TWI338009B - Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof - Google Patents

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TWI338009B
TWI338009B TW091125173A TW91125173A TWI338009B TW I338009 B TWI338009 B TW I338009B TW 091125173 A TW091125173 A TW 091125173A TW 91125173 A TW91125173 A TW 91125173A TW I338009 B TWI338009 B TW I338009B
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Liliana Nieves Esperanza
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Description

1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23日） 4 六、發明說明： > j 相關之其他申請案
本申請案之先前申請案，乃Jiao，J等人之美國臨時 申請案USSN 60/343,306號’案名：抑制血液凝結之抗體 及其使用方法’申請日為2001年1〇月29日，相關於1999 -年4月16日申請之美國專利申請案09/293, 854號，乃USSN .08/814,806號之分割案（即今之美國專利案第5,986,065 號）。於2001年1〇月29曰申請之美國臨時申請案USSN # 60/343,306號，美國專利申請案第〇9/293,854號及美國 專利案第5, 986, 065號，所揭示之内容均併此作參考。 【發明所屬之技術領域】 本發明為有關新穎之人類組織因子抗體及以此等抗體 抑制組織因子相關之功能（如血液凝結、企管生成、腫瘤轉 移及發炎）之方法。尤其，本發明為有關新穎之抗體，該抗 1 體能以高度親和力專一性結合人類組織因子，且能防止因 »* φ子X或因子IX結合及活化。本發明之抗體有用於多種方 面’特別是於活體内降低血液凝結方面。 【先前技術】 . 金塊能使血液流失減至最低，而幫助惶定性。通常， ' 血塊需要血管損害、血小板凝結、凝結因子活化及纖維蛋 白分解抑制。凝結因子幫助由血管損害至血塊形成之串連 (參見 L. Stryer，生物化學（Biochemistry)，第 3 版，W. H. Freeman公司，紐約；及A · G · Gilman等著，治療學 之藥理基礎（The Pharmacological Basis of 4 92214(修正版) 1338009 观导利申請索 月 2 3α、'
Inc.出版，紐約，
Therapeutics)，.第 8 版，McGraw Hill 1311 至 1331 頁）。 一般而言，因子X(FX)活化成因子Xa(FXa)(或因子Ιχ 活化成因子I Xa )，於血液凝結過程中屬轉捩步驟。通常， FX(或FIX)由結合包含“組織因子”（TF)之催化活性複合 體而轉化成FXa(或FIXa)°TF係控制表現性細胞膜蛋白 質’可結合因子V11 /V11 a產生催化活性複合體（tf : FVI la)。血塊隨著凝血酶原（pr〇thronibin)之FXa-媒介（或 FIXa)活化作用產生。血塊能以TF失活化成非天然型，乃 未能最適產生TF : FVIIa複合體者，而減至最低程度。咸 信由形成FXa(或FIXa)之凝結串連過度活化，而產生各種 栓塞（包含再狹窄）。 …血栓可能與侵入性醫學處置有關，例如心臟手術（如， 血s成形術）、腹胸手術、動脈手術、末稍血管分流移植術、 器=部署（如，移植模或導管）、或動脈内臈切除術。再則， 血检可伴隨多種血栓性栓塞障礙及凝A病變，分別例如中 ::肺栓塞(如’拴塞之心房纖維顫動）、冠狀動脈病症或 症候群（如’不穩定性絞痛或心肌梗塞）、動脈粥 :或其他㈣礙、深祕血妓散布性血 i體液=體轉作亦可導致賴狀餘，尤其是輸血 腎透析。樣’以及體外循環之處置（如’心肺分流手術）及 λ抗凝血劑常用以減輕或避免血塊連合血栓。通常藉由 技予合宜之抗凝血劑或其混合物可使血塊減至最低或消 92214(修正版) 5 1338009 第91125173號專利申請索 (99年9月23日> 除，該合物包含· 一種或多種香豆素衍生物（如，華法令 - (warfarin)、華法令納（(2011111&(^1：1)或雙經香豆素 (dicumarol))或帶電聚合物（如，肝素（heparin)、低分子 量肝素、水蛭素（hirudin)或水蛭肽（hirulog))或抗血小板 劑（如，里歐普（ReoPro)、積谷利（integrilin)、凝斯大 ‘ (A找restat)、普拉韋（Plavix)、提可利（Ticlid)或阿斯匹 靈（aspirin))。見如 Gi 1 man 等著，同前，R. J. Beigering 等著，血液學年刊（Ann. Hematol. )，72期：177頁（1996 鲁年）’ J. D. Willerson，循環（Circulation) ’ 94 期：866 頁（1996 年）。 然而’抗凝金劑時常伴隨副作用，例如：出血、再吸 凝、白色血塊症候群、刺激、先天性缺陷、血小板減 少症及肝機能障礙。長期投予抗凝血劑特別會增加危及生 命之病症（見如Gil man等著，同前）。 t 有些具抗血小板活性之抗體，亦可用以減輕各種血 籲栓。例如，ReoPro®TM為治療性抗體片段，常規投予乃能減 車工各種血检性血检p爭礙’例如由血管成形術、心肌梗塞、 不穩定性絞痛及冠狀動脈狹窄而來者。此外，Re〇pr〇®可用 作預防劑，以減低心肌梗塞及絞痛之風險τ.
Willerson ’ 循環（Circulation)，94 期：866 頁（1996 年）； M. L. Simmons 等著，循環（Circulation) ’ 89 期：596 頁 (1994 年））。 有些抗凝血抗體亦為周知。尤其，有些TF-結合之抗 體據報導，能抑制血液凝結，可能係藉干擾催化活性TF : 6 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日> FVlIa 複合體而成如 Jeske 等著，SEM in THROM and HEMO，22 期：213 頁（1996 年）；Ragni 等著，循環 93 期： 1913頁（1996年）；歐洲專利案第〇 420 937 B1號；W, Ruf 等著，Throm. Haemosp.，66 期：529 頁（1991 年）；Μ. Μ.
Fiore 等著，血液（Bl〇〇d)8 期：3127 頁（1992 年））。 然而，目前之TF-結合抗體展示顯著缺點，使其作為 杬凝血劑之合宜性減至最低。例如，目前之τ卜結合抗體， 就最適抗凝血活性言，未展示足夠之結合親和力。因此， 就諸多血栓病況言，為彌補此等無效之結合親和力，必須鲁 才又予未此接受之尚水平抗體，以使血凝減至最低。 因此，需要一種以高度親和力及選擇性結合天然人類 TF之抗凝血抗體，以抑制不理想之血凝及血塊形成。又需 要此抗凝血抗體，以防止时χ(或因子ιχ)結合成丁卜 FVIIa複合體。 【發明内容】 現在，吾等發現以高度親和力和專—性， TF結合，祕供❹減血活性之邱之抗體。树明之 抗體=於活體内有效抑制血液凝結。本㈣之抗體能盘單 獨形式之天然人類TF^TF:FVUa複合體形式之天“ 類TF結合，有效防止因子χ(或因子ιχ)結人 · 合體，而降低血液凝結。 σ F或”複 本發明較佳之抗體為單株系，專一性結 TF之構形抗原決定部位主體，此 以人類 之強勢抗聽合位。實際上，本發提供意料外 季又佳之抗體結合至天 92214(修正版) 7 1338009 第911251V3號專利申請案 (99年9月 23日） 然人類TF，與習知抗凝抗體所展示之絲合親和力比較，至 少約5倍以上’更典型至少約1 〇倍以上。此外，本發明較 佳之抗體會選擇天然人類TF，實質上幾乎不結合非天然或 變性TF。H36. D2. B7(由融合瘤ATCC HB-12255分泌，常稱 作H36)為本發明尤佳之抗體。 本發明較佳之抗體會結合TF ’使得1^(或Fix)不能有 效結合至TF : FVIIa複合體，乃使fx(或FIX)不能有效轉 變成其活化型（FXa或FlXa)。本發明較佳之抗體能有效嵌 阻FX(或FIX)結合或接近分子，而抑制TF功能。參見 例如，實施例3之結果如下。 本么明較佳之抗體，亦不能明顯抑制於TF或因子v η a 間之又互作用或結合’或抑制關於及因子以外物料 之TF : FVIIa複合體活性。參見例如實施例4之結果如下。 •本發明亦提供編碼本發明抗體之核酸。而H36 D2 b7 可變區之核酸及胺基酸序列（SEQ ID: N〇s ^)，係如第 鲁1A及1B圖所示。 較佳方面，本發明提供抑制血液凝結及血塊形成之方 法’及降低人類TF水平之方法。 通常，本發明之抗體，有用於實際上調節㈣（或即 ^至TF或TF ; FVIIa複合體媒介之任何生物性反應，包 各.上述血液凝結、發炎、腫瘤血管生成及轉移，及並他 病症。 八 本發明之抗體尤其有用於減輕各種血检，尤其能預防 s P制由侵人性醫學處置如動脈或心臟手術（如，血管成形 922〗4(修正版) 8 1338009 第911251"73珑專利 (99 年 9 月 23 ^ 術）而來之再狹乍k或莫他血栓。本發明之抗體亦可用以減低 或甚 ^閉塞，此乃於非手術心血管狀況，包 含但不、限於=狀動脈病症、急性冠狀症候群（如，不穩定絞 痛及。肌梗^ *動脈粥樣硬化而來者。本發明之抗體亦可 用以減低或至有致消除血液凝結，此乃用醫學器具（如， 導管、移植模或其他醫學裳置）而來者。本發明較佳之抗 體’可與料抗凝血劑、抗血小板劑及溶解血栓組成物相 配σ以、4。^ ,而加強或延長抑制血液凝結。 本發明抗體亦可用作哺乳類，尤其是人類體外循環之 抗凝血劑。依此等方法，—或多種本發明抗體，於例如心 肺分流手術、ϋ官㈣手術或其他延長手料，進行體外 循環之期間或之前’以足量投予人類’而抑制血液凝結。 本發明之抗體亦可用作藥物載劑，尤其是與血塊作用 目標之藥物，例如鏈球菌激酶、組織胞漿素原活化劑（t_pA) 或尿激素。同樣地，本發明抗體可用作使合宜毒素接合至 抗體之細胞毒素劑。本發明抗體共軛物亦可用以減輕哺乳鲁 類尤其人類之組織因子水平，其係藉由投予哺乳類有效量 之本發明抗體，而此抗體共價連合至細胞毒素劑或效應分 子，以提供補體固定力及抗體-依賴性細胞—媒介之細胞毒 害性，於是抗體共輛物與細胞表現組織因子接觸，而減輕 哺乳類組織因子水平。 