KR20160130989A - 단백질 매트릭스의 단백질가수분해를 검출 및 모니터링하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

피브린 응고와 같은 단백질 매트릭스, 세포외 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스의 단백질가수분해의 검출 및 모니터링을 위한 장치 및 방법이 제공된다. 장치 및 방법은 일반적으로 합성 단백질 매트릭스에서 전기활성 종 또는 엘락토머에 의해 생성되는 확산-제한된 전기화학적 전류의 측정을 수반한다. 장치 및 방법은 다양한 구현예에서 샘플의 단백질가수분해 활성, 및 더욱 구체적으로는 샘플의 섬유소분해 활성 및 콜라게나아제 활성을 검출 및 모니터링하기 위해 적용된다. 장치 및 방법은 일반적으로 심혈관 및 종양학 상태의 모니터링 및 진단에 이용된다.

Description

단백질 매트릭스의 단백질가수분해를 검출 및 모니터링하기 위한 시스템 및 방법 {SYSTEM AND METHOD FOR DETECTING AND MONITORING PROTEOLYSIS OF PROTEIN MATRICES}

본 발명은 일반적으로 전기화학적 시험을 위한 분석 기기 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 단백질성 매트릭스의 단백질가수분해의 전기화학적 검출에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 피브린 응고를 비롯한 단백질성 매트릭스, 세포외 매트릭스 및 유사한 콜라겐 또는 관련 단백질-기반 매트릭스 (내인성이든 합성이든) 의 단백질가수분해의 검출을 위한 신규한 장치 및 방법이 제공된다.

단백질 매트릭스는 무엇보다도, 조직 기능, 조직 재생, 상처 치유 및 지혈을 위해 중요하다. 예를 들어 많은 진핵 세포는 구조적 지지체, 세포 및 조직 정체성, 및 세포에 대한 자가분비, 주변분비 및 인접분비 특성을 제공하는 단백질의 세포외 매트릭스에 의해 피복되고, 따라서 매트릭스는 정상 조직 기능에 필요하다. 상처 치유에서 분자 및 세포 사건의 케스케이드는 처음에, 혈액 손실의 방지인 지혈을 야기한다. 피브린은 복잡한 반응 케스케이드에 의해 가교된 단백질성 매트릭스 (응고) 를 형성하므로, 지혈 및 상처 치유에 중요한 역할을 한다 - 최종 단계가 트롬빈에 의한 단량체성 피브리노겐의 전환으로, 가교된 피브린 중합체 (이것은 종종 응고 (혈전) 으로서 불림) 를 형성함.

이에 더해 지혈 피브린 형성에서의 이의 역할은 다수의 병리학적 및 염증 상태에서 통상적이다. 예를 들어, 피브린 침적 (혈전증) 은 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 사구체신염, 전신성 홍반성 루프스, 심근 경색, 폐색전, 심부 정맥 혈전증, 자가면역 신경병, 육아종 질환, 기생충 감염 및 동종이식 거부와 연관된다. 또한 혈전증이 신경퇴행성 질환에서 역할을 한다는 증거가 있다. 유사하게는, 콜라게나아제는, 이들이 건강한 조직에서의 세포외 매트릭스를 분해해서, 일차 종양 세포가 그들의 일차 환경을 탈출하여 이후에 먼 조직을 침습하여 먼 전이를 형성하도록 하는, 침습성 암에서 중요한 역할을 한다.

흥미롭게도, 단백질 매트릭스 예컨대 세포외 매트릭스 및 피브린 응고는 전형적으로 동적이다, 즉, 매트릭스는 병리학적 과정 또는 정상 생리학적 과정의 일부로서 형성되고 분해될 수 있다. 게다가, 지혈은 플라즈민을 포함하는 효소 또는 응고 인자에 의한 피브린 응고의 형성과 상기 응고 (섬유소분해) 의 단백질가수분해적 분해 사이의 평형의 유지로서 볼 수 있다.

혈전 (트롬비: thrombi) 과 같은 단백질 매트릭스의 형성을 검출 또는 모니터링하기 위한 방법에는 예를 들어 혈액 응고, 예를 들어, 프로트롬빈 시간, 트롬빈 응고 시간의 측정 방법 또는 피브리노겐 시험을 위한 클라우스 (Clauss) 방법이 포함되고, 이동식, 케어-지점 (point-of-care) 형태로 이러한 응고 시험을 수행할 수 있는 시판 장치가 있다. 그러나, 섬유소분해를 검출 또는 모니터링하기 위한 시험은 일반적으로 특정화된 실험실에서의 복잡한 방법론 및 고유의 피브린 응고, 예컨대, 예를 들어 혈전탄성검사 (TEM: thromboelastometry) 에 제한되고, 케어 또는 필드 진단 지점에서 이용가능하지 않다. 대안적인 접근법은 비색 또는 형광 검출 방법론을 사용하는데, 너무 비싸고 복잡하며, 추가로 샘플의 색상 또는 탁도에 의해 부정적으로 영향을 받아, 따라서 섬유소분해의 시기적절하고 민감한 검출 및 모니터링에는 비효과적이다.

그러므로 단백질 매트릭스의 단백질가수분해를 검출 및/또는 모니터링하기 위한 신규하고 개선된 장치 및 방법에 대한 필요성이 존재한다. 특히, 예를 들어, 단백질가수분해 활성 예컨대 섬유소분해 또는 콜라겐, 세포외 매트릭스, 또는 기타 유사한 단백질 매트릭스의 분해를 검출 및 모니터링하는 전기화학적 및 관련된 분석 기술은 의료 및 건강에 대한 가치있는, 진단 및 모니터링 도구를 제공할 수 있다.

따라서 본 발명의 목적은 내인성 또는 합성 단백질 매트릭스의 생리학적으로 및 병리학적으로 관련된 단백질가수분해 활성을 검출 및 모니터링하기 위한 신규한 및 개선된 시스템 및 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 섬유소분해 또는 콜라겐 및 세포외 매트릭스의 분해와 같은 단백질가수분해 활성의 검출 및 모니터링을 가능하게 하는 신규한 및 개선된 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.

하나의 구현예에 따르면, (i) 합성 단백질 매트릭스, (ii) 작업 전극, 및 (iii) 대향 전극을 포함하는, 단백질 매트릭스의 단백질가수분해를 검출 또는 모니터링하기 위한 장치로서, 상기 합성 단백질 매트릭스가 상기 전극 각각의 적어도 일부와 접촉하고 있고, 제 1 및 제 2 전기활성 종이 상기 합성 단백질 매트릭스와 접촉되어 제공되고, 샘플에 노출 시 확산-제한된 전기화학적 전류는 작업 전극에서 상기 제 1 전기활성 종에 의해 발생되며 대향 전류는 대향 전극에서 상기 제 2 전기활성 종에 의해 발생되며, 상기 확산-제한된 전기화학적 전류가 측정되고 상기 측정이 상기 합성 단백질 매트릭스의 단백질가수분해 수준의 지표인 장치가 제공된다.

또다른 구현예에서, 합성 단백질 매트릭스는 피브린 응고, 혈전, 혈소판 풍부 혈장 응고, 젤라틴, 콜라겐 매트릭스 중 하나이고, 매트릭스는 지지체 상에, 그 내에 또는 그 주변에 형성된다. 보다 또다른 구현예에서, 상기 작업 전극은 상기 대향 전극보다 크다. 추가의 구현예에서, 상기 제 1 및 제 2 전기활성 종은 동일한 분자의 반대 산화 상태이다.

특정 구현예에서, 제 1 전기활성 종은 본원에 정의되고 기재된 바와 같은 엘락토머이다. 하나의 구현예에서, 엘락토머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEGs), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리펩티드, 폴리아민, 및 이의 유도체 중 하나이다. 또다른 구현예에서, 제 2 전기활성 종은 소형 분자 전기활성 종이고, 제 2 전기활성 종의 확산도는 엘락토머의 확산도보다 크다. 보다 또다른 구현예에서, 제 1 및 제 2 전기활성 종의 상대 농도는 작업 전극에서의 본질적으로 모든 전류가 제 2 전기활성 종에 의해서가 아니고, 제 1 전기활성 종에 의해서 발생되는 그러한 식으로 결정된다. 추가의 구현예에서, 제 1 전기활성 종은 PEG-Fc (Fc-CO-NH -(CH2CH2O)n-NH-CO-Fc) 이고, 제 2 전기활성 종은 루테늄 (III) 헥사민 (Ru(NH3)63+) 이다.

하나의 구현예에서, 샘플은 혈액, 혈장, 간질액, 기타 체액, 및 공지된 단백질가수분해 활성을 가진 대조군 샘플 중 하나이다.

또다른 구현예에서, 장치는 미리결정된 식 또는 방법론을 사용하여 확산 제한된 전류의 측정을 분석하는데 적응된 데이터 프로세싱 단위를 추가로 포함하여, 단백질 매트릭스의 단백질가수분해의 결과 지표를 생성한다. 보다 또다른 구현예에서, 장치는 확산 제한된 전류의 상기 측정을 출력하는데 적응된 출력 단위를 추가로 포함하고, 결과가 단백질가수분해의 지표이다. 추가의 구현예에서, 상기 데이터 프로세싱 및 출력 단위 중 하나는 모바일 기기 또는 모바일 앱 중의 하나이다.

하나의 구현예에서, 대향 전극은 참고 전극 및 보조 전극을 포함한다.

또다른 구현예에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 샘플의 단백질가수분해 활성을 검출 또는 모니터링하기 위한 방법이 제공된다: (i) 단백질가수분해 활성에 적용되는 합성 단백질 매트릭스를 제공하는 단계, 상기 합성 단백질 매트릭스는 작업 전극 및 대향 전극에 접촉됨, (ii) 상기 합성 단백질 매트릭스에 접촉된 제 1 및 제 2 전기활성 종을 제공하는 단계, (iii) 상기 합성 단백질 매트릭스를 상기 샘플에 노출시키는 단계, 이에 의해 확산-제한된 전기화학적 전류가 작업 전극에서 상기 제 1 전기활성 종에 의해 발생되고, 대향 전류가 대향 전극에서 상기 제 2 전기활성 종에 의해 발생됨, (iv) 상기 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정하는 단계, 상기 측정은 상기 샘플 내의 단백질가수분해 활성의 수준의 지표임.

추가의 구현예에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 샘플의 섬유소분해 활성을 검출 또는 모니터링하기 위한 방법이 제공된다: (i) 합성 피브린 스트립을 제공하는 단계, 상기 스트립은 작업 전극 및 대향 전극이 인쇄되어 있음, (ii) 합성 단백질 매트릭스와 접촉된 엘락토머 및 소형-분자 전기활성 종을 제공하는 단계, (iii) 상기 피브린 스트립을 상기 샘플에 노출하는 단계, 이에 의해 확산-제한된 전기화학적 전류가 작업 전극에서 상기 엘락토머에 의해 발생하고, 대향 전류가 대향 전극에서 상기 소형-분자 전기활성 종에 의해 발생함, (iv) 상기 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정하는 단계, 상기 측정은 상기 샘플 내의 섬유소분해 활성의 수준의 지표임.

또다른 구현예에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 샘플의 콜라게나아제 활성을 검출 또는 모니터링하기 위한 방법이 제공된다: (i) 젤라틴 스트립을 제공하는 단계, 상기 스트립은 작업 전극 및 대향 전극이 인쇄되어 있음, (ii) 단백질 매트릭스와 접촉된 엘락토머 및 소형-분자 전기활성 종을 제공하는 단계, (iii) 상기 젤라틴 스트립을 상기 샘플에 노출하는 단계, 이에 의해, 상기 확산-제한된 전기화학적 전류는 작업 전극에서 상기 엘락토머에 의해 생성되는 반면, 대향 전류는 대향 전극에서 상기 소형-분자 전기활성 종에 의해 생성됨, (iv) 상기 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정하는 단계, 상기 측정은 상기 샘플 내의 콜라게나아제 활성의 수준의 지표임.

