TWI338781B

TWI338781B - Electrochemical detection method

Info

Publication number: TWI338781B
Application number: TW093101258A
Authority: TW
Inventors: Mcindoe Hodges Alastair; Christopher Chatelier Ronald; Chambers Garry
Original assignee: Universal Biosensors Pty Ltd
Priority date: 2003-01-20
Filing date: 2004-01-16
Publication date: 2011-03-11
Also published as: CA2513868A1; JP2006517027A; EP1585982A1; TW200422620A; CN100458430C; WO2004065951A1; ES2639412T3; CA2513868C; US7403017B2; US20060237332A1; JP4866232B2; EP1585982A4; AU2003900285A0; CN1809746A; EP1585982B1; US20080223732A1; MY144615A

Description

1338781 五、發明說明（1) 【技術領域】本發明是一種量測方法，量測可減緩或限制電活性物質（electroactive species)移動的障壁形成，此法有特殊應用’可用於測試凝集反應。本發明之應用範例是抗原測試技術’例如分析血液中的血型。【先前技術】在習知技術中，典型測量一液態檢體中是否有抗原出現的方法’是將檢體和該抗原的抗體接觸反應，使抗原抗體結合’檢體内發生凝集反應。接著用光學方法評估凝集反應，例如檢驗檢體之光密度，濁度，或光散射。例如，美國專利第6，3 3 0，0 5 8號揭示了一種利用既定範圍波長的光密度光譜作為測試檢體的凝集反應指標的方法。而美國專利第5, 256, 37 6號揭示了一種藉光度測定量測凝集反應的方法，使用一離心器執行此法，量測光學密度數據。凝集測試可以是定性的，測量分析物是否出現，或定量的，測量分析物發生凝集反應的狀況。從前是以目視評估凝集反應發生與否，以散射光量測液體濁度，或量測光密度或類似方法。這些目視法，雖然簡單，但僅能半定量，而且有使用者誤差（user error)，而光密度或散射法，更能定量且較不易有使用者誤差，但需要昂貴且複雜的儀器執行測試。本發明旨在尋求一種可替代這類習知技術的方法。 1338781 五、發明說明（2) :内容】首先會限制或本方提供隔之輔助槽内質，待測活性物質在工生電流^ 率相關；測量性物質移障壁在某持在工作在一量是在槽次測量，在一壁形成測時，該參，本發明提供一種量測方法，量測檢體中是否有降低電活性物質移動的障壁物形成。法包括：一電化學槽，含有一工作電極及一和工作電極分電極；提供一待測成分，一測試成分和至少一電活性物成分和測試成分是用以形成障壁，限制或降低電的移動；作電極和輔助電極間施以電壓，而此電壓足以產此電流和工作電極上測試的電活性物質移動的速在工作電極上的電流，以獲得可減緩或限制電活動的障壁形成數值。的形成最好是由凝集反應所引起的。些實施例中，本方法涉及施加電壓，強度足以維電極上的電活性物質濃度。較佳實施例中，本方法涉及電流測量，第一次測内預計顯著障壁形成前，及顯著障壁形成的第二並且從測得電流的差異獲得該障壁形成的數值。較佳實施例中，第一次測量時間，此時間是指障量參數的變化大略低於或預計低於障壁完全形成數總變化值的2 0 %，最好是小於該參數總變化值

第6頁 1338781 五、發明說明（3) 的約1 0 %。在一較佳實施例中，第二次測量時間，此時間是指凝集測量參數的變化超過障壁完全形成時，該參數總變化值的5 0 %，同時最好是超過該參數總變化值的約7 0 %。實際上這些時間的決定，可考慮本裝置應用時的測試狀況及檢體可能的障壁形成動力學範圍，以選出範圍内合適的時間。或是藉評估障壁形成量測參數隨時間變化的速率，每一測試皆可找出適當時間點。對熟知習知技藝者而言，·障壁形成量測參數本身的變化速率即可用以量測待測物質是否出現或是其濃度高低。所測得電流的差值可用於取得電活性物質的擴散係數，從而獲得障壁形成值。所測得電流的差值也可用於取得擴散係數變化的數值，從而取得障壁形成值。測試成分，待測成分，及電活性物質可用數種不同方法，置入電解槽内。一般是將含有待測成分的液體檢體放入電解槽内，藉此加入實驗物。在有些實施例中，是在將液體檢體放入電解槽内之前，將測試成分注入檢體中，藉此提供測試成分。在其他實施例中，是在將液體檢體放入電解槽内之前，就加入測試成分。例如，將待測物乾燥後儲存在電解槽内。可藉障壁形成反應或其他測試成分和待測成分間的反應，提供電活性物質。

1338781 五、發明說明（4) 或者，藉測試成分提供f活性物質。除此外，也可藉測試成分和待測成分，分別提供電活性物質。在一較佳實施例中，藉由障壁形成反應，提供電活性物質。本方法提供兩電極*可作為工作電極，並在兩電極之一附近或其上提供測試成分；本方法進一步包括改變施加的電壓或電路上測得的電流，以轉換該工作電極極性，同時量測兩工作電極之電流，藉以取得障壁形成的量測值在某些實施例中，測得的電流可用於取得量測變化值用以取得障壁形成的量測值。本發明同時亦提供一種方法，可測試待測成分中是否含標的成分，包括：提供一電化學槽，含有一工作電極及一和工作電極分隔之輔助電極；槽内提供一待測成分，可能含有或不含標的成分，一測試成分和至少一電活性物質，在標的成分出現的狀況下，待測成分和測試成分可用以形成障壁，以限制或降低電活性物質的移動；在工作電極和輔助電極間施加電壓，而此電壓足以產生和工作電極上測得的電活性物質移動的速率相關的電流，同時測量在工作電極上的電流，以測定可減緩或限制電活性物質移動的障壁是否形成，藉以測定待測成分中是否出現該標的成分。