本發明抗體亦可用於活體内診斷方法，包含天然人類 TF之活體内診斷投影。 本發明抗體亦可用於試管分析，以偵測生物樣品包含 92214(修正版) 9 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 體液（如，血漿或血清）或組織（如，活k織，檢查樣品）中之 天然TF。詳言之，各種異質及同質免疫分析，可用競爭型 或非競爭型以偵側存量，尤其係生物樣品中天然TF量。 本發明之此等分析高度有用於決定病患有無血液凝結 或血塊。亦即，血液凝結通常伴隨著TF表現於細胞表面上 (例如單核血球、巨嗟細胞、及内皮細胞襯血管分布）之結 果。因此，以本發明分析法，偵測體液樣品中之TF，能指 示血液凝結。 ® 本發明抗體亦可用以自生物樣品製備實質上精純之天 然TF，尤其是天然人類TF。本發明抗體亦可用以偵測及純 化表現天然TF之細胞。 本發明抗體亦可用作診斷套劑，例如偵測及較佳定量 生物樣品中天然TF之診斷套劑之成分。 本發明亦提供人類化抗體，其能專一性結合至人類組 織因子（TF)，而形成複合體。依較佳具體例，血液因子X 籲或因子IX與複合體之結合明顯受到抑制。較佳，該人類化 抗體包含至少一個老氣互補決定區（CDR)，較佳一、二、三 或四個此老鼠CDRs。又，本發明提供此等人類化抗體之TF 結合片段。 另一方面，本發明提供抑制哺乳類血液凝結之方法， 包含：投予哺乳類有效量之人類化抗體或其片段，其能專 一性結合至人類組織因子（TF)，以形成複合體。此方法所 用之較佳抗體，明顯降低因子X或因子IX結合至複合體。 較佳之方法，又包含：使抗體與TF或TF : FVIIa複合體形 10 922]4(修正版) 1338009 第91125173號專利申請索 (99年9月23日） 成專一性複合體：以抑制血液凝結。 本發明亦提供抑制哺乳類血液凝結之方法，包含：投 予哺乳類有效量之人類化抗體或其片段，其包括至少一個 老鼠互補決定區（C0R)。此方法所用較佳之人類化抗體，能 專一性結合至人類組織因子（TF)，以形成複合體。較佳為 明顯降低因子X或因子IX結合至複合體。較佳之方法，又 包含：於抗體及TF之間形成特定複合體，以抑制血液凝結。 本發明之其他方面，詳論如下文。 如上述，本發明較佳之抗體對天然人類TF展現實質親 ® 和力。尤其，藉由表面質粒基因分析（尤其，依後述實例1 之BIACore分析程序）本發明較佳之抗體對天然人類TF展 現之結合常數（Ka, 1T1)，至少約lxlO8,更佳約5xl08,又更 佳約lxlO1、本發明抗體之實質結合親和力，與先前已報 告抗體之極低結合親和力，明顯相反。 於此點，可使用非常低濃度之本發明抗體，如於試管 分析時，可用較低濃度抗體抑制TF功能（如，至少約95、 · 98或99%抑制率），如下文實施例3所述。 較佳之抗體對天然人類TF亦具高度專一性，且較佳幾 乎不與非天然TF結合。較佳之抗體幾乎不與如標準圓點點 潰分析決定之非天然TF或其他免疫不相關分子結合（如， 不與圓點點潰分析一般偵測之非天然TF結合）。此處關於 “非天然TF”意指已經變性劑處理之天然產生或重組人類 TF，使得TF變性。典型之變性劑包含：清潔劑（如，SDS)、 尿素與二硫蘇糖醇或β-巯基乙醇之組合、胍鹽酸鹽等。 11 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 、 （99年9月23曰） H36、H36.D2或H36.D2.B7抗體幾乎不奐此非天然TF結合。 參見’例如，下文實施例8之結果及圓點點潰分析。 如上述，本發明較佳之抗體，亦與TF結合，使Fx(或 FIX)不能有效結合至TF : Fvna複合體，因而Fx(或 不能有效轉變成其活化型（FXa或FIXa)。本發明尤佳之抗 .體，以如下文實施例3之標準試管結合分析進行測定，包 •含：使FX(或FIX)與TF : FVIIa複合體，於有（即，試驗例） _及無（即，對照例）本發明抗體存在下，相接觸而決定於試 驗=及對照例間，Fx轉變成FXa(或FIX變成FIXa)之差異 百刀率，即使於低濃度，如低於約1. OnM TF、或甚至 低於約0. 20nM或〇. i〇nM TF下，能以TF : FVIIa複合體， 強烈抑制FX活性，如抑制至少約50% ’更佳至少約8〇%， 又更佳至少約90%或95%。 本發明抗體用於所揭示之方法及分析時，較佳為實質 j純者。關於抗體之“實質上精純”意指抗體或蛋白質 戈^天然伴隨之各種成分分離。例如，用標準免疫親和力 ^白質A親和力純化技術，以天然TF作抗原或蛋白質a 本發明抗體能自融合瘤培養物中純化得之。同樣地， ^本發明抗體’及標準免魏和性純化技術，能獲得實質 白:純型，天然TF。尤其，若全部蛋白質(樣品中全部蛋 蛋白ί重置有至少、5⑽為本發明抗體或蛋白質該抗體或 # s係實質上精純者。較佳乃抗體或蛋白質佔全部蛋白
旦y，/ 6〇重罝％’更佳至少75重量％，又更佳至少90重 最佳至少98重量％。.純度容易以已知方法，例如SDS 922〗4(修正版) 12 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23曰） (PAGE)凝膠電泳分析、管柱層析（如，親和力層析）或HPLC 分析。 本發明較佳抗體（H36.D2.B7)之核酸（SEQ ID NOS. 1及 3)及胺基酸（SEQ ID N0S. 2及4)序列，示於第1A及1B圖。
SEQ ID NOS. 1及2分別為輕鏈可變區之核酸及胺基酸，SEQ ID N0S. 3及4分別為重鏈可變區之核酸及胺基酸，而所有 序列之高可變區（CDRs或互補決定區）均劃底線。 本發明更佳之抗體，可具與第1A及1B圖所示輕鏈或 重鏈二者或二者之一，實質相同之胺基酸系列。更佳，乃 · 較佳之抗體包含：對SEQ ID N〇s. 2及/或4,具至少約70% , 更佳約80%以上，又更佳約85，9〇或95%以上之胺基酸相 似性。 本發明較佳之抗體’具有與SEq ID N〇s. 2及4之高可 變區（第1A及1B圖劃雙線所示者）高度相似性之胺基酸系 列。本發明尤佳之抗體，具有一、二或三個輕鏈高可變區，
其與H36.D2.B7輕鏈可變區之一、二或三個對應高可變區φ 具有鬲度相似性或相同（至少9〇%或95%)之胺基酸系列（上 述呵可變區如第1A圖劃底線所示，如下：1)LASQTID(SEQ ID
No . 5)，2)AATNLAD(SEQ ID no : 6);及 3)QQVYSSPFT(SEQ ID NO : 7))。 ▲本發明尤佳之抗體，具有重鏈可變區之一、二或三個 问可變區’其與H36.D2.B7重鏈可變區之一、二或三個對 應高可變區具有高度相似性或相同(至少9〇%或95%)之胺 基酸系列（上述高可變區如第1B圖劃底線所示 ，如下：1) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23日） TDYNVYCSEQ ID NO： 8) ； 2)YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQ ID NO ： 9);及 3)DVTTALDF(SEQ ID NO : 10))。 本發明核酸較佳具足夠長度（較佳至少約100、200或 250個鹼基對），以與SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO : 3 相結合，此乃於適度嚴格條件（此處稱作“正常嚴格，，條 - 件）：用融合緩衝液（包括20%甲醯胺於0.8M鹽液/0.08M檸 . 檬酸鈉（ss〇緩衝液），於溫度37°C進行；又於37。(：，以 SSC洗滌一次，使仍結合。 _ 更佳’本發明核酸（較佳至少約100、200或250個鹼 基對），與SEQ ID NO : 1及/或SEQ ID NO : 3相結合，此 乃於高度嚴格條件（此處稱作“高度嚴格，，條件）：用融合 缓衝液（包括20%甲醯胺於〇. 9M鹽液/〇. 〇9M檸檬酸鈉（SSC) 缓衝液），於溫度42〇C進行；又於42。(：，以SSC洗滌二次， 使仍結合。 本發明核酸較佳包括至少20個鹼基對，更佳至少約 籲50個驗基對，又更佳包括至少約100、200、250或300個 驗基對。 通常’本發明較佳之核酸，會表現本發明之抗體’此 抗體展不較佳之結合親和力及所揭示之其他性質。 本發明較佳之核酸，亦具有與第1A及1B圖所示輕鏈 或重鏈一者或二者之—實質相同之序列。詳言之，較佳之 核酸包括♦對SEQ ID NOS. 1及/或3 ,具有至少約70% ’更 佳約8〇%以上’又更佳約85、90或95%以上同源性之核苷 酸系列。 14 922!4(修正版) 1338009 第91125；Π3號專利申請案 (99年9月23曰） 本發明尤佳之核酸系列，具有與SEQ ID NOS. 1及3高 可變區（第1A及1B圖劃底線者）高度相同之序列。尤佳之 核酸包含：編碼抗體輕鏈可變區，且具有一、二或三條編 碼高可變區之序列，又與編碼H36.D2.B7對應高可變區之 一、二或三條序列高度相似（至少90%或95%核苷酸系列） 或相同者（高可變區如第1A圖劃底線所示，如下： 1)CTGGCAAGTCAGACCATTGAT(SEQ ID NO ： 11) ； 2)GCTGCCA CCAACTTGGCAGATCSEQ ID NO : 12);及 3)CAACAAGTTTACAG TTCTCCATT CACGT(SEQ ID NO : 13))。 镛 尤佳之核酸，亦編碼抗體重鏈可變區，且具有一、二 或三條編碼高可變區之序列，又與H36.D2.B7對應高可變 區之一、二或三條序列高度相似（至少90%或95%系列）或相 同者（高可變區如第1B圖劃底線所示，如下： 1)ACTGACTACAACGTGTAC(SEQ ID NO ： 14) ； 2)TATATTGATCC TTACAATGGTATTACTATCTACGACCAGAACTTCAAGGGC(SEQ ID NO ： 15)及 3)GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC(SEQ ID NO : 16))。 本發明核酸經單離後，通常於所予部分中佔全部核酸 至少約0· 5%，較佳至少約2%，更佳至少約5%重量。部分 精純之核酸，於所予部分中佔全部核酸至少約1〇%，較佳 至少約30% ’更佳至少約60%重量。精純之核酸，於所予部 分中’佔全部核酸至少約80% ’較佳至少約9〇%，更佳至少 約95%重量。 本發明抗體可依此項技藝一般周知之技術製備，典型 產生天然TF之純化樣品’典型天然人類Tf、較佳純化之 922K修正版) 1338009 第91125173號專利中請案 (99年9月23日） 重組人類組織因子（rhTF)。