CN104792850B - 用于检测和监测蛋白质基质的蛋白水解的系统和方法 - Google Patents

Abstract

提供用于检测和监测蛋白质基质，诸如纤维蛋白凝块、细胞外基质和胶原基质的蛋白水解的装置和方法。所述装置和方法大体包括对由合成蛋白质基质中的电活性物类或电动元(elactomer)生成的扩散限制的电化学电流进行测量。所述装置和方法在各实施方案中用于检测和监控样品的蛋白水解活性，更具体而言用于检测和监控样品的纤维蛋白溶解活性和胶原酶活性。所述装置和方法通常用于监控和诊断心脑血管和肿瘤状况。

Description

用于检测和监测蛋白质基质的蛋白水解的系统和方法

技术领域

本公开大体上涉及用于电化学测试的分析仪器和方法。本公开具 体涉及蛋白质基质的蛋白水解的电化学检测。更具体提供用于检测蛋 白质基质——包括纤维蛋白凝块、细胞外基质和类似的胶原或相关蛋 白质基基质（无论是内源性的还是合成的）的蛋白水解的新型装置和 方法。

背景技术

蛋白质基质对组织功能、组织再生、创伤愈合和止血等方面是重 要的。例如，许多真核细胞被蛋白质的细胞外基质包封，所述蛋白质 为细胞提供结构支持、细胞和组织确定以及自分泌、旁分泌和近分泌 性质，因此所述基质是正常细胞功能所必需的。在创伤愈合中，一连 串分子和细胞事件最初导致止血——防止失血。纤维蛋白在止血和创 伤愈合中发挥关键作用，因为其通过复杂的反应级联形成交联蛋白质 基质（凝块），最终步骤是通过凝血酶转化单体纤维蛋白原以形成交联 的纤维蛋白多聚体，其通常被称作凝块。

除了其在止血中的作用外，纤维蛋白形成是许多病理学和炎症状 况中常见的。例如，纤维蛋白沉积（血栓形成）与动脉粥样硬化、类 风湿性关节炎、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、心肌梗塞、肺栓塞、 深静脉血栓形成、自身免疫性神经病、肉芽肿病、寄生虫感染和同种 异体移植排斥相关联。也有证据表明血栓形成在神经退行性疾病中起 到作用。类似地，胶原酶在浸润性癌中起到重要作用，在此它们破坏 健康组织中的细胞外基质以致原发性肿瘤细胞能够逃脱它们的原生环 境并随后侵袭远端组织而形成远端转移酶。

有趣地，蛋白质基质，如细胞外基质和纤维蛋白凝块通常是动态 的，即该基质可作为病理学过程或正常生理学过程的一部分形成和降 解。实际上，止血可以被视为维持纤维蛋白凝块形成与这些凝块被酶 或凝血因子（包括纤溶酶）蛋白降解之间的平衡。

检测或监测蛋白质基质形成，如血块（血栓）的方法包括例如测 定凝血的方法，例如凝血酶原时间、凝血酶凝血时间或用于纤维蛋白 原测试的Clauss方法，有商业装置可以以便携的定点照护 （point-of-care）的形式进行这样的凝血测试。但是，用于检测或监测纤维蛋白溶解的试验通常限于在专业实验室中和对原生纤维蛋白凝块 的复杂方法，例如血栓弹性测定法（thromboelastometry，TEM），而不 适用于定点照护或现场诊断。另一些方法使用比色或荧光检测法，也 昂贵、复杂，且受样品的颜色或浊度的负面影响，因此对纤维蛋白溶 解的及时性和灵敏性检测和监测无效。

因此对用于检测和/或监测蛋白质基质的蛋白水解的新型和改进的 装置和方法存在需求。特别地，例如，检测和监测蛋白水解活性，如 纤维蛋白溶解或胶原、细胞外基质或其它类似蛋白质基质的分解的电 化学和相关分析技术可以为医学健康提供有价值的诊断和监测工具。

发明内容

因此，本公开的一个目的是提供用于检测和监测内源性或合成蛋 白质基质的生理学和病理学相关的蛋白水解活性的新型和改进的系统 和方法。本公开的另一目的是提供能够检测和监测蛋白水解活动，如 纤维蛋白溶解或胶原和细胞外基质的分解的新型和改进的系统和方 法。

根据一个实施方案，提供用于检测或监测蛋白质基质的蛋白水解 的装置，其包括：(i)合成蛋白质基质,(ii)工作电极，和(iii)对电极， 其中该合成蛋白质基质与各电极的至少一部分接触，其中与该合成蛋 白质基质接触中提供第一和第二电活性物类，其中在暴露于样品时， 由第一电活性物类在工作电极处生成扩散限制的电化学电流，并由第 二电活性物类在对电极处生成反向电流，测量扩散限制的电化学电流， 该测量指示合成蛋白质基质的蛋白水解水平。

在另一实施方案中，该合成蛋白质基质是纤维蛋白凝块、血块、 富含血小板的血浆凝块、明胶、胶原基质之一，并且在基质在载体上、 载体内或载体周围形成。在再一实施方案中，工作电极大于对电极。 在又一实施方案中，第一和第二电活性物类为相同分子的相反氧化态。

在一个具体实施方案中，第一电活性物类是如本文中定义和公开 的电动元。在一个实施方案中，该电动元是聚乙二醇(PEGs)、聚乙烯 醇(PVA)、多肽、聚胺及其衍生物之一。在另一实施方案中，第二电活 性物类是小分子电活性物类，且第二电活性物类的扩散系数不同于该 电动元的扩散系数。在再一实施方案中，测定第一和第二电活性物类 的相对浓度以使工作电极处的基本所有电流由第一电活性物类而非由 第二电活性物类生成。在又一实施方案中，第一电活性物类是PEG-Fc （Fc-CO-NH-(CH₂CH₂O)n-NH-CO-Fc），且第二电活性物类是六胺钌(III) （Ru(NH₃)₆ ³⁺）。

在一个实施方案中，该样品是血液、血浆、间质液、其它体液和 具有已知蛋白水解活性的对照样品之一。

在另一实施方案中，该装置进一步包括适合使用预定公式或方法 分析扩散限制电流的测量结果的数据处理单元，由此产生指示蛋白质 基质的蛋白水解的结果。在再一实施方案中，该装置进一步包括适合 输出扩散限制电流的所述测量结果的输出单元，该结果指示蛋白水解。 在又一实施方案中，数据处理和输出单元之一是移动设备或移动应用 程序之一。

在一个实施方案中，对电极包括参考电极和辅助电极。

根据另一实施方案，提供检测或监测样品的蛋白水解活性的方法， 包括：(i)提供受蛋白水解活性影响的合成蛋白质基质，该合成蛋白质 基质与工作电极和对电极接触，(ii)与该合成蛋白质基质接触中提供第 一和第二电活性物类，(iii)使合成蛋白质基质暴露于样品，由此由第 一电活性物类在工作电极处生成扩散限制的电化学电流，并由第二电活性物类在对电极处生成反向电流，(iv)测量扩散限制的电化学电流， 该测量指示样品中的蛋白水解活性水平。

根据另一实施方案，提供检测或监测样品的纤维蛋白溶解活性的 方法，包括：(i)提供合成纤维蛋白条，已在该条上印刷工作电极和对 电极，(ii)与该合成蛋白质基质接触中提供电动元和小分子电活性物 类，(iii)使纤维蛋白条暴露于样品，由此由电动元在工作电极处生成 扩散限制的电化学电流并由小分子电活性物类在对电极处生成反向电 流，(iv)测量扩散限制的电化学电流，该测量指示样品中的纤维蛋白 溶解活性水平。

根据另一实施方案，提供检测或监测样品的胶原酶活性的方法， 包括(i)提供明胶条，已在该条上印刷工作电极和对电极，(ii)与该蛋 白质基质接触中提供电动元和小分子电活性物类，(iii)使所述明胶条 暴露于样品，由此由电动元在工作电极处生成扩散限制的电化学电流 并由小分子电活性物类在对电极处生成反向电流，(iv)测量扩散限制 的电化学电流，该测量指示样品中的胶原酶活性水平。

根据再一实施方案中，来自样品的扩散限制的电化学电流的测量 结果代表基线，该方法进一步包括使第二合成蛋白质基质暴露于第二 样品并测量来自第二样品的扩散限制的电化学电流。基线与第二样品 之间的差异指示根据这一实施方案的蛋白水解活性的变化。