第8頁 1338781 五、發明說明（5) 本發明同時可延伸至一琪彳量可減緩或限制電活性物質移動的障壁形成的裝置，包括：. 一電化學槽，含有一工作電極及一和工作電極隔開的輔助電極；該電化學槽，可用於容納一待測成分’ 一測試成分和至少一電活性物質，而待測成分和測試成分是用以形成障壁，限制或降低電活性物質的移動；一電源可在工作電極和輔助電極間施以電壓，而此電壓足以產生和工作電極上測得的電活性物質移動的速率相關的電流；

一安培計用以測量在工作電極上的電流；及障壁形成測量工具，從測得的電流，決定障壁形成的數值。障壁形成測量工具最好是一種凝集量測裝置，用以決定凝集數值。裝置之電化學槽可能含有一獨立的參考電極。或者，輔助電極可以是輔助/參考電極。從下列本發明的詳細說明，可更了解本發明方法之裝置構造細節及其他特性》

本發明之實施例是基於電化學測試，特別是時間安培 (c h r ο η 〇 a m p e r 〇 m e t r i c)量測，可產生和溶液中電活性物質濃度及/或擴散係數相關的數據。藉著在工作電極和輔助 (或輔助/參考）電極間施以電壓，而此電壓會經由物質的氧化還原，產生電流，和工作電極表面上測得的還原態或氧化態電活性物質濃度成正比。在許多實施例中，這包括施以足夠足以維持工作電極

第9頁 1338781 五、發明說明（6) -~ --- 表面上，電活性物質濃度在事的電壓。在工作電極因氧化還原產生的電流和物質傳輸速度有關，在本案中物質傳輸是濃度梯度和擴散係數造成之結果。可分析電流以獲得溶液中電活性物質的濃度及其擴散係數兩者的量值。例如果已知電活性物質的濃度，那麼可藉Cottrell等式或類似物’分析在一單獨之工作電極上的電流，以獲得擴散係數量值。大家所熟知的c〇ttreUf 式界定了有限擴散電流密度及時間之間的關係。擴散電流密度和時間的平方根成反比，或是以其他方式表示：i (t) x t0 · 5之結果為一常數。這常數和反應物的濃度，及反應物的擴散係數的平方根成比例。另一方面，如果已知液態檢體中的物質之擴散係數，則可推論出其濃度。在另一類安培量測槽中，於美國專利第6, 284, 1 25號所揭示的薄層槽（thin-layer cel 1 )，工作電極和輔助電極放置位置相當接近彼此。在本例中，電活性物質的濃度及其擴散係數兩者皆可量測’不需要先知道其中任一參數〇在各實施例中，I不一定要將工作電極上的電壓設定在能使工作電極的電活性物質濃度維持在零（即一般擴散限制區 the normal diffusion limited regime)，只需要使流過的電流至少有部分是因物質傳輸到電極所引起的。例如，可將工作電極的電壓設定在能使電活性物質以特定速率傳輸到電極，在電極上反應作用掉的電活性物質的里和因電活性物質濃度造成物質傳輸，到達電極的置，兩者

第10頁丄錫/81 五、發明說明（7) 間的化學平衡維持在田 rnnr, , + .、在所明電活性物質成團濃度（bulk concentration)的 Rn。/。& ^ ^ όίι ^ ^ ii ^ ^ 接者，當到達電極的電活性物質移向^二點，对内的障壁形成影響而減少，則化學平衡會質I Ϊ :農产的ΤηΓ電極的電活性物質濃度是所謂電活性物 ' 1又 ° ’於是流過電極的電流會改變，如

Butler-Volmer等式炻 + , m lLB=_ 飞所不因此顯示檢體内障壁形成的變化0

不定要使用能產生直流電的電壓來執行測量，也可使用會產生交流電的電壓，例如可使用方波/正弦電壓，電壓波的代表振幅和頻率是3〇 Mv， 5 Hz，這特別適用於田施以電壓的兩電極之一有塗佈試劑，可形成障壁反應，而另電極則無试劑時。在本例中，電流訊號之不對稱性可做為量測是否有任何障壁形成之利器。本發明之實施例是從如下所述之數值至少一測得電流值，濃度值和擴散係數’得到可限制或減緩電活性物質移動之障壁值；一般而言，此法是用以量測凝集反應形成之障壁；然而障壁也可在其他狀況下形成，例如’可能由其他群聚反應（clumping reaction)，

固定電活性物質之反應’或使電活性物質和緩慢移動物質相結合之反應形成障壁。熟知技藝者會發現，雖然本發明之實施例是運用安培檢測技巧（amperometric techniques)，也可運用庫倫檢測技巧（c 〇 u 1 〇 m e t r i c t e c h n i q u e s )-即測量流過工作電極的電荷以替代電流，（通常測量電流時間的關係，再積分

第11頁 1338781 五、發明說明以獲得電本發電極和一可選擇電壓，供或是把輔除了特殊身及輔助在一用或不易果工作電下，它必極是作為須不易產有金，白氧化錫，混合物或列陽極材在本一測試成在本詞是用於 -般而言體，其中 (8) 荷）取得障壁形成值。明實施例之安培測試槽至少含有兩電極，一工作輔助電極，當檢體注入槽内時，可觸及液態檢體性加入第三電極，參考電極，用途在於提供參考工作電極比較。實際上，常常並不需要參考電壓助電極同時當參考電極/輔助電極使用。因此，情況，否則"輔助電極"此一名詞可指輔助電極自 /參考電極兩者。般使用狀況下，工作電極必須以不易和化學物作產生電化學氧化或還原反應的物質製成；例如如極是作為陽極，在它被使用的電壓和化學環境之須不易產生化學性或電化學性氧化。如果工作電陰極，在它被使用的電壓和化學環境之下，它必生化學性或電化學性還原。適合製作陽極的材質金，把，銀，碳（graphitic carbon) > 氧化銦，混合銦/錫氧化物，不錄鋼，水銀。這些材質的合金也適用。適合製作陰極的材質包括上述所質，還有例如銅，鋼，錄，紹*絡，及銀。發明之各實施例的電解槽内，含有一待測成分，分和至少一電活性物質，以獲得障壁形成量值。文中，"待測成分”（s u b j e c t c 〇 m ρ ο n e n t )這一名形成障壁反應的物質，也就是特性不明的成分。，待測物是待檢測是否有障壁形成反應的液態檢的一部分的形式，出現在電解槽内。檢體也可