尤佳以 , 诹奴之重組人類組織因 子或rhTF (由243個胺基酸組成，缺^ α μ 太丄丄☆ χ缺乏細胞質功能部位） 產生本叙明抗體。該抗體亦可自免疫 , x 凡役胜肽產生，此免疫胜 肽包括：天然TF之一或多個抗原決定邱 ^ ^ ^ Η 而此等抗原決 疋#未能由非天'然TF展示。此處關於“天然tf TF樣品，而TF樣品包含rhTF。如上述，、s〆οσ ^ I 上述，通常以單株抗體 較佳’然而亦可使用多株抗體。 詳言之，可使哺乳類以天然人類τρ之純化樣品，或上 ^免疫胜肽、單獨或與載體複合，予以免疫製備抗體。合 且：哺乳類包含：典型之實驗室動物如線羊、山羊、兔、 天大鼠及小鼠。較佳以大鼠及小鼠，尤其是小鼠， 獲得單株抗體。抗原可由任何合宜途徑如皮下、腹内、靜 脈内、肌内或皮内注射，而投予至哺乳類。最適免疫間隔、 免疫劑量、等可於寬廣範圍内變化，及依本文揭示之試驗 決定。典型之程序包含：經諸多月數注射抗原數次。以標 準技術，自經免疫動物之血清，收集抗體，又經篩選以尋 找對天然人類TF具專一性之抗體。單株抗體可於產生抗體 之細胞中產生’以及以形成融合瘤細胞之標準融合技術， 使彼等細胞產生單株抗體。參見G. Kohler等著，自然雜 誌（Nature)，256期：456頁（1975年）。通常，包含：使 產生抗體之細胞’與不死細胞株，如骨髓瘤細胞融合，以 產生融合細胞。或者依Huse等著，科學雜誌（Science)， 256期：1275頁（1989年）所示方法，自細胞中製得單株抗 16 92214(修正版) 第911251"73號專利申諳宏 (9 9年9月2 3日） 一種合宜之擬程提供以包括純化rhTF複合體之組成 、 貢約2至7個月’使小鼠經腹膜内免疫。然後，自免 疫丨、氣移除脾細胞。於切除脾細胞之前，自免疫小鼠取得 /月，分析血清中對rhTF具專一性之抗體力價。然後，經 刀除之小鼠脖細胞與具有標記（如次黃》票吟鳥嗓岭構酸核 糖基轉移酶缺乏（HGPRT)或胸腺核苷激酶缺乏（τκ-)之適宜 同貝性或異質性（較佳同質性）淋巴細胞株融合。較佳使用 月知瘤細胞作為淋巴細胞株。骨趙瘤細胞及脾細胞一起混 & ’如以約1 : 4之骨髓瘤細胞對脾細胞混合。此等細胞可鲁 依聚乙二醇（PEG)方法融合，參見g· Kohler等著，自然雜 誌（Nature)，同前文。所選殖之融合瘤於培養基如RPMI_ 1640生長，參見g. Ε· More等著’美國醫學會雜誌（J0urnai 〇f American Medical Association) ’ 199 期：549 頁（1967 年）。經融合程序後，所生長融合瘤以例如放射性免疫分析 或酵素免疫分析予以篩選，以分泌對純化rhTF具有專一性 結合之抗體，如選擇出結合至純化rhTF，而不與非天然TF 鲁 結合之抗體。較佳以ELISA分析進行篩選。經篩選呈正結 果之融合瘤可依限制稀釋方法，予以擴增及選殖。較佳進 一步進行篩選，以選擇能於溶液及人類流液樣品中，與汁灯 結合之抗體。經單離之抗體可由任何合宜免疫技術（包含親 和力層析術）予以純化。產生尤佳H36 D2. B7抗體之融合瘤 k養物，可依布達佩斯條約（Budapest Treaty)，寄存於美 國菌種保藏中心（ATCC)，12301 Parklawn Drive，
Rockville ’ MD ’ 10852。此融合瘤培養物乃於1997年j月 92214(修正版) 17 1338009 第911251?3號專利申請索 (9 9年9月2 3日） 8曰，以ATCC HB-12255登記號，寄存於ATCC。 就人類治療方面’較佳產生嵌合型抗體衍生物，如與 非人類動物可變區及人類保留區結合之抗體分子，使抗體 比對應之祚後合型抗體’對人類更少免疫性。可製備各種 嵌合型抗體，包含：如由製造人類可變區嵌合物，其中部 分可變區，尤其抗原結合功能部位保留區，為人類來源， 只有高可變區為非人類來源。參見人類化嵌合型抗體討 論，製造方法如同S. L. Morrison ’科學雜誌（science)， 鲁229期：1202至1207頁（1985年）；〇i等著，生物技術（Bi〇 Technigues)，4 期：214 頁（1986 年）；Teng 等著，美國國 家科學院院報（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. )，80 期： 7308至7312頁（1983年）；Kozbor等著，今曰免疫學 (Immunology Today) ’ 4 期：7279 頁（1983 年）；〇lsson 等 著’酵素方法（Meth. Enzymol. )，9期：3 至 16 頁（1982 年）。又則’可使用基因轉殖小鼠。例如，製造攜帶人類抗 鲁體基因轉殖小鼠，其能與天然人類TF免疫。然後，自此該 基因轉殖小鼠取得之脾細胞，可用以製造融合瘤，分泌能 與上述天然人類TF專一性反應之人類單株抗體。參見N.
Lonberg等著，自然雜諸（Nature)，368期：856至859頁 (1994年），l. L. Green等著，自然基因學（Nature Genet. )，7 期：13 至 21 頁（1994 年）；s. L. M〇rris〇n 著， 美國國家科學院院報（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A·)， 81 期：6851 至 6855 頁（1994 年）。 編碼本發明抗體之核酸亦可依聚合酶鏈反應製備（見 18 92214(修正版) 1338009 第 91125173 (9 9 年 9 〜般參見，Sambrook等著， 下文實施例1揭.示之引子）。 分子選殖（Molecular Cloning)(第2版，1989年）。此等 核酸亦可依周知方法，如魏，方法合成（見寡核苦酸合 成，IRLPressQl. J. Gait，ed.，痛年）），或用市售 自動寡核酸合成儀）合成。此等經製備之本發明核酸，可依 周知技術，表現本發明抗體。例如，編碼本發明抗體之核 酸可依周知方法，例如用限制酶於載體上切割，插入構成 物接著接口之’而將其併入合宜之載體。將含有所插入 核酸系列之載體’合宜地操縱連接至啟動序列，然後引人φ 宿主細胞以使其表現。—般參見，等著，同前文。 可依選酿程有關之因子，選擇合宜之載體。例如，载體 應與所使用之宿主細胞相配合，且該宿主細胞具有合宜的 複製子。又則，載體必須能容一插人之核酸序列。合宜 =宿主細胞包含廣泛種類之真核或原核細胞，例如大腸桿 本發月抗體之分子量，依數個因子如用途而不同，不 論含：輛或重組融合毒素、醫藥、賴測水平等。 Μ ” hi右有任何對抗體之轉譯後修飾（如，糖基化 作用）之本性及延性程度而不同。修飾乃宿主功能，用以表 社腸桿隸生之祕基化抗體及哺乳類細胞產生之糖基 化抗體。通常’本發明技艘且八 々 曰 ％月柷體具分子量約20至150kDa之間。 此等刀子^:易由分子敎小方法如哪―凝膠電泳分 析’接著蛋白質染色或西方氏斑漬分析，而決定。 本毛月抗體《其他類似名詞，係指與天然TF結合 92214(修正版) 19 1338009 第91125：Π3號專利申請案 (99年9月23曰） 之免疫球蛋白及免疫活性片段。免疫球蛋白及其免疫活性 片段，包含：抗體結合位（即，抗原決定部位，乃以辨識及 專一性結合天然人類TF之抗體所能專一性結合者）。抗體 片段範例包含：例如，Fab、F(v)、Fab’、F(ab’）2片段等， “半分子”來目免疫球蛋白減少二硫鍵者、單鏈免疫球蛋 白、或其他合宜抗原結合片段（參見例如：Bird等著，科 學雜誌（Science) ’ 242 至 424 頁（1988 年）；Huston 等著， 美國國家科學院院報PNAS(USA)，85期：5879頁0988年）； 春 Webber 等著，分子免疫學（Mol. Immunol. )，32 期：249 頁（1995年））。抗體或其免疫活性片段，可為動物型者（如， 齧齒動物如小鼠或大鼠）、或嵌合型者（見Morrison等著， 美國國家科學院院報（PNAS)，81期：6851頁（1984年）；
Jones 等著，自然雜誌（Nature)，321 至 522 頁（1986 年））。 以本發明單鏈抗體較佳。 同樣地，“本發明核酸”指能表現以提供本發明抗體 馨之核苷酸序列，而本發明抗體適才定義如上述。 如上述，本發明抗體可投予哺乳類，較佳乃靈長類如 人類’以預防或減輕血栓閉合病症，此歸屬於血凝之TF-媒介活化作用，通常投予之組成物，包含：一或多種醫藥 上可接受之非毒性載劑，如滅菌水或鹽液、二醇類如乙二 醇、植物油、等。尤其，以生物相合劑、生物可降解之乳 父醋聚合物、乳酸交酯乙交酯共聚物或聚氧乙烯、聚氧丙 烤共聚物為有用之賦形劑，以控制此處所述含抗體之組成 物之釋放。其他可用之投予系統包含，乙烯-乙酸乙烯酯共 20 92214(修正版) 1338009 . 第91125173號專利申請案 (99 年 9 月 聚物顆粒、渗透柄符 、抽琦、及次液糸統及微脂體。通常，本發 、月抗凝血且成物’可成溶液或懸浮液型式（或為可再構成溶 液或懸浮液之凌乾型式），較佳包含：約G.G1%至10% (W/W)幸乂佳約〇. 〇1%至5%(w/w)之本發明抗體。該抗體可 以於組成物中單獨活性成分投予，或成綜合物包含：一或 多種其他抗血凝劑（如，肝素、水垣素或水紐、香豆定、 華法令、抗血小板劑（如，阿斯匹靈、普拉韋、提利得、里 1W積谷利或凝斯大、或血栓劑（如，組織血纖維蛋白蛋 白冷酶原活化劑、鏈激酶及尿激酶）。此外，本發明抗體可Φ 於才又予或夕種合宜抗凝血劑、抗血小板劑或抗血栓劑之 刖或之後，予以加強或延長所要抗凝結活性。 亦如上述’本發明抗體可用於減少由使用醫學器具如 内用裝置’如導管、移植模等而引起之潛在血液凝結。就 一較佳方法’於與體液接觸之前，器具可以本發明抗體 (如，以1宅克/亳升鹽液）處理。或則，或又則，本發明抗 體以足使血凝降至最低之量，與體液混合。 _ 根據本發明之治療用抗凝結組成物，適宜以非經腸或 經靜脈内投予’尤其係以液體溶液型式投予。此等組成物 可方便地以單位劑量投予，且可依製藥技藝熟知之方法製 備。參見雷氏製藥學（Remingt〇n，s Pharmaceutical Sciences) ’ 馬克出版公司（Mack Publ ishing Co. )，Eoston PA(1980年））。“單位劑量，，係指本發明治療組成物，係 以適合靈長類（如人類）之單位劑量以實際上個別單位之形 式使用’各單位含有預定量活性物質，該活性物質之預定 21 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 量係與所須稀釋劑或載劑連合時，經計算能產生23曰） 單位劑量依各種因子，包含:所要治療= 瞻化作用之抑制或中和程度。通常，投予1要= \再攸醫生判斷’但S，劑量—般依投予途徑而不同， 其範圍為每日10毫微克/公斤體重至50毫克/公斤體重， 更典型地為100毫微克/公斤體重至約10毫克/公斤體重。