在各种实施方案中，该测量基于计时电流分析法、电位阶跃伏安 法、线性扫描伏安法、循环伏安法、方波伏安法、阶梯伏安法、阳极 或阴极溶出伏安法、吸附溶出伏安法、交流电伏安法、旋转电极伏安 法、常规或差动脉冲伏安法和计时库仑分析法之一。

在另一实施方案中，在交变电流或多直流脉冲上进行该测量。在 再一实施方案中，该测量基于电化学阻抗谱，由此频域的变化指示样 品中的蛋白水解活性水平。

附图简述

图1描绘了根据本公开的一个实施方案的(A)金电极表面的电子 显微照片，比例尺为20μm；(B)在电极表面上具有在1xPBS（磷酸盐 缓冲盐水:137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM磷酸氢二钠，2mM磷 酸二氢钾，pH7.4）中的2%纤维蛋白凝块的金电极表面的电子显微照片，比例尺为20μm；(C)在电极表面上具有在0.1xPBS（13.7mM NaCl， 0.27mM KCl，1mM磷酸氢二钠，0.2mM磷酸二氢钾，pH7.4）中的 2%纤维蛋白凝块的金电极表面的电子显微照片，比例尺为10μm；(D) 带有多电极的传感器芯片的图像。所显示的是含有人纤维蛋白凝块的 过滤器的布置。

图2描绘了根据另一实施方案的(A)空白金电极、在表面上具有 纤维蛋白凝块的金电极和在用纤溶酶培养7分钟后的具有纤维蛋白凝 块的金电极的电流对时间图；(B)显示了金电极、具有纤维蛋白凝块 的金电极和在用纤溶酶培养7分钟后的具有纤维蛋白凝块的金电极的 电流响应的表；(C)将纤溶酶添加到金电极上的纤维蛋白凝块中后随 时间经过的电流提高；和(D)在将87nM纤溶酶添加到在金电极上用 2%纤维蛋白原和1单位凝血酶形成的15μl血块中后随时间经过的电 流提高。

图3描绘根据另一实施方案的(A)包含三个电极的本公开的系统 的一部分，其中电极与在孔径大约30微米的Whatmann113级滤纸的 5x5mm条中形成的纤维蛋白凝块接触。(B)含有人纤维蛋白凝块并被 K3Fe(CN)6浸渍的滤纸条。(C)被纤维蛋白凝块和K3Fe(CN)6浸渍并 粘贴到带有印刷金电极的传感器芯片上的滤纸条。所看见的是与测量 仪器（在这种情况中为恒电位仪）和参考银丝电极电接触的探针端。

图4描绘根据另一实施方案的(A)存在PBS或含10mM铁氰化物 (Fe(CN)6)的PBS的Whatmann113级滤纸条的循环伏安图；(B) Whatmann113级滤纸中的0.2%纤维蛋白凝块在10mM Fe(CN)6存在 下的电流对时间图，和Whatmann113级滤纸中的0.2%纤维蛋白凝块 在10mM Fe(CN)6和纤溶酶存在下的电流对时间图；(C)Whatmann113 级滤纸中的0.2%纤维蛋白凝块在10mM Fe(CN)6存在下的电流对时间 图；(D)Whatmann113级滤纸中的0.2%纤维蛋白凝块在10mM Fe(CN)6和纤溶酶存在下的电流对时间图。

图5描绘根据另一实施方案的(A)存在PBS或含50mM铁氰化物 (Fe(CN)6)的PBS的Whatmann113级滤纸条的循环伏安图；(B) Whatmann113级滤纸在PBS和50mM Fe(CN)6存在下的电流对时间曲 线图；(C)Whatmann113级滤纸中的2.0％纤维蛋白凝块在含50mM Fe(CN)6的PBS存在下在存在和不存在纤溶酶的情况下的循环伏安图； (D)Whatmann113级滤纸中的2.0％纤维蛋白凝块在PBS和50mM Fe(CN)6存在下并在存在和不存在纤溶酶的情况下的电流对时间曲线 图；(E)纤维蛋白凝块在存在和不存在纤溶酶的情况下的循环伏安图。 (扫描速率＝0.1V/sec)；(F)纤维蛋白凝块在存在和不存在纤溶酶的 情况下的电流对时间(i-t)响应(电位＝-50mV)；(G).纤维蛋白凝块 在存在和不存在纤溶酶的情况下的线性扫描伏安图(扫描速率＝ 0.1V/sec)。

图6描绘根据一个实施方案的聚合物电活性物类或电动元在蛋白 质基质或水凝胶的孔隙内和穿过其孔隙的扩散（底部），与小分子电活 性物类在蛋白质基质或水凝胶的孔隙内或穿过其孔隙的扩散（顶部） 形成对照。

图7描绘根据另一实施方案的PEG聚合物经过明胶基质/水凝胶扩 散的线性扫描伏安法(LSV)扫描。

图8描绘根据另一实施方案的PEG聚合物经过明胶基质/水凝胶扩 散的计时电流分析法(CA)扫描。

具体实施方案的详述

I.定义

除非本文中另行规定，本公开中提到的各种术语应具有本领域技 术人员理解的它们的公认含义。为清楚起见，下列术语对本公开而言 如下定义。

除非文中清楚地另行规定，本申请中所用的单数形式“一”和“该” 包括复数对象。例如，术语“基质”或“蛋白质基质”也分别包括许 多基质或蛋白质基质。除非文中另行要求或明确作出相反的陈述，本 文中作为单数形式的整数、步骤或要素列举的本发明的整数、步骤或 要素明确地包括所列整数、步骤或要素的单数和复数形式。

“大约”是指测量值、量、水平、活性、值、数目、频率、百分 比、尺寸、大小、量、重量或长度与参考测量值、量、水平、活性、 值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相差10、9、 8、7、6、5、4、3、2或1%之多。

本文所用的术语“生物样品”是指可以从对象中提取、未处理、 处理、稀释或浓缩的样品。该生物样品可包括生物流体，如全血、血 清、血浆、唾液、尿、汗、腹水、腹膜液、滑液、羊水、脑脊液、组 织活检切片、淋巴液、间质液等。在某些实施方案中，该生物样品包 含血液。

在下列说明书和权利要求中各处，除非文中另行要求，词语“包 含”和变体被理解为意味着包括所述整数或步骤或整数或步骤组，但 不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤组。

本文所用的术语“电活性物类”定义为可以氧化或还原并可以转 移一个或多个电子的物质。电活性物类是电化学分析中的试剂并提供 蛋白质基质的蛋白水解的间接测量。通常，“电活性物类”在水溶液中 在水电解所需的电位以下的电位还原或氧化，因此在水电解不生成显 著感应电流的条件下为活性。

本文所用的术语“电动元（elactomer）”是指电活性聚合物或聚合 物电活性物类。电动元是根据本公开的某些实施方案的电活性物类并 且是指各种电活性聚合物，包括例如聚乙二醇(PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、 聚胺、多肽和它们的合适的衍生物。与小分子电活性物类相比电动元 的解释显示在下图6中。

本文所用的术语“氧化还原对”是指具有不同氧化值的化学物质 的两种共轭物类。具有较高氧化值的物类的还原产生具有较低氧化值 的物类。或者，具有较低氧化值的物类的氧化产生具有较高氧化值的 物类。

本文所用的术语“蛋白水解”是指蛋白质分解成较小多肽和所造 成的蛋白质纤维的降解。该分解可通过酶促或化学机制引起的肽键裂 解而发生。该分解可通过同种或异种蛋白之间交联的裂解而发生。蛋 白水解可导致蛋白质分解成独立的氨基酸。

本文所用的术语“电极”是指可通过其测量电位的电导体。电极 也可以是电流的收集器和/或发射器。电极优选是固体并包含导电金属。 优选的导电金属包括合金如氧化铟锡，导电碳，或贵金属，如金、银、 钯或铂。电极也可以是线或微丝，或术语“电极”可描述线或微丝的 集合。