더욱 또다른 구현예에 따르면, 샘플로부터의 확산-제한된 전기화학적 전류의 측정은 기준선의 지표이고, 상기 방법이 추가로 제 2 합성 단백질 매트릭스를 제 2 샘플에 노출시키고, 제 2 샘플로부터 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정하는 것을 포함한다. 기준선과 제 2 사이의 차이는 본 구현예에 따른 단백질가수분해 활성에서의 변화의 지표이다.

다양한 구현예에서, 측정은 시간대전류법, 전위 계단 전압전류법, 선형 스위프 전압전류법, 순환 전압전류법, 직사각형파 전압전류법, 계단식 전압전류법, 양극성 또는 음극성 스트리핑 전압전류법, 흡착성 스트리핑 전압전류법, 교류 전압전류법, 회전 전극 전압전류법, 정상 또는 차등 펄스 전압전류법, 및 시간대전하법 중 하나에 기반한다.

또다른 구현예에서, 측정은 교류 또는 다중 직류 펄스 상에서 수행된다. 보다 또다른 구현예에서, 측정은 전기화학 임피던스 분광학에 기반하고, 이에 의해 주파수 영역 내의 변화가 상기 샘플 내의 단백질가수분해 활성의 수준의 지표이다.

도 1 은 본 발명의 하나의 구현예에 따라, (A) 금 전극의 표면의 전자 현미경 사진, 기준 눈금은 20 ㎛ 임; (B) 전극 표면 상에 1xPBS (인산염 식염수: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM 제2인산나트륨, 2 mM 제1인산칼륨 및 7.4 의 pH) 중의 2% 피브린 응고가 있는 금 전극의 표면의 전자 현미경 사진, 기준 눈금은 20 ㎛ 임; (C) 전극 표면 상에 0.1xPBS (13.7 mM NaCl, 0.27 mM KCl, 1 mM 제2인산나트륨, 0.2 mM 제1인산칼륨 및 7.4 의 pH) 중의 2% 피브린 응고가 있는 금 전극의 표면의 전자 현미경 사진, 기준 눈금은 10 ㎛ 임; (D) 다중 전극이 있는 센서 칩의 이미지를 명시한다. 제시되는 것은 인간 피브린 응고를 함유하는 여과지의 배치이다.
도 2 는 또다른 구현예에 따라, (A) 빈 금 전극, 표면 상에 피브린 응고가 있는 금 전극 및 7 분 동안 플라즈민으로의 인큐베이션 후 피브린 응고가 있는 금 전극에 대한 전류 대 시간 그래프; (B) 금 전극, 피브린 응고가 있는 금 전극 및 7 분 동안 플라즈민으로의 인큐베이션 후 피브린 응고가 있는 금 전극의 전류적정 반응을 나열한 표; (C) 금 전극 상에 피브린 응고에 대한 플라즈민의 첨가 후 시간에 걸친 전류의 증가; 및 (D) 2% 피브리노겐 및 1 단위 트롬빈으로 형성된 금 전극 상에 형성된 15 μl 응고에 대한 87nM 플라즈민의 첨가 후 시간에 걸친 전류의 증가를 명시한다.
도 3 은 또다른 구현예에 따라, (A) 3 개의 전극을 포함하는 본 발명의 시스템의 일부로서, 상기 전극은 대략 30 ㎛ 의 공극 크기를 갖는 Whatmann 등급 113 여과지의 5x5mm 스트립에서 형성된 피브린 응고와 접촉된다. (B) 인간 피브린 응고를 함유하고 K3Fe(CN)6 으로 함침된 여과지의 스트립. (C) 피브린 응고 및 K3Fe(CN)6 으로 함침되고 인쇄된 금 전극을 갖는 센서 칩에 부착된 여과지 스트립을 명시한다. 제시되는 것은 측정 기기 (이 경우 정전위) 및 참조 은 와이어 전극에 대한 전기 접점을 위한 프로브 팁이다.
도 4 는 또다른 구현예에 따라, (A) PBS 또는 10mM 페리시아니드 (Fe(CN)6) 를 함유하는 PBS 로의 Whatmann 등급 113 여과지 스트립의 순환 전압전류곡선; (B) 10 mM Fe(CN)6 의 존재 하에서의 Whatmann 등급 113 여과지에서의 0.2% 피브린 응고에 대한 전류 대 시간 그래프 및 10 mM Fe(CN)6 및 플라즈민의 존재 하에서 Whatmann 등급 113 여과지에서의 0.2% 피브린 응고에 대한 전류 대 시간 그래프; (C) 10 mM Fe(CN)6 의 존재 하에서 Whatmann 등급 113 여과지에서의 0.2% 피브린 응고에 대한 전류 대 시간 그래프; (D) 10 mM Fe(CN)6 및 플라즈민의 존재 하에서 Whatmann 등급 113 여과지에서의 0.2% 피브린 응고에 대한 전류 대 시간 그래프를 명시한다.
도 5 는 또다른 구현예에 따라, (A) PBS 또는 50mM 페리시아니드 (Fe(CN)6) 를 함유하는 PBS 로의 Whatmann 등급 113 여과지 스트립의 순환 전압전류곡선; (B) PBS 및 50 mM Fe(CN)6 의 존재 하에서의 Whatmann 등급 113 여과지에 대한 전류 대 시간 그래프; (C) 플라즈민의 존재 및 부재 시 50 mM Fe(CN)6 이 있는 PBS 의 존재 하에서의 Whatmann 등급 113 여과지에서의 2.0% 피브린 응고의 순환 전압전류곡선; (D) PBS 및 50 mM Fe(CN)6 의 존재 및 플라즈민의 존재 및 부재 시의 Whatmann 등급 113 여과지에서의 2.0% 피브린 응고에 대한 전류 대 시간 그래프; (E) 플라즈민의 존재 (청색) 및 부재 (적색) 시 피브린 응고의 순환 전압전류곡선. (스캔 속도 = 0.1V/초); (F) 플라즈민의 존재 (적색) 및 부재 (청색) 시 피브린 응고의 전류 대 시간 (i-t) 반응. (전위 = - 50 mV); (G). 플라즈민의 존재 (청색) 및 부재 (적색) 시 피브린 응고의 선형 스캔 전압전류곡선. (스캔 속도 = 0.1V/초) 을 명시한다.
도 6 은 하나의 구현예에 따라, 단백질성 매트릭스 또는 히드로겔의 공극 내에 및 그것을 가로질러 소형 분자 전기활성 종 (상부) 의 확산과 대조적으로, 단백질성 매트릭스 또는 히드로겔의 공극 내에 및 그것을 가로질러 중합체 전기활성 종 또는 엘락토머 (하부) 의 확산을 명시한다.
도 7 은 또다른 구현예에 따라, 젤라틴 매트릭스/히드로겔을 가로질러 PEG 중합체의 확산의 선형 스위프 전압전류법 (LSV) 스캔을 명시한다.
도 8 은 대안적인 구현예에 따라, 젤라틴 매트릭스/히드로겔을 가로질러 PEG 중합체의 확산의 시간대전류법 (CA) 스캔을 명시한다.

I. 정의

본원에 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 언급되는 다양한 용어는 당업자에 의해 이해되는 이들의 성립된 의미를 가질 것이다. 명확성을 위해, 하기 용어가 본 발명의 목적을 위해 다음과 같이 정의된다.

본 출원에서 사용되는 바와 같은, 단수형 관사에는 문맥 상 명백하게 다르게 표시되지 않는다면 복수형도 포함된다. 예를 들어, 용어 "매트릭스" 또는 "단백질성 매트릭스" 는 또한 복수의 매트릭스 또는 단백질성 매트릭스를 각각 포함한다. 문맥상 다르게 또는 구체적으로 반대로 언급되지 않는 한, 단수형의 정수, 단계 또는 요소로서 본원에 언급된 본 발명의 정수, 단계 또는 요소는 명백하게 언급된 정수, 단계 또는 요소의 단수 및 복수 형태 모두를 포함한다.

"약" 은 참조 측정, 양, 수준, 활성, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 % 만큼 변화하는 측정, 양, 수준, 활성, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "생물학적 샘플" 은 대상으로부터 추출, 미처리, 처리, 희석 또는 농축될 수 있는 샘플을 말한다. 생물학적 샘플은 생물학적 유체 예컨대 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 땀, 복수, 복막액, 관절낭액, 양수, 뇌척수액, 조직 생검, 림프액, 간질액, 등을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액을 포함한다.

뒤따르는 본 명세서 및 청구항 전체에서, 문맥상 다르게 필요하지 않으면, 단어 "~ 를 포함하다", 및 변형 예컨대 "~ 를 포함함" 또는 "~ 를 포함하는" 은, 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 함축하나 임의의 기타 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제는 포함하지 않는 것으로 이해될 것이다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "전기활성 종" 은 산화 또는 환원될 수 있고, 하나 이상의 전자를 이동시킬 수 있는 성분으로서 정의된다. 전기활성 종은 전기화학적 분석에서 시약이고, 단백질성 매트릭스의 단백질가수분해의 간접 측정을 제공한다. 일반적으로, "전기활성 종" 은 물의 전기분해에 필요한 전위 미만의 전위에서 수용액에서 환원 또는 산화되어, 이에 의해 물 전기분해가 상당한 Faradic 전류를 생성하지 않는 조건에서 활성이다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "엘락토머 (elactomer)" 는 전기활성 중합체 또는 중합체 전기활성 종을 의미한다. 엘락토머는 본 발명의 특정 구현예에 따른 전기활성 종이고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEGs), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리아민, 폴리펩티드, 및 이의 적합한 유도체를 포함하는 다양한 전기활성 중합체를 말한다. 소형-분자 전기활성 종과 비교한 엘락토머의 설명은 하기 도 6 에 제시된다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "산화환원 쌍" 은 상이한 산화수 (산화 숫자) 를 갖는 화학 물질의 2 개의 콘쥬게이트 종을 말한다. 높은 산화수를 갖는 종의 환원은 낮은 산화수를 갖는 종을 생성한다. 대안적으로는, 낮은 산화수를 갖는 종의 산화는 높은 산화수를 갖는 종을 생성한다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단백질가수분해" 는 단백질의 보다 작은 폴리펩티드로의 분해, 및 단백질 섬유의 산출되는 분해를 말한다. 분해는 효소적 또는 화학적 메커니즘으로 인한 펩티드 결합의 분할에 의해 발생할 수 있다. 분해는 동종 또는 이종 단백질 사이의 가교연결의 분할에 의해 발생할 수 있다. 단백질가수분해는 단백질의 개별적인 아미노산으로의 분해를 산출할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "전극" 은 그를 통해 전위가 측정될 수 있는 전기 도체를 의미한다. 전극은 또한 전류의 콜렉터 (collector) 및/또는 이미터 (emitter) 일 수 있다. 바람직하게는, 전극은 고체이고 전도성 금속을 포함한다. 바람직한 전도성 금속에는 합금, 예컨대 인듐 주석 옥시드, 전도성 탄소, 또는 귀금속 예컨대 금, 은, 팔라듐 또는 백금이 포함된다. 전극은 또한 와이어 또는 마이크로와이어일 수 있고, 또는 용어 "전극" 은 와이어 또는 마이크로와이어의 집합을 설명할 수 있다.

II. 다양한 구현예의 성분 및 양상

1. 단백질성 매트릭스

본 발명의 단백질성 매트릭스는 당업계에 공지된 임의의 단백질 매트릭스일 수 있다. 용어 "단백질성 매트릭스" 및 "단백질 매트릭스" 는 본원에서 사용되는 바와 같이 상호교환적이다. 다양한 구현예에 따르면, 단백질 매트릭스는 자연적으로 예컨대 세포외 매트릭스로 존재할 수 있고 또는 자연적으로, 예컨대 혈액의 응고 또는 피브리노겐에 대한 트롬빈의 작용에 의해 형성될 수 있다. 일부 구현예에서 합성 단백질성 매트릭스가 시험관 내에서 형성된다. 일부 구현예에서 단백질성 매트릭스는 매트릭스를 자발적으로 형성하는 하나 이상의 단백질로부터 형성된다. 일부 구현예에서 단백질성 매트릭스는 단백질과 하나 이상의 폴리음이온 및/또는 가교제와의 반응에 의해 형성된다. 일부 구현예에서 단백질성 매트릭스는 피브리노겐을 트롬빈과 접촉시킴으로써 형성되는 피브린 매트릭스이다. 다른 구현예에서, 단백질성 매트릭스는 콜라겐 매트릭스 (예를 들어, 유형 I 콜라겐 분자의 고유의 또는 재구성된 집합) 이다.