第12頁 1338781 五、發明說明（9) 被置於含孔膠質内，或微孔轉膜内。然而，熟之習知技藝人士會發現此反應可反轉-例如.；待測物也可用於測試中 ’以測定它引起障壁反應的能力。同樣地，"測試成分"（t e s t i n g c 〇 m ρ ο n e n t)是指用以測試待測物，含有已知特性的成分。測試成分通常是在含有待測物的液態檢體被放入電解槽内之前，就先置入電解槽中。然而它也可以在檢體被放入電解槽内之前或之後，先加入液態檢體内。 n電活性物質”（e 1 e c t r 〇 a c ΐ i v e s p e c i e s )是指可在工作電極交換電子，引起電流流入電解槽内的物質。電活性物質的出現，可能是因測試成分和待測成分之間發生障壁反應所生成的物質。或者它是被加入液態檢體中（或單獨被放入電解槽）。在此文中，”標的成分"（target component)—詞是指會和測試成分反應作用的物質，可能會也可能不會出現在待測成分中。在此文中’ ”凝集"（agglutination)—詞，最廣義而言’是指在凝集素出現後，含有結合位的可凝集物質會集結成塊。凝集素（a g g 1 u t i n i η )是種對於結合部位具可產生特異性反應的物質’而此結合位存在於一種以上的物質内’藉此使可凝集物質產生交叉鍵結，也就是產生一般的格子狀般結構。藉著凝集素和特定分析物（analyte)結合特異性’可量測在混合化合物内是否有待測分析物。凝集反應的發生’ 一般需要凝集素和可凝集物質的濃

第13頁 1338781 五、發明說明（10) 度相配合。過多的凝集素會使可凝集物上的結合部位飽和 ’因此可凝集物間無法形成交叉·鍵結。而過多的可凝集物質會迅速的和凝集素結合，因而降低可凝集物質之間形成交又鍵結的可能性。對熟知技藝人士而言，他們可迅速決定發生特定凝集反應的理想狀況。凝集反應可用於量測可凝集物質結合部位是否出現，例如提供抗原所需的凝集素，以量測紅血球表面的血型抗原；或者是否有凝集素出現，例如提供可凝集物質，以量測會和細胞表面標記物作用之循環抗體於是，視各種不同應用而定，"待測成分s ub j e c t c 〇mροn en t"，可能是凝集素，而相對應地"測試成分tes t i ng componen t"可能是可凝集物質，或是相反地，"待測成分sub ject component"是種可凝集物質，而相對應的"測試成分 testing component"是凝集素。適合凝集反應的物質包括特殊的載it (carrier)，載體表面包被有特定類的結合部位，例如乳膠微珠，膠狀金質微粒’炭微粒，或表面吸附有抗原之紅血球。其他具有特定結合部位物的載體還有電化學槽内，會交叉鍵載或凝集成擴散障壁的聚合物（p〇lymer)。這些聚合物可能是可溶於或不溶於檢體基質内。例如適用於水狀檢體的的不溶性聚合物包括聚苯乙烯，聚合碳酸鹽類，聚合磺胺。這些聚合物最好是呈細絲狀。適用於水狀檢體的的可溶性聚合物包括聚丙烯酸，聚乙稀醇’聚乙硫酸鹽，聚酯類磺酸鹽（ester 1338781 五、發明說明（11) '---% sulfonate)，聚苯乙烯磺酸鹽，具有四價銨基的聚笨乙。理論上這類微粒或聚合物都已懸浮在溶液中。另一類歸有特定結合部位物的載體是小分子物質，當標的成分出^ 時’會和小分子物質交叉鍵結’形成體積較大物質，可現緩電活性物質的移動。這類系統其中的一例去氧膽延鈉（sodium deoxycholate)是種小分子物質，其特定部位在叛酸基（carboxylic acid)上，可形成去氧= 的一部份，而標的物為鈣，可和去氧膽酸鹽交又鍵社。·^ 外，可凝集物質可能本質上就可在其表面表現抗原了 $ 在紅血球表面表現的血型抗原，或表現在像細菌，黴病毒顆粒等微生物的表面抗原。 ’ 凝集素（agglutinin)是一種可結合兩種或以上可物質的分子’特別是在不同的顆粒間，可形成交又鍵择t 伴隨發生的格子狀結構。凝集素一般包括免疫球蛋白 (imnuinoglobulin)，特別是 Μ型（IgM：^ ㈣（jgG)免浐白。這類免疫球蛋白可能是來自血清的多株抗體或^藉J 織培養，腹水，或重組DNA技術所製造的單株抗體。多株抗體或是各種單株抗體混合物可用於和同樣顆粒上的不同抗原結合位（epitope)結合。因含有免疫球蛋白胺基酸序列，所以有所需抗原結合特異性的合成分子（synthetic molecule)也可列入考慮《有經驗人士會發現，在凝集反應中’具有抗體抗原結合特異性的人造抗體變體 (artificial antibody variants)也可作。這類變體包括有兩種以上抗原結合序列的嵌合分'子 1338781 五、發明說明（12)