II.各种实施方案的组分和方面

1.蛋白质基质

本发明的蛋白质基质可以是本领域中已知的任何蛋白质基质。如 本文所用，术语“蛋白质的基质”和“蛋白质基质”可互换。根据各 种实施方案，蛋白质基质可天然存在，如细胞外基质，或可以天然形 成，如通过血液的凝结或凝血酶对纤维蛋白原的作用。在一些实施方 案中，体外形成合成蛋白质基质。在一些实施方案中，蛋白质基质由 自发形成基质的一种或多种蛋白质形成。在一些实施方案中，通过蛋 白质与一种或多种聚阴离子和/或交联剂的反应形成蛋白质基质。在一 些实施方案中，蛋白质基质是通过使纤维蛋白原与凝血酶接触形成的 纤维蛋白基质。在其他实施方案中，蛋白质基质是胶原基质（例如I 型胶原分子的原生或重构聚集体）。

生物流体可以与某些试剂反应形成蛋白质基质。该生物流体可以 是血、血浆、血清、尿、脑脊液、眼泪、唾液、乳汁、粘液、唾液、 腹腔液。或者，此类流体可以是合成制备的组分，例如组织培养基、 含有蛋白质、合成聚合物、具有在蛋白质上发现的官能团（如胺、巯基、羧基或羟基）的聚合物、胺封端的聚乙二醇、胺封端的聚醚或其 混合物的组织培养基。适用于制备蛋白质基质的蛋白质的非限制性实 例包括纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白。制造 此类基质的方法是本领域中公知的。

在一些实施方案中，该蛋白质基质包含非蛋白质组分，如细胞、 脂质、碳水化合物、糖、盐等。

该蛋白质基质通常基本抑制电活性物类的扩散。从物理角度看， 蛋白质基质中的蛋白质纤维相互作用以形成具有极高动态粘度（例如 >2Pas）的多孔粘弹性物质。根据Einstein-Stokes方程，扩散常数D如 下给出

其中η是动态粘度。当基质中的蛋白质纤维通过蛋白水解分解时， 基质的孔隙率提高，粘度降低且扩散常数提高。

可以对蛋白质基质施以机械或物理处理。机械处理可包括压缩或 挤出。

在一些实施方案中，蛋白质基质包含能被氧化或还原形成带电物 类的电活性物类。电活性物类的非限制性实例包括铁氰化物、亚铁氰 化物、十甲基二茂铁(DMFc)、1,1'-二甲基二茂铁(DiMFc)和7,7,8,8-四 氰代二甲基苯醌(TCNQ)、二茂铁羧酸、六胺钌。

在具体实施方案中，使蛋白质基质进行脱水。在这些实施方案中， 蛋白质基质在与受试样品（例如生物样品）接触时适当复水。可以在 含氧气氛（例如空气）或惰性气氛，如氮气气氛中进行脱水。合意地， 该脱水选自冻干（即冷冻干燥）、热脱水（例如在环境温度下）、渗透、 过滤和离心。在脱水后，该蛋白质基质合意地具有低含水量，例如小 于大约7.5%，小于大约2%，小于大约1%的含水量。

在一些实施方案中，该蛋白质基质是纤维蛋白凝块、PRP凝块或 血块，且样品中的蛋白水解活性至少部分由纤溶酶提供。在其他实施 方案中，该蛋白质基质是胶原，且样品中的蛋白水解活性至少部分由 一种或多种胶原酶（例如基质金属蛋白酶(MMPs)，如MMP-1、MMP-8、 MMP-13、MMP-18等）提供。

该蛋白质基质可以使用本领域技术人员已知的常规方法，例如通 过丝网印刷或喷墨印刷油墨或机器人移液（robotic pipetting）附着或形 成到电极（例如工作电极）上。

2.蛋白质基质载体

在各种实施方案中，还提供用于蛋白质基质和与蛋白质基质相关 的载体。该载体可以是多孔载体。要理解的是，该载体的孔隙可以基 本互连和/或贯穿载体的体积。在其他实施方案中，孔隙可以基本不连 接并贯穿载体的体积。优选至少一部分蛋白质基质包含在孔隙中。多 孔载体的示例性实例包括纸（如吸附纸、滤纸）、过滤膜、烧结玻璃、 聚(偏二氟乙烯)膜和凝胶。本发明的含蛋白质基质的固体载体尤其有 利，因为它们可以在固体载体和蛋白质基质之一，优选两者的孔径和 孔体积具有更大一致性情况下大量制造，这合适地改进测定间和测定 内可靠性和一致性。

在具体实施方案中，该固体载体是多孔的。示例性的多孔固体载 体具有包含直径明显大于蛋白质基质的孔径的孔隙的结构。例如，孔 为至少大约5.0微米，至少大约10.0微米，合适地为20微米或更大， 因为较大孔较不限制电活性物类的扩散。

在一些实施方案中，该固体载体进一步包含能被氧化或还原形成 带电物类的电活性物类（例如铁氰化物、亚铁氰化物、十甲基二茂铁(DMFc)、1,1'-二甲基二茂铁(DiMFc)、7,7,8,8-四氰代二甲基苯醌 (TCNQ)、二茂铁羧酸、六胺钌等）。

可以对含蛋白质基质的固体载体施以机械或物理处理。机械处理 可包括压缩或挤出。代表性的物理处理包括脱水（例如冻干、热脱水 等）和辐射（例如光）。该机械或物理处理合适地在无菌条件下进行。

在具体实施方案中，对固体载体施以脱水，由此产生基本脱水形 式的固体载体。在这些实施方案中，固体载体合适地在与受试样品（例 如生物样品）接触时复水。可以在含氧气氛（例如空气）或惰性气氛， 如氮气气氛中进行脱水。合意地，该脱水选自冻干（即冷冻干燥）、热 脱水（例如在环境温度下）、渗透、过滤和离心。在脱水后，该固体载 体合意地具有低含水量，例如小于大约7.5%，小于大约2%，小于大 约1%或小于大约0.5%的含水量。固体载体的脱水具有若干优点，包 括减轻降解并改进蛋白质基质的贮存寿命。其还通过使样品毛细流动 或“芯吸”穿过其中而实现据推定含蛋白酶的样品与蛋白质的更好或 更有效接触。

在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的常规方法（如用 粘合剂粘合或热粘合）将该固体载体粘贴到电极（例如工作电极）上。

3.合成纤维蛋白凝块

在某些实施方案中，提供作为本文中公开的方法、系统和试剂盒 中所用的蛋白质基质的合成纤维蛋白凝块。根据一个实施方案，纤维 蛋白凝块或“网”通过下述方法制备，其包括：(a)提供包含含纤维蛋 白原的材料的第一组分；(b)提供包含将纤维蛋白原转化成纤维蛋白凝 块的物质的第二组分；(c)通过合并和混合第一组分与第二组分，形成 含纤维蛋白凝块的材料；和(d)使含纤维蛋白凝块的材料与至少一部分 电极接触。

第一组分合适地包含含有至少大约2mg/mL，至少大约5mg/mL， 或至少大约10mg/mL纤维蛋白原，合意地至少大约15mg/mL，例如 大约20mg/mL至大约250mg/mL或大约20mg/mL至大约150mg/mL 纤维蛋白原的含纤维蛋白原的溶液。

第二组分合适地包含含凝血酶的溶液。使一定体积的含凝血酶的 溶液与第一组分接触以提供小于大约1000IU/mL，小于大约200 IU/mL，小于大约100IU/mL，小于大约50IU/mL，小于大约20，小 于大约10IU/mL或小于大约1IU/mL的最终凝血酶浓度/活性。该凝血 酶可以是活性或无活性形式，本领域中公知的是，当凝血酶是无活性 形式（例如，可通过例如辐射或光活化的凝血酶（=可光活化的凝血酶）） 时，与活性形式的凝血酶相比，通常需要更大的量以使凝血酶样品凝 块。凝血酶可以是重组或合成的或具有天然来源，即衍生自人或动物 血浆。

合成纤维蛋白凝块在一些实施方案中具有基本抑制电活性物类 （例如K₃Fe(CN)₆）扩散的孔径。在非限制性实例中，纤维蛋白凝块的 孔径小于大约100纳米(nm)，小于大约5.0nm，小于大约2.0nm，并 合适地为1.0nm或更小。

含纤维蛋白凝块的材料在其范围内包括“裸”纤维蛋白凝块以及 包含在多孔固体载体中或以其它方式与多孔固体载体结合的那些。用 于本发明的可接受的载体可广为不同并可以是合成或天然的、有机或 无机的、挠性或无挠性的。代表性的载体包括聚合载体，如织造和非 织造网（例如纤维网）、微孔纤维和微孔膜以及微粒或珠粒载体。织造 和非织造网可具有规则或不规则的表面物理构造。

