JP4866232B2 - 電気化学的検出方法及び装置 - Google Patents

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Description

本発明は、凝集検出への特別な応用を有する電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるための障壁の形成を測定する電気化学的方法に関する。本発明の典型的な応用は、抗原発見技術にあり、例えば、血液型のための全血液の分析にある。
従来技術において、液体試料内の抗原の存在の評価の一般的な方法は、抗体が抗原に結合する時サンプル内の種の凝縮が起きる、そのように抗体と抗原の接触に試料を置くことである。そして、凝集が光学的方法、例えば試料の光学密度、濁りあるいは光学散乱を検査することで評価される。
例えば、米国特許ＵＳ６,３３０,０５８は、予定波長範囲上の光学密度スペクトラムが、例えば凝集指標に到達するために使われる方法を公開している。また、米国特許ＵＳ５,２５６,３７６は、方法を実行するために遠心分離機を用いる装置と共に光学密度プロファイルを測定することにより凝集を測定するための光学測定技術を公開している。
凝集試験は、アナライトの存否のみが検出されるところの定量的、あるいは生じた凝集の程度がアナライトの特別なレベルに一致するところの定量的のいずれかでありえる。従来技術において、凝集発生の評価は、溶液濁りを測定するために散乱光を用いることにより、あるいは光学密度あるいは類似のものを測定することにより、視覚的に達成される。これら視覚的技術は、簡単であることで、せいぜい半定量的であり、ユーザ誤りをもたらす、ところが、光学密度あるいは散乱技術は、より定量的で、ユーザ誤りが少ないことで、達成には比較的高額で複雑な装置を必要とする。
本発明は、これら従来技術の代替を提供することを目的とする。
本発明の実施形態に係る方法は、電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるための障壁の形成を測定する方法であって、作用電極と作用電極から離れた対向電極を有する電気化学的セルを備え、前記セル内に対象成分、試験成分および少なくとも１種類の電場応答性種を提供し、対象および試験成分が、電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるために凝集反応により障壁の形成を引き起こすように意図され、作用電極への測定される電場応答性種の質量移送比率に関連する電流を生成するために十分な電位を作用電極と対向電極間に印加し、電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるために障壁の形成の測定を得るために作用電極で電流を測定する、ことから成る。
好ましくは、障壁の形成は、凝集により生じさせられる。
いくつかの実施の形態例において、方法は、作用電極で電場応答性種の濃度を維持するに十分な電位を印加することから成る。
好ましい実施の形態例において、発明は、１回目、有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれる前に電流測定し、そして、２回目、再度有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれるときに電流測定し、そして、障壁形成の測定を得るために測定された電流の相違を用いることから成る。
好ましい実施の形態例において、１回目は、障壁形成測定補助変数内の変化が試料内で障壁が完全に生成された時のその補助変数の総変化の約２０％よりも少ない時であり、更に好ましくは、その補助変数の総変化の約１０％よりも少ない時である。
好ましい実施の形態例において、２回目は、凝集測定補助変数内の変化が試料内で障壁が完全に生成された時のその補助変数の総変化の約５０％よりも多い時であり、更に好ましくは、総変化の約７０％よりも多い時である。
実際上、試料範囲と試験条件上の可能な障壁形成力学の範囲の考察によりこれらの時間は決定され、それにより装置が適用され、そして全体の範囲に適した時間を選ぶことになっている。一方、長期に渡り障壁形成測定補助変数の変化率を評価することにより、各個別試験に対する適当な時間が得られる。
技術的に明らかであるように、障壁形成測定補助変数の変化率、それ自身はまた、興味の試験種の存在あるいは欠如あるいは濃度の測定として用いることができる。
測定された電流の相違は、障壁形成の測定を得るために使用され得る、それにより障壁形成の測定を得る。測定された電流の相違は、また、拡散係数の変化の測定を得るために使用され得る、それにより障壁形成の測定を得る。
試験成分、対象成分および電場応答性種は、数々の異なる方法でセル内に提供され得る。
一般的に、方法は、セルに、対象成分を含む液体試料を置くことにより対象成分が提供することから成る。
いくつかの実施の形態例において、方法は、液体試料がセル内に置かれる前に、液体試料に試験成分を導入することにより、試験成分を提供することから成る。
他の実施の形態例において、試験成分は、液体試料が導入される前に、セル内に提供される。例えば、試験成分は、セル内に試験成分を乾燥させることによりセルに蓄積され得る。
電場応答性種は、障壁形成反応あるいは試験成分と対象成分間の別の反応により提供され得る。
一方、電場応答性種は、試験成分により提供され得る。更に、電場応答性種は、試験成分と対象成分に独立に提供され得る。
他の好ましい実施の形態例の１つにおいて、電場応答性種は、障壁形成反応により提供される、方法は、作用電極として働くことが出来る２個の電極と、２個の電極の１つにあるいは近傍に試験成分を備えることから成り、方法は更に、前記作用電極間を切り替えるために印加電位あるいは電流測定回路接続を変えることから成り、そして双方の作用電極で電流を測定し、それにより障壁形成の測定を得る。
いくつかの実施の形態例において、測定された電流は、障壁形成の測定を得るために用いられる電荷の測定を得るために使用し得る。
本発明の他の実施形態に係る方法は、作用電極と作用電極から離れた対向電極を有する電気化学的セルを備え、前記セル内に、目標成分から構成されるかあるいは構成されない対象成分、試験成分および少なくとも１種類の電場応答性種を提供され、目標成分が存在する時、対象および試験成分が電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるために凝集反応により障壁の形成を引き起こすように意図され、作用電極への測定される電場応答性種の質量移送比率に関連する電流を生成するに十分な電位を作用電極と対向電極間に印加し、電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じる障壁が生成されるかどうかを決定するために作用電極で電流を測定する、それにより前記対象成分に目標成分が存在するかどうかを決定する、ことから成り、対象成分内に目標成分が存在するかどうかを決定する。
