HRP20050809A2 - Method for selectively binding a substrate to sorbents by way of at least bivalent bonds - Google Patents

Method for selectively binding a substrate to sorbents by way of at least bivalent bonds

Info

Publication number
HRP20050809A2
HRP20050809A2 HR20050809A HRP20050809A HRP20050809A2 HR P20050809 A2 HRP20050809 A2 HR P20050809A2 HR 20050809 A HR20050809 A HR 20050809A HR P20050809 A HRP20050809 A HR P20050809A HR P20050809 A2 HRP20050809 A2 HR P20050809A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
groups
substrate
binding
sorbent
different
Prior art date
Application number
HR20050809A
Other languages
English (en)
Inventor
Gottschall Klaus
Original Assignee
Instraction Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10313324A external-priority patent/DE10313324A1/de
Priority claimed from DE10358696A external-priority patent/DE10358696A1/de
Application filed by Instraction Gmbh filed Critical Instraction Gmbh
Publication of HRP20050809A2 publication Critical patent/HRP20050809A2/hr

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3253—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure not containing any of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. aromatic structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3251—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising at least two different types of heteroatoms selected from nitrogen, oxygen or sulphur
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3255—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure containing at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. heterocyclic or heteroaromatic structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3285—Coating or impregnation layers comprising different type of functional groups or interactions, e.g. different ligands in various parts of the sorbent, mixed mode, dual zone, bimodal, multimodal, ionic or hydrophobic, cationic or anionic, hydrophilic or hydrophobic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Opisana je metoda za proizvodnju bar jednog sorbenta koji ima bar dvije različite skupine, koje mogu vezati, za selektivno vezanje supstrata, za kojuje svojstveno da se sastoji od stupnjeva (i) do (ii):(i) određivanje bar dvije skupine koje mogu vezati sorbent od sintetskog ili prirodnog prvog supstrata,(ii) odgovarajuća primjena bar dvije različite skupine koje mogu vezati drugi sintetski ili umjetni supstrat za jedan odgovarajući nosač, na taj način stvarajući bar jedan sorbent, pri čemu su skupine identične skupine stupnja (i) ili skupine koje su njima komplementarne, a drugi supstrat stupnja (ii) je identičan ili se razlikuje od prvog supstrata sukladno stupnju (i),pri čemu su skupine određene tako da doprinosi Gibbsovim energijama pojedinih skupina nekovalentnim vezama s drugim supstratom daju negativnu vrijednost Gibbs-ove energije ΔG, tako da dolazi do jačanja vezanja što rezultira poboljšanom selektivnošću odvajanja u odnosu na bar jednu tvar koju treba odvojiti.

