DE69828319T2

DE69828319T2 - Verfahren und gerät zur messung der blut-koagulation oder lyse mit hilfe von viskositätsveränderungen

Info

Publication number: DE69828319T2
Application number: DE69828319T
Authority: DE
Inventors: N. Arvind JINA
Original assignee: Hemosense Inc
Current assignee: Hemosense Inc
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1998-07-29
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2018-07-30
Also published as: DE69828319D1; AU8761098A; ATE285572T1; EP1151268A1; WO2000006761A1; EP1151268A4; EP1151268B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren für das genaue Messen der Koagulation oder Lyse von Blut am Pflegeort. Insbesondere wird eine diagnostische Vorrichtung, die vollständig oder teilweise wegwerfbar ist, zum Messen der Viskositätsänderung durch die elektrische Leitfähigkeit des Bluts oder den Diffusionskoeffizienten oder die elektrische Leitfähigkeit einer elektroaktiven Spezies im Blut verwendet, um einen Koagulations- oder Lyseassay durchzuführen und die Assayergebnisse in Echtzeit anzuzeigen.
Allgemeiner Stand der Technik
Der Mechanismus, durch den der Körper Blutverlust aus dem Gefäßsystem verhindert, ist als Hämostase bekannt. Das Blut behält bei normaler Zirkulation einen Fluiditätszustand bei, bildet jedoch eine Barriere, wenn Trauma oder pathologische Bedingungen Gefäßschäden verursachen. Beim Koagulationstest wird die Fähigkeit des Bluts gemessen, ein Gerinnsel zu bilden oder sich zu koagulieren und er wird zum Managen der Antikoagulantientherapie eines Patienten und zum Diagnostizieren hämostatischer Beschwerden verwendet. Lysetests messen die Umkehränderung, wenn die lytische Aktivität von koaguliertem Blut gemessen wird, das beispielsweise durch ein Enzymplasmin zu löslichen Abbauprodukten abgebaut wird.
Es gibt zwei allgemein anerkannte Koagulationswege: den extrinsischen oder durch Thromboplastin gesteuerten und den intrinsischen oder durch Prothrombin/Fibrinogen gesteuerten Koagulationsweg. Sowohl der extrinsische als auch der intrinsische Weg führt zur Bildung von Thrombin, einem proteolytischen Enzym, das die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin katalysiert. Zwei Routinekoagulationstests messen die Prothrombinzeit (PZ) und die aktivierte Teilthromboplastinzeit (ATTZ). Beide Tests messen die Gerinnungszeit, um den Basislinienhämostasezustand eines Patienten zu beurteilen oder die Reaktion auf die Antikoagulantientherapie sowie die Gesamtfunktion und den Status des Koagulanssystems zu überwachen.
Der PZ-Test wird zum Beurteilen der extrinsischen und allgemeinen Bahngerinnungssysteme und zum Überwachen der Langzeit-Antikoagulantientherapie verwendet. Ein allgemein verwendetes Arzneimittel für die Langzeit-Antikoagulantientherapie ist Natriumwarfarinisopropanolclathrat, das allgemein unter dem Markennamen COUMADIN^® bekannt und von Dupont Pharmaceuticals, Wilmington, Delaware, hergestellt wird. Warfarin und seine Analoge führen die Antikoagulation durch wirksames Blockieren der Biosynthese von Vitamin K-abhängigen Koagulationsfaktoren herbei. Da der PZ-Test die Gerinnungszeit misst, kann die wirksame Menge an Antikoagulans im Blut bestimmt werden.
Ein weiteres häufig verwendetes Arzneimittel, das im Zusammenhang mit der Herz-Bypass-Chirurgie, Herzkatheterisierung, der Nierendialyse und in kritischen Pflegesituationen bei akutem Herzinfarkt steht, ist Heparin. Der ATTZ-Test findet zum Überwachen der Heparintherapie für das Screenen bezüglich mangelnder Gerinnungsfaktoren, einschließlich des intrinsischen und allgemeinen Koagulationssystems weitverbreitete Anwendung. Heparin übt seine Antikoagulationswirkung durch Binden an einen Komplex und Bilden eines Komplexes mit einem Plasmacofaktor, der Antithrombin III genannt wird, aus.
Viele Laborgerinnungstests im Stand der Technik basieren auf dem Phänomen des Messens eines Endpunkts, bei dem es sich um eine Phasenänderung handelt, wenn eine Testprobe von einer flüssigen in eine koagulierte Form übergeht. Diese Phasenänderung ist der Umwandlung eines löslichen Plasmaproteinfibrinogens in ein unlösliches Fibrin durch die Wirkung des Enzyms Thrombin zuzuschreiben. Der Gerinnungsendpunkt wird physikalisch durch sekundäre Indikatoren bestimmt wie beispielsweise die Farb- oder Fluoreszenzbestimmung durch optische Mittel und Trübemessungen durch Lichtstreuung und magnetische Teilchenoszillation. Diese Laborinstrumente sind relativ groß wegen der komplizierten verwendeten Technologie, teuer und aufgrund der Komplexität der Bestimmungsmethoden zur Verwendung durch geschultes Personal konstruiert. Man vergleiche allgemein die US-Patentschrift Nr. 5,344,754. Gewöhnlich sind auch große Blutproben erforderlich.
Bei einigen Vorrichtungen des Stands der Technik werden poröse Membranstützen verwendet, die mit Schichten eines Reagenzes für enzymatische Assays imprägniert sind, bei denen man sich auf das Überwachen der Intensität des Reaktionsprodukts durch optische Spektroskopie wie das Reflektionsvermögen, die Fluoreszenz, Lumineszenz oder Farbänderung verlässt. Derartige mit Reagenz imprägnierte Membranen erhöhen die Komplexität des Reaktionsumfelds aufgrund der Abwesenheit einer flüssigen Phase, die das ideale Umfeld für Reaktionen oder Phasenübergänge darstellt und könnten des Weiteren zu möglichen Störungen des enzymatischen Wegs führen. Die Genauigkeit der Ergebnisse bei Systemen auf Membranbasis wird des Weiteren durch Bluthämatokrit- und Reaktionsvolumen beeinflusst. Die Notwendigkeit großer flüssiger Blutproben zur Erzielung einer vollständigen Benetzbarkeit der Membranen erlegt noch eine weitere Einschränkung auf. Um einige der Probleme bei Membranen zu bewältigen, lehrt die US-Patentschrift 5,418,141 die Verwendung kostspieliger, hochreiner Reagenzien. Jedoch leiden Koagulationstechniken, bei denen Thrombinsubstratchemien verwendet werden, an einem starken Nachteil aufgrund ihrer Unempfindlichkeit Fibrinogenmängeln gegenüber, die zu ungenauen Gerinnungszeiten führen könnten.
Bei vielen Studien der Blutkoagulation ist versucht worden, aufzuzeigen, dass durch Messen des Blutwiderstands die Gerinnungszeit bestimmt und ein quantitativer Messwert der Gerinnselretraktionsrate erhalten wird. Diese Ergebnisse sind gewöhnlich nicht reproduzierbar gewesen und „es bestanden bei den meisten allgemein angewendeten Verfahren starke Variationen und Widersprüchlichkeiten", wie von Rosenthal, R.L. und Tobias C.W.: Measurement of the Electrical Resistance of Human Blood; Use in Coagulation Studies (Messung des elektrischen Widerstands von menschlichem Blut; Verwendung in Koagulationsstudien), J Lab Clin Med 33, 1110, 1948 offenbart. Die kritische Betonung wurde auf die geometrische Orientierung der Zelle, innerhalb derer ein Pool der Blutprobe zurückgehalten wurde, und die Elektroden gelegt. Es war auch kritisch, das Vibrieren der Zelle zu verhindern. Es wurde beobachtet, dass die Gerinnselretraktion, sobald das Blut gerinnt, durch Zusammenziehen des Fibrinnetzwerks beginnt, das die großen Elemente oder Zellen zu einer dichten Masse zusammenzieht, so dass das Serum an die Peripherie verdrängt wird. Dieser Vorgang führt zu Erhöhungen der Widerstandsmesswerte, weil er gleichzeitig die Konzentration schlecht leitender Zellen erhöht und die Konzentration von Serum, einem guten Leiter, zwischen und um die Elektroden reduziert. Vor der Gerinnselbildung findet keine signifikante Änderung des Widerstands statt. Die Gerinnungszeit und der Beginn der Gerinnselretraktion sind durch die erste Erhöhung des Widerstands gekennzeichnet. So kann die Gerinnungszeit nur bei Bewegungseliminierung bestimmt werden. Daraufhin erfolgende Erhöhungen wurden durch die Retraktion des Gerinnsels hervorgerufen. Es wurde angenommen, dass die Neigung des steigenden Teils der Zeit-Widerstandskurve der Gerinnselretraktionsrate entsprach.