本発明の他の実施形態に係る装置は、作用電極と前記作用電極から離れた対向電極を有する電気化学的セルであって、電気化学的セルは、対象成分、試験成分および少なくとも１種類の電場応答性種を前記セル内に受け取るために適応され、対象および試験成分は、少なくとも１種類の電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるために凝集反応により障壁の形成を引き起こすように意図される電気化学的セル、と、前記作用電極への測定される電場応答性種の質量移送比率に関連する電流を生成するに十分な電位を前記作用電極と前記対向電極間に印加するための電源と、前記作用電極で電流を測定するための電流計と、測定された電流から前記少なくとも１種類の電場応答性種の動きへの障壁形成の測定を決定し、それにより凝集の測定を決定する、ための障壁形成測定手段とを有する電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じる障壁の形成を測定する。
好ましくは、障壁形成測定手段は、凝集の測定を決定するための凝集測定手段である。
装置の電気化学的セルは、別の基準電極を含み得る。一方、対向電極は、逆のあるいは基準の電極であり得る。
更に、装置の構造的詳細は、本発明の方法の追加の特徴と同じく、以下の発明詳細記述から明らかになる。
従来技術において、凝集発生の評価は、溶液濁りを測定するために散乱光を用いることにより、あるいは光学密度あるいは類似のものを測定することにより、視覚的に達成される。これら視覚的技術は、簡単であることで、せいぜい半定量的であり、ユーザ誤りをもたらす、ところが、光学密度あるいは散乱技術は、より定量的で、ユーザ誤りが少ないことで、達成には比較的高額で複雑な装置を必要とする。本発明は、これら従来技術の改善された代替を提供できる。
発明の実施の形態例は、電気化学的測定、特に時間電流滴定測定が溶液中の電場応答性種の濃度かつ／あるいは拡散係数についての情報をもたらすことが出来るという事実に基づく。これは、電極での種の酸化あるいは還元を介して作用電極表面で測定された電場応答性種の還元あるいは酸化された形式の濃度に比例する電流を生成するに十分な電位を作用電極および対向電極（対向基準電極）間に印加することにより達成される。
多くの実施の形態例において、これは、作用電極表面のゼロの電場応答性種の濃度を維持するために十分な電位を印加することから成る。
作用電極で発生する還元あるいは酸化の結果として流れる電流は、この場合、濃度勾配と拡散係数の積である質量移送比率に関係する。電流は、電場応答性種の濃度の測定、溶液内の電場応答性種の拡散係数あるいは両方を得るために分析することができる。例えば、電場応答性種の濃度が既知であるならば、隔離された作用電極に対して、コットレル方程式あるいは拡散係数をもたらす同じようなものを介して電流は分析することができる。公知のコットレル方程式は、拡散―制限電流密度と時間の間の関係を定義する。拡散電流密度は、時間の平方根と逆関係である、あるいは、別の表現では、「i(t) × t0.5の積が一定（定数）」である。定数は、反応物質の濃度と反応物質の拡散係数の平方根に比例する。一方、液体試料内の種の拡散係数が既知であれば、濃度は推測できる。
別の型の電流測定セルにおいて、米国特許６,２８４,１２５で開示された薄層セルは、作用電極と対向電極が互いに比較的近く置かれている。この場合、電場応答性種の拡散係数と濃度の両方を、互いの補助変数の事前知識無くして、測定することができる。
全ての実施の形態例において、作用電極の電位が、電場対応性種の濃度が作用電極でゼロに維持される（すなわち、通常拡散制限領域）ように設定される必要はない。電流の流れが少なくと電極への種の質量移送によって決定された部分に存在することだけは必要である。例えば、作用電極の電位は、電極への電場応答性種の質量移送の特別比率に対して、電極に到達した電場応答性種の量と、電極で電場応答性種の濃度で結論付けられた質量移送を介して電極に到達する量の平衡が、電場応答性種の体積濃度の５０％で維持されるように設定することができる。そして、電極への電場応答性種の質量移送が試料内の障壁形成により減じられる場合、平衡は、電極での電場応答性種の濃度が体積濃度の２０％であったポイントに移行する。そして、電極での電流の流れは、Butler-Volmer 方程式に示されるように変化し、それにより試料障壁形成の変化を伝える。
測定を達成するために直流電流を生成する電圧を用いる必要は無く、また、交流電流を生成する電圧を使用できる。例えば、矩形波あるいはサイン波電圧を印加できる。電圧波形に対する典型的な振幅と周波数は、それぞれ、３０ｍＶ，５Ｈｚである。これは、電圧が印加された電極の１つが 障壁形成を施すことができる試薬で覆われ、第二電極がそのような試薬の存在がなければ、特別な利点である。この場合、電流信号内の非対称を、全ての障壁形成発生の確固たる測定器として用いることができる。
本発明の実施の形態例において、電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるための障壁の測定は、以下に詳細に説明するように、測定された電流、濃度の測定あるいは拡散係数の少なくとも１つから得られる。一般に、方法は、凝集反応によって形成された障壁を測定することに用いられる。しかしながら、障壁は他の環境下でも形成し得る。例えば、障壁は他の凝集反応、電場応答性種電場応答性種を動けなくする反応あるいは低速移動種へ電場応答性種を結合する反応によって形成し得る。
関連の技術者は、本発明の実施の形態例が電流測定技術を採用することに共感するでしょう、電荷量測定技術も障壁形成の測定を得るために使い得る、つまり、電流の代わりに、作用電極を通過する電荷が測定され得る、（通常、時間に渡って電流を測定し、電荷を得るためにそれを積分する）。
本発明の実施の形態例の電流測定セルは、セルが満たされたとき液体試料に接触する作用電極、対向電極の少なくとも２個の電極を必要とする。また、その目的が、作用電極の電位を比較することができる基準電位を提供することになっている基準電極、第三の電極が追加的にあり得る。実際的に、基準はしばしば全く必要としないか、あるいは対向電極が、対向電極と共に基準の電極として機能するようにすることが出来る。ここで、文脈が別の方法を意味する以外は、「対向電極」という用語は独立の対向電極と対向基準電極の両方を意味する。
少なくとも、作用電極は、使用に関する条件の下で化学的にあるいは電気化学の酸化あるいは還元に不活性な材料を作ることが要求される。例えば、作用電極が陽極として利用されれば、電位で、それが用いられる化学的環境で、化学的あるいは電気化学的のいずれかに、酸化に不活性でなければならない。作用電極が陰極として利用されれば、電位で、それが用いられる化学的環境で、化学的あるいは電気化学的のいずれかに、還元に不活性でなければならない。陽極で用いるに適当な材料の例は、金、プラチナ、パラジューム、イリジューム、グラファイトカーボン、酸化インジューム、酸化錫、混合インジューム／酸化錫、ステンレス、水銀である。これら材料の混合物あるいは合金も、また陽極で用いるに適当な材料である。陰極で用いるに適当な材料の例は、陽極用に適当な上記記載の全てのものに加えるに、例えば、銅、スチール、ニッケル、アルミニューム、クロムおよび銀である。
発明の全実施の形態例において、対象成分、試験成分および少なくとも１個の電場応答性種が、障壁形成の測定を得るためにセル内に提供される。
