 나린제닌 [RS] 대 용액 중 나린제닌 [S]의 플롯) 상에서 한점을 획득하였다. 흡착 등온선에 대한 랭뮤어 모델을 사용함으로써, 결합에 대한 평형 상수 (KA) 및 최대 충전도 [R0]를 비선형 회귀로 계산하였다.
Figure pat00023
비선형 회귀법은 특히 약한 상호작용에 대해 실패하였다. 상기 경우에서, KA 및 R0를 스캐차드 (Scatchard) (플롯팅된 [RS]/[S] 대 [RS])에 따른 다이아그램으로부터의 선형 회귀로 결정하였다. 스캐차드에 따른 플롯에서, 간단한 랭뮤어 등온선은 직선이다:
Figure pat00024
하기 표 9에서, 수득된 상호작용 파라미터 KA 및 R0를 시험 물질과 함께 나타낸다:
Figure pat00025
결과의 관찰: 표 9로부터 결합 상수 KA에 의해 나타내는, 시험 물질과 수용체 상 사이의 상호작용의 강도가 벤젠 고리에서 치환기의 수와 함께 증가함을 알 수 있다.
단지 하나의 치환기를 갖는 벤젠 고리는 40 l/mole 미만의 결합 상수를 가지며, 이 값은 기술된 측정 시스템에서 측정 가능성의 경계에 있다.
벤젠 고리에서 제 2의 치환기는 시험 분자에 대한 추가 상호작용 가능성에 기여하였다. 약한 상호작용 둘 모두는 협력하여, 일치환된 벤젠의 결합 상수의 성과를 대략 나타내는 치환된 벤젠 유도체에 대한 결합 상수를 산출하였다. 따라서, 400 내지 1,000 l/mole의 KA-값을 수득하였다.
벤젠 고리에서 제 3의 치환기는 비교적 약한 상호작용 포텐셜 (KA ~20 내지 40 l/mole)을 지닌 이치환된 벤젠의 결합 상수를 증가시켰고, 3개의 치환기를 갖는 벤젠에 대해 17,722 l/mole의 결합 상수를 수득하였다.
도 2에서, 4-아미노-3-니트로벤조니트릴에 대한 스캐차드 다이아그램을 나타낸다.
Figure pat00026
도 2에서, a, b 및 c는 하기 의미를 갖는다:
Figure pat00027
Figure pat00028
랭뮤어 등온선으로부터, 결합 상수 KA의 형태로 상호작용의 강도를 수득할 수 있었을 뿐 아니라, 최대 충전도 R0로서 상호작용 사이트의 수를 수득할 수 있다. 3가 상호작용에 대한 최대 충전도는 2차 상호작용에 대한 R0 보다 대략 5배 낮았다. 이는 합성 수용체 상에서 3개의 동시 상호작용에 대한 결합 사이트가 두개 또는 심지어 단지 하나의 상호작용과 비교하여 보다 소수로 존재한다고 추정할 수 있기 때문에 직접적으로 이해가능하다. 부가적으로, 3가 결합 사이트에, 4-아미노-3-니트로벤조니트릴이 또한 2가 및 심지어 1가 결합 사이트를 차지할 수 있으며; 자연히 적절하게 보다 낮은 결합 강도 (KA) 및 보다 높은 최대 충전도 (R0)를 지닌다.
상기 상황은 도 2에 기술하였다. 매우 낮은 기재 농도에서 파라미터 KA 및 R0를 결정한 경우, 이후 지배적으로, 강력한 3가 상호작용 (KA3 및 R3)을 관찰하였다. 보다 약한 1가 및 2가 결합 사이트는 이러한 희석된 용액으로부터 현저하게 점유되지 않았다. 보다 높은 기재 농도에서 파라미터 KA 및 R0를 결정한 경우, 보다 약하고 더욱 많은 2가 결합 사이트의 상호작용 사이트 (예를 들어, KA1 및 R01)를 수득하였다. 이들 기재 농도에 대해, 강한 결합 사이트는 이미 포화되었고, 단지흡착 등온선에 일정한 기여를 제공하였다. 1가 상호작용은 도 2에 기술되지 않는다.