(chimeric molecules)。這轉嵌合分子的抗原結合部位可能有同樣的抗原結合特異性，也可能是不同的抗原特異性。有經驗人士會發現嵌合分子含有的結合部位，可能是針對抗體或其他物質，例如植物凝集素（lectin)，咬兩者兼具。其他具有抗原結合特異性的分子’也可作為凝集素使用。例如’植物凝集素（lectin)被證實對末端的酿類殘基 (terminal carbohydrate residues)有特異十生，戶斤以可作為凝集素用，不管是原型或經過修飾，如形成 (dimer)’寡聚體（〇1 i gome rs)或具有多重結合部位的嵌^ & 式多胜鍵（chimeric polypeptides)’如此一來它們才可以隨時和一個以上的抗原顆粒表面起交互作用。依據本發明的_實施例，流入安培檢測槽 Camper ometric cell)的電流是用於量測液體檢體内發生的障壁形成反應（barrier formation)。電流的量值可用於評估障壁形成反應的程度。例如，利用特定量的待測成分和測試成分’根據實驗數據’流入電解槽的電济可被校準’用於計算障壁形成值。而電流量值隨時間的變化也可用於獲得檢體内電活性物質的擴散係數，或者藉電活性物質擴散係數隨時間的變化，獲得障壁形成的數值β

置值（magnitude)的變化或其比例可用於決定障壁形成反應是否發生及/或障壁形成生成物的量。同樣地，這些測量可以被校準（cal i bra ted)，以計算特定待測成分及測試成分。在電化學槽内障壁形成反應不同位置的差異也可算出。例如藉著將障壁形成反應試劑-測試成分塗佈上

第16頁 1338781 五、發明說明（13) 槽内的一電極電流通過伴隨之實施例中極，接，讓另電極上體不含壁形成同或測響。此別是在這類型抗原的抗Rh型在極，面的測試壁形成工作電另一電的電流分，因在此實熟悉習著測量一電極的檢體障壁形的情況試時週實施例單一安的應用測定，抗體。本發明對面放成分塗試劑的極，而極成為。此實此易於施例中知技藝或在附近，但界一電極則無，如此則可評估障壁形成或沒有障壁形成的情況。在本發明，可先設定一電極的電壓，使其成為工作電槽内流過的電流。接著調整兩電極間的電壓成為工作電極，再次測量電流。如果在工作含有障壁形成試劑但在另一工作電極上的檢成試劑，那麼可比較兩者之電流，以評估障。此實施例之優點在於可避免因檢體基質不遭環境不同，可能會對障壁形成評估造成影也可用於測定是否有障壁形成反應出現，特培檢測槽内發生的不同物質間的凝集反應。，例如人類紅血球單一檢體内，A，B，及Rh型使用3個工作電極，上面覆蓋有抗A，抗B，及的一較佳置著。依佈在一電測試成分另一為輔工作電極施例之優製造，同，電活性者會發現實施例中本實施例極上，而。將不含助電極。，而測量點在於電時降低測物質必須結合反應，電極的設定是有兩電而言，含有障壁形成試劑在另一電極上塗佈不含障障壁形成試劑的電極作為接著電壓的極性反轉，使這含有障壁形成試劑電極極層可分別塗佈上測試成試成分互相污染的機率。 \ 偈限在障壁形成試劑内。 (binding reaction)較像

第17頁 1338781 五、發明說明（14) 是固定反應（immobilisatio.n)的一種，而非凝集反應。在此實施例中，測試成分和電活性物質是相同的，而待測成分會固定電活性物質。一般而言，這類實施例中，固定每 -電活化物分子，需要一分子的待測分析物（a n a 1 y t e )，所以只適用於分析物濃度較高的狀況。在本發明的另一較佳實施例中，兩電極如上所述裝置，如此則在測試時，輔助電極的生成物會和工作電極反應，如本文參考資料中所述，美國專利第6, 2 84, 1 2 5,所揭示的薄層槽（thin-layer cell)。在美國專利第6,284， 125, 所揭示的電解槽中，擴散係數可確實測量，不受所用工作電極面積，或電活性物質出現的濃度影響。.藉交替使用每一電極作為工作電極，一電極不含障壁形成試劑，而另一電極塗佈有障壁形成試劑，藉分析每一狀況之電流，算出擴散係數，可更直接測量障壁反應是否出現，較不易有製造誤差（fabrication errors)，例如當實驗者只有部分參予，將檢體注入電解槽内的過程時，電極可能不會出現假定面積（assumed area)誤差，或使用者誤差。在本發明這類的另一實施例中，在測試時，只有一電極作為工作電極。在此實施例中，在將檢體加入感測槽 (s e n s 〇 r c e 1 1 )後，適當的一小段時間後，測量流過工作電極的電流，和檢體加入感測槽後，經過較長一段時間後，測得的電流相比。所謂適當的一小段時間是指，在標的成分出現情況下，電解槽内預期會有許多量的障壁反應物出現前的時間。適當、較長的一段時間是指，在標的成分

第18頁 1338781 五、發明說明（15) 出現情況下，電解槽内預期會有許多量的障壁反應物出現的時間。預期會有許多量的障壁反應物出現前的時間是指障壁形成量測參數變化小於總變化約2 0 %，最好是小於1 0 %值的時間。參數總變化值是指檢體中的障壁完全形成時，該參數的變化量。預期會有許多量的障壁反應物出現的時間是指障壁形成量測參數變化超過總變化約5 0 % ，最好是超過7 0 %值的時間。參數總變化值是指檢體中的障壁完全形成時，該參數的變化量。實際上，這些時間點是可藉著考慮檢體範圍内可能的障壁形成動力學範圍及裝置測試情況，以選出範圍内最合適的時間。或者是，藉著評估障壁形成量測參數隨時間的變化速率，可找出個別測試適當的時間點。熟悉習知技藝者很顯然會知道障壁形成量測參數的變化本身，也可用於量測待測試物質是否出現或其濃度。藉著比較不同時間點測得的電流值，可測得所發生的障壁形成反應值，這樣得到的結果，比較不會受到檢體基質，或測試溫度的影響。在此實施例中，如果電解槽内的工作電極離辅助電極夠遠，那麼輔助電極上的反應生成物，在測試時不會觸及工作電極，可於短時間内，在兩電極間加上電壓差，以量測短時間内之電流。接著關閉電流，讓電活性物質的濃度階梯（concentration gradients)回復。接著再次於較長