ここで、用語「対象成分」は障壁形成試験の対象を参照することに使われる、それは未知の特性を有する成分である。一般に、対象成分は、障壁形成を試験されることになる液体試料の一部としてセルに提供される。試料は、また多孔性のゲルあるいはマイクロ孔膜内に保持され得る。しかしながら、関連の技術者は、状況を逆にすることが出来ること、つまり「対象成分」を、障壁形成を生じるその能力を決定するために試験にかけることができることを認識するであろう。
同様に、用語「試験成分」は、未知の特性を有する成分を参照することに使われ、そして対象成分を試験するために使われる。試験成分は、通常、対象成分を含む液体試料が導入される前に、セル内に存在する。しかしながら、それをまた、液体試料がセルに提供される前後に液体試料に加え得る。
「電場応答性種」は、セルに電流を流させるために作用電極で電子を交換する種である。
電場応答性種は、試験および対象成分間の障壁形成反応の生産物として提供され得る。一方、それは独立に液体試料に（あるいはセル自体に）導入し得る。
用語「目標成分」は、試験成分に反応する成分を参照するために使われ、それは対象に存在してもしなくても良い。
用語「凝集」は、広義の意味で使われ、凝集素への露出後、バインディングサイトから成る凝集可能種の凝集の過程を参照することに使われる。凝集素は、特に、１個以上の凝集可能種のバインディングサイトで相互に作用することができる物質であり、それにより、一般的に格子に似た構成内に凝集可能種を交差リンクする。特別な所望のアナライトに対して特異性を拘束することで凝集素を選ぶことにより、合成物の混合内の所望のアナライトの存在を検出することが可能である。
凝集反応は、一般に凝集可能種と凝集素の濃縮の合致を要求する。超過凝集素は、凝集可能種間の交差リンクの形成を許さずに凝集可能種のバインディングサイトを飽和させる。超過凝集可能種は、急速に凝集素を巻きつけ、凝集可能種間の交差リンクの可能性を減らす。関連の技術者は、容易に、特定の凝集反応に対して最適条件を決定することができる。
凝集反応は、所望の抗原に凝集素を提供することにより凝集可能種バインディングサイトの存在を検出するために使うことができる、例えば、赤血球の表面の血液型抗原、あるいは、適切な凝集可能種を提供することにより凝集素の存在を検出するために使うことができる、実例では、セル・サーフェース・マーカーへの循環抗体。従って、応用に依存して、「対象成分」は凝集素であり得る、そして対応の「試験成分」は凝集可能種であり得る、あるいは、逆に「対象成分」は凝集可能種であり、そして対応の「試験成分」は凝集素であり得る。
凝集反応に適当な種は、それらの表面で抗原を吸収したラテックスマイクロビーズ、コロイド状の金粒子、炭粒子あるいは赤血球などの特定のバインディングサイト種で覆われる微粒子のキャリアを含み得る。特定のバインディングサイト用の他の適当なキャリアは、交差リンクすることができる、あるいは電気化学セル内で拡散障壁を形成するために凝集することができるポリマーである。これらポリマーは試料マトリックス内で可溶性あるいは不溶性であり得る。
実例用の水溶性試料に対して、適当な不溶性ポリマーの例は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホンである。好ましくは、これらポリマーはマイクロ・フィラメント（細い繊維）の形である。水溶性試料用に適当な可溶性ポリマーは、４個が１組のアンモニウムグループを含む、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニール硫酸塩、ポリエステルスルホン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩、及びポリスチレンを含む。理想的にそのような粒子あるいはポリマーは、溶液中で容易に浮かせられる。特定のバインディングサイト用の他のクラスの適当なキャリアは、小さな分子であり、そこで、目標種の存在は、電場応答性種の動きを遅くする能力がある大きな種を形成するために小さな分子に交差リンクする。そのようなシステムの例は、デオキシコール酸ナトリウムが小さな分子であり。特定バインディングサイトは、デオキシコール酸の部分を作るカルボン酸グループであり、そして目標種は、デオキシコール酸に交差リンクを勧めるカルシウムである。一方、膠着種（agglutinate species）は、本質的にそれらの表面上の抗原を表現し得る、例えば、赤血球の表面で表現された血液型抗原、あるいはバクテリアか菌類かウイルス粒子などの微生物で表現された表面抗原。
凝集素は、好ましくは粒子と続く格子形成のあいだの交差リンクを可能にする異なる粒子上の、２個あるいはそれ以上の膠着種を結合する能力のある分子である。一般に、凝集素は免疫グロブリンを、特にＩｇＭおよびＩｇＧ免疫グロブリンを含む。そのような免疫グロブリンは、組織培養内で、腹水あるいは組み替え技術によって生成される血清あるいは単クローン抗体からのポリクローン抗体であり得る。ポリクローン抗体あるいは異なる単クローン抗体の混合は、同じ粒子上で異なる抗原性のエピトープス（antigenic epitopes）を結合するために使用され得る。分子が所望の抗原結合特異性を所有するそのような、免疫グロブリンアミノ酸配列を含む合成分子は、同様に熟考される。熟練の受信者は、抗体の抗原結合特異性を有する人工の抗体変体が、凝集反応内の凝集素としてまた関与できることを認識する。そのような変体は、２個あるいはそれ以上の抗原結合配列を有するキメラ分子を含む。そのようなキメラ分子の抗原バインディングサイトは、同じ抗原結合特異性を持ち得る、あるいは異なる抗原特異性を持ち得る。熟練の受信者は、キメラ分子が抗体あるいはレクチンのような他の分子あるいは両方からバインディングサイトを含むことが出来ることを認識する。抗原結合特異性を持つ他の分子は、また凝集素として使用し得る。例えば、レクチンは、端末の炭水化物の残留物への結合内の特異性を証明する、そして、これらは、例えば、それらがどんな１回でも１つ以上の抗原性粒子の表面で相互に作用可能なように、複数バインディングサイトを有する二量体か他のオリゴマーあるいはキメラポリペプチドを作ることにより、それらの未変更形かあるいは変更時のいずれかで凝集素として使用し得る。
本発明の１実施の形態例によれば、電流滴定セル内の電流の流れは、液体試料内で発生した障壁形成の測定を得るために使用される。電流の流れの大きさは、障壁形成の程度の存在を評価するために用いることができる。例えば、対象および試験成分の特別な量に対して、セル内の電流の流れは、実験データを用いる障壁形成値に較正することが出来る。時間での電流の大きさの変化は、また、試料の電場応答性種の拡散係数の測定、あるいは時間に渡って電場応答性種の拡散係数の変化を得るために使用される、それにより障壁形成の測定を得る。