일반적으로, 스캐차드 다이아그램에서, 왼쪽으로 증가하는 등온선의 굽은 코스는 상이한 강한 결합 사이트가 동시에 존재함을 증명하는 것이다.
결과: 나타낸 실험 결과에 따라, 수용체 상 C (구조 K1000-PVA-FA-2-5-Dod-MVS-100)가 3-아미노-4-니트로벤조니트릴과 강한 3가 및 또한 보다 약한, 1가 및 2가 상호작용 둘 모두를 수행할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 보다 낮은 수의 치환기를 갖는 기재에 대해, 동일한 수용체 상은 따라서 기재 분자에서 다수의 치환기와 응하는 최대 결합 강도로 행동한다.
더욱이, 결합 강도는 기재 분자의 영구적이고 유도된 쌍극자의 치환기-의존 변경에 의해 영향을 받을 수 있었다.
실시예 4: 적어도 2가 결합으로서 컴퍼니 인스트랙션의 수용체 상에 기재로서 스테로이드의 결합
단독으로 아미노기를 함유하는 수용체 상 A (컬럼 PV 02007 중의 SBV 01044 VD/4), 및 분지된 알킬기 (4-메틸발레르산)로 27% 정도 유도체화된 상 C (컬럼 PV 02001 중의 ND 02001/1)에 대한 에스트라디올 및 테스토스테론의 결합 (보유)을 구배 HPLC로 결정하였다.
구배 HPLC에 대해, 하기 조건을 사용하였다:
*중성 용출액:
용출액 A: 1 부피부의 디메틸포름아미드 + 9 부피부의 물,
용출액 B: 디메틸포름아미드.
산성 용출액:
용출액 A: 1 부피부의 디메틸포름아미드 + 9 부피부의 물 중의 10 mmole 트리플루오로아세트산 (TFA),
용출액 B: 디메틸포름아미드 중 10 mmole 트리플루오로아세트산.
구배 프로필: 5 분 동안 0.2 ml/분의 흐름 속도로 일정한 용출액 A; 이후 완전한 물질의 용출까지 0.6 ml/분에서 2%/분으로 B의 배합.
구배에서, 이동상에서 용매법에 대한 깁스(Gibbs) 에너지가 단지 수용체/기재 결합 에너지를 초과하는 경우, 각각의 물질은 용출될 것이다. 또한, 수용체/용매 상호작용의 깁스 에너지 △G는 에너지 균형에 영향을 미친다: 대체로, 엔트로피 △S는 보다 많은 수의 흡착된 보다 작은 용매 분자로 인해, 감소되고, 상호작용 엔탈피 △H는 중간 정도의 음수이다.
적절하게 이루어진 수용체 상에 대해, 기재 결합 (흡착) 동안, 용매 흡착의 상호작용 엔탈피 △H는 수용체와 기재 사이의 다가 상호작용 엔탈피 △H의 기여 보다 상당히 덜 작은 음수이다.
검토된 물질이 수중에서 불량한 가용성을 지니며, DMF 중에 우수한 가용성을 지녔기 때문에, 용출을 위해 필수적인 이동상의 DMF 함량은 개략적으로 측정하였지만, 수용체에 대해 다수의 기재의 결합 강도를 빠르게 비교하기 위하여 간단하게 결정될 수 있었다.
에스트라디올 및 테스토스테론 둘 모두는 수용체 상과 친유성 상호작용을 수행할 수 있으며, 추가로 에스트라디올은 이온과 같은 페놀/아민 결합이 가능할 것으로 예상되었다. 더욱이, 수용체 상 C (컬럼 PV 02001 중의 ND 02001/1)에 존재하는 4-메틸발레르산기는 아미노 상 A와 비교하여 친유성 결합 부분을 현저하게 강화시켜야 한다.
테스토스테론과는 달리, 에스트라디올은 이온성 및 친유성 부분과 2가 결합을 수행할 수 있는 것으로 예측되었다. 이러한 경우에, 에스트라디올은 사용된 용매 구배에서 수용체 상 C로부터의 테스토스테론보다 상당히 늦게 용출되어야 한다. 상 A에 대해, 다른 한편으로는, 전체적으로 명확하게 보다 짧은 잔류 시간이 예상되었으며, 테스토스테론 및 에스트라디올의 용출 행동에 보다 적은 차이가 예상되었다.