多次加強時，初始投予之合宜攝取法不同，但通常初次投 予後，接著每隔一或數小時以上，以接續注射或其他法， 重覆投予。或則，連續或間歇經靜脈内注入，以保持血液 中抗體濃度至少約10毫微莫耳至1〇微莫耳。 有時，本發明抗體可經修飾，以具有所要之生物性、 化學性或物理性。詳言之，抗體可共軛（即，共價連接）至 藥劑，如血纖雉蛋白分解藥劑，如t-PA、鏈激酶、或尿激 轉，以提供血纖維蛋白洛解活性或目標劑如企纖維蛋白結 籲合主區。此等連接可由數種方法完成，包含：用連接分子， 如異雙功能蛋白質交聯劑’如SPDP、裁二亞胺 (carbodimide)、等’或重組方法。 除了藥劑如血纖維蛋白溶解劑以外，本發明抗體可共 輛至如植物源或細菌源毒素，如白喉毒素（即DT)、志克 (shiga)毒素、雞母珠蛋白.（abrin)、霍亂（cholera)毒素、 蓖麻驗（ricin)、皂苷毒素（saP〇rin)、假單孢菌外毒素 (PE)、美洲商陸（pokeweed)抗病毒蛋白質、或白樹素 (gelonin)。此等毒素之生物活性片段，為本項技藝所周 92214(修正版) 22 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 知，包含：如DTA鏈及蓖麻鹼A鏈。毒素亦可為於細胞表 面具有活性之藥劑，如磷脂酶類（如，磷脂酶C)。另一實 例’毒素可為化療藥物，如凡得辛（vemiesine)、長春新鹼 (vincristine)、長春花鹼（vinblastin)、胺曱喋呤 (methotrxate)、亞德里亞黴素（adriamycin)、阿黴素 (doxirubicin)、博萊黴素（bleomycin)或氣氨鉑 (cisplatin)、或則，毒素可為放射性核種 (radionuclide) ’ 如碘-131、釔-90、銖-188 或鉍-212(參 見’ Moskaug等著，生物化學雜誌（J. Brol· Chem. )，264 籲 期：15709 頁（1989 年）；I· Pastan 等著，細胞（Cell)， 47期：641頁（1986年）；Pastan等著，重組毒素作為新穎 治療劑（Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents)，生物化學年鑑（Ann. Rev. Biochem. )，61 期： 331 頁（1992 年）；嵌合型毒素（Chimeric Toxins)，Olsnes 及 Phil，藥物治療（Pharmac· Ther. )，25 期：355 頁（1982 年）；公告PCT申請案WO 94/29350號；公告PCT申請案 · W0 94/04689號；及美國專利案第5, 620, 939號。而且， 除了毒素以外，如上述，本發明抗體可共軛至效應分子 (如，IgGl或IgG3)，於投予哺乳類時，提供補體-固定能 力及抗體-依賴性細胞-媒介之細胞毒素性。 此等抗體-細胞毒素或效應分子共輛物，可以治療有效 量投予哺乳類，較佳為靈長類如人，此哺乳類已知或懷疑 具腫瘤細胞，免疫系統細胞，或能表現TF之内皮細胞。此 等腫瘤細胞、免疫系統細胞及内皮細胞，包含：乳房及肺 23 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利中請案 (99年9月23曰） 邻之惡性細皰、單核白血球、及血管内皮細胞。 本發明抗體亦可共軛至上述以外之各種其他藥劑，例 如·藥物、酵素、荷爾蒙、能結合放射性核種之螯合劑， 以及用以診斷或治療疾病之其他蛋白質及聚胜肽。就診斷 目的’本發明抗體可標示或不標示偵測。例如，廣泛之各 種仏示物可合宜用以偵測標示此抗體’例如：放射性核種、 焚光物、酵素、酵素基質、酵素輔因子、酵素抑制劑、配 _位子如半抗原（haptens)等。 亦提供診斷方法’包含：活體診斷影像法[參見例如’ A· L Abbas著，細胞及分子免疫學第328頁（W B. Saunders Co· 1991)]。在多數的活體内影像應用方面，本發明抗體 可直接以125丨、32P、99Tc或其他可偵測之標籤加以標示，接 著投予至哺乳動物（特別係人類），待一段預決定之時間， 使該抗體與所欲之目標接觸。然後利用已知程序（例如閃爍 攝影分析）對受者進行掃描以偵測該抗體之結合。該分析有 魯助於s乡斷及治療許多諸如本文特定揭示之血检症。該方法 特別適用於與心臟手術（特別係血管成形術）或其他手術程 序結合使用以將血塊之發展或移動視覺化。 本發明抗體亦可用於自生物樣本製備實質上純（例 如’至少約90%純度’較佳至少約96或97%純度）之天然 丁F，特別係天然人類TF。例如，天然TF可如上述說明獲 得（參見 L. V. M. Rao 等人 Thrombosis Res.，56:109 (1989))以及藉由使該溶液與含有抗體之固體支撐體混 合，以形成結合反應混合物。固體支撐體之實例包含盤壁 24 922丨4(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） (例如微量滴定盤）以及包含或由聚苯乙烯、聚乙烯基氯、 經交聯之葡萄聚糠（例如SephadexTM，Pharmacia Fine Chemicals)、洋菜璦脂、聚笨乙烯珠（Abbott Laboratories)、聚乙烯基氣、聚笨乙嫜、交聯型式之聚丙 醯胺、硝化纖維或耐龍等構成之支撐體。然後該TF可依照 一般免疫技術自固體支撐體上以實質上純之型式單離出 來。一般參見Harlow與Lane，如前述，以及Ausubel等 人如前述。 前文也討論，可使用本發明抗體來偵測於生物樣本中 籲 之天然人類TF，特別係與血塊相關之天然TF。生物樣本例 如包括血漿、血清、唾液、尿液、糞便、陰道分泌物、膽 汁、淋巴、眼球玻璃體液、腦脊髓液、細胞培養基以及組 織，特別係血管組織如心臟組織。樣本可得自患有或懷疑 患有下列疾病之哺乳動物：血栓，且較佳為下列病情相關 之血管再狹窄，例如侵襲性醫療手術如經皮穿管腔冠狀動 脈手術、心肺繞道手術、動脈内膜切除術、周邊血管繞道鲁 移植片、重建或成形手術、關節置換術；心臟病如心肌梗 塞、心肌病、瓣膜心臟病、穩定性心絞痛、不穩定性心絞 痛或才王塞引起的心房震顫；凝血病症包括彌漫性灰管内凝 血、深部靜脈血栓、置放器材如血管支架或插管；休克（如 敗血性休克症候群）、血管外傷、肝病、出血性中風、熱性 中風、惡性病（如姨癌、印巢癌或小細胞肺癌）、狼瘡 厥、血管周圍阻塞病及腎臟病。 ··’ 用於此等檢定分析，本發明抗體可根據已知方法加可 9Π4(修正版) 25 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23曰） 憤測的標記，可偵測標記例如係使用適當原子或分子如放 射性蛾、氚、生物素、或可產生可偵測產物之試劑，例如 附著於酶如/5 -半乳糖苷酶或辣根過氧化酶之抗專一性 (anti-iodiotypic)抗體、或使用螢光標籤（例如螢光素或 若丹明）標記。將生物樣本與可偵測標記抗體接觸後，未反 -應抗體可由生物樣本分離，標記（或產物）可藉習知免疫學 * 方法偵測，該等免疫學方法包括抗體捕捉檢定分析、抗體 夾層檢定分析、RIA、ELISA、免疫沈澱法、免疫吸收法等（參 •考Harlow及Lane’參見上文；Ausubel等人，參見上文）。 任種標籤（或產物）超過適當對照樣本可偵測量時，指示 物樣本存在有天然TF，更特別存在有血塊。例如本發 體可根據標準免疫學技術（如抗體捕捉檢定分析、 A、k體夾層檢定分析、RIA、免疫沈澱法、免疫吸收 5等）’纟至過可偵測的方式標示來偵測且較佳來定量天然 鲁 某些情況下，特別於使用組織時，免疫技術包括使用 已知可實質上維持蛋白質組態之試劑（例如稀曱醛）進行組 織固定。概略參考Ausubel等人，分子生物學現今方案， •二輪咸和父子公司，紐約（1989) ; Harlow及Lane，抗體： 只驗室手冊，CSH出版公司，NYC1988)。 本發明抗體也可用於偵測及純化可表現天然TF之細 I忒等細胞包括纖維母細胞、腦細胞、免疫細胞（例如單 核、’田胞）、上皮細胞及某些惡性細胞。較佳之細胞偵測與純 化方去包括習知免疫學方法（例如流動細胞計量術方法如 FAPQ ' 以及免疫淺盤法）。可表現天然TF之實質純質細胞族 26 92214(修正版) 第91125U3號專利申請索 '9 9年9月2 3日） 救一^― (99年9月2 :用於臨床#實驗研究，例如建立此種細胞做為筛檢 1F結合抗體用之培養細胞。 本發明也提供於試驗樣本特、^ ^ ^ 等或前文巧从之组蟠店， 體液例如血液、血漿 h文“之、，且織’偵測天然TF，特別係 ^試驗及診斷套件组。較佳套件組包括本發明之 W之抗體。診斷套件組可根據任—種可接^_ 例如EUSA方法’用來債測生物樣本之=方 或天然TF的含量。 、、、1F的存在 如前文討論，本發明之另—特芦 專-性結合至人類組織因子俾形成結合複合物抗其可 可為天然或重組因子⑽F)。較佳鱗制因子^且織因子 、’、。合至複合物本發明之較佳具體實施例中s因子U pTF具有親和常數⑽小於約-，較佳小= 員化抗體 Μ為約G划至約G.4nM。參考後文實施例， 弋人類化抗體親和常數之其它資訊。「專—性結人有關測 示藉標準免疫學技術如RIA、西方墨點法或e=」—詞表 人類化抗體可與TF形成可偵測之結合複a A ;則定， 抗原形成複合物。 與其它 其它本發明人類化抗體之另一特徵為藉 (PT)凝血檢定分析測定，可延長金液凝固冑^ 4血崎原 秒。較佳具體實施例中，顯示於檢定分柝中，達至少約5 2為約_至約—，更佳約1_至約二 考後文實施例11(說明如何使用人類化枋 j如參 血檢定分析）。 體進行標準PT凝 27 92214(修正版) 1338009 第911251V3號專利_請案 (99年9月23曰） 根據本發明之其它較佳人類化抗體具有對組織因子， 較佳對人類TF ’之、结合專一性係等於或大於得自H36. D2. 抗體（以ATCC存取編號HB-12255寄存）之結合專一性。 亦較佳者為人類化抗體其具有對TF之結合親和力約略等 於或大於得自H36. D2. B7抗體（以ATCC存取編號hb-12255 寄存）之結合親和力。測定結合專一性及結合親和力之方法 為業界已知，包括後文說明之特定檢定分析。 鲁 根據本發明之其它人類化抗體包括至少一個鼠互補決 定區（CDR )。如一般了解，免疫球蛋白輕鏈及重鏈共通具有 某些結構類似性，例如各自包括一種四區（FR1 -4)架構，其 序列相對有保留性。FR卜4(FR卜FR2、FR3、FR4)各自藉三 個CDRs亦即CDR1、CDR2、CDR3共價聯結。