大きさの変化あるいは大きさの比率は、障壁形成が生じた、かつ／また障壁形成の量の測定を得るかどうかを決定するために用いることが出来る。再び、これら測定を、特別な対象および試験成分に対して較正することが出来る。また、電気化学セルの空間的な障壁形成の相違が得られる。例えば、セルの１個の電極上あるいは近傍で障壁形成試薬の形式で試験成分を覆うことによって、しかし、第二電極上には無い、障壁形成の有り及び無しで通過した電流を評価することができる。発明のこの側面の１実施の形態例において、１個の電極の電位を、それがセルの作用電極および測定された電流の流れであるように設定できる。そして、電極間の電位を、第二電極が作用電極、また測定された電流になるように調整できる。作用電極の１個の上の試料が障壁形成試薬を含み、他の作用電極上の試料は含まないとすれば、２個間の電流は障壁形成を評価するために比較することが出来る。この実施の形態例は、サンプルマトリックス及びそれ以外に障壁形成の評価に影響するかもしれない周囲の試験条件の変化を許容する利点を有する。この実施の形態例は、また、単一電流滴定セル内の異なる種の、特に凝集、障壁形成の存在を検出するために使用し得る。そのような応用は、例えば、ａｎｔｉ−Ａ，ａｎｔｉ−ＢあるいはＲｈ抗体で覆われた３個の作用電極を用いることにより人間の赤血球の単一試料上の抗原Ａ，ＢおよびＲｈの決定を含むことが出来る。
発明の側面の特に好ましい実施の形態例において、電極構成は、２個の電極が互いに向き合って置かれて用いられる。この実施の形態例によれば、障壁形成試薬を含む試験成分が向かい合う電極の１つの表面を覆い、障壁形成試薬を含まない試験成分が向かい合う他の電極の表面を覆う。まず、障壁形成試薬の無い電極は、作用電極を作り、電流の流れを測定する、一方、他の電極は対向電極として動作する。そして、電位の極性は、反転され、他の向かい合う電極が作用電極になり、障壁形成試薬の存在中でその電流を測定する。この実施の形態例の利点は、電極層を試験成分で独立に覆うことが出来、容易な製造を許し、試験成分の交差汚染の機会が少ないということである。この実施の形態例が動作するためには、電場応答性種を障壁形成試薬に結合しなければならない。関連の技術者は、結合反応が厳密には凝集よりむしろ固定化の１つであることに共感するでしょう。この実施の形態例において、試験成分と電場応答性種は同じであり、そして対象成分は電場応答性種を固定化させる。一般に、そのような実施の形態例は、１個の固定化された電場応答性分子に対して１分子のアナライトを必要とする、だから、それは高濃度アナライトへ適用されるだけである。
発明のこの側面の別の特に好ましい実施の形態例において、上述の２個の向かい合う電極は、試験の間に対向電極の生成物が作用電極に到達するように、米国特許６，２８４，１２５に開示された形式の薄層セル内のように、置かれる、開示のものは、ここに参照で取り入れられている。米国特許６，２８４，１２５に開示されたそれらのようなセルにおいて、拡散係数を、用いられる作用電極領域か存在の電場応答性種の濃縮から独立して実質的に測定できる。作用電極、障壁形成試薬が覆われていないものと障壁形成試薬が覆われているもの、として互いに向かい合う電極を交互に用いることにより、そして拡散係数を得るために各場合で電流の流れを分析することにより、電極が前提領域を持ってない製造エラー、あるいは試料でセルを不完全に満たしているユーザのようなユーザ誤りにより依存しないで、発生する障壁形成のより直接的な測定を得ることができる。
本発明のこの側面の別の実施の形態例において、１個の電極のみが試験の間に作用電極として用いられる。この実施の形態例によれば、作用電極での電流の流れは、試料が検出セルに導入された後に、適当な短い時間で測定され、試料が検出セルに導入された後に、少なくとも１回の長い時間で電流の流れを比較する。適当な短い時間は、障壁形成の有意な量が目標成分の存在のセルで生じると期待される前の時間である。適当な長い時間は、障壁形成反応の重要な量が目標成分の存在のセルで生じると期待される時間である。
有意な障壁形成が発生すると期待される前の時間は、障壁形成測定補助変数の変化が約２０％より小さい、あるいは、より好ましくは障壁が試料内で完全に形成された時のその補助変数の総変化の約１０％より小さい時の時間である。
有意な障壁形成が発生すると期待される時間は、障壁形成測定補助変数の変化が約５０％より大きい、あるいは、より好ましくは障壁が試料内で完全に形成された時のその補助変数の総変化の約７０％より大きい時の時間である。
実際上、試料範囲と試験条件上の可能な障壁形成力学の範囲の考察によりこれらの時間は決定され、それにより装置が適用され、そして全体の範囲に適した時間を選ぶことになっている。一方、長期に渡り障壁形成測定補助変数の変化率を評価することにより、各個別試験に対する適当な時間が得られる。
技術的に明らかであるように、障壁形成測定補助変数の変化率、それ自身はまた、興味の試験種の存在あるいは欠如あるいは濃縮の測定として用いることができる。
異なる時間で測定電流を比較することにより、時試料マトリックあるいは試験を達成する温度に、より依存しないで発生した障壁形成の測定を得ることができる。
この実施の形態例によれば、試験期間中に対向電極からの反応生成物が作用電極に到達しないように、作用電極を十分に対向電極から離す場合において、短時間に電流を測定するために、短期間に電極間に電位差が印加される。そして、電場応答性種の濃度勾配の緩和返しを許容するためにスイッチが切られる。
そして、再度、電極間の電位差は、長時間で電流測定のために、長時間印加される。いくつかの場合で、これは、生じた障壁形成のより正確な測定に導くことが出来る。
この実施の形態例による発明を働かすには、それらが、有意な障壁形成なくして液体試料を示す電流信号を測定するために十分な時間を許容するに十分遅く、しかし、アナライトの存在下で障壁形成反応が所望の短時間で完了するように十分に早いような障壁反応力学であることを必要とする。
現在の発明のいくつかの実施の形態例は、セル内で発生できる障壁形成、特に凝集は、１個あるいは複数の抗原と１個あるいは複数の抗体の間の反応の結果である。試験成分は、１個の抗原あるいは抗体のどちらでも良く、または抗原あるいは抗体は、他の抗体または抗原である目標成分を持つ試験成分の一部から構成できる。
現在の発明のこの側面の好ましい実施の形態例において、試験成分は、過度の活性化なくして液体試料内に浮遊させることができるが、有意な障壁を拡散させるに十分に大きいような適当なサイズと機能である。適当な試験成分の例は、試料液内で可溶性であるポリマーに結合した、あるいは小さな不溶性のビーズか繊維に結合した抗原あるいは抗体である。適当な可溶性ポリマーの例は、ポリ(アクリル酸)、ポリ(ビニール硫酸塩)、ポリ(スチレンスルホン酸塩)及びポリ(ビニルアルコール)である。不溶性のビーズか繊維に使用する適当な材料の例は、ポリスチレン、ラテックス、あるいは(ポリアクリルアミド)である。一方、抗原あるいは抗体は、赤血球か懸濁液の細菌細胞のように、セル（細胞）の表面にあり得る。
試験成分は、有意な障壁を自身拡散させるに十分に大きくある必要は必ずしもない例えば、目標成分が有意な障壁を拡散させるに十分なサイズであれば、試験成分はとても小さくて良い。そのような目標成分の例は、セル表面の抗原であり、そこで、試験成分はセル表面抗原への抗体であり、セルを凝集させる。セルあるいは凝集粒子であるセルにその導入に先立つ試料内に浮遊した他の粒子の場合において、粒子は、試験期間中それらが実質的にセル内で安定しない、少なくとも非凝集形式であるような適当なサイズかつ／又は密度のみが必要である。