Wie später bei Hirsch FG, et al.: The Electrical Conductivity of Blood L Relationship to Erythrocyte Concentration, Blood 5: 1017, 1950 (Die elektrische Leitfähigkeit von Blut I. Der Zusammenhang mit der Erythrozytenkonzentration, Blut 5) offenbart, schrieben einige Forscher diese Änderungen den Wirkungen der Koagulation zu, andere waren jedoch nicht in der Lage, diese Befunde zu bestätigen. Bei gewissen Konstruktionen von Leitfähigkeitszellen wurde beobachtet, dass sich der Blutwiderstand aufgrund von Extrusion von Serum während der Gerinnselretraktion erhöht. Es wurde auch festgestellt, dass die Leitfähigkeit des Bluts sich je nach dem Absetzen, Bewegen oder Rühren ändert. In Tabelle I auf Seite 1018 wird außerdem berichtet, dass die Leitfähigkeit während des Gerinnens unverändert war und dass eine Abnahme der Leitfähigkeit nur während der Gerinnselretraktion erfolgte.
Wie in der US-Patentschrift Nr. 4,947,678 offenbart, misst eine Vorrichtung Viskositätsänderung im Blut, um die Blutkoagulation zu bestimmen. Ein elektrisch leitfähiger Sensor erwärmt eine Blutprobe durch Hindurchführen von Strom durch die Probe. Es wird der Durchschnitt der Temperatur des Sensors unter Zuhilfenahme seiner Oberflächentemperatur und des auf den Sensor aufgebrachten Stroms bestimmt. Die Temperatur der Probe wird ebenfalls überwacht und es wird der Unterschied zwischen dieser und der durchschnittlichen Sensortemperatur berechnet. Änderungen des berechneten Temperaturunterschieds werden als Anzeige von Viskositätsänderungen benutzt.
Die US-Patentschrift Nr. 5,447,440 offenbart Methoden für das Durchführen einer Reihe verschiedener Assays, die auf eine Änderung der Viskosität eines Probenfluids ansprechen. Eine Methode beinhaltet das Positionieren einer Fluidprobe in einen Probenbehälter, das Aufbingen von Druck, um einen Teil des Fluids über einen Sensor zu verdrängen und das Bestimmen der Verdrängung der Fluidprobe über den Sensor, um eine Änderung der Viskosität der Fluidprobe anzuzeigen. Eine andere Methode beinhaltet das Durchführen eines Fibrinolysetests, bei dem die Probe mit einem zweitem Reagenz behandelt wird, das in der Lage ist, die Fibrinolyse der Probe dann zu unterstützen, wenn die Probe koaguliert oder teilweise koaguliert wird.
Die US-Patentschrift Nr. 5,628,961 offenbart eine Kartusche für das Durchführen eines oder mehrerer Koagulations- oder Fibrinolyseassays. In einer Kartusche wird eine Blutuntersuchung bezüglich der Prothrombinzeit durchgeführt unter Anwendung mindestens eines Leitfähigkeitssensors, der für die Verdrängung einer Blutprobe über den Sensor empfindlich ist, mindestens einer Mischung, die Thromboplastin und Calciumionen enthält, eines Probenbehälters für das Halten der Blutprobe außerhalb des Kontakts mit dem Reagenz und dem Sensor und einer Pumpenvorrichtung für das reversible Aufbringen von Druck, um einen Teil des Bluts über den Sensor zu verdrängen, um das Reagenz zu kontaktieren und die Koagulation der Probe zu unterstützen.
Die US-Patentschrift Nr. 5,494,639 offenbart einen wegwerfbaren Biosensor für das Messen von Änderungen der Viskosität und/oder Dichte in einem Testfluid, der ein Gehäuse, eine Messkammer und ein piezoelektrisches Element aufweist, das in der Kammer, die eine Oszillationseinheit darstellt, angeordnet ist. Das piezoelektrische Element weist eine Messfläche auf, die mit einer Messmischung benetzt wird, die ein Testfluid und eine Reaktionskomponente umfasst. Die Reaktionskomponente ist innerhalb der Messkammer angeordnet, wobei sie die Messfläche des piezoelektrischen Elements nicht berührt, bevor irgendein Testfluid in die Messkammer eingebracht wird. Das Testfluid wird dann in die Messkammer so eingebracht, dass das Testfluid auf das Einbringen desselben mit der Reaktionskomponente und der Messfläche des piezoelektrischen Elements in Kontakt kommt. Zum Beurteilen der Änderungen der Parameter der Oszillationseinheit ist ein elektronischer Auswertungsschaltkreis an das piezoelektrische Element angekoppelt.
Die US-Patentschrift Nr. 5,629,209 offenbart einen Apparat für das Erfassen von Änderungen der Viskosität eines Fluids. Es wird eine zu prüfende Fluidprobe durch eine Injektionsöffnung in ein Fluidaufnahme-/abgabereservoir und darauf hin in eine Fluidaufnahmekammer eingeführt, die eine Luftöffnungs-/Fluidstöpselvorrichtung aufweist sowie ein frei bewegliches ferromagnetisches Material. Wenn eine Viskositätsanalyse durchgeführt wird, so wird das ferromagnetische Material bis zur Decke der Kammer hochgehoben und bis zum Boden der Kammer fallengelassen und die Zeit des Abfallens wird durch Bestimmen der Position des ferromagnetischen Materials gemessen. Die Hin- und Herbewegung des ferromagnetischen Materials wird wiederholt, bis eine Änderung der Fallzeit festgestellt wird, was eine Änderung der Viskosität des Fluids in der Kammer signalisiert. Eine die Viskosität ändernde Substanz kann an irgendeiner erwünschten Stelle im Apparat eingeschlossen sein.
So besteht ein Bedarf auf dem Gebiet der Diagnostik für ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen der Blutkoagulation oder -lyse, das bzw. die genügend kostengünstig, rechtzeitig verfügbar, effizient, bequem, dauerhaft und verlässlich ist zur Verwendung in einer Diagnosevorrichtung, die die Verwendung am Pflegeort durch ungeschulte Individuen an Orten wie zu Hause, an Anwendungsstellen oder in medizinischen Notfällen oder an Orten, bei denen es sich nicht um ein Krankenhaus handelt, gestattet. Gleichgültig, ob die Vorrichtung wegwerfbar oder wiederverwendbar ist, besteht auch ein Bedarf dafür, mit kleinen Blutprobengrößen zu arbeiten.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bietet einen Elektrodenaufbau, der das quantitative Messen von Viskositätsänderungen im Laufe von Zeitintervallen zum Signalisieren der Koagulation oder Lyse einer Blutprobe bietet. Die Viskositätsänderung wird in Echtzeit entweder durch die elektrische Leitfähigkeit des Bluts oder den Diffusionskoeffizienten oder die elektrische Leitfähigkeit einer elektroaktiven Spezies in der Blutprobe bestimmt.
Elektronische Vorrichtung zur einmaligen Verwendung zur Durchführung eines Koagulations- oder Lyseassays an einer Blutprobe, wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst:
ein Gehäuse, das eine Außenfläche aufweist und einen Innenbereich definiert;
ein nicht poröses Substrat, das im Innenbereich zum Empfang der Probe darauf positioniert ist;
ein Reagenz zur Beschleunigung der Koagulation der Probe, das auf dem Substrat und in Kontakt mit der Probe positioniert ist;
eine elektroaktive Spezies, die auf dem Substrat und in Kontakt mit der Probe positioniert ist;
Mittel zum Messen der Viskosität der Probe und Generieren eines elektrischen Signals, das mit einer Kurve eines Koagulations- oder Lyseassays korreliert;
Verarbeitungsmittel, das im Innenbereich positioniert ist und an das Messmittel zum Empfang und zur Umwandlung des elektrischen Signals in eine Digitalausgabe, die dem Koagulations- oder Lyse-Assay unter Verwendung der im Verarbeitungsmittel gespeicherten Assaykalibrationsinformation entspricht, angeschlossen ist; und
Anzeigemittel zur Sichtanzeige der Digitalausgabe außerhalb des Gehäuses, wobei das Anzeigemittel an das Verarbeitungsmittel angeschlossen ist.
Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren eine Testkarte für eine elektronische Vorrichtung, die ein Signal mit einer prädeterminierten Frequenz generiert und eine Kurve von einem Koagulations- oder Lyseassay einer Blutprobe erstellt, wobei die Testkarte Folgendes umfasst:
ein nicht poröses Substrat, das eine Oberfläche zum Empfang der Probe definiert;
eine elektroaktive Spezies, die zum Kontakt mit der Probe auf dem Substrat positioniert ist;
ein initiell auf der Oberfläche immobilisiertes Reagenz zum Kontakt mit der Probe und
eine Mehrzahl von Elektroden, die auf dem Substrat positioniert sind und die Probe kontaktieren, wobei die Elektroden zum Empfang und Weiterleiten des Signals angepasst sind, wobei die Elektroden ein elektrisches Signal generieren, das der Viskosität der Probe entspricht, die mit der Kurve des Koagulations- oder Lyseassays korreliert.
Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren ein Verfahren zur Bestimmung der Koagulation oder Lyse einer Probe, wobei die Schritte des Verfahrens Folgendes umfassen:
Einführen der Probe in einen Probenaufnahmeort auf einem Substrat und Kontaktieren einer elektroaktiven Spezies, die auf dem Substrat mit der Probe positioniert ist;
Beschleunigen der Koagulation der Probe durch chemisches Reagieren der Probe mit mindestens einem Reagenz auf dem Substrat zur Herstellung einer nachweisbaren Änderung der Viskosität der Probe, die mit dem Zustand der Koagulation oder der Lyse der Probe korreliert;
Messen der Viskosität der Probe und Generieren eines elektrischen Signals, das mit einer Kurve des Koagulations- oder Lyseassays korreliert und
Verarbeitung des elektrischen Signals in eine Digitalausgabe, die dem Koagulations- oder Lyseassay unter Verwendung der Assaykalibrationsinformation entspricht.
Die vorliegende Erfindung bietet eine Koagulationsmessvorrichtung, die genügend kompakt und kostengünstig ist zur Verwendung in einer Diagnosevorrichtung, die tragbar und nach einer einzigen Anwendung wegwerfbar ist. Die Vorrichtung bietet auch ein genaues und präzises Messen der Reaktionschemie der Diagnosevorrichtung mit Ergebnissen, die zur rechten Zeit zur Bequemlichkeit des Anwenders bereitgestellt werden.
Die Vorteile, Ausführungsformen, Ausgestaltungen und dergleichen werden den Fachleuten aus der vorliegenden Beschreibung offensichtlich, wenn sie zusammen mit den beiliegenden Zeichnungen und anliegenden Ansprüchen betrachtet wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen, die einen Teil dieser Offenbarung umfassen, stellt:
1 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Diagnosevorrichtung,
2 eine schematische Ansicht der in 1 veranschaulichten Diagnosevorrichtung,
3 eine Ausführungsform einer wegwerfbaren erfindungsgemäßen Testkarte für das Einschieben in die in 1 veranschaulichte Vorrichtung mit einem anfänglich immobilisierten Reagenz und Elektroden für das Messen der Viskositätsänderung einer Blutprobe,
4 eine Ausführungsform der Testkarte, wie sie in 3 veranschaulicht ist, mit einem Kapillarkanal für das Inkontaktziehen einer Blutprobe mit den Elektroden,
5 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Testkarte mit zwei Elektrodensätzen in verschiedenen Testbereichen für das Durchführen eines getrennten integrierten Kontrolltests,
6 eine andere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Testkarte, die eine Arbeitseleketrode, eine Gegenelektrode und eine Bezugselektrode aufweist,
7 eine Querschnittsansicht einer erfindungsgemäßen Testkarte,
8 eine Kurve der Leitfähigkeit in mS/cm in Abhängigkeit von der Zeit in Sekunden, die eine Änderung der Leitfähigkeit bei steigender Viskosität während des Koagulierens einer Vollblutprobe veranschaulicht,
9 eine Kurve der Leitfähigkeit in mS/cm in Abhängigkeit von der Zeit in Sekunden, die die Änderung der Leitfähigkeit während des Tests veranschaulicht, dar;
In 10 wird eine normale Plasmaprobe, die mit einer heparinisierten Normalplasmaprobe (HNP) citratisiert worden ist und eine citratisierie COUMADIN-Plasmaprobe (CCP) in einer Kurve der Leitfähigkeit in Abhängigkeit von der Zeit, verglichen; und
11 veranschaulicht die Gerinnungsprofile von Vollblutproben, wobei eine heparinisierte Probe und eine citratisierte Probe auf einer Kurve der Leitfähigkeit in Abhängigkeit von der Zeit miteinander verglichen werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung wird bevorzugt in dem wegwerfbaren, digitalen elektronischen Instrument zur einmaligen Verwendung und in Assayvorrichtungen angewendet. Jedoch wird bei einer anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform eine Mehrfachverwendungs- oder wieder verwendbare Vorrichtung verwendet, die für das Arbeiten mit Handgeräten kompakt oder leicht tragbar und geeignet ist, eine darin hineingeschobene, wegwerfbare Testkarte aufzunehmen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht das genaue und präzise Messen von elektrischen oder Diffusionseigenschaften aus einem oder mehreren Probenahmebereich(en), die sich auf einer oder mehreren Testkarten befinden, für die quantitative Durchführung eines Koagulations- oder Blutlyseassays. Bei den Probenahmebereichen kann es sich um eine oder mehrere Erfassungszonen handeln, die eine erfassbare Änderung der elektrischen oder Diffusionseigenschaften der Probe aufweisen, die dem Koagulations- oder Lysezustand der Probe entsprechen.
Eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen wiederverwendbaren diagnostischen Vorrichtung 10 ist in 1 und 2 veranschaulicht. Die Vorrichtung 10 umfasst ein Gehäuse 12 mit einer Einlassöffnung 14 für die Aufnahme einer Testkarte 16 für das mindestens teilweise Einschieben durch diese. Die Testkarte 16 ist bevorzugt nach Durchführen des erwünschten Assays wegwerfbar. Der Begriff Testkarte 16, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf irgendeinen Assaystreifen, eine Kartusche oder andere geometrische Gestalt, der bzw. die ein oder mehrere Reagenzien und Elektroden wie hier beschrieben, tragen kann. Die Vorrichtung 10 selbst kann irgendeine geeignete geometrische Gestalt annehmen, so lange die hier beschriebene Elektronik und Chemie kostenwirksam mit einer akzeptablen Leistungsfähigkeit darin gehalten sind.
2 veranschaulicht diagrammatisch eine bevorzugte Ausführungsform eines Schaltkreises und der einzelnen Elektronikteile, die das Messen von elektronischen oder Diffusionseigenschaften der Probe während des Koagulations- oder Lyseassays regeln. Im Innenraum des Gehäuses 12 sind alle Komponenten montiert, einschließlich einer zum Durchführen des Assays erforderlichen Stromzufuhr. Wahlweise kann die Vorrichtung einen Stecker für einen Wechselstromadapter bieten. Die Testkarte 16 wird in die Vorrichtung eingeschoben und in Wärmenähe zu einem Heizgerät 18 positioniert, das zum Erwärmen der Probe auf der Testkarte auf eine vorbestimmte Temperatur über der Raumtemperatur verwendet wird. Irgendein herkömmliches Heizgerät 18 geeigneter Größe und Heizkapazität für die vorgesehene Probengröße ist geeignet. Ein Beispiel eines geeigneten Heizgeräts 18 wird von Minco hergestellt, welches Thermofoil ^TM Thermofolienheizgeräte herstellt. Die Thermofoil ^TM Thermofolienheizgeräte geben Hitze genau und präzise auf die Testkarte 16 in der Nähe der Probe ab, ohne die Probe selbst berühren zu müssen. Die Thermofoil ^TM Thermofolienheizgeräte enthalten dünne und biegbare Heizelemente, die zwischen eine biegsame Isolierung wie Kapton C eingebracht sind. Das Element des Heizgeräts 18 ist eine flache Folie anstatt eines röhrenförmigen Drahts. Bevorzugt ist das Thermofoil ^TM Thermofolienheizgerät zwischen zwei Schichten oder unterhalb eines Substrats wie Aluminium oder einem anderen wärmeleitfähigen Material zur effizienten Übertragung von Wärme auf die Testkarte 16 montiert. Bevorzugt wird die Temperatur bei 37°C gehalten, so dass die Prüfergebnisse ohne Weiteres ohne Interpolation mit anderen standardisierten Prüfergebnissen verglichen werden können.
Ein Temperatursensor 24 ist in der Nähe des Erfassungs- oder Probenahmebereichs 20 montiert, wohin die Probe aufgebracht oder transportiert wird, um die Temperatur des Systems zu bestimmen und Angaben zur Umgebungstemperatur zur Kalibriereinstellung bei Temperaturextremen zu bieten. Geeigneterweise wird der Temperatursensor 24 irgendwo in oder auf der Vorrichtung positioniert. Beispielsweise kann der Temperatursensor 24 auf der Testkarte 16 positioniert werden.
Die Stromzufuhr 28 weist eine Stromverbindung von ihrem negativen Pol, der an eine Seite eines Elektrodenpaars 22 angeschlossen ist, und eine Stromverbindung von ihrem positiven Pol, der an einen Analog-Digital-Umwandler 30 und eine Anzeige 26 angeschlossen ist, auf.