一般了解四個 FR大半採用冷片組態’互連的CDRs形成環圈聯結，某些 情況下形成/3片結構之一部分。大部分CDRs維持接近於毗 鄰FRs，帶有來自相反輕鏈或重鏈之對應CDR，辅助形成抗 •原結合位置。已經揭示寬廣多種CDRs及FRs。例如參考 Kabat等人，免疫上感興趣之蛋白質序列，美國健康及人 類服務部’美國政府印製廠（1987)。 也參考EP-A-0239400及美國專利案第5,985,279(說 明變化抗體之製造方法，其中CDRs係衍生自FR以外的種 類）。 人類化」一詞表示一種免疫球蛋白包括人類架構區 以及一或多個仵自非人類來源之CDRs，通常係得自酱齒類 如大鼠或小氣免疫球蛋白。提供⑽之非人類免疫球蛋白 28 92214(修正版） 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） ^做「施體」’而人_免疫球蛋白稱做「受體〆保留區無 私存在於例如某些此種免疫球蛋白之π結合片段。較佳之 係留區若存在時’實質與人類免疫球蛋白保留區相同，亦 ^就胺基酸序列而言相同性至少約_，且較隹至少約95% f以上。如此，幾乎全部人類免疫球蛋白各部分（CDRS可 月b除外）皆實質與天然人類免疫球蛋白序列之對應部分相 同。 人類化抗體 y 一詞表示一種抗體，其包括人類化輕 p及人類化重鏈免疫球蛋白。此種抗體之製造及使用方法 ^經封論如前。參考s.L.M〇rri_，參見上文；〇i等人， 二見上,’ Ter^等人’參見上文;㈣虹等人，參見上文; =等人’蒼見上文；及其它前文；丨述之參考文獻。 (F二，人類化抗體之實例包括：。輕鏈及重鏈架構 應 ^ J心至乂 —種得自小鼠之，a 車乂佳全部CDRS皆得自 CDR且 a m & 及3)免疫球蛋白保留區， ，、興對應人類免疫球蛋白保留 由 少約95%相同。須了解由於 ^ 9(U相冋且較佳至 ^ ^ ,θ 由於、·，σ果所侍人類化抗體褚细叮鉍 。至棱供C D R s的施體抗體的相同抗 負翊可… 經藉「人類化」方法而被「人類化」:、故預機體抗體已 進-步須了解此處提供之人類:抗體〜 額外保留胺基酸取代，該基 1多個 =連。例如此種取代典型對抗;-連或 蛋白功能實質上極少影響或絲毫無影響。「保留^免= 92214(修正版) 29 1338009 包括複數形表示下列組合：g 1 y leu ； asp<-->g\n ； asn<--^gjn ； 及 phe^6--^tyr 〇 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） > val-i—>· j 20<—> ser^--^thr ’ lys<__>arg ; 其它人類化抗體之特徵為帶有一個可變區，該可變區 之胺基酸序列係與一或多種天然人類免疫球蛋白序列之對 應可變區相同性至少70%(例如約73%至75%)。此外根據本 發明人類化抗體整個抗體與—或多種人類化抗體之相同性 至少為90%。 本發月之更特疋人類化抗體為其中於架構、2、 3及4各自具有與第12A圖所示輕鏈FR序列（SEq ID N〇. 3) 之胺基酸序列相同性至少約9〇%，且較佳至少約娜或以 上。較佳該序列顯示於第12A圖為「LC_Q9」（SEQ IDN〇s : 103和109對應刚：卿㈣⑽：心⑽及川對應 FR2，SEQ IDNOS: 1〇5 及 111 至 145 對應 FR3 ; SEQ ID N〇s : 106、107及110對應FR4)。更佳之人類化抗體包括輕鏈保 #留區，其具有與第14A圖或15A圖所示序列（seq ID NOS 分別為 97 及 99)(SEQIDNOS:1〇9、⑽、112 及 11〇 分別 對應FR1、2、3及4)之胺基酸序列相同性至少約9〇%，且 較佳至少約95%或以上。 更特定人類化抗體為其中架構（FRs)1、2、3及4各自 具有與第13A圖之重鏈序列（SEq ID N〇s : i17、U2及ι27 至 133 對應 FR1 ’ SEQ IDNOS : 118 及 123 對應 FR2 ; SEQID NOS . 119 及 124 至 126 對應叩3 ;及 SEQ ID NOS : 120 和 122對應FR4)之胺基酸序列相同性至少約9〇%，且較佳約 30 92214(修正版) 第911251*73號專利申請案 <99年9月23日） 95%相同性或以上。較佳
NOS：129M23.128^〇 ^^rHC_〇8jSEQID
及122分別對應FR卜2、3及4之序 k類化仏體具有重鍵保留區，其與第14β或15B θ二EQ iD N〇S.分別為98及1〇〇)具有胺基酸序 列相同/生至少約猶且較佳至少約95%或以上。 右干，、體實她例中’人類化抗體具有刷陳丁）或 IgG4(hFAT)同型基因。參考實施例9。 本發明也提供此處揭示之人類化抗體功能片段。較佳 之片奴專11結合TF ’其具有親和常數⑽)小於約， 較佳小於約〇·5ηΜ，更佳為約O.OlnM至約〇.4nM。特佳為 抗原結合Fab、Fab’、及F(ab)2片段。 如前文討論，本發明之人類化抗體特徵包括至少一個 鼠互補決定區（CDR)，例如CDR1、CDR2、CDR3。較佳具體 實施例中，抗體專一性地結合至人類組織因子（TF)而形成 複合物。典塑地，因子X或因子Ιχ結合至TF或TF: VIIa , 藉TF:FVIIa活化作用受抑制，如前述，較佳QRs(輕鏈# 及重鏈）係得自齧齒類來源，典型係得自小氧。 本發明之人類化抗體之一具體實施例中，抗體進一步 包括至少一個人類架構（FR)區。較佳全部FR區（輕鏈及重 鏈）皆為人類架構區。 更特定具體實施例中，重鏈超可變區之第_ cdr(cdri) 係與第13B圖所示CDR1取基睃序列（均為seq id NO 134) 相同性至少90% ’且較佳至少約95%或以上。典型地，重鏈 超可變區之第一 CDR(CDR2)係與第13C圖所示CDR21胺基 92214(修正版) 31 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） ’ 酸序列（SEQ ID N0S.分別為9及101)相同性至少90%，且 • 較佳至少約95%或以上。此外較佳，重鏈超可變區之第三 CDR(CDR3)係與第13D圖所示CDR3胺基酸序列（均為SEQ ID NO. 10)相同性至少90%，且較佳至少約95%或以上。 另一本發明具體實施例中，輕鏈超可變區之第一 CDR (CDR1)係與第12B圖所示CDR1胺基酸序列（仰卩id no Π6) •相同性至少90%，且較佳至少約95%或以上。典型地，輕鏈 超可變區之第二CDR(CDR2)係與第12C圖所示CDR2胺基酸 序列（SEQ ID N0[: ]. 6)相同性至少，且較佳至少約 或以上。較佳，輕鏈超可變區之第三CDR(CDR3)係與第12D 圖所示CDR3胺基酸序列（SEQ id N〇[:].7)相同性至少 90%，且較佳至少約95%或以上。 另一種本發明之人類化抗體包括重鏈超可變區之第一 架構FR1，該FR1係與第13A圖顯示為「FR1 HC-〇8」之FRi 胺基酸序列（SEQ ID NO. 129)相同性至少9〇%，且較佳約95% •或以上。-具體實施例中’ FR1包含下列胺基酸變化之至 少一者：E1改變成Q ; Q5改變成v ; P9改變成g ; LI 1改 變成V ; V12改變成K ; Q19改變成r ;以及τ24改變成A。 較佳FR1包括該等變化中之二、三、四、五或六者，以全 部之胺基酸變化用於多項應用用途為較佳。 此外本發明之人類化抗體包括重鍵高度可變區之第二 架構FR2,該FR2與第13A圖所示為「FR2 HC_〇8」之印2 序列（SEQ ID NO. 123)相同性至少為90%，較佳至少約g5% 或以上。一具體實施例中，該FR2包括下列胺基酸變化之 92214(修正版) 32 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） 至少一種：41H改變成P;以及4㈣變成G。較佳繼包 括該等胺基酸二者均變化者。 本發明之特徵也包括人類化抗體，其中重鍵高度可變 區之第二木構（FR3)係與第13A圖做為「hc~〇8之叩3 序列（SEQ ID _〇].126)相同性至少為霞且較佳至少 95%或以上。-具體實施例中，FR3包括下列胺基酸變化中 之至少-者：76S改變成T ; m改變成s ;腳 82H改變成E ; 84N改變成s ; 87T改變成r ;謂 錢91S改變成T。較佳FR3包括該等胺基酸變化之二、， 三、四、五或六者，通常以全部七種胺基酸 ^ 此外本發明特徵為人類化抗體，其 ^佳。 之第四架構⑽4)係與第13A圖做為「ρ ^可變區 ™^1(SEQ ID NO.l22),am„^ 90〇/〇,fe^FR； 脱或以上。較佳刚包括下列胺基酸變化：u3L ^至^ 另-種依據本發明之人類化抗體 核V。 之第-架構™，該m係與第12A圖為^，可變區 ^fru,^^,kseq id νο.109),^^^ 佳約至少95%或以上。一具體电 且較 酸變化之至少-者，改變== 變成D;以及18改變成R。較佳F艾:改 或三者，全部四種胺基酸變化更佳。匕㈣“化中之二 本發明之人類化抗體特鏈 構⑽)與第12A圖所示為「pp:间度可，支區之第二架 _1〇购.1〇8)相同性至小1^—〇9」之叩2胺基酸序列 夕為90%，較佳至少約95%或以 92214(修正版) 33 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） • 上。較佳FR2之胺基酸變化：37Q改變成L者。 • 本發明之特徵也包括人類化抗體，其中輕鏈高度可變 區之第三架構（FR3)係與第12A圖做為「FR3 LC-09」之FR3 胺基酸序列（SEQ ID N0. 112)相同性至少為90%且較佳至少 95%或以上。一具體實施例中，FR3包括下列胺基酸變化中 . 之至少一者：70K改變成D ; 74K改變成T ; 80A改變成P ; 84A改變成V ;以及85N改變成T。較佳FR3包括該等胺基 酸變化之二、三或四者，通常以全部五種胺基酸變化為較 鲁佳。 此外本發明亦包括人類化抗體，其中輕鏈高度可變區 之第四架構（FR4)係與第12A圖做為「FR4 LC-09」之FR4 序列（SEQ ID NO. 110)相同性至少為90%且較佳至少95%或 以上。較佳FR4包括至少一種，更好所有之下列胺基酸變 化：100A改變成Q及106L改變成I。 本發明也涵蓋前述人類化抗體之人類TF結合片段為 #其特徵。此等片段例如包括Fab、Fab’及F(ab)2。 特定具體實施例中，本發明之特徵包括一種人類化抗 體，其包括至少一種齧齒類互補決定區（CDR)，通常為小鼠 C D R。較佳該抗體係專一性結合至人類組織因子（T F )而形成 複合物，其中因子X或因子IX結合至TF或TF/VIIa，藉 TF/VIIa之活化受抑制。