第19頁 1338781 五、發明說明（16) 時間内，在兩電極流。在某些案例中形成反應值。操作本發明之間加上電壓差，以量測較長時間内之電，這樣可得到較準確的，已發生的障壁本實施例需要知道障壁形成反應動力學如此一來，才能知道是否有足夠時間，在障壁形成反應明顯發物出現成再次在應，特反應的原或抗抗體。在要有適在液態測試成體，或可溶性磺酸鹽有聚苯抗原或細胞或測生前，去量，障壁形成的測量。本發明之某別是凝集反結果。測試體組成部分本發明這類當分子大小檢體中，這分例如和可是和不溶性聚合物包括，聚乙烯醇乙烯，乳膠抗體也可能細菌。試成分分子測液態檢體的電流訊號*但是要在分析反應完成前，這段相當短的時間内，完些實施例中，在槽内發生的障壁形成反應，是單一 /多重抗原和單一 /多重抗體成分可以是單一抗原或抗體，或者該抗測試成分，而標的成分含不同的抗原或實施例，其中一較佳實施例，測試成分及官能基，使其不需過份攪拌就可懸浮樣它才能引致有效的擴散障壁。合適的溶於液態檢體之聚合物結合的抗原或抗小珠或纖維結合的抗原或抗體。合適的聚丙烯酸，聚乙烯基硫酸鹽，聚苯乙烯。適合製造不溶性小珠或纖維的材料，或聚丙稀醢胺（acrylamide)。另外，是位在細胞表面，如懸浮液中的紅血球並不一定要很大，大到自己本身足夠引

第20頁 I33878l 五、發明說明（17) =$散障壁。例如如果標的成分分子夠大，足以引起擴散在^ ’則測試成分分子就可以很.小。這類標的成分包括位、、、表面的抗原’而剛試成分就是針對細胞表面抗原作 $的k體’會引起細胞的凝集。在將檢體加入槽内之前，將細胞或其他顆粒懸浮於檢體内，這些凝集顆粒只要大 J及/或密度適當，它們在測試時就不會沉積在細胞上，至少是以非凝集形式存在。 θ 在本發明這類實施例中之另一實施例，測試成分可以疋會和相當大顆粒-如細胞結合，以及標的成分結合的物，。同時，在本實施例，標的成分可和超過一種以上的測 j成分結合，如此一來，藉著和至少兩種測試成分結合，每一測試成分又和個別的微粒結合，則微粒會形成障壁^ ^ 在某些實施例中，和液態檢體作用的測試成分被乾燥後’放入電化學槽内^乾燥的測試成分可以觸及至少一電極或是置於槽的内壁。此外，測試成分也可在槽外，在注入電化學槽前，以乾燥型態，和檢體反應，溶解於其中。測試成分可能包括電活性物質或其他和液態檢體接觸後，會形成電活性物質的物質。此外，電活性物質可能已經出現在待測試的檢體中。可以已知電活性物質濃度，但對本發明的某些實施例而言，這不是必要的。例如，先前所述的以薄層槽（t h i η - 1 a y e r c e 1 1 s )測量電活性物質的擴散係數’就和出現的電活性物質濃度無關，不受影響。同樣地 ’如果要比較電流訊號，那麼這對比常常和電活性物質濃度無關。電活性物質必須要能在檢體中溶解及移動β合適

第21頁 1538781 五、發明說明（18) 的電活性物質例如 Fe(CN)6 ，Fe(CN)4-，Cr3 +，C：f2072-， Cu2 +，Co(NH3)63 +，Co(NH3)62 +，.Sn4 +，I-，Br_離子。

如同電活性物質，試驗物質可能也含有電活性物質的可溶性氧化還原共軛氧化劑，或是還原劑，或第二種的可溶性電活性物質’可和輔助電極作用，完成電化學電路。此第二電活性物質最好比第一電活性物質的量要更多，如此它才不會限制電化學槽中，電流的流動β在其他設計中，輔助電極可藉如習知中所述，不溶性物質的氧化或還原反應，完成電路。適合這類輔助電極的物質有銀/氣化銀，銀/溴化銀，汞/氣化汞，汞/硫酸汞。測試成分可能也會含有緩衝液，以控制酸鹼值，同時可穩定試劑及其他有助於促進檢測器可用性的添加物。例如可加入表面活化劑’及聚合物’有助於乾燥試劑的製造成形及/或改進檢體注入槽中的方式’改善細胞表面的親水性。合適的緩衝液有磷酸鹽，碳酸鹽，蝴酸鹽，2_甲基馬來酸鹽（citraconate)’檸檬酸鹽，笨六曱酸"鹽 ^

(mellitate)。合適的介面活性劑有Trit〇n x_；^〇， tween’ Brij 35’ Brij 20 piur〇nicSe 注意當液態檢體或細胞測試成分中含有蛋白質時，所用的介面活性劑不能使蛋白質變性，否則可能會干擾實驗結果。同時，如果測試成分中有會氧化血紅素的氧化劑，則所用的介面活性劑，要小心不能破壞紅血球，因為游離的血紅素可能會被氧化，因而干擾感應器的電流訊號。然而在某些實施例中，凝集反應的測量和出現的電活性物質濃度無關時，關於這