Eine Prozessor- und Speicherkomponente 32 ist an den Analog-Digital-Umwandler 30 und die Anzeige 26 angeschlossen. Externe Öffnungen 34 sind an den Analog-Digital-Umwandler 30 für die Aufnahme von Assaykalibrierungsinformationen, das Ankoppeln an einen Rechner oder das Herunterladen von Prüfergebnissen angeschlossen. Ein Ende 38 jedes Elektronenpaars 22 ist elektrisch an ein entsprechendes Paar Kontaktkissen 40 angeschlossen, die die Verbindung zum Prozessor 32 und der Stromquelle 28 bereitstellen. Die Verbindung zwischen den Elektroden 22 und den Kontaktkissen 40 wird dann hergestellt, wenn die Testkarte 16 in die Einlassöffnung 13 eingeschoben wird.
Der Erfassungs- oder Probenahmebereich 20 ist so konfiguriert, dass er die Probe direkt aufnimmt oder die Probe in den Bereich transportiert wird. Der Erfassungsbereich 20 umfasst ein oder mehrere Reagenzien, die anfänglich auf der Oberfläche der Testkarte 16 in dem Bereich immobilisiert wurden. Auf das Aufbingen der Probe auf den Erfassungsbereich 20 hin wird/werden ein oder mehrere der Reagenzien durch die Probe benetzt und damit gemischt. Der Erfassungsbereich 20 ist auch so konfiguriert, dass er die Probe in Kontakt mit Elektroden 22 hält. Die Probe kann ebenfalls durch zusätzliche Reagenzien behandelt oder filtriert werden, bevor die Probe in Kontakt mit den Elektroden 22 gebracht wird.
Wahlweise weist die Testkarte 16 ein Elektrodenpaar 36 auf, das in der Nähe des Erfassungsbereichs 20 darauf montiert ist, um das Vorliegen und die Bewegung von Probeflüssigkeit auf der Testkarte 14 zu erfassen. Das Vorliegen der Probeflüssigkeit, die das Elektrodenpaar 36 überbrückt, reduziert den Widerstand über die Elektroden und signalisiert das Vorliegen eines Leiters (Probeflüssigkeit) dazwischen. Wenn die Probe die Elektroden 36 kontaktiert, so sind die chemischen Reaktionen schon voll im Gang und das Instrument beginnt das Reagenziensystem abzulesen. Das Ablesen kann sofort dann beginnen, wenn die Probe die Elektroden 36 kontaktiert oder es kann eine Verzögerung von weniger als 1 Sekunde bis 10 Minuten (bevorzugt etwa 30 Sekunden bis 2 Minuten) stattfinden. Es kann/können eine einzige Ablesung oder mehrfache Ablesungen stattfinden oder die Ablesungen können fortgesetzt werden, bis das Ansprechen des Reagenziensystems sich entweder bei einem Endpunkt, Maximum oder Minimum oder einer konstanten Reaktionsgeschwindigkeit stabilisiert hat.
Bei dem Prozessor 32 kann es sich um irgendeine allgemeine oder kundenspezifische integrierte Schaltung mit Speicher handeln. Der Prozessor 32 muss die Kapazität besitzen, entweder einen Satz vorprogrammierter Kalibriationsinformationen zu speichern oder die Fähigkeit besitzen, während der Geräteherstellung programmiert zu werden. Im Falle der vorprogrammierten Kalibrierung ist die Auswahl entsprechender Informationen während der Herstellung erforderlich und kann durch Laserbrennen einer Auswahl von Schaltungswegen oder irgendeine bequeme Art und Weise stattfinden. Im Falle der Kalibrierung nach der Herstellung ist eine Methode zum Laden von Kalibrationsdaten auf den Chip erforderlich, beispielsweise externe Öffnungen 34. Die externe Kalibrierung kann mit externen elektrischen Kontakten stattfinden oder mit einer Nichtkontaktmethode unter Zuhilfenahme von Radiowellen, magnetischen Feldern, Pulslicht, Laser oder dergleichen erfolgen. Die Nichtkontakt-Kalibrierungsmethode ist vom Herstellungsstandpunkt her eventuell praktischer und effizienter.
Der Prozessor 32 steuert auch den ganzen Betrieb des Instruments einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, das Anstellen des Instruments als Reaktion auf das Einschieben einer Testkarte 16 unter Bereitstellung von elektrischen Strom- oder Zeitsignalen; die Zeiteinstellung mit einer integrierten Uhr, Aufzeichnen und Verarbeiten der Instrumentnullfunktion; Regeln irgendwelcher Zeitverzögerungen oder zeitgesteuerter Schritte während des Ablesens; Bestimmen, wann der Assay sich stabilisiert hat; Empfangen und Verarbeiten von Informationen vom Temperatursensor und Empfangen von Eingaben vom Messen der elektrischen Eigenschaften der Probe und Umwandeln derselben in Ausgangssignale, auf der Basis von Kalibrationsinformation, an die Anzeige. Der Prozessor bestimmt auch, ob die Koagulations- oder Lysereaktion innerhalb der spezifizierten Zeit bis zu einem spezifizierten Endpunktbereich oder innerhalb eines spezifizierten Reaktionsgeschwindigkeitsbereichs zum Regeln bei inaktiven Reagenzien stattgefunden hat. Irgendwelche anderen elektronischen Steuerkontrollen können ebenfalls eingeschlossen sein. Der Prozessor 32 umfasst Coden, die die Herstellungschargennummern der Gerätekomponenten identifizieren. Der Prozessor 32 enthält ein Programm, das das Interpretieren des Stroms aus den Elektroden, das Bezugsetzen des Signalstärkeverhältnisses zu der Bezugsstärke, das Bereitstellen von Assayergebnissen, das Identifizieren potentieller Fehler und das Durchführen anderer Qualitätskontrollen einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist.
Durch Anwendung dieser Messungen mit im Prozessor 32 gespeicherten Informationen erhält man genaue Ergebnisse auf das Abschließen jedes Assays hin. Beispiele der in dem Mikroprozessor gespeicherten Informationen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Algorithmen oder Kalibrationskurven für die für die Analyse ausgewählten Analyten und andere Assaykalibrationsinformationen; Informationen über die Reaktionsstabilisation, den Endpunkt oder seltene Informationen; und Herstellungschargeninformationen über jede der chemischen Reagenzien, Detektoren, LED, Assaystreifen oder andere in der Vorrichtung verwendete Komponenten.
Die Stromzufuhr 28 kann aus irgendeiner geeigneten Vorrichtung bestehen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, einer Batterie oder Solarzelle. Die Gebrauchsfähigkeitsdauer des Endprodukts ist etwa 6 Monate bis etwa 24 Monate bei Raumtemperatur. Die Stromzufuhr muss eine mit dieser Gebrauchsfähigkeitsdauer im Einklang stehende Stabilität aufweisen.
Bevorzugt handelt es sich bei der Anzeige 26 um eine LCD-Flüssigkristallanzeige oder irgendein herkömmliches kostengünstiges Anzeigegerät. Die Zahlengröße in der Anzeige sollte ausreichend groß sein, um es den meisten Leuten zu erlauben, den Assaywert selbst dann abzulesen, wenn sie schlecht sehen. Die Anzeigehöhe kann etwa 2,0 cm betragen. Die Anzahl von Ziffern in der Anzeige kann irgendwo zwischen 1 und etwa 10 Ziffern liegen, jedoch reicht gewöhnlich eine 3 bis 5-stellige Anzeige aus. Zusätzlich zum Anzeigen des Assayergebnisses kann die Anzeige noch Meldungen anzeigen, die sich auf das Assayergebnis oder das Verarbeiten beziehen, oder Fehlermeldungen angeben.
Der Wandler 30 kann einen Mehrfachkoppler zum Integrieren des Signals von den Elektroden umfassen und das Digitalsignal zum Prozessor 32 bereitstellen. Der Prozessor kann zum Bestimmen der Zeit verwendet werden, die erforderlich ist, bis das Integral einen festgesetzten Spannungsvergleichergrenzwert erreicht. Die Zeit ist dem durchschnittlichen Signal über die Probenahmeperiode proportional.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die gesamte Vorrichtung 10 wegwerfbar sein, indem die Testkarte 16 als Teil der Vorrichtung zusammengebaut und mit allen anderen Komponenten innerhalb des Innenraums des Gehäuses während der Herstellung versiegelt wird. Um die Blutprobe in den Erfassungsbereich 20 der Testkarte 16 einzuführen, erstreckt sich eine in 1 gezeigte Aufnahmeöffnung 44 von der Oberfläche des Gehäuses 12 bis in ihr Inneres zum Aufnehmen einer Probe. Sobald die Probe durch die Aufnahmeöffnung 44 eingeführt worden ist, wird die Probe chemisch mit mindestens einem Reagenz 42 unter Bildung einer Reaktionsproduktmischung reagiert, die dem Koagulations- oder Lysezustand der Probe entspricht. Ein Teil der Reaktionsproduktmischung erzeugt eine erfassbare Änderung der elektrischen oder Diffusionseigenschaften der Probe, die mit dem Koagulations- oder Lysezustand der Probe korreliert. Obwohl die Vorrichtung 10 automatisch durch Einschieben der Testkarte 16 aktiviert werden kann, kann wahlweise ein handbetätigter Prüfdruckknopf 46 an dem Gehäuse 12 so bereitgestellt werden, dass er von außen zugänglich ist.