생물학적 유체는 특정 작용제와 반응하여 단백질 매트릭스를 형성할 수 있다. 생물학적 유체는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 눈물, 타액, 젖, 점액, 가래, 복강 유체일 수 있다. 대안적으로는, 이러한 유체는 합성적으로 제조된 조성물, 예를 들어, 조직 배양 매질, 단백질, 합성 중합체, 단백질에서 발견되는 작용기, 예컨대 아민, 술프히드릴, 카르복실 또는 히드록실을 가진 중합체, 아민-말단 폴리에틸렌 글리콜, 아민-말단 폴리에테르를 함유하는 조직 배양 매질, 또는 이의 혼합물일 수 있다. 단백질 매트릭스의 제조에 사용하는데 적합한 단백질의 비-제한적인 예에는 피브리노겐, 피브린, 콜라겐, 피브로넥틴, 및 라미닌이 포함된다. 이러한 매트릭스의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.

일부 구현예에서 단백질성 매트릭스는 비-단백질 성분, 예컨대 세포, 지질, 탄수화물, 당, 염 등을 포함한다.

단백질성 매트릭스는 일반적으로 전기활성 종의 확산을 상당히 억제한다. 물리적 관점으로부터, 단백질성 매트릭스 내의 단백질 섬유는 상호작용하여 매우 높은 역학 점도 (예를 들어, >2 Pas) 를 가진 다공성 점탄성 물질을 형성한다. Einstein-Stokes 방정식으로부터, 확산 상수, D 는 하기에 의해 제시된다:

(식 중,

는 역학 점도임). 매트릭스 내의 단백질 섬유가 단백질분해로 분해되는 경우, 매트릭스의 다공성이 증가하고, 점도가 감소하고, 확산 상수가 증가한다.

단백질성 매트릭스는 기계적 또는 물리적 처리에 적용될 수 있다. 기계적 처리는 압착 또는 압출을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 단백질성 매트릭스는 산화 또는 환원되어 하전된 종을 형성할 수 있는 전기활성 종을 포함한다. 전기활성 종의 비-제한적인 예에는 페리시아니드, 페로시아니드, 데카메틸페로센 (DMFc), 1,1'-디메틸페로센 (DiMFc) 및 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄 (TCNQ), 페로센 카르복실산, 루테늄 헥사민이 포함된다.

특정 구현예에서, 단백질성 매트릭스는 탈수에 적용된다. 상기 구현예에서, 단백질성 매트릭스는 시험 하에서 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플) 과 접촉되는 경우 적합하게 재수화된다. 탈수는 산소-함유 분위기 (예를 들어, 공기), 또는 비활성 분위기, 예컨대 질소 분위기에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 탈수는 동결건조 (즉, 얼리고 건조시킴), 열 탈수 (예를 들어, 주위 온도에서), 삼투, 여과 및 원심분리로부터 선택된다. 탈수 후, 단백질성 매트릭스는 바람직하게는 낮은 습기 함량, 예를 들어 약 7.5% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만의 습기 함량을 갖는다.

일부 구현예에서, 단백질성 매트릭스는 피브린 응고, PRP 응고 또는 혈전이고, 샘플 내의 단백질가수분해 활성은 적어도 일부분 플라즈민에 의해 제공된다. 다른 구현예에서, 단백질성 매트릭스는 콜라겐이고, 샘플 내의 단백질가수분해 활성은 적어도 일부분 하나 이상의 콜라게나아제 (예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMPs) 예컨대 MMP-1, MMP-8, MMP-13, MMP-18 등) 에 의해 제공된다.

단백질성 매트릭스는 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 스크린 인쇄, 또는 잉크-젯 프린트잉크, 또는 로봇 파이펫팅에 의해 전극 (예를 들어, 작업 전극) 에 부착되거나 그 위에 형성될 수 있다.

2. 단백질성 매트릭스 지지체

다양한 구현예에서 또한 단백질성 매트릭스와 관련된 그리고 이에 대한 지지체를 제공한다. 지지체는 다공성 지지체일 수 있다. 지지체의 공극이 지지체의 부피를 통해 실질적으로 상호연결 및/또는 확장될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 다른 구현예에서, 공극은 지지체의 부피를 통해 실질적으로 비연결되고 확장될 수 있다. 바람직하게는 단백질성 매트릭스의 적어도 일부는 공극 내에 함유된다. 다공성 지지체의 예증적 예에는 종이 예컨대 흡착제, 여과지, 여과지 멤브레인, 소결 유리, 폴리(비닐리덴 플루오라이드) 멤브레인, 및 젤이 포함된다. 본 발명의 단백질성 매트릭스-함유 고체 지지체는 이들이 상호 또는 내부-어세이 신뢰성 및 일관성을 적합하게 개선하는, 고체 지지체 및 단백질성 매트릭스 중 하나, 및 바람직하게는 둘다의 공극 크기 및 공극 부피에서의 더 큰 일관성으로 대량으로 제조될 수 있으므로 특히 유리하다.

특정 구현예에서, 고체 지지체는 다공성이다. 예증적 다공성 고체 지지체는 단백질성 매트릭스의 공극 직경보다 실질적으로 큰 직경의 공극을 포함하는 구조를 갖는다. 예를 들어, 공극은 적어도 약 5.0 ㎛, 적어도 약 10.0 ㎛ 이고, 공극이 클수록 전기활성 종의 확산에 대해 덜 제한적이므로 적합하게는 20 ㎛ 이상이다.

일부 구현예에서, 고체 지지체는 산화 또는 환원되어 하전된 종 (예를 들어, 페리시아니드, 페로시아니드, 데카메틸페로센 (DMFc), 1,1'-디메틸페로센 (DiMFc), 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄 (TCNQ) 페로센 카르복실산, 루테늄 헥사민 등) 을 형성할 수 있는 전기활성 종을 추가로 포함한다.

단백질성 매트릭스-함유 고체 지지체는 기계적 또는 물리적 처리에 적용될 수 있다. 기계적 처리는 압착 또는 압출을 포함할 수 있다. 대표적인 물리적 처리는 탈수 (예를 들어, 동결건조, 열 탈수 등) 및 방사 (예를 들어, 빛) 를 포함한다. 기계적 또는 물리적 처리는 적합하게는 살균 상태 하에서 실시된다.

특정 구현예에서, 고체 지지체는 탈수에 적용되어, 이에 의해 실질적으로 탈수된 형태인 고체 지지체를 산출한다. 상기 구현예에서, 고체 지지체는 시험 하에서 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플) 과 접촉되는 경우 적합하게 재수화된다. 탈수는 산소-함유 분위기 (예를 들어, 공기), 또는 비활성 분위기, 예컨대 질소 분위기에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 탈수는 동결건조 (즉, 얼리고 건조시킴), 열 탈수 (예를 들어, 주위 온도에서), 삼투, 여과 및 원심분리로부터 선택된다. 탈수 후, 고체 지지체는 바람직하게는 낮은 습기 함량, 예를 들어 약 7.5% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.5% 미만의 습기 함량을 갖는다. 고체 지지체의 탈수는 분해를 감소시키고 단백질성 매트릭스의 유통기한을 개선시키는 것을 포함하여 여러 장점을 갖는다. 이것은 또한 모세관 흐름 또는 그것을 통한 샘플의 '빨아들여짐' 을 통한 추정적인 프로테아제-함유 샘플을 단백질성과 더욱 양호하고 더욱 효과적인 접촉을 허용한다.

일부 구현예에서, 고체 지지체는 접착제 또는 열 결합으로의 접착과 같은 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용하여 전극 (예를 들어, 작업 전극) 에 부착된다.

3. 합성 피브린 응고

특정 구현예에서 본원에 기재된 방법, 시스템 및 키트에 적용되는 단백질성 매트릭스로서의 합성 피브린 응고를 제공한다. 하나의 구현예에 따르면, 피브린 응고 또는 "메쉬" 는 하기를 포함하는, 방법에 의해 제조된다:

(a) 피브리노겐-함유 재료를 포함하는 제 1 구성성분을 제공하는 단계;

(b) 피브리노겐을 피브린 응고로 전환시키는 성분을 포함하는 제 2 구성성분을 제공하는 단계;

(c) 제 1 구성성분과 제 2 구성성분의 조합 및 혼합에 의해 피브린 응고-함유 재료를 형성하는 단계; 및 (d) 피브린 응고-함유 재료를 전극의 적어도 일부와 접촉시키는 단계.

제 1 구성성분은 적합하게는, 적어도 약 2 mg/mL, 적어도 약 5 mg/mL, 또는 적어도 약 10 mg/mL 피브리노겐, 바람직하게는 적어도 약 15 mg/mL, 예를 들어 약 20 mg/mL 내지 약 250 mg/mL 또는 약 20 mg/mL 내지 약 150 mg/mL 피브리노겐을 포함하는 피브리노겐-함유 용액을 포함한다.

제 2 구성성분은 적합하게는, 트롬빈을 포함하는 용액을 포함한다. 트롬빈-포함 용액의 부피는 제 1 구성성분과 접촉하여, 약 1000 IU/mL 미만, 약 200 IU/mL 미만, 약 100 IU/mL 미만, 약 50 IU/mL 미만, 약 20 미만, 약 10 IU/mL 미만 또는 약 1 IU /mL 미만의 최종 트롬빈 농도/활성을 제공한다. 트롬빈은 활성 또는 비활성 형태일 수 있으며, 트롬빈이 비활성 형태 (예를 들어, 예를 들어 방사 또는 빛 (=광활성가능 트롬빈) 에 의해 활성화될 수 있는 트롬빈) 인 경우, 일반적으로 활성 형태로의 트롬빈보다 트롬빈의 샘플을 응고시키는 데 다량을 필요로 한다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 트롬빈은 재조합 또는 합성 또는 천연 기원, 즉, 인간 또는 동물 혈장으로부터 유래될 수 있다.

합성 피브린 응고는 일부 구현예에서 전기활성 종 (예를 들어, K₃Fe(CN)₆) 의 확산을 실질적으로 억제하는 공극 직경을 갖는다. 비-제한적인 예에서, 피브린 응고의 공극 직경은 약 100 나노미터 (nm) 미만, 약 5.0 nm 미만, 약 2.0 nm 미만이고, 적합하게는 1.0 nm 이하이다.

피브린 응고-함유 재료는 그 범주 내에 '노출된 (naked)' 피브린 응고 뿐 아니라 다공성 고체 지지체에 함유된 또는 다르게는 이와 관련된 것을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 허용가능한 지지체는 매우 다양할 수 있고, 합성 또는 천연, 유기 또는 무기, 유연성 또는 비유연성일 수 있다. 대표적인 지지체에는 중합체 지지체, 예컨대 직포 (woven) 및 부직포 웹 (nonwoven web) (예를 들어, 섬유성 웹), 마이크로공극 섬유 및 마이크로공극 멤브레인 뿐 아니라 미립자 또는 비이드 지지체가 포함된다. 직포 및 부직포 웹은 표면의 규칙적 또는 불규칙적 물리적 배열을 가질 수 있다.