示例性的多孔固体载体具有包含直径大于纤维蛋白凝块的孔径的 孔隙的结构。例如，孔径为至少大约1.0微米(μm)，至少大约5.0微米， 至少大约10.0微米，合适地为20微米或更大，因为较大孔隙较不限制 电活性物类的扩散。多孔载体的非限制性实例包括滤纸、烧结玻璃、 聚(偏二氟乙烯)膜、微粒或珠粒载体，如琼脂糖、亲水聚丙烯酸酯、聚 苯乙烯、矿物氧化物（无机氧化物，mineral oxide）和琼脂糖（Sepharose）。

合适地，对含纤维蛋白凝块的材料（例如裸或包含在多孔固体载 体中或以其它方式与多孔固体载体结合的含纤维蛋白凝块的材料）施 以机械或物理处理。机械处理可包括压缩或挤出。代表性的物理处理 包括脱水（例如冻干、热脱水等）和辐射（例如光）。该机械或物理处 理适当地在无菌条件下进行。

在具体实施方案中，含纤维蛋白凝块的材料包含能被氧化或还原 形成带电物类的电活性物类（例如铁氰化物、亚铁氰化物、十甲基二 茂铁(DMFc)、1,1'-二甲基二茂铁(DiMFc)、7,7,8,8-四氰代二甲基苯醌 (TCNQ)等）。

在某些实施方案中，对含纤维蛋白凝块的材料施以脱水。在这些 实施方案中，含纤维蛋白凝块的材料适当地在与受试样品（例如生物 样品）接触时复水。可以在含氧气氛（例如空气）或惰性气氛，如氮 气气氛中进行脱水。合意地，该脱水选自冻干（即冷冻干燥）、热脱水 （例如在环境温度下）、渗透、过滤和离心。在脱水后，含纤维蛋白凝 块的材料适当地具有低含水量，例如小于大约7.5%，小于大约2%， 小于大约1%或小于大约0.5%的含水量。在具体实施方案中，对含纤 维蛋白凝块的材料施以冻干以制备包含纤维蛋白凝块的干或基本干的 多孔载体。

使用本领域技术人员已知的常规方法使含纤维蛋白凝块的材料 （例如裸或包含在多孔固体载体中或以其它方式与多孔固体载体结合 的含纤维蛋白凝块的材料）附着到电极上。

4.蛋白质基质的蛋白水解的检测

根据某些实施方案，通过电化学方法，包括伏安法检测蛋白质基 质的蛋白水解。伏安法是通常用于研究电解机制的技术，但如本文中 公开可用于检测或监测蛋白质基质的蛋白水解，特别是响应蛋白水解。 各种形式的伏安法可用于检测；这些形式包括方波伏安法、阶梯伏安 法、阳极或阴极溶出伏安法、吸附溶出伏安法、交流电伏安法、旋转 电极伏安法、常规或差动脉冲伏安法、计时电流分析法、计时库仑分 析法或电流对时间。在本公开的方法和系统的示例性实施方案中，采 用电位阶跃伏安法、线性扫描伏安法和循环伏安法。可以使用峰值电 流或稳态电流或转移的总电荷作为测量变量。

在各类型的伏安法中，对被称作工作电极的电极施加电压或系列 电压并监测流过的相应电流。通常，工作电极接触电活性物类，例如 铁氰化物(Fe(CN)₆ ^3-)，并施加电位以促进电荷向和自电活性物类转移， 由此生成电流。第二电极充当电解电池的另一半。第二电极的作用是 供应或减去电子，由此保持溶液中的电中性。如果需要正确估计工作 电极处的电位-相对于已知标准，可以将第二电极分成两个单独的电 极——参考电极和辅助电极。参考电极是具有已知还原电位并在测量 和控制工作电极电位时充当参考并且不传送电流的半电池。辅助电极 传送平衡在工作电极处观察到的电流所需的电流。

因此，通过伏安法测量电解所需的元件是至少两个电极、溶剂、 背景电解质和电活性物类。这两个电极通常与包含电解质和电活性物 类的溶剂接触。

在某些实施方案中，蛋白质基质与至少一部分工作电极接触或存 在于其上，以致损害或阻碍电活性物类向工作电极的迁移或扩散以向 电极或从电极转移电荷。在其他实施方案中，蛋白质基质存在于至少 一部分第二电极上并且其平衡通过工作电极添加或移除的电荷的能力 受到损害或阻碍。在另一些实施方案中，蛋白质基质存在于至少一部 分工作电极和第二电极上。在这些实施方案中，与不存在蛋白质基质 相比，施加电位时测得的电流被改变。相应地，当通过例如将蛋白水 解剂或据推定含有蛋白水解剂的样品添加到溶剂中或直接添加到蛋白 质基质中而使蛋白质基质与蛋白水解剂接触时，发生蛋白质基质的降 解。随着蛋白质基质蛋白水解，施加电位时测得的电流也改变，由此 能够定性和/或定量检测和/或监测蛋白质基质的降解。

背景电解质是电化学惰性的盐，如氯化钠的水溶液。在一些实施 方案中，可以使用生理溶液（0.9%氯化钠）作为背景电解质。电活性 物类通常以低浓度（大约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、 0.08、0.09或0.1M的级别）存在。电活性物类可以是例如铁氰化物 （Fe(CN)₆ ^3-）。

电活性物类能被氧化或还原形成带电物类。即电活性物类形成氧 化还原对，例如当铁氰化物是电活性物类时，形成铁氰化物(Fe(CN)₆ ^3-)/ 亚铁氰化物(Fe(CN)₆ ^4-)氧化还原对。在施加电位时，该电活性物类可以 在工作电极处被氧化或还原，由此在工作电极中造成电化学电流。在 一些实施方案中，该电活性物类发生可逆氧化或还原。该电活性物类 优选化学稳定。

根据一个实施方案，使用电位阶跃伏安法，其中外加电压从一个 值(V1)改变或阶跃成另一值(V2)。然后测量作为时间函数的所得电流。 例如，使用铁氰化物作为反应物，通常设定电压范围，使得在V1下(Fe(CN)₆ ^3-)的还原是热力学不利的。通常选择第二电压(V₂)，使得接近 电极表面的任何Fe(CN)₆ ^3-被还原成产物(Fe(CN)₆ ^4-)。

在电位阶跃伏安法中，在电压改变（阶跃）后电流立即升高，然 后随时间经过降低。这是因为在电压阶跃之前，电极与具有恒定组成 的电解溶液中的电活性物类接触，但是，一旦发生电压阶跃，电活性 物类（例如Fe(CN)₆ ^3-）转化成产物（例如Fe(CN)₆ ^4-）且电流流动。为 使反应继续，更多电活性物类（例如Fe(CN)₆ ^3-）必须接近电极。这通 常在溶液中通过取决于电活性物类的浓度梯度的扩散发生。因此向表 面供应更多电活性物类和因此电流的流动取决于电活性物类的扩散通 量。

随着电解继续，电活性物类从距电极的更远距离扩散，因此浓度 梯度降低，从而向电极表面的电活性物类供应也降低，因此电流降低。

可以使用下列公式计算电流

其中i是电流，n是反应中转移的电子的摩尔数，F是法拉第常数 （96,484Cmol^-1），A是电极面积，k_red是电子转移的速率常数，c^bulk是 电活性物类的总浓度，t是时间且D是电活性物类的扩散系数。

电流与电活性物类的体相浓度，即还原和氧化物类的组合浓度相 关。阶跃伏安法因此能够估算电活性物类的扩散系数。因此，在蛋白 质基质的存在影响电活性物类的扩散的实施方案中，对例如由于蛋白 质基质的蛋白水解造成的扩散系数变化的估算可用于检测或监测蛋白 质基质的蛋白水解。

根据另一实施方案，使用线性扫描伏安法(LSV)，其中施加固定电 位范围，尽管电压从下限(V₁)扫描至上限(V₂)。线性扫描伏安图的特征 取决于许多因素，包括电子传递反应的速率、电活性物类的化学反应 性和电压扫描速率。