本発明のこの側面の別の実施の形態例は、目標成分に結合するようなセルのような比較的大きい粒子に結合できる種であり得る、この実施の形態例によれば、目標成分は、少なくとも２個の試験成分に結合することにより、そしてそこで各試験成分はまた別の粒子に結合され、粒子は障壁を形成する、そのように１個以上の試験成分に結合できる。
いくつかの実施の形態例において、液体試料を加工するために試験成分は、電気化学セル内に乾燥化される。試験成分は、少なくともセルの１個の電極あるいはセルの不活発な壁に接触して乾燥化されることができる。一方、試験成分は、電気化学的セルに導入する前に、試料が接触し、試験成分を溶かすような場所のセルの外側で乾燥化されることが出来る。試験成分は、それ（あるいはそれら）が液体試料と接触するとき、電場応答性種を形成する電場応答性種あるいは種を構成することが出来る。一方、電場応答性種がすでに試験すべき試料内にあるかもしれない。電場応答性種は既知の濃度であり得る、しかしながら、これは、いくつかの具体例で機能するために本発明のいくつかの実施の形態例に対して必ずしも必要とされない。例えば、電場応答性種の拡散係数が、前述に記載したように薄層セルを用いて計測されれば、測定は実質的に電場応答性種の存在の濃度に独立である。同様に、電流信号の比較がなされば、比較はしばしば電場応答性種の存在の濃度に独立である。電場応答性種は、試料内で可溶性および可動性でなければならない。適当な電場応答性種の例は、Ｆｅ（ＣＮ） ６ ３− 、Ｆｅ（ＣＮ） ６ ４− 、Ｃｒ ３＋ 、Ｃｒ ２ Ｏ ７ ２− 、Ｃｕ ２＋ 、Ｃｏ（ＮＨ ３ ） ６ ３＋ 、Ｃｏ（ＮＨ ３ ） ６ ２＋ 、Ｓｎ ４＋ 、Ｉ − 、Ｂｒ − である。
この電場応答性種と同様に、試験成分は、また、この種が対向電極で反応することにより電気化学的回路を完成するために必要とされる電場応答性種、あるいは第二の可溶性電場応答性種へ可溶性酸化還元共役酸化剤あるいは還元剤を含み得る。好ましくは、この第二の可溶性電場応答性種は、それが電気化学的セル内の電流の流れを制限しないような第一の可溶性電場応答性種に関連する超過内にある。他の構成において、対向電極は、従来技術で知られた不溶性種を酸化あるいは還元することにより回路を完成し得る。そのような対向電極に適当な材料の例は、銀／塩化銀、銀／臭化銀、水銀／塩化第一水銀、水銀／硫化第一水銀である。
追加的に、試験成分は、また、ＰＨを制御するための緩衝剤を含み得る、そして試薬と、製造と検出器の有用性の側面を助けるように設計された他の添加剤を安定化し得る。例えば、界面活性剤とポリマーは、例えば、セルの表面の親水を変更することにより、製造期間中にいかに乾燥試薬を形成するかを改善し、かつ／またセルを試料で満たす方法を改善するために加え得る。適当な緩衝剤の例は、燐酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、シトラコネート（citraconate）、クエン酸塩、及びメリテート（mellitate）である。適当な界面活性剤の例は、トリトンX-100、トゥイーン（tween）、Brij 35、Brij 20 pluronicsである。使用する液体試料あるいはセル試験成分がタンパク質を含む時、界面活性剤は、それが、テストを妨げることができるようにタンパク質を変質しないようにすべきであることに留意しよう。ヘモグロビンを酸化させることができる試験成分内に酸化剤がある状況において、開放ヘモグロビンが酸化され、検出器電流信号を妨害し得る時、界面活性剤は赤血球を溶解すべきでない。しかしながら、この規範は、凝集の測定が実質的に電場応答性種の存在に独立である実施の形態例においては、さほど重要ではない。
本発明を用いるための好ましい実施の形態例において、目標成分のための試験する液体の試料は、少なくとも２個の電極、つまり作用電極と対向電極あるいは逆の／基準の電極と乾燥試験成分を含むセルに導入される。セルを充てんすることで、液体試料は少なくとも部分的に乾燥試薬を溶解させ、そして目標成分が存在すれば、目標成分は液体内の種の障壁を形成するために相互に作用する。障壁形成の発生は、セル内の電極間の電流の流れの特性を測定することにより監視される。電流を電極間に流すために、電位差が作用電極と対向電極間に印加される、ここで、電位差は、作用電極／溶液インタフェースで起きる電気化学的な酸化あるいは還元反応、そして対向電極／溶液インタフェースで起きる対応の酸化あるいは還元反応を生じさせるに十分大きい。更に、電極間の電位差は、実効的ゼロで作用電極／溶液インタフェースで酸化あるいは還元される種の濃度を維持するために十分高くあるべきです。障壁形成測定手段は、一般に電流から障壁形成の測定を決定するための装置を完成する。
上述のように、発明の別の実施の形態において、１個あるいはそれ以上の試験成分が液体試料に存在することが出来、あるいは液体試料がセル内に導入される前に液体試料に加えることが出来る。
他の実施の形態例において、液体試料は、障壁形成反応が起きるアガロースゲルのような多孔性のゲルであり得る。別の可能性は、障壁形成反応が電極を覆うマイクロ多孔性膜内で起きることである。これらの構成は、障壁が形成されるなら、ビーズを小孔に浮遊させ、それらを阻止することができるように障壁形成剤内で被覆されたビーズの使用をより間単にし得る、それゆえ、試料内でビーズが簡単に止められなければならないという要求は取り除かれる。
いくつかの実施の形態例において、１個以上の電気化学的セルが、単一の装置で複数の障壁形成反応の測定を許容するために単一の装置に組み入れられる。
発明のこの側面の一実施の形態例において、別々の電気化学的セルが、別々のセル内の少なくともいくつかの作用電極が外部電気回路に別々に接続されるように形成されることが出来る。この方法で、別々に接続された作用電極での電流の流れは、別々に監視できる。一方、電場応答性セルは、マイクロアレイあるいは複数の試験成分を提供するための他の既知の構成として提供し得る。
本発明のこの側面の好ましい実施の形態例において、別々の電気化学的セル内の作用電極は、それら全てが同じ接続を介して電流測定回路に接続するように配置される。これは、セルが、単発利用、その後廃棄用に設計されているときに特に好ましい。例えば、装置は、複数のセルを含むストリップでよく、それはメーターに挿入され、試料の分析に使用され、その後ストリップは廃棄する。そのような単発利用装置において、ユーザやメーターの複雑さにストリップを供給するコストを低く保つことが望ましい。
本発明のこの側面のこの実施の形態例の使用方法の例は次のようである、試料が第一セルに導入され、そして、試験のこの部分の終わりで第一セル内の電流が知られ、そしてより長い時間で予測できるそのように凝集の発生を表す電流測定が行われた。
そして、第二セルが試料で満たされ、第二電流測定がなされ、それが第二セル内の障壁形成発生を表す。第二セル内の電流を正確に測定するために、第一セルに流れる既知の電流が、総電流の流れから差し引かれる。第二セルの障壁形成発生の測定が完了した後、もし同一装置上の更なるセルが用いられるのであれば、第一および第二セル内の電流の流れは、それらを第三セルが満たされたとき電流の流れから差し引くことが出来るように、既知状態である必要がある、以下同様。
複数セルの好ましい実施の形態例において、セルは薄層電気化学的セルである、それゆえ、適当な時間後、前に満たされた全てに電流が流れ、そして障壁形成セルは実質的に一定であり、満たされた最新のセル内の電流の流れから前に満たされたセルの電流の更に正確な減算を許す。