예증적 다공성 고체 지지체는 피브린 응고의 공극 직경보다 큰 직경의 공극을 포함하는 구조를 갖는다. 예를 들어, 공극 직경은 적어도 약 1.0 마이크로미터 (㎛), 적어도 약 5.0 ㎛, 적어도 약 10.0 ㎛ 이고, 공극이 클수록 전기활성 종의 확산에 대해 덜 제한적이므로 적합하게는 20 ㎛ 이상이다. 다공성 지지체의 비-제한적 예에는 여과지, 소결 유리, 폴리(비닐리덴 플루오라이드) 멤브레인, 미립자 또는 비이드 지지체 예컨대 아가로오스, 친수성 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 광물 옥시드 및 세파로오스 (Sepharose) 가 포함된다.

적합하게는, 피브린 응고-함유 재료 (예를 들어, 노출된 또는 다공성 고체 지지체에 함유된 또는 이와 관련된) 는 기계적 또는 물리적 처리에 적용된다. 기계적 처리는 압착 또는 압출을 포함할 수 있다. 대표적인 물리적 처리는 탈수 (예를 들어, 동결건조 (lyophilisation), 열 탈수 등) 및 방사 (예를 들어, 빛) 를 포함한다. 기계적 또는 물리적 처리는 적합하게는 살균 상태 하에서 실시된다.

특정 구현예에서, 피브린 응고-함유 재료는 산화 또는 환원되어 하전된 종 (예를 들어, 페리시아니드, 페로시아니드, 데카메틸페로센 (DMFc), 1,1'-디메틸페로센 (DiMFc), 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄 (TCNQ) 등) 을 형성할 수 있는 전기활성 종을 포함한다.

특정 구현예에서, 피브린 응고-함유 재료는 탈수에 적용된다. 상기 구현예에서, 피브린 응고-함유 재료는 시험 하에서 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플) 과 접촉되는 경우 적합하게 재수화된다. 탈수는 산소-함유 분위기 (예를 들어, 공기), 또는 비활성 분위기, 예컨대 질소 분위기에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 탈수는 동결건조 (즉, 얼리고 건조시킴), 열 탈수 (예를 들어, 주위 온도에서), 삼투, 여과 및 원심분리로부터 선택된다. 탈수 후, 피브린 응고-함유 재료는 적합하게는 낮은 습기 함량, 예를 들어 약 7.5% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.5% 미만의 습기 함량을 갖는다. 특정 구현예에서, 피브린 응고-함유 재료는 동결건조에 적용되어, 피브린 응고를 포함하는 건조된 또는 실질적으로 건조된 다공성 지지체를 제공하도록 한다.

피브린 응고-함유 재료 (예를 들어, 노출된 또는 다공성 고체 지지체에 함유된 또는 이와 관련된) 는 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용하여 전극에 부착된다.

4. 단백질 매트릭스의 단백질가수분해의 검출

특정 구현예에 따르면, 단백질 매트릭스의 단백질가수분해는 전압전류법을 포함하는 전기화학적 방법에 의해 검출된다. 전압전류법은 전기분해의 메커니즘을 조사하기 위해 전형적으로 사용되는 기술이나 본원에 기재된 바와 같이, 특히 단백질가수분해에 반응하여, 단백질성 매트릭스의 단백질가수분해를 검출 또는 모니터링하는데도 사용된다. 다양한 형태의 전압전류법이 검출에 사용될 수 있다; 이들 형태에는 직사각형파 전압전류법, 계단식 전압전류법, 양극성 또는 음극성 스트리핑 전압전류법, 흡착성 스트리핑 전압전류법, 교류 전압전류법, 회전 전극 전압전류법, 정상 또는 차등 펄스 전압전류법, 시간대전류법, 시간대전하법, 또는 전류 대 시간이 포함된다. 본 발명의 방법 및 시스템의 예시적 구현예에서, 전위 계단 전압전류법, 선형 스위프 전압전류법 및 순환 전압전류법이 이용된다. 피크 전류, 또는 정상 상태 전류, 또는 이동된 총 전하가 측정 변수로서 사용될 수 있다.

상기 유형의 전압전류법 각각에서 전압 또는 일련의 전압을 작업 전극으로서 공지된 전극에 적용하고, 흐르는 상응하는 전류를 모니터링한다. 전형적으로 작업 전극은 전기활성 종, 예를 들어 페리시아니드 (Fe(CN)₆ ^3-) 와 접촉하고, 전위가 전기활성 종에 대한 그리고 그로부터의 전하의 수송을 용이하게 하여, 그에 의해 전류를 발생시키도록 적용된다. 제 2 전극은 전해조의 다른 절반으로서 작용한다. 제 2 전극의 역할은 전자를 공급 또는 감극하여, 이에 의해 용액 내의 전기적중성을 유지하도록 하는 것이다. 공지된 표준에 대해, 작업 전극에서의 전위의 정확한 추정이 요구되는 경우, 제 2 전극은 2 개의 별도의 전극, 참고 전극 및 보조 전극으로 나뉠 수 있다. 참고 전극은 공지된 환원 전위를 가지며 작업 전극의 전위를 측정하고 통제하는데 참고로서 작용하고 전류를 통과하지 않는 반전지 (half-cell) 이다. 보조 전극은 작업 전극에서 관찰되는 전류의 균형을 유지하는데 필요한 전류를 통과한다.

따라서 전압전류법에 의한 전기분해 측정에 필요한 요소는 적어도 2 개의 전극, 용매, 배경 전해질 및 전기활성 종이다. 2 개의 전극은 전형적으로 전해질 및 전기활성 종을 포함하는 용매와 접촉한다.

특정 구현예에서 단백질 매트릭스는 전극에 대한 또는 그로부터의 전하를 이동시키는 작업 전극에 대한 전기활성 종의 이동성 또는 확산이 손상되거나 방해되는 식으로 작업 전극의 적어도 일부와 접촉하거나 그 위에 존재한다. 다른 구현예에서, 단백질 매트릭스는 제 2 전극의 적어도 일부 상에 존재하고, 작업 전극에 의해 첨가되거나 제거되는 전하의 균형을 유지하는 그의 능력이 손상되거나 방해된다. 추가의 구현예에서 단백질 매트릭스는 작업 및 제 2 전극의 적어도 일부 상에 존재한다. 상기 구현예에서, 전위의 적용 시 측정되는 전류는 단백질 매트릭스의 부재와 비교하여 변경된다. 따라서, 단백질 매트릭스를, 예를 들어 단백질가수분해 작용제 또는 이러한 작용제를 추정적으로 함유하는 샘플을 용매에 또는 단백질 매트릭스에 직접 첨가함으로써, 단백질가수분해 작용제와 접촉시키는 경우, 단백질 매트릭스의 분해가 일어난다. 단백질 매트릭스가 단백질가수분해되므로, 전위의 적용시 측정되는 전류는 또한 변화하고, 이에 의해 단백질 매트릭스의 분해의 정성적 및/또는 정량적 검출 및/또는 모니터링을 허용한다.

배경 전해질은 전기화학적으로 비활성인 염 예컨대 염화나트륨의 수용액이다. 일부 구현예에서, 생리학적 유체 (0.9% 염화나트륨) 가 배경 전해질로서 사용될 수 있다. 전기활성 종은 전형적으로 저 농도 (0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 또는 0.1M) 로 존재한다. 전기활성 종은 예를 들어 페리시아니드 (Fe(CN)₆ ^3-) 일 수 있다.

전기활성 종은 산화 또는 환원되어 하전된 종을 형성할 수 있다. 즉, 전기활성 종은 산화환원 쌍을 형성한다, 예를 들어 페리시아니드가 전기활성 종인 경우 페리시아니드 (Fe(CN)₆ ^3-)/페로시아니드 (Fe(CN)₆ ^4-) 산화환원 쌍을 형성한다. 전기활성 종은 전위의 적용 시 작업 전극에서 산화 또는 감소될 수 있어, 작업 전극에서 전기화학적 전류를 야기한다. 일부 구현예에서 전기활성 종은 가역적인 산화 또는 환원을 겪는다. 전기활성 종은 바람직하게는 화학적으로 안정하다.

하나의 구현예에 따르면, 전위 계단 전압전류법은 적용된 전압이 하나의 값 (V₁) 에서 다른 값 (V₂) 으로 스위치되거나 단계식으로 바뀔때 적용된다. 산출되는 전류는 이후 함수 시간으로서 측정된다. 예를 들어, 반응물로서 페리시아니드를 사용하면, 전압 범위는 전형적으로, (Fe(CN)₆ ^3-) 의 환원이 열역학적으로 적합하지 않은 V1 에서 설정된다. 제 2 전압 (V₂) 은 전형적으로 전극 표면과 가까운 임의의 Fe(CN)₆ ^3- 이 생성물 (Fe(CN)₆ ^4-) 로 환원된다.

전위 계단 전압전류법에서 전류는 전압의 스위치 (단계) 직후 상승한 다음 시간이 경과하면 감소한다. 이것은 전압 단계 전에 전해질 용액 내의 전기활성 종과 접촉하고 있는 전극이 일정한 조성을 갖고 있기 때문에 일어나며 그러나, 일단 전압 단계가 일어나면 전기활성 종 (예를 들어, Fe(CN)₆ ^3-) 이 생성물 (예를 들어, Fe(CN)₆ ^4-) 로 전환되고, 전류가 흐른다. 반응을 지속하기 위해서는 추가의 전기활성 종 (예를 들어, Fe(CN)₆ ^3-) 이 전극에 접근해야만 한다. 이것은 전형적으로 전기활성 종의 농도 구배에 따른 확산에 의해 용액 내에서 일어난다. 그래서 추가의 전기활성 종의 표면에 대한 공급, 및 따라서 전류의 흐름은 전기활성 종의 확산적 유동에 따라 다르다.

전기분해가 지속되면서 전기활성 종이 전극으로부터 더 멀리 확산되고, 그러므로 농도 구배가 떨어지고, 따라서 전극 표면에 대한 전기활성 종의 공급도 또한 떨어지고, 그 결과 전류가 감소한다.

전류는 하기 식을 사용하여 계산될 수 있다:

(식 중, i 는 전류이고, n 은 반응에서 이동되는 전자의 몰 수이고, F 는 파패러데이 상수 (Faraday's constant) (96,484 C mol^-1) 이고, A 는 전극 면적이고, k _red 는 전자 이동에 대한 속도 상수이고, c^bulk 는 전기활성 종의 총 농도이고, t 는 시간이고, D 는 전기활성 종의 확산 계수임)

전류는 환원된 및 산화된 종의 조합된 농도인 전기활성 종의 벌크 농도와 관련이 있다. 단계 전압전류법은 따라서 전기활성 종의 확산 계수의 추정을 허용한다. 따라서, 전기활성 종의 확산이 단백질성 매트릭스의 존재에 의해 영향을 받는 구현예에서, 예를 들어 단백질성 매트릭스의 단백질가수분해로 인한 확산 계수의 변화의 추정이 단백질성 매트릭스의 단백질가수분해를 검출 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다.

또다른 구현예에 따르면, 선형 스위프 전압전류법 (LSV) 은 전압이 하한 (V₁) 으로부터 상한 (V₂) 으로 스캔될지라도, 고정된 전위 범위가 적용되는 곳에서 이용된다. 선형 스위프 전압전류곡선의 특징은 전자 이동 반응(들) 의 속도, 전기활성 종의 화학적 반응성 및 전압 스캔 속도를 포함하는 다수의 인자에 따라 다르다.

LSV 에서 전압이 좀더 환원적인 값으로 스위프되므로 전류가 흐르기 시작하고 결국에는 강하 전 피크에 도달한다. 전극 표면에서 전자 이동 속도는 전압 스위프 (sweep) 속도와 비교하여 빠르고 전극 표면에서 평형은 열역학에 의해 예상되는 것과 실질적으로 동일하게 성립된다. 전압이 처음에 V₁ 로부터 스위프되므로, 표면에서의 평형이 변경되기 시작하고 전류가 흐르기 시작한다. 평형이 옮겨지고 더 많은 전기활성 종이 환원되면서 전압이 그의 초기 값으로부터 추가로 스위프되므로 전류는 상승한다. 전류에서 피크는 확산 층이 전극 위로 충분히 성장하는 경우 발생하여, 전극에 대한 전기활성 종의 유동은 전류가 하강하기 시작하는 경우 Nernst 방정식에 의해 요구되는 것을 만족하는데 충분할만큼 빠르지 않다. Nernst 방정식은 하기와 같이, 전기화학적 전지 (cell) 의 전압과 전지의 구성성분 중 하나의 농도 사이의 관계식을 설명한다.