在LSV中，随着电压扫描至更还原的值，电流开始流动并在减低 前最终到达峰值。在电极表面，电子传递速率比电压扫描速率快，在 电极表面，与通过热力学预测的基本相同地建立平衡。随着电压最初 从V1扫描，表面处的平衡开始改变且电流开始流动。随着电压从其初 始值进一步扫描，由于平衡改变并且更多电活性物类被还原，电流因 此升高。当扩散层在电极上已充分生长时出现电流峰以致电活性物类 通向电极的通量不够快到满足Nernst方程的要求，此时电流开始下降。 Nernst方程如下描述电化学电池的电压与电池组分之一的浓度之间的 关系。

E_cell=E⁰ _cell-(RT/nF)lnQ

其中E_cell是对一个电极施加电位后的电池电位，E⁰ _cell是施加电位 前的电池电位，R是气体常数（8.31(伏特-库仑)/(mol-K)），T是温度(K)， n是在电化学反应中交换的电子的摩尔数(mol)，F是法拉第常数（96,484 C mol^-1）且Q是反应商（该平衡表达式使用初始浓度而非平衡浓度）。

电极表面上的扩散层的尺寸随所用电压扫描速率而不同。在慢电 压扫描中，该扩散层与快速扫描相比在电极上生长得远得多。因此， 通向电极表面的通量在慢扫描速率下明显小于其在较快速率下。由于 电流与通向电极的通量成比例，因此电流强度在慢扫描速率下较低， 在高速率下较高。

术语“线性扫描”是指以固定扫描速率以单一“正”向改变电压 的扫描，如对Ag/AgCl从-0.7V至+0.7V，以提供1.4V扫描范围。可 以通过电位的一系列递增变化近似进行线性扫描。如果增量在时间上 靠得非常近，它们就相当于连续线性扫描。因此，施加近似于线性变 化的电位变化可以被认为是线性扫描。

在线性扫描过程中，在工作电极处的电位随时间经过恒定速率线 性变化的同时，测量工作电极处的电流。扫描范围，如大约-0.5V至大 约+0.5V，大约-1.0V至+1.0V通常覆盖电活性物类的氧化还原对的还 原和氧化态，这样就发生了从一个状态（例如还原）向另一状态（例 如氧化）的转换。

在某些实施方案中，以至少大约10mV/sec，或至少大约50mV/sec， 或至少大约100mV/sec，或至少大约150mV/sec，或至少大约200 mV/sec，或至少大约500mV/sec，或至少大约1000mV/sec，或至少大 约2000mV/sec的速率改变电压。

根据另一实施方案，使用循环伏安法(CV)。CV非常类似于LSV， 尽管以固定速率在两个值之间以循环方式（循环扫描）扫描电压，但 现在当电压达到V₂时，逆转扫描，并将电压扫描回V₁。正向扫描产生 与在LSV实验中在还原电活性物类时所观察到的相同响应。当逆转扫 描时，还原的电活性物类被氧化，且电流反转。

术语“循环扫描”是指线性正向扫描与线性反向扫描的组合，其 中扫描范围包括氧化还原对的氧化和还原峰。例如，以从大约-1.0V 到大约+1.0V再回到大约-1.0V的循环方式改变电位是对铁氰化物/亚 铁氰化物氧化还原对进行的循环扫描的一个实例，其中在该扫描范围 中包括氧化和还原峰。

5.聚合物电活性物类（电动元）

蛋白质基质通常可以被视为单相粘弹性体系。但是，根据某些实 施方案的一些蛋白质基质被视为包含聚合物骨架作为第一相（其浸在 作为第二相的液体中）的双相体系。第一相聚合物骨架可以是刚性或 弹性的，第二相液体可以是水或其它合适的溶剂。此类基质根据某些 实施方案并与现有技术一致地也被称作水凝胶。

电活性物类扩散通过水凝胶是不容易通过整个体系的动态粘度建 模的复杂过程。影响这种多孔水凝胶中的扩散系数（D）的因素是孔隙 率（占据水凝胶的溶剂分数，其衡量多少空间可供扩散）、压缩度 (constrictivity)（衡量由于与孔隙壁的相互作用，溶剂在孔隙中如何紧 密有序）、曲折度（衡量孔隙几何结构如何影响扩散）和与基质的相互 作用性（衡量与骨架的弱键和范德华相互作用如何影响D）。

例如，如果(i)水凝胶具有极高孔隙率，(ii)电活性物类不与蛋白 质分子相互作用或不与蛋白质分子形成弱键，(iii)孔隙中的水具有与 在自由溶液中相同的有序度，和(iv)孔隙曲折度低，则电活性物类会 以非常接近在溶剂本身中的扩散的扩散系数通过孔隙系统扩散。

在一个实施方案中，提供在本公开中被称作电动元（elactomer） 的新型电活性物类。电动元本身是聚合物，根据某些实施方案其可用 于以高灵敏度测定水凝胶孔隙率。通过用电化学技术（包括但不限于 计时电流分析法和线性扫描伏安法）测量扩散限制的电化学电流，进 行这种测定。在蛋白质基质被蛋白水解降解的情况中，作为蛋白水解 的函数，基质孔隙率提高，并可以根据具体实施方案使用该电动元测 量蛋白水解。

由于该电动元与聚合物骨架的缠结、熵孔隙限制效应和/或位阻效 应，聚合物电活性物类或电动元的扩散比小分子或离子电活性物类的 扩散对水凝胶孔隙率更敏感。

在一个实施方案中，该电动元包括二茂铁衍生化的聚乙二醇 (PEGs)。二茂铁及其衍生物是电活性有机化合物，其可根据确定的有 机化学工艺用于较大分子的衍生化。例如，二茂铁碳酰氯——二茂铁- 羧酸的酰基氯——非常易与伯胺反应并可用于用伯胺将大分子有效衍 生化。

二茂铁本身高度疏水并且本身不容易溶于水溶液。相反，PEGs是 高度亲水的聚合物，其非常适合生物用途并充分混入蛋白质基质中， 而不造成蛋白质变性或聚集。

根据一个实施方案，具有一定分子量的同型双官能氨基PEG可以 在两个氨基处都用二茂铁碳酰氯改性，并可通过红外光谱法证实所得 产物。使用在末端具有伯氨基的同型双官能PEG的优点在于所得分子 仍高度亲水并容易溶解在水溶液中。将二茂铁作为侧基部分添加到聚 合物中的内部单体基团上的可选方法会产生高度衍生化的疏水分子。

Fc-CO-NH-(CH₂CH₂O)_n-NH-CO-Fc

在另一实施方案中，该电动元可以类似地由包括聚乙烯醇(PVAs)、 聚乙烯基吡咯烷酮(PVPs)、聚丙烯酸酯、多糖如葡聚糖、聚胺、多肽 或蛋白质在内的其它水溶性大分子衍生。

6.电活性物类的组成

在某些实施方案中，如其它伏安测量法那样，在本公开的方法和 系统中使用计时安培测量法。如本领域普通技术人员已知，计时安培 测量法已用于医疗诊断，例如用于测定血糖水平，其中测量特定时间 点的电化学电流。为简单和低成本起见，通常在没有参考电极的两电 极电池中进行这些测量。在这样的布置中，跨两个电极施加电位，并 在工作电极处测量电流。因此，为了保持电中性，在另一（对）电极 处供应等幅度电流。

根据本公开的一个实施方案，在使用如本文中论述的计时安培分 析法以及其他技术测量蛋白质基质中的扩散限制电流以测定基质孔隙 率和粘度及其蛋白水解降解时，在对电极（CE）处供应充足电流水平， 以使向工作电极（WE）供应的电流是扩散限制的，并且通过该系统的 总电流在对电极处不受限制。在某些实施方案中，WE明显大于CE， 因此更多WE面积暴露于样品（即血液或间质液）以提供更强的待测 量信号。基于Cottrell方程，较小CE面积将限制CE电流，这需要通 过CE处的较大反应物浓度（C0）或通过CE反应物的较快扩散（D） 弥补。

在一些实施方案中，用相反氧化态的相同电活性物类满足上述要 求，其分别在WE处发生氧化（还原）和在CE处发生还原（氧化）。 根据这些实施方案，代表CE反应的反应物的氧化（还原）形式的浓度 明显高于代表WE处的反应物的还原（氧化）形式。这确保在CE处 提供足够的电流。