하기 표 10에서, 이동상의 DMF 함량은 수용체/기재 결합의 끊기 위하여 요구되는 것으로 지시된다.
*
Figure pat00029
1. 관찰: 결과는 에스트라디올이 아미노 상 A (PV02007) 상에서 이미 테스토스테론보다 강력하게 결합하였고, 이는 부가적인 이온성 상호작용에 인한 것일 수 있음을 나타내었다. 알킬화된 상 C (PC 02001)상에서, 33.6 부피부의 증가를 나타내는 염기성 상과 비교하여 에스트라디올은 47.7% DMF의 농도까지 용출되지 않았다. DMF의 용출력과 관련하여, 상기 결과는 결합에서 급격한 증가와 상응하였다. 다른 한편으로, 테스토스테론의 결합은 18.5% DMF까지 중간 정도로 증가하였다.
2. 관찰: 예상될 수 있었던, 에스트라디올의 결합은, 이의 이온성 상호작용 가능성이 이동상에 10 mmole 트리플루오로아세트산을 첨가하는 동안 정지상에서 아미노기를 양자화시킴으로써 주로 제거되는 경우, 감소하였다.
다른 한편으로, 테스토스테론의 결합은 상 C와 관련하여 산성 매질에서 중간 정도로 강화되었고, 상 A와 관련하여 변형되지 않은 상태로 유지되었다. 기재 둘 모두에 대해, 트리플루오로아세트산으로 인해 용출액 중에서 생성된 수용체의 아미노기는 아민에 대해 사용가능하지 않는 부가 상호작용을 수행한다는 것을 생각할 수 있었다.
전체적으로, 수용체 상에서 결합 강화는 두개의 서로 다른 비공유 상호작용 유형을 사용하는 경우, 보다 현저하게 높아짐을 발견하였다. 단지 지방족 분자 부분의 친유성 접촉 영역의 확대에 의한 결합 강화는 보다 낮게 발달되었다.
더욱이, 상기 결과는 에스트라디올 분자의 특정 구조 요소의 유지를 비교함으로써 지지되었다. 이러한 분자 프로브와 함께, 포괄적인 HPLC 시험은 고속으로 수행될 수 있었다. 그래서, 2-나프톨은 유형 C의 상에 나프탈렌 보다 상당히 강하게 결합되고, 나프탈렌은 1,2,3,4-테트라히드로나프톨 보다 강하게 결합된다. 이어서, 예상된 이온성 결합 기여는 상기 행동으로부터 유도될 수 있었던 반면, 알콜성 OH기의 극성 결합은 예상대로 수성 용매에서 발생하지 않았다.
결과: 상 C (PV02001)와 같은 알킬 및 아미노기를 함유하는 상에서 페놀성 스테로이드의 2가 결합은 비방향족 스테로이드로부터 분리하기에 유리하였다. 이에 의해, 등용매 분리 조건하에서, 10 이하의 값 (분리 선택도)이 달성되었다.
한편으로, 약한 소수성 이온 교환제 A (PV 02007)상에서, 상기 분리는 해상도가 만족스럽지 않았다.
기술된 원리는 중성 또는 염기성 지방족으로부터의 페놀성 물질, 또는 방향족의 분리에 대해 일반화될 수 있다. 더욱이, 또한 다가 페놀이 잘 분리될 수 있었다.
실시예 5: 적어도 2가 결합으로서 컴퍼니 인스트랙션의 수용체 상에 기재로서 락탐의 결합
80%의 아미노기 및 14%의 벤질기를 함유한 일련의 수용체 상(예를 들어, PV 99047, PV 00010; 가교도 5%)에 클로로포름으로부터의 메틸페닐히단토인 (MPH, 1), 디페닐히단토인 (DPN, 2) 및 메틸페닐숙신이미드 (3)의 결합을 전단 분석에 의해 결정하였다.