(식 중, E_cell 은 하나의 전극에 대한 적용 후 전지 전위이고, E⁰ _cell 은 전위를 적용하기 전 전지 전위이고, R 은 기체 상수 (8.31 (부피-콜룸)/(mol-K) 이고, T 는 온도 (K) 이고, n 은 전기화학적 반응에서 교환된 전자의 몰 수 (mol) 이고, F 는 패러데이 상수 (96,484 C mol^-1) 이고, Q 는 반응 몫임 (평형 농도보다는 초기 농도로의 평형 표현)).

전극 표면 위의 확산 층의 크기는 사용되는 전압 스캔 속도에 따라 다를 것이다. 저속 전압 스캔에서 확산 층은 고속 스캔과 비교하여 전극으로부터 훨씬 멀리 성장할 것이다. 따라서 전극 표면에 대한 유동은 그것이 빠른 속도로 있을 때보다 저속 스캔 속도에서 상당히 더 적다. 전류는 전극에 대항하는 유동에 비례하므로, 전류의 규모는 저속 스캔 속도에서는 더 낮고 고속 속도에서는 더 높을 것이다.

용어 "선형 스캔" 은 전압이 고정된 스캔 속도에서 단일한 "정" 방향으로 변하는, 예컨대 Ag/AgCl 에 대항하여 -0.7 V 에서 +0.7 V 로, 1.4 V 스캔 범위를 제공하는 스캔으로서 정의된다. 선형 스캔은 전위의 일련의 점진적인 변화에 의해 근사값을 계산할 수 있다. 증분이 시간과 함께 매우 가깝게 발생하는 경우, 이들은 연속 선형 스캔에 상응한다. 따라서, 선형 변화에 근사하는 전위의 변화를 적용하는 것은 선형 스캔으로 고려할 수 있다.

선형 스캔 동안 작업 전극에서의 전류는 작업 전극에서의 전위가 일정한 속도로 시간에 따라 선형으로 변하면서 측정된다. 스캔 범위, 예컨대 약 -0.5 V 내지 약 +0.5 V, 약 -1.0 V 내지 +1.0 V 는 전형적으로 전기활성 종의 산화환원 쌍의 환원된 및 산화된 상태를 포괄하여, 하나의 상태의 (예를 들어, 환원된) 또다른 상태 (예를 들어, 산화된) 로의 전이가 발생하도록 한다.

특정 구현예에서 전압은 약 10mV/초 미만, 또는 약 50 mV/초 미만, 또는 약 100 mV/초 미만, 또는 약 150 mV/초 미만, 또는 약 200 mV/초 미만, 또는 약 500 mV/초 미만, 또는 약 1000 mV/초 미만, 또는 약 2000 mV/초 미만의 속도에서 변한다.

추가의 구현예에 따르면, 순환 전압전류법 (CV) 이 이용된다. CV 는 전압이 고정된 속도로의 2 값 사이에 순환 방식으로 스위프 또는 스캔 (순환 스캔) 됨에도 불구하고 LSV 와 매우 유사하나, 이제 전압이 V₂ 에 도달하면 스캔은 반전되어 전압이 V₁ 로 다시 스위프된다. 정방향 스위프는 전기활성 종이 환원되면서 LSV 실험에서 보는 것과 동일한 반응을 산출한다. 스캔이 반전되는 경우, 환원된 전기활성 종이 산화되고 전류 흐름이 반전된다.

용어 "순환 스캔" 은 스캔 범위가 산화환원 쌍의 산화 및 환원 피크를 포함하는 선형 정방향 스캔 및 선형 역방향 스캔의 조합을 말한다. 예를 들어, 약 -1.0 V 내지 약 +1.0 V 및 다시 약 -1.0 V 로의 순환 방식으로의 전위의 변화는 산화 및 환원 피크 둘다가 스캔 범위에 포함되는, 페리시아니드/페로시아니드 산화환원 쌍에 대한 순환 스캔의 예이다.

5. 중합체 전기활성 종 (엘락토머)

일반적으로 단백질 매트릭스는 단상성 점탄성 시스템으로서 볼 수 있다. 그러나, 특정 구현예에 따른 일부 단백질 매트릭스는 제 2 상으로서의 액체 내에 침지된, 제 1 상으로서의 중합체 백본을 포함하는 이상성 시스템으로 고려된다. 제 1 상 중합체 백본은 강성 또는 탄성일 수 있고, 제 2 상 액체는 물 또는 기타 적합한 용매일 수 있다. 이러한 매트릭스는 또한 특정 구현예에 따르고 관련 업계와 일치하는 히드로겔로서 언급된다.

히드로겔을 통한 전기활성 종의 확산은 전체로서의 시스템의 역학 점도를 통해 쉽게 모델링될 수 없는 복잡한 과정이다. 이러한 다공성 히드로겔에서 확산 계수 (D) 에 영향을 주는 인자는 다공성 (히드로겔을 차지하는 용매의 분획, 이것은 얼마나 많은 공간이 확산에 이용가능한지에 대한 측정임), 수축성 (공극 벽과의 상호작용으로 인해, 용매가 공극 내에 얼마나 빽빽하게 정렬되어 있는지에 대한 측정), 비틀림 (얼마나 많은 공극 기하학이 확산에 영향을 주는지에 대한 측정), 및 매트릭스와의 상호활성 (스캐폴드와의 얼마나 약한 결합 및 Van der Walls 상호작용이 D 에 영향을 주는지에 대한 측정) 이다.

예를 들어, (i) 히드로겔이 매우 높은 다공성을 갖는 경우, (ii) 전기활성 종이 단백질 분자와 상호작용하지 않거나 또는 약한 결합을 형성하지 않는 경우, (ii) 공극 내의 물이 자유 용액에서와 동일한 정도의 정렬을 갖는 경우, 및 (iv) 공극 비틀림이 낮은 경우에는, 전기활성 종은 용매 그 자체 내에서 확산과 매우 가까운 확산 계수를 갖는 공극 시스템을 통해 확산될 것이다.

하나의 구현예에서, 본 명세서에서 엘락토머 (elactomer) 라고 언급되는 새로운 전기활성 종이 제공된다. 엘락토머는 특정 구현예에 따라 높은 감수성을 가진 히드로겔 다공성을 측정하는데 사용될 수 있는, 중합체 그 자체이다. 이러한 측정은 제한 없이, 시간대전류법 및 선형-스캔 전압전류법을 비롯한, 전기화학적 기법으로 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정함으로써 수행된다. 단백질 매트릭스가 단백질가수분해적으로 분해되는 상황에서는, 단백질가수분해의 함수로서 매트릭스 다공성이 증가하고, 엘락토머는 특정 구현예에 따라 단백질가수분해를 측정하는데 사용될 수 있다.

중합체 전기활성 종 또는 엘락토머의 확산은 엘락토머의 중합체 스케폴드와의 연루, 엔트로피 공극 구속 효과, 및/또는 입체 장애 효과로 인해, 소형-분자 또는 이온 전기활성 종의 확산보다 히드로겔 다공성에 대해 더욱 민감하다.

하나의 구현예에서, 엘락토머는 페로센-유도 폴리에틸렌 글리콜 (PEGs) 을 포함한다. 페로센 및 그의 유도체는 성립된 유기 화학 방법에 기반하여, 더 큰 분자의 유도체화에 사용될 수 있는, 전기활성 유기 화합물이다. 예를 들어, 페로세노일 클로라이드 - 페로센-카르복실산의 아실 클로라이드 - 는 일차 아민에 고도로 반응성이며, 일차 아민을 가진 큰 분자를 효과적으로 유도체화하는데 사용될 수 있다.

페로센 그 자체는, 고도로 소수성이며, 수용액에서의 그 자체에 의해 쉽게 가용성이 아닐 것이다. 대조적으로, PEG 는 고도로 친수성인 중합체이며, 이것은 생물학적 적용에 매우 상용성이고, 단백질 변성 또는 응집을 야기하지 않으면서 단백질성 매트릭스 내로 잘 혼합될 것이다.

하나의 구현예에 따르면, 분자량을 가진 동종이작용성 (homobifunctional) 아미노 PEG 는 페로세노일-클로라이드와 두 아미노기에서 개질될 수 있고, 산출되는 생성물은 IR-분광학에 의해 확인될 수 있다. 말단에 일차 아미노기를 갖는 동종이작용성 PEG 를 사용하는 장점은 산출되는 분자가 여전히 고도로 친수성이고 수용액에 쉽게 용해된다는 점이다. 페로센이 중합체에 내부 단량체성 기 상에 펜턴트 잔기로서 첨가될 수 있는 대안적인 접근법은, 고도로 유도체화된 소수성 분자를 산출할 것이다.

또다른 구현예에서, 엘락토머는 유사하게는 폴리비닐 알코올 (PVAs), 폴리비닐 피롤리돈 (PVPs), 폴리아크릴레이트, 폴리사카라이드 예컨대 덱스트란, 폴리아민, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는, 기타 수용성 거대분자로부터 유도될 수 있다.

6. 전기활성 종의 조성

특정 구현예에서 시간대전류법 측정이 기타 전압전류법 측정과 같이, 본 발명의 방법 및 시스템에서 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 시간대전류법 측정은 특정 시점에서 전기화학적 전류가 측정되는 의료 진단, 예를 들어 글루코오스 수준 측정에서 사용된다. 단순함 및 저 비용에 대해, 종종 상기 측정은 참고 전극 없이 2 개의-전극 전지에서 행해진다. 이러한 설정에서, 전위는 2 개의 전극을 걸쳐 적용되고, 전류는 작업 전극에서 측정된다. 전기적중성을 유지하기 위해, 따라서, 필적하는 (equal-in) 규모-전류가 다른 (대향) 전극에 공급될 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 매트릭스 다공성 및 이의 점도 뿐 아니라 단백질가수분해적 분해를 측정하기 위해 단백질 매트릭스 내의 확산-제한된 전류를 측정하기 위해서 본원에 논의된 바와 같은 다른 기법 중에서 시간대전류법을 사용하는 경우, 충분한 수준의 전류가 대향 전극 (CE) 에 공급되고, 시스템을 통한 전체적인 전류가 대향-전극에 제약되지 않는 식으로, 작업 전극 (WE) 에 제공되는 전류가 확산-제한된다. 특정 구현예에서, WE 는 CE 보다 상당히 커서, 더 강한 신호가 측정되도록 하기 위해 더 큰 WE 면적이 샘플 (즉, 혈액 또는 간질액) 에 노출되도록 한다. Cottrell 방정식에 근거하여, 더 적은 CE 면적은 CE 전류를 제한할 것이며, 이것은 CE (C0) 에서의 더 높은 반응물 농도를 통해, 또는 CE 반응물 (D) 의 빠른 확산을 통해 대응하는 것을 필요로 한다.

일부 구현예에서 상기 요구조건은 각각 WE 에서 산화 (환원) 및 CE 에서 환원 (산화) 을 겪고 있는 반대 산화 상태로의 동일한 전기활성 종을 충족시킨다. 상기 구현예에 따르면, CE 반응의 반응물을 나타내는 산화된 (환원된) 형태의 농도는 WE 에서의 반응물을 나타내는 환원된 (산화된) 형태보다 상당히 높다. 이것은 충분한 전류가 CE 에 제공되는 것을 확실히 한다.