本発明の側面を説明するために、血液型決定のための応用例が与えられる。この応用において、血液の型を決めるために赤血球の表面上の３個の抗原の存否を得ることは一般的である。抗原は、Ａ抗原、Ｂ抗原とＲＨ抗原である。
発明の実施の形態によれば、要求された測定は、３個の別々の装置、あるいはより好ましくは、ここでストリップと称した同じ装置上の３個のセルを持つ単一の装置によってなされる。別々のストリップ上あるいは同一のストリップ上のセルの場合において、１個のセルは、Ａ抗原への抗体の形式の第一試験成分を含み、第二セルは、Ｂ抗原への抗体を含み（第二試験成分）、そして第三セルは、ＲＨ抗原への抗体を含む（第三試験成分）。使用において、ストリップは、電気回路にストリップ電極を接続した接続装置を持ったメーターに挿入される。電気回路は、少なくとも電極間に所望の電位を印加し、そして結果の電流を測定することができる電源によって完成される。好ましい実施の形態例において、メーターは、また、測定された電流信号を分析し、結果を表示し、結果を蓄積し、他の装置とやり取りをする能力を有する凝集測定手段を含む。
凝集測定手段は、変更された電流計であり得る。メーターは、所望の時間で電流測定を減算するためのサンプリング（標本化）手段を含み得る。
この例において、セルの電極は互いに向かい合って置かれ、そして約１００ミクロン離される。１０ｍＭ（ミリモル）のカリウムフェロシアン化物から成る試薬は、全３個のセルの上側の電極にコーティング（塗る）され、１００ｍＭのカリウムフェリシアン化物から成る試薬と抗体は、下側の電極をコーティングする。抗体は、第一セルのＡ抗原に、第二セルのＢ抗原におよび第三セルのＲＨ抗原に対してである。
使用において、ユーザは第一セルを全血液の試料（目標成分）で満たし、そして３００ｍＶの電位を、上側電極が陽極、つまり作用電極、下側電極が陰極、つまり対向電極のように、電極間に印加する。電流が記録され、そして数秒後の電流が、凝集反応が起きる十分長い時間で記録された電流と比較された。作用電極上に凝集試薬が無いことにより、作用電極近くの凝集反応の始まりは遅らされ、非凝集試料を表す電流を記録するための十分な時間を許す。もし、短時間での測定に対する長時間での測定された電流の比が事前閾値の値より少なければ、Ａ抗原（目標成分）の存在が検出される。
第一セルの試料のA抗原の検出のために、一度適当な時間が経過し、もし存在すれば、メーターは、ユーザに同じ血液の別の試料で第二セルを満たすことを示す。このとき、第一セルの電流は、予測可能な方法の時間で安定な値あるいは変化のどちらかであることに留意する。一度ユーザが試料で第二の窪みを満たせば、第一および第二セルの全体電流の流れに応じた第二の電流軌跡が記録される。そして、メーターは、第二セルのための電流に到達するために、第一セルからの既知電流を差し引く。前のように、この電流は、短時間で、および凝集が生じているかどうかを検出するために長時間で検査される。
第二セルのＢ抗原の検出のための適切な時間後、メーターはユーザに同じ血液の別の試料で第三の窪みを満たすよう指示し、そして第一と第二セルの既知電流が、第三セルの電流を与えるために、全体電流から差し引かれる。電流は、上記のように、凝集が生じているかどうかを検出するために検査される。
３個の結果から、血液型Ａ，Ｂ，ＡＢおよびＯを、分析されている血がＲｈプラスあるいはマイナスであるかどうかと共に確定することが出来る。
血液試料は、毛細管血、静脈血あるいは動脈血で良いことに留意。
発明の好ましい実施の形態例
適当な複数セル（マルチ・セル）ストリップが、図１Ａおよび図１Ｂに描かれる。図１Ａは、装置の上面図を示し、図１Ｂは装置の断面図を示す（一定縮尺ではない）。
ストリップ１０は、それらの内面にコーティングされた電極層２３および２４を有する上側層と下側層２１および２２の間に挿入された絶縁スペサー層２０内に切り抜きを入れることにより、その中に形成されたセル１、２および３を有する。接続ポイント４は電極層をメーター（図示せず）の外部電気回路に接続するために用意される。必要な測定を達成するための適切な回路は、技術者により簡単に考案することができる。試験成分（図示せず）は、窪み１，２および３の登録（位置）で層２３および２４の内面上に乾かされる。
例、例１−カルシウム用凝集センサー
カルシウム用凝集センサーは本発明の効率を決定するためのモデルとして開発される。
金（ゴールド）電極が、厚さ０．００７インチのＭｅｌｉｎｅｘ４５３（登録商標）の上に厚さ３０ｎｍ（ナノメーター）の金コーティングをスパッタリング（飛ばす）することにより用意される。
４４ｍｇ／ｍＬのデオキシコール酸ナトリウム、２１４ｍＭのカリウムフェリシアン化物と０．１１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ ＰＥ６２００から成る溶液が２７％のエタノール／１．５％のイソプロパノール／７１．５％の水内に提供された。この溶液は金電極に塗られ、乾かされた。
長方形の穴は、厚さ１０７mｍ（マイクロメーター）の両面接着テープから切り抜かれた。テープは、穴が乾燥した化学的性質を覆うような方法で金電極に貼り付けられた。上記試薬が塗られた第二金電極は、テープの他方側に貼り付けられ、それにより反対の電極を持つ電気化学的セルを形成する。３個の薄層が、電極の面積がうまく定められる（０．０９８５ｃｍ2）ように切られ、そして長方形穴の終端に、試料入場ポートおよびセンサーを満たすための空気出口口として働く開口がある。
２個の電極はポテンシオスタットに取り付けられ、０−３０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む９ ｍＭのカリウムフェロシアン化物の溶液が電気化学的セルに負荷された。
−０．３Ｖの電位が２５秒間印加され、それから＋０．３Ｖが１０秒間印加された。電流は、＋０．３Ｖが印加された後、０．１秒で測定された。溶液を含む種々のカルシウムに対する電流は図２に示される。
例２−レンニン（凝乳酵素）の蛋白質分解の活動用センサー
凝集反応の別々の型は、ミルクの上の酵素レンニンの動きにより提供された。
レンニンが、不溶性タンパク質を作るためにミルクのカゼイン（乾酪素）から離れた親水性の燐酸化されたペプチドを分解する。そして、このタンパク質は凝集し、更なる処理の後、ヨーグルトかチーズを形成できる。
レンニン用センサーは、電気化学的セル内の電場応答性種と混合されたダウンミルクあるいはカゼインを乾かすことにより提供される。セルに導入した液体が活性レンニンを含めば、そして続いて起きる凝集は、電極間に電圧を印加し、過渡電流を分析することにより検出できる。
例３、例２で述べられた酵素分析は、洗浄ステップを伴わず、固定されたタイミングステップを持たず単一の部屋（チャンバー）内で達成される免疫学的検定に使用することが出来る。
この免疫学的検定の機能を図３に示す。センサーは、電極あるいは平らなポリマーあるいは他の面であり得る上側の面３０と下側電極３１を有する単一の部屋から成る。下側の電極３１は、ガゼイン（ミルクタンパク質）のコーティングを備える。上側の面３０は、抗体―抗原―レンニン層を形成するために、抗体の上の抗原バインディングサイトに非共有結合した抗原―レンニン３４共役を有する固定された抗体３３（Y形状構造で示す）のコーティングを備える。酸化還元の組の酸化されたおよび還元された形式の混合は、例えば、フェリシアン化物とフェロシアン化物の混合、は下側かつ／あるいは上側電極／面に塗られる。