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1338781 五、發明說明點就不那在本撿體，注電極或輔體至少溶則會起内流過量。為了量壓差，而電化學氧相對應的兩到足以濃度有效來測量障如上上的測試解槽内之 (19) ----- 麼要求，不重要了。 !::較佳實施例+ 將用於測試標的物的液態 /少兩電極之槽内，一工作電極和一輔助姐2極，退有乾燥的測試成分◊等液態檢 ::7刀乾燥的試劑，如果測試成分中有標的成分 3乂在液體中形成障壁物質。ϋ著量測電解槽間的電流特性，可監測障壁形成反應的發生測電極間的電A，對工作電極和輔助電極施以電此電壓差需強到能使工作電極/液體介面間發生化或還原反應，而在輔助電極/液體介面間發生還原或氧化反應。再者，電極間的電壓差應該要使在工作電極/液體介面間被氧化或還原的物質維持在零。障壁形成量測器具，一般是指從電流壁形成數值的設備。所述’在本發明的另一實施例中，一種或一種以成分就已存在液態檢體中，或在液態檢體注入電前，加入液態檢體中。在其他實施例中’液態檢體可能是多孔膠質，如澡膠 (瓊脂agarose gel)，障壁形成反應會在此膠質内發生'。另一種可能是障壁形成反應發生在包覆在電極上的微孔薄膜内。這些配置（configurat ions)也可使用塗有障壁形成試劑的微珠，而這些微珠能懸浮在小孔内，當障壁^成時 ’會堵住小孔’因此關於微珠必須要能於懸浮在檢體中的此一實驗條件，可以免除。

1338781 五、發明說明（20) 在某些實施例中，由超過一個以上的電化學槽組成單一裝置，以便用一台裝置就可測量多重障壁形成反應。在本發明這類實施例其中之一’可使用不同的電化學槽，如此則至少各不同槽内的工作電極可分別被連接到外部電路。這樣可分別監測各工作電極流過的電流。此外，電化學槽也可以微陣列（microarray)或其他已知結構出現，提供多種測試成分。

在本發明這類實施例之中，一較佳實施例，不同電化學槽内的工作電極可用相同連接法連接到一電流量測電路，特別是當電化學槽是設計作單一用途使用，接著鱿要處理掉時，尤其適用。例如本裝置可以是一狹長裝置，含有多個電化學槽，連接上一用於分析檢體的量測表，剛試後，此狹長裝置就被丟棄。對這類單一用途裝置的操作者而言’要將狹長裝置的成本降至最低，量測表的複雜性降到最小。因此會較偏好使用連接量測表數目最少的狹長事置

本發明中，這種實施例之一的使用方法是將檢發注入第一個電化學槽，同時測量可標示凝集反應發生的電流，因此就可知在測試的這一部份，這一端，第一個電化^槽内的電流，同時可預測較長時間後的電流值。 9 接著將檢體注入第二個電化學槽，接著測量第二電# 值，可顯示在第二個槽内的障壁是否形成。為了正確剛= 第二個槽内的電流，將流過總電流扣除流過第一個槽，已知的電流。在測得第二個槽内的障壁反應完成後，如禾同

第24頁 1338781 五、發明說明一裝置含電流狀態流量扣除在一電化學槽並形成障將流過先入液體的為更例。在此定血型。依據置内進行說的狹長狹長裝置第二槽内抗原的抗狹長裝置連接到一，電路可器也包括示結果，可能是一以獲得預是否出原，及所需量内有三不同狹測試成試成分用時，置，可兩電極在一較分析測其他設器可能包括一取樣裝置 (21) 有其他電化學槽，則必，這樣當笫三槽裝念實這兩者，以此類推。具多重電化學槽裝置的，所以經一段適當時間壁的電化學槽内的電流前已填入液體的電化學電化學槽之電流扣除。了解本發明，以下提供應用中，以紅血球表面這些抗原為A抗原，扮宄本發明之實施例，定型，或最好是在單一裝置裝置。如果電化槽是在内，第一槽内含有第一含扮充原的抗體（第二測體（第二測試成分）《使内，而計量器含連接裝電路。藉一至少可提供完成，同時量測電流。了一凝集測量裝置，可儲存結過及同時連接到改造過的安培計。計量期時間電的電流值。須知道第一槽及第二槽的驗物時，才能將流過的電較佳實施例中，槽是薄層後，流過任一已填入液體已經穩定時，可更正確地槽之電流，從流過最末填關於測定血型之應用範現三種抗原，來決 Rh抗原。測可在三個不同裝個槽，就是此處所長裝置内，或同一分A抗原的抗體， )，第三槽内含Rh 一計量器會被插入將狹長裝置之電結間所需電壓的電源佳實施例中，計量得的電流訊號’顯備。凝集測量裝置

第25頁 1338781 五、發明說明（22) 在此範例中，電極會被以面對面’相距約1〇〇微方式放置在槽内。含有濃度10m.M亞鐵氰化鉀化合物的試塗佈在所有三個槽内’較上位的電極上，而含有濃戶 1 0 OmM氰化鐵鉀化合物的試劑及抗體塗佈在所有三'個^槽内 ’較低位置的電極上。在第一槽内，是針對A抗原的抗體’第一槽是針對B抗原的抗體，而第三槽則是Rh抗原的抗體。使用時，操作者將全血檢體（待測成分 jriq ’並在電極間施以3 0 〇 mV電壓，而上位電極兔哩把 "^ , ^^陽極，妹县工作電極，而較低處電極為陰極，就是輔助電疋電流’同時將數秒後的電流值和一段足夠長時]紀錄下應已發生後紀錄的電流值做比較。由於在工作^，凝集反集試劑，因此工作電極附近凝集反應的起始會^沒有凝夠時間可紀錄能代表無凝集檢體的電流量。如，有足和較短時間測得的電流量比例低於事先預估長時間是代表測得抗原A (標的成分 > 问值’那就經過一段適當時間，如果在第一槽内的檢原，計量器會指示使用者將同樣血液的另—檢/得A抗槽内。注意這時在第一槽内的電流不是穩定值，j入第二預期型態隨時間而改變。一但使用者將第二槽，=是以可就紀錄第二次電流量，對應於流過第一及第二摊ΐ檢體，量。接著計量器將從第一槽已知的電流值扣除「、、總電流二槽的電流值。如同前述，檢查較短時間及較=取得第電流，看凝集反應是否發生。夺間點的