엘락토머가 단백질 매트릭스에서 사용되는 다른 구현예에서, 그러나, CE 전류 제약 이슈를 다루는 상기 접근법은 비현실적일 수 있다. 높은 분자량으로 인해, 단백질 매트릭스 내의 반대 산화 상태의 상당한 과량의 엘락토머를 갖는 것은 중합체의 총 질량을 크게 증가시킬 수 있고, 이 때는 엘락토머 그 자체가 물질 증가를 야기하고 매트릭스의 점도 및 다공성을 왜곡시켜, 이에 의해 측정을 간섭할 수 있다.

따라서 또다른 구현예에서 WE 에서의 확산-제한된 전류의 측정을 위한 엘락토머인 제 1 전기활성 종, 및 CE 에서의 충분한 대향-전류를 공급하기 위한 소형-분자 전기활성 종인 제 2 전기활성 종을 포함하는, 혼합된 전기활성 종의 조성물이 제공된다. 제 1 전기활성 종은 본원에서 작업 전기활성 종 (WES) 으로서 언급되는 반면, 제 2 전기활성 종은 또한 대향 전기활성 종 (CES) 으로서 언급된다. 본 구현예에 따르면, 과량의 소형-분자 CES 는 매트릭스의 전반적인 중합체 함량 또는 점도를 증가시키지 않는다. 게다가, 이의 작은 분자량으로 인해, CE 에서의 CES 는 높은 확산 계수를 갖고, 이것은 Cottrell 방정식에 따라 높은 전류를 산출한다. 따라서, CES 는 두 전기활성 종이 동일한 확산도를 갖는 상황과 비교한, 본 구현예에 따른 WES 에 대해 상당히 과량이 아니도록 공급된다.

WES 및 CES 가 대립 산화 상태이기 때문에, 이들은 Nernst 평형에 도달할 때까지 이들의 표준 산화환원 전위 및 농도 (활성) 에 기반하여 서로를 산화/환원시킬 수 있다. 이것은 처음에 공급된 것에 비해 반대 산화 상태로의 상당한 양의 CES 를 산출할 수 있다. 이것은 차례로 작업 전극에서 상응하는 전류를 발생시켜, WES 로부터의 신호를 간섭할 수 있다. 그러므로, 본 구현예에 따르면, WES 및 CES 및 이들의 상대 농도는 WE 에서의 대부분에서 실질적으로 모든 전류가 WES 에 의해 발생되고, CES 에 의해서는 거의에서 실질적으로 전혀 발생되지 않는 방식으로 측정된다. WES 및 CES 의 작업의 특정 예는 하기 실시예 II 에 언급된다.

III. 다양한 구현예에 따른 시스템 및 방법

1. 단백질가수분해의 검출 및 모니터링을 위한 방법

다양한 구현예에서, 특히 단백질가수분해로 인한, 단백질성 매트릭스의 분해를 검출 및/또는 모니터링하기 위한 방법이 제공된다. 추가의, 방법은 샘플의 단백질가수분해 활성, 예를 들어, 샘플의 섬유소분해 활성 또는 콜라게나아제 활성을 검출 및/또는 모니터링하기 위해 제공된다.

상기 방법은 전형적으로 제 1 전극, 제 2 전극 및, 단백질성 매트릭스가 적어도 제 1 전극의 적어도 일부 상에 침적된 또는 이와 접촉하는 전기활성 종을 포함하는 전해질 용액을 포함한다. 전위가 전해질 용액을 통해 적용되는 경우 전류가 발생된다. 전위가 변경되는 경우 전류도 또한 변경되고 전압의 함수로서의 전류의 변화가 다수의 시점에서 측정된다. 예를 들어 단백질가수분해로 인해 단백질성 매트릭스가 분해되는 경우, 전압의 함수로서의 전류의 변화는 매트릭스의 분해가 일어나지 않는 기준선 또는 대조군 측정 (전형적으로 전하 대 전류) 과 비교하여 변경될 것이다. 전형적으로 단백질성 매트릭스의 밀도는 전기활성 종의 확산을 심각하게 억제한다. 예를 들어 섬유소분해에 의한 매트릭스의 분해는 매트릭스의 밀도를 감소시키고, 전형적으로 가교-연결 정도를 감소시켜, 따라서 유효 역학 점도가 감소하고 매트릭스 또는 매트릭스를 포함하는 다공성 지지체 내의 겉보기 확산 계수의 증가를 초래하여, 전기화학적 전류의 변화를 허용한다.

"기준선" 은 대조군 측정이고, 일부 구현예에서 시험 샘플을 비교할 수 있는 정상 전류 측정이다. 따라서, 대조군 또는 기준선 전류 측정에 기반하여, 샘플이 기준선 수준과 비교하여, 매트릭스 분해에 있어서 측정가능한 증가, 감소가 있는지, 또는 실질적으로 변화가 없는지에 대한 것을 측정할 수 있다. 하나의 양상에서, 기준선 수준은 대상에서의 단백질가수분해 활성, 특히 섬유소분해 활성의 부재의 지표일 수 있다. 그러므로, 전류 측정의 기준선 수준을 참조하여 사용되는 용어 "단백질가수분해 활성" 은 전형적으로 정상 단백질가수분해 활성 및/또는 섬유소분해 활성을 갖는 것으로 여겨지는, 대상 또는 대상의 집단으로부터의 샘플의 부재 또는 대상 또는 대상의 집단으로부터의 샘플의 존재에서 성립된 기준선 수준을 말한다. 또다른 구현예에서, 기준선은 대상으로부터의 이전 샘플로부터 성립되어, 대상의 단백질가수분해 활성이 시간에 따라 모니터링될 수 있거나 및/또는 제시된 치료제 또는 약제의 효능이 시간에 따라 평가될 수 있도록 할 수 있다.

기준선을 성립하기 위한 방법은 바람직하게는 대상으로부터의 샘플을 평가하는데 사용될 동일한 방법이다. 하나의 구현예에서, 기준선 수준은 평가하고자 하는 샘플과 동일한 샘플 유형을 사용하여 성립된다.

하나의 구현예에서, 기준선은 대상으로부터 수득된 자가 대조군 샘플에서 성립된다. 즉, 샘플은 평가하고자 하는 샘플이 수득되는 동일한 대상으로부터 수득된다. 대조군 샘플은 바람직하게는 평가하고자 하는 샘플과 동일한 샘플 유형이다.

방법은 예를 들어 전위 계단 전압전류법, 선형 스위프 전압전류법 또는 순환 전압전류법과 같은 당업계에 공지된 임의의 전압전류법 방법을 사용하여 대상에서의 또는 대상으로부터의 샘플에서의 단백질가수분해 활성을 검출 또는 모니터링하는 것을 수반할 수 있다. 단백질가수분해 활성은, 정상 대상을 비정상 단백질가수분해 활성을 가진 대상으로부터 구별하기 위해, 미리측정된 또는 참고 전하 대 전류 측정과 비교할 수 있다.

전압전류법 방법은 측정 사이에 예를 들어 10 내지 180 초 대기 기간을 두고 동일한 단백질성 매트릭스로 반복될 수 있다. 그 시간 동안 단백질분해 반응 예를 들어 플라즈민 섬유소분해 반응은 지속될 수 있고 각 시점에서 전류 반응은 이전 측정과 비교하여 변경될 것이다, 전형적으로 반응은 더욱 두드러질 것이다. 예를 들어, 10 초, 30 초, 60 초 또는 180 초 전류 신호 대 초기 (t=0) 전류의 비는 측정 파라미터로서 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 다른 파라미터 (활성 전극 표면 면적, WES 농도, 다공성 지지체 가변성) 의 영향은, 이들이 2 개의 시점 사이에 변화가 없었으므로, 내부적으로 통제된다. 유일한 변수는 단백질성 매트릭스의 분해 예를 들어 단백질가수분해, 예를 들어, 섬유소분해의 정도이다.

단백질성 매트릭스는 전극 상에 직접 형성될 수 있다. 대안적으로는 단백질성 매트릭스는 용액 내에 또는 표면 상에 형성될 수 있고, 적어도 하나의 전극은 이후 매트릭스와 접촉되어 위치한다. 특정 구현예에서 단백질성 매트릭스가, 매트릭스와 접촉되어 위치하는 다공성 지지체 및 적어도 하나의 전극 내에, 적어도 부분적으로 형성된다. 예를 들어 매트릭스는 단백질, 예컨대 피브리노겐의 용액의 다공성 지지체에 대한 적용 및 이어서 매트릭스의 형성을 용이하게 하기 위한 폴리음이온, 가교제 또는 부가적인 단백질 예컨대 트롬빈의 지지체에 대한 적용에 의해 형성될 수 있다. 다공성 지지체는 이후 전극의 적어도 일부 또는 지지체 내에 삽입된 전극에 적용될 수 있다.

하나의 구현예에서 그의 표면의 적어도 부분 상에 침적된 단백질 매트릭스를 갖는 적어도 하나의 전극은 단백질가수분해 활성을 추정적으로 갖는 샘플 내에 삽입될 수 있다.

또다른 구현예에서 전극은 단백질성 매트릭스와 접촉되고 전압전류법 측정이 시행되고, 전형적으로 이것은 전압의 함수로서의 전류의 변화 (예를 들어, 전하 대 전류) 의 측정이다. 이에 후속하여 샘플을 다공성 지지체에 적용하고, 추가의 전압전류법 측정을 시행하며, 이때 샘플의 적용 전 후에 시행된 측정 사이의 차이는 단백질가수분해 활성을 갖는 샘플의 지표이다.

샘플은 생물학적 샘플 예컨대 체액, 배설물 또는 분비물일 수 있다. 예를 들어 샘플은 타액, 혈액, 혈액 혈장, 혈액 혈청, 또는 간질액을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

샘플은 질환 또는 상태가 있는 대상으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서 질환 또는 상태는 피브린 침적과 연관될 수 있다. 상기 질환 또는 상태에는 심부 정맥 혈전증, 폐색전, 신장 질환, 비대성 켈로이드 반흔, 관상동맥 경색, 전이, 염증, 파종성 혈관내 응고, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 사구체신염, 전신성 홍반성 루프스, 자가면역 신경병, 육아종 질환, 기생충 감염 및 동종이식 거부가 포함된다.

다른 구현예에서, 샘플은 치료제 또는 치료 섭생 예컨대 상기 질환 또는 상태에서 사용되는 이들 요법 또는 치료 섭생의 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후에 대상으로부터 수득될 수 있다. 이러한 구현예에서 샘플을 단백질성 매트릭스를 분해하는 대상의 능력에 대한 치료제 또는 치료 섭생의 영향을 검출 또는 모니터링하기 위한 수단으로서 본원에 기재된 전압전류법 측정에 적용한다. 예를 들어 단백질성 매트릭스가 피브린 응고인 구현예에서 방법은 대상의 섬유소분해 활성에 대한 치료제 또는 치료 섭생의 영향을 검출 또는 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.

추가의 구현예에서, 지지체 위의 젤라틴 매트릭스가, 젤라틴 분해 효소 (a.k.a. 젤라티나아제, 콜라게나아제, 또는 매트릭스 메탈로프로테아제) 를 함유하는 혈액 또는 간질액 샘플이 첨가된 스트립으로서 형성된다. 이어지는 매트릭스의 단백질가수분해는 매트릭스 다공성을 증가시키고 전체적인 유효 점도를 감소시켜, D 에서의 증가를 산출하여, 확산-제한된 전기화학적 전류의 증가를 가져온다.

본 구현예의 콜라겐 단백질가수분해 검출 방법은 다양한 구현예에 따른 진단 및 예방 목적 모두를 위해, 암 전이를 모니터링하는데 적용될 수 있다. 콜라게나아제는, 이들이 건강한 조직에서의 세포외 매트릭스를 분해해서, 일차 종양 세포가 그들의 일차 환경을 탈출하여 이후에 먼 조직을 침습하여 먼 전이를 형성하도록 하는, 침습성 암에서 중요한 역할을 한다.