但是，在其他实施方案中，如果在蛋白质基质中使用电动元，应 对CE电流限制问题的上述方法可能不切实际。由于高分子量，在蛋白 质基质中存在显著过量的具有相反氧化态的电动元可能极大提高该聚 合物的总质量，其中电动元本身可能导致材料增加并改变基质的粘度 和孔隙率，由此干扰测量。

因此在另一实施方案中提供混合电活性物类的组合物，其包含第 一电活性物类，即用于测定WE处的扩散限制电流的电动元，和第二 电活性物类，即用于在CE处供应充足反向电流的小分子电活性物类。 第一电活性物类在本文中也被称作工作电活性物类(WES)，而第二电活 性物类也被称作反电活性物类（CES）。根据这一实施方案，过量小分 子CES不会提高总聚合物含量或基质的粘度。此外，由于其较小分子 量，CE处的CES具有较高扩散系数，这根据Cottrell方程导致较高电 流。因此，与两种电活性物类具有相同扩散系数的情况相比，根据这 一实施方案，相对于WES不显著过量供应CES。

由于WES和CES具有相反氧化态，它们可能根据它们的标准氧 化还原电位和浓度（活性）互相氧化/还原直至达到能斯特平衡。这可 能产生显著量的具有与最初供应相反的氧化态的CES。这又可能在工 作电极处生成相应电流，干扰来自WES的信号。因此，根据这一实施 方案，确定WES和CES和它们的相对浓度以确保WE处的大部分至 基本所有电流由WES生成，且很少电流至基本上没有电流由CES生 成。下面在实施例II中阐述WES和CES工作的特定实施例。

III.根据各种实施方案的系统和方法

1.检测和监测蛋白水解的方法

在各种实施方案中，提供检测和/或监测蛋白质基质的降解（特别 归因于蛋白水解）的方法。进一步提供检测和/或监测样品的蛋白水解 活性，例如样品的纤维蛋白溶解活性或胶原酶活性。

该方法通常包括提供第一电极、第二电极和包含电活性物类的电 解溶液，其中蛋白质基质位于至少第一电极的至少一部分上或与至少 第一电极的至少一部分接触。当通过电解溶液施加电位时，生成电流。 当电位改变时，电流也改变，并在许多时间点测量作为电压函数的电 流的变化。如果蛋白质基质降解（例如归因于蛋白水解），与不发生基 质降解的基线或对照测量（通常电荷对电流）相比，作为电压函数的 电流变化会改变。蛋白质基质的密度通常严重抑制电活性物类的扩散。 例如通过纤维蛋白溶解发生的基质降解降低基质的密度并通常降低交 联度，因此有效动态粘度降低，导致基质或包含基质的多孔载体内的 表观扩散系数提高，因此使得电化学电流改变。

“基线”是对照测量，在一些实施方案中是正常的电流测量，可 对照其比较试验样品。因此，基于对照或基线电流测量，可以测定与 基线水平相比样品是否具有可测量的基质降解的提高、降低还是基本 不变。一方面，基线水平可以指示在对象中不存在蛋白水解活性，特 别是纤维蛋白溶解活性。因此，关于电流测量的基线水平使用的术语 “蛋白水解活性”通常是指在不存在来自对象或对象群体的样品的情 况下或在来自被认为具有正常蛋白水解活性和/或纤维蛋白溶解活性的 对象或对象群体的样品存在下建立的基线水平。在另一实施方案中， 由来自对象的之前的样品建立基线，以便随时间监测对象的蛋白水解活性和/或随时间评估给定治疗剂或药理剂的效力。

建立基线的方法优选是用于评估来自对象的样品的相同方法。在 一个实施方案中，使用与待评估的样品相同的样品类型建立基线水平。

在一个实施方案中，在获自对象的自体对照样品中建立基线。也 就是说，该样品与待评估的样品获自相同对象。对照样品优选与待评 估的样品是相同类型。

该方法包括使用本领域中已知的任何伏安法，例如电位阶跃伏安 法、线性扫描伏安法或循环伏安法来检测或监测对象或来自对象的样 品中的蛋白水解活性。可以将该蛋白水解活性与预定或参考电荷对电 流测量结果进行比较，以区分正常对象与具有异常蛋白水解活性的对 象。

可以用相同蛋白质基质重复该伏安法，测量之间的等待期为例如 10至180秒。在此期间，蛋白水解反应，例如纤溶酶的纤维蛋白溶解 反应可继续，在各时间点，电流响应与之前的测量相比发生改变，通 常响应会更显著。例如，10sec、30sec、60sec或180sec电流信号与 初始(t=0)电流的比率可用作测量参数。由此内部控制其它参数的影响 （有效电极表面积、WES浓度、多孔载体可变性），因为它们在两个 时间点之间不变。唯一变量是蛋白质基质降解，如蛋白水解，例如纤 维蛋白溶解的程度。

可以直接在电极上形成蛋白质基质。或者，可以在溶液中或在表 面上形成蛋白质基质，随后使至少一个电极与该基质接触放置。在某 些实施方案中，至少部分在多孔载体中形成蛋白质基质并使至少一个 电极与该基质接触放置。例如，可以通过将蛋白质如纤维蛋白原的溶 液施加到多孔载体上，随后将聚阴离子、交联剂或附加蛋白质如凝血 酶施加到载体上以促进基质形成来形成基质。然后将该多孔载体施加 到至少一部分电极上或将电极插入该载体中。

在一个实施方案中，可以将在其至少一部分表面上存在蛋白质基 质的至少一个电极插入据推定具有蛋白水解活性的样品中。

在另一实施方案中，使电极与蛋白质基质接触并进行伏安测量， 这通常是测量作为电压函数的电流变化（例如电荷对电流）。随后，将 样品施加到多孔载体上并再进行伏安测量，其中施加样品之前和之后 进行的测量之间的差异指示该样品具有蛋白水解活性。

该样品可以是生物样品，如体液、排泄物或分泌物。例如，该样 品可以选自唾液、血液、血浆、血清或间质液。

该样品可获自具有疾病或状况的对象。在一些实施方案中，该疾 病或状况可能与纤维蛋白沉积相关联。这些疾病或状况包括深静脉血 栓形成、肺栓塞、肾病、肥厚性瘢痕疙瘩、冠状动脉梗塞、转移、炎 症、弥散性血管内凝血、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、肾小球肾 炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性神经病、肉芽肿病、寄生虫感染和 同种异体移植排斥。

在其他实施方案中，该样品可获自给予治疗剂或治疗方案，如上 述疾病或状况中所用的那些治疗剂或治疗方案之前、之中或之后的对 象。在这样的实施方案中，作为检测或监测治疗剂或治疗方案对该对 象降解蛋白质基质的能力的影响的手段，对样品施以如本文所述的伏 安测量。例如，在蛋白质基质是纤维蛋白凝块的实施方案中，该方法 可用于检测或监测治疗剂或治疗方案对对象的纤维蛋白溶解活性的影 响。

在又一实施方案中，以条形式形成在载体上的明胶基质，在此加 入含有明胶降解酶（亦称明胶酶、胶原酶或基质金属蛋白酶）的血液 或间质液样品。该基质随后的蛋白水解提高基质孔隙率并降低总有效 粘度，导致D提高，因此扩散限制的电化学电流提高。

此实施方案的胶原蛋白水解检测方法可用于监测癌转移，根据各 种实施方案起到预测和预防的作用。胶原酶在浸润性癌中发挥重要作 用，在此它们降解健康组织中的细胞外基质，使得原发性肿瘤细胞能 够逃脱它们的原生环境并随后侵袭远端组织而形成远端转移酶。

外周血中，特别是身体的位置中的胶原酶活性因人而异。例如， 需要组织重塑的其它过程，如创伤修复与细胞外基质分解相关。根据 各种实施方案，本文所述的检测方法提供血液和其它体液，如间质液 中的胶原酶活性的简单、灵敏和方便的监测。关于额外的论述，参见 下列实施例II。重要地，特定个体中胶原酶活性随时间不断提高是可 能存在浸润性癌的信号，其为进一步的诊断试验和及时的适当的治疗 留出余地。

2.用于检测和监测蛋白水解的系统和装置

在某些实施方案中，提供用于检测和/或监测蛋白质基质的降解的 装置。该装置通常至少包括电极和蛋白质基质，在各种实施方案中其 可用作临床和医疗装置或家用监测装置。在一些实施方案中，该装置 作为定点照护装置或健康监测工具来提供。该基质通常与至少一部分 电极接触。