Description

Područje izuma
Izum je iz područja farmakologije.
Izum se odnosi na metodu za proizvodnju bar jednog sorbenta za selektivno vezanje supstrata s bar dvije različite skupine koje mogu vezati kao i na metodu za selektivno vezanje navedenog supstrata pomoću navedenih sorbenata. Navedeni sorbent je određen iz skupa sorbenata na površini od kojih svaki ima bar dvije različite skupine koje mogu vezati koji su dobiveni disekcijom sintetskih ili prirodnih supstrata u komponente koje sadrže navedene skupine. Konkretno, metoda za selektivno vezanje pogodna je za izdvajanje sintetskih ili također prirodnih sredstava kao i za karakteriziranje i identificiranje funkcije i svojstava navedenih sredstava. Sljedeći predmet izuma je također kompleks sorbent/supstrat koji se dobije selektivnim vezanjem navedenog supstrata. Nadalje, izum se također odnosi na kombinacijsku biblioteku koja sadrži sorbente i supstrate, od kojih svaki poželjno ima bar dvije različite aminokiselinske rezidue, ugljikohidratne rezidue, nukleotidne rezidue, nukleozidne rezidue, pirimidinske rezidue i/ili purinske bazne rezidue kao skupine koje mogu vezati. Metoda selektivnog vezanja kao i kombinacijska biblioteka mogu se koristiti za detektiranje interakcija supstrat/receptor, kao ‘screening’ sredstvo, za selektivno odvajanje izomernih spojeva, za selektivno odvajanje kao i za pročišćavanje supstrata.
Stanje tehnike
Već je poznato iz bioafinitetne kromatografije kemijsko imobiliziranje tvari na površini netopljivog nosača visoke molekularne težine koji ima osobito visoki afinitet za specifične biomolekule. Tako, oni su ti koji mogu vezati navedene biomolekule.
Većinom, tvari koje se imobiliziraju na nosaču su biopolimeri. S druge strane, također je moguće dodati tvari malene molekularne težine uz površinu uz pomoć kojih je vezanje ili zadržavanje biopolimera moguće.
Na taj način, općenito, postoji samo dovoljno visoki afinitet imaju li sorbent i supstrat skupine koje su međusobno komplementarne i koje mogu stvarati vezu. Primjerice, komplementarne skupine su hidrofilne skupine koje su međusobno u interakciji pomoću vodikovih veza ili dipola ili polipola, pri čemu dolazi do vezanja.
Već je poznato da biološki sustavi mogu biti istovremeno međusobno u interakciji pomoću nekoliko molekularnih kontaktnih mjesta (M. Withesides et al., Angew. Chem. 1998, 110, 2908-2953).
Nadalje, iz WO 00/32649 poznati su polimeri kao sorbenti za odvajanje supstrata kao i metode za odvajanje supstrata pomoću sorbenata. Ovdje, odvajanje je provedeno pomoću bar dva različita tipa interakcija. Skupina sorbenata koji mogu vezati i koji djeluju kao receptori mogu biti skupina jednog tipa, međutim, to također mogu biti dvije ili više različitih skupina.
Nadalje, patentne dokumentacije WO 00/32648, WO 01/38009 kao i WO 00/78825 opisuju interakcije sorbent/supstrat kojima se postižu dobri uvjeti za bar bivalentno vezanje.
U ovim metodama, za ciljano vezanje supstrata, mora također biti poznat odgovarajući biopolimer i on se mora proizvesti, koristi li se kao dio sorbenta. Ako su, obrnuto, biopolimeri vezani za sorbent pomoću niskomolekularnih tvari, one moraju također biti poznate i mora postojati mogućnost da se imobiliziraju na nosaču bez promjene vezivnih svojstava.
Metoda za dobivanje sintetskih skupina na polimernom spoju za vezanje biološki ili farmakološki aktivnih tvari također je poznata. U tu svrhu, molekule-predlošci koje su biološki ili farmakološki aktivne tvari vežu se s polimernim spojem. Nakon dodavanja reaktivnih funkcionalnih skupina za polimerni spoj za vezanje supstrata, molekule-predlošci se odvajaju (WO 00/13016).
Nadalje, također je poznata metoda za selektivno odvajanje odabranog organskog spoja. U tu svrhu, na površini nosača primijene se skupine koje su komplementarne skupinama spoja kojega treba odvojiti. Poželjno, spojevi koje treba odvojiti su makromolekule koje imaju ionizirajuće skupine. Vezujuće skupine na površini nosača su suprotnog naboja u odnosu na skupine na makromolekulama. Međutim, postoji samo jedan tip skupina na sorbentu pomoću kojih se može izvršiti vezanje (WO 93/19844).
Nadalje, također patent US 2002/0155509 Al opisuje metodu koja se konačno može koristiti za selektivno odvajanje supstrata iz supstratne smjese. U tu svrhu, supstratna smjesa dovodi se u dodir s različitim sorbentima i eluentima. Pomoću desorpcijske spektrometrije može se odrediti jesu li i koliko jako supstrati vezani za sorbente s odabranim kombinacijama sorbent/eluent. Sorbent i eluent mogu varirati sve dok se ne pronađe odgovarajuća kombinacija sorbent/eluent koja omogućuje selektivno odvajanje supstrata (na taj način, pojmovi “sorbent” i “supstrat” koriste se na način koji se razlikuje od definicije koja se rabi u patentu US 2002/0155509 Al glede definicije na kojoj se zasniva ova patenta publikacija, kao što je navedeno niže).
Već je poznato imobiliziranje polarne skupine zajedno s dugolančanim alkilnim radikalima na površini nosača, pri čemu nastaju sorbenti s bar dvije različite skupine koje su vezno sposobne. Ovdje, u prvom reakcijskom stupnju, klorsilani koji su poželjno supstituirani sa srednjelančanim ili dugolančanim alkil radikalima, kao što su C8- ili C18-radikali, reagiraju s OH skupinama površine nosača, primjerice silikolnim skupinama silikagela, pri čemu su navedeni alkil radikali imobilizirani na površini nosača. Zatim, u drugom stupnju, površina nosača reagira s trimetoksisilanima ili trietoksisilanima, nakon čega slijedi stupanj hidrolize uz odvajanje alkohola i nastajanje silikolne skupine. Nadalje, također je moguće da reagiraju silikonski spojevi kao što su alkiltrialk-oksisilani, kao što su oktadeciltrimetoksisilan, s OH skupinama površine nosača, nakon čega je prvi alkilni radikal imobiliziran. Neizreagirane alkoksi rezidue mogu zatim hidrolizirati uz nastajanje silikolne skupine, nakon čega nastaje druga skupina koje je sposobna za vezanje. Konkretno, vjeruje se da su navedeni sorbenti iskoristivi za vezanje supstrata iz vodenih otopina (Column Watch, LC*GC Europe, December 2002, str. 780-786).
Ako treba izvršiti odvajanje supstrata kojima nije poznata struktura i/ili vezna svojstva pomoću sorbenata, metode koji su opisane u prethodnoj tehnici općenito ne omogućuju da se ciljano procijeni je li i koliko je određeni sorbent sposoban ili nije sposoban za selektivno vezanje supstrata. Ovdje, uglavnom pomoću složenih eksperimenata, valja analizirati jesu li poznati sorbenti odgovarajući ili nisu odgovarajući za selektivno vezanje navedenog supstrata. Zatim, nalaženje odgovarajućeg supstrata je ustvari koincidencija.
Opis izuma
Sukladno tome, cilj izuma je da se definira metoda za proizvodnju sorbenta pomoću kojega se može postići odvajanje supstrata, poželjno supstrata s fiziološkom aktivnošću, iz supstratne smjese. Nadalje, cilj izuma je definiranje metode koja omogućuje ciljano odvajanje navedenog supstrata iz supstratne smjese pomoću navedenog sorbenta.
Ovi ciljevi mogu se ostvariti pomoću bar jednog sorbenta koji sadrži bar dvije različite skupine koje mogu vezati i koje mogu komplementarno bivalentno biti u s bar dvije skupine na supstratu. Na taj način, u odnosu na monovalentnu interakciju koja je slabo selektivna do neselektivna, dolazi do jačanja. Kao posljedica, ciljani spoj se jače veže za sorbent nego za monovalentno vezane kompetitore, pri čemu, uspoređujući s navedenim kompetitorima, postiže se selektivno vezanje. Uspoređujući s drugim polivalentnim kompetirajućim supstratima, selektivno vezanje može se postići optimiziranim sorbentom, pri čemu se njegova neophodna svojstva mogu odrediti uz pomoću skupine sorbenata.
Tako, predmet izuma je metoda za proizvodnju bar jednog sorbenta koji ima bar dvije različite skupine, koje su sposobne za vezanje, za selektivno vezanje supstrata, a ona obuhvaća stupnjeve (i) do (ii):
(i) određivanje bar dvije skupine koje mogu vezati sorbent sintetskog ili prirodnog prvog supstrata,
(ii) odgovarajuća primjena bar dvije različite skupine koje mogu vezati drugi sintetski ili prirodni supstrat za odgovarajući nosač, na taj način nastaje bar jedan sorbent, pri čemu su skupine identične skupinama stupnja (i) ili su to skupine koje su im komplementarne, dok je drugi supstrat stupnja (ii) identičan ili se razlikuje od prvog supstrata sukladno stupnju (i).
Sljedeći cilj izuma je također metoda za selektivno vezanje supstrata koji imaju bar dvije različite skupine, koje su sposobne za vezanje, za bar jedan sorbent, što uključuje stupnjeve (i) do (iv):
(i) određivanje bar dvije skupine koje mogu vezati sorbent sintetskog ili prirodnog prvog supstrata,
(ii) odnosno primjena bar dvije različite skupine koje mogu vezati drugi sintetski ili prirodni supstrat za jedan odgovarajući nosač, te na taj način nastaje bar jedan sorbent, pri čemu su skupine identične skupinama stupnja (i) ili
su to skupine koje su im komplementarne, dok je drugi supstrat stupnja (ii) identičan ili se razlikuje od prvog supstrata sukladno stupnju (i),
(iii) dovođenje u kontakt bar jednog drugog supstrata koji je identičan ili se razlikuje od prvog supstrata sukladno stupnju (i) s bar jednim sorbentom stupnja (ii),
(iv) ispitivanje snage vezanja bar jednog drugog supstrata prema bar jednom sorbenta stupnja (iii).
Tako, izum omogućuje da se ciljano pojača ili da se također ciljano oslabi veza između sorbenata i supstrata, pri čemu se selektivnost vezanja sorbenta za supstrat kojega treba odvojiti iz supstratne smjese također mora ciljano poboljšati.
Sukladno tome, izum se zasniva na novom načelu odvajanja supstrata iz supstratne smjese koji se značajno razlikuje od načela odvajanja u metodama prethode tehnike, jer on oblikuje i postiže obećavajuću selektivnost odvajanja za bilo koji supstratni par kojega treba razlučiti.
Načelo odvajanja ovog izuma temelji se na predikciji, na kvantitativnoj procjeni ili na mjerenju intenziteta nekovalentne veze koja nastaje interakcijom između bar dvije različite skupine koje mogu vezati sorbent, odnosno supstrat. Načela odvajanja za metode prethodne tehnike temelje se na činjenici da se odvajanje vrši pomoću empirijskih metoda koje su grubo podijeljene u kategorije polarno/nenpolarno, odnosno hidrofilno/hidrofobno, dakle to je slučajna metoda. To je također potvrđeno uspješnošću odvajanja što, dosada, često nije dovoljno.
Poželjno, skupine u stupnju (ii) su identične skupine kao skupine stupnja (i) ili su komplementarne navedenim skupinama.
U značenju izuma, pojam supstrat obuhvaća sve tavri prirodnog ili sintetskog podrijetla koje se mogu selektivno vezati. Poželjno, ove tvari su agensi, također spojevi s fiziološkom i/ili biološkom aktivnošću u živim biljnim ili životinjskim organizmima. Načelno, ove tvari sve prirodni i sintetski kemijski i/ili biološki spojevi koje imaju dvije ili više skupina koje su sposobne za vezanje. Poželjno, to su aminokiseline, oligopeptidi, nukleotidi, nukleozidi, proteini, glikoproteini, antigens, antigenske determinante, antitijela, ugljikohidrati, enzimi, koenzimi, fermenti, hormoni, alkaloidi, glikozidi, steroidi, vitamini, metaboliti, virusi, mikroorganizmi, tvari koje sadrže biljna i životinjska tkiva, stanice, stanične fragmente, stanične odjeljke, stanična cijepanja, lektini, flavilijski spojevi, flavoni i izoflavoni, kao i sintetske tvari, poput farmaceutika i biljnih zaštitnih sredstava.
U slučaju niskomolekularnih tvari koje se vežu, u literaturi se navedene tvari često nazivaju ligandi. Protein-slične vezujuće tvari koje imaju visoku molekularnu težinu često se nazivaju receptor.
Pojam supstrat obuhvaća također prethodne stupnjeve koji se, kao što može biti slučaj, mogu prilagoditi kao sredstvo nakon daljnjeg modificiranja. Takva potencijalna sredstva često se nazivaju pogoci ili vodilje, ako se, za njihovo određivanje, izvode iz upotrijebljenih 'screening' metoda, ili se nazivaju okviri (scaffold), igle i farmakofori ako se izvode iz strukturnih svojstava.
Nadalje, navedeni pojam supstrat također obuhvaća izvore, čije izdvajanje, uklanjanje ili dobivanje iz smjese može biti ekonomski opravdano. Među spomenutim izvorima su također izvori niske koncentracije i sporedni produkti, primjerice iz procesnog toka ili otpadnih tokova. Izvori mogu biti organski, kao što su peptidi ili metaboliti iz tjelesnih tekućina, ili anorganski, kao što su radioaktivni metalni ioni ili metalni ioni plemenitih metala.
Pojam nosač obuhvaća tvari koje služe kao nosači ili okviri (scaffold) za skupine koje treba vezati. Pri primjeni navedene skupine za nosač, nastaje sorbent. Za kromatografske primjene, sorbent se također označuje kao nepokretna faza.
Pojam sorbent obuhvaća bilo koju kombinaciju nosača i bar dvije različite skupine koje mogu vezati supstrat.
Pojam komponenta označuje dijelove ili fragmente supstrata, poželjno sredstva, od kojih svako ima jednu skupinu koja je sposobna za vezanje. Primjeri takvih komponenti su epitopi. Pojam komponenta može također biti identičan pojmu skupina koja je sposobna za vezanje. Primjerice, histidin je komponenta koja nosi skupinu koja je sposobna za vezanje imidazolne rezidue koja opet sadrži amidinsku skupinu ili iminsku skupinu koja je sposobna za vezanje.
Pojam epitop označuje molekularna područja supstrata. Primjerice, pojam epitop označuje molekularno područje antigena koje se može vezati za antitijelo. takva vezujuća mjesta antitijela na antigen također se označuju kao antigenska determinanta.
Pojam (različite) skupine koje su sposobne za vezanje obuhvaća sve skupine koje mogu vezati sorbent i/ili supstrat pomoću kovalentnih ili nekovalentnih interakcija. U engleskoj literaturi, navedeni pojam također se naziva rezidue vezujućeg mjesta. Usput, ove skupine su svi spojevi ili rezidue spojeva opisani u literaturi kao oni koji mogu stvarati nekovalentne veze. Pojam nekovalentna veza objašnjen je niže.
Poželjno, skupine koje mogu vezati su hidroksil, karboksil, amid, amino, i-butil, fenil, nitrofenil, nafthil, međutim također diol, hidroksifenil, karbonil, imin, alkilen, alkinil, indolil i imidazolil rezidue. Tako, skupina koja je sposobna za vezanje može sadržavati barem jednu funkcionalnu skupinu. Međutim, skupine koje su sposobne za vezanje nisu ograničene na funkcionalne skupine.
Skupina koja je sposobna za vezanje može također izvršiti više od jedne energijske interakcije, dakle ona može sudjelovati u više nego jednom tipu nekovalentne veze. Primjerice, u osnovi indolna rezidua može istovremeno sudjelovati s tvarima koje se trebaju vezati ionske, van der Waals-ovske, p-p i disperzne interakcije. Međutim, indenskim reziduama nedostaju sposobnosti ionske interakcije i disperzna interakcija je slabije razvijena.
Na taj način, pojedinačni doprinosi vezi također ovise o otapalu. Na njih se može ciljano utjecati izborom sastava otapala, pH i temperature. Općenito, van der Waals-ovske interakcije su slabije razvijene u organskim otapalima nego u smjesi vodenih otapala. U usporedbi s tim, u pravilu interakcije vodikove veze u neprotonskim otapalima jako su smanjene s povećanjem sadržaja vode.
Pojam različit označuje one skupine koje imaju bilo različiti elementarni sastav ili, uz identičan elementarni sastav, elementi u skupinama su različito povezani, ili su skupine različito kemijski povezane. Razlika koja se odnosi na bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje također uključuje prostorni raspored u usporedbi sa tvari koja se veže. Sukladno tome, raspored se odnosi na razlikovanje stereoizomera, konkretno diastereomera i enantiomera. Primjerice, hidroksilne skupine u cis rasporedu razlikuju se od hidroksilnih skupina u trans rasporedu, ili hidroksilne skupine u R obliku razlikuju se od onih u S obliku. Takve razlike mogu se detektirati fizičkim metodama, primjerice pomoću NMR spektroskopije, jer su takve skupine magnetski neekvivalentne i daju različite rezonancijske signale u NMR spektru. Detektiranje se može također izvršiti pomoću rentgenske strukturne analize. Također, takvim skupinama je svojstveno da mogu imati različitu reaktivnost u odnosu na reagense koji ih napadaju.
Tako, konkretno, različite skupine koje su sposobne za vezanje su takve skupine od kojih svaka doprinosi interakcijskoj energiji različitim doprinosom u odnosu na tvar koja se veže (drugi supstrat). Navedena interakcijska energija se također naziva kao interakcijska Gibbs-ova energija �G. U svakom slučaju, takve skupine mogu biti identične u odnosu na njihovu građu, konfiguraciju i konformaciju, međutim mogu se razlikovati svojim interakcijskim doprinosom. Primjerice, u derivatima glutaminske kiseline, karboksilne skupine mogu imati različiti interakcijski doprinos. Također, rhamnoza rezidue koje su različito vezane mogu imati različiti interakcijski doprinos što se, primjerice, može koristiti za odvajanje naringina i rutina.
Opet, različiti doprinosi interakciji Gibbs-ove energije �G mogu imati različito velike komponente entalpije, odnosno entropije. Tako je normalno da dvije ionske interakcije karboksilnih skupina koje su sadržane u tvari koju treba vezati, zaista imaju gotovo identičan doprinos u odnosu na interakciju entalpije �H, međutim, drugo vezujuće mjesto ima razmjerno veći doprinos negativne entropije �S.
Obrnuto, također se događa da se prvi i/ili drugi supstrat bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje mogu vezati izravnim povezivanjem ako su kemijski identični ili ekvivalentni. Njihovi doprinosi na interakciju, kao što može biti, može se međusobno postepeno razlikovati, pa ih se unutar pogreške eksperimenta više ne može razlikovati. Stehiometrijski odnos međusobno ili u odnosu na daljnje skupine koje su sposobne za vezanje, uzima se u obzir pri proizvodnji sorbenta pomoću stupnja derivatizacije. Za otopine ili suspenzije sorbenta, navedeni stupanj derivatizacije također je mjera za koncentracijske specifikacije.
Primjer za akumulaciju identične ili energijski aproksimirane ekvivalentne skupine koje su sposobne za vezanje su steroidni receptori. Za vezujući kontakt prema estradiolu ili progesteronu, steroidni receptori sadrže do sedam leucinskih rezidua, koje se nepolarno vežu za ligand putem njihovih alkilnih skupina. Nadalje, postoji do tri polarna vezujuća mjesta koja se sastoje od arginina, glutamina (glutaminske kiseline) i histidina. Sukladno izumu, navedeni prirodni receptori mogu jednostavno biti simulirani ubacivanjem i-pentil radikala iz metilvalerijanske kiseline, te polarnih skupina, kao što su amid jantarne kiseline te bazičnih skupina, kao što su amin ili imidazol, u odgovarajućem koncentracijskom odnosu.
Takvi sorbenti mogu izvršiti jako vezanje ne samo za ciljanu molekulu estradiola na odgovarajući način, već također i za cijeli niz sintetskih i prirodnih tvari koje pokazuju u fiziološkim testovima i in vivo estrogenu sličnu aktivnost. Među tim tvarima su primjerice dietilstilbestrol i genistein.
Na taj način, poželjno, sorbent kao sintetski polimerni receptor je kalibriran s takvim sredstvima, ali također i sa sredstvima koja su s njima strukturno srodna, ali neaktivna, kao što su tamoksifen, testosteron ili katehin. Praktična korist postoji za tvari koja su dobro vezujuća na prirodnom receptoru te također pokazuju jako vezanje na sorbentu, za razliku od tvari koje se već vežu slabo ili nespecifično na modelu. U optimiziranju strukture, uz odnos skupina koje su sposobne za vezanje, također se podešava stupanj unakrsnog vezanja koji regulira opseg i prostorno stanje vezujućih mjesta.
Takvi sorbenti vežu iz otopljenih tvari smjese pretežno one tvari ili čak isključivo takve tvari koje se također jako vežu u modelu biološkog proteina. Tako, iz smjese tvari prirodnog ili sintetskog podrijetla, potencijalna sredstva mogu se izdvojiti u čistom obliku na brz i jednostavan način.
Značajan aspekt ovog izuma je vrlo širok izbor otapala u metodi odnosno upotrebi sukladno izumu. Rangiranje i dimenzija razlika u energiji veze između tvari koje vežu slabo i jako iznenađujuće ostaje uglavnom nepromijenjena, dodaju li se veće količine alkohola i dodatnih kiselina ili pufera vodenom eluentu. Poželjno, dodatak metanola značajno smanjuje vezanje za sve tvari koje se koriste u kalibriranju, bez djelovanja na podjele u skupine tvari sa slabim i jakim vezanjem. Posljedica je razmjerno ranije eluiranje u kromatografskim uvjetima. Tako, tvari od interesa mogu se ispitati i izdvojiti u vremenu prolaska, jer se dodavanjem organskih otapala konstante veze smanjuju za potenciju broja deset u usporedbi s čistom vodom ili fiziološkim puferom.
Pojam nekovalentna veza označuje skupine koje su sposobne za vezanje i međusobno se vežu ionskim parovima, vodikovim vezama, dipol-dipol interakcijama, interakcijama prijenosa naboja, p-p interakcijama, kation-p-elektron interakcijama, van der Waals-ovskim interakcijama i disperznim interakcijama, hidrofobnim (lipofilnim) interakcijama, stvaranjem kompleksa, poželjno nastajanjem kompleksa prijelaznih metalnih kationa, kao i kombinacijom navedenih interakcija.
Pojam komplementaran znači da vezu mogu stvarati samo one skupine koje su međusobno usklađene. Na taj način, interakcija koja izaziva vezanje mora biti energijski favorizirana. Što je jače razvijena nekovalentna veza navedene skupine s drugom, to je jače vezan supstrat za bar jedan sorbent. Na taj način, također je moguće na nekoliko skupina može biti komplementarno jednoj skupini. Primjerice, karboksilna skupina, aminska skupina i amidna skupina mogu biti komplementarne hidroksilnoj skupini.
Pojam komplementarne skupine također znači da se takve skupine mogu zamijeniti sa skupinama koje su strukturno slične komplementarnim skupinama ili onima koje su strukturno srodne navedenim skupinama. Primjerice, moguće je zamijeniti u nekovalentnoj vezi koja se zasniva na p-p interakciji naftilnu reziduu s antracenskom reziduom, pri čemu se doprinos aromatskog vodika za jačinu vezanja nekovalentne veze dalje modificira odnosno povećava. Na identičan način, moguće je povećati udio indolnih rezidua u disperznoj nekovalentnoj vezi zamjenom akridinske rezidue.
Jačina interakcije između komplemenarnih skupina koja se primjerice može izmjeriti i izraziti kao konstanta veze, rezultat je doprinosa pojedinih skupina koje su sposobne za vezanje. Ovi pojedini doprinosi konstanti veze ne ovisi samo o tipu nekovalentne interakcije, već također i o udaljenosti i orijentaciji (kut) skupina koje su međusobno u interakciji kao i o sastavu otapala. Pojedini tipovi interakcije međusobno se razlikuju energijom, pri čemu se veza i dakle Gibbs-ova energija različito smanjuju s udaljenošću između navedenih skupina.
Skupine koje su međusobno komplementarne imaju tu značajku što doprinosi Gibbs-ovih energija pojedinih skupina rezultiraju Gibbs-ove energije �G koja poprima (visoku) negativnu vrijednost. Na taj način, sukladno izumu, skupine su odabrane na način da promjena Gibbs-ove energije �G vodi jačanju vezanja tako da se dobije poboljšana selektivnost odvajanja za tvari koje treba odvojiti.
Općenito, poboljšana selektivnost odvajanja uočava se ako je �G vrijednost za vezu između odabranih komplementarnih skupina dobivenog sorbenta i drugog supstrata (ciljana tvar) u dovoljnoj mjeri negativna (ili postaje negativnija) nego što je �G vrijednost između navedenog sorbenta i tvari koju treba odvojiti. U kromatografiji ovog tipa tvar koju treba odvojiti eluira ranije, dakle navedena tvar je slabije vezana. Međutim, do poboljšane selektivnosti odvajanja dolazi ako se tvar koju treba odvojiti veže jače nego drugi supstrat (ciljana tvar) ubacivanjem drugih komplementarnih skupina, pa je ta promjena povezana s promjenom �G vrijednosti.
Sukladno izumu, ciljno odvajanje zbog dovoljne selektivnosti odvajanja se uvijek postiže, ako u kompleksu sorbent/supstrat bar jedna komplementarna skupina više ili jače (kao što su stereoizomeri) sudjeluje u vezi s drugim supstratom nego što je to slučaj u kompleksu između sorbenta i bar jedne koju treba odvojiti.
Primjeri za tipične vrijednosti navedene interakcijske Gibbs-ove energije �G (kJ/mol) koja ovisi o otapalu su:
- 4 do -6 za ionsku interakciju, pri čemu se jačina odnosno raspon navedene interakcije recipročno smanjuje s udaljenošću. Primjer za takvu interakciju je interakcija između karboksilne kiseline i kvarterna amin vodika u vodi;
- 1 za ion/kvadrupolnu interakciju, pri čemu se jačina odnosno raspon smanjuje s trećom potencijom udaljenosti.
Primjer je interakcija između kvarternog dušika u amonijevim spojevima i arenske skupine u vodi;
- 1,75 za disperznu interakciju (inducirani dipoli), pri čemu se raspon odnosno jačina smanjuje sa šestom potencijom udaljenosti. Primjer je interakcija između dviju arenskih skupina u kloroformu;
- 4 do -6 za vodikove veze. Primjer je interakcija između dviju amidnih skupina u kloroformu. U ugljik tetrakloridu, interakcijska energija između takve skupine približno je -10;
- 2,3 za hidrofobni efekt, kao rezultat interakcije između alkana i metilen radikala u vodi.
Ako, sukladno izumu, u kloroformu se hidantoini bivalentno vežu za amonijevu skupinu, mjere se �G vrijednosti do -22 kJ/mol. U slučaju monovalentnog vezanja derivata sukcinimida, �G vrijednosti su u prosjeku -9 kJ/mol. Tako, razlika obiju �G vrijednosti približno je 13 kJ/mol, a odgovarajuća vrijednost selektivnosti odvajanja je približno 200.
Navedeni podaci sugeriraju vodikove veze te, pretežno, entropijsko jačanje bivalentne interakcije.
U danom sustavu otapala, za svaki tip nekovalentne interakcije i za svaki par prvog i drugog supstrata (receptor/ligand), Gibbs-ove energije koje ovise o energiji mogu biti različito sastavljene od doprinosa entalpije i entropije.
Sukladno izumu, navedeni pojedini doprinosi određuju se analizom jačine vezanja prvog supstrata koji sadrži jednu, dvije, tri ... n skupina koje su sposobne za vezanje, s primjerice skupom drugog supstrata čije su skupine koje su sposobne za vezanje odabrane na način da su mogući zaključci glede određenog tipa interakcija. Tako, prvi supstrati mogu se koristiti koji, poželjno, sadrže amino, acetil, benzil, nitrofenil i izopentil rezidue, kao i kombinacije dviju i triju rezidua. Zatim, drugi supstrati sastoje se od derivata poželjno alanina, aspartanske kiseline i glutaminske kiseline. Poželjno, N-terminalne zaštitne skupine navedenih derivata su ili alifatske ili aromatske.
Poželjno, energije veza mogu se odrediti kao k’-vrijednosti iz izokratskih HPLC eksperimenata. Ako je, pri prvom supstratu, koncentracija skupina koje su sposobne za vezanje i odnos faza/volumen između nepokretne (stacionarne) faze i pokretne faze poznat, konstanta veze KA može se odrediti iz k’-vrijednosti, i dalje, iz navedene vrijednosti promjena Gibbs-ove energija �G. Primjerice, promjena entalpije �H i promjena entropije �S mogu se mikrokalorimetrijski odrediti ili pomoću temperaturno-ovisnog mjerenja ravnotežne konstante što se također naziva van't Hoff-ov dijagram. Nakon toga, uspoređivanjem odgovarajućih interakcijskih energija između odabranih receptorskih inačica i liganada, može se provjeriti do kojeg opsega interakcijski doprinosi međusobno djeluju, jačanjem ili slabljenjem. Očito je da metode za određivanje vezanja nisu ograničene na one gore spomenute. K tome, mogu se koristiti sve standardne metode određivanja, kao što su kompetitivne analize, površinska plazmon rezonancija ili NMR titriranje. Određivanje interakcijskih energija može se izvršiti u obliku minijaturiziranih analiza i u paraleli.
U sterički povoljnim uvjetima, za skupine koje su sposobne za vezanje, dijelovi Gibbs-ovih energija međusobno se zbrajaju. Sukladno tome, doprinosi konstantama veze međusobno se množe. Štoviše, kooperativni učinci su mogući doprinos daljnjem jačanju vezanja. Također, u uvjetima koji sterički nisu povoljni, većinom se može postići jačanje bivalentnog vezanja. Ovoje osobit boljitak za praktičnu primjenu, jer jačanje vezanja za odgovarajući izbor rezidua koje su sposobne za vezanje gotovo u potpunosti rezultira poboljšanom selektivnošću odvajanja za tvar koju treba odvojiti (prateće tvari/sporedni produkti).
Pojam nekomplementaran označuje one skupine koje su zaista međusobno u interakciji, međutim navedene skupine slabije doprinose nekovalentnoj vezi nego komplementarne skupine. Sukladno tome, jačina vezanja između nekomplementarnih skupina slabije je razvijena nego što je veza između komplementarnih skupina. Sukladno izumu, skupine koje nisu međusobno komplementarne slabe nekovalentnu vezu koja je nastala između navedenih skupina, ili slabe odgovarajuće cijelo vezujuće mjesto, ako je ono nevezujuće. Svojstveno je da doprinosi Gibbs-ovih energija pojedinih skupina rezultiraju promjenom Gibbs-ovih energija �G koje su nula ili imaju pozitivnu vrijednost.
Pojam determiniranje označuje ciljani izbor, primjerice ciljani izbor skupina koje su sposobne za vezanje.
Bar jedan sorbent koji je dobiven sukladno novoj metodi može se koristiti za prepoznavanje interakcija sorbent/supstrat. Konkretno, kao metoda prepoznavanja, nova metoda je pogodna za selektivno vezanje navedenog supstrata za bar jedan navedeni sorbent. Kao kriterij prepoznavanja, može se koristiti jačina veze. U slučaju dovoljno jake veze između sorbenta i supstrata, dobiva se informacija o tome koje skupine supstrata i koje skupine sorbenta se mogu međusobno vezati.
Ako je skupina supstrata nepoznata, u slučaju vezanja može se zaključiti koje skupine koje su sposobne za vezanje mogu biti u supstratu na vezujućem mjestu.
Međutim, također je moguće odvojiti molekularna područja prvog supstrata nepoznate strukture u odgovarajuće komponente, primjerice epitope, te podesiti navedenu strukturu ili strukturu koja je komplementarna odgovarajućom raspodjelom komponenti na sorbentu.
Na taj način, odvajanje se može izvršiti sukladno kemijskim, fizikalnim ili kemijsko-fizičkim metodama, primjerice reakcijama kemijskog degradiranja ili pomoću ultrazvuka, te također virtualnim eksperimentima. Za navedene virtualne eksperimente se mogu također koristiti računalno-potpomognute metode pomoću kojih se mogu dobiti informacije o mogućnostima vezanja u komponentama supstrata.
Polazna točka za odvajanje je to da broj komponenti koje su sposobne stvarati interakcije i broj skupina koje su sposobne za vezanje bude konačan i ograničen, a za konkretan problem mora biti ograničen. Iz svake proizvoljno odabrane podskupine takve skupine, mogu se dobiti proizvoljne klase kombinacija s m elemenata (m = 2, 3, 4, ...). Primjer može biti klasa 3 sa svim mogućim kombinacijama triju skupina koje su sposbne za vezanje, odnosno odabiranjem n = 5 s primjerice skupinama fenil, alkil, amino, karboksil i amid.
Na taj način, svaki protein može se razdvojiti u 20 komponenti, dakle aminokiseline, od kojih su opet u prvoj aproksimaciji n = 6 do n = 9 skupine koje su sposobne za vezanje relevantne za nekovalentnu interakciju s drugim supstratom. Ovo smanjenje se vrši na taj način što je ista skupina ili ekvivalentna skupina koja je sposobna za vezanje sadržana u nekoliko aminokiselina, kao što su hidroksilna, karboksilna i amidna skupina, i također bazična funkcija, ako postepeno gradiranje između lizina, arginina, triptofana ili histidina nije značajno.
Na usporedivi način, 8 izomernih ketoheksoza ili 16 stereoizomernih aldoheksoza te piranozidi i furanozidi koji su izvedeni iz njih mogu se koristiti kao komponente koje predstavljaju oligosaharide.
To znači da se svaki proizvoljno nepoznati supstrat sastoji od izbrojive količine komponenti koje, opet, sadrže definiranu količinu skupina koje su sposobne za vezanje. Komponente i skupine koje su sposobne za vezanje počivaju na kemijskom znanju i u pravilu su poznate sukladno tipu i svojstvima. To uglavnom vrijedi ako se one mogu dodijeliti organskoj kemiji ili kemiji kompleksa.