말초 혈액 및 체내 특정 위치에서의 콜라게나아제 활성은 사람마다 다르다. 예를 들어, 조직 리모델링을 필요로 하는 다른 과정, 예컨대 상처 회복은 세포외 매트릭스 분해와 연관된다. 본원에 기재된 검출 방법은 다양한 구현예에 따라 혈액 및 기타 체액 예컨대 간질액 내의 콜라게나아제 활성의, 용이한, 민감한 및 편리한 모니터링을 제공한다. 추가의 논의에 대해서는 하기 실시예 II 를 참고한다. 중요하게는, 특정 개인에서의 시간에 따른 콜라게나아제 활성의 지속적인 증가는 침습성 암의 가능한 존재에 대한 신호일 수 있으며, 적절하게 추가의 진단 시험 및 적합한 요법을 요할 것이다.

2. 단백질가수분해를 검출 및 모니터링하기 위한 시스템 및 장치

특정 구현예에서, 단백질 매트릭스의 분해의 검출 및/또는 모니터링에 사용하기 위한 장치가 제공된다. 장치는 전형적으로 적어도 전극 및 단백질성 매트릭스를 포함하고, 이것은 다양한 구현예에서 임상적 및 의료적 장치 또는 가정용 모니터링 장치로서 이용될 수 있다. 일부 구현예에서 장치는 케어지점 (point-of-care) 장치 또는 건강 모니터링 도구로서 제공된다. 매트릭스는 전형적으로 전극의 적어도 일부와 접촉된다.

일부 구현예에서 매트릭스는 전극 상에 직접, 예를 들어 전극 또는 이의 일부를 매트릭스가 전극 상에 형성되도록 적어도 하나의 단백질 적어도 하나의 폴리음이온 및/또는 적어도 하나의 가교제를 포함하는 용액과 접촉하도록 둠으로써 형성될 수 있다. 대안적으로는 매트릭스는 전극을 매트릭스를 형성할 구성성분을 포함하는 용액, 예를 들어 피브리노겐 및 트롬빈의 용액 또는 혈액 샘플과 접촉하도록 둠으로써 전극 상에 형성될 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 언급된 방법을 수행하기 위해, 단백질성 매트릭스의 단백질가수분해의 검출 및/또는 모니터링을 수행하기 위한 시스템이 제공된다. 특정 구현예에서, 이러한 검출 또는 모니터링은 전압전류법 기법을 사용하여 수행된다. 본 구현예에 따른 시스템은 작업 전극, 대향 전극, 전류 측정 단위, 통제 단위, 데이터 저장 단위 및 데이터 프로세싱 단위를 포함하는 전압전류법 분석을 위한 수단을 포함한다. 대향 전극은 참고 전극 및 보조 전극을 포함할 수 있다. 하나의 양상에서, 작업 및/또는 대향 전극은 단백질성 매트릭스 예컨대 피브린 응고로 적어도 부분적으로 코팅될 수 있다.

하나의 구현예에서, 작업 전극은 전형적으로 통제가능한 가변 전위 공급원, 예컨대 당업계에 공지된 또는 시판되는 전위 공급원에 의해 공급되는 제 1 전위에 연결된다. 전류 측정 단위는 작업 전극과 대향 전극 사이를 흐르는 전류를 기록하기 위해 배열되고, 전류 측정 단위에 의해 측정되는 전류는 단백질 매트릭스의 단백질가수분해의 표지자로서 사용된다. 하나의 구현예에서, 전류 측정 단위는 측정된 전류의 대표 출력을 생성하는 전류 증폭기를 포함한다.

통제 단위는 전형적으로 제 2 전위, 작업 전극 및 대향 전극을 통제하고, 미리 결정된 시간에 전류 측정 단위로부터 전류 값을 판독하기 위해 배열된다. 순환 전압전류법을 사용하는 방법에서, 통제 사이클은 제 2 전위를 설정하는 것, 작업 전극 및 대향 전극을 통제하는 것 및 전류 측정 단위로부터 전류 값을 판독하는 것을 포함한다. 통제 단위는 통제 소프트웨어가 저장되는 메모리 단위, 또는 외부 프로세스 통제 시스템에 의해 통제되는 통제-인터페이스를 포함할 수 있다.

제 2 전위는 전형적으로 대향 전극 (또는 대향 전극이 참고 및 보조 전극을 포함하는 구현예에서는 보조 전극) 에 연결된 통제가능한 가변 전위 공급원, 예컨대 당업계에 공지된 또는 시판되는 전위 공급원에 의해 공급된다. 데이터 저장 단위는 기록된 전류 값을 저장한다. 하나의 구현예에서, 시판되는 메모리 회로를 포함한다. 프로세싱 단위는 미리 결정된 수학적 모델을 사용하여 저장된 전류 값을 분석하는데 사용된다. 분석 결과는 디스플레이 등을 통해, 예컨대 도 4 및 5 에 제시되는 전압전류곡선 또는 전류 대 시간 곡선으로 제시된다.

하나의 구현예에서, 작업 전극, 대향 전극, 전류 측정 단위, 및 통제 단위는 측정된 전류 값을 내부 또는 외부 데이터 저장 및 프로세싱 단위에 대해 출력하도록 배열된 단위 장치로서 통합된다. 통제 단위는 외부 데이터 저장 및 프로세싱 단위에 의해 외부적으로 통제될 수 있다. 따라서, 필드 사용 또는 케어 지점 사용을 가능하게 하는 단백질성 매트릭스의 단백질가수분해의 검출 또는 모니터링을 위한 값싸고 다재다능한 시스템이 고려된다.

일부 구현예에서 다양한 구현예의 시스템이 특정 단백질성 매트릭스 예컨대 피브린 응고, 콜라겐 매트릭스, 또는 젤라틴의 단백질가수분해를 검출 또는 모니터링하기 위해 디자인된다. 본 구현예에서, 시스템은 바람직하게는 완전히 통합된다, 즉, 단백질성 매트릭스, 작업 전극, 대향 전극, 전류 측정 단위, 통제 단위, 데이터 저장 단위 및 프로세싱 단위가 하나의 장치로서 통합된다. 장치는 분석으로부터의 결과를 출력하기 위해 배열될 수 있다.

다양한 구현예에 따르면, 데이터 프로세싱 및 출력 단위는 하드웨어, 소프트웨어, 펌웨어, 또는 이의 조합 중 하나이다. 특정 구현예에서, 데이터 프로세싱 및 출력 단위는 모바일 기기, 예컨대 스마트폰 기기로부터 채택 및 이것으로 도입된다. 다른 구현예에서, 데이터 프로세싱 및 출력 단위는 제한 없이 IOS 폰, 안드로이드 폰 및 유사한 스마트폰 기기를 포함하는, 하나 이상의 스마트폰 기기와 호환성인 모바일 앱으로서 실행된다.

부가적인 구현예에 따르면, 데이터 프로세싱 및 출력 단위는 클라우드 (cloud), 다른 유선 또는 무선 커뮤니케이션 네트워크, 또는 다른 원격 커뮤니케이션 수단을 통해 측정 장치에 연결된다.

다른 구현예에서, 또한 상기 언급된 방법을 실시하기 위한 키트가 제공된다. 전형적으로, 본 발명의 방법을 실행하기 위한 키트는 모두 방법을 실시하기 위한 필수 시약을 함유한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 키트는 단백질성 매트릭스를 포함하는 지지체 또는 지지체 및 지지체 상에 단백질 매트릭스를 형성하는 필수 시약 예컨대 피브리노겐 및 트롬빈의 용액을 포함할 수 있다. 키트는 또한: (1) 적어도 하나의 전극, (2) 적어도 하나의 전기활성 종, (3) 적어도 하나의 전해질 용액, (4) 적어도 하나의 염 및 (5) 공지된 수준의 단백질가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 대조군 샘플 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.

키트는 또한 본 발명에 따른 단백질 매트릭스의 단백질가수분해를 정성적으로 또는 정량적으로 검출 또는 모니터링하기 위한 키트를 사용하기 위한 인쇄된 지침을 특징으로 할 수 있다.

3. AC-기반 전압전류법 및 분광 기법에 기반한 대안적인 시스템 및 방법

대안적인 구현예에서, 단백질 매트릭스 내에 엘락토머의 억제된 확산은 교류 (AC) 또는 다중 DC 펄스에 기반한 다른 측정 기법의 사용을 가능하게 한다. 상기 구현예에서, 엘락토머 반응물은 전압 극성 또는 진폭이 매번 변하면서 전극 표면으로부터 앞뒤로 확산될 수 있어, 이에 의해 확산 길이를 효과적으로 늘리고 원시적인 또는 단백질가수분해된 매트릭스 내의 확산 계수의 차이를 과장할 수 있다.

전기화학적 반응 (작업 펄스) 을 허용하는 규모의 다중 펄스 전압전류법 전압 펄스는 반응이 일어나지 않는 펄스 (휴지 펄스) 와 교대된다. 휴지 펄스 동안 엘락토머 반응물은 소모되지 않으면서 전극 표면을 향해 확산되는 반면, 엘락토머 생성물은 전극으로부터 멀리 확산된다. 측정된 양은 작업 전압의 n 번째 펄스에서의 Faradaic 전류이다.

급속-확산 전기활성 종 및 낮은 주파수에 대한 제한 조건으로서, 전극-표면 농도의 완전한 평형이 일어나, 측정된 전류가 매 펄스에서 실질적으로 동일하고. 벌크 농도 (C₀) 에서 관찰되는 어떠한 작은 차이에 대해서라도 교정되도록 할 수 있다. 다른 말단에서는, 저속-확산 전기활성 종 및 높은 주파수로는 전극 표면에서 어떠한 복구라도 발생하지 않고 매 펄스에서 전류가 소실되어, 시간대전류법으로 관찰되는 붕괴를 닮는다. 가장 높은 감수성의 기법은 상기 2 가지 제한 조건 사이에서 성립될 수 있고, 특정 구현예에 따라 실험적으로 결정될 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 시스템 및 방법에서 사용되는 분광 기법, 예컨대 전기화학 임피던스 분광학 (EIS) 이 있다. 본 구현예에 따르면, 확산도의 변화가 주파수 영역에서 관찰될 수 있다. 주파수-기반 측정은 일반적으로 진폭-기반 기법보다 더욱 민감하고 정확하며, 따라서 본 구현예에 따른 시스템 및 방법에 대해 추가의 이점을 제공한다.

작업 전극 표면으로 그리고 이로부터 멀어지는 확산의 동일한 물리적 현상은 본원에 기재된 펄스된 기법과 같이 EIS 로 적용된다. 그러나, 본 구현예에서, 주파수는 측정 과정 동안 가변된다. 특정 확산 상수에 대해, 또한, Warburg Impedance 로도 알려진, 확산의 억제로 Farradaic 전류가 전압 파형을 최대로 뒤처지게 만드는 특정 주파수가 있다. 하나의 구현예에 따른 주파수 영역 측정에서, 본 주파수는 피크 상 지연에 상응할 수 있고, 확산 계수의 측정, 및 그러므로 매트릭스 내의 단백질가수분해 정도의 측정일 수 잇다.

IV. 실시예

하기 설명은 특정 구현예의 예로서 제공되며, 본 발명의 다양한 구현예의 범주를 제한하지 않는다.

실시예 1: 단백질가수분해의 전압전류법 측정

인간 피브리노겐 및 인간 트롬빈 저장 용액을 혼합하여 10 μL 최종 용액 (2% 피브리노겐 + 0.1U 의 트롬빈 최종 농도) 을 산출하고, 이것을 보르텍스에 적용하고 즉시 5x5 mm 여과지 스트립 (Whatman No. 4, 큰 공극 크기를 가짐, 30-40 ㎛ 입자 보유) 에 적용하였다. 피브린 응고가 종이 스트립의 공극 내에서 형성되었고, 스트립을 2 시간 동안 실온에서 건조되도록 방치하였다. 피브리노겐 농도로 인해, 응고 공극-크기는 여과지 내의 공극보다 작다.