Die Vorrichtung 10 kann irgendeine geeignete Größe aufweisen, wobei die optimalen Dimensionen durch mehrere Faktoren, einschließlich der Bequemlichkeit der Verwendung durch den Benutzer, bestimmt wird. Bevorzugt weist das Gerät 10 einen Volumenbereich von etwa 15 cm³ bis etwa 500 cm³ auf.
Bei der praktischen Durchführung einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Viskositätsänderungen einer Probe durch Reagieren der Probe innerhalb des Gehäuses einer mindestens teilweise wegwerfbaren Vorrichtung mit einem entsprechenden Reagenz bestimmt, das dem Assay entspricht, damit die Probe eine erfassbare Änderung der elektrischen oder Diffusionseigenschaften erzeugt, die mit dem Koagulations- oder Lyseassay der Probe korreliert. Daraufhin wird die Viskositätsänderung unter Zuhilfenahme der vorhin schon beschriebenen Assaykalibrationsinformation kalibriert und in eine zahlenmäßige Ausgabe umgewandelt. Die Assaykalibrationsinformation ist für das spezifische Reagenz in dem Gehäuse und für die erfassbare Änderung der elektrischen oder Diffusionseigenschaften jeder Probe einzigartig charakteristisch.
Der Begriff spezifisches Reagenz bezieht sich auf das Reagenz, das in dem einzelnen Vorrichtungsgehäuse enthalten ist. Bei der Vorrichtung zur einmaligen Verwendung, die vollständig wegwerfbar ist, ist die Chemie (d.h. die Herstellungschargennummer usw.) des spezifischen Reagenz bekannt, wenn das Gehäuse, die Innenteile und das Reagenz hergestellt werden. Deshalb kann bei der vorliegenden Erfindung Assaykalibrationsinformation verwendet werden, die für das spezifische Reagenz einzigartig ist. Desgleichen kann die Assaykalibrationsinformation spezifische individuelle Information über jede bei der Herstellung der einzelnen Assayvorrichtungen verwendete Komponente enthalten. Bevorzugt wird die Vorrichtung so hergestellt, dass die Assaykalibrationsinformation in dem Prozessor innerhalb des Gehäuses gespeichert und alle Komponenten in dem Gehäuse fest versiegelt sind. Bezüglich der Testkarte zur einmaligen Verwendung und der wiederverwendbaren Vorrichtung kann diese Information verschlüsselt auf der Testkarte angegeben und auf das Einschieben hin durch die Vorrichtung gelesen werden.
Die Assaykalibrationsinformation kann zum Bestimmen der Genauigkeit des Assays durch Messen eines elektrischen Signals verwendet werden, das als Antwort auf die die Viskosität messende bestimmbare Änderung durch elektrische oder Diffusionseigenschaften mit einem vorbestimmten Bereich für das elektrische Signal erzeugt wird. Die bestimmbare Änderung kann auch gegen einen Referenzstandard kalibriert werden, der in der Assaykalibrationsinformation enthalten ist oder mit deren Hilfe berechnet wird. Die Assayergebnisse können auch auf die Umgebungstemperatur des Vorrichtungsgehäuses unter Zuhilfenahme der Kalibrationsinformation eingestellt werden. Die Assaykalibrationsinformation kann mit der Anzeigeausgabe verglichen werden, um die Genauigkeit des Assays zu bestimmen, indem ein vorbestimmter Bereich für die Ausgabeanzeige in die Information eingeschlossen wird. Eine andere Methode zum Bestimmen der Genauigkeit des Assays besteht darin, das Vorliegen der Probe zeitlich zu bestimmen und die zum Erzielen des Assayergebnisses benötigte Zeit mit der Kalibrationsinformation zu vergleichen, die einen vorbestimmten Bereich für diesen Parameter einschließen kann.
Obwohl eine Testkarte durch die oben veranschaulichte Ausführungsform analysiert wird, bietet die vorliegende Erfindung auch die Möglichkeit des sequentiellen Analysierens mehrerer Probenahmebereiche auf einer Testkarte oder das Analysieren von mehr als zwei Testkarten entweder gleichzeitig oder sequentiell.
Die erfindungsgemäße Testkarte 16 kann verschiedene Konfigurationen aufweisen. 3 veranschaulicht eine Ausführungsform, bei der das Elektrodenpaar 22 in dem Erfassungsbereich 20 bereitgestellt wird. Ein Ende 38 jeder der Elektroden des Elektrodenpaars 22 ist elektrisch an ein entsprechendes Paar Kontaktkissen 40 angeschlossen, um den Anschluss an den Prozessor 32 und die Stromquelle 28, wie vorher schon in 2 beschrieben, bereitzustellen. Der Anschluss zwischen den Elektroden 22 und den Kontaktkissen 40 findet dann statt, wenn das Ende 48 der Testkarte 16 in die Einlassöffnung 14 eingeschoben wird.
4 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Testkarte 16, wobei ein Kapillarkanal 50 zum Transportieren einer Probe zum Erfassungsbereich 20 bereitgestellt wird. Ein Ende 52 des Kapillarkanals endet in der Nähe der Kante 54 der Testkarte, die nicht in die Einlassöffnung eingeschoben ist. Das entgegengesetzte Ende 56 des Kapillarkanals wird mit dem Erfassungsbereich 20 verbunden.
5 zeigt eine andere Ausführungsform einer Testkarte 16, die einen integrierten Steuertestbereich 58 mit einem Paar Elektroden 60 für das Kontaktieren der Probe bereitstellt. Ein Ende 62 jeder Elektrode des Elektrodenpaars 60 wird elektrisch an ein entsprechendes Paar Kontaktkissen 40 angeschlossen, um den Anschluss an den Prozessor 32 und die Stromquelle 28, wie vorher in 2 beschrieben, bereitzustellen. Die Kapillare 50 spaltet sich am Ende 56, um die Probe sowohl zum Erfassungsbereich 20 als auch zum Kontrolltestbereich 58 zu transportieren. Die Tatsache, dass ein Kontrolltestbereich 58 verfügbar ist, der von dem Erfassungsbereich 20 getrennt ist, erlaubt das Immobilisieren anderer Reagenzien im Kontrolltestbereich als im Erfassungsbereich.
7 zeigt eine Querschnittsansicht der Testkarte 16, bei der ein nicht poröses Substrat 70 verwendet wird, das bevorzugt aus einem polymeren Material hergestellt ist. Eine obere Platte 27, die ebenfalls aus einem nicht porösen Material hergestellt ist, wird über das Substrat 70, das den Erfassungsbereich 20 definiert, gelegt. Die Elektrode 22 befindet sich im Erfassungsbereich 20 und erstreckt sich bis zum Ende 38.
Die vorliegende Erfindung bietet auch ein Reagenzsystem für die Verwendung in Koagulations- oder Lyseassay, die sich auf die Erzeugung eines elektrischen Signals (Spannung, Strom usw.) verlassen, das auf den Blutgerinnungs- oder den Lysevorgang schließen lässt. Diese Reagenzzusammensetzungen sind in Assayvorrichtungen besonders nützlich, in denen eine Flüssigblut- oder Plasmaprobe durch Kapillarwirkung in die Testkarte transportiert wird, die das Reagenz enthält und in der der Assay durchgeführt wird.