Budući da je sinteza moguća unaprijed za svaku kombinaciju poznatih komponenti i biblioteke skupina koje su sposobne za vezanje u proizvoljno dosegu sorbenata koji su im komplementarni i identični, u osnovi svaka komponenta iz molekularnog područja ili s vezujućeg mjesta prvog supstrata nepoznate strukture može se uključiti ili može biti sadržana u takvoj biblioteci sorbenata. Isto se može primijeniti na kombinacije skupina koje su sposobne za vezanje.
U metodi sukladno ovom izumu, može se dobiti nekoliko sorbenata, dakle kolekcija sorbenata. Jedan može biti u kontaktu s poznatim ili nepoznatim drugim supstratom koji se razlikuje od prvog supstrata i čije su skupine koje su sposobne za vezanje poznate, s navedenom kolekcijom sorbenata, te se može odrediti jačina vezanja. Na taj način, dobiva se informacija o tome kako su komponente raspodijeljene na veznom mjestu drugog supstrata, te kako je oblikovana prostorna struktura vezujućeg mjesta. Dakle, nova metoda može se također koristiti za određivanje strukture.
Nadalje, nova metoda za selektivno vezanje navedenog supstrata je osobito za razvoj agenasa, poželjno za razvoj lijekova. Općenito je poznato da se učinkovitost lijekova zasniva na činjenici što su u fiziološkim uvjetima vezani za prirodni receptor koji, primjerice, može biti hormon ili enzim. Sada je moguće odvojiti vezno mjesto prirodnog receptora na način koji je prije opisan, te dobiti niz sorbenata. Zatim, svaki sorbent iz niza navedenih sorbenata sadrži definirane komponente (dijelovi) navedenih veznih mjesta. Poželjno, na taj način imitira se također prostorni raspored komponenti, također poželjni prostor raspored komponenti cijelog veznog mjesta. Ako se odredi snaga vezanja proizvoljnog supstrata, primjerice lijeka, za svaki dio navedenog sintetskog receptora, pri čemu svaki predstavlja drugi strukturni dio prirodnog receptora, dobiva se informacija iz podataka o vezanju može li navedeni supstrat općenito biti u interakciji s prirodnim receptorom te ako je odgovor pozitivan, s kojom prostorno oblikovanom receptorskom skupinom. Zatim, pomoću odgovarajućih kemijskih modifikacija, supstrat može biti optimiziran sve dok se ne postigne maksimalno vezanje za receptor.
Poželjno, metoda je prilagođena za izdvajanje biopolimera koji su nepoznati ili za koje postoji samo pretpostavka za određenu funkciju, poželjno proteini ili glikoproteini, te da se provjere navedeni proteini ili glikoproteini sukladno njihovim svojstvima.
Uspoređivanjem, može se izvršiti sinteza prema peptidima iz prikaza faga, sorbentna struktura koja je komplementarna prema oligonukleotidima ili prema drugim matricama što se može koristiti za izdvajanje molekula agenasa izravno iz smjese.
Obrnuto, oblikovanjem strukturnih dijelova koji su tipični za agense na površini sorbenta, dolazi do vezanja supstratne smjese ili odgovarajućeg supstrata, te njegova karakteriziranja. Primjerice, takav supstrat je receptor.
U stupnju (i), odabiranje bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje prvog sintetskog ili prirodnog supstrata za sorbent, vrši se određivanjem navedene skupine iz sintetskog prvog ili prirodnog prvog supstrata. Određivanje bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje prvog sintetskog ili prirodnog supstrata može se izvršiti na bilo koji zamislivi način, tj. proizvoljne skupine mogu se odabrati proizvoljnim metodama, sve dok su to skupine koje su sposobne za vezanje. U poželjnoj realizaciji, odabiranje se vrši prema nekovalentnim interakcijama koje se očekuju sa supstratom.
U navedenoj realizaciji izuma, poželjno, određivanje sukladno stupnju (i) uključuje odvajanje sintetskog ili prirodnog prvog supstrata u bar dvije komponente koje imaju bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje za sorbent.
U sljedećoj realizaciji, izum predviđa da bar jedan prvi supstrat je identičan supstrat kao bar drugi supstrat i odgovarajuće bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje drugog supstrata odabrane su iz takvih skupina koje su komplementarne skupinama koje su određene u stupnju (i).
Druga realizacija izuma karakterizirana je time što je bar jedan prvi supstrat različit od bar jednog drugog supstrata, te što su odgovarajuće bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje drugog supstrata odabrane uz takvih skupina koje su komplementarne skupinama koje su odabrane u stupnju (i).
Sljedeća realizacija izuma is također karakterizirana s bar dvije skupine koje mogu vezati bar jedan drugi supstrat koji je odabrane iz skupina koje su određene sukladno stupnju (i), tj. skupine drugog supstrata koje su sposobne za vezanje komplementarne su u odnosu na odgovarajuće skupine prvog supstrata.
Unutar dosega ovog izuma, u jednoj realizaciji, moguće je odvojiti u stupnju (i) sintetski ili prirodni supstrat samo u dvije komponente od kojih svaka ima jednu skupinu koja je sposobna za vezanje, pri čemu u stupnju (ii) dobije se samo jedan sorbent.
Međutim, također je moguće odvojit sintetski ili prirodni u tri komponente, pri čemu kombiniranje parova rezultira sa tri sorbenta u stupnju (ii).
Pri odvajanju u četiri komponente, dobije se šest sorbenata pri kombiniranju parova u stupnju (ii).
Međutim, također je moguće da u slučaju tri različite komponente uz kombiniranje parova u stupnju (ii), navedene tri komponente mogu se primijeniti zajedno kao triplet na sorbentu. Uz gore navedena tri sorbenta, dodatno se dobije četvrti sorbent.
Na analogni način, također je moguće da u slučaju četiri različite komponente uz kombiniranje parova u stupnju (ii) daje šest sorbenata, nadalje mogu se dobiti četiri sorbenta koji sadrže tri različite komponente, te drugi sorbent koji sadrži sve četiri komponente kao kvartet.
Sukladno tome, izum je također karakteriziran što određivanje bar dvije skupine koje su sposobne vezati sorbent iz sintetskog ili prirodnog prvog supstrata u stupnju (i) daje dvije komponente od kojih svaka ima bar jednu skupinu koja može vezati sorbent, te u stupnju (ii) dobije se jedan sorbent; ili određivanje bar dvije skupine koje su sposobne vezati sorbent iz sintetskog ili prirodnog prvog supstrata u stupnju (i) daje tri komponente od kojih svaka ima bar jednu skupinu koja je sposobna za vezanje sorbenta, te u stupnju (ii) dobiju se bar tri sorbenta; ili određivanje bar dvije skupine koje su sposobne vezati sorbent iz sintetskog ili prirodnog prvog supstrata daje u stupnju (i) četiri komponente od kojih svaka ima bar jednu skupinu koja je sposobna vezati sorbent, dok u stupnju (ii) dobije se bar šest sorbenata.
Slično, također je normalno da se odabere iz većeg broja od i komponenata n komponenata i da se od njih načine multipleti od m skupina koje su sposobne za vezanje. Primjerice, mogu se odabrati iz skupa prirodnih aminokiselina komponente fenilalanin, tirozin, izoleucin, aspartanska kiselina, asparagin, serin, lizin, triptofan i histidin (n = 9), pomoću kojih se mogu pokriti najvažniji tipovi nekovalentnih interakcija. Kombinacija za svaki m = 4 različite skupine koje su sposobne za vezanje iz navedenog odabira daje 126 različitih inačica sorbenata koji se također mogu koristiti na kombinacijski način ili kao analiza za potrebe vezanja i istraživanja vezanja.
Svaka od navedenih m nekovalentnih interakcija daje za svaki pojedini sorbent karakterističnu vrijednost za ukupnu interakciju s tvari koja se veže. Navedeni pojedini doprinosi svake skupine koja može vezati (m - 1) može se eksperimentalno ovisno o otapalu odrediti za bilo koju tvar koja se veže unutar raspona koji se može zanemariti za primjenu za primjenu. Slično, mogu se dobiti mjerni podaci za dubletne interakcije s m - 2, za tripletne interakcije s m = 3, itd.
Na taj način, opsežan skup energijskih inkremenata dobije se za različite oblike i kombinacije nekovalentnih interakcija, što omogućuje predikciju snage vezanja između dva proizvoljna supstrata ili komponente. Na taj način, također se koristi činjenica što su različite nekovalentne interakcije ovisne o otapalu i pH. Tako, interakcije vodikove veze imaju jak utjecaj u neprotonskim nepolarnim organskim otapalima, ali slab utjecaj u protonskim polarnim otapalima ili u vodi. S bazičnim reziduama, karboksilne skupine daju jake ionske veze u organskim otapalima, međutim, u pravilu u vodi se mogu detektirati samo razmjerno interakcije niže entropije.
Kao primjer, navedene korelacije su usput ilustrirane vezanjem aminokiselinskih derivata za različite sorbente. Na taj način, kao što je prethodno napomenuto, može se zaključiti iz k’-vrijednosti kromatografskih mjerenja o konstanti veze KA pod uvjetom da su poznate koncentracije komponenata koje su vezane za sorbent ili skupine koje su sposobne za vezanje. Na taj način, definirana je brza metoda koja se može paralelno koristiti da se dobiju konstante veze iz supstrata koji kompetiraju za vezivno mjesto, ako su oni prisutni u složenoj smjesi.
Iz vrijednosti konstanti veze i iz energija veze koje se mogu dobiti za kombinacije multivalentnih interakcija, moguće je na opisani način zaključiti o tipu i broju skupina koje su sposobne za vezanje strukturno nepoznatih tvari koje treba vezati, ili postaviti postulat o odsutnosti drugih skupina. Tako, moguće je postaviti zaključke koji se odnose na broj karboksilnih skupina, bazičnih skupina ili alifatskih ili aromatskih rezidua u vezanom aminokiselinskom derivatu ili peptidu.
Slično, mogu se izvesti zaključci o strukturno-ovisnoj procjeni ili mogućim veznim svojstvima između dviju supstrata koji imaju nepoznatu strukturu, sve dok su poznate skupine koje su sposobne za vezanje. To se može primijeniti na peptide i proteinske fragmente, samo ako se zna aminokiselinski sastav.
Slično, normalno je da se predvide ili opišu vezna svojstva između dviju supstrata nepoznate strukture, ako navedeni supstrati imaju stabilnu prostornu strukturu u odabranom sustavu otapala. Dva proteina ili glikoproteina s definiranom tercijarnom strukturom u međusobnoj interakciji na bar jednom vezujućem mjestu, bit će podvrgnuti interakcijama slične jačine ili rangiranja s članovima biblioteke sorbenata koji su međusobno komplementarni.
Druga značajna primjena opisuje proizvodnju sorbenata koji predstavljaju cjelovit skup svih kombinacija skupina koje su sposobne za vezanje koje su komplementarne vezujućem mjestu u proteinu ili glikoproteinu. Zatim, navedena biblioteka sorbenata ispitivana je s cjelovitim skupom liganada koji, primjerice, predstavljaju sve kombinacije dvije, tri i četiri skupine koje su točno one koje su sposobne za vezanje na proteinskom vezujućem mjestu. Zatim, one skupine koje mogu vezati smještene su na sorbentima od kojih svaki ima najjaču vezu koja bi poželjno trebala biti sadržana u sredstvu koje se razvija. Sasvim je očigledno da se također proteini mogu vezati za navedene sorbente koji služe kao model za komplementarne skupine.
Na analogni način, iz vezujuće slike cikličkog peptida koji se dobije pomoću analize faga, može se zaključiti o vezujućem mjestu u odgovarajućoj proteinskoj meti. Štoviše, razumljivo je da se načini pomoću komplementarnog mapiranja takvog peptida sorbent-podržana matrica za otkriće novih sredstava koja imaju konfiguraciju i konformaciju koja odgovara navedenom peptidu.
U tu svrhu, navedena metoda može se koristiti za vezanje, karakteriziranje i procjenu vrijednosti nepoznatih proteinskih meta i vezujućih mjesta za nekompetitivno i modulatorsko djelujuće agense. Nadalje, moguće je načiniti fleksibilna i nepostojana sredstva, kao što su peptidi, unutar krute strukture sa zadovoljavajućom mogućnošću primjene.
U svim spomenutim slučajevima, strukturna prognoza omogućena je time što su supstrati u kontaktu s odgovarajuće odabranim sorbentima i mjere se podaci o vezanju. Na taj način, za izvođenje komplementarne strukture supstrata, nedostajuće ili slabe interakcije su bitne koliko i jaka veza. Ako, primjerice, supstrat sadrži aminokiselinu, veza za sorbent koji sadrži karboksilne skupine bit će jača za karakterističnu količinu u odnosu na vezu istog supstrata koji nosi hidroksilne skupine ili čak amino skupine.
Suštinska praktična vrijednost navedenog pristupa je isključivanje većine prihvatljivih mogućnosti vezanja, pri čemu je jedino ograničenje rada prema daljnjem istraživanju broj mogućih veznih kombinacija. Isto načelo se koristi za screening, pri ispitivanju smjese tvari za tvari koje imaju unaprijed određena strukturna svojstva koja su sadržana u njima. Na taj način, osobita praktična korist je postignuto isključivanje velike većine neupotrebljivih tvari bez dodatnog rada.
Poželjno, disekcija komponenti se vrši na način da se dobiju komponente koje su u neposrednoj prostornoj blizini mjesta vezanja prirodnog ili sintetskog supstrata. Prostorni raspored vezujućeg mjesta može se karakterizirati disekcijom u dvije komponente linearnom raspodjelom navedenih komponenti, za tri komponente pomoću trokuta i za četiri komponente pomoću (zakrenutog) tetraedra.
Ako navedeno vezno mjesto nastaje na način da u navedenom veznom mjestu poželjno postoji tri ili četiri komponente s bar jednom skupinom koja je sposobna za vezanje, odnosno stereoizomerni supstrati, kao što je slučaj u racemičkim smjesama, one se različito jake veze.
Sukladno tome, također se stereoizomerni supstrati mogu različito jako vezati sukladno metodi izuma pomoću bar jednog sorbenta sukladno izumu. Ovo svojstvo može se uzeti za razvijanje sredstva, jer je poznato da stereoizomerni spojevi mogu imati različitu fiziološku aktivnost.
Tako, nova metoda je vrijedna metoda za selektivno odvajanje jednog ili više stereoizomernih spojeva iz smjese stereomernih spojeva. Primjerice, ona se može koristiti za razdvajanje racemata.
Kao daljnji stereoizomerni spojevi koji se mogu selektivno vezati, mogu se spomenuti diastereomeri, konformeri, geometrijski izomeri, kao što su cis i trans izomerni spojevi, epimeri, kao i anomeri, kao što su α- i β-glikozidni ugljikohidrati.
Međutim, pomoću nove metode ne mogu se selektivno vezati samo stereoizomerni spojevi, već također i konstitucijski izomeri, dakle spojevi koji imaju isti elementarni sastav, no u kojima su, međutim, elementi različito relativno raspoređeni jedan prema drugom.
Primjerice, razumljivo je da se mogu razdvojiti sjedinjeni aromatski sustavi koji imaju istu empirijsku formulu ali koji se razlikuju tipom vezanja ugljikovih prstena.
U primjeni bar dvije različite skupine koje se mogu vezati na svaki nosač stupnja (ii), sukladno metodama koje će biti opisane, općenito se ne može izbjeći da u barem jednom od nastalih sorbenata nastaju ne samo regije vezanja u kojima poželjne bar dvije različite skupine koje mogu vezati koegzistiraju u statističkoj raspodjeli, nego također nastaju regije u kojima, u suštini, postoji samo jedna skupina, odnosno regije u kojima su navedene skupine obogaćene. Međutim, takva područja ne remete selektivno odbijanje navedenog supstrata jer se takva regija općenito veže slabije od regije koja sadrži bar dvije različite skupine. Većinom, takva regija koja suštinski sadrži samo jedan tip skupina koje su sposobne za vezanje, čak odbija navedeni supstrat. Konkretno, takva regija je odbijač ako nekomplemenatrne skupine stoje vis-a-vis jedna drugoj.
Općenito, sve u svemu, nekomplementarne skupine koje stoje jedna vis-a-vis druge če slabiti vezanje na prvom i drugom supstratu. Navedeni učinak već se zbiva s bivalentnim vezama. Ako, primjerice, kao skupine koje su sposobne vezati odaberemo, s jedne strane, karboksilne rezidue i, s druge strane, aminske rezidue kao i s druge strane, fenilne rezidue, te s druge strane, fluorenilne rezidue, svaki prostorni raspored energetski nije pogodan, pri čemu bar jedna od polarnih rezidua stoji vis-a-vis nepolarne rezidue.
Zbog pokretljivog rasporeda polimernih lanaca, drugi supstrat kojega treba vezati za sorbent bit će spontano vezan na način da se postigne najveća moguća Gibbsova energija.
Općenito, navedene činjenice mogu se izraziti na način da, u sorbentu, par komplemenatrnih skupina mora stajati vis-a-vis para skupina koje su sposobne vezati. Veza između sorbenta i liganda dosiže svoju maksimalnu čvrstoću ako su sve uključene skupine sposobne na komplementarni raspored jedne prema drugoj u parovima, odnosno u multipletima.
Već kod dva bivalentno sparena supstrata, postaje očigledan smjer ovisnosti. Navedena sterička vodilja će sukladno tome jačati pri promjeni u trivalentne ili tetravalentne interakcije. Za visoki prinos energijski optimalnih vezujućih mjesta, potrebni su polimerni derivati s osobito visokom konformativnom pokretljivošću. Na taj način, kopolimeri su očigledni, u kojima između vezanih skupine koje mogu biti u interakciji, sub-regije s osobito visokom konformativnom pokretljivošću se udružuju, primjerice alkilni lanci.
Molarni odnos, odnosno lokalna koncentracija bar dviju različitih skupina koje su sposobne vezati i koje se primjenjuju na bar jedan sorbent, izvanredno je značajan za selektivno vezanje supstrata. Poželjno, svaka skupina na supstratu koji se veže mora naći skupinu za koju se može vezati na sorbentu.
Tako, poželjno, bar dvije različite skupine koje su sposobne vezati primjenjuju se u molarnom odnosu koji optimalno odgovara strukturnim zahtjevima supstrata kojega treba vezati.
Poželjno, bar dvije različite skupine koje su sposobne vezati su, poželjno, identične ili komplementarne skupine prvog ili drugog supstrata, te se primjenjuju na sorbent u molarnom odnosu kao što je onaj koji postoji u supstratu koji se treba
vezati, ili kao što je onaj koji postoji u kopiranom prvom supstratu. Na taj način poželjno se rabe preparativne metode kao što su one prije opisane.
Sintetski ili prirodni supstrat stupnja (i) može biti malene molekularne težine, poželjno molekularne težine manje od 1000 Da. Na taj način, međutim, navedeni supstrati također mogu biti oligomeri ili polimeri, poželjno biopolimeri.
Poželjno, jedan supstrat ima nisku molekularnu težinu dok je drugi supstrat biopolimer.
Poželjno, bar jedan sorbent koji može vezati poželjno biološke supstrata ima jednu skupinu koja može vezati koja je također odgovorna za vezanje struktura kakve se nalaze u prirodi ili za vezanje određenih dijelova takvih struktura, koje mogu biti u interakciji sa supstratom koji je poželjno biološki supstrat. U nastavku teksta, te skupine su također nazvane receptori ili receptorske skupine.
Poželjno, bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje su dijelovi komponenti ili dijelovi ili fragmenti supstrata koji imaju funkcionalne skupine. Ovdje se konkretno mogu navesti enzimske skupine, amino kiselinske skupine, peptidne skupine, ugljikohidratne skupine, amino ugljikohidratne skupine, ugljikohidratne kisele skupine kao i oligosaharidne skupine, odnosno njihovi derivati, kao i nukleozidi i nukleotidi. Ostali pogodni supstrati su pirimidinske baze i purinske baze, kao što su citozin, uracil, timin, purin, adenin, guanin, mokraćna kiselina, hipoksantin, 6-tiopurin, 6-tioguanin, ksantin.
Fragmenti molekula su, primjerice, fenil, fenol ili indolne rezidue iz fenilalanina, tirozina ili triptofana kao i hidroksil, karboksil, amino i amidne skupine. Bitno je za spomenute skupine da načelo vezanja receptora sa supstratom koje se nalazi u prirodi bude zadržano i približno ispoštovano, tako da se pomoću nove metode mogu primijeniti, primjerice, sintetski enzimi, vezujuće domene antitijela ili drugih fizioloških epitopa, npr. molekularne regije, cjeloviti domaćini, peptidi, glikopeptidi, epitopi proteina, glikoproteini, kao i oligonukleotidi.
Poželjno, kao aminokiseline mogu se spomenuti sljedeće kiseline:
aminokiseline koje imaju alifatske rezidue, kao što su glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin;
aminokiseline koje imaju alifatske bočne lance koji sadrže jednu ili više hidroksilnih skupina, kao što su serin, treonin;
aminokiseline koje imaju aromatske bočne lance, kao što su fenilalanin, tirozin, triptofan;
aminokiseline koje sadrže bazične bočne lance, kao što su lizin, arginin, histidin;
aminokiseline koje imaju kisele bočne lance, kao što su aspartanska kiselina, glutaminska kiselina;
aminokiseline koje imaju amidne bočne lance, kao što su asparagin, glutamin;
aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor, kao što su cistein, metionin;
modificirane aminokiseline, kao što su hidroksiprolin, α-karboksil glutamat, O-fosfoserin;
derivati gore navedenih aminokiselina, ili proizvoljno sljedećih aminokiselina, primjerice aminokiselina esterificiranih na karboksilnoj skupini s primjerice, alkilnim ili arilnim radikalima koji mogu biti odgovarajuće supstituirani.
Umjesto aminokiselina, također je razumljiva upotreba jednog ili više dipeptida ili oligopeptida, pri čemu, konkretno, beta, gama ili druge strukturno izomerne aminokiseline i peptidi koji su iz njih izvedeni, kao što su depsipeptidi.
Na taj način, također je moguće da se s jednom komponentom istovremeno ubace bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje.
Sukladno tome, metoda sukladno izumu također je karakterizirana time što jedna komponenta nosi bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje.
Ako bi se veća od četiri skupine koje mogu vezati trebala dodati istom sorbentu, poželjna realizacija sastoji se u tome da se kombinirano ubace bar dvije navedene skupine koje su sposobne za vezanje pomoću već kompletirane komponente u definiranom prostornom rasporedu. Na taj način, poželjno, takve skupine koje su sposobne za vezanje dodane su u komponentu koja je bila u blizini već u prvom supstratu.
Jasno je da se može realizirati sukcesivno ili istovremeno ubacivanje nekoliko takvih bar bivalentnih komponenti u sorbent, te nadalje kombiniranje navedenih komponenti s monovalentnim komponentama.
Jednostavan primjer bivalentne komponente je fluorenilmetoksikarbonil glutamin, također nazvan Fmoc glutamin. Ovdje, karboksilna skupina se koristi za vezanje za sorbent, pri čemu amidni radikal se može polarno vezati za ligand, dok je fluorenilna skupina odgovorna za p-p interakciju. Na sličan način, oligopeptidi također mogu koristiti, komb-oblikovane derivate oligomera.
Poželjno, vezanje navedenih supstrata za bar jedan sorbent izvršava se putem radikala ili skupina amino ugljikohidrata, ugljikohidrata, nukleotida i nukleozida, kao i pirimidinskih baza i purinskih baza koje se nalaze na sorbentu.
Kao rezultat, izum is također karakteriziran time što su bar dvije različite skupine koje mogu vezati bar jedan sorbent odabrane među skupinama koje su dio aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza ili purinskih baza.
U sljedećoj realizaciji, bar dvije različite skupine koje su sposobne vezati bar jedan drugi supstrat odabrani su među skupinama koji su aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza ili purinskih baza.
Ubacivanjem daljnjih skupina koje imaju prirodno ili sintetsko podrijetlo, konkretno koje imaju sintetsko podrijetlo, mogućnost nekovalentnog vezanja sorbenta može se ciljano mijenjati, konkretno se ona može osnažiti.
Primjerice, aminokiseline koje imaju sintetske zaštitmogu se primijeniti ovom novom metodom. Primjerice, mogu se primijeniti aminokiseline koje su zaštićene fluorenil reziduom. Uz fluorenil rezidue, mogu se primijeniti također rezidue kao što su antracenil ili naftil skupina. Na taj način, nastajanjem daljnjih nekovalentnih veza između aromatskih prstena zaštitne skupine i vezujućih skupina supstrata, može se postići jačanje veznih svojstava. Kao daljnji primjeri, mogu se spomenuti nitrofenil rezidue i oligo-fluorofenil rezidue i drugih elektron-bogati i elektron-deficijentni aromatski sustavi koji mogu stvarati p-p interakcije.
Poželjno, sorbent stupnja (ii) uključuje nosač koji može biti izgrađen od anorganskog ili organskog materijala ili anorganskog i organskog materijala. Kao materijali nosača, pogodni su svi materijali koji se mogu primijeniti odgovarajućim metodama na bar dvije različite skupine iz stupnja (i).
U slučaju kada je materijal nosača krutina, njegova površina može biti ravna površina, kao što su staklena ili metalna ploča, ili to mogu biti zakrivljene površine ili površine koje su ugrađene u porozni materijal, kao što su cjevaste ili spužvaste površine, kao što su zeoliti, silikagel ili celulozne kuglice. Nadalje, materijali nosača mogu biti sintetskog ili prirodnog podrijetla. Između ostalog, primjerice, valja spomenuti želatinu, kolagen ili agarozu. Također, mogu se koristiti porozne ili neporozne smole kao i plastične ili keramičke površine
Međutim, također je moguće kao nosač koristiti jednu ili više tekućina, poželjno one koje su jako viskozne. Poželjno, odgovarajući spojevi su silikonska ulja s visokom viskoznošću.
Poželjno, odgovarajuće bar dvije različite skupine stupnja (i) nalaze se na nosaču u obliku kovalentno vezanom za polimer.
Na taj način, pojam “polimer” obuhvaća također spojeve koji imaju veću molekulsku težinu koji se u polimernoj kemiji označuju kao “oligomeri”. Na taj način, također mogu se koristiti polimer kao i smjese polimera.
Bez želje da se ograničimo na određene polimere, kao moguće polimere, između ostalog mogu se spomenuti sljedeći polimeri:
polisaharidi, npr. celuloza, amiloza i dekstrani;
oligosaharidi, npr. ciklodekstrin;
chitosan;
polivinil alkohol, politreonin, poliserin;
polietilen imin, polialil amin, polivinil amin, polivinil imidazol, polianilin, polipiroli, polilizin;
poli(met)akrilna kiselina(esteri), poliitakonska kiselina; poliasparagin;
policistein.
Slično, ne samo homopolimeri, već također i kopolimeri te, konkretno, blok kopolimeri i slučajni kopolimeri načelno odgovaraju da se rabe u ovoj metodi. Ovdje navodimo kopolimere koje imaju nefunkcionalne komponente kao što su kostiren ili koetilen, kao i kopolimere kao što su kopirolidon.
Navedeni polimeri imaju bar dvije skupine koje su identične ili koje se razlikuju i koje se mogu kovalentno vezati za polimer pomoću bar dvije različite skupine koje su sposobne vezati iz stupnja (i).
Dakle, jedna realizacija izuma je određena time što su odgovarajuće bar dvije različite skupine u stupnju (ii) kovalentno vezane za polimer.
Poželjne funkcionalne skupine polimera koje imaju bar dvije identične ili različite funkcionalne skupine koji možemo spomenuti su, između ostalog, OH skupine, proizvoljno supstituirane amin skupine, SH skupine, OSO3H skupine, SO3H skupine, OPO3H2 skupine, OPO3HR skupine, PO3H2 skupine, PO3HR skupine, COOH skupine i smjese dviju ili više navedenih, gdje je R poželjno alkil radikal. Slično, polimeri koje imaju bar dvije identične ili različite funkcionalne skupine može također sadržavati polarne skupine, primjerice -CN.
Na taj način, u jednoj realizaciji, moguće je u stupnju (ii) prvo ubaciti bar dvije različite skupine koje su sposobne vezati u navedeni polimer putem bar dvije identične ili različite funkcionalne skupine, pri čemu nastaje polimer koji je derivatiziran s navedenim skupinama. Navedeni derivatizirani polimer se zatim može primijeniti na nosač.
Derivatiziranje funkcionaliziranog polimera s bar dvije skupine može se izvršiti sukladno poznatim metodama, u homogenoj i heterogenoj fazi.
Derivatizacija u heterogenoj fazi može se izvršiti reakcijom u čvrstoj fazi.
Ako su polimeri koji imaju bar dvije identične ili različite funkcionalne skupine derivatizirani u homogenoj tekućoj fazi s navedene bar dvije različite skupine, koje mogu vezati, zatim se, poželjno, miješano-funkcionalni ili, alternativno, prederivatizirani polimeri primjenjuju da bi se postigla optimalna topljivost. Primjeri navedenog koji se mogu spomenuti su, primjerice:
djelomično ili potpuno sililirana, alkilirana ili acilirana celuloza;
polivinil acetat/polivinil alkohol;
polivinil eter/polivinil alkohol;
N-butilpolivinil amin/polivinil amin.
Slično, mogu se također koristiti smjese polimer/kopolimer. Mogu se koristiti sve odgovarajuće smjese polimer/kopolimer, primjerice smjese polimera i kopolimera koje su ovdje već između ostalog, pri čemu spominjemo sljedeće:
poli(akrilna kiselina-ko-vinil acetat);
poli(vinil alkohol-ko-etilen);
poli(oksimetilen-ko-etilen);
modificirani polistireni npr. kopolimeri stirena s (met)akrilnom kiselinom (esteri);
polivinil pirolidon i njegovi kopolimeri s poli(met)akrilatima.
Poželjno, polimer koji ima bar dvije identične ili različite funkcionalne skupine reagira prije derivatizacije s bar dvije različite skupine sa sredstvom za aktiviranje. Takvi reagensi i metode za njihovu primjenu opisani su, primjerice, u patetu WO 00/32649.
Primjerice, kao spojevi koji suaktivirajući reagensi mogu se koristiti oni koji su izvedeni iz strukturnog elementa sukcinimida, pri čemu je N-vezani atom vodika zamijenjen s -OCO-Cl skupinom. Takav primjer je sljedeći spoj:
[image]
Na taj način, R3 to R10 su poželjno vodik, alkil, aril, cikloalkil i heterocikličke rezidue. Ako su rezidue R3 do R10 vodik, zatim, kako slijedi, spoj se označava kao ONB-Cl.
Ako polimer koji ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili različite, reagira kao aktivirajući reagens, onda navedeni reakcijski produkt može reagirati s odgovarajućim spojevima koji imaju skupine neophodne za vezanje za navedeni supstrat.
Također je razumljivo da reagira polimer koji ima dvije funkcionalne skupine koje su identične ili različite, sa smjesom dviju ili više odgovarajućih aktivirajućih reagensa. Navedeni reagensi mogu istovremeno reagirati s polimerom. Slično, dva ili više aktivirajućih reagensa može naknadno reagirati s polimerom.
Ovdje se načelno mogu koristiti svi spojevi koji mogu reagirati s aktiviranim polimerom i koji izravno ili posredno rezultiraju s željenim polimerom koji je derivatiziran. Za derivatiziranje, između ostalog, mogu se koristiti spojevi koji imaju bar jednu nukleofilnu skupinu.
Sljedeća mogućnost je da reagira aktivirani polimer s monohidridnim ili polihidridnim alkoholom, odnosno merkaptanom, koji sadrži amino skupinu. Ako je aktiviran polimer koji sadrži bar dvije funkcionalne skupine, primjerice s ONB-Cl, monohidni ili polihidni alkohol koji sadrži amino skupinu ili monohidni ili polihidni merkaptan koji sadrži amino skupinu selektivno će reagirati s amino skupinom. OH ili SH skupine koje su tako ubačene u polimer mogu opet biti aktivirane u stupnju s, primjerice, jednim aktivirajućim reagensom koji su prije opisani, pri čemu su koriste lančasti produžeci i grananja, ovisno o funkcionalnim skupinama alkohola i merkaptana koje se izvorno koriste.
U sljedećoj realizaciji, također je moguće da prvo reagiraju spojevi od kojih svaki ima bar jednu različitu skupinu koju mogu vezati s aktivirajućim reagensom, pa da zatim reagira produkt koji je dobiven spomenutom reakcijom s navedenim polimerom.
Poželjno, aktivirani derivati aminokiselinski ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza i purinskih baza reagiraju s polimerom koji ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili koje se razlikuju. Na taj način, u poželjnoj realizaciji, aktivirani su spojevi s ONB-Cl ili sa spojem navedenog strukturnog tipa.
Navedene reakcije mogu se koristiti za polimerno unakrsno vezanje, za stabiliziranje polimera i za grananje polimera.
Nadalje, navedene reakcije omogućuju priređivanje polimernih derivata koji imaju cijeli niz prostornih rasporeda, i koji se tome sukladno mogu koristiti za cijeli niz primjena pri čemu je navedeni prostorni raspored od suštinskog značaja.
Tako, primjerice, moguće je postići sklopove koji su načinjeni u obliku štapića, comb polimera, mreža, košara, posuda, cijevi, dimnjaka ili kaveza.