이를 위하여, HPLC 컬럼 (40 × 4 mm)에 채워진 수용체 상을 각각의 포화 평형까지 농도를 증가시키면서 기재 용액으로 헹구었다. 흐름 속도로부터, 물질 및 기재농도의 격변까지의 시간으로부터, 결합된 기재 [RS]의 각각의 농도를 공지된 일정한 기재 농도 [S]=[S0]에 대해 계산할 수 있다. 10 내지 12의 기재 농도에 대해 측정된 돌파점 곡선으로부터, 흡착 등온선을 통한 각각의 스캐차드 다이아그램에 의해, 결합 상수 KA 및 포화 농도 [R0]를 결정할 수 있었으며, 이로 인해 2가 및 1가 결합의 영역을 검출할 수 있었다.
Figure pat00030
용매 선택에 의해, 필수적으로 극성 상호결합, 특히 수소 결합이 구현되었다.
통상적인 측정값은 하기 a) 내지 c)로 나타낸다.
*a) 실리카 겔 상에서 폴리(벤질-N-알릴-카르바메이트)에 MPH의 결합, 6층, 가교됨 (PAA-OBzl14-2Dod, PV 99047):
Figure pat00031
b) 실리카 겔 상에서 폴리(벤질-N-알릴-카르바메이트)에 DPH의 결합, 6층, 가교됨 (PAA-OBzl14-2Dod, PV 00010):
Figure pat00032
c) 실리카 겔 상에서 폴리(벤질-N-알릴-카르바메이트)에 MPS의 결합, 3층, 가교됨 (PAA-OBzl14-2Dod, PV 99047):
Figure pat00033
1. 관찰: 포괄적인 시험 시리즈에서, 히단토인 (1) 및 (2) (MPH 및 DPH) 둘 모두에 대해, 2가 결합 상수 KA는 다수의 수용상의 변이체 (예를 들어, PV 99047, PV 00010)에 대한 포화 기재 양 R0는 3 μmole/g 상 내지 12.6 μmole/g 상 사이의 포화 물질 양 Ro에 대하여 6,000 내지 23,000 M-1로 결정되었다. 이는, 두개의 수소 다리가 아민에 대해 형성될 수 있었음을 나타내었다. 1가 결합 상수는 109 내지 221 M-1 (R0=239-301 μmole/g)이었다. 다른 한편으로는, 숙신 이미드 유도체에 대해 75 내지 78 M-1의 유일한 1가 결합 상수를 96 μmole/g의 포화 값, R0으로 밝혀내었다. 이는 숙신 이미드가 단지 하나의 수소 다리를 형성할 수 있으며, 그러므로, 1가로 결합가능할 수 있는 것으로 해석될 수 있다.
2. 관찰: 2가 결합에 대한 결합 상수는 조합된 1가 결합 상수의 값의 산물과 매우 잘 상응된다. 상응하는 1가 깁스 에너지 △G는 대략 서로 더해진다. 5원 고리의 락탐기의 단일 수소 결합에 대해, 클로로포름 중에서 2.5 내지 3.14 kcal/mole의 깁스 에너지 △G는 25℃에서 결정되었으며, 2가 수소 결합에 대해서는 5.06 내지 5.88 kcal/mole이었다. 이들 값은 문헌에서 용매 클로로포름에 대해 예상된 데이타를 초과한다 (MPH:KA=6,014M-1, △G=5.06 kcal/mole, R0=3.2μmole/g; DPH:KA=7,171M-1, △G=5.16 kcal/mole, R0=6.9μmole/g 및 KA=145M-1, △G=2.90 kcal/mole, R0=264.0μmole/g).
결과: 이와 함께, 킬레이트 효과와 유사하게, 기재면 상에 그리고 수용체면 상에 두개의 유사한 상보적 잔부 (결합 사이트 잔부) 각각이 서로 상호작용하는 경우, 2가 결합강화 또한 일어남을 알 수 있었다. 언급된 경우에서, 이들은 기재의 아미드기 및 수용체의 아민기이다. 이에 의해, 깁스 에너지는 대략적으로 서로 더해지고 결합 상수는 서로 곱해졌다. 상기 원리에 따라, 특히 작용기와 관련하여 균일한 물질 또는 상이한 원자가를 갖는 물질(예를 들어, 당과 같은 모노히드릭 내지 헥사히드릭 알코올)의 분리에 적합한 수용체 상이 개발될 수 있다.