Die Reagenzzusammensetzungen sind hauptsächlich für die Verwendung bei Blutkoagulations- oder Blutlyseassays entwickelt worden, bei denen man sich auf Änderungen der Viskosität und schließlich die Reduzierung oder Erhöhung der Ionenmobilität und/oder Diffusionscharakteristiken einer zugegebenen elektroaktiven Spezies der Blut- oder Plasmaprobe, wie sie durch die Erzeugung eines elektrischen Signals (Strom oder Spannung) gemessen wird, verlässt. Blut ist ein Elektrolyt und kann daher einen elektrischen Strom leiten oder führen. Die elektrolytische Leitfähigkeit ist ein Maß der Fähigkeit einer Lösung von Elektrolyten, einen elektrischen Strom durch die Mobilität ihrer Ionen unter dem Einfluss eines Potentialgradienten zu führen. Die Ionenmobilität und – diffusion ist eine Funktion der Lösungsviskosität, Ionengröße und Ladung und der Größe des aufgebrachten Potentials. Wenn Blut zu gerinnen oder sich zu koagulieren beginnt, verdickt es sich oder führt dazu, dass sich seine Viskosität erhöht. Diese Viskositätserhöhung hemmt oder verzögert die Ionenmobilität. Die Verzögerung der Ionenmobilität ist direkt proportional zu einer Reduzierung des elektrischen Stroms der gesamten Lösung. Während des Gerinnungsvorgangs zieht sich das Blutgerinnsel zusammen und die Fibrinmonomere vereinigen sich unter Bildung eines Gerinnsels. Der Zusatz der elektroaktiven chemischen Spezies zu der Reagenzzusammensetzung verbessert die Leitfähigkeit von nicht geronnenem Blut durch Modulieren des gemessenen Signals. Diese Verbesserung führt zu einer erhöhten Empfindlichkeit und Verlässlichkeit der Erfassungstechnik. Während der Gerinnselbildung verzögert das Fibringerinnsel die Bewegung von Ionen und deshalb nimmt der Strom ab. Bis zu diesem Zeitpunkt, an dem die Gerinnung abgeschlossen ist, kann eine leichte Erhöhung des Stroms im Gerinnsels aufgrund der Aggregation der elektroaktiven Spezies trotz eingeschränkter Ionenmobilität und/oder Diffusion stattfinden. Ein derartiges Strom-Zeit-Profil ist äußerst nützlich zum Bestimmen des Einsetzens des Gerinnens sowie des Endpunkts des Gerinnungsvorgangs und könnte konzeptuell ein äußerst genaues Mittel zum Bestimmen der Blutgerinnungszeit in PZ-, ATTZ- oder anderen Gerinnungsassays bieten. Die Empfindlichkeit dieser Typen von Strom- oder Spannungszeitmessungen ist der direkten Messtechnik inhärent und verlässt sich nicht auf sekundäre oder indirekte Indikatoren wie die Farb- oder Fluoreszenzerfassung durch optische Mittel und Trübemessungen durch Lichtstreuungsmethoden. Gleichzeitig kann durch diese Methode die Wirkung der Thrombolyttherapie auf Blutgerinnsel, beispielsweise unter Zuhilfenahme des Gewebeplasminogenaktivators, die Zeit, die zum Auflösen des Gerinnsels erforderlich ist (die auch als Gerinnsellysezeit oder Lyseeinsetzzeit bezeichnet wird) ebenfalls bestimmt werden. Angenommen, der Basislinienstrom des Gerinnsels ist aufgrund des Vorliegens aggregierter elektroaktiver Spezies hoch, so erfolgt beim Lösen des Gerinnsels anfänglich eine Reduzierung des Stroms, gefolgt von einer scharfen Erhöhung aufgrund erhöhter Ionenmobilität oder Diffusionscharakteristiken.
Bei PZ-Assays besteht die Reagenzmatrix normalerweise aus Thromboplastin, das durch Reinigen aus einem wässrigen Extrakt von mit Aceton getrocknetem Gehirngewebe erhalten worden ist, das viele Komponenten und Verunreinigungen enthält. Im Gegensatz dazu besteht synthetisches rekombinantes Thromboplastin (r-DNA-Thromboplastin) aus einem relativ gut definierten Komplex, der durch gereinigtes rekombinantes Gewebefaktorprotein und eine gereinigte künstliche Lipidkomponente gebildet wird. Die vorliegende Erfindung bietet eine Reagenzzusammensetzung, die entweder Thromboplastin enthält, das aus Gehirngewebe gereinigt und isoliert worden ist, oder r-DNA-Thromboplastin, das in der Lage ist, ein von irgendwelchen nachteiligen Faktoren unabhängiges PZ-Ergebnis zu bieten.
Bei den Reagenzzusammensetzungen handelt es sich bevorzugt um eine wässrige Lösung, die auf die Testkarte mit Hilfe verschiedener Arten von Mikroabgabetechniken aufgebracht werden kann, die Tintenstrahl-, Streifer- und Sprühaufgabemethoden oder Eintauchbeschichten umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, und während des Herstellungsvorgangs in situ luftgetrocknet wird. Bei einer derartigen Lösung werden das Thromboplastinreagenz und die elektroaktive Spezies, die bei Koagulationsassays verwendet werden, in einer homogenen wässrigen Lösung gemischt, die entsprechende Verhältnisse spontan hydratisierbarer und löslicher chemischer Kohlenhydratspezies wie Saccharose, Stärke, Dextrose, Dextran, Maltodextrin oder andere wasserlösliche Polymere, Bindemittel und dergleichen enthält. Die Verwendung der Kohlenhydratspezies dient dem Erleichtern des Hydratisierens und Stabilisierens der Reagenzmatrix während der Solvatation mit der Flüssigprobe wie Blut oder Plasma.
Die vorliegende Erfindung bietet auch das Erfassen oder Messen der Änderungen der Diffusionskonstante oder des kinetischen Profils einer elektroaktiven Spezies, die der Blutprobe zugegeben wird, in Abhängigkeit von der Zeit, während der das Fluid eine Gerinnung durchmacht. Irgendeine elektrochemische Technik, die die Bestimmung der Diffusionskinetik/-konstanten einer elektroaktiven Substanz erlaubt, ist für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet. Eine bekannte Konzentration einer elektroaktiven Spezies wird in der Probe gelöst und es kann dann ein scheinbarer Diffusionskoeffizient gemessen werden. Die erhaltene Information hängt von der Natur der elektroaktiven Spezies ab. Geeignete elektrochemische Techniken umfassen die Polarographie, cyclische Voltammetrie (CV), Drehscheibenvoltammetrie (RDV), Chronoamperometrie/Chronocoulometrie und die Chronopotentiometrie und sind bei E. Dayalan et al. „Micelle and Microemulsion Diffusion Coefficients (Mizellen und Mikroemulsions-Diffusionskoeffizienten)", Electrochemistry in Colloids and Dispersion, VCH Publishers, Inc. New York 1992 und den darin enthaltenen Literaturangaben offenbart. Die Verhältnisse von Strom zu Diffusionskoeffizient, die bei jeder dieser Techniken zutreffen, sind wie folgt:
Polarographie (Ilkovic-Gleichung) id = 708nCD1/2m2/3+1/6 Cyclische Volammetrie (Randles-Sevcik-Gleichung) ip = 0,4463(n3/2F3/2)/(R1/2T1/2)ACD1/2v1/2)Drehscheibenvoltammeetrie (Levich-Gleichung) il = 0,62nFACD2/3v-1/6w1/2 Chronoamperometrie (Cottrell-Gleichung) i(t) = nFACD1/2π-1/2t-1/2 Chronopotentiometrie (Sand-Gleichung) i(τ) = 1/2nFACD1/2π-1/2τ-1/2
Die obigen Symbole besitzen folgende Bedeutung: i_d ist der polarographische diffusionsbegrenzte Strom (A), n ist die Anzahl übertragener Elektronen, C ist die Konzentration der elektroaktiven Sonde (Mol cm^-3), D ist der Diffusionskoeffizient der elektroaktiven Sonde (cm² s^-1), m ist die Massenströmungsgeschwindigkeit von Quecksilber bei der Tropfelektrode (mg s^-1), t ist die Tropfzeit bzw. die Tropfzeiten, I_p ist der Spitzenstrom (A), F ist die Faraday-Konstante (Coulombs Mol^-1), A ist der Bereich der Elektrode (cm²), R ist die Gaskonstante (J Mol^-1), T ist die Temperatur (K), v ist die Spannungsabtastrate (V s^-1), i_l ist der Grenzstrom (A), v ist die kinematische Viskosität der Lösung (cm² s^-1), w ist die Winkelgeschwindigkeit der sich drehenden Scheibenelektrode (rad s^-1), i(t) ist der Diffusionsstrom (A) bei dem Zeitpunkt t(s) und τ ist die Übergangszeit (s).
Die bevorzugten elektrochemischen Methoden sind die Voltammetrie, die cyclische Voltammetrie, Chronoamperometrie und Chronopotentiometrie. Bei diesen Methoden ist der gemessene Strom dem Diffusionskoeffizienten der elektroaktiven Spezies proportional, die mit der über die Zeit gemessenen Viskosität der Probe in Bezug steht. Im Allgemeinen wird das Potential oder die Spannung bei der Chronoamperometrie bei einem konstanten Niveau, beispielsweise 400 Millivolt oder einer anderen geeigneten Spannung aufgebracht, die ausreicht, um die elektroaktive Spezies zu oxidieren oder zu reduzieren, was zu einer Änderung des Stroms im Laufe der Zeit führt. Bei der cyclischen Voltammetrie wird die Spannung bei zwei verschiedenen Potentialen cyclisiert. Bei der Chronopotentiometrie wird der Strom auf konstante oder vorgeschriebene Änderungsweise aufgebracht und das Potential im Laufe der Zeit gemessen.