Na taj način, moguće je provesti reakcije u nepolarno-dipolarnom i/ polarno-protonskom otapalu ili smjesi otapala, kao što su smjese vodenih otapala. Ovisno o tipu polimera koji reagira i upotrijebljenom aktivirajućem reagensu i/ili spojevima koji imaju bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje, u navedenoj smjesi otapala uz vodu mogu se nalaziti različita otapala. Mogu se koristiti, između ostalog, otapala kao što su neprotonska-dipolarna otapala, kao što su DMSO, DMF, dimetilacetamid, N-metilpirolidon, tetrahidrofuran ili metil-t-butileter.
pH koji je odabran za navedene reakcije, općenito je u rasponu od 4 do 10, poželjno u rasponu od 8 do 12 i, konkretno, u rasponu od 8 do 10. Za postizanje određenog pH, mogu se koristiti odgovarajući puferi.
Pomoću otapala i pH, mogu se ciljano podesiti svojstva bujanja i širenja mreže, pri čemu se pomoću mreže može djelovati na pristup supstrata prema sorbentu.
Stupanj derivatizacije polimera, dakle stupanj do kojega funkcionalizirani polimer može biti derivatiziran, može biti oblikovan na način da se postigne najbolja moguća interakcija sa supstratom.
Poželjan je stupanj derivatizacije u rasponu od 1 do 70%, poželjnije u rasponu od 3 do 60% i, konkretno poželjan u rasponu od 5 do 50%.
Na taj način, također je moguće da bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili su različite budu derivatizirane tako da one mogu biti u interakciji kao receptorske skupine sa supstratom, te je bar jedna funkcionalna skupina supstrat-specifična i/ili monomerna jedinica bez funkcionalne skupine je smještena između dvije navedene derivatizirane skupine, pri čemu su funkcionalne skupine identične ili su međusobno identične ili su međusobno različite i odabrane između gore navedenih skupina.
Također je očekivano da skupine koje još postoje u nederivatiziranom obliku u polimeru doprinose interakciji sa supstratom.
Također je moguće koristiti derivat polimera koji ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili različite, u kojemu je druga funkcionalna skupina koja nije supstrat-specifična derivatizirana sa završnom skupinom.
Pomoću odgovarajućeg izbora završne skupine također je moguće djelovati na topljivost polimernog derivata koji im završnu skupinu ili završne skupine te prilagoditi navedene derivate zahtjevima mogućih naknadnih reakcija.
Načelno, kao završna skupina može se odabrati svaka skupina zadržava funkcionalnu skupinu inertnom ili inertnom koliko je to moguće u odnosu na interakcije sa supstratom. U ovom kontekstu, pojam “inertan” znači da interakcije kojima je podvrgnut supstrat s receptorskim skupinama derivatiziranog polimera su, u odnosu na interakcije kojima je supstrat podvrgnut s jednom ili više funkcionalnih skupina koje su derivatizirane sa završnom skupinom, tako jake da je supstrat suštinski vezan samo putem receptorske skupine.
Ako je poželjno da se odvoje dva ili više različitih supstrata putem interakcije između supstrata i receptorske skupine, primjerice u kromatografskoj metodi, nema potrebe za završnom skupinom da bi se zadržala inertnost funkcionalne skupine prema mogućim interakcijama, kao što je prije opisano. U ovom slučaju, primjerice je dovoljno ako završna skupina podliježe dovoljno slabim ili nespecifičnim interakcijama s dva ili više supstrata koji se odvajaju što nije značajno za metodu odvajanja.
Kao završna skupina, može se načelno koristiti bilo koja skupina iz prethodne tehnike. Ovisno o supstratu, primjerice je normalno da kao završna skupina bude odabrana skupina koja nije H-donor. Poželjno
[image]
se ovdje rabi, a osobito poželjan je
[image]
U polimeru koje ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili koje se razlikuju, kao receptor može se ubaciti svaka od gore navedenih rezidua da se dobije reakcijski polimer s bar dva aktivirana derivatizirana reagensa, pri čemu svaki sadrži bar jednu nukleofilnu skupinu, ili reakcijom aktiviranog polimera s bar dva takva derivatizirana reagensa.
Poželjan je derivat polimera koje ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili koje se razlikuju, kao što je prije opisano, pri čemu bar dva receptora obuhvaćaju rezidue spojeva ili skupina koje su odgovorne za vezanje u spojevima, pri čemu su spojevi odabrani iz skupa koji se sastoji od aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza i purinskih baza.
Da bi se derivatizirao polimer koji ima funkcionalne skupine sa spomenutim spojevima, derivati navedenih spojeva ili skupina koje sadrže navedene spojeve, ili njihove smjese, mogu se obraditi sukladno metodama što je prije opisano. Tako, normalno je da se prvo provede reakcija, primjerice aminokiselinskog spoja s odgovarajućim reagensom za aktiviranje, te da nakon toga reagira reakcijski produkt s polimerom. Slično je normalno da prvo reagira polimer s odgovarajućim reagensom za aktiviranje, pa zatim s aminokiselinom. Prirodno, također je razumljivo da se izravno dodaju polimer, aminokiselina i reagens za aktiviranje.
Ubacivanje rezidua ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza i purinskih baza, ili vezujućih skupina koje su sadržane u navedenim spojevima ili njihovim smjesama, također je moguće na analogni način.
Ovisno o izboru aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza i purinskih baza, ili odgovarajućih rezidua ili derivata ili vezujućih skupina koji su sadržane u navedenim spojevima, može se pokazati nužnim da se zaštite sadržane funkcionalne skupine tijekom derivatiziranja i/ili aktiviranja sa zaštitnim skupinama. U tu svrhu, sve odgovarajuće zaštitne skupine su što je poznato iz prethodne tehnike. Ovisno o kasnijoj upotrebi polimera, nakon derivatiziranja, navedene zaštitine skupine mogu ostati na aminokiselinskim reziduama, ugljikohidratnim reziduama, nukleotidnim reziduama, nukleozidnim reziduama, pirimidinskim baznim reziduama i purinskim baznim reziduama, ili se mogu odvojiti.
Umjesto aminokiseline, također je normalna upotreba jednog ili više oligopeptida.
Da bi se optimizirala interakcija sa supstratom, tekući derivat polimera ili derivat polimera koji je otopljen u otapalu ili smjesi otapala može se deformirati (rastaviti) u prisutnosti supstrata koji ovdje djeluje kao predložak.
Na taj način, primjerice, deformiranje se provodi na način da se, u odgovarajućem otapalu ili smjesi otapala, miješa derivatizirani polimer, kao što je prije opisano sa supstratom, te omogućuje polimeru da postigne jednu ili više energijski preferiranih konformacija.
Na taj način, također je normalno da se miješa i da se deformira derivatizirani polimer s različitim supstratima. Nadalje, također je normalno, ako je potrebno, da se miješaju i deformiraju razni derivatizirani polimeri s jednim ili više različitih supstrata.
Također je normalno da se derivat polimera koji ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili koje su različite deformira bez predloška.
Nakon toga do deformiranja, nastali derivat konformacijskog polimera koji je nastao deformiranjem u prisutnosti predloška može se vezati.
Ovdje, također je moguće primijeniti deformirani polimer prije vezanja za nosač.
Načelno, za vezanje mogu se koristiti sve predvidljive metode. Konkretno, ovdje treba spomenuti promjenu temperature, otapala, taloženje i unakrsno vezanje. Poželjno, konformacija se veže unakrsnim vezanjem.
Na taj način, u suštini, materijal nosača i oblik nosača mogu se slobodno odabrati, pri čemu međutim materijal nosača mora biti kondicioniran na način da se polimer može permanentno primijeniti na nosaču. Poželjno, materijal nosača, nakon što je primijenjen derivat, nema nijednu ili ima jednu ili više specifičnih interakcija s tvari od koje se odvaja.
Ovisno o kasnijem području primjene, može biti nužno da materijal nosača bude otporan na tlak. U ovom kontekstu, pojam “tlačno postojan” ima značenje da je materijal nosača dimenzijski postojan do tlaka od 100 bar.
Gore spomenuti materijali mogu se koristiti kao materijali nosača. Na taj način, oblik materijala nosača može se prilagoditi zahtjevima metode i nije ograničen. Primjerice, mogući su nosači u obliku tablete, loptice ili niti.
Primjena na materijal je uglavnom slobodnog odabira. Primjerice, primjena je moguća impregniranjem, uranjanjem nosača u odgovarajuću otopinu polimera, raspršenjem polimera na nosač ili koncentriranjem polimera uparavanjem.
Također je moguće primijeniti derivatizirani polimer na različite pogodne nosače. Slično je moguće primijeniti dva ili više derivatiziranih polimera koji su međusobno različiti na jedan ili više pogodnih nosača. U sljedećoj realizaciji metode sukladno izumu, derivatizirani, deformirani i pričvršćeni polimer obrađuje se prema poroznom materijalu. Zatim, on istovremeno oblikuje nosač tako da nije potreban dodatni materijal nosača. Na taj način, primjerice se mogu dobiti kuglice, nepravilne čestice, diskovi, niti i membrane.
Na taj način, može se vezati jedna konformacija koja je načinjena od jednog tipa derivatiziranog polimera. Međutim, slično je razumljivo da se načini konformacija koja je načinjena od dva ili više tipova derivatiziranih polimera koji su međusobno različiti. Ovdje, pojam “različiti tipovi derivatiziranih polimera” znači da se, primjerice, polimeri međusobno razlikuju u odnosu na bazični polimer ili tip aktivirajućeg reagensa, ili tip receptorske skupine koji je ubačen derivatiziranjem, iloi stupnjem aktiviranja, ili stupnjem derivatizacije, ili kombinacijom dviju ili više ovih svojstava.
Prema tome, unakrsno vezanje može se postići na taj način da dva ili više niti derivatiziranog polimera izravno međusobno reagira.
To je moguće postići na taj način da su skupine koje su ubačene derivatiziranjem takve prirode da je moguće povezivanje između navedenih skupina kovalentnim i/ili nekovalentnim vezama. Vrlo uopćeno, razumljivo je da navedene kovalentne i/ili nekovalentne veze nastaju između skupina koje su dodane jednoj polimernoj niti, ili nastaju između skupina koje su vezane za dvije ili više polimernih niti, tako da unakrsnim vezanjem dvije ili više polimernih niti može biti međusobno povezano putem jednog ili više mjesta.
Slično, također je normalno da se može primijeniti za unakrsno vezanje jedan ili više pogodnih unakrsno-vezujućih reagensa pomoću kojih se, kao što je prije opisano, skupine mogu unakrsno vezati na kovalentni i/ili nekovalentni način unutar polimerne niti i/ili skupine koje su povezane s nekoliko niti proizvoljno različito derivatiziranih polimera.
Načelno, kao reagensi za unakrsno vezanje mogu se koristiti svi odgovarajući spojevi što je poznato iz prethodne tehnike. Tako, primjerice, unakrsno vezanje može se izvršiti na kovalentno-reverzibilnina kovalentno-ireverzibilni način ili na nekovalentni način, pri čemu u slučaju unakrsnog vezanja na nekovalentni način valja primjerice spomenuti unakrsno vezanje pomoću ionskih interakcija ili interakcijama prijenosa naboja.
Kao unakrsno vezujući reagensi koji mogu dovesti do kovalentno-ireverzibilnog unakrsnog vezanja, treba spomenuti dvostruke i višestruke funkcionalne spojeve, kao primjerice diole, diamine ili dikarboksilne kiseline. Na taj način, primjerice, bivalentne unakrsne poveznice reagiraju s aktiviranim polimernim derivatom ili bar bivalentni aktivirani unakrsno-vezujući reagens reagira s neaktiviranim polimernim derivatom.
Može se izvršiti kovalentno-reverzibilno unakrsno vezanje, vezanjem sumpor-sumpor veze za disulfidni most između dvije skupine koje su vezane s jednom ili dvije polimerne niti.
Može doći do unakrsnog vezanja pomoću ionske interakcije, primjerice pomoću dva radikala od kojih jedan ima strukturnu jedinicu kvarterna amonijeva iona, a drugi ima strukturnu jedinicu
[image]
Unakrsno vezanje pomoću vodikovih veza može se izvršiti, primjerice između dviju komplementarnih aprova baza, npr. sljedećom strukturom
[image]
Sasvim općenito, polimeri koji se trebaju nekovalentno unakrsno vezati mogu se izgraditi u odnosu na mjesta unakrsnog vezanja na komplemenatrni način, pri čemu strukturne jedinice koje su međusobno komplementarne su primjerice kiselina/triamin ili uracil/melamin. Slično, u nekovalentnoj unakrsnoj vezi, reagens za unakrsno vezanje može biti komplementaran prema mjestima unakrsnog vezanja na polimernoj niti. Primjer je amino skupina na polimernoj niti i dikarboksilna kiselina kao reagens za unakrsno vezanje.
Amidna veza prema amino skupini polimera može se dobiti iz karboksilata pomoću vezivnih reagensa koji su poznati iz kemije peptida. Na isti način, karboksilna skupina koja je kovalentno vezana za polimer, unakrsno je vezana s amino skupinom polivinil amina, ili opet, vezana amino skupina unakrsno je vezana s karboksilnom skupinom, primjerice iz poliakrilata.
Suštinski, stupanj unakrsnog vezanja može biti proizvoljno odabran te se primjerice može skrojiti prema poljima primjene koji nakon toga slijede.
U stupnju (ii), reakcija bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje s polimerom koji ima bar dvije skupine može se također izvršiti u heterogenoj fazi, tj. na čvrstoj površini polimera. Povoljno, navedeni polimer je suspendiran u otapalu koje je slabe snage otapanja za primijenjeni polimer.
Za derivatiziranje polimera polimera kao i za primjenu dobivenog polimera na nosač, mogu se primijeniti gore opisani stupnjevi aktiviranja i derivatizacije kao i metode unakrsnog vezanja i prevlačenja.
S druge strane, također je moguće koristiti kao nosač polimer koji je poželjno derivatiziran u heterogenoj fazi bez daljnjeg materijala nosača.
U sljedećoj realizaciji, poželjno je da se gore opisani derivatizirani polimeri koji su sintetizirani u homogenoj ili heterogenoj fazi mogu primijeniti na nosač u stupnjevima. U tu svrhu, u barem jednom stupnju, bar jedan sloj bar jednog polimera je vezan za materijal nosača i u barem jednom sljedećem stupnju bar jedan daljnji sloj bar jednog polimera se primjenjuje na bar jedan polimerni sloj koji je vezan za materijal nosača. Odgovarajuće metode opisane su u WO 01/38009.
Ovdje, stupnjevita primjena bar jednog polimera može se realizirati sukladno svim pogodnim metodama koje osiguravaju da se po stupnju primjenjuje bar jedan sloj polimera tako da se slojevita struktura polimera primjenjuje na materijal nosača.
U prvoj realizaciji navedene metode, u barem jednom koraku u kojem je bar jedan sloj bar jednog polimera vezan za nosač, otopina bar jednog polimera je u kontaktu s materijalom nosača u reakcijskim uvjetima u kojima bar jedan polimer nije vezan na materijali nosača, te se nakon toga reakcijski uvjeti variraju na način da je bar jedan polimer vezan za materijal nosača ili, u drugoj realizaciji, otopina bar jednog polimera je u kontaktu s materijalom nosača u reakcijskim uvjetima u kojima je otopina bar jednog polimera u theta uvjetima.
Ovdje, otopina koji je u kontaktu s materijalom nosača sukladno prvoj realizaciji može imati jedan ili više otapala, pri čemu se bar jedan polimer otapa u otapalu ili u smjesi otapala, ili može također biti koloidno otopljen ili također suspendiran, primjerice u obliku nano suspenzije.
Zatim, reakcijski uvjeti su odabrani na način da se kontaktiranjem otopine s materijalom nosača prvo ne dešava vezanje bar jednog polimera za materijal nosača. Primjerice, navedeni reakcijski uvjeti prilagođeni su pomoću jednog ili više pogodnih otapala. U tu svrhu, primijenjena su poželjna otapala u kojima je bar jedan polimer dobro topljiv da se vezanje za materijal nosača zaustavlja.
U značenju ovog izuma, pojam “polimer nije vezan za materijal nosača” ima značenje da se pomoću mjerenja koeficijenta razdjeljenja ne može detektirati nikakvo vezanje.
Slično, navedeni reakcijski uvjeti mogu se postići odgovarajućim izborom temperature, pri čemu, primjerice, otopina je u kontaktu s materijalom nosača pri temperaturama koje su tako visoke da je vezanje bar jednog polimera za materijal nosača zaustavljeno.
Nadalje, navedeni reakcijski uvjeti mogu se postići odgovarajućim podešavanjem otopine polimera u slučaju kada je vezanje bar jednog polimera za nosač materijala ovisno o pH.
Slično, također je razumljivo da se prvo spriječi vezanje bar jednog polimera za materijal nosača odgovarajućim kombiniranjem dviju ili više ovih metoda.
Pomoću ovog specifičnog tipa reakcijskog vodiča, između ostalog se postiže da se reakcijska stanja mogu izbjeći, među kojima je to da bar jedan polimer koji je u kontaktu u otopini taloži.
Što se tiče kontakta otopine bar jednog polimera s bar jednim materijalom nosača, načelno su prihvatljivi svi odgovarajući procesni uvjeti.
Tako, primjerice, moguće je kontaktirati otopinu koja sadrži bar jedan polimer s materijalom nosača. Slično je normalno da je prvo kontakt materijala nosača s bar jednim otapalom i zatim da se ubaci u bar jedno otapalo bar jedan polimer. Na sličan način je moguće prvo dovesti u kontakt materijal nosača s bar jednim otapalom i zatim dodati otapalo koje sadrži bar jedan polimer. Ako su primijenjena dva ili više polimera, razumljivo je da se odvojeno otopi svaki polimer ili zajedno s jednim ili više drugih polimera u jednom otapalu ili smjesi otapala, odnosno, da se kombinirano ili odvojeno dovedu u kontakt pojedine otopine od kojih bar jedna uključuje bar jedan polimer, s materijalom nosača koji je već otopljen ili je koloidno otopljen ili je suspendiran u bar jednom otapalu.
Načelno, već prije opisan materijal nosača je prilagođen, na kojega se bar jedan polimer može primijeniti vezanjem. Ako su primijenjena dva ili više polimera koji su međusobno različiti, dovoljno je ako se jedan od polimera može primijeniti na materijal nosača. Također je prihvatljivo ako se dva ili više različitih polimera može primijeniti na materijal nosača vezanjem.
Ako se dva ili više polimera međusobno razlikuju i dva ili više materijala nosača se međusobno razlikuju među onima koji su primijenjeni, onda je između ostalog razumljivo da su polimeri primijenjeni na sve materijale nosača. Slično je normalno da se jedan ili više polimera može primijeniti na jedan ili više materijala nosača. te da se jedan ili više polimera međusobno različitih može primijeniti na jedan ili više materijala nosača koji su međusobno različiti.
Nadalje, mogu se primijeniti daljnji polimeri i spojevi, kao što su općenito poznati aditivi, pri čemu se vezanje polimera za nosač materijal također može izvršiti pomoću drugih interakcija i/ili metoda. Nadalje, polimeri ili/i spojevi koji su prisutni u otopini ne mogu se primijeniti na nosač i primjerice ostaju o otopini. Između ostalog, razumljivo je da se u daljnjem koraku primjenjuje bar jedan od navedenih polimera, primjerice na materijal nosača koji je u kontaktu s otopinom koja sadrži navedeni polimer prije sljedećeg koraka.
Sukladno prvoj realizaciji, nakon dovođenja u kontakt reakcijski uvjeti se mijenjaju tako da se sada vrši vezanje bar jednog polimera za nosač.
Kao što je prije opisano, razumljivo je da u slučaju kada se primjenjuje dva ili više različitih polimera ili/i dva ili više različitih materijala nosača, polimer bude vezan za jedan materijal nosača.
Što se tiče variranja reakcijskih uvjeta, sve promjene su prihvatljive ako pogoduju da se omogući vezanje bar jednog polimera za materijal nosača.
U slučaju da je vezanje temperaturno ovisno, normalno je da se vrši promjena temperature u smjeru koji favorizira vezanje. U sličnoj poželjnoj realizaciji, promijenjen je sastav otopine koja sadrži bar jedan polimer, ili je navedena otopina polako koncentrirana.
Što se tiče promjene sastava otopine koja sadrži bar jedan polimer, načelno su prihvatljive sve metode koje su prilagođene da se omogući vezanje pomoću navedene promjene.
U poželjnoj realizaciji, otopini se dodaje drugo otapalo u kojem bar jedan polimer koji je sadržan ima slabiju topljivost u odnosu na bar jedan polimer.
U sljedećoj realizaciji, sastav otopine je promijenjen tako da se dodaje bar jedan kiseli ili bar jedan bazični spoj ili smjesa njih dviju ili više pomoću čega se mijenja pH otopine na takav način da je moguće vezanje bar jednog polimera. Očigledno je da se dodaje jedna ili više otopina pufera na način da je vezanje bar jednog polimera moguće.
Nadalje, mogu se dodati odgovarajući spojevi, kao što su soli koje sadrže primjerice metalne katione ili odgovarajući organski spojevi, pomoću kojih dolazi do vezanja jednog od polimera.
Otopina koja sadrži bar jedan polimer također se može koncentrirati tako da koncentracija bar jednog polimera kojega treba vezati za materijal nosača uglavnom ostaje konstantna u otopini. Navedeno koncentriranje otopine vrši se odgovarajućim sporim vođenjem procesa pri čemu se koncentracija polimera uglavnom održava konstantnom.
Nadalje, dvije ili više gore navedenih metoda mogu se kombinirati na odgovarajući način uz uključenje promjene temperature. Tako, primjerice, razumljivo je da se varira sastav otopina kao što je prije opisano i da se sporo koncentrira otopina i/ili da se na odgovarajući način mijenja temperatura.
Ovisno o odabranim reakcijskim uvjetima, normalno je da se na materijal nosača primjenjuje jedan polimer ili više polimera koji su međusobno različiti. Između ostalog, razumljivo je da se odaberu reakcijski uvjeti tako da se dva ili više polimera koje su međusobno različita istovremeno primjenjuju na materijal nosača, pri čemu se jedan sloj generira na materijalu nosača koji uključuje dva ili više polimera koji su međusobno različiti. Ako se koriste dva ili više materijala nosača koji su međusobno različiti, razumljivo je primijeniti na svaki materijal nosač jedan sloj polimera koji može sadržavati jedan polimer ili više polimera koji su međusobno različiti.
Nadalje, također je moguće da se u jednom stupnju primijene dva ili više slojeva bar jednog polimera na materijal nosača, pri čemu je prvi sloj polimera vezan za materijal nosača, a drugi sloj polimera je vezan za prvi sloj, i, proizvoljno, svaki daljnji sloj polimera je vezan za odgovarajući prethodni sloj. Na taj način, načelno, svaki sloj koji sadrži polimer jednog tipa ili dva ili više polimera razlikuje se od svakog drugog.
Nadalje, sukladno drugoj realizaciji, otopina bar jednog polimera može biti u kontaktu s materijalom nosača u reakcijskim uvjetima u kojima se otopina bar jednog polimera nalazi u theta uvjetima. U odnosu na navedenu realizaciju, primjena bar jednog polimera za materijal nosača konkretno se zbiva tijekom kontaktiranja otopine s materijalom nosača.
Sukladno metodi koja je prije opisana, poželjno u prvom stupnju sloj bar jednog polimera primjenjuje se na materijal nosača te, u drugom stupnju, na navedeni prvi sloj drugi sloj, te u trećem stupnju, na the drugi sloj proizvoljno treći sloj, itd. U odnosu na odgovarajuće metode primjene, valja pogledati gore navedeno razmatranje.
Pojam “vezanje polimera za nosač” obuhvaća sve kovalentno-reverzibilne, kovalentno-nerevrzibilne i nekovalentne interakcije pomoću kojih bar jedan polimer može biti u interakciji s materijalom nosača ili/i s polimernim slojem koji je proizvoljno već primijenjen na materijal nosača, ili polimerni sloj koji je proizvoljno već primijenjen na polimerni sloj.
Sukladno, mogu se primijeniti praktički svi polimeri koji primjerice mogu stvarati takve nekovalentne interakcije. Ovdje je, između ostalog normalno da je bar jedna funkcionalna skupina pomoću koje polimer stvara bar jednu od navedenih interakcija u polimernoj niti ili/i u bar jednoj polimernoj niti bočnog lanca.
Međutim, primjerice, interakcije se mogu desiti pomoću ugljikovodikovih lanaca i drugih strukturnih jedinica putem van der Waals-ovskih interakcija.
U odnosu na kovalentno-reverzibilnu interakciju, valja spomenuti egzemplarno vezanje putem disulfidnih mostova ili putem nestabilnih estera ili imina, kao što su Schiff-ove baze ili enamini.
U sljedećoj realizaciji, mogu se također primijeniti na nosač u nederivatiziranom obliku svi polimeri ili/i kopolimeri koji su prije opisani, sve dok postoji mogućnost da, kao što je prije opisano, oni mogu stvarati kovalentne ili/i nekovalentne interakcije s bar jednim materijalom nosača.
Za derivatiziranje polimera koji se primjenjuju na nosač, mogu se koristiti aktiviranje i derivatiziranje koji su prije opisani, kojima eventualno slijede stupnjevi unakrsnog vezanja kao što je opisano u WO 00/32649 i WO 00/78825.
U navedenoj realizaciji, metoda sukladno izumu karakterizirana je da se prije kovalentnog vezanja bar dviju različitih skupina za polimer koji ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili su različite, navedeni polimer primjenjuje na nosač.
U sljedećoj konkretnoj realizaciji metode, polimer koje ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili koje su različite, može se također izravno dobiti polimeriziranjem ili polikondenziranjem bar dviju identičnih ili različitih funkcionaliziranih monomera.
Na taj način, poželjno, olefinski nezasićeni monomeri koji poželjno sadrže OH skupine, proizvoljno supstituirane aminske skupine, SH skupine, OSO3H skupine, SO3H skupine, OPO3H2 skupine, PO3H2 skupine, PO3HR skupine, COOH skupine i smjese dviju ili više njih, gdje R poželjno ima značenje alkilnog radikala, mogu se međusobno polimerizirati u prisutnosti materijala nosača sukladno poznatim metodama. Također, monomeri mogu nadalje sadržavati polarne skupine, kao primjerice -CN. Daljnji odgovarajući monomeri su primjerice etilen imin, alil amin ili vinil pirolidon.
Poželjno, kao polimerizacijske tehnike, možemo navesti emulzijsku polimerizaciju, suspenzijsku polimerizaciju, disperzijsku polimerizaciju i taložnu precipitaciju, pri čemu se polimerizacija vrši u prisutnosti nosača ili materijala nosača. Polimerizacija se može pokrenuti uobičajenim metodama, primjerice pomoću startera radikala kao što su azo spojevi ili peroksidi, pomoću kationskih ili anionskih startera ili ozračivanjem elektronima.
U jednoj realizaciji, moguće je izvršiti polimerizaciju tako da ne dolazi do reakcije između nastalih polimernih lanaca i površine nosača. Poželjno, navedena realizacija se koristi ako se kao jedan od dviju monomera primjenjuje hidrofilni monomer, kao što su etilen imin, alil amin ili vinil pirolidon. U prisutnosti hidrofilnog nosača, kao što je silikagel, normalno nastali polimer je jako adsorbiran na površini nosača.
Za povećanje stabilnosti prevučenog nosača, polimer može također biti unakrsno vezan za nosač. Poželjno, to se postiže zagrijavanjem, pri čemu funkcionalne skupine prvog adsorbiranog polimera reagiraju s nosačem odnosno funkcionalne skupine nosača reagiraju s polimerom, pri čemu dolazi do vezanja.
Međutim, također je moguće izvršiti (ko)polimeriziranje tako da se polimer izravno kemijski veže na površini nosača. Navedena realizacija je poželjna, nastaju li konkretno stabilni prevučeni nosači. U tu svrhu, nosač može imati skupine koje reagiraju u uvjetima polimerizacije s polimernim lancima koji nastaju na površini nosača. Međutim, također je moguće da funkcionalne skupine polimera reagiraju s površinom nosača. Ako se kao materijal nosača koristi silikagel, silikolne skupine koje se nalaze na površini silikagela mogu sudjelovati u polimerizaciji bar dviju funkcionaliziranih monomera, pri čemu se nosač i polimer međusobno vežu. Također je moguće, primjerice, dodati vinil silane za površinu nosača, čije vinilne skupine sudjeluju u kopolimeriziranju bar dviju identičnih ili različitih funkcionaliziranih monomera.
Za daljnje povećanje stabilnosti nastale nepokretne faze, polimerizacija dviju identičnih ili različitih funkcionaliziranih monomera se može također izvršiti u prisutnosti jednog ili više unakrsno-vezujućih reagensa. Unakrsno vezujući reagensi su, primjerice, bifunkcionalni spojevi kao što su divinil benzen ili etilen glikol diakrilat.
Također, bar dvije identične ili različite funkcionalizirane monomerne komponente koje poželjno imaju skupine koje su prije navedene mogu biti polikondenzirane međusobno u prisutnosti materijala nosača sukladno poznatim metodama.
Na taj način, mogu se primijeniti također metode i reagensi koje se zasnivaju na ONB-C1 kao što je opisano u WO 00/32649 i WO 00/78825.
Poželjno, dobiveni funkcionalizirani polikondenzati mogu biti od polifenilena, poliestera, poliamida, polietera, polieter ketona, polieter sulfona, poliuretana ili polisiloksil silane tipa. U ovom reakcijskom tipu, mogu se također proizvesti miješani polikondenzati. Na taj način, polikondenziranje se može izvršiti u otopini kao i u taljevini.
Poželjno, koriste se polikondenzati poliesterskog tipa. Za povećanje stabilnosti, oni se mogu dalje unakrsno povezati dodatkom daljnjih polifunkcionalnih spojeva, kao što su polivalentni alkoholi, kao što su trimetilolpropan, pentaeritrol ili ugljikohidrat. Također, unakrsno vezanje putem polifunkcionalnih izocijanata je moguće, pod uvjetom da navedeni poliesteri imaju skupine koje reagiraju s izocijanatnom skupinom. Primjerice, poliesteri koji sadrže hidroksilne skupine mogu reagirati s poliizocijanatima, pri čemu se ugrađuju poliester/uretan jedinice.
Primjerice, dobiveni prevučeni materijal nosača može se izdvojiti filtriranjem reakcijske smjese koja se dobije u polimerizaciji ili polikondenzaciji, te se može pročistiti ispiranjem s odgovarajućim otapalom od čestica polimera ili polikondenzirajućih čestica koje nisu vezane na površini materijala nosača.
Sukladno, metoda sukladno izumu karakterizirana je na taj način da se polimer koji ima bar dvije funkcionalne skupine koje su identične ili koje su različite izravno dobiva na nosaču polimeriziranjem ili polikondenziranjem bar dviju identičnih ili različitih funkcionaliziranih monomera.
Također je moguće izvršiti prije opisano polimeriziranje što dovodi do prevlačenja nosača što je analogno poznatoj “tehnici utiskivanja” u prisutnosti supstrata koji se kasnije prepoznaje. U jeziku se upotreba navedene tehnike, za pojam supstrat se često rabi naziv predložak.
Uvjet za navedeno polimeriziranje je da monomeri koji imaju bar dva identična ili različita funkcionalizirana monomera već imaju skupine koje su sposobne za vezanje. Na taj način, poželjno, svaki od navedenih monomera ima jednu navedenu skupinu, pri čemu su skupine različite.
Međutim, također je moguće primijeniti monomere koji već imaju bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje.
Poželjno, polimerizacija se vrši u prisutnosti tvari koja stvara pore.
Da bi se izvršila polimerizacija, mogu se rabiti gore opisane polimerizacijske tehnike.
Nakon odvajanja ili ispiranja supstrata s pogodnim otapalima, u stupnju (ii) dobije se bar jedan sorbent s prethodno stvorenim interakcijskim prostorom za supstrat.
Poželjno, za navedenu realizaciju, odabrani su monomeri koji se koriste za polimerizaciju tako da polimer koji nastaje na nosaču ima okvir (scaffold) koji je krut i unakrsno vezan koliko je to moguće, tako da je interakcijski prostor stabilan koliko je to moguće. Tako, poželjno, za bar jedan od funkcionaliziranih monomera, koriste se akrilna kiselina ili metakrilna kiselina ili derivati ili njihove smjese što, što je općenito poznato, omogućuje proizvodnju polimera ili kopolimera s visokim temperaturama prijelaza. Osobito pogodni monomeri su primjerice metakrilna kiselina i etilen glikol dimetakrilat.
Sljedeći primjer je polimerizacija metakrilne kiseline s hidroksietilakrilatom, pri čemu se dobije polimer koji ima karboksilne i hidroksilne skupine koje su sposobne za vezanje.
Međutim, također je moguće izvršiti gore opisanu polikondenzaciju što dovodi do prevlačenja nosača u prisutnosti supstrata koji će kasnije biti prepoznat, pri čemu se kao monomeri koriste takvi spojevi koji već imaju različite skupine koje su sposobne za vezanje. Poželjno, svaki monomer ima jednu od navedenih skupina, pri čemu su skupine različite.
Međutim, također je moguće koristiti monomere koji već imaju bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje.
Nakon uklanjanja ili ispiranja supstrata s pogodnim otapalima, u stupnju (ii) dobije se bar jedan sorbent s unaprijed oblikovanim interakcijskim prostorom za supstrat.