스트립-응고를 0.2% Tween 20 을 함유하는 50 mM K₃Fe(CN)₆ 의 용액으로 함침하고, 건조되도록 방치하였다. 스트립은 평평한 인쇄된 전극 (금 또는 전도성 탄소) 을 함유하는 칩에 부착되었다. 임의의 은 와이어를 참고 전극으로서 스트립에 부착하였다 (도 3C). 상기 스트립을 2 nM 인간 플라즈민을 함유하는, 인산-완충 생리 식염수 (PBS) 로 재수화한다. 플라즈민이 없는 PBS 를 대조군으로서 사용한다. K₃Fe(CN)₆ 에서 K₂Fe(CN)₆ 로의 환원으로부터 발생하는 전기화학적 전류를 측정하기 위해, 전기화학적 시험을 스트립 상에서 수행하였다. 전류 반응 (도 5E, F, G) 은 여러 파라미터: 전위, 전극 면적, K₃Fe(CN)₆ 농도 및 확산 계수의 함수이다.

실시예 2: 시간대전류법에 사용되는 CES 및 WES

시간대전류법 측정에 대해 이용된 WES 및 CES 의 상기 언급된 혼합된 조성물을 언급한다. 예로서, 상기 논의된 Fc-PEG 엘락토머에서, 전기활성 Fc 잔기는 +0.641V 의 표준 전극 전위 E0 를 갖고, 엘락토머 그 자체는 심지어 더 높은 E0 를 가져, 아미드 결합 (측정된 E0 는 +0.7V 내지 0.75V 범위 내임) 내에 pi-전자를 제공한다. WES 의 환원된 형태가 WE 에서 측정을 위해 사용되는 경우, - 다른 통상 사용되는 전기활성 종에 비해 - 이러한 높은 산화에 대한 저항성은 다수의 산화 CES 에 대한 용인성을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 상기 논의된 바와 같은, CES 의 농도 과량으로 인해, 약한 산화제를 CES 로서 사용하면, WES 가 이의 환원된 상태로 우세하게 존재하므로 유리하다.

따라서, 예로서, 적합한 CES 는 루테늄 (III) 헥사민, Ru(NH₃)₆ ³⁺ (이것은 +0.1V 의 표준 전극 전위 E0 를 가짐) 이다. Nernst 방정식에 근거하여, 2mM 을 포함하는 WES-CES 조성물은 PEG-Fc WES 를 환원시키고, 8mM Ru(NH₃)₆ ³⁺ CES 는 WES 의 3% 미만을 산화시킬 것이다. 이의 높은 확산도와 커플링된 과량의 CES 는 대향 전극에서 충분한 전류를 제공하여, 시스템을 통한 전반적인 전류가 오로지 엘락토머 WES 의 WE 표면으로의 확산에 의해서만 제약된다. CES 의 또다른 예는 Fe₃(CN)₆ ³⁺ 의 산화된 형태이다.

조성물 CES-WES 혼합물을 젤라틴의 미리 가열된 20% 용액에 첨가하고, 2 개의 스크린-인쇄된 탄소 전극을 함유하는 시험 스트립 상에 침적시킨다. 샘플 전지에 노출된 전극의 치수는 WE 1.79x1.3 mm, 및 CE 0.6x1.3mm 이다. 젤라틴이 없는 별도의 시험 스트립을 대조군으로서 제조한다. 0.8 ㎕ 의 생리학적-완충 식염수를 스트립에 첨가하고, 스트립을 선형 스캔 전압전류법 및 시간대전류법으로 어세이하였다. 결과는 각각, 젤라틴을 함유하는 스트립 대 대조군 상에 억제된 확산-제한된 전류를 입증하는, 도 7 및 8 에 제시된다.

시간대전류법 측정으로부터, 유효 확산 계수 (D) 를 Cottrell's 방정식으로 사용하여 계산한다. 대조군 스트립의 경우 D 는 5.15x10^-6 ㎠/s 이고, 이것은 수용액 중 5kDa 분자의 확산과 일치한다. 젤라틴 스트립의 경우, 유효 확산 계수는 1.56x10^-7 ㎠/s 아래에서 30 배 초과였다. D 에서이 이러한 상당한 차이는 엘락토머 WES 의 사용 없이는 달성되지 않는다.

2014 년 1 월 1 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 14/145,986, 및 2014 년 1 월 21 일에 출원된 중국 특허 출원 일련 번호 201410028684.6 의 설명이 그 전체가 본원에 인용된다.

다양한 도면 및 실시예를 포함하여 본원에 제공되는 다양한 구현예의 설명은 예시하기 위한 것이지, 본 발명 및 그의 다양한 구현예를 제한하는 것은 아니다.

Claims (24)

1. (i) 합성 단백질 매트릭스, (ii) 작업 전극, 및 (iii) 대향 전극을 포함하는, 단백질 매트릭스의 단백질가수분해를 검출 또는 모니터링하기 위한 장치로서, 상기 합성 단백질 매트릭스가 상기 전극 각각의 적어도 일부와 접촉하고 있고, 제 1 및 제 2 전기활성 종이 상기 합성 단백질 매트릭스와 접촉되어 제공되고, 샘플에 노출 시 확산-제한된 전기화학적 전류는 작업 전극에서 상기 제 1 전기활성 종에 의해 발생되며 대향 전류는 대향 전극에서 상기 제 2 전기활성 종에 의해 발생되며, 상기 확산-제한된 전기화학적 전류가 측정되고 상기 측정이 상기 합성 단백질 매트릭스의 단백질가수분해 수준의 지표인 장치.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 합성 단백질 매트릭스가 피브린 응고, 혈전, 혈소판 풍부 혈장 응고, 젤라틴, 콜라겐 매트릭스 중 하나이고, 상기 매트릭스가 지지체 상에, 그 내에 또는 그 주변에 형성되는 장치.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 작업 전극이 상기 대향 전극보다 큰 장치.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 전기활성 종이 동일한 분자의 반대 산화 상태인 장치.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 전기활성 종이 엘락토머인 장치.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 엘락토머가 폴리에틸렌 글리콜 (PEGs), 폴리비닐 알코올 (PVA), 및 이의 유도체 중 하나인 장치.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 제 2 전기활성 종이 소형 분자 전기활성 종이고, 상기 제 2 전기활성 종의 확산도가 상기 엘락토머의 확산도와 상이한 장치.
8. 제 7 항에 있어서, 제 1 및 제 2 전기활성 종의 상대 농도가 작업 전극에서의 본질적으로 모든 전류가 제 2 전기활성 종에 의해서가 아니고, 제 1 전기활성 종에 의해서 발생되는 그러한 식으로 결정되는 장치.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 전기활성 종이 PEG-Fc (Fc-CO-NH -(CH₂CH₂O)_n-NH-CO-Fc) 이고, 상기 제 2 전기활성 종이 루테늄 (III) 헥사민 (Ru(NH₃)₆ ³⁺) 인 장치.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈장, 간질액, 기타 체액, 및 공지된 단백질가수분해 활성을 가진 대조군 샘플 중 하나인 장치.
11. 제 1 항에 있어서, 미리결정된 식 또는 방법론을 사용하여 확산 제한된 전류의 상기 측정을 분석하는데 적응된 데이터 프로세싱 단위를 추가로 포함하여, 상기 단백질 매트릭스의 단백질가수분해의 결과 지표를 생성하는 장치.
12. 제 11 항에 있어서, 확산 제한된 전류의 상기 측정을 출력하는데 적응된 출력 단위를 추가로 포함하고, 상기 결과가 단백질가수분해의 지표인 장치.
13. 제 11 항에 있어서, 상기 데이터 프로세싱 및 출력 단위 중 하나가 모바일 기기 또는 모바일 앱 중의 하나인 장치.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 대향 전극이 참고 전극 및 보조 전극을 포함하는 장치.
15. 하기 단계를 포함하는, 샘플의 단백질가수분해 활성을 검출 또는 모니터링하기 위한 방법: (i) 상기 단백질가수분해 활성에 적용되는 합성 단백질 매트릭스를 제공하는 단계, 상기 합성 단백질 매트릭스는 작업 전극 및 대향 전극에 접촉됨, (ii) 상기 합성 단백질 매트릭스에 접촉된 제 1 및 제 2 전기활성 종을 제공하는 단계, (iii) 상기 합성 단백질 매트릭스를 상기 샘플에 노출시키는 단계, 이에 의해 확산-제한된 전기화학적 전류가 작업 전극에서 상기 제 1 전기활성 종에 의해 발생되고, 대향 전류가 대향 전극에서 상기 제 2 전기활성 종에 의해 발생됨, 및 (iv) 상기 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정하는 단계, 상기 측정은 상기 샘플 내의 단백질가수분해 활성의 수준의 지표임.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 측정이 시간대전류법, 전위 계단 전압전류법, 선형 스위프 전압전류법, 순환 전압전류법, 직사각형파 전압전류법, 계단식 전압전류법, 양극성 또는 음극성 스트리핑 전압전류법, 흡착성 스트리핑 전압전류법, 교류 전압전류법, 회전 전극 전압전류법, 정상 또는 차등 펄스 전압전류법, 및 시간대전하법 중 하나에 기반하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 측정이 교류 및 다중 직류 펄스 중 하나에 대해 수행되는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 측정이 전기화학 임피던스 분광학에 기반하고, 주파수 영역 내의 변화가 상기 샘플 내의 상기 단백질가수분해 활성의 수준의 지표인 방법.
19. 제 15 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈장, 간질액, 기타 체액, 및 공지된 단백질가수분해 활성을 가진 대조군 샘플 중 하나인 방법.
20. 제 15 항에 있어서, 상기 제 1 전기활성 종이 엘락토머이고, 상기 제 2 전기활성 종이 소형-분자 전기활성 종인 방법.
21. 제 15 항에 있어서, 상기 제 1 전기활성 종이 PEG-Fc (Fc-CO-NH -(CH2CH2O)n-NH-CO-Fc) 이고, 상기 제 2 전기활성 종이 루테늄 (III) 헥사민 (Ru(NH₃)₆ ³⁺) 인 방법.
22. 제 15 항에 있어서, 상기 측정이 기준선의 지표이고, 상기 방법이 추가로 제 2 상기 합성 단백질 매트릭스를 제 2 샘플에 노출시키고, 제 2 상기 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정하는 것을 포함하고, 상기 제 2 측정 및 상기 기준선 사이의 차이가 단백질가수분해 활성에서의 변화의 지표인 방법.
23. 하기 단계를 포함하는, 샘플의 섬유소분해 활성을 검출 또는 모니터링하기 위한 방법: (i) 합성 피브린 스트립을 제공하는 단계, 상기 스트립은 작업 전극 및 대향 전극이 인쇄되어 있음; 상기 피브린 스트립과 접촉하는 엘락토머 및 소형-분자 전기활성 종을 제공하는 단계, (iii) 상기 피브린 스트립을 상기 샘플에 노출하는 단계, 이에 의해 확산-제한된 전기화학적 전류가 작업 전극에서 상기 엘락토머에 의해 발생하고, 대향 전류가 대향 전극에서 상기 소형-분자 전기활성 종에 의해 발생함, (iv) 상기 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정하는 단계, 상기 측정은 상기 샘플 내의 섬유소분해 활성의 수준의 지표임.
24. 하기 단계를 포함하는, 샘플의 콜라게나아제 활성을 검출 또는 모니터링하기 위한 방법: (i) 젤라틴 스트립을 제공하는 단계, 상기 스트립은 작업 전극 및 대향 전극이 인쇄되어 있음, (ii) 엘락토머 및 소형-분자 전기활성 종을 제공하는 단계, (iii) 상기 젤라틴 스트립을 상기 샘플에 노출하는 단계, 이에 의해, 상기 확산-제한된 전기화학적 전류는 작업 전극에서 상기 엘락토머에 의해 생성되는 반면, 대향 전류는 대향 전극에서 상기 소형-분자 전기활성 종에 의해 생성됨, (iv) 상기 확산-제한된 전기화학적 전류를 측정하는 단계, 상기 측정은 상기 샘플 내의 콜라게나아제 활성의 수준의 지표임.

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