Bei einer voltammetrischen Methode wird ein Potential angelegt und der Strom in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Bei zwei Ausgestaltungen dieser Methode wird das aufgebrachte Potential konstant gehalten oder das Potential auf vorgeschriebene Weise geändert. Bevorzugt wird eine voltammetrische Methode zum Messen des diffusionsbegrenzten Stroms der elektroaktiven Spezies verwendet. Die Vorrichtung misst den diffusionsbegrenzten Strom der elektroaktiven Spezies, die in dem Reagenz vorliegt. Der diffusionsbegrenzte Strom steht mit dem Diffusionskoeffizienten der elektroaktiven Spezies in der Probe in Beziehung, der ein direktes Maß der Viskositätsänderung der Probe ist. 6 veranschaulicht eine wegwerfbare Testkarte 16, die eine miniaturisierte elektrochemische Zelle bietet, die eine Arbeitselektrode 64, eine Bezugselektrode 66 und bevorzugt eine Gegenelektrode 68 im Erfassungsbereich 20 enthält. Die Elektroden können aus verschiedenen Metalltypen hergestellt werden. Bevorzugt sind die Arbeitselektrode 64 und die Gegenelektrode 68 aus Graphit/Kohlenstoff, Gold oder Platin und die Bezugselektrode 66 ist aus Silber/Silberchlorid hergestellt.
Bevorzugte elektroaktive Spezies sind wasserlöslich und bilden ein Redoxpaar. Noch spezifischer sind Ferricyanid, Ferrocyanid, Cadmiumchlorid und Methylviologen die bevorzugteste elektroaktive Spezies zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung.
Die Reagenzzusammensetzungen, die auf den erfindungsgemäßen Testkarten immobilisiert sind, sind hauptsächlich zur Verwendung bei Blutkoagulations- oder Blutlyseassays entwickelt worden, bei denen man sich auf Änderungen der Viskosität und schließlich die Reduktion oder Erhöhung der Ionenmobilität oder Änderungen der Diffusionskinetik der Blutplasmaprobe, wie sie durch die Erzeugung eines elektrischen Signals (Strom oder Spannung) gemessen wird, verlässt. Denn Blut ist ein Elektrolyt und kann daher einen elektrischen Strom leiten oder führen. Die elektrolytische Leitfähigkeit ist ein Maß der Fähigkeit einer Lösung von Elektrolyten, einen elektrischen Strom aufgrund der Mobilität ihrer Ionen unter dem Einfluss eines Potentialgradienten zu führen. Die Ionenmobilität und Diffusionskinetik hängt von der Lösungsviskosität, der Ionengröße und -ladung und der Stärke des aufgebrachten Potentials ab. Wenn Blut zu gerinnen oder sich zu koagulieren beginnt, verdickt es sich oder verursacht, dass seine Viskosität sich erhöht. Diese Viskositätserhöhung hemmt oder verzögert die Ionenmobilität. Die Verzögerung der Ionenmobilität ist einer Reduktion des elektrischen Stroms der gesamten Lösung direkt proportional. Während des Gerinnungsvorgangs, zieht sich das Blutgerinnsel zusammen und Fibrinmonomere lagern sich aneinander unter Bildung eines Gerinnsels an. Während die Gerinnung stattfindet, verzögert das Fibringerinnsel die Bewegung von Ionen und man kann daher eine Reduzierung des Stroms erwarten. Ein derartiges Strom-Zeit-Profil ist äußerst nützlich zum Bestimmen des Einsetzens des Gerinnens sowie des Endpunkts des Gerinnungsvorgangs und könnte konzeptuell ein äußerst genaues Mittel zum Bestimmen der Blutgerinnungszeiten in PZ-, ATTZ- und anderen Gerinnungsassays bieten. Die Empfindlichkeit dieser Typen von Strom- oder Spannungszeitmessungen ist der direkten Messtechnik inhärent und verlässt sich nicht auf sekundäre oder indirekte Indikatoren. Zum Verbessern der Stabilität der Reagenzien auf der Testkarte wird bevorzugt ein Konservierungsmittel wie Thimerosol, ein Tensid wie Triton und zusätzliche Puffersalze hinzuzufügen.
Die vorliegende Erfindung kann auch auf einen Hautblutungszeitvorgang angewendet werden, bei dem aus einer standardisierten Wunde austretendes Blut durch die steigende Leitfähigkeit zwischen einer Oberflächenelektrode und der darunter liegenden Haut fortschreitend quantifiziert wird. Die hier beschriebene Testkarte kann direkt auf die Wunde eines Patienten aufgegeben werden. Nötigenfalls kann die Information bezüglich einer standardisierten Wunde durch Einführen einer entsprechend ausgebildeten Lanzette als Teil der Testkarte erhalten werden. Das aus der Wunde austretende Blut kann direkt auf die Oberfläche der Testkarte aufgebracht werden.
BEISPIELE
Es sei denn, es wird etwas Anderes angegeben, so wurde bei den folgenden Tests ein handelsmäßig verfügbares Reagenz, Thromboplastin-XS mit Calcium (Pt), verwendet, was von Dade International, Miami, FL, erhalten wurde und unter dem Warennamen INNOVIN^® verkauft wird, bei dem es sich um einen getrockneten rekombinanten menschlichen Gewebefaktor mit Calcium handelt. Das Pt-Reagenz beschleunigt die Gerinnselbildungsrate, wobei gewöhnlich ein Gerinnsel in etwa 45 Sekunden gebildet wird. Das Pt-Reagenz enthält eine Quelle von Gewebethromboplastin und wurde mit entionisiertem Wasser, wie vom Hersteller gefordert, rekonstituiert, auf eine Mikrolektrode gegeben und teilweise luftgetrocknet. Es wurden keine zusätzlichen Zusatzmittel wie ein Konservierungsmittel oder Tensid verwendet. Die Mikroelektrode wurde von Applied Graphics, Soquel, CA, durch Aufdrucken einer dünnen Schicht Silber unter Bildung der Elektrode auf die Oberfläche einer nicht porösen Testkarte in einer in 3 illustrierten Konfiguration hergestellt. Die Testkarte wurde vor der Verwendung mit Wasser und Alkohol gewaschen. Alle Tests wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem die Blutprobe auf die das Pt-Reagenz enthaltende Mikroelektrode aufgebracht worden war, wurde das Gerinnungsprofil von Hand mit Hilfe eines herkömmlichen Leitfähigkeitsmessgeräts aufgezeichnet, das an die Kontaktkissen der Elektrode angeschlossen war. Das Messgerät wird von Horiba in Japan hergestellt.
8 veranschaulicht eine Änderung der Leitfähigkeit bei steigender Viskosität während eine Vollblutprobe sich koaguliert. 9 zeigt das Kurvenbild der Änderung der Leitfähigkeit während des Tests. Die Leitfähigkeit wurde sofort auf die Abnahme hin gemessen, bis die Probe sich zu koagulieren begann. Die Leitfähigkeit beginnt bei etwa 0,31 mS/cm und, wie hier entdeckt, nimmt charakteristischerweise ziemlich gleichförmig ab, bis die Leitfähigkeit sich bei etwa 0,24 mS/cm abflacht, bei welchem Punkt die Leitfähigkeit anzusteigen beginnt. Es wurde beobachtet, dass nach Entfernen der Verstopfung nur Serum zurückblieb, bei dem es sich hauptsächlich um Elektrolyt handelt und das die Leitfähigkeitserhöhung beeinflusste.
Die Gerinnselbildungszeit wird durch Auftragen der Leitfähigkeitsabnahme zwischen t=0 und ungefähr t=150 Sekunden aus diesen Testergebnissen bestimmt und führt erstaunlicherweise zu einer genauen Gerinnungszeitmessung, die mit der PZ-Zeit korreliert werden kann. Obwohl die Tests nicht optimiert wurden und bei ihnen keine Temperatursteuerung verwendet wurde, sind die Leitfähigkeitsänderungen während des Blut/Plasmakoagulationsvorgangs klar bewiesen.
Andere Tests wurden als Kontrolle mit Pt-Reagenz und Salzwasser durchgeführt, um zu überprüfen, ob die charakteristische Kurve der Koagulation zuzuschreiben war. Die dabei entstehenden Kurven waren flach, was anzeigt, dass die in 8 zu sehende Reaktion tatsächlich der Koagulation zuzuschreiben war. Über die gleiche Zeitspanne ändert sich die Viskosität von Leitungswasser nicht und bleibt ziemlich konstant.