亦較佳為人類化抗體包括於重鏈 包括下列成分之至少一者且更佳包括全部下列成分： a)第一 CDR(CDRl)，其係與第13B圖所示CDR1胺基酸 序列（SEQ ID NO, 134)之相同性至少為95%， 34 92214(修正版) 1338009 第9112517 3號專利t請案 (99年9月23日） b) 第二CDR(CDR2)，其係與第13C圖所示CDR2胺基酸 序列（SEQ ID N0S. 9或101)之相同性至少為95%， c) 第三CDRCCDR3)，其係與第13D圖所示CDR3胺基酸 序列（SEQ ID N0, 10)之相同性至少為95%， d) 第一架構（FR1)，其與第13A圖顯示為「FR1 HC-08」 之FR1胺基酸序列（SEQ ID NO. 129)之相同性至少為95%， e) 第二架構（FR2)，其與第13A圖顯示為「FR2 HC-08」 之FR2胺基酸序列（SEQ ID NO. 123)之相同性至少為95%， f) 第三架構（FR3)，其與第13A圖顯示為「FR3 HC-08」 · 之FR3胺基酸序列（SEQ ID NO. 126)之相同性至少為95°/〇， 以及 g) 第四架構（FR4)，其與第13A圖顯示為「FR4HC-08」 之FR4胺基酸序列（SEQ ID N0[N0].122)之相同性至少為 95%。 特定具體實施例中，人類化抗體於輕鏈也包括下列成 分之至少一者且較佳包括全部成分： 籲 h) 第一 CDR(CDRl)，其係與第12B圖所示CDR1胺基酸 序列（SEQ ID NO. 116)之相同性至少為95%， i) 第二CDR(CDR2)，其係與第12C圖所示CDR2胺基酸 序列（SEQ ID NO. 6)之相同性至少為95%， j) 第三CDR(CDR3)，其係與第12D圖所示CDR3胺基酸 序列（SEQ ID NO. 7)之相同性至少為95%， k) 第一架構（FR1)，其與第12A圖顯示為「FR1 LC-09」 之FR1胺基酸序列（SEQ ID N0S. 109)之相同性至少為95%， 35 92214(修正版) 1338009 第9112517 3號專利中請案 (99年9月23日） ' 1)第二架構（FR2)，其與第12A圖顯示為「FR2 LC-09」 ' 之FR2胺基酸序列（SEQ ID N0. 108)之相同性至少為95%， m)第三架構（FR3)，其與第12A圖顯示為「FR3 LC-09」 之FR3胺基酸序列（SEQ ID N0. 112)之相同性至少為95% 1 以及 η)第四架構（FR4)，其與第12A圖顯示為「FR4LC-09」 之FR4胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ[ΝΟ].110)之相同性至少為 95%。較佳該人類化抗體進一步包括第14Α圖（SEQ ID 籲NO. [NO. ]97)或第15A圖（SEQ ID NO, [NO]99)之輕鏈保留序 列。也較佳該抗體包括第14B圖（SEQ ID NO. [NO]98)或第 15B圖（SEQ ID NO. [N0]100)之重鏈保留區。 本發明也有特徵在於一種人類化抗體其於重鏈包括下 列成分之至少一者且較佳包括全部成分： a)第一 CDR(CDRl)，其係與第13B圖所示CDR1胺基酸 序列（SEQ ID N0, 134)相同， • b)第二CDR(CDR2)，其係與第13C圖所示CDR2胺基酸 序列（SEQ ID N0S. 9 或 101)相同， c) 第三CDR(CDR3)，其係與第13D圖所示CDR3胺基酸 序列（SEQ ID Ν(λ 10)相同， d) 第一架構（FR1)，其與第13Α圖顯示為「FR1 HC-08」 之FR1胺基酸序列（SEQ ID NO. 129)相同， e) 第二架構（FR2)，其與第13A圖顯示為「FR2 HC-08」 之胺基酸序列（SEQ ID NO. 123)相同， f) 第三架構（FR3)，其與第13A圖顯示為「FR3 HC-08」 36 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） 之胺基酸序列（SEQ ID N0. 126)相同，以及 g) 第四架構（FR4)，其與第13A圖顯示為「FR4HC-08」 之卩1^胺基酸序列（8即1〇仙.[叩]122)相同。 一具體實施例中，人類化抗體於輕鏈進一步包括下列 成分之至少一者且較佳包括全部成分： h) 第一 CDR(CDRl)，其係與第12B圖所示CDR1胺基酸 序列（SEQ ID N0. 116)相同， i) 第二CDR(CDR2) ’其係與第12C圖所示CDR2胺基酸 序列（SEQ ID N0. 6)相同， · j) 第三CDRCCDR3)，其係與第12D圖所示CDR3胺基酸 序列（SEQ ID N0. 7)相同， k) 第一架構（FR1)，其與第12A圖顯示為「FR1 LC-09」 之FR1胺基酸序列（SEQ ID N0. 109)相同， l) 第二架構（FR2)，其與第12A圖顯示為「FR2LC-09」 之FR2胺基酸序列（SEQ ID N0. 108)相同， m) 第三架構（FR3) ’其與第12A圖顯示為「FR3 LC-09」 · 之FR3胺基酸序列（SEQ ID NO. 112)相同，以及 η)第四架構（FR4) ’其與第12A圖顯示為「FR4LC-09」 之FR4胺基酸序列（SEQ ID NO. [ΝΟ]110)相同。較佳該人類 化抗體進一步包括第14Α圖（SEQ ID NO. [Ν0]97)或第15Α 圖（SEQ ID NO. 99)之輕鏈保留序列。也較佳該抗體包括第 14B 圖（SEQ ID NO. [NO]98)或第 15B 圖（SEQ ID NO [NO]. 100)之重鏈保留區。 本發明之人類化抗體除了全抗體外可以多種適當形式 37 92214(修正版) 1338009 (99 珧辱利申請索 月 2 3 s 、 存在，包括，例如Fv、Fab及F(ab’）2以及雙官能雜交抗體 (例如Lanzavecchia等人，歐洲免疫學期刊17’ 105(1987)) 以及單鏈（例如Huston等人，美國國家科學院議事錄，85， 5879-5883(1988)以及 Bird 等人，科學 242，423-426 (1988)，以引用方式併入此處以供參考）。（參考Ho〇d等 人’免疫學’紐約班哲明，2.sup.nd ed. (1984)，Harlow 及Lane ’抗生素。實驗室手冊，冷泉港實驗室（1988)以及
Hunkapiller 及 Hood，自然，323，15-16(1986)，以引用 胃方式#入祕）。 嵌合體抗體」一詞或相關名詞包括其複數形表示抗 體其輕鏈以及重鏈基因典型係藉基因工程學而由屬於不同 種屬的免疫球蛋白基因節段組構而成。例如，得自小鼠單 株抗體之基因之可變（v)節段係接合至人保留（c)節段，如 T 17 典型的治療性嵌合體抗體為由得自小鼠抗體之 V領域或抗原結合領域以及得自人抗體之[領域或效應物 領域組成的雜交蛋白質，但也可使用其它哺乳類種屬。特 佳嵌合體抗體為此處揭示之小鼠-人嵌合體。 本發明之人類化抗體視需要可為多株或單株且可具有 kGl或IgG4同種型基因。 此處揭不之人類化抗體可藉多種策略之一或其組合製 造’該等策略W前述策略 。例如參考 S.L. Morrison， 二見上文，〇i痒人，參見上文；Teng等人，參見上文；Kozbor 等人’爹見上文；Olsson等人，參見上文；及先前引用的 其它參考文獻。 38 92214(修正版) ^38009 第911251*73號專利申請案 , (99年9月 23日） —種辦法中’採用四種概略步驟來人類化該抗體。首 先小鼠抗體輕鏈及重鏈胺基酸序列係得自cH36小鼠-人嵌 s體抗體。第一 ’ cH36抗體經由測定人類抗體架構區予以 人類化’獲得「最匹配」換言之，最密切類似對應小鼠架 構胺基酸序列。第三，相關輕鏈及重鏈FR序列經人類化； 以及第四編碼人類化輕鏈或重鏈（或人類化輕鏈及重鏈例 如參考後述大載體（mega vectors))之經單離之核酸之轉 移感染以及表現。 某些情況下選用有限數目之人類化免疫球蛋白架構胺 · 基酉欠係與施體該荨位置之胺基酸相同，而非與受體該等位 置之胺基酸相同。此項技術之優勢為可提升包括人類化免 疫球蛋白鏈之抗體親和力。也參考美國專利案第 5, 985, 279 ; 5, 693, 762 號；及 EP-A0239400(揭示一般人類 化抗體製法）。 特別「最匹配」辦法應用於將嵌合體抗組織因手抗體 cH36人類化為特佳。此種最匹配辦法中，第丨人及ib圖（3即· ID N0S: 2及4)所示小鼠輕鏈及重鏈可變序列用來搜尋（「比 對」）全部可取得之蛋白質資料庫有關與小鼠可變領域最類 似的該等人類抗體可變領域序列。例如參考KabM等人， 參見上文。多種方便易得之電腦程式可用於從事此項步驟 例如BLAST、FASTA以及相關程式。輕鏈及重鏈之架構J、 2 3及4特別々人感興趣，該等位置幾乎已經全然了解可 保有CDRs於適當方向性供抗原結合。來自搜尋的輸出典型 為最類似查詢小氣序列之序列表單、各序列類似性百分 92214(修正版) 39 第91125173號專利申請案 (99年9月 23日） 、以及各人序列於對應鼠序列之排齊情形。通常係對輕 ^及重鏈分開進行分析。 根據「最匹配」辦法，資料庫中查詢小鼠架構序列與 對應人類架構序列間不相匹配的胺基酸數目減至最低。大 部分情況下，適當人類架構區係基於如下相同性標準選 擇。於輕鏈，小鼠FR1胺基酸序列與對應人類FR1之相同 性至少約80% ;小鼠FR2與對應人類FR2之相同性至少約 _ 9⑽；小鼠FR3與對應人類FR3之相同性至少約90% ;以及 小鼠FR4與對應人類FR4之相同性至少約75%。以及於重 鏈，小鼠FR1胺基酸序列與對應人類FR1之相同性至少約 80% ;小鼠FR2與對應人類FR2之相同性至少約85% ;小鼠 FR3與對應人類FR3之相同性至少約70%;以及小鼠FR4與 對應人類FR4之相同性至少約90%。典型地，當評估類似 之候選人類架構序列時以保留性胺基酸取代為較有利。發 現考慮此等因數時，結合所得人類架構可做為嵌合體cH36 •抗體人類化之良好參考點。 也較佳根據「最匹配」辦法，於輕鏈及重鏈之全部人 類架構須儘可能衍生自同一株人類抗體。 一旦決定所需人類架構，重組聚合酶連鎖反應（PCR) 技術用來於輕鏈及重鏈做出所需胺基酸取代。典型地’製 造寡核苷酸且用來讓小鼠可變領域架構突變而含有所需殘 基。採用具有不等長度之寡核苷酸。參考W0 92/07075有 關重組PCR及相關方法之概略揭示。 