Sukladno, navedena realizacija je također karakterizirana time što polimer neposredno nastaje na nosaču pomoću polimerizacije ili polikondenzacije bar jednog monomera koji ima bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje, ili bar dviju monomera od kojih svaki ima bar jednu skupinu koja je sposobna za vezanje, pri čemu su navedene skupine različite, pa dolazi do polimerizacije ili polikondenzacije u prisutnosti supstrata kojega kasnije treba vezati.
Poželjno, u realizacijama u kojima se polimerizacija ili polikondenzacija navedenih monomera izravno izvršava u prisutnosti nosača, polikondenzacija ili polimerizacija se izvršava u prisutnosti bar drugog ili trećeg monomera koji nemaju skupinu koje je sposobna za vezanje. Na taj način, bar jedan drugi ili treći monomer imaju funkciju razmaknice.
Nije nužno zahtijevati da bar dvije različite skupine koje su potrebne za vezanje bar bivalentnog supstrata za bar jedan sorbent budu vezane za polimer. Također je moguće izravno imobiliziranje u stupnju (ii) skupine na površini nosača bez upotrebe polimera.
Poželjno, imobiliziranje se izravno vrši na nosaču, ako je navedeni nosač izgrađen od anorganskog materijala. Poželjno, anorganski materijali su silikagel ili glinica.
Poželjno, imobiliziranje se vrši pomoću reagensa za aktiviranje i/ili silaniziranje. Povezivanje s površinom nosača može se također izvršiti korištenjem razmaknice (spacer).
Poželjno, kao reagensi za aktiviranje, mogu se primijeniti reagensi koji su opisani u WO 00/32648.
Poželjno, reagensi za silaniziranje također obuhvaćaju takve silikonske spojeve koji mogu izvršiti reakciju hidrosililiranja.
Poželjno, kao reagensi za silaniziranje primijenjeni su poželjno klorsilani, alkoksisilani i silazani.
Ovdje, u jednoj realizaciji, spoj koje ima skupinu koja je neophodna za vezanje supstrata, može prvo reagirati s odgovarajućim silikonskim spojem. Nakon toga, produkt može biti imobiliziran pomoću hidroksilne skupine koja je na površini nosača uz stvaranje kovalentne veze kisik/silicij. Primjerice, alkil radikali koji proizvoljno mogu biti supstituirani, primjerice sa skupinama amino, urea, eter, amid i karbamat, mogu tako biti imobilizirani na površini korištenjem alkiliranih silana.
Primjerice, moguće je na taj način imobilizirati na površini nosača 3-aminopropil radikal putem atoma silicija. Zatim, amino skupine mogu dalje reagirati, primjerice s kiselinskim kloridima do amida. Mogu se koristiti alifatski, poželjno aromatski kiselinski kloridi, kao i aktivirane komponente, konkretno ONB-aktivirane komponente kao što je opisano u WO 00/32649 i WO 00/78825.
Primjeri silikonski spojevi pomoću koji se alkil radikali mogu primijeniti na nosač su metiltriklorsilan i oktiltriklorsilan, pomoću kojih s emogu ubaciti razmjerno kratkolančani ili srednjelančani radikali, kao i oktadeciltriklorsilan, dokosiltriklorsilan i trikontiltriklorsilane pomoću kojih se mogu ubaciti razmjerno dugi lanci. Primjerice, ubacivanje alkil radikala koji sadrži amino skupinu moguće je s 3-aminopropiltrietoksisilanom.
Nadalje, moguća je upotreba silil glicidil etera koji, nakon hidrolize, daju diole koje također nazivamo dio faze.
S druge strane, također je moguće da prvo reagira površina nosača sa silikonskim spojem koji ima drugu funkcionalnu skupinu ili više funkcionalnih skupina. Nakon toga, skupine koje su odabrane ili određene za vezanje i koje su imobilizirane na nosaču, mogu se ubaciti pomoću odgovarajućih spojeva putem jedne ili više funkcionalnih skupina.
Primjerice, za primjenu na površini nosača, mogu se koristiti silikonski spojevi koji imaju dvostruku vezu. Skupine koji su namijenjene za vezanje mogu se ubaciti putem navedene dvostruke veze. Primjeri pogodnih silikonskih spojeva su vinilsilan ili (met)akriloksipropiltrimetoksisilan.
Opisane metode mogu se također koristiti u kombinaciji.
Proizvoljno, vezanje skupina koje su namijenjene za vezanje zbiva se pomoću razmaknice, pri čemu, poželjno, kratkolančani ugljikov lanac ugrađen je između skupina koje treba imobilizirati i nosača. Poželjno, povezivanje nosača i skupine koju treba imobilizirati može se realizirati pomoću odgovarajućih karbodiimida, kao što su diciklokarbodiimid, diizopropil karbodiimid, N-cikloheksil-N'-2-(N-metilmorfolino)-etil karbodiimid-p-toluen sulfonat, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid-hidroklorid, kloroformijati, karbonil diimidazoli ili diizocijanati, kao što je heksametilen diizocijanat. Također, mogu se koristiti homotelomerni ili heterotelomerni polietilen glikoli.
Pri korištenju razmaknice, poželjno se izrađuje ona u obliku četke u kojoj su bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje poželjno vezane bilo na kraju razmaknice i/ili su bočno vezane za razmaknicu.
Sukladno, navedena realizacija je također karakterizirana time što u stupnju (ii) bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje s drugim supstratom primijenjene na nosač pomoću reagensa koji je odabran iz skupa kojega sačinjavaju reagensi za aktiviranje, reagensi za silaniziranje i razmaknica, ili smjese dviju ili više navedenih reagensa.
Pokazalo se da nije dobro za supstrat-specifično vezanje primijeniti sorbente koji imaju bar dvije različite skupine koje su sposbne za vezanje skupina koje opisane u prethodnoj tehnici, dakle hidroksilne skupine iz silikagelnog skeleta (scaffold) odnosno silikolne skupine i alkilne skupine koje su ugrađene putem reagensa za silaniziranje. Tako, iz izuma se isključuju kombinacije skupina hidroksil, silikol i alkil ili hidroksil i alkil ili silikol i alkil, pri čemu su skupine imobilizirane na silikagelu.
Osobito pogodne skupine u smislu ovog izuma su s druge strane skupine kao što su fenil, hidroksifenil, karboksil, amin i amidne rezidue kao i hidroksil, indol, imidazol i guanidinske rezidue. Poželjno, navedene rezidue su vezane na površini nosača putem razmaknice uz nastajanje četkasto-oblikovane faze.
Sukladno tome, osobito poželjna realizacija je karakterizirana time što su u stupnju (ii) bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje s drugim supstratom odabrane iz skupa kojega sačinjavaju: fenil, hidroksifenil, karboksil, amin, amid, hidroksil, indol, imidazol i guanidinske rezidue.
Poželjno, bar jedan sorbent koji je dobiven sukladno prethodnim metodama, može se obraditi sukladno standardnim metodama na folije, filmove, mikrotitarske ploče o nano kuglice. Poželjno, bar jedan sorbent stupnja (ii) dobiva se i koristi u nano formatu.
Supstrat kojega treba vezati odnosno supstrat kojega treba selektivno vezati iz supstratne smjese dovodi se u kontakt u stupnju (iii) s bar jednim sorbentom. Na taj način, supstrat ili supstratna smjesa mogu se nalaziti u čvrstoj fazi, tekućoj fazi ili plinovitoj fazi, ili također u smjesama dviju ili više navedenih faza.
Poželjno, supstrat odnosno supstratna smjesa su u tekućoj fazi. Na taj način, mogu se koristiti otopine kao i suspenzije ili disperzije supstrata odnosno supstratna smjesa. Kao tekućine, mogu se koristiti voda i organska otapala, smjese organskih otapala i smjese koje sadrže vodu i organska otapala. U svim slučajevima, puferi, soli, kiseline, baze i modifikatori, kao što su ion-par reagensi mogu se nalaziti u tekućini u proizvoljnoj koncentraciji. Poželjno, koncentracija je od 10 mmolarne do 2 molarne u odnosu na jednu litru tekućine. Poželjno, supstrat kojega treba vezati je u vodenom obliku, primjerice kao tjelesna tekućina.
Za ispitivanje vezanja odnosno veznih svojstava prema sorbentu, mogu se koristiti poznate metode. Poželjno, veza između sorbenta i supstrata je nekovalentna veza.
Poželjno, interakcije koji su prije opisane su nekovalentne veze.
Međutim, također je moguće da bar jedan supstrat je kovalentno-reverzibilno ili kovalentno-ireverzibilno vezan za bar jedan sorbent.
Poželjno, u stupnju (iv), za ispitivanje snage vezanja bar jednog drugog supstrata za bar jedan sorbent stupnja (iii), odgovaraju kromatografske metode i metode interpretiranja. Konkretno, navedene metode su kromatografija na koloni, primjerice poznata HPLC metoda. U tu svrhu, bar jedan sorbent se koristi kao nepokretna faza na koloni. Iz sekvencije eluiranih supstrata, može se izravno zaključiti o njihovoj snazi vezanja u odnosu prema korištenim sorbentima. Najjače vezani supstrat eluira se kao posljednji supstrat.
Moguće je izvršiti frontalnu analizu u kojoj se razrijeđene otopine supstratne smjese koja se odvaja primjenjuju na stacionarnu fazu. Najjače vezani supstrat može se razlikovati od supstrata koji su manje čvrsto vezani na ovaj način, jer on posljednji dospijeva u eluat.
Međutim, mogu se također izvršiti poznate tehnike eluiranja, gdje su relativno koncentrirane otopine supstratne smjese primijenjene na vrh kolone i zatim eluirane s eluentom. Slabo vezani supstrati prvi dospijevaju u eluat. Najjače vezani supstrat može biti također desorbiran korištenjem eluenta koji vrši jače eluiranje.
Poželjno, može se također koristiti mikrokalorimetrija. Pri tome se mjeri adsorpcijska toplina koja se oslobađa tijekom vezanja supstrata za sorbent.
Druga metoda koja se može povoljno primijeniti je površinska plazmon rezonancijska metoda u kojoj se određuje rezonancijska frekvencija pobuđujućih elektrona koja ovisi o fizičkim svojstvima barijernog sloja supstrata i sorbenta, što također ovisi o jačini vezanja.
Poželjno, također se kao test može koristiti metoda fluorescencijskog obilježavanja, pri čemu su supstrati obilježeni s fluorescentnom bojom samo i fluoresciraju samo ako reagiraju s komplementarnim receptorom.
Sljedeća metoda je enzim vezana imunosorbentna metoda analize (ELISA), u kojoj se antigeni koji su vezani za sorbent mogu detektirati tretiranjem s imunoreagensima. Također su iskoristive kompetitivne i nekompetitivne analize, među njima radioanalize.
Sukladno, navedena realizacija izuma karakterizirana je time što se u stupnju (iv) za ispitivanje snage vezanja supstrata za sorbent koristi metoda koja je odabrana iz skupa kojega sačinjavaju kromatografija, mikrokalorimetrija, površinska plazmon rezonancija, fluorescencijsko obilježavanje, kompetitivne i nekompetitivne analize uključujući radioanalizu i ELISA.
Iz snage vezanja, može se dobiti informacija koji od sorbenata, odnosno koja od primijenjenih skupina je odgovorna za vezanje supstrata. Tako, navedena metoda omogućuje da se izdvoji, identificira i karakterizira navedeni supstrat. Tako je moguća procjena funkcije i svojstava supstrata.
Sukladno tome, metoda za selektivno vezanje navedenog supstrata je karakterizirana time što također obuhvaća stupanj (v):
(v) izdvajanje bar jednog drugog substrata.
Nadalje, metoda za selektivno vezanje navedenog supstrata također je karakterizirana time što dodatno obuhvaća stupanj (vi):
(vi) karakteriziranje i identificiranje bar jednog drugog supstrata.
Konkretno, sorbenti koji su dobiveni sukladno novoj metodi pogodni su za selektivno vezanje prirodnih supstrata ili prirodnih tvari kao i sintetskih tvari. Zajedničko je za navedene supstrate i tvari što imaju farmakofore, tako da prostorni raspored skupina čini osnovicu za biološki učinak u živim organizmima. Farmakofor veže tvar za vezujući džep prirodnog receptora. Farmakofor se veže za okvir koji se u engleskoj literaturi također naziva scaffold.
Poželjno, prirodni supstrati i agensi obuhvaćaju aminokiseline, oligopeptide, nukleotide, nukleozide, proteine, glikoproteine, antigene, antigenske determinante, antitijela, ugljikohidrate, enzime, koenzime, fermente, hormone, alkaloide, glikozide, steroide, vitamine, metabolite, viruse, mikroorganizme, tvari koje su sadržane u biljnim i životinjskim tkivima, stanice, stanične fragmente, stanične odjeljke, stanične ulomke, lektin, flavilijeve spojeve, flavone i izoflavone.
U kontekstu izuma, od osobitog interesa je disekcija prirodnih receptora i enzimi ili drugi proteini farmakološke aktivnosti, da se generira s njihovom pomoći zbirka sorbenata sukladno izumu i da se rabe navedeni sorbenti sukladno izumu. Poželjno, navedeni receptori su unutarstanični ili proteini koji su smješteni na membrani koji mogu vezati sintetske ili prirodne agense.
Unutarstanični receptori mogu se dobiti iz citoplazme i iz stanične jezgre. Takvi receptori odnosno sorbenti koje imaju bar dvije vezujuće skupine navedenih receptora mogu se koristiti za selektivno vezanje steroidnih hormona, kao što su glukokortikoidi, mineralokortikoidi, androgeni, estrogeni, gestageni, vitamin D hormoni, kao i retinoidi ili hormoni štitnjače.
Receptori koji su smješteni na opni, a njihove skupine mogu se primijeniti na sorbente sukladno izumu, su guanin/nukleotid/protein-vezani receptori, ion-kanal receptori i enzim-vezani receptori.
Konkretno, za medicinsku terapiju, među skupinom guanin/nukleotid/protein-vezanih receptora su značajni neurotransmiterski receptori, kao što su adeninski receptori i adrenergični receptori, ATP-(P2Y) receptori, dopaminski receptori, GABAB receptori, (metabotropni) glutamatni receptori, histaminski receptori, muskarinski receptori, opioidni receptori i seretoninski receptori. U navedenoj skupini su hormonski receptori i mediatorski receptori, primjerice adiuretin, glikogen, somatostatini i prostaglandini.
Ion-kanalni receptori obuhvaćaju ATP-(P2X) receptore, GABAB receptore, (ionotropne) glutamatne receptore, glicinske receptore, 5-HT3 receptore i nikotinske receptore.
Među enzim-vezanim receptorima su receptori s tirozin kinaza aktivnošću activity, receptori s associated tirozin kinazama, s guanilat ciklaza aktivnošću te receptor/serin/treonin kinaze.
Poželjno, sintetski agensi obuhvaćaju farmaceutike i sredstva za zaštitu bilja.
Primjerice, farmaceutici su tvari koje djeluju na živčani sustav (psihotropici, barbiturati, analeptici, analgetici, lokalni i opći anestetici, mišićni relaksansi, antikonvulzanti, antiparkinsonska sredstva, antimetici, sredstva koja djeluju na ganglije, simpatička sredstva, parasimpatička sredstva); koje djeluju na hormonski sustav (hipotalamus, hipofiza, štitnjača, paratiroidna žlijezda i bubrežni hormoni, hormoni timusa, sredstva koja djeluju na endokrini dio gušterače, nadbubrežne žlijezde, gonada); koje djeluju na medijatore (histamin, serotonin, eikozanoidi, faktori koji djeluju na trombocite, kinini); koje djeluju na kardiovaskularni sustav; koje djeluju na dišni sustav (antiastmatici, antitusici, ekspetoranti, surfaktanti); koje djeluju na gastrointestinalni sustav (probavni enzimi, hepatici); koje djeluju na bubrege i niži urinarni trakt (diuretici); koje djeluju na oči (oftalmici); koje djeluju na kožu (dermatoterapeutici); tvari za profilaksu i terapiju zaraznih bolesti (farmaceutici s antibakterijskim djelovanjem, antimikotici, kemoterapeutici za bolesti virusa i protozoa, antihelmintici); koje djeluju na maligne tumore (antimetaboliti, citostatici, topoizomerazni inhibitori, inhibitori mitoze, antibiotici koje imaju citostatičko djelovanje, hormoni i hormonski antagonisti); koje djeluju na imunološki sustav i tvari koje imunološki djeluju (serumi, imunomodulatori, imunosupresivi).
Tvari za zaštitu bilja su primjerice insekticidi, herbicidi, pesticidi i fungicidi.
Primjeri spojeva i klasa spojeva sintetskih sredstava su fenotiazini i njihovi analozi, butirofenoni i difenilbutilpiperidini, benzamidi, benzodiazepini, hidroksitriptofani, kafeini, amfetamini, opioidi i morfinei, fetidini i metadoni, derivati salicilne kiseline i acetilsalicilne kiseline, derivati arilpropanonske kiseline, derivati antranilne kiseline, derivati anilina, derivati pirazola, sulfapiridini, hidroksiklorokin i klorokin, penicilamin, N-metilirani barbiturati i tiobarbiturati, dipropiloctene kiseline, hidantoini, dopamini, noradrenalin i adrenalin, ergot alkaloidi, derivati karbaminske kiseline, fosforne kiseline, beladonna alkaloidi, hormoni hipotalamusa, HVL hormoni, hormoni hipofize, tiouracili i merkaptoimidazoli, sulfoniluree, histamini, triptani, prostaglandini, dipiradimoli, hirudini i derivati hirudina, tiazidi, psoraleni, benzilperoksidi i azelaična kiselina, vitamin A, vitamin K, vitamin B1, B2, B6, amid nikotinske kiseline, biotin, vitamin B12, vitamin C, halogeni spojevi, aldehidi, alkoholi, fenoli, N- heterociklički spojevi, piretrini i piretroidi, esteri fosforne kiseline, esteri tiofosforne kiseline, esteri karbaminske kiseline, 6-laktami, aminoglikozidi, tetraciklini, fluorokinoloni, oksazolidinoni, diaminobenzilpirimidini, pirazinamidi, griseofulvin, aziridini, aktinomicini, antracoklini, citokini, monoklonska i poliklonska antitijela. Nadalje, mogu se spomenuti antigenske determinante, lektini, flavilijski spojevi, flavoni i izoflavoni kao i monosaharidi i oligosaharidi.
Sintetska sredstva mogu se također prirediti korištenjem prirodnih tvari. Nadalje, navedeni pojam uključuje također potencijalne tvari kao i tvari koje imaju farmakofore kao i okvir (scaffold), za kojega se vežu farmakofori.
Kao što je već prije navedeno, konkretno, nova metoda za selektivno odvajanje navedenog supstrata prilagođena je da se dobiju informacije može li proizvoljni supstrat općenito biti u interakciji s prirodnim receptorom. Obrnuto, također je moguće korištenjem primjerice svih skupina koje su relevantne za prepoznavanje supstrata dobiti biblioteke sintetskih molekularnih područja, primjerice epitopa, dijelovi kojih sadrže dva, tri ili više različitih interakcijskih mjesta. Kontaktom poznatog agensa s navedenim bibliotekama sintetskih receptora, dobije se informacija o vjerojatnosti tipa vezanja na prirodnom receptoru.
Tako, u ovom izumu korišteno je novo komplementarno načelo koje obuhvaća na strani receptora odnosno sorbenta i na strani supstrata bar dvije različite rezidue među spojevima ili skupinama, koje su odgovorne za vezanje u spojevima. Poželjno, na taj su način odabrani spojevi iz skupa kojega sačinjavaju aminokiseline, ugljikohidrati, nukleotidi, nukleozidi, pirimidinske baze i purinske baze.
Međutim, iz svih mogućih kombinacija navedenih bivalentnih molekularnih područja, samo maleni odabir je sukladno komplementaran, dakle energijski favoriziran u svojoj interakciji. Velik broj kombinacija nije energijski favoriziran: primjerice svi parovi hidrofobnih rezidua s jedne strane, te hidrofilnih rezidua s druge strane, ili sve one rezidue koje se međusobno odbijaju.
Primjerice, sukladne su kombinacije sparenih skupina koje mogu vezati OH/fenil s amino/alkil reziduama, međutim ne OH/fenil s alkil/amino reziduama, jer se samo hidrofilni OH i amino rezidue kao i hidrofobni fenil i alkil rezidue međusobno vežu. Nadalje su sukladne kombinacije primjerice karboksil/amino s amino/karboksil reziduama kao i imidazol/hidroksil s amid/amid reziduama. Nesukladna u smislu navedenih razmatranja je kombinacija hidroksil/fenil s alkil/amino reziduama, jer hidrofilne rezidue ne mogu vezati hidrofobne rezidue.
U odnosu na dvadeset prirodnih aminokiselina, za dubletne komponente od kojih svaka ima bar jednu skupinu koja je sposobna za vezanje, dobiva se rezultat od ukupno 380 inačica. Za biblioteku koja obuhvaća samo smislene strukturne inačice, potrebno je bitno manje navedenih sintetskih dubletnih komponenti koje mogu također biti nazvane doublet receptori, jer u aminokiselinskom nizu funkcionalnost je identična, kao što su treonin i serin, glutamin i asparagin, za valin, izoleucin i leucin, itd. Dakle, općenito, dovoljno je koristiti od navedenih dvadeset aminokiselina poželjno njih sedam.
Budući da pokretne dodane receptorske skupine u sintetskom receptoru mogu mijenjati svoje prostorne koordinate sukladno zahtjevima supstrata, u svrhu željenog vezanja često nisu nužne same aminokiseline sa svojim dugim lancima, već samo glavne koje su nužne za interakciju. U tom smislu, često su funkcije arginina, licina, triptofana i histidina jednostavno predstavljene amino skupinom, pod uvjetom da je nužna samo funkcija baza.
Ako, primjerice, u značenju ovog izuma, od sedam aminokiselina načelno rabi njih četiri, nakon permutiranja dobije se jednostavno 35 različitih kombinacija dublet receptora.
Prema tome, sljedeći cilj izuma je također kombinacijska biblioteka koja se sastoji od kolekcije sorbenata koji imaju bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje bar jednog supstrata od kojih svaki ima bar dvije različite skupine, pri čemu bar dvije različite skupine sorbenata, odnosno, te bar jedan supstrat koji im je komplementaran.
Poželjno, navedena kombinacijska biblioteka karakterizirana je time što su bar dvije različite skupine sorbenata i bar dvije različite skupine bar jednog supstrata odabrane među skupinama koje su dijelovi različitih aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza i purinskih baza.
U sljedećoj realizaciji, kombinacijska biblioteka je karakterizirana time što proizvodnja sorbenata obuhvaća stupnjeve (i) i (ii):
(i) određivanje bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje prvog sintetskog ili prirodnog supstrata za sorbent,
(ii) primjena bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje drugog sintetskog ili prirodnog supstrata na nosač pri čemu svaki na taj način stvara bar jedan sorbent, odnosno, skupine su skupine koje su identične skupinama stupnja (i) ili su komplementarne skupinama stupnja (i), a drugi supstrat stupnja (ii) je identičan supstratu kao supstrat sukladno stupnju (ii) ili se razlikuje od prvog supstrata sukladno stupnju (i).
Sljedeći cilj izuma je također kompleks sorbent/supstrat koji je dobiven selektivnim odvajanjem supstrata. Navedeni kompleks sorbent/supstrat uključuje bar jedan sorbent s bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje i bar jedan supstrat koji ima bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje, pri čemu skupine koje su sposobne za vezanje bar jednog sorbenta i skupine bar jednog supstrata su međusobno komplementarne.
Poželjno, bar dvije različite skupine bar jednog sorbenta i bar dvije različite skupine bar jednog supstrata obuhvaćaju različite skupine koje su dio aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza ili purinskih baza.
U kompleksu sorbent/supstrat, vezanje između bar jednog sorbenta i supstrata postoji u nekovalentnoj, kovalentno-reverzibilnoj ili kovalentno-ireverzibilnoj vezi. Poželjno, veza je nekovalentno reverzibilna.
Sljedeći cilj izuma je također upotreba nove metode za selektivno vezanje supstrata za sorbente pomoću bar bivalentnih veza i upotreba kombinacijske biblioteke.
Mogućnost primjene je detektiranje interakcija receptor/agens kao i screening.
Poželjno, za detektiranje interakcija receptor/agens kao i za screening, koriste se gore navedeni agensi odnosno klase agensa.
Ovaj izum može se također koristiti za razvoj novih kandidata za agense (vodeće tvari). Navedene vodeće tvari mogu se optimizirati glede njihove aktivnosti, selektivnosti, biološke raspoloživosti, farmakokinetike i toksičnosti korištenjem nove metode odnosno kombinacijske biblioteke.
Na taj način, također je razumljivo da su agensi kandidati u interakciji samo s jednom sekcijom mjesta biološkog vezanja. Kombiniranjem i povezivanjem bar dviju takvih agensa kandidata koji vežu bar dvije sekcije mjesta biološkog vezanja, mogu se jednostavno naći nova sredstva. Navedeno traženje sredstava također funkcionira pri realizaciji visoko paraleliziranih metoda.
Daljnja mogućnost primjene je odvajanje stereoizomernih spojeva i spojeva s izomernom strukturom.
Nadalje, moguće je pročišćavanje i/ili odvajanje supstrata i supstratnih smjesa.
Poželjno, pročišćavanje i/ili odvajanje vrši se pomoću kromatografskih metoda. Kao daljnje pogodne metode mogu se spomenuti elektroforeza, elektrofokusiranje, gel elektroforeza, gel elektroforeza, paralelna kromatografija, paralelna flash kromatografija i kapilarne tehnike. U slučaju dovoljno velike selektivnosti, supstrat može biti izravno adsorbiran iz otopljene smjese dodatkom sorbenta, može biti izvučen i izdvojen filtriranjem u obliku kompleksa sorbent/supstrat.
Nadalje, mogućnosti primjene su uklanjanje štetnih tvari i produkata razgradnje iz smjes etvari, pri čemu te tvari mogu biti prisutne u maloj koncentraciji.
Poželjno, štetne tvari i produkti razgradnje mogu se izdvojiti iz tjelesnih tekućina, kao što je krv. Primjerice, navedene štetne tvari i produkti razgradnje postoje pri toksikaciji, kao metabolički produkti ili metaboliti. Oni mogu biti biogene prirode ili mogu nastati u samom tijelu, mogu biti primijenjeni izvana na spomenuto tijelo, primjerice preko kože, oralne sluznice ili injekcijom, primjerice u krvotok. Među štetnim tvarima i produktima razgradnje su također zmijski otrovi i intoksikanti.
Poželjno, novi sorbenti mogu se primijeniti u uređajima za dijalizu.
Također, moguće je uklanjanje štetnih tvari iz otapala, iz procesnih voda i iz procesa za proizvodnju prehrambenih artikala.
Također se pomoću izuma mogu provesti farmakokinetički testovi, poglavito za metaboliziranje i biološku raspoloživost.
Nova metoda za selektivno vezanje može se također blagotvorno koristiti za definiranje dinamički kombinacijskih biblioteka. U tu svrhu, iz smjese koja uz množinu edukata također sadrži željeni supstrat, poželjno neki agens, ovaj potonji izdvaja se sukladno izumu. Nakon toga, u smjesi se ponovo uspostavlja ravnoteža uz stvaranje sljedećeg supstrata. Metoda za odvajanje se ponavlja sve dok se više ne stvara supstrat.
Kao što je prije razmotreno, nove metode koriste se za ciljano i selektivno odvajanje supstrata iz smjese s bar jednim dodatnim supstratom.
Tako, sukladno izumu, pojam selektivno vezanje ima značenje da se supstrat odvaja iz smjese s bar jednim drugim pratećim supstratom na način da supstrat koji ima bar dvije različite skupine čini jaču vezu s bar dvije različite skupine sorbenta nego prateći supstrat.
S ovim izumom, prvi puta, interakcija mjesta i interakcija tipa su točno definirane pomoću sljedećih metoda, što je očigledno iz primjera:
ciljanim ubacivanjem vezujućih mjesta na receptoru u željenoj koncentraciji i kombinaciji, izuzimanjem, dodavanjem, variranjem ili blokiranjem pojedinih vezujućih mjesta na receptoru i na ispitanom supstratu, pri čemu je učinak na jačinu vezanja egzaktno (= energijski) određen, odnosno, spektroskopskim ispitivanjem i određivanjem adsorpcijskih izotermi.
Primjerice, uspoređivanjem s pojedinačnim doprinosima iz literature odgovarajućih nekovalentnih tipova vezanja, ukupna interakcija multivalentne veze može se iznenađujuće dobro predvidjeti. Ako je odgovarajuća energija veze određena u očekivanoj količini, moguće je zaključiti koje su skupine obuhvaćene vezom.
Tako, prvi puta, selektivnost se može ciljano oblikovati u odnosu na proizvoljno odabrani problem odvajanja.
U odnosu na ciljani spoj (supstrat) kojega treba odvojiti, nova tehnika obuhvaća izgradnju namjenske nekovalentne multivalentne interakcije koja se dovoljno razlikuje od nekovalentnih interakcija s kompetirajućim supstratima (prateće tvari).
Metode ovog izuma pokazuju visoke vrijednosti za selektivnost odvajanja koja se također jednostavno naziva selektivnošću. Na taj način, selektivnost odvajanja definirana je kao kvocijent odgovarajućih konstanti veza odnosno kapacitetnih faktora supstratnih veza koje se selektivno odvajaju od sorbenta, te konstanti veza za veze pratećeg supstrata za sorbent.
Primjerice, pri izuzimanju jedne karboksilne skupine u supstratu, selektivnost odvajanja postiže vrijednost veću od 35. Ako se zamijeni aromatski prsten s tročlanim prstenom, dobije se vrijednost 10.
Novom metodom, u tehničkom opsegu mogu se postići selektivnosti odvajanja koje su, u usporedbi s prethodnom tehnikom, iznenađujuće visoke i koje često omogućuju odvajanja koja dosad nisu bila kromatografski moguća.
Poželjno, ako je selektivnost odvajanja veća od 1,4, supstrat koji se selektivno veže s bar dvije skupine koje se mogu vezati za bar jedan sorbent odvaja se od smjese supstrata pomoću bar jednog sorbenta.
Poželjno, selektivnost odvajanja veća je od 2, poželjnije veća od 4, još poželjnije veća od 8.
Poželjnije su selektivnosti odvajanja veće od 10, poželjnije veće od 35.
Nadalje, jer konstanta veze izravno korelira s određivanjem Gibbs-ove energije što je poznato osobi koja poznaje ovo područje, također postoji korelacija između Gibbs-ove energije i selektivnosti odvajanja. Što je negativnija promjena Gibbs-ove energije �G za nekovalentnu vezu, to je jači komplementarni karakter vezanja skupina međusobno, te je također veća selektivnost odvajanja i odnosu na prateće tvari što, ubacivanjem skupine koje imaju sposobnost vezanja (s ciljanom tvari), ne unosi značajniju promjenu u odnosu prema Gibbs-ovim energijama (prema navedenoj skupini, odnosno prema sorbentu).
Štoviše, za postizanje selektivnost u odnosu prema proizvoljnom supstratnom paru, dovoljno je dodatno vezati jednu skupinu koja ima sposobnost vezanja u sorbent, sve dok navedena skupina nema komplementarnog partnera za jednog od oba supstrata koji se odvajaju.
Na opisani način, može se također detektirati postoji li i koji tip veze istovremeno postoji (tj. multivalencija). Navedena multivalencija, konkretno dostignuti skup vrijednosti za konstante veza i za Gibbs-ovu energiju su, međutim, moguća je samo onda ako supstrat može biti bar djelomično prostorno ugrađen induciranim usklađivanjem ili ako se konformacijski prilagođava prema receptoru.
Navedeno prilagođavanje je poželjno moguće s polimernom mrežom, pri čemu je stupanj unakrsnog vezanja polimernog nano filma odabran na način da još uvijek postoji dovoljno konformacijske pokretljivosti i time sposobnosti prilagođavanja prema strukturi supstrata. Poželjno, maleni supstrati s molarnim težinama koje su ispod 1000 Da su potpuno ugrađeni unutar polimerne mreže. Poželjno, veći supstrati kao što su peptidi ili proteini, vežu se s ograničenom kontaktnom površinom pri uronjavanju u polimernu mrežu što omogućuje multivalentnu interakciju, pa se ubacivanjem izbjegava da vezanje bude prejako.
Da bi se shvatio pojam izgradnje selektivnih multivalentnih vezujućih mjesta, često je neophodno ponuditi da nužna vezujuća mjesta budu konformacijski pokretna u prostoru. Štoviše, nužno je ponuditi dovoljno jaku vezujuću sklonost pomoću supstrata da bi se postigla konformacijska prilagodba (inducirano usklađivanje). Posljednje i ne najmanje bitno, bar dva neophodna interakcijska mjesta moraju biti prethodno uređena u prostoru s visokom koncentracijom da bi se izvršilo željeno vezanje u velikom broju temeljem konformacijske promjene.
Primjeri realizacije
Izum je ilustriran sljedećim primjerima:
Primjer 1: Selektivno vezanje N-blokirane aminokiseline kao supstrata za sorbente na osnovi polivinilamin/silikagel pomoću bar bivalentnih veza
Retencijska svojstva osam različitih derivata aminokiselina (supstrati u Tablici 1) ispitana su za četiri različita sorbenta na osnovi polivinilamin/silikagel (sorbenti u Tablici 2), pri čemu je kao metoda ispitivanja odabrana kromatografija. U nastavku, sorbenti su također nazvani stacionarna faza, dok su sintetski receptori također nazvani receptori, također u drugim primjerima.
Aminokiselinski derivati bili su derivati glutamina (1-4) i glutamata (5-8), kojima su amino skupine bile blokirane s četiri različite zaštitne skupine koje su acetil (Ac), tert-butiloksikarbonil (Boc), benziloksikarbonil (Z), odnosno fluorenil-metoksikarbonil (Fmoc).
[image]
[image]
Korištene receptorske faze bile su polivinilamin-prevučeni kuglasti silikagel s veličinom čestica od 20 µm i promjerom pora od 1000 Å. Metodom prevlačenja prvo je dobivena aminofaza A. Derivatizirane receptorske faze B do D sintetizirane su iz amino faze A sintezom u čvrstoj fazi sukladno poznatim metodama.
[image]
[image]