在一些实施方案中，可以直接在电极上形成该基质，例如通过使 电极或其一部分与包含至少一种蛋白质、至少一种聚阴离子和/或至少 一种交联剂的溶液接触放置以在电极上形成该基质。或者，可以通过 使电极与包含构成基质的组分的溶液，例如纤维蛋白原和凝血酶的溶 液或血液样品接触放置而在电极上形成该基质。

在某些实施方案中，为了实施上述方法，提供用于进行蛋白质基 质的蛋白水解的检测和/或监测的系统。在某些实施方案中，使用伏安 技术进行这样的检测或监测。根据这一实施方案的系统包含伏安分析 工具，包括工作电极、对电极、电流测量单元、控制单元、数据存储 单元和数据处理单元。对电极可包括参考电极和辅助电极。一方面， 工作和/或对电极可以至少部分被蛋白质基质，如纤维蛋白凝块涂布。

在一个实施方案中，工作电极通常连向由可控可变电位源，如本 领域中已知的那些或市售电位源供应的第一电位。布置电流测量单元 以记录在工作电极与对电极之间流动的电流，并使用通过电流测量单 元测得的电流作为蛋白质基质的蛋白水解的指示。在一个实施方案中， 该电流测量单元包括产生代表测得的电流的输出值的电流放大器。

通常布置控制单元以控制第二电位、工作电极和对电极并在预定 时间读取来自电流测量单元的电流值。在使用循环伏安法的方法中， 控制周期包括设定第二电位、控制工作电极和对电极并读取来自电流 测量单元的电流值。该控制单元可包含存储单元——在此存储控制软 件，或通过外部工艺控制系统控制的控制界面。

通常由连向对电极（或在对电极包含参考和辅助电极的实施方案 中，连向辅助电极）的可控可变电位源，如本领域中已知的那些或市 售电位源供应第二电位。数据存储单元存储记录的电流值。在一个实 施方案中包含市售存储电路。利用处理单元使用预定的数学模型分析 存储的电流值。通过显示器等呈现分析结果，如图4和5中所示的伏 安图或电流对时间绘图。

在一个实施方案中，工作电极、对电极、电流测量单元和控制单 元集成为单装置，其设置成向内部或外部数据存储和处理单元输出测 得的电流值。可通过外部数据存储和处理单元外部控制该控制单元。 因此，考虑了能够现场使用或定点照护使用的用于检测或监测蛋白质 基质的蛋白水解的便宜通用的系统。

在一些实施方案中，各种实施方案的系统被设计成检测或监测特 定蛋白质基质，如纤维蛋白凝块、胶原基质或明胶的蛋白水解。在这 些实施方案中，该系统优选完全集成，即蛋白质基质、工作电极、对 电极、电流测量单元、控制单元、数据存储单元和处理单元集成为一 个设备。该设备可以设置成输出分析结果。

根据各种实施方案，数据处理和输出单元是硬件、软件、固件或 其组合之一。在某些实施方案中，数据处理和输出单元改造自移动设 备和并作为移动设备并入，如智能电话设备。在另一些实施方案中， 数据处理和输出单元作为与一种或多种智能电话设备，包括但不限于 IOS电话、Android电话和类似的智能电话设备兼容的移动应用程序执 行。

根据另一些实施方案，数据处理和输出单元经由云服务、其它有 线或无线通讯网络或其它远程通讯手段连向测量装置。

在其他实施方案中，还提供用于实施上述方法的试剂盒。通常， 用于实施本发明的方法的试剂盒含有用于实施该方法的所有必要试 剂。例如，在一个实施方案中，试剂盒可包含含有蛋白质基质的载体 或载体和在载体上形成蛋白质基质所需的试剂，如纤维蛋白原和凝血 酶的溶液。该试剂盒还可包含下列任何一种或多种：(1)至少一个电 极，(2)至少一种电活性物类，(3)至少一种电解溶液，(4)至少一种 盐和(5)至少一种具有已知蛋白水解活性水平的对照样品。

该试剂盒还可具有使用该试剂盒根据本发明定性或定量检测或监 测蛋白质基质的蛋白水解的印刷说明书。

3.基于AC-基伏安和光谱技术的另一系统和方法

在可选实施方案中，电动元在蛋白质基质中的受抑制的扩散允许 使用基于交变电流(AC)或多DC脉冲的其它测量技术。在这些实施方 案中，电动元反应物可以随电压极性或振幅的每次改变从电极表面来 回扩散，由此有效延长扩散长度并扩大原始或蛋白水解的基质中的扩 散系数差异。

借助多脉冲伏安法，具有允许电化学反应的幅度的电压脉冲（工 作脉冲）与不发生反应的脉冲（静止脉冲）交替。在静止脉冲过程中， 电动元反应物朝电极表面扩散而不消耗，而电动元产物远离电极扩散 开。测得的量是在工作电压的第n次脉冲下的法拉第电流。

作为快速扩散的电活性物类和低频率的限制条件，发生电极表面 浓度的完全平衡，以致测得的电流在每一脉冲下基本相同，无论观察 到体相浓度（C₀）的多小变化都进行校正。另一方面，对于慢扩散的 电活性物类和高频率，在电极表面没有出现任何恢复，电流在每次脉 冲都降低，类似于用计时安培分析法观察到的衰减。在这两个限制条 件之间可实现该技术的最高灵敏度，并可以根据某些实施方案实验测 定。

在又一实施方案中，在本公开的系统和方法中使用光谱技术，如 电化学阻抗谱(EIS)。根据这一实施方案，在该频域中可观察到扩散系 数变化。频率基测量通常比振幅基技术更灵敏和精确，由此为根据此 实施方案的系统和方法提供进一步的好处。

在EIS中适用与本文所述的脉冲技术相同的向工作电极表面和离 开工作电极表面扩散的物理现象。但是，在此实施方案中，在测量过 程中频率变化。在特定扩散常数下，存在特定频率，其中扩散的抑制 导致法拉第电流最滞后于电压波形，也称作Warburg阻抗。在根据一 个实施方案的频域测量中，这种频率可对应于峰值相位延迟并且产物 扩散系数和因此基质中的蛋白水解程度的量度。

IV.实施例

提供下列描述作为某些实施方案的实施例并且其不限制本公开的 各种实施方案的范围。

实施例1:蛋白水解的伏安测量

混合人纤维蛋白原和人凝血酶储液以产生10微升终溶液（2%纤 维蛋白原+0.1U凝血酶终浓度），将其涡旋并立即施加到5x5滤纸条 （Whatman No.4,具有大孔径，保留30-40微米粒子）上。在纸条的 孔隙内形成纤维蛋白凝块，并使纸条在室温下干燥2小时。由于纤维 蛋白原浓度，凝块孔径小于滤纸中的孔隙。

用含有0.2%Tween20的50mM K₃Fe(CN)₆溶液浸渍纸条-凝块并 使其干燥。将纸条粘贴到含有平板印刷电极（金或导电碳）的芯片上。 可以将任选银丝作为参考电极连接到纸条上（图3C）。该纸条用含有2 nM人纤溶酶的磷酸盐缓冲的盐水生理溶液（PBS）复水。使用无纤溶 酶的PBS作为对照。在纸条上进行电化学试验以测定由K₃Fe(CN)₆还 原成K₂Fe(CN)₆而生成的电化学电流。电流响应（图5E、F、G）是几 个参数的函数：电位、电极面积、K₃Fe(CN)₆浓度和扩散系数。

实施例2:用于计时安培分析法的CES和WES

参考用于计时安培分析法测量的WES和CES的上述混合组合物。 例如，在上文论述的Fc-PEG电动元中，电活性的Fc部分具有+0.641V 的标准电极电位，考虑到酰胺键中的π-电子，电动元本身具有甚至更 高的E0（测得的E0在+0.7V至0.75V范围内）。如果WES的还原形式 用于WE处的测量，这种高抗氧化性-相对于其它常用电活性物类- 提供对许多氧化CES的耐受性。但是，如上论述，由于CES的浓度过 量，使用弱氧化剂作为CES是有利的，以使WES主要以其还原态存 在。