실시예 6: 적어도 2가 결합으로서 흡착제로서 폴리비닐 아민/실리카 겔을 기초로 한 흡착제에 기재로서 일부 C-차단된 아미노산의 결합
18개의 서로 다른 아미노산 유도체 (표 11의 기재)의 보유 특성을 7개의 서로 다른 정지상 (합성 수용체) 상에서 크로마토그래로 조사하였다.
아미노산 유도체 (1-18)는 알라닌, 류신, 프롤린, 라이신, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판의 에스테르였다. 에스테르를 이온화가능한 카르복실레이트 기능의 원치 않는 상호작용을 제외시키기 위하여 선택하였다. 본 출원인은 벤질 에스테르와는 매우 대조적으로 메틸 에스테르로부터 현저한 상호작용 기여를 예상치 않았다.
Figure pat00034
Figure pat00035
Figure pat00036
사용된 수용체 상은 입자 크기가 20 ㎛이고, 공극 직경이 1000 Å인 폴리비닐 아민-코팅된 구형 실리카 겔이다. 코팅 방법에서, 먼저 아미노 상 A를 제조하였다. 유도체화된 수용체 상 B 내지 K를 공지된 방법에 따른 고체상 합성에 의해 아미노 상 A로부터 제조하였다. 상을 표 12에 요약한다:
Figure pat00037
Figure pat00038
크로마토그래피 시험을 위한 이동상으로서, pH가 7.5인 수성 10 mM 트리스-HCl-완충액을 사용하였다.
각각의 완충용액 중의 기재와 수용체 사이의 상호작용의 강도에 대한 측정으로서, 장치-독립형의 상대 용출 인자 k' (용량 인자)를 사용하였다. 이는 최대 피크에서 용출 부피와 컬럼 무용 부피의 차를 컬럼 무용 부피로 나누어서 계산하였다:
*
Figure pat00039
10 mmole 트리스-HCl 완충액에서 기재의 k'-값을 표 13에 요약한다:
Figure pat00040
Figure pat00041
1. 관찰: 실시예 1에서, 카르복실레이트기를 지닌 아미노산 유도체의 k'-값을 아미노 상에서 시험하였다. 실시예 1로부터의 모노카르복실레이트 Ac-Gln (1) 및 Boc-Gln (2)은 아미노 상 (BV 02042)에서 9.5 및 8.8의 k'-인자(factor)를 달성하였다. 실시예 6에서, H-ala-OMe (1) 및 H-leu-OMe (3)과 같은 단순한 모노아민에 대해 카르복실레이트 상 I 에서 13.7 및 12.5의 k'-값을 획득하였다.
관찰의 해석: 기재 및 수용체 상에서 상호작용 기를 상호변경시킴에 있어서, k'-값은 단지 약간 변경되었다. 이는 결합의 강도가 결합의 방향에 독립적이어야 하기 때문에 예상될 수 있었다. 상호작용기의 계획된 적용에 대해, 동등한 결합이 발생하여 독립적으로, 기가 수용체에 고정되거나 기재에서 이동적인지와 독립적으로 일어난다는 점이 중요하다.
2. 관찰: 아미노 상 A 및 아세트아미도 상 B에서, 실질적으로 어떠한 기재의 보유도 발생하지 않았다.
관찰의 해석: 수용체 상 A 및 B는 기재에 대한 현저한 상호작용이 선택된 완충액에서 가능한 수용체기를 함유하지 않는다. 따라서, k'-값은 대략 제로 (0)이다. 이들 상은 상대적인 상호작용 스케일 상에서 제로-포인트로서 사용될 수 있다. 중합체 골격의 친유성 영향은 결합 균형에서 무시될 수 있다.