Sve receptorske faze još uvijek su imale mjerljivi sadržaj slobodnih amino skupina koje mogu biti podvrgnute ionskim interakcijama u protoniranom stanju s odgovarajućom anionskom skupinom supstrata, primjerice karboksilatnom skupinom. Nadalje, receptori C i D sadrže rezidue koje su primjerene za lipofilne interakcije.
Sadržaj amino skupina određen je iz krivulja kromatografskog proboja s 10 mM 4-toluensulfonskom kiselinom u DMF. Određene količine amino skupina po gramu receptorske faze sažete su u Tablici 3.
[image]
Za kromatografsko ispitivanje sa supstratima 1 do 8, kao pokretna faza korišten je vodeni tris-HCl-pufer koji ima pH 7,5. Eluiranje je izvršeno u izokratskim uvjetima s koncentracijama pufera od 10 do 500 mM.
Kao mjera za jačinu interakcije između supstrata i receptora u odgovarajućim otopinama pufera, korišten je relativni elucijski faktor k’ (kapacitetni faktor) koji ne ovisi o uređaju. On se može izračunati kao razlika elucijskog volumena za pik maksimuma i mrtvog volumena kolone podijeljeno s mrtvim volumenom kolone, što je predstavljeno sljedećom jednadžbom:
[image]
k’-vrijednosti supstrata u 10 mmolarnom odnosno 50 mmolarnom tris-HCl-puferu sažete su u Tablicama 4 i 5.
[image]
[image]
Uspoređivanje k’-vrijednosti unutar i između Tablica 4 i 5 rezultira sljedećim opažanjima i objašnjenjima opažanja:
1. Opažanje: Acetilirana receptorska faza B (ND 03001#2) nije se vezala čak i pri najnižoj koncentraciji pufera u značajnijoj količini (k’ = 1,6).
Objašnjenje opažanja: Navedeni receptor sadrži svega nekoliko amino skupina za moguću ionsku interakciju s karboksilnim skupinama supstrata. Ni acetilna skupina niti polivinilaminski lanci receptorske faze nemaju sposobnosti da sudjeluju u značajnijim lipofilnim interakcijama.
2. Opažanje: U 10 mmolar puferu, supstrati s dvije karboksilatne skupine (5-8) vezali su s faktorom od približno 20 do 40 jače nego odgovarajući supstrati sa samo jednom karboksilnom skupinom (1-4). U 50 mmolar puferu, vezanje dikarboksilata bilo je još jače s faktorom 10 do 25 nego vezanje monokarboksilata.
Objašnjenje opažanja: Očigledno, postoje ionske interakcije između karboksilatnih skupina supstrata i amino skupina receptora. Temeljem bivalentne interakcije, za dikarboksilate, navedene interakcije rezultiraju mnogo jačom vezom nego za supstrate sa samo jednom karboksilnom skupinom. U vodenom mediju, amidna skupina ne doprinosi značajno veznom doprinosu.
3. Opažanje: Pri povećanju koncentracije pufera od 10 do 50 mmolarne, snaga vezanja se smanjuje za monokarboksilate približno za čimbenik četiri, dok za dikarboksilate približno za čimbenik deset.
Objašnjenje opažanja: Također, ovaj rezultat može se objasniti ionskim interakcijama koje slabe s povećanjem koncentracije pufera. Očigledno, slabljenje je rezultat kompeticije puferskih soli s karboksilnim skupinama sipstrata za amonijeve skupine receptora. U slučaju jačeg vezanja supstrata 5-8, kompeticija puferskih soli ima jači učinak jer su obuhvaćene njihove karboksilne skupine.
4. Opažanje: Za inače identične supstrate, k’-vrijednosti drastično se povećavaju s veličinom organskih rezidua N-zaštitne skupine. Opseg navedenog povećanja vezanja bio je neovisan o koncentraciji pufera.
Objašnjenje opažanja: Pokazalo se da uz ionske interakcije između karboksilnih skupina supstrata i amonijevih skupina receptora postoje dodatne lipofilne interakcije između supstrata i receptora. Tako, pri prijelazu od malenih k velikim organskim reziduama u N-zaštitnoj skupini, jačanje vezanja ima učinak na receptorsku fazu C i D, za koje su receptorske skupine osobito pogodne za lipofilne interakcije.
Zaključak: S gore navedenim eksperimentima može se jasno potvrditi da sintetski receptori istovremeno mogu sudjelovati u dvije ili tri vezne interakcije s odgovarajućim supstratima, pod uvjetom da su receptor i supstrat komplementarni u odnosu na njihove funkcionalne skupine.
Dakle, može se zaključiti da se oblikovan receptor koji je odgovarajuće komplementaran u odnosu na ciljanu tvar, prateće tvari ili sporedne produkte, može lako odvojiti. Mjera za realizaciju odvajanja je kvocijent k’-vrijednosti, selektivnost alfa koja je opisana sljedećom formulom:
Selektivnost: alpha = k2'/k1'
Primjerice, alfa je približno 25 (263/9,7) s benzil/amino receptorskom fazom D za kromatografsko odvajanje Z-Gln (3) i Z-Glu (7) s 10 mmolarnim tris-HCl-puferom (pH 7,5) kao pokretnom fazom.
Na taj način, može se pokazati da postoji kvantitativna korelacija između odgovarajuće ciljano odbačene molekule rezidua i jačine vezanja.
Primjer 2: Vezanje flavanon naringenina kao supstrata za receptorske faze tvrtke instrAction pomoću bar bivalentnih veza
Interakcija između naringenina (Slika 1) i sedam različitih receptorskih faza tvrtke instrAction (Tablice 6 i 7) mjerena je u acetonitrilu kao otapalu. Za navedena mjerenja, korištena je izravna metoda ravnotežnog određivanja u tzv. „eksperimentu miješanjem u čaši“.
[image]
[image]
Za eksperimente miješanja u čaši, točno odmjerene količine receptorske faze (svaka približno 100-300 mg) suspendirane su u točno odmjerenim volumenima otapala (15 ml). Ovim suspenzijama, u obrocima, dodane su točno izmjerene količine naringenina (primjerice 1,0 ml 10 mmolarne otopine u acetonitrilu). Naringenin je razdijeljen između receptorske faze i otapala pri uspostavljanju dinamičke ravnoteže.
Stanje ravnoteže može se točno odrediti određivanjem koncentracije naringenina u otapalu pomoću „high performance“ tekućinske kromatografije (HPLC). Time se izravno dobiva količina tvari naringenina u tekućoj fazi (acetonitril). Količina tvari naringenina u receptorskoj fazi izračunata je kao razlika između dodanog naringenina i naringenina u otopini. U svakom eksperimentu miješanja u čaši, ravnoteža je ponovljeno određena (6-12 puta) s povećanjem koncentracije naringenina u sustavu. Za naringenin te dodatke i oduzimanja otapala, pažljivo je postignuta ravnoteža i uzeta u obzir pri računanju količina tvari.
[image]
[image]
Za svako uspostavljanje ravnoteže, dobiva se jedna točka na adsorpcijskoj izotermi (nanošenje receptor-vezani naringenin [RS] vs. naringenin u otopini [S]). Pomoću Langmuir-ova modela adsorpcijske izoterme, nelinearnom regresijom izračunate su konstante asocijacije (KA) i maksimalna nabojnost [R0].
Langmuir-ova izoterma: [RS] = [R0] × [S] / (1 /KA + [S])
Za osobito slabe interakcije, metoda nelinearne regresije ne može se primijeniti. U navedenim okolnostima, KA i R0 određuju se linearnom regresijom iz dijagrama prema Scatchard-u ([RS]/[S] vs. [RS]).
Na dijagramu sukladno Scatchardu, jednostavne Langmuir-ove izoterme su ravne crte:
Scatchard-ova linearizacija: [RS]/[S] = -KA × [RS] + KA × [R0]
Značajna prednost Scatchard-ova dijagrama je što se odstupanja od linearnosti mogu lako uočiti. Takva odstupanja mogu ukazati na receptorsku fazu koja ima istovremeno vezujuća mjesta različite vezujuće snage i broj veza.
Vrijednosti konstante asocijacije KA i maksimalna nabojnost R0 nalaze se u Tablici 8:
[image]
Opažanja i objašnjenja opažanja: Zbog svojih fenolnih hidroksilnih skupina, naringenin bi trebao imati polarne interakcije s primarnom amino skupinom amino faze A. U nepolarnom acetonitrilu, navedene interakcije bi se trebale dobro mjeriti. Postojanje jakih (KA2) i slabih vezujućih mjesta (KA1) može se objasniti time što naringenin očigledno ima sposobnost stvarati monovalentne, bivalentne i trivalentne polarne veze, što odgovara trima postojećim fenilnim skupinama.
U receptorskim fazama C, D i G, većina primarnih amino skupina faze A izvedena je s lipofilnim reziduama. Kada navedene rezidue ne bi doprinosile vezanju za naringenin, nabojnosti R0 navedenih faza trebale bi se smanjiti što odgovara manjem sadržaju amino skupina. Ravnotežne konstante trebale bi ostati približno jednake jer tip interakcija se ne bi trebao promijeniti. Ustvari, nabojnosti je djelomično jasno povećavaju, primjerice od 14,7 do 38,5 mmol/g faze za naftoil-izvedeni receptor (receptorske faze A i G). Navedeni rezultat može se objasniti amo dodatnim interakcijama između naringenina i derivatne skupine. Navedene slobodne receptorske skupine imaju zajedničko to što mogu biti podvrgnute lipofilnim interakcijama. Sa svoje strane, naringenin ima također lipofilne dijelove molekule da bi mogao dijeliti takve interakcije.
Iz toga slijedi da bi naringenin mogao istovremeno stvarati polarne veze s receptorskim fazama C, D i G, tj.s preostalim amino skupinama, te lipofilnim vezama s receptorskim skupinama MVS, BzlO odnosno NaphCar. Značajna je okolnost da se navedene lipofilne veze mogu uočiti u organskom otapalu (acetonitril). To znači da između naringenina i lipofilnih receptorskih skupina dolazi do kontakta koji kompetira s energijom solvatiranja lipofilnih skupina s organskim otapalom.
Dakle, konstante asocijacije KA s receptorskim fazama C, D i G sastavljene su od udjela polarnih i nepolarnih veza. Stoga, konstante asocijacije su ovdje niže od onih s amino fazom A. Očigledno, lipofilne veze su slabije od polarnih veza, što se opet može pripisati korištenim relativno polarnim organskim otapalima (acetonitril).
Receptorske faze E, F i H sadrže receptorske skupine koje mogu sudjelovati i u lipofilnim i polarnim vezama - sve tri sadrže amino skupine koje su ugrađene u djelomično produženu aromatsku strukturu. Zaista, obje najveće KA-vrijednosti mogu se uočiti s receptorskim fazama E i F. Može se pretpostaviti da je ovdje favorizirana zajednička akcija polarne i lipofilne veze, pri čemu su receptori C, D i G lipofilnih receptorskih skupina ugrađeni na račun amino skupina.
Rezultat: U ovom primjeru, pokazano je da u jednom otapalu supstrat (naringenin) može imati različite veze prema odgovarajućoj receptorskoj fazi. Pri pravilnom odabiru receptorskih skupina u nepokretnoj fazi, polarne i lipofilne interakcije za vezanje supstrata mogu biti istovremeno aktivirane. Sukladno, receptorske faze mogu biti sintetizirane koje su optimizirane za vezanje određenog supstrata ili supstratne skupine, jer različite mogućnosti vezanja su istovremeno prisutne i na taj način nastaju selektivni interakcijski prostori.
Primjer 3: Vezanje strukturno srodnih benzenskih derivata kao supstrata za receptorsku fazu tvrtke instrAction pomoću bar bivalentnih veza
Interakcija između strukturno srodnih benzenskih derivata i instrAction receptorske faze C (ND 02048#2, K1000-PVA-FA-2-4-Dod-MVS-100) izmjerena je u nepolarnoj smjesi organskih otapala. Uz skupine 4-metilvalerijanske kiseline (MVS), receptorska faza C također sadrži 0,16 mmol/g amino skupine. Otapalo je smjesa metil-t-butil eter/heptan (1 dio/3 dijela volumenski). U navedenoj nepolarnoj smjesi otapala, s jedne strane valja očekivati pretežno polarne interakcije, dok s druge strane, sve tvari za testiranje su u njoj dobro topljive.
Konstante asocijacije (KA) i maksimalna nabojnost (R0) za interakciju između receptorske faze i ispitivane tvari određeni su pomoću tzv.”eksperimenta miješanjem u čaši”.
Za eksperimente miješanja u čaši, točno odvagnuta količina receptorske faze (svaka približno 200-350 mg) suspendirana je u točno odmjerenim volumenima otapala (15 ml). Navedenoj suspenziji dodana je u obrocima točno odmjerena količina supstrata. Supstrat koji se ispituje razdijeljen je između receptorske faze i otapala pri uspostavljanju dinamičke ravnoteže. Ravnotežno stanje može se točno odrediti određivanjem koncentracije supstrata u otapalu pomoću “high performance” tekućinske kromatografije (HPLC). Ovdje se izravno dobiva količina tvari supstrata u otapalu. Količina supstrata na receptorskoj fazi izračunata je kao razlika između dodanog supstrata i supstrata u otopini. Za svaki eksperiment miješanja u čaši, ravnoteža je ponovo određena (6-12 puta) s povećanjem koncentracije supstrata u sustavu. Ravnoteža je pažljivo postignuta za supstrat te dodatke i oduzimanja otapala što je uzeto u obzir pri izračunavanju količina tvari.
Za svako postignuto stanje ravnoteže, dobiva se jedna točka na adsorpcijskoj izotermi (nanošenje receptor-vezanog supstrata [RS] vs. supstrat u otopini [S]). Pomoću Langmuir-ova modela adsorpcijske izoterme, pomoću nelinearne regresije izračunati su ravnotežna konstanta za asocijaciju (KA) i maksimalna nabojnost (R0) su:
Langmuir-ova izoterma: [RS] = [R0] × [S] / (1/KA + [S])
Za osobito slabe interakcije, metoda nelinearne regresije ne može se primijeniti. U navedenim okolnostima, KA i R0 određuju se linearnom regresijom iz dijagrama prema Scatchard-u ([RS]/[S] vs. [RS]). Na dijagramu sukladno Scatchardu, jednostavne Langmuir-ove izoterme su ravne crte:
Scatchard-ova linearizacija: [RS]/[S]= -KA × [RS] + KA × [R0|
U Tablici 9, dobiveni interakcijski parametri Ka i R0 navedeni su zajedno s ispitivanim supstratima:
[image]
Opažanje o rezultatima: Iz Tablice 9 može se vidjeti da se snaga interakcije između ispitivane tvari i receptorske faze koja je predstavljena konstantom asocijacije KA, povećava s brojem supstituenata na benzenskom prstenu.
Benzenski prsteni sa samo jednim supstituentom imaju konstantu asocijacije koja je manja 40 l/mol, a vrijednosti su na granici mjerljivosti u opisanom mjernom sustavu.
Drugi supstituent na benzenskom prstenu doprinosi daljnjoj interakcijskoj mogućnosti za testiranu molekulu. Obje slabe interakcije u suradnji daju konstante asocijacije za supstituirane benzenske derivate koje približno predstavljaju produkt konstante asocijacije monosupstituiranih benzena. Sukladno, dobivene su KA-vrijednosti od 400 do 1000 1/mol.
Treći supstituent na benzenskom prstenu množi konstantu asocijacije disupstituiranog benzene sa svojim vlastitim, razmjerno slabim interakcijskim potencijalom (KA ~ 20-40 l/mol), i tako se dobije konstanta asocijacije od 17722 l/mol za benzene s tri supstituenta.
Na slici 2, Scatchard-ov dijagram prikazan je za 4-amino-3-nitrobenzonitril.
[image]
Slika 2: Scatchard-ov dijagram za različite koncentracije supstrata [S] 4-amino-3-nitrobenzonitrila
Ovdje, a, b i c imaju sljedeće značenje:
a: područje trivalentnih interakcija
[S] = 0,0044-0,043 mmol
KA3= 17,722 1/mol
R03 = 3,5 μmol/g faze
b: prijelazno područje trivalentnih i bivalentnih interakcija
[S] = 0,086 -0,30 mmol
KA2 = 2,350 1/mol
R02 = 16 μmol/g faze
c: područje bivalentnih interakcija
[S] = 0,40-0,98 mmol
KA1 = 855 1/mol
R01 = 33 μmol/g faze
Iz Langmuir-ove izoterme, ne dobiva se samo jačina interakcije u obliku konstante asocijacije KA, već također broj interakcijskih mjesta kao maksimalna nabojnost R0. Maksimalna nabojnost za trivalentne interakcije približno je pet puta manja nego R0 za bivalentnu interakciju. Ovo je izravno razumljivo jer se može pretpostaviti da u sintetskoj receptorskoj fazi ima manje vezujućih mjesta za tri istovremene interakcije u odnosu na dvije ili čak samo jednu interakciju. Uz trivalentna vezujuća mjesta, 4-amino-3-nitrobenzonitril može također zauzeti bivalentna i čak monovalentna vezujuća mjesta, prirodno uz odgovarajuće manje jačine vezanja (KA) i veće maksimalne nabojnosti (R0).
Navedene okolnosti prikazane su na Slici 2. Ako se odrede parametri KA i R0 s vrlo niskim koncentracijama supstrata, onda se dominantno uočava jaka, trivalentna interakcija (KA3 i R3). Slabija monovalentna i bivalentna vezujuća mjesta nisu značajnije zauzeta u takvim razrijeđenim otopinama. Ako se odrede KA i R0 s većim koncentracijama supstrata, dobivaju se interakcijske vrijednosti slabijih i brojnijih bivalentnih vezujućih mjesta (primjerice KA1 i R01). za ove koncentracije supstrata, jaka vezujuća mjesta su već zasićena i predstavljaju samo konstantan doprinos adsorpcijskoj izotermi. Monovalentne interakcije nisu prikazane na Slici 2.
Općenito, u Scatchard-ovu dijagramu, zakrivljeni izgled izoterme koji se povećava prema lijevo, dokazuje istovremenu prisutnost različito jakih vezujućih mjesta.
Rezultat: Iz ovdje prikazanih eksperimentalnih rezultata može se vidjeti da receptorska faza C (struktura K1000-PVA-FA-2-5-Dod-MVS-100) može sudjelovati u jakim trivalentnim i također slabijim monovalentnim i bivalentnim interakcijama s 3-amino-4-nitrobenzonitrilom.
U odnosu na supstrate s manjim brojem supstituenata, ista receptorska faza ponaša se sukladno, dakle maksimalna jačina vezanja u skladu je s brojem supstituenata supstratne molekule.
Štoviše, na jačinu veza može se djelovati samo supstituent-ovisnim nabojem permanentnog i induciranog dipola molekule supstrata.
Primjer 4: Vezanje steroida kao supstrata za receptorske faze tvrtke instrAction pomoću bar bivalentnih veza
Vezanje (zadržavanje) estradiola i testosterona za receptorsku fazu A (SBV 01044 VD/4 u koloni PV 02007) koja sadrži samo amino skupine, i za fazu C (ND 02001/1 u koloni PV 02001) koja je derivatizirana s razgranatim alkilnim skupinama (4-metilvalerijanska kiselina) stupnja 27% određena je pomoću gradijentne HPLC.
Za gradijentnu HPLC, korišteni su sljedeći uvjeti:
Neutralni eluenti:
Eluent A: 1 dio dimetilformamid + 9 dijelova vode (volumenskih dijelova)
Eluent B: dimetilformamid
Kiseli eluenti:
Eluent A: 10 mmol trifluoroctena kiselina (TFA) u 1 dio dimetilformamid + 9 dijelova vode (volumenskih dijelova)
Eluent B: 10 mmole trifluoroctena kiselina u dimetilformamidu
Gradijentni profil: Stalni eluent A brzine protoka 0,2 ml/min tijekom pet minuta; zatim dodavanje B s 2%/min na 0,6 ml/min sve do potpunog eluiranja tvari.
U gradijentu, odgovarajuća tvar će eluirati ako Gibbs-ova energija za metodu otapala u pokretnoj fazi upravo premašuje energiju veze receptor/supstrat. Također, Gibbs-ova energija �G interakcije receptor/otapalo djeluje na energijski balans: u pravilu, entropija �S se smanjuje jer je veći broj malenih molekula otapala, i interakcijska entalpija �H je umjereno negativna.
Za odgovarajuće sastavljenu receptorsku fazu, tijekom supstratnog vezanja (adsorpcija) interakcijska entalpija �H adsorpcije otapala je negativnija nego što je doprinos multivalentne interakcijske �H između receptora i supstrata.
Budući da su ispitivane tvari slabo topljive u vodi i dobro topljive u DMF, sadržaj DMF pokretne faze koji je neophodan za eluiranje bio je gruba mjera koja bi se trebala jednostavno odrediti jačina vezanja nekoliko supstrata prema receptoru.
Očekivalo se da i estradiol i testosteron mogu sudjelovati u lipofilnim interakcijama s receptorskom fazom, nadalje, estradiol bi trebao stvarati ion-sličnu vezu fenol/amin. Nadalje, 4-metilvalerijanska kiselinska skupina koja postoji u receptorskoj fazi C (ND 02001/1 u koloni PV 02001) trebali bi na određeni način jačati udio lipogilne veze u odnosu na amino fazu A.
Predviđeno je da, za razliku od testosterona, estradiol može sudjelovati u bivalentnoj vezi s ionskim i lipofilnim dijelom. U ovom slučaju, estradiol bi se trebao eluirati razmjerno kasnije nego testosteron s receptorske faze C u upotrebljenom gradijentu otapala. Za fazu A, s druge strane, sve u svemu jasno kraća retencijska vremena su očekivana kao i manje razlike elucijskih svojstava testosterona i estradiola.
U tablici 10, naveden je sadržaj DMF pokretne faze koji je neophodan da se prekine veza receptor/supstrat.
[image]
1. Opažanje: Rezultati ukazuju na to da se estradiol veže jače nego testosteron već na amino fazi A (PV02007), što se može pripisati dodatnoj ionskoj interakciji. Na alkiliranoj fazi C (PV 02001) estradiol nije eluirao sve do koncentracije 47,7% DMF, što u usporedbi s bazičnom fazom predstavlja povećanje od 33,6 dijelova (volumen). U odnosu na elucijsku snagu DMF, navedeni rezultat odgovara drastičnom povećanju vezanja. S druge strane, vezanje testosterona umjereno se povećalo do 18,5% DMF.
2. Opažanje: Kao što se očekivalo, vezanje estradiola se smanjuje ako se mogućnost njegove ionske interakcije većinom ukloni protoniranjem amino skupine pri nepokretnoj fazi uz dodavanje 10 mmol trifluoroctene kiseline pokretnoj fazi.
S druge strane, vezanje testosterona bilo je umjereno pojačano u kiselom mediju u odnosu na fazu C, te je ostalo nepromijenjeno u odnosu na fazu A. Za oba supstrata je normalno da amino skupine receptora koji je nastao u eluentu zbog trifluoroctene kiseline podliježe daljnjim interakcijama koje nisu bile raspoložive za amin.
Sve u svemu, bilo je intrigantno što je jačanje vezanja na receptorskoj fazi bilo značajno veće u slučaju kada su korištena dva različita tipa nekovalentnih interakcija. Jačanje vezanja pomoću isključivog povećanja regije lipofilnog kontakta dijelova alifatske molekule bilo je manje izraženo.
Nadalje, navedeni rezultati su potkrijepljeni uspoređivanjem zadržavanja (retencije) karakterističnih strukturnih elemenata molekule estradiola. S takvim molekularnim sondama, opsežni HPLC testovi mogu se brzo izvršiti. Tako, 2-naftol se vezao za fazu tipa C bitno jače nego naftalen, a opet naftalen bolje nego 1,2,3,4-tetrahidronafthol. Očekivani doprinos ionskog vezanja može se lako izvesti iz navedenog svojstva, dok se polarno vezanje alkoholnih OH skupina očekivano nije zbilo u vodenom otapalu.
Rezultat: Bivalentno vezanje fenolnih steroida na fazama koje sadrže alkilne i amino skupine, kao što su C (PV02001), ima prednosti za odvajanje od nearomatskih steroida. Na taj način, u uvjetima izokratskog odvajanja, postignute su vrijednosti (selektivnosti odvajanja) sve do 10.
S druge strane, na slabo hidrofobnom ionskom izmjenjivaču A (PV 02007), navedeno odvajanje nije bilo moguće sa zadovoljavajućim razlučivanjem.
Ilustrirano načelo može se uopćiti za odvajanje fenolnih tvari od neutralnih ili bazičnih alifatskih tvari, a također za aromatične tvari. Nadalje, moguće je također dobro odvajanje multivalentnih fenola.
Primjer 5: Vezanje laktama kao supstrata za receptorske faze tvrtke instrAction pomoću bar bivalentnih veza
Vezanje metilfenilhidantoina (MPH) 1, difenilhidantoina (DPN) 2 i metilfenilsukcinimida 3 iz kloroforma za niz receptorskih faza koje sadrže 80% amino skupina i 14% benzilnih skupina (primjerice PV 99047, PV 00010; stupanj unakrsnog vezanja 5%) određeno je pomoću frontalne analize.
U tu svrhu, receptorska faza koji je pakirana u HPLC kolonama (40×4 mm) isprana je otopinama supstrata rastuće koncentracije sve do odgovarajuće saturacijske ravnoteže. Iz brzine protoka, iz vremena do proboja tvari i koncentracije supstrata, odgovarajuće koncentracije vezanog supstrata [RS] mogu se odrediti za poznate konstantne koncentracije supstrata [S] = [S0]. Iz krivulja proboja koje su određene za 10-12 koncentracija supstrata, pomoću adsorpcijskih izotermi odnosno Scatchard-ovih dijagrama, mogu se odrediti konstante veze Ka i koncentracija zasićenja (saturacije) [Ro], pri čemu se mogu detektirati područja bivalentnih i monovalentnih veza.
[image]
Pomoću izbora otapala, potvrđeno je da postoje polarne interakcije, konkretno vodikove veze.
Tipične izmjerene vrijednosti su navedene pod a) do c).
a) Vezanje MPH za poli(benzil-N-alil-karbamat) na silikagelu, 6 slojeva, unakrsno vezan (PAA-OBzll4-2Dod, PV 99047):
Područje bivalentnih veza:
KA= 12,703 M-1
�G = 5,50 kcal/mol
R0 = 12,0 μmol/g
Područje monovalentnih veza:
KA = 221 M-1
�G = 3,14 kcal/mol
Ro = 301,4 μmol/g
b) Vezanje DPH za poli(benzil-N-alil-karbamat) na silikagelu, 6 slojeva, unakrsno vezan (PAA-OBzll4-2Dod, PV 00010):
Područje bivalentnih veza:
KA = 19,880 M-1
�G = 5,76 kcal/mol
R0 = 4,6 μmol/g
Područje monovalentnih veza:
KA = 201 M-1
�G = 3,09 kcal/mol
R0 = 226,7 μmol/g
c) Vezanje MPS za poli(benzil-N-alil-karbamat) na silikagelu, 3 sloja, unakrsno vezan (PAA-OBzll4-2Dod, PV 99047):
Područje monovalentnih veza:
KA = 75-78M-1
R0 = 96,5-97,4 μmol/g
1. Opažanje: Za oba hidantoina 1 i 2 (MPH i DPH), u opsežnom ispitanom nizu, konstante bivalentne veze KA određene su između 6,000 i 23,000 M-1 za količine saturacijske tvari R0 između 3 μmol/g faze i 12,6 μmol/g faze za nekoliko inačica receptorske faze (primjerice PV 99047, PV 00010). To ukazuje na to da bi dva vodikova mosta mogla nastati prema aminu. Konstanta monovalentne veze bila je između 109 i 221 M-1 (R0 = 239-301 μmol/g). S druge strane, za sukcinat imidni derivat nađene su konstante monovalentne veze od 75 do 78 M-1 s vrijednošću zasićenja R0 od 96 μmol/g. To se može objasniti činjenicom da sukcinat imid može stvarati samo jedan vodikov most te je, prema tome, sposoban stvarati samo monovalentno vezanje.
2. Opažanje: Konstanta veze za bivalentnu vezu vrlo dobro odgovara produktu vrijednosti kombiniranih konstanti monovalentne veze.
Odgovarajuće monovalentne Gibbs-ove energije �G približno se dodaju jedna drugoj. Za jednostruku vezu laktamske skupine peteročlanog prstena u kloroformu određene su Gibbs-ove energije �G između 2,5 i 3,14 kcal/mol na 25ºC, a za bivalentne vodikove veze između 5,06 do 5,88 kcal/mol. Ove vrijednosti premašuju podatke koji su bili očekivani za otapalo kloroform uz pomoću literature (MPH: KA = 6,014 M-1, �G = 5,06 kcal/mol, R0 = 3,2 μmol/g; DPH: KA = 7,171 M-1, �G = 5,16 kcal/mol, R0 = 6,9 μmol/g i KA = 145 M-1, �G = 2,90 kcal/mol, R0 = 264,0 μmol/g).
Rezultat: Na ovaj način, pokazalo se da se zbiva jačanje bivalentnog vezanja ako su na strani supstrata i na strani receptora dvije slične komplementarne rezidue (vezujuće rezidue mjesta), odnosno, ako su međusobno u interakciji, slično kelatnim učincima. U navedenom slučaju, to su bile amidne skupine supstrata i aminske skupine receptora. Na taj način, Gibbs-ove energije približno se zbrajaju, dok se konstante vezanja međusobno množe. Sukladno navedenom načelu, konkretno, mogu se razviti receptorske faze koje su prilagođene za odvajanje homolognih tvari ili tvari s različitom valencijom u odnosu na funkcionalne skupine (primjerice monohidni prema heksahidnim alkoholima, kao što su ugljikohidrati).
Primjer 6: Vezanje nekih C-blokiranih aminokiselina kao supstrata za sorbente na osnovi polivinil amin/silikagel kao sorbente pomoću bar bivalentnih veza
Retencijska svojstva 18 različitih aminokiselinskih derivata (supstrati u Tablici 11) ispitana su kromatografski na sedam različitih stacionarnih faza (sintetski receptori).
Aminokiselinski derivati (1-18) bili su esteri alanina, leucina, prolina, lizina, histidina, fenilalanina, tirozina i triptofana. Esteri su odabrani da bi se isključile neželjene interakcije ionizirajućih karboksilatnih funkcionalnih skupina. Nismo očekivali značajni interakcijski doprinos metil estera, sasvim suprotno od benzil estera.
[image]
[image]
[image]
Korištene receptorske faze su polivinil amin-prevučeni kuglasti silikagel s veličinom čestica od 20 μm i promjerom pora od 1000 Ǻ. U metodi prevlačenja, prvo je dobivena amino faza A. Izvedene receptorske faze B do K dobivene su iz amino faze A pomoću sinteze u čvrstoj fazi sukladno poznatim metodama. Faze su navedene u Tablici 12:
[image]
[image]
Kao pokretna faza za kromatografska ispitivanja, korištena je vodena otopina 10 mM tris-HCl-pufera koja ima pH 7,5.
Kao mjera za jačinu interakcije između supstrata i receptora u odgovarajućim puferskim otopinama, korišten je relativni elucijski faktor k’ (kapacitetni faktor) koji ne ovisi o uređaju. On se može izračunati iz razlike elucijskog volumena u maksimalnom piku i mrtvog volumena kolone podijeljeno s mrtvim volumenom kolone:
[image]
k’-vrijednosti supstrata u 10 mmolarnom tris-HCl puferu navedene su u Tablici 13:
[image]
[image]
1. Opažanje: U primjeru 1, k’-vrijednosti aminokiselinskih derivate s karboksilnom skupinom ispitani su na amino fazi. Monokarboksilati Ac-Gin 1 i Boc-Gln 2 iz Primjera 1 dosegli su k’-faktore od 9,5 i 8,8 na amino fazi (BV 02042). U ovom Primjeru 6, za jednostavne amine kao što su H-Ala-OMe 1 i H-Leu-OMe 3 dobivene su k’-vrijednosti od 13,7 i 12,5 na karboksilatnoj fazi I.
Objašnjenje opažanja: U izmjeni interakcijskih skupina u supstratu i receptorskoj fazi, k’-vrijednosti vrlo malo su se promijenile. To se moglo očekivati jer bi jačina veze trebala biti neovisna o smjeru veze. Za planiranu primjenu interakcijske skupine, značajno je da dolazi do usporedivog vezanja, neovisno o tome koja skupina je vezana u receptoru ili koja je pokretna u supstratu.
2. Opažanje: Na amino fazi A i acetamido fazi B, praktično ne dolazi do zadržavanja supstrata.
Objašnjenje opažanja: Receptorske faze A i B ne sadrže receptorske skupine s kojima bi bila moguća značajnija interakcija prema supstratu u odabranom puferu. Sukladno, k’-vrijednosti bile su približno nula. Ove faze mogu se koristiti kao nulte točke ma relativnoj interakcijskoj skali.
Lipofilni utjecaj polimernog skeletea (scaffold) može se zanemariti u ravnotežnom vezanju.
3. Opažanje: Svi supstrati pokazuju jasnu retenciju na karboksilatnoj fazi I. k’-vrijednosti su između 4,5 do 21,7.
Objašnjenje opažanja: Svi ispitani supstrati sadrže bar jednu amino skupinu. Navedena amino skupina je uglavnom protonirana na pH 7,5 i podliježe jakim ionskim interakcijama s karboksilatnim ionima faze.
4. Opažanje: Receptorske faze C i D petenciju sa supstratima koji sadrže jednostruku lipofilnu parcijalnu strukturu, primjerice 2, 6, 7, 8, 15 ili 17. Jaka retencija (k’-vrijednosti > 8) nađena je sa supstratima koji imaju dva veća dijela lipofilne molekule, 4, 14, 16 i 18. Na taj način, vezanje za aromatsku receptorsku fazu D bilo je u svakom slučaju veće nego za alkilnu receptorsku fazu.
Objašnjenje opažanja: Receptorske faze C i D mogu sudjelovati samo u lipofilnim interakcijama. Ove veze su razmjerno slabe usporedimo li ih s ionskim interakcijama. Monovalentne lipofilne interakcije su često na granici detektiranja u odabranom puferu. Supstrati s dvije proširene lipofilne rezidue pokazuju povećanu retenciju kao posljedicu lipofilnog kontaktnog područja.
5. Opažanje: U većini slučajeva, najveća k’-vrijednost za odgovarajući supstrat nađena je na receptorskoj fazi K.
Objašnjenje opažanja: Receptorska faza K sadrži u približno jednakim molarnim količinama karboksilatne skupine i benziloksilkarbonilne skupine, tj. receptorske skupine za ionske i za lipofilne interakcije. Budući da ukupni broj interakcijskih skupina približno odgovara onom za izvorne receptorske faze C, D ili I, valja očekivati k’-vrijednost između k’-vrijednosti faza D i I na miješanoj receptorskoj fazi K. Detektirana visoka k’-vrijednosti na miješanoj recetorskoj fazi pokazuje da u navedenim slučajevima dolazi do istovremenog ionskog i lipofilnog vezanja, pa je prisutan miješan, bivalentni način vezanja.
Za jačinu p-p kontakata između aromatskih sustava, vezanje svih supstrata koji imaju aromatsku reziduu za fazu koja sadrži benzilnu skupinu je jače nego za fazu J koja ima razgranate alkilne rezidue.
Rezultat: S gore opisanim eksperimentima, postoji jasni dokaz da se mogu ciljano aktivirati i deaktivirati interakcije između supstrata i receptorske faze odgovarajućim izborom izvorne receptorske skupine. Za reguliranje afiniteta i selektivnosti, mogu se varirati sastav otapala, ionska jakost i pH.
Ako supstrat dva lipofilna molekularna dijela, on može bivalentno biti u interakciji s receptorskom fazom što vodi do značajnog jačanja veze. U takvom slučaju, to je bivalentna interakcija istog tipa.
Također bi se moglo pokazati da su moguće bivalentne interakcije različitog tipa (ionske i lipofilne), ako i receptorska faza i supstrat sadrže odgovarajuću komplementarnu skupinu. Ovdje također dolazi do selektivnog jačanja veze.
Oblikovanjem receptora tako da bude komplementaran ciljanoj tvari, prateće tvari ili nusprodukti mogu se lako odvojiti. Mjera za izvedivost odvajanja je kvocijent k’-vrijednosti, selektivnost alfa
Selektivnost: alfa = k2’/k1’
Primjerice, s benzil/receptorska faza D, kromatografsko odvajanje Boc-lys-OMe (9) i H-lys(Boc)-OMe (10) bilo bi jedva moguće. Na karboksilat receptorskoj fazi I, dobivena je alfa vrijednost od 1,59. Mješavina receptorskih faza J i K već pokazuje alfa-vrijednosti od 2,25 i 2,06. To je osnovica značajnog unaprijeđenja kromatografske odvojivosti smjese prilagođenim oblikovanjem receptorske faze.