相应地，例如，适当的CES是六胺钌(III)Ru(NH₃)₆ ³⁺，其具有+0.1V 的标准电极电位E0。基于Nernst方程，包含2mM还原PEG-Fc WES 和8mM Ru(NH₃)₆ ³⁺CES的WES-CES组合物会氧化少于3%的WES。 过量CES及其较高扩散系数在对电极处提供充足电流，因此经过该系统的总电流仅受电动元WES向WE表面的扩散限制。CES的另一实 例是Fe₃(CN)₆ ³⁺的氧化形式。

将组合物CES-WES混合物添加到预热的20%明胶溶液并沉积到 含有两个丝网印刷碳电极的试纸条上。暴露于样品电池的电极的尺寸 为WE1.79x1.3mm和CE0.6x1.3mm。制备无明胶的单独试纸条作为 对照物。将0.8微升生理学缓冲盐水添加到纸条上，并用线性扫描伏安 法和计时安培分析法测定纸条。结果分别显示在图7和8中，表明与 对照物相比，含有明胶的纸条上受抑制的扩散限制电流。

根据计时安培测量，使用Cottrell’s方程计算有效扩散系数（D）。 对对照条而言，D为5.15x10^-6cm²/s，这符合5kDa分子在水溶液中的 扩散。对明胶条而言，有效扩散系数低多于30倍，为1.56x10^-7cm²/s。 不使用电动元WES无法实现D的这种显著差异。

本文中提供的各种实施方案的描述，包括各种附图和实施例，旨 在例示而非限制本发明及其各种实施方案。

Claims (30)

1.用于检测或监测蛋白质基质的蛋白水解的装置，其包括：(i)合成蛋白质基质；(ii)工作电极；(iii)对电极；(iv)电动元；和(v)小分子电活性物类，

其中合成蛋白质基质与各电极的至少一部分接触，

其中电动元包括二茂铁衍生化的聚合物，其中聚合物选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)及其衍生物，

其中电动元和小分子电活性物类为相反氧化态并通过在合成蛋白质基质的孔隙内并穿过其孔隙扩散而与合成蛋白质基质相接触，

其中电动元能够在工作电极处生成扩散限制的电化学电流，并且小分子电活性物类能够在对电极处生成反向电流，和

其中扩散限制的电化学电流指示合成蛋白质基质的蛋白水解水平。

2.如权利要求1所述的装置，其中合成蛋白质基质是纤维蛋白凝块、血块、富含血小板的血浆凝块、明胶、胶原基质之一，且其中基质在载体上、载体内或载体周围形成。

3.如权利要求1所述的装置，其中工作电极大于对电极。

4.如权利要求1所述的装置，其中小分子电活性物类的扩散系数不同于电动元的扩散系数。

5.如权利要求1所述的装置，其中测定电动元和小分子电活性物类的相对浓度以使工作电极处的基本所有电流由电动元而非由小分子电活性物类生成。

6.如权利要求1所述的装置，其中电动元是具有Fc-CO-NH-(CH₂CH₂O)_n-NH-CO-Fc式的二茂铁衍生化的聚乙二醇且小分子电活性物类是六胺钌(III)(Ru(NH₃)₆ ³⁺)。

7.如权利要求1所述的装置，还包括样品，其中样品是血液、血浆、间质液、其它体液和具有已知蛋白水解活性的对照样品之一。

8.如权利要求1所述的装置，其进一步包括适合使用预定公式或方法分析扩散限制电流的测量结果的数据处理单元，由此产生指示蛋白质基质的蛋白水解的结果。

9.如权利要求8所述的装置，其进一步包括适合输出扩散限制电流的测量结果和指示蛋白水解的结果的输出单元。

10.如权利要求9所述的装置，其中数据处理和输出单元之一是移动设备或移动应用程序之一。

11.如权利要求1所述的装置，其中对电极包括参考电极和辅助电极。

12.如权利要求1所述的装置，其中合成蛋白质基质至少包含2mg/mL纤维蛋白原。

13.如权利要求2所述的装置，其中载体包括多孔载体。

14.如权利要求13所述的装置，其中多孔载体包括吸附纸、滤纸、烧结玻璃、聚(偏二氟乙烯)膜、凝胶或其任意组合。

15.检测或监测样品的蛋白水解活性的方法，包括：

(i)提供受蛋白水解活性影响的合成蛋白质基质，其中合成蛋白质基质与工作电极和对电极的至少一部分接触，

(ii)提供电动元和小分子电活性物类，其中电动元和电活性物类通过在合成蛋白质基质的孔隙内并穿过其孔隙扩散而与合成蛋白质基质相接触，其中电动元包括二茂铁衍生化的聚合物，其中聚合物选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)及其衍生物，且其中电动元和小分子电活性物类为相反氧化态，

(iii)使合成蛋白质基质暴露于样品，由此由电动元在工作电极处生成扩散限制的电化学电流并由小分子电活性物类在对电极处生成反向电流，

(iv)测量扩散限制的电化学电流，其中测量指示样品中的蛋白水解活性水平。

16.如权利要求15所述的方法，其中测量由以下执行：计时电流分析法、电位阶跃伏安法、线性扫描伏安法、循环伏安法、方波伏安法、阶梯伏安法、阳极或阴极溶出伏安法、吸附溶出伏安法、交流电伏安法、旋转电极伏安法、常规或差动脉冲伏安法和计时库仑分析法之一。

17.如权利要求16所述的方法，其中测量交变电流或多直流脉冲。

18.如权利要求17所述的方法，其中测量基于电化学阻抗谱，且其中频域的变化指示样品中的蛋白水解活性水平。

19.如权利要求15所述的方法，其中样品是血液、血浆、间质液、其它体液和具有已知蛋白水解活性的对照样品之一。

20.如权利要求15所述的方法，其中电动元是具有Fc(Fc-CO-NH-(CH₂CH₂O)_n-NH-CO-Fc)式的二茂铁衍生化的聚乙二醇，且小分子电活性物类是六胺钌(III)(Ru(NH₃)₆ ³⁺)。

21.如权利要求15所述的方法，其中测量结果表示基线，方法进一步包括使第二合成蛋白质基质暴露于第二样品并测量来自第二样品的扩散限制的电化学电流，其中第二测量结果与基线之间的差异指示蛋白水解活性的变化。

22.如权利要求15所述的方法，其中合成蛋白质基质包括纤维蛋白凝块、明胶或胶原基质。

23.如权利要求15所述的方法，其中合成蛋白质基质至少包括2mg/mL纤维蛋白原。

24.如权利要求15所述的方法，其中蛋白质基质在载体上、载体内或载体周围形成。

25.如权利要求24所述的方法，其中载体包括多孔载体。

26.如权利要求25所述的方法，其中多孔载体选自吸附纸、滤纸、烧结玻璃、聚(偏二氟乙烯)膜或凝胶。

27.如权利要求15所述的方法，其中小分子电活性物类的扩散系数不同于电动元的扩散系数。

28.如权利要求15所述的方法，其中测定电动元和小分子电活性物类的相对浓度以使工作电极处的基本所有电流由电动元而非由小分子电活性物类生成。

29.检测或监测样品的纤维蛋白溶解活性的方法，包括：

(i)提供合成纤维蛋白条，已在条上印刷工作电极和对电极；

(ii)提供通过在纤维蛋白条的孔隙内并穿过其孔隙扩散而与纤维蛋白条相接触的电动元和小分子电活性物类，其中电动元包括二茂铁衍生化的聚合物，其中聚合物选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)及其衍生物，且其中电动元和小分子电活性物类为相反氧化态，

(iii)使纤维蛋白条暴露于样品，由此由电动元在工作电极处生成扩散限制的电化学电流并由小分子电活性物类在对电极处生成反向电流，

(iv)测量扩散限制的电化学电流，测量指示样品中的纤维蛋白溶解活性水平。

30.检测或监测样品的胶原酶活性的方法，包括：

(i)提供明胶条，已在条上印刷工作电极和对电极，

(ii)提供通过在明胶条的孔隙内并穿过其孔隙扩散而与明胶条相接触的电动元和小分子电活性物类，其中电动元包括二茂铁衍生化的聚合物，其中聚合物选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)及其衍生物，且其中电动元和小分子电活性物类为相反氧化态，

(iii)使明胶条暴露于样品，由此由电动元在工作电极处生成扩散限制的电化学电流并由小分子电活性物类在对电极处生成反向电流，和

(iv)测量扩散限制的电化学电流，测量指示样品中的胶原酶活性水平。