3. 관찰: 모든 기재는 카르복실레이트 상 I에서 명백한 보유를 나타내었다. k'-값은 4.5 내지 21.7 이었다.
관찰의 해석: 모든 시험된 기재는 하나 이상의 아미노기를 함유한다. 상기 아미노기는 주로 pH 7.5에서 양자화되고, 상의 카르복실레이트 음이온과 강하게 이온성 상호작용을 수행할 수 있다.
4. 관찰: 수용체 상 C 및 D는 단일 친유성 부분 구조물을 함유하는 기재, 예를 들어, 2, 6, 7, 8, 15 또는 17과 함께 보다 낮은 보유를 나타내었다. 강한 유지 (k'-값>8)는 적어도 두개의 보다 큰 친유성 분자 부분을 지닌 기재, 예를 들어 4, 14, 16 및 18에서 확인하였다. 이에 의해, 방향족 수용체 상 D에 대한 결합은 각각의 경우에서 알킬 수용체 상에 대한 것 보다 높았다.
관찰의 해석: 수용체 상 C 및 D는 단지 친유성 상호작용을 수행할 수 있다. 이들 결합은 이온성 상호작용과 비교하여 비교적 약하다. 1가 친유성 상호작용은 종종 선택된 완충액 중에서 검출 한계에 존재한다. 두개의 연장된 친유성 잔부를 지닌 기재는 친유성 접촉 영역의 결과로서 증가된 보유를 나타낸다.
5. 관찰: 대부분의 경우에서, 각각의 기재에 대해 가장 높은 k'-값은 수용체 상 K에서 확인되였다.
관찰의 해석: 수용체 상 K는 이온성 및 친유성 상호작용을 위한 대략 동일한 몰량의 카르복실레이트기 및 벤질옥시카르보닐기, 즉 수용체 기를 함유한다. 상호작용기의 총수가 대략 순수한 수용체 상 C, D 또는 I 중 하나와 상응하기 때문에, 혼합된 수용체 상 K에서 상 D 및 I의 k'-값 사이의 k'-값이 예상되어야 한다. 혼합된 수용체 상에서 검출된 높은 k'-값은, 상기 경우에서 이온성 및 친유성 결합이 동시에 발생하고, 이와 함께, 혼합된, 2가 결합 모드가 존재함을 나타낸다.
방향족 시스템 사이에서 p-p 접촉 강도에 대해, 벤질기-함유 상에 방향족 잔부를 갖는 모든 기재의 결합은 분지된 알킬 잔부를 갖는 상 J에 대한 것 보다 강하다.
결과: 상술된 실험에 따라, 순수한 수용체 기의 적합한 선택에 의해 기재와 수용체 상 사이의 상호작용을 의도적으로 활성화시키고 비활성화시킬 수 있음을 명확하게 증명할 수 있었다. 친화력 및 선택성의 조정을 위해, 부가적으로 용매 조성물, 이온 강도 및 pH를 변경시킬 수 있다.
기재가 두개의 친유성 분자 부분을 갖는 경우, 수용체 상과 2가적으로 상호작용하여 현저한 결합의 강화를 초래할 수 있다. 이러한 경우에서, 이는 동일한 형태의 2가 상호작용이다.
또한, 수용체 상 및 기재 둘 모두가 상응하는 상보적인 기를 함유하는 경우, 서로 다른 유형의 2가 상호작용이 가능함을 알 수 있었다. 여기서, 또한 선택적인 결합 강화가 일어난다.
따라서, 표적 물질에 상보적인 수용체의 고안에 의해, 동반되는 물질 또는 부산물은 용이하게 분리될 수 있다. 분리용이성에 대한 측정은 k'-값, 선택도 알파로부터의 지수이다:
Figure pat00042
예를 들어, 벤질/수용체 상 D와 함께, Boc-lys-OMe (9) 및 H-lys(Boc)-OMe (10)의 크로마토그래피 분리는 거의 가능하지 않을 것이다. 카르복실레이트 수용체 상 I에서, 1.59의 알파 값을 얻었다. 혼합된 수용체 상 J 및 K는 이미 2.25 및 2.06의 알파-값을 나타내었다. 이는 수용체 상의 적합한 고안에 의해 혼합물의 크로마토그래피 분리가능성의 현저한 개선을 뒷받침하고 있었다.