抗原の未知の濃度の流れが部屋に導入されるとき、自由抗原は、抗原―レンニン共役結合を競って分離することができる。そして、共役はガゼイン層に拡散し、下側の電極３１の隣の障壁層を形成しているカゼインの凝固を始める。
凝集の過程は、固定電圧を印加し、電流を監視することにより連続して続けることができる、あるいは、酸化還元種の酸化あるいは還元の拡散効率は、この応用のどこにでも記載されているような電圧パルス列の印加により種々の時間で監視することができる、あるいは、電圧の極性は簡単に反転でき、ピーク電流は時間で監視することができる。大きさと下側電極での電流の流れの変化率は、時間での凝集の進行の範囲に一致し、それは、次々にガゼイン層に到達する抗原―レンニン共役の量に比例する。これは、次々に、試料溶液内にあった抗原の濃度に比例する。
ここに記載した発明の趣旨を逸脱しない範囲で本発明に種々の変形がなし得られることは、当該分野の技術者には明らかであろう。
Ａ 好ましい実施の形態例の複数セル装置を示す。 Ｂ 好ましい実施の形態例の複数セル装置を示す。 例２の異なったカルシウム溶液用の電流のグラフである。 例３の免疫センサーを示す。
符号の説明
１，２，３・・・セル、４・・・接続ポイント、１０・・・ストリップ、２１・・・上側層、２２・・・下側層、２３，２４・・・電極層

Claims (39)

  1. 電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるための障壁の形成を測定する方法であって、
    作用電極と作用電極から離れた対向電極を有する電気化学的セルを備え、
    前記セル内に対象成分、試験成分および少なくとも１種類の電場応答性種を提供し、対象および試験成分が、電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるために凝集反応により障壁の形成を引き起こすように意図され、
    作用電極への測定される電場応答性種の質量移送比率に関連する電流を生成するために十分な電位を作用電極と対向電極間に印加し、
    電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるために障壁の形成の測定を得るために作用電極で電流を測定する、ことから成る方法。
  2. 障壁の形成の測定が凝集の程度の決定に用いられる
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 印加電位は、作用電極で電場応答性種の濃度をゼロに維持するに十分である
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 電流測定の段階は、１回目、有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれる前に電流測定し、そして、２回目、再度有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれるときに電流測定することから成り、測定された相違から障壁形成の前記測定を得る
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 障壁形成の測定に使用される補助変数に変化があるとき、あるいは障壁が完全に生成された時の前記補助変数の総変化の約２０％よりも少ないと見積もられる時を１回目に選ぶことを含む
    請求項４に記載の方法。
  6. 障壁形成の測定に使用される補助変数における変化が、総変化の約１０％よりも少ない
    ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 障壁形成の測定に使用される補助変数に変化があるとき、あるいは障壁が完全に生成された時の前記補助変数の総変化の約５０％よりも多いと見積もられる時を２回目に選ぶことを含む
    請求項４に記載の方法。
  8. 障壁形成の測定に使用される補助変数における変化が、総変化の約７０％よりも多い
    ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 長い間に渡って障壁形成の測定に使用される補助変数の変化率を評価することによって前記１回目と２回目を選択することを含む
    請求項４に記載の方法。
  10. 測定された電流における相違が電場応答性種の拡散係数の測定を得るために使用され、それにより障壁形成の測定を得る
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 測定された電流における相違が拡散係数の変化の測定を得るために使用され、それにより障壁形成の測定を得る
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. セル内に対象成分を含む液体試料を導入することにより対象成分を提供する段階が実行される
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  13. セル内に液体試料を導入する前に、液体試料に試験成分を導入することにより試験成分を提供する段階が実行される
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 液体試料を導入する前に、セル内に試験成分を導入することにより試験成分を提供する段階が実行される
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  15. セル内に試験成分を乾燥させることにより、セルに試験成分が導入される
    ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  16. 試験成分と対象成分間の反応の進行又は結果により前記電場応答性種を提供することから成る
    請求項１に記載の方法。
  17. 試験成分を供給することにより前記電場応答性種を提供することから成る
    請求項１に記載の方法。
  18. 電場応答性種は障壁形成反応により提供され、方法は更に、作用電極として働くことが出来る２個の電極と、２個の電極の１つにあるいは近傍に試験成分を備えることから成り、方法は更に、前記作用電極間を切り替えるために印加電位あるいは電流測定回路接続を変えることから成り、そして双方の作用電極で電流を測定し、それにより障壁形成の測定を得る、
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  19. 障壁形成を測定するために、電流が測定され、電荷量の測定を得る
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  20. 対象および試験成分は、前記対象成分が目標成分から構成されるとき、障壁形成を引き起こすように意図され、そして方法は更に、前記目標成分が障壁形成の測定から存在するかどうかを決定することから成る