In 10 wird eine normale Plasmaprobe, die citriert worden ist (CNP) mit einer heparinisierten normalen Plasmaprobe (HNP) und einer citrierten COUMADIN Plasmaprobe (CCP) verglichen. Die graphische Darstellung zeigt, dass die CNP-Kurve die schnellste Gerinnselbildung aufwies. Die CCP-Kurve eines Patienten, der eine Antikoagulantientherapie mit COUMADIN durchmacht, weist die charakteristische oben veranschaulichte Neigung auf, ist jedoch eindeutig von der normalen Plasmaprobe verschieden. Die HNP-Kurve eines mit Heparin behandelten Patienten weist eine extremere Reaktion zu einem Antikoagulantien-Arzneimittel auf.
11 veranschaulicht die Gerinnungsprofile von Vollblutproben beim Vergleich einer heparinisierten Probe und einer citrierten Probe. Wiederum liegt die charakteristische Wirkung selbst im Vollblut eines Patienten, der mit Heparin behandelt wird, vor. Mehrere Sätze der Tests wurden durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit zu bestätigen.
Die vorliegende Erfindung ist bei vielen Koagulations- und Lyseassaytypen nützlich. Beispielsweise, und nicht zur Einschränkung, umfassen erfindungsgemäße Anwendungen PZ-, ATTZ-, Thrombinzeit-, Fibrinogenassays und die Plättchenerfassung. Für Fibrinolyseassays wird ein lytisches Mittel wie ein Gewebeplasminogenaktivator in die Gerinnungsreagenzmischung eingearbeitet. Nach Einsetzen des Gerinnens erfolgt eine Erhöhung der Leitfähigkeit, was das Einsetzen der Lyse anzeigt.
Captions
8.

Control = Kontrolle
Blood = Blut
Cond. In mS/cm = Leitfähigkeit in mS/cm
Time in second = Zeit in Sekunden

9 + 10

Cond. In mS/cm = Leitfähigkeit in mS/cm
Time in second = Zeit in Sekunden

11

Heparinized = heparinisiert
Citrated = citriert
Conductivity (MS/CM) = Leitfähigkeit (mS/cm)
Time (Seconds) = Zeit (Sekunden)

Claims

Elektronische Vorrichtung zur einmaligen Verwendung zur Durchführung eines Koagulations- oder Lyseassays an einer Blutprobe, wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst: ein Gehäuse, das eine Außenfläche aufweist und einen Innenbereich definiert; Mittel zum Empfang der Probe durch das Gehäuse in den Innenbereich; ein nicht poröses Substrat, das im Innenbereich zum Empfang der Probe darauf positioniert ist; ein Reagenz zur Beschleunigung der Koagulation der Probe, das auf dem Substrat und in Kontakt mit der Probe positioniert ist; eine elektroaktive Spezies, die auf dem Substrat und in Kontakt mit der Probe positioniert ist; Mittel zum Messen der Viskosität der Probe und Generieren eines elektrischen Signals, das mit einer Kurve eines Koagulations- oder Lyseassays korreliert; Verarbeitungsmittel, das im Innenbereich positioniert ist und an das Messmittel zum Empfang und zur Umwandlung des elektrischen Signals in eine Digitalausgabe, die dem Koagulations- oder Lyse-Assay unter Verwendung der im Verarbeitungsmittel gespeicherten Assaykalibrationsinformation entspricht, angeschlossen ist; und Anzeigemittel zur Sichtanzeige der Digitalausgabe außerhalb des Gehäuses, wobei das Anzeigemittel an das Verarbeitungsmittel angeschlossen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Messmittel Folgendes einschließt: Mittel zum Generieren eines Signals von prädeterminierter Frequenz, wobei das Generierungsmittel im Innenbereich positioniert ist; mehrere Elektroden, die auf dem Substrat positioniert sind und die Probe kontaktieren, wobei die Elektroden an das Generierungsmittel zum Weiterleiten des Signals in die Probe angeschlossen sind, wobei die Elektroden ein elektrisches Signal generieren, das der Leitfähigkeit/Widerstandsfähigkeit der Probe entspricht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Messmittel Folgendes einschließt: Mittel zum Generieren eines Signals von prädeterminierter Frequenz, wobei das Generierungsmittel im Innenbereich positioniert ist; mehrere Elektroden, die auf dem Substrat positioniert sind und die Probe kontaktieren, wobei die Elektroden an das Generierungsmittel zum Weiterleiten des Signals in die Probe angeschlossen sind, wobei die Elektroden ein elektrisches Signal generieren, das dem Diffusionskoeffizienten der elektroaktiven Spezies entspricht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die elektroaktive Spezies aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ferricyanid, Ferrocyanid, Cadmiumchlorid und Methylviologen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung weiter ein Heizgerät einschließt, das sich im Innenbereich und in thermischem Kontakt mit dem Substrat befindet, damit das Substrat nach Empfang der Blutprobe auf eine prädeterminierte Temperatur erwärmt werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Verarbeitungsmittel weiter das elektrische Signal gegen einen Referenzstandard unter Verwendung der gespeicherten Assaykalibrationsinformation kalibriert.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Verarbeitungsmittel weiter die Umgebungstemperatur der Assay-Vorrichtung von einem Sensor im Gehäuse empfängt und die Assayergebnisse unter Verwendung der gespeicherten Assaykalibrationsinformation anpasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die im Verarbeitungsmittel gespeicherte Assaykalibrationsinformation die Ergebnisse für mindestens einen der Assays bestimmt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Prothrombinzeit und aktivierten partiellen Thromboplastinzeit, Thrombozytenaggregation und Fibrinogen.
Testkarte für eine elektronische Vorrichtung, die ein Signal mit einer prädeterminierten Frequenz generiert und eine Kurve von einem Koagulations- oder Lyseassay einer Blutprobe erstellt, wobei die Testkarte Folgendes umfasst: Ein nicht poröses Substrat, das eine Oberfläche zum Empfang der Probe definiert; eine elektroaktive Spezies, die zum Kontakt mit der Probe auf dem Substrat positioniert ist; ein initiell auf der Oberfläche immobilisiertes Reagenz zum Kontakt mit der Probe, wobei die Elektroden zum Empfang und Weiterleiten des Signals in die Probe angepasst sind, wobei die Elektroden ein elektrisches Signal generieren, das der Viskosität der Probe entspricht, die mit der Kurve des Koagulations- oder Lyseassays korreliert.
Testkarte nach Anspruch 9, wobei das von den Elektroden generierte elektrische Signal die Leitfähigkeit/Widerstandsfähigkeit der Probe misst.
Testkarte nach Anspruch 9, wobei das von den Elektroden generierte elektrische Signal den Diffusionskoeffizienten der elektrostatischen Spezies misst.
Testkarte nach Anspruch 9, wobei die elektroaktive Spezies aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ferricyanid, Ferrocyanid, Cadmiumchlorid und Methylviologen.
Verfahren zur Bestimmung der Koagulation oder Lyse einer Probe, wobei die Schritte des Verfahrens Folgendes umfassen: Einführen der Probe in einen Probenaufnahmeort auf einem Substrat und Kontaktieren einer elektroaktiven Spezies, die auf dem Substrat mit der Probe positioniert ist; Beschleunigen der Koagulation der Probe durch chemisches Reagieren der Probe mit mindestens einem Reagenz auf dem Substrat zur Herstellung einer nachweisbaren Änderung der Viskosität der Probe, die mit dem Zustand der Koagulation oder der Lyse der Probe korreliert; Messen der Viskosität der Probe und Generieren eines elektrischen Signals, das mit einer Kurve des Koagulations- oder Lyseassays korreliert und Verarbeitung des elektrischen Signals in eine Digitalausgabe, die dem Koagulations- oder Lyseassay unter Verwendung der Assaykalibrationsinformation entspricht.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Verfahren den Schritt der Anzeige der Digitalausgabe einschließt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Messschritt Folgendes einschließt: Generieren eines Signals von prädeterminierter Frequenz; Kontaktieren mehrerer Elektroden mit der Probe; Weiterleiten des Signals von prädeterminierter Frequenz durch die Elektroden in die Probe; und Generieren des elektrischen Signals mit den Elektroden, das der Leitfähigkeit/Widerstandsfähigkeit der Probe entspricht.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Messschritt Folgendes einschließt: Generieren eines Signals von prädeterminierter Frequenz; Kontaktieren mehrerer Elektroden mit der Probe; Weiterleiten des Signals von prädeterminierter Frequenz durch die Elektroden in die Probe; und Generieren des elektrischen Signals mit den Elektroden, das dem Diffusionskoeffizienten der elektroaktiven Spezies entspricht.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Verfahren das Kalibrieren des elektrischen Signals gegen einen Referenzstandard unter Verwendung der gespeicherten Assaykalibrationsinformation zur Bestimmung der Ergebnisse für mindestens einen der Assays, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Prothrombinzeit und aktivierten partiellen Thromboplastinzeit, Thrombozytenaggregation und Fibrinogen, einschließt.