通常使用常規PCR進行轉殖，導入轉殖或導入診斷核 40 92214(修正版) 1338009 第91125Π3號專利中請案 (99年9月23日） 酸内切酶位置，以及改變位於可變區末端之胺基酸殘基。 基於PCR之突變發生作用特別係用來當殘基位在可變區中 央時改變複數個胺基酸殘基。位置導向之突變發生作用用 來一次導入一或二個胺基酸取代。於各步驟後，部分人類 化純株經定序，若干可變區後來被轉殖入表現載體。進行 此等操作之更特定方法說明於實施例乙節。 於進行前述最匹配辦法來將嵌合體cH36抗體人類化 後，將編碼架構及/或CDR之經突變發生的核酸鏈結至編碼 輕鏈或重鏈保留區的適當DM。然後將此種構成體轉殖入 ® 表現載體，轉移感染宿主細胞且較佳為哺乳類細胞。此等 步驟係經由使用業界已知之重組技術及細胞培養技術達 成。如此本發明之人類化抗體可藉下述概略方法製備： (a) 製備第一表現載體，該表現載體包括適合用於該表 現宿主之複製子、以及以可操作方式鏈接至DNA序列之適 當啟動基因，該DNA序列編碼Ig重鏈或輕鏈之至少一個可 變領域，該可變領域包含根據「最匹配」辦法製備之人類 · 化架構區1至4以及得自cH36抗體之鼠CDRs 1至3， (b) 製備第二可複製表現載體，其包括以可操作方式鏈 接至DNA序列之適當啟動基因，該DNA序列至少編碼互補 Ig輕鏈或重鏈個別的可變領域，該可變領域包含根據前述 「最匹配」辦法製備之互補人類化架構區1至4以及得自 cH36抗體之鼠CDRs 1至3 ; (c) 以第一製備之載體或第二載體轉移感染細胞株；以 及 41 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年 9月 23日） (d)培養該經過轉移感染之細胞株而製.造經改變的抗 體。 較佳於步驟（a)及（b)之DNA序列編碼適當得自人抗體 鏈之保留領域。適當的同種型基因包括例如IgGl及IgG4。 另外，本發明之適當人類化抗體可經由製造單一可複 製「大」載體而製備，該大載體包括適當啟動基因以可操 作方式鏈接至DNA序列，其編碼Ig輕鏈或重鏈之至少一個 可變領域，該可變領域包含根據「最匹配」辦法製備之人 *類化架構區1至4以及得自cH36抗體之小鼠CDRs 1至3。 較佳大載體額外包括一個適當啟動基因以可操作方式鏈接 至DNA序列，其編碼互補Ig輕鏈或重鏈個別之可變領域， 該可變領域包含根據前述「最匹配」辦法製備之互補人類 化架構區1至4以及得自cH36抗體之小鼠CDRs 1至3。 大載體之使用經常適合用於本發明之具體實施例，其中需 要來自單一載體之人類化抗體表現。 ® 其它方法極為適合用於製造本發明之人類化抗體及片 段。一具體實施例令，該方法包括下列至少一步驟且較佳 包括全部步驟： a) 比對得自齧齒類抗體之輕鏈架構之胺基酸序列與對 應人類抗體架構序列較佳為小鼠抗體之收集物， b) 由對應齧齒類輕鏈架構有最大胺基酸序列相同性 (亦即至少約70%序列相同性）之收集物選擇人類架構序列， c) 突變編碼齧齒類輕鏈架構之DNA節段，成為編碼人 類化輕鏈架構，該人類化輕鏈架構之胺基酸序列實質係與 42 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 步驟b)選用之人類架構序列相同（亦即至少約95%相同 性）， d) 對齧齒類輕鏈個別架構重複步驟a)至c)，俾製造複 數個DNA序列，其中各序列編碼人類化輕鏈架構，其中於 步驟b)選用之對應人類架構序列個別較佳係得自相同或相 異之人類抗體， e) 將步驟d)製造之編碼人類化架構序列之DNA序列組 裝入第一載體，該第一載體至少編碼齧齒類抗體之輕鏈可 變區；以及 鲁 f) 於足夠產生人類化抗體之條件下，引入已組裝之載 體至適當宿主。用於該方法之較佳輕鏈架構序列包括此處 揭示之特定鼠及人類化輕鏈架構。 一具體實施例中，前述製造人類化抗體之方法進一步 包括下列步驟之至少一者且較佳包括全部步驟： g) 將得自齧齒類抗體重鏈架構之胺基酸序列與對應人 抗體架構序列收集物做比對， · h) 由與對應齧齒類重鏈架構有最高胺基酸序列相同性 (亦即至少約70%序列相同性）之收集物，選擇人架構序列， i) 讓編碼齧齒類重鏈架構之DNA節段發生突變，成為 編碼人類化重鏈架構，該人類化重鏈架構帶有於步驟（h) 選定之人架構序列實質相同（亦即至少約95%相同性）之胺 基酸序列；以及 j) 對齧齒類重鏈之個別架構重複步驟g)至i)，而產生 複數個DNA序列，其中各序列編碼人類化重鏈架構。較佳 43 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 為於步驟h)選定之對應人類架構序列個別係得自相同或相 ' 異人類抗體。較佳用於該方法之重鏈架構序列包括此處揭 示之特定小鼠及人類化重鏈架構。 更特別之人類化抗體之製法包括將步驟j)製造之編碼 人類化架構序列之腿A序列組裝入第二載體，該第二載體 至少編碼齧齒類抗體之重鏈可變區；以及將組裝妥之第一 及第二載體於足夠摩生人類化抗體之條件下引入宿主。 如此處討論，較佳由單一載體（偶爾為大載體）表現本 鲁發明之人類化抗體。一具體實施例中，該方法包括將步驟 j)產生編碼人類化架構序列之DNA序列，組裝入第一載 體，該第一載體至少編碼齧齒類抗體之重鏈可變區及輕鏈 可變區；以及將該進一步組裝妥的第一載體於足夠產生人 類化抗體之條件下引入宿主體内。 「組裝」或「組裝妥」等詞表示使用標準重組技術來 將編碼人類化架構之本DNA序列引入載體内。此種組裝可 籲藉一種辦法或多種辦法之組合進行，包含，但非限於將迭 代變化導入單一架構序列，共同剪接各片段（透過使用限剪 核酸内切酶以及接合酶），或藉合成DNA合成技術進行。概 略參考Harlow及Lane(參見上文）及Ausubel等人（參見上 文）。 前述人類化抗體製法可使用幾乎任一種可接受之突變 發生技術施行。特別前述步驟c)及i)之一或二者可採用位 置導向突變發生法或標準PCR方法來以適當人胺基酸置換 架構中之所需齧齒類胺基酸。典型地，經過修改之（人類化） 44 922丨4C修正版) 1338009 架構序列係對應.於選自資料庫之人架構序列产 人類化抗體可使用任-種適當重組表現系 如揭示於S· L. Morr i son，參見上文；〇 i等人 ％
Teng等人，參見上文；Kozbor等人，參見上 > 見上文； 等人，參見上文；及其它前文引述之參考文獻。
例如，適當的本發明核酸可編碼此處揭示之人 體或其片段之重鏈或輕鏈中之至少n型地該核= 包括經轉之核酸之重組醜載體。該職栽體典型㈣ 一步包括表現控制多核苷酸序列，其係以可操作方式聯么士 至人類化免疫球蛋白編碼序列，包括天然相關啟動基因、^ 或非同源啟動基因區。較佳表現控制序列為可轉形或轉: 感染真核伯主細胞，載體中之真核啟動基因系統，但也可 使用原核宿主控制序列。一旦載體已經結合入適當宿主，
宿主係維持於適合高度表現核苷酸序列之條件下，若有所 需接著為輕鏈、重鏈、輕重鏈二元體或完好抗體、結合片 •ί又或其匕免疫球蛋白形式之收集與純化。 最終可表現所需人類化抗體之本發明之核酸序列可由 多種不同多核苷酸（基因體或cDNA、RNA、合成寡核苷酸 等）及成分（如V、j、d及c區）構成，以及藉多種不同技術 製成。接合適當基因體序列及合成序列為目前最常用的製 法’但也可利用cDNA序列。例如參考S. L. Morrison，參 見上文；〇1等人，參見上文；Teng等人，參見上文；Kozbor 等人，參見上文；Olsson等人，參見上文；歐洲專利公告 案第 0239400 銳以及 Riechmann, L.等人，自然 ’ 332-323- 45 92214(修正版) 1338009 第911251?3號專利申諳亲 (9 9年9月2 3日 327(1988);及其中引用之參考文獻。 一具體實施例中，適當的DNA表現載體包括一或多個 選擇標記（例如四環素（tetracycline)、安比希林 (ampicillin)或新黴素（neomycin))，俾允許偵測使用所需 DNA序列轉形的細胞（例如參考美國專利案第4, 7〇4,祁2 號，以引用方式併入此處）。大腸桿菌（E. c〇li)為供轉殖 -本發明之多核苷酸特別有用之一種原核宿主。其它適合使 用之微生物宿主包括（但非限制性）桿菌，如枯草桿菌 籲（Bacillus subtilus)，及其它腸細菌科，例如沙門氏菌 (Salmonel la)、沙雷氏菌（Serratia)、多種假單胞桿菌屬 (Pseudomonas species)以及其它微生物例如放線菌科（如 鏈絲菌屬（Streptomyces species))、酵母（如釀母菌屬 (Saccharomyces species))或真菌（如麴菌屬 (Aspergillus species))。此等原核宿主中，也可使用表 現載體’表現載體典型含有可與宿主細胞相容之表現控制 •序列（例如啟動基因以及複製起點）。此外，可存在有多種 眾所周知之啟動基因中之任一者’例如乳糖啟動基因系 統、色胺酸（trp)啟動基因系統、々内醯胺酶啟動基因系統 或得自嗟菌體λ之啟動基因系統。啟動基因典型地控制表 現，視需要地帶有操縱基因序列，以及帶有供引發以及完 成轉錄及轉譯用之核糖體結合位置序列等。其它微生物如 酵母也可用於供表現。以釀母菌為較佳宿主，帶有適當載 體’該載體有表現控制序’列如啟動基因，包括3-鱗酸甘 油酸激轉或其它糖分解轉’以及視需要包括複製起點、終 46 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 • (99年9月23曰） 結序列等。植物（如南芥菜屬（Arabid〇pSis)、菸草屬 (Nicotinia)等）以及植物細胞培養也可用於表現且製造本 發明抗體。 除了前述以微生物為主之系統外，哺乳動物組織細胞 培養也可用來表現及製造本發明之多肽（參考Winnacker， 由基因至純株，VCH出版社，紐約州紐約（1987年），以引 用方式併入此處）。 多種情況下’通常以真核細胞為佳，典型為⑽細胞 株、多種C0S細胞株、NS0細胞、BI(細胞、心細胞以及鲁 較佳骨髓瘤細胞株等或轉形後之融合瘤B細胞。此等細胞 之表現載體包括表現控制序列，如複製起點、啟動基因、 及促進基因（Queen等人，免疫綜論89，46_68(1986))以及 需要的處理資訊位置例如核糖體結合位置、RNA煎接位置、 聚腺苦化位置、以及轉錄終結子序列。較佳表現控制序列 為衍生自免疫球蛋白基因、SV40、線病毒、牛乳頭瘤病毒、 細胞巨病毒等之啟動基因。 _ 較佳用以實施本發明之DNA载體包括下列以可操作方 式聯結之序列：抗生素抗藥性標記如安比希林抗藥性、π 起點以及重鏈（HC)或輕鏈（LC)可變區。該可變區可插入適 當重鏈表現’其序列包括以可操作方式聯結：重鏈可變區、 人IgGl或IgG4保留區、第一 poly A位置、別4〇啟動基 因、抗生素抗藥性標記如新黴素抗藥性、第二p〇lyA位置^ 細胞巨病毒（CMV)啟動基因/促進基因，以及適當前導子序 列0 92214(修 JL 版) 47 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） 其它較佳DNA載體包括輕鏈可變區.以可操作方式聯結 至齧齒類/c插入序列（intr〇n)(如小氣），該插入序列係以 可心作方式聯結至適當人《保留區；以及包括抗生素抗藥 性標記，如新黴素抗藥性。 如此處討論，經常可由單一核酸表現本發明 之人類化 抗體。較佳DNA载體偶爾於此處稱做為「大」載體，且於 序列中以可操作方式聯結下列成分：SV40啟動基因、抗生 鲁素抗藥性標記如新黴素、第一 p〇ly A位置、第一 CMV啟動 因/促進基因、輕鏈可變區、齧齒類/c插入序列（如小 氣）' 人/c表現序列、第二p〇ly A位置、第二CMV啟動基 因/促進基因、重鏈可變序列以及人IgGl或IgG4重鏈保留 區。此種大載體特例為後文於實施例11所述人類化抗TF IgG1抗體表現載體。也參考第11圖。