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  21. 作用電極と作用電極から離れた対向電極を有する電気化学的セルを備え、
    前記セル内に、目標成分から構成されるかあるいは構成されない対象成分、試験成分および少なくとも１種類の電場応答性種を提供され、目標成分が存在する時、対象および試験成分が電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるために凝集反応により障壁の形成を引き起こすように意図され、
    作用電極への測定される電場応答性種の質量移送比率に関連する電流を生成するに十分な電位を作用電極と対向電極間に印加し、
    電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じる障壁が生成されるかどうかを決定するために作用電極で電流を測定する、それにより前記対象成分に目標成分が存在するかどうかを決定する、ことから成る対象成分内に目標成分が存在するかどうかを決定する方法。
  22. 障壁の形成の測定が凝集の程度の決定に用いられる
    ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  23. 作用電極で電場応答性種の濃度をゼロに維持するに十分な電位を印加することから成る
    請求項１に記載の方法。
  24. 電流測定の段階は、１回目、有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれる前に電流測定し、そして、２回目、再度有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれるときに電流測定することから成り、測定された相違から障壁形成の前記測定を得る
    ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  25. 障壁形成の測定に使用される補助変数の変化が、障壁が完全に生成された時の前記補助変数の総変化の約２０％よりも少ない時に一致して１回目に選び、
    前記補助変数の変化が、前記補助変数の総変化の約５０％よりも多い時を２回目に選ぶことから成る
    請求項２４に記載の方法。
  26. １回目と２回目は、それぞれ総変化の約１０％より小さいか、約７０％より大きいかに応じて選択される
    ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  27. 測定された電流における相違から電場応答性種の拡散係数の測定を得、それにより障壁形成の測定を得ることから成る
    請求項２１に記載の方法。
  28. 更に、測定された電流における相違から拡散係数の変化の測定を得、それにより障壁形成の測定を得ることから成る
    請求項２１に記載の方法。
  29. 電場応答性種は障壁形成反応により提供され、方法は、作用電極として働くことが出来る２個の電極と、２個の電極の１つにあるいは近傍に試験成分を備えることから成り、方法は更に、前記作用電極間を切り替えるために印加電位あるいは電流測定回路接続を変えることから成り、そして双方の作用電極で電流を測定し、それにより障壁形成の測定を得る、
    ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  30. 作用電極と前記作用電極から離れた対向電極を有する電気化学的セルであって、対象成分、試験成分および少なくとも１種類の電場応答性種を前記セル内に受け取るために適応され、対象および試験成分は、少なくとも１種類の電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じるために凝集反応により障壁の形成を引き起こすように意図される電気化学的セルと、
    前記作用電極への測定される電場応答性種の質量移送比率に関連する電流を生成するに十分な電位を前記作用電極と前記対向電極間に印加するための電源と、
    前記作用電極で電流を測定するための電流計と、
    測定された電流から前記少なくとも１種類の電場応答性種の動きへの障壁形成の測定を決定し、それにより凝集の測定を決定する、ための障壁形成測定手段と
    を有する電場応答性種の動きを制限するかあるいは減じる障壁の形成を測定するための装置。
  31. 前記障壁形成測定手段が、凝集の程度の決定に用いられる
    ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
  32. 電気化学セルは、更に、前記作用電極及び前記対向電極と別個に基準電極を有する
    ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
  33. 対向電極は、基準電極を兼用する対向基準電極である
    ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
  34. 更に、前記装置が対象成分内の目標成分の存在を検出するために利用されるとき、障壁形成の測定に基づいて試験成分の存在を検出するための検出手段を備える
    請求項３０に記載の装置。
  35. 前記電流計は、１回目、有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれる前に、そして、２回目、有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれるときに電流を測定し、測定された電流における相違から前記障壁形成の測定を得るために構成される
    ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
  36. １回目および２回目で電流計から電流をサンプリングするサンプリング手段を更に備え、１回目は有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれる前であり、２回目は有意な障壁形成がセル内で起きることが見込まれるときであり、前記障壁形成測定手段が、電流の相違から障壁の形成の測定を決定する
    ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
  37. 前記障壁形成測定手段は、電流の測定から電場応答性種の拡散係数の測定を決定し、それにより障壁形成の測定を得る
    ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
  38. 前記障壁形成測定手段は、拡散係数の変化の測定を行うために測定された電流の相違を用い、それにより障壁形成の測定を行う
    ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
  39. 作用電極として働くことが出来る２個の電極と、双方の作用電極で電流の測定を得るために作用電極を切り替えるために印加電位あるいは電流測定回路接続を変えるための手段を備える
    ことを特徴とする請求項３０に記載の装置。
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