第26頁 1338781 五、發明說明（23) 在第二槽内測得B抗原後適當時間，計量器會指示使用者將同樣血液的另一檢體注入.第三槽内。接著將已知的第一槽及第二槽電流值從總電流量中扣除，以取得第三槽的電流值。如上所述檢測電流，看凝集反應是否發生。從這三個結果，可確定A，B，A B及0血型，以及被分析血液是Rh陽性或陰性。注意血液檢體可以是來自微血管，靜脈或動脈。 :實施方法】圖la及 lb顯示了一適合的多重槽狹長裝置。圖la 顯示裝置之上視圖，圖lb顯示了裝置的戴面圖（未按適當比例）。此狹長裝置1 0内含有槽1、2、3在絕緣間隔層2 0上切開一缺口，位於上層2 1和下層2 2之間，而其内面分別塗佈上電極層2 3及2 4。有一連接點4可將電極層連接到外在的，位於計量器内的電路（未顯示出）。熟悉習知技藝者可迅速設計出一適當，可執行必要量測的電路。測試成分（未顯示）乾燥後，附在標號1、2及3之凹槽内，電極層2 3及2 4 的内面。範例1 :鈣之凝集感測器可作為一種測定本發明效力之 007"的 Melinex 453(r)薄膜上一種鈣之凝集感測器測試模型。將金子濺鍍到厚度為達30nm#，以製備金電極。一溶液含有44 mg/mL去氧膽酸鈉，214 mM鐵氰化鉀及

第27頁 1338781 五、發明說明（24) 〇. 1 1% Pluronic PE6 2 0 0 C—種非離子型界面活性劑），製被於27%乙醇/1.5%異丙醇/71. 5%水中。在金電極上塗佈此溶液並乾燥之。從雙面膠帶上切一厚度為1 〇 7Cm之方形開口。將膠帶叠合上金電極’使開口覆蓋在乾燥化學物表面。第二個覆蓋有上述試劑的金電極疊合上膠帶的另一面，形成了一個帶有輔助電極的電化學槽。切開這三層構造，使電極面積龟〇. 0 9 85 cm2 ，在方形孔的一端有些開口，可作為檢體住入口，及感測器所需的空氣出口。兩電極接上恆電位儀（？〇161^1〇5131；)，將91111^亞鐵氰化卸溶液’含有〇 - 3 〇 m Μ氣化鈣’注入電化學槽。施以-〇 3 V電壓2 5秒，接著是+ 〇. 3 V，1 〇秒》在施以+ 〇 . 3 ν電壓後〇 . 2知測量電流。圖二顯示了各種不同濃度鈣溶液的電流。已例2 :檢測凝乳酵素之蛋白質分解力的感測器另一類凝集反應是牛奶中的凝乳酵素（renn in)活性。，礼酵素會將牛奶中酪蛋白上的親水性磷酸化多胜切下， =不溶性的蛋白f。接著這蛋白會會形成優格或乳酪。 β φ Γ種量測凝乳酵素的感測器，將乾燥的牛奶或酪蛋白電活性物質放入電化學槽内。如果注入槽内的液體含有 ς活性之凝乳酵素’那麼藉著在電極間施加電流，並分析 ί f::換，即可量測出接著會發生的凝集反應。 ^ ^ w如範例2中所述的酵素分析可用於免疫分析’此分可於單槽内執行，無須清洗步驟，也不需固定時間步

第28頁 1338781 五、發明說明（25) 驟（f i X e d t i m i n g s t e p ) 〇此免疫分析之特性參見圖三。感測器包括—單〆槽， =有一上表面30’可作為一電極，或一般聚合物成其他物質形成之表面，還有一較低電極3丨。較低電極3丨塗佈有酪蛋白（乳蛋白）3 2。上表面3 〇則被覆有固定化抗體 (immobi 1 ized antibody)(顯示為γ形結構33)，附有抗原-凝乳酵素3 4標示物（c ο n j u g a t e )，非共價性結合到抗體上的抗原結合部位，形成抗體-抗原-凝乳酵素層3 5 β 一對還原氧化偶之氧化型及還原型混合物，例如鐵氰化物和亞鐵氣化物的混合物’塗佈到較低電極和/或較高電極/表面。當含有未知濃度抗原的液體注入槽内，游離的抗原會和抗原-凝乳酵素標示物競爭。接著標示物會向下擴散到絡蛋白層’啟動酪蛋白的凝集反應，在緊鄰較低電極31處形成障壁層◦藉著施以固定電壓及監測電流，凝集的過會持續，或是藉著施以本應用它處中所述之電壓脈栴^王序列

’在不同時間監測還原態或氧化態之還原氧化物質的 J 係數’或是快速反轉電壓極性，並隨時間變化監測尖4散流。流過較低電極的電流幅度和變化速率會和凝隼電時間變化的程度有關聯，也就是它會和檢體溶液中久應隨的抗原 J辰度成正比對熟悉習知技藝者而言，各種本發明的改良，皆視為落入此處所述本發明的反範圍内。〜被

第29頁 1338781 圖式簡單說明圖1 a及1 b顯示了一較佳實施例的多重槽（mu 11 i -ce 1 1 )裝置。圖2是範例2中不同鈣濃度時的電流圖。圖3顯示了範例3之免疫感測器。