Claims (21)

1. Metoda za proizvodnju bar jednog sorbenta koji ima bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje, za selektivno vezanje supstrata, naznačena time što uključuje stupnjeve (i) do (ii): (i) određivanje bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje sorbenta iz sintetskog ili prirodnog prvog supstrata, (ii) odgovarajuća primjena bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje drugog sintetskog ili prirodnog supstrata za jedan odgovarajući nosač, te na taj način nastaje bar jedan sorbent, pri čemu su skupine identične skupinama stupnja (i) ili su to skupine koje su im komplementarne, a drugi supstrat stupnja (ii) je identičan ili se razlikuje od prvog supstrata sukladno stupnju (i), pri čemu su skupine određene tako da doprinosi Gibbs-ovih energija pojedinih skupina prema nekovalentnim vezama s drugim supstratom daju negativnu vrijednost Gibbs-ove energije �G, tako da dolazi do jačanja vezanja što rezultira poboljšanom selektivnošću odvajanja u odnosu na bar jednu tvar koju treba odvojiti.
2. Metoda za selektivno vezanje supstrata koji imaju bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje za bar jedan sorbent, naznačena time što uključuje stupnjeve (i) do (iv): (i) određivanje bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje sorbenta iz sintetskog ili prirodnog prvog supstrata, (ii) primjena bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje drugog sintetskog ili prirodnog supstrata za jedan odgovarajući nosač, pa na taj način nastaje bar jedan sorbent, pri čemu su skupine identične skupinama stupnja (i) ili su to skupine koje su im komplementarne, a drugi supstrat stupnja (ii) je identičan ili se razlikuje od prvog supstrata sukladno stupnju (i), (iii) dovođenje u kontakt bar jednog drugog supstrata koji je identičan ili različit od prvog supstrata sukladno (i) s bar jednim sorbentom stupnja (ii), (iv) ispitivanje jačine vezanja bar jednog drugog supstrata prema bar jednom sorbentu stupnja (iii), pri čemu su skupine određene tako da doprinosi Gibbs-ovim energijama pojedinih skupina nekovalentnoj vezi s drugim supstratom daje negativnu vrijednost Gibbs-ove energije �G, tako da dolazi do jačanja vezanja što rezultira poboljšanom selektivnošću odvajanja u odnosu na bar jednu tvar koju treba odvojiti.
3. Metoda sukladno zahtjevu 1 ili 2, naznačena time što određivanje u stupnju (i) uključuje disekciju sintetskog ili prirodnog prvog supstrata u bar dvije komponente koje imaju bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje sorbenta.
4. Metoda sukladno bilo kojem zahtjevu 1 do 3, naznačena time što jedna komponenta ima bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje.
5. Metoda sukladno bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačena time što je bar jedan first supstrat identičan bar jednom drugom supstratu, te bar dvije različite skupine koje mogu vezati drugi supstrat su odabrane među onim skupinama koje su komplementarne skupinama koje su određene u stupnju (i).
6. Metoda sukladno bilo kojem zahtjevu 1 do 4, naznačena time što se bar jedan prvi supstrat razlikuje od bar jednog drugog supstrata, a bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje drugog supstrata odabrane su među onim skupinama koje su komplementarne skupinama koje su određene u stupnju (i).
7. Metoda sukladno bilo kojem zahtjevu 1 do 4, naznačena time što su bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje odabrane među skupinama koje su određene sukladno stupnju (i).
8. Metoda sukladno bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačena time što odabiranje bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje sorbenta iz sintetskog ili prirodnog prvog supstrata u stupnju (i) daje dvije komponente pri čemu svaka od njih ima bar jednu skupinu koja je sposobna za vezanje sorbenta, te su u stupnju (ii) dobije jedan sorbent; ili odabiranje bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje sorbenta iz sintetskog ili prirodnog prvog supstrata u stupnju (i) daje tri komponente pri čemu svaka ima bar jednu skupinu koja je sposobna za vezanje sorbenta, te u stupnju (ii) dobiju se bar tri sorbenta; ili odabiranje bar dvije skupine koje su sposobne za vezanje sorbenta iz sintetskog ili prirodnog prvog supstrata u stupnju (i) daje četiri komponente pri čemu svaka ima bar jednu skupinu koja je sposbna za vezanje sorbenta, te u stupnju (ii) dobije se bar šest sorbenata.
9. Metoda sukladno bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačena time što su bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje bar jednog sorbenta odabrane među skupinama koje su dio aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza i purinskih baza.
10. Metoda sukladno bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačena time što su bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje bar jednog drugog supstrata odabrane među skupinama koje su dio aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza i purinskih baza.
11. Metoda sukladno bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačena time što su bar dvije različite skupine u stupnju (ii), kovalentno vezane za polimer.
12. Metoda sukladno zahtjevu 11, naznačena time je polimer izravno sintetiziran pomoću polimerizacije ili polikondenzacije bar jednog monomera koji ima bar dvije različite skupine koje su sposobne za vezanje, ili bar dviju monomera od kojih svaki ima bar jednu skupinu koja je sposobna za vezanje, pri čemu se navedene skupine razlikuju.
13. Metoda sukladno bilo kojem zahtjevu 1 do 10, naznačena time što su u stupnju (ii) bar dvije različite skupine koje mogu vezati drugi supstrat primijenjene na nosač pomoću reagensa koji je odabran iz skupa kojega sačinjavaju aktivirajući reagensi, reagensi za silaniziranje i razmaknica, ili smjese dviju ili više navedenih reagensa.
14. Metoda sukladno zahtjevu 13, naznačena time što su u stupnju (ii) bar dvije različite skupine koje mogu vezati drugi supstrat odabrane iz skupa kojega sačinjavaju: fenil, hidroksifenil, karboksil, amin, amid, hidroksil, indol, imidazol i guanidinske rezidue.
15. Metoda sukladno bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačena time što dodatno obuhvaća stupanj (v): (v) izdvajanje bar jednog drugog supstrata.
16. Metoda sukladno bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačena time što dodatno obuhvaća stupanj (vi): (vi) karakteriziranje i identificiranje bar jednog drugog supstrata.
17. Metoda sukladno bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačena time što supstrat obuhvaća jedan ili više prirodnih sredstava koji su odabrani iz skupa kojega sačinjavaju aminokiseline, oligopeptidi, nukleotidi, proteini, glikoproteini, antigeni, antitijela, ugljikohidrati, enzimi, koenzimi, hormoni, alkaloidi, steroidi, virusi, mikroorganizmi, tvari koje su sadržane i biljnim i životinjskim tkivima, stanice, stanični fragmenti, stanični odjeljcu, stanični ulomci, lektini, flavilijevi spojevi, flavoni i izoflavoni, ili jedan ili više sintetskih sredstava koji su odabrani iz skupa tvari koje djeluju na živčani sustav, koje djeluju na hormonski sustav, koje djeluju na medijatore, koje djeluju na kardiovaskularni sustav, koje djeluju na dišni sustav, koje djeluju na gastrointestinalni sustav, koje djeluju na bubrege i na donji mokraćni sustav, koje djeluju na oči, koje djeluju na kožu, tvari za profilaksu i terapiju infekcijskih bolesti, koje djeluju na maligne tumore, koje djeluju na imunološki sustav i tvari koje imaju imunološki utjecaj, kao i insekticidi, herbicidi, pesticidi i fungicidi.
18. Kombinacijska biblioteka, naznačena time što obuhvaća zbirku sorbenata koji imaju bar dvije različite prve skupine, odnosno koji mogu ostvariti nekovalentno vezanje bar jednog supstrata koji imaju bar dvije različite drugi skupine, pri čemu bar dvije različite prve skupine su odabrane ta doprinosi Gibbs-ovih energija pojedinih prvih skupina prema nekovalentnim vezama s bar dvije različite druge skupine daje ukupnu negativnu vrijednost Gibbs-ove energije �G, tako da dolazi do jačanja vezanja što rezultira poboljšanom selektivnošću odvajanja u odnosu na bar jednu tvar koju treba odvojiti.
19. Kombinacijska biblioteka sukladno zahtjevu 18, naznačena time što su bar dvije različite skupine sorbenata i bar dvije različite skupine bar jednog supstrata odabrane među skupinama koje su dio aminokiselina, ugljikohidrata, nukleotida, nukleozida, pirimidinskih baza i purinskih baza.
20. Kompleks sorbent/supstrat koji sadrži bar jedan sorbent i bar jedan supstrat, naznačen time što ima bar dvije različite druge skupine, pri čemu navedeni sorbent ima bar dvije različite prve skupine koje su sposobne za nekovalentno vezanje bar jednog supstrata koji ima bar dvije različite drugi skupine, pri čemu su bar dvije prve skupine odabrane tako da doprinosi Gibbs-ovih energija pojedinih prvih skupina prema nekovalentnoj vezi s bar dvije različite druge skupine daje ukupnu negativnu vrijednost Gibbs-ove energije �G, tako da dolazi do jačanja vezanja što rezultira poboljšanom selektivnošću odvajanja u odnosu na bar jednu tvar koju treba odvojiti.
21. Upotreba metode sukladno bilo kojem zahtjevu 2 do 17, ili upotreba kombinacijske biblioteke sukladno bilo kojem zahtjevu 18 do 20 za detektiranje interakcija receptor/agent, naznačena time što se odnosi na screening sredstava, na razvoj vodećih tvari, na razdvajanje supstrata, na pročišćavanje supstrata, na odvajanje izomernih spojeva, na pročišćavanje tekućina za odvajanje štetnih tvari, na iskorištavanje dinamičkih kombinacijskih biblioteka.
HR20050809A 2003-03-25 2005-09-14 Method for selectively binding a substrate to sorbents by way of at least bivalent bonds HRP20050809A2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10313324A DE10313324A1 (de) 2003-03-25 2003-03-25 Verfahren zur selektiven Bindung eines Substrats an Sorbentien durch mindestens bivalente Bindung
DE10358696A DE10358696A1 (de) 2003-12-15 2003-12-15 Verfahren zur selektiven Bindung eines Substrats an Sorbentien durch mindestens bivalente Bindung
PCT/EP2004/003138 WO2004085046A2 (de) 2003-03-25 2004-03-24 Verfahren zur selektiven bindung eines substrats an sorbentien durch mindestens bivalente bindung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20050809A2 true HRP20050809A2 (en) 2006-02-28