Claims (4)

  1. 두개 이상의 서로 다른 제 2의 기를 갖는 하나 이상의 기재와 각각 비공유 결합가능한 두개 이상의 상이한 제 1의 기를 갖는 흡착제의 수집물을 포함하며,
    두개 이상의 서로 다른 제 2의 기와의 비공유 결합에 대한 개별의 제 1의 기의 깁스 에너지의 기여가 전체 음수값의 깁스 에너지 △G를 도출하고, 상기 기여가 제2의 기재 세트와 제1의 기재의 결합 강화에 의해 결정되고, 결합 강도가 발생하여 분리되는 하나 이상의 물질과 관련하여 개선된 분리 선택성을 초래하도록, 두개 이상의 상이한 제 1의 기가 선택되는 것인 조합 라이브러리.
  2. 제 1항에 있어서, 흡착제의 두개 이상의 서로 다른 기 및 하나 이상의 기재의 두개 이상의 서로 다른 기가 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 피리미딘 염기 및 퓨린 염기의 일부인 기들 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조합 라이브러리.
  3. 두개 이상의 서로 다른 제 2의 기를 갖는, 하나 이상의 흡착제 및 하나 이상의 기재를 포함하며,
    상기 흡착제가 두개 이상의 서로 다른 제 2의 기를 갖는 하나 이상의 기재와 비공유결합 가능한 두개 이상의 서로 다른 제 1의 기를 갖고,
    두개 이상의 서로 다른 제 2의 기와의 비공유 결합에 대한 개별의 제 1의 기의 깁스 에너지의 기여가 전체 음수값의 깁스 에너지 △G를 도출하고, 상기 기여가 제2의 기재 세트와 제1의 기재의 결합 강도에 의해 결정되고, 결합 강화가 발생하여 분리되는 하나 이상의 물질에 대하여 개선된 분리 선택성을 초래하도록, 두개 이상의 제 1의 기가 선택되는 것인 흡착제/기재 복합체.
  4. 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 갖는 기재를 하나 이상의 흡착제에 선택적으로 결합시키는 방법으로서,
    (i) 합성 또는 천연의 제 1의 기재로부터 흡착제와 결합가능한 두개 이상의 기를 결정하는 단계로서, 제 2의 합성 또는 천연의 기재와의 비공유 결합에 대한 두개 이상의 기의 깁스 에너지(Gibbs energy)의 기여가 음수 값의 깁스 에너지 △G를 도출하며, 상기 기여는 제2의 기재 세트와 제1의 기재의 결합 강도에 의해 결정되는 것인 단계,
    (ii) 제 2의 합성 또는 천연의 기재와 결합가능한 두개 이상의 서로 다른 기를 하나의 각각의 담체에 각각 적용하여 하나 이상의 흡착제를 형성시킴으로써, 상기 기가 단계 (i)과 동일한 기이거나 이와 상보적인 기이고 단계 (ii)의 제 2의 기재가 단계 (i)에 따른 제 1의 기재와 동일하거나 상이하게 하는 단계,
    (iii) 단계 (i)에 따른 제 1의 기재와 동일하거나 상이한 하나 이상의 제 2의 기재를 단계 (ii)의 하나 이상의 흡착제와 접촉시키는 단계, 및
    (iv) 단계 (iii)의 하나 이상의 흡착제에 대한 하나 이상의 제 2의 기재의 결합 강도를 시험하는 단계를 포함하며,
    결합 강화가 발생하여 분리되는 하나 이상의 물질에 대하여 개선된 분리 선택성을 초래하도록 상기 단계 (i)의 기들을 결정함을 특징으로 하는 방법, 또는 제 1항 또는 제 2항에 따른 조합 라이브러리를 이용하여, 수용체/제제 상호작용을 검출, 제제를 스크리닝, 선도 물질을 개발, 기재를 분리, 기재를 정제, 이성질체 화합물을 분리, 또는 해로운 물질의 분리에 의해 액체를 정제하는 방법.
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