Claims

1338781 六、申請專利範圍祝. .7丨-太【申請專利範圍】 · > 1 . 一種測量可減緩或限制電活性‘物質移動的^聲壁形成的方法，包括：提供一電化學槽，含有一工作電極及一和工作電極隔開的輔助電極；槽内提供含有一待測成分，一測試成分和至少一電活性物質，待測成分和測試成分是藉凝集反應以形成障壁，該障壁可限制或降低電活性物質的移動；在工作電極和輔助電極間施以電壓1而此電壓足以產生和工作電極上測得的電活性物質移動的速率相關的電流；測量在工作電極上的電流，以獲得可減緩或限制電活性物質移動的障壁形成數值。 2,如申請專利範圍第1項所述之方法，其中測試成分的障壁形成通常取決於凝集的程度。 3 ,如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所施以的電壓足以維持工作電極上，電活性物質的濃度。 4.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中測量電流的步驟包括在槽内預計顯著障壁形成前，第一次測量，及顯著障壁形成的第二次測量，並且從測得電流的差異，獲得該障壁形成的數值。 5 .如申請專利範圍第4項所述之方法，包括選擇第一次測

1338781 六、申請專利範圍量時間，此時間是指障壁形成測量參數的變化大略低於或預計低於障壁完全形成時，該參‘數總變化值的2 0 %。 6 .如申請專利範圍第5項所述之方法，其中障壁形成測量參數的變化約小於總變化值的1 0 %。 7 .如申請專利範圍第4項所述之方法，包括選擇第二次測量時間，此時間是指障壁形成測量參數的變化大略超過或預計高過障壁完全形成時，該參數總變化值的5 0%。 8.如申請專利範圍第7項所述之方法，其中障壁形成測量參數的變化約超過總變化值的7 0 %。 9 .如申請專利範圍第4項所述之方法，包括第一次和第二次測量時間的選擇，是藉評估障壁形成測量參數隨時間變化的速率來評估的。 1 0 .如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所測得電流的差異可用於取得電活性物質的擴散係數，從而獲得障壁形成的數值。 1 1 .如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所測得電流的差異可用於取得擴散係數的差值，從而獲得障壁形成的數值。 1 2.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中提供待測成分的步驟是指著將含有待測成分的液態檢體注入槽内。 1 3 .如申請專利範圍第1 2項所述之方法，其中提供測試成分的步驟是指在液體檢體注入槽内之前 > 先將測試成分注入液態檢體中。 1 4 .如申請專利範圍第1 2項所述之方法，其中提供測試成

第32頁 1338781 六、申請專利範圍分的步驟，是在液體檢體注入槽内之前，先將測試成分注入槽内。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項所述之方法，其中測試成分經乾燥後，再放入槽内。 1 6 .如申請專利範圍第1項所述之方法，包括了藉測試成分和待測成分間的反應，以提供該電活性物質。 1 7 .如申請專利範圍第1項所述之方法，可藉測試成分，提供該電活性物質。

1 8 .如申請專利範圍第1項所述之方法，其中藉障壁形成反應以提供電活性物質，本方法進一步包括兩電極，可作為工作電極，並在兩電極之一附近或其上提供測試成分；本方法進一步包括改變施加的電壓或量測電路上電流，以轉換該工作電極，同時量測兩工作電極之電流，藉以取得障壁形成的量測值。 1 9.如申請專利範圍第丨項所述之方法，其中測量電流是為了獲得電荷數值，以取得障壁形成的量測值。

2 0 .如申請專利範圍第1項所述之方法，其中待測成分和測試成分是用以引起障壁形成，當該待測成分含有標的成分時，同時此方法進一步包括在測量障壁形成時，測定該標的成分是否出現。 2 1 . —種測試標的成分是否在待測成分中出現的方法，包括：提供一電化學槽，含有一工作電極及一和工作電極分隔之輔助電極；

第33頁 1338781 六、申請專利範圍槽内提供一待測成分，可能含有或不含標的成分，一測試成分和至少一電活性物質，’當標的成分出現時，待測成分和測試成分可藉凝集反應形成障壁，限制或降低電活性物質的移動；在工作電極和輔助電極間施以電壓，而此電壓足以產生和工作電極上測得的電活性物質移動的速率相關的電流；同時測量在工作電極上的電流，以測定可減緩或限制電活性物質移動的障壁是否形成，從而測定待測成分中是否出現該標的成分。 2 2 .如申請專利範圍第2 1項所述之方法，其中測量成份的障壁形成通常取決於凝集的程度。 2 3 .如申請專利範圍第2 1項所述之方法，包括施加電壓，該電壓足以維持工作電極上，電活性物質的濃度。 2 4 .如申請專利範圍第2 1項所述之方法，其中測量電流的步驟包括在槽内預計顯著障壁形成前，第一次測量，及顯著障壁形成的第二次測量，並且從測得電流的差異，獲得該障壁形成的數值。 2 5 .如申請專利範圍第2 4項所述之方法，包括選擇第一次測量時間，此時間相對應於障壁形成測量參數的變化略低於障壁完全形成時，該參數總變化值的2 0 %，最好是小於總變化值的1 0 %，而選擇第二次測量時間，此時間是指凝集測量參數的變化略超過檢體總變化值的5 0%。 2 6 .如申請專利範圍第2 5項述之方法，其中所選擇的第一

1338781 六、申請專利範圍及第二時間點個別相對應於缚變化值，約低於1 〇 %及約超過70%之時。 . 2 7 .如申請專利範圍第2 1項述之方法，從所測得電流的差異可用於取得電活性物質的擴散係數，從而獲得障壁形成的數值。 2 8 .如申請專利範圍第2 1項述之方法，進一步包括從所測得電流的差異，測得擴散係數的變化值，從而獲得障壁形成的數值。 2 9 .如申請專利範圍第2 1項述之方法，其中藉障壁形成反應以提供電活性物質，本方法進一步包括兩電極，可作為工作電極，並在兩電極之一附近或其上提供測試成分；本方法進一步包括改變施加的電壓或電路上測得的電流，以轉換該工作電極，同時量測兩工作電極之電流，藉以取得障壁形成的量測值。

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