Family

ID=33099284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20050809A HRP20050809A2 (en) 2003-03-25 2005-09-14 Method for selectively binding a substrate to sorbents by way of at least bivalent bonds

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20060292569A1 (hr)
EP (1) EP1613420B1 (hr)
JP (1) JP4673836B2 (hr)
KR (2) KR101322019B1 (hr)
BR (1) BRPI0408724A (hr)
CA (1) CA2519479C (hr)
ES (1) ES2545069T3 (hr)
HR (1) HRP20050809A2 (hr)
IL (1) IL171007A (hr)
IS (1) IS8085A (hr)
MX (1) MX288503B (hr)
NO (1) NO20054901L (hr)
PL (1) PL1613420T3 (hr)
RU (1) RU2338587C2 (hr)
TW (1) TWI353880B (hr)
WO (1) WO2004085046A2 (hr)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010104151A1 (ja) * 2009-03-12 2010-09-16 株式会社資生堂 充填剤の製造方法、充填剤及びカラム
WO2011012302A1 (en) * 2009-07-28 2011-02-03 Instraction Gmbh Specific sorbent for binding proteins and peptides, and separation method using the same
EP2512653A1 (en) * 2009-12-17 2012-10-24 InstrAction GmbH Specific sorbent for binding proteins and peptides, and separation method using the same
DE102010054766B4 (de) 2010-12-16 2012-08-30 Previpharma Ag Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung
DE102010054767B4 (de) 2010-12-16 2013-02-21 Previpharma Ag Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung von (Blut)Plasmaprotein, Viren oder Virenbestandteilen
JP6141838B2 (ja) * 2011-07-13 2017-06-07 インストラクション・ゲーエムベーハー クロマトグラフィー用複合材料
RU2538897C2 (ru) * 2012-10-24 2015-01-10 Александр Иванович Сотниченко Способ получения обращенно-фазовых гидрофобизированных полисиликатных сорбентов и сорбенты, полученные этим способом
DE102012022233A1 (de) 2012-11-14 2014-05-15 Instraction Gmbh Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins
DE102012022234A1 (de) 2012-11-14 2014-05-15 Instraction Gmbh Einstufiges Verfahren zur Reinigung von (Blut)Plasmaproteinen wie Albumin aus Gemischen
RU2737589C1 (ru) * 2019-12-30 2020-12-01 Общество с ограниченной ответственностью "ВИЗЕКС ИНФО" Универсальная система для проведения виртуальных лабораторных и исследовательских экспериментов
RU2751439C1 (ru) * 2020-12-25 2021-07-13 Общество с ограниченной ответственностью "ВИЗЕКС ИНФО" Способ и система симуляции в виртуальных лабораториях по электродинамике
CN116836547A (zh) * 2023-07-07 2023-10-03 安徽大学 聚乙烯亚胺/β-环糊精纳米复合材料及其在制备纳滤膜中的应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5372719A (en) * 1992-03-30 1994-12-13 Perseptive Biosystems, Inc. Molecular imaging
US6176268B1 (en) * 1996-01-29 2001-01-23 Hybritech Polymers Multi-layer assembly for fluid and vapor handling and containment systems
NZ516848A (en) * 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
US6342160B2 (en) * 1998-01-09 2002-01-29 Christopher J. Welch Method for screening chromatographic adsorbents
JP2002523057A (ja) * 1998-08-25 2002-07-30 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート タンパク質の機能を予測するための方法およびシステム
DE19855173C2 (de) * 1998-11-30 2001-03-15 Gottschall Instruction Ges Fue Verfahren zur Herstellung derivatisierter Polymere und Derivate von funktionelle Gruppen aufweisende Polymere sowie Verfahren zur Substratbindung
DE19860972A1 (de) * 1998-11-30 2001-04-26 Gottschall Instruction Ges Fue Verfahren zur Herstellung derivatisierter Polymere
US6989267B2 (en) * 2001-07-02 2006-01-24 Agilent Technologies, Inc. Methods of making microarrays with substrate surfaces having covalently bound polyelectrolyte films
US7504364B2 (en) * 2002-03-01 2009-03-17 Receptors Llc Methods of making arrays and artificial receptors
US20030119063A1 (en) * 2002-09-03 2003-06-26 Pham Thang T. High accuracy protein identification
US7026014B2 (en) * 2003-02-07 2006-04-11 Clemson University Surface modification of substrates

Also Published As

Publication number Publication date
JP4673836B2 (ja) 2011-04-20
IS8085A (is) 2005-10-24
WO2004085046A3 (de) 2004-12-29
CA2519479C (en) 2016-12-20
MXPA05010175A (es) 2006-05-22
US20060292569A1 (en) 2006-12-28
CA2519479A1 (en) 2004-10-07
MX288503B (es) 2011-07-19
WO2004085046A2 (de) 2004-10-07
BRPI0408724A (pt) 2006-03-07
IL171007A (en) 2010-11-30
PL1613420T3 (pl) 2016-03-31
KR20120060170A (ko) 2012-06-11
RU2338587C2 (ru) 2008-11-20
KR20050119148A (ko) 2005-12-20
TWI353880B (en) 2011-12-11
US20110257028A1 (en) 2011-10-20
EP1613420A2 (de) 2006-01-11
ES2545069T3 (es) 2015-09-08
NO20054901L (no) 2005-12-16
TW200500136A (en) 2005-01-01
NO20054901D0 (no) 2005-10-24
RU2005132835A (ru) 2006-08-10
JP2006523831A (ja) 2006-10-19
KR101248734B1 (ko) 2013-03-28
KR101322019B1 (ko) 2013-10-29
EP1613420B1 (de) 2015-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HRP20050809A2 (en) Method for selectively binding a substrate to sorbents by way of at least bivalent bonds
Puoci et al. New restricted access materials combined to molecularly imprinted polymers for selective recognition/release in water media
Tang et al. Ultrasensitive detection of clenbuterol by a covalent imprinted polymer as a biomimetic antibody
Ertürk et al. From imprinting to microcontact imprinting—A new tool to increase selectivity in analytical devices
Marszałł et al. Magnetic beads method for determination of binding of drugs to melanin
US20120269799A1 (en) Diagnostic and treatment methods using a ligand library
Tan et al. Antibody-free ultra-high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry measurement of angiotensin I and II using magnetic epitope-imprinted polymers
EP2254696B1 (en) Improved chromatography resin, and methods and devices related thereto
Gong et al. Synthesis of adenosine-imprinted microspheres for the recognition of ADP-ribosylated proteins
EP3954371A1 (en) Anti-acetylcholinesterase active composition in caulis mahoniae and screening method therefor and application thereof
Yu et al. Development of a novel assay of molecularly imprinted membrane by design-based gaussian pattern for vancomycin determination
Sobiech et al. Synthesis and characterization of poly (methacrylic acid-co-trimethylolpropane trimethacrylate) imprinted sorbent for analysis of biogenic amines
CN104931687A (zh) 一种三维生物表面及其制备方法和一种三维生物芯片及其用途
Berger et al. Exploring the polyamine regulatory site of the NMDA receptor: a parallel synthesis approach
Sun et al. Determination of closantel residues in milk and animal tissues by HPLC with fluorescence detection and SPE with oasis MAX cartridges
Li et al. Construction of nano receptors for ubiquitin and ubiquitinated proteins based on the region-specific interactions between ubiquitin and polydopamine
DE10313324A1 (de) Verfahren zur selektiven Bindung eines Substrats an Sorbentien durch mindestens bivalente Bindung
JP5561484B2 (ja) 新規アフィニティー担体
Shi et al. Fabricating Ultrathin Imprinting Layer for Fast Capture of Valsartan via a Metal Affinity-Oriented Surface Imprinting Method
DE10358696A1 (de) Verfahren zur selektiven Bindung eines Substrats an Sorbentien durch mindestens bivalente Bindung
Khivansara et al. A Concise Review on Analytical Methods for Determination of Nilotinib
Edinboro Molecularly imprinted polymers for the direct analysis of opiates in urine by liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry
JP2004045368A (ja) 液体クロマトグラフィ定常相上の固定化ｇタンパク質共役レセプター及びオンラインスクリーニングのためのその用途
Wu Molecularly imprinted solid phase extraction-pulsed elution for rapid screening and determination of cephalexin in a-aminocephalosporin antibiotics. Canada
Abdel Qader Imprinted polymers for affinity based extractions of a peptidic biomarker from protein digests

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
ARAI Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application
ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20100316

Year of fee payment: 7

OBST Application withdrawn