下述三種核酸載體PSUN36(人類化抗-TF抗體IgGl-HC 表現裁體）、PSUN37(人類化抗-TF抗體IgG4-HC表現載 體）、、 、以及pSUN38(人類化抗-TF抗體LC表現載體）已經遵 二布達佩斯條約寄存於美國維吉尼亞州20110-2209瑪納 薩斯大學林蔭大道10801號美國菌種保藏中心（ATCC)。載 體分別具有下述存取編號：PTA-3727(pSUN36) ; PTA-3728 (PSUN37);及 PTA-3729(pSUN38)。 夕種適當的宿主細胞可用於製造此處揭示的人類化抗 -巧心。一具體實施例中，該方法包括提供一種使用下 歹]轉移感染之宿主細胞：1)編碼人類化抗體或其片段輕鏈 之第—表現載體，以及編碼人類化抗體或其片段重鏈之表 48 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 現載體；或2)編碼人類化抗體輕鏈及重鏈二者之單一表現 載體，宿主細胞維持於表現各鏈之生長條件下，以及分離 人類化抗體或其片段。 例如，經轉移感染而產生人類化抗體之細胞株可為中 國倉鼠卵巢（CH0)細胞株、BK細胞株或NS0細胞株。其它 可接受之細胞株包括經過認可之永生化哺乳類細胞株且較 佳為淋巴來源細胞株例如骨髓瘤、融合瘤、三元融合瘤或 四元融合瘤細胞株。細胞株也包含正常淋巴細胞如B細 胞，其已經使用病毒如EB病毒（Epstein-Barr virus)轉型鲁 而永生化。已有報告指出使用CH0細胞表現多種蛋白質之 方法。例如參考Ur 1 aub等人，美國國家科學議事錄，7? 4216-4220(1980))以及W0 87/04462。後文於實施例乙節 所述之NSO細胞亦較佳。 雖然用於製造人類化抗體之細胞株較佳為哺乳類細胞 株仁另外可使用任何其它適當細胞，例如細菌細胞、植 物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞。特別涵蓋可使用大腸桿菌鲁 衍生之細菌種系。 旦由適當細胞來源表現抗體，則可根據標準程序回 H =化本發明之全抗體、其二元體、個肺鏈及重鍵、 本發明之免疫球蛋白形式（例如具功能之人類化抗 體片&)。此等程序包括，但非限於硫義沈澱、親和管柱、 管柱層析術、明膠電泳等（概略參考Sc〇pes，R.，蛋白質 ’屯化史賓哲維賴（Springer_Verlag)，紐約（1982年））。 實質為純質之本發明人類化抗體及其片段具有至少約9〇 49 92214(修正版） 1338009 Μ 專利申琦案 第 (9。Λ· A 现寻 3 至95%同質性，以約98至99%或以上同質性 年9月2 用於大部分藥物用途。一旦純化後，視需要^通常較佳 純化之均質，人類化抗體可供治療用，或用於=純，或 檢定分析程序、免疫螢錢色等（概略參考切^及實施 I及II冊，Lefkovits及Pernis編輯，學術法’第 州紐約（〗979年及1981年））。 ？ ’紐約 本發明之人類化抗體之較佳純化方法涉及習知 離子交換層析術，較佳使用重組蛋白質八希法羅斯”和及 (s_聰）純化（已經辨識人Ig G Fc對重組蛋白 法羅斯有高度親和力）。收集含抗體之洗提分，進 離子交換騎術且較佳使用法羅斯層析。 2 白質峰經匯集且對適當溶液或緩衝· m做體之蛋 根據本發明之人類化抗體及其片段可藉標準 或標準方法組合測試其功能。較佳_ # # τ ρ h w 析。較佳方法偶爾於此處稱做為「襟準凝血酶原日 定分析等術語。標準凝血酶原時間（ρτ)檢定分析;^ 下列至少一步驟且較佳全部步驟： '、 a) 組合TF與因子Vila而形成〜種結合複合物， b) 於可誘導形子XaU因子_之條件下讓該处 合複合物接觸因子X(或因子IX)， ' C)因子Xa接驗血酶原可錢凝血_，較佳係於因子 Va及脂質存在下進行。 ' 進行標準pt檢定分析之較佳的TF來源於市面上可以 伊諾文（In_hO獲得。巍血中因子來源為稱做希仇⑹― 92214(修正版) 50 1338009 f999nr93，'i申請案 漿製
Trol)凝血對照的人如 、
驗 nM 此處提供之人》化抗體及其片段方 。將-份經純化么批體或片段較佳約2 "^檢^分析試 ㈣，添加至該方法，軾隹係於步驟a)切、ΛΜ至約2_ 用途而言於檢定分折其它點添加為佳。典:’但對某些 抗體或片段添加至爺仇凝結對照，接著泰如，，將人類化 高度較佳之人類化抗體及其片段包枯=織因子。
Fab、Fab’、F(ab)2 ’以及當單鏈抗體（包含人類化之 抗原結合可變區）存在於標準檢定分析中之以約ln= 約漏，較佳約5nM至約_，及更佳約】_濃度時， 將延長凝血時間達至少約5秒。典型對照為未添加任何抗 體ί其片段施行之標準PT檢定分析。此外較佳本發明抗體 二，與對照組相比’可達成組織因子相依性凝血抑制作 用至少約90%且較估5 ^ , 私佳至少約95%或以上。標準ΡΤ檢定分析 之特例述於實施例5及"。 ,,…、已、’"說明某個範圍之本發明之治療性抗凝血劑組 亦含有其它包括人類化抗體及其片段之組成物。例 接種抗體及月段可用作為單獨治療劑，或組合-或多 片段二體或片段用來達成預定結果。此種抗體及 β、’且0其匕抗體使用，特別係對該疾病有反應性 胞之ί它標記的反應性人單株抗體。 、. 」文說明多種本發明抗體及其片段之主要用途，例如 、]、;則生物樣本中之天然組織因子，用於偵測及純化可 、見、且織因子之細皰’以及用於於人類病人預防或治療例 51 知丨4(修正版） 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23日） (9 9年 9月 2 如非期望之血液凝固等醫療病情。實際上，人類化抗體可 呈個別投予之組成物使用，组合其它抗凝▲劑（包括阿斯匹 靈琴Γ1η)、香丑素、肝素 '水虫至素或水蛭肽（hirulog)) 使用本务月也/函蓋與抗血小板劑（例如里歐普、積谷剩、 凝斯大'普拉韋及/或提可利及/或血检溶解劑（如組織胞質 素原活化劑、鏈激酶及尿激酶）合併投藥。 於-體見知例中，此處所述治療性抗凝血組成物包 括一或多種人類化抗體或片段，該組成物包括抗體或其多 種混合物轉於可接受之_，㈣為水性賴之溶液。 曾經引述多種水性載劑，例如水、經緩衝之水、q彻水、 0J甘胺酸等。此等溶液較佳為無菌，且通常不含粒狀物 質。此等組成物可藉習知、眾所周知之滅菌技術滅菌。組 成物可含有近似生理條件需要的醫藥上可接受之輔助物 質，例如p Η調節劑及緩衝劑、毒性調整劑等，例如乙酸鈉' 氣化鈉、氯化卸、氣化妈、乳酸納等&抗體於此等調配物 之濃度可有寬廣變化，例如由低於0 5%，通常於或至少約 1%至高達15或2〇%重量比，主要係根據選用之特定投藥模 式基於體液容積、黏度等而選用。概略參考雷明頓醫藥百 科，參見上文。 、-'、 若有所需’此處所述抗凝血組成物可凍乾儲存，且於 使用前於適當載劑重新調製。此項技術可有效用於習知免 疫球蛋白。任一種適當凍乾以及重新調製技術皆可使用β 热諳技藝人士了解凍乾及重新調製可能導致不等裎度的抗 體活性損失（例如使用習知免疫球蛋白，IgM抗體性^ 92214(修正版) 52 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23日） 失比IgG抗體更.高），因而必須調整使用濃度來補償活性的 損失。 用於某些預防性用途，將治療性抗凝血組成物投予尚 未患有可偵測的疾病狀態病人，可提升病人對疾病的抵抗 力。此種用量定義為「預防有效劑量」。此項用途中，精確 用量再度係依據病人健康狀態以及全面性免疫程度決定， 但通常係於每劑0. 1至25毫克之範圍，特別每一病人0. 5 至2.5毫克之範圍。較佳預防性用途係用於預防計晝接受 侵襲性醫療手術後出現非期望的凝血。 * 如此處討論，本發明亦提供套件組，其包括本發明之 抗體或其片段。一具體實施例中，人類化抗體或其片段可 供給用於抗TF抗原或用於偵測TF抗原。如此，例如一或 多種人類化抗體、其片段或單鏈抗體通常可以凍乾形式置 於容器提供。此種抗體、片段或單鏈抗體可軛合至前述標 籤或毒素，或未經扼合，與緩衝劑（如Tris、鱗酸鹽、碳 酸鹽等）、安定劑、殺生物劑、惰性蛋白質（如血清白蛋白）籲 等共通涵括於套件組。通常依據活性抗體存在量而定，此 等材料之存在量係低於約5%重量比；再度以抗體濃度為基 準，通常總存在量至少約為0.001%重量比。經常希望涵括 惰性增量劑或賦形劑來稀釋活性成分，此處賦形劑之存在 量係占總組成物約1至99% wt。檢定分析若採用第二可結 合至嵌合抗體之第二抗體，則第二抗體通常係存在於分開 的小瓶。第二抗體典型係軛合至標籤，且以類似前述抗體 調配物之方式調配。套件組通常亦涵括一組使用指示。 53 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） ' 如此處討論，本發明也提供多種於哺乳類，較佳為靈 * 長類如人類病人，抑制血液凝結之方法。 例如一具體實施例中，該方法包括對哺乳類投予治療 有效量之此處提供之人類化抗體或其片段（其專一性結合 至人組織因子（TF)而形成複合物）中之至少一者，或較佳 一、二或三者。典型地，因子X或因子IX結合至TF或TF: FVIIa以及藉TF : FVIIa活化受到抑制。大部分具體實施 例中，該方法進一步包括抗體與TF間形成專一性複合物來 •抑制血液的凝結。 也提供於哺乳類抑制血液凝結之方法，包括對該哺乳 類投予治療有效量之此處揭示之人類化抗體或其片段。典 型抗體及片段係專一性結合至人組織因子（TF)而形成複合 物，此外其中因子X或因子IX結合至TF或TF : FVIIa以 及藉TF : FVIIa活化受到抑制。大部分具體實施例中，該 方法進一步包括抗體與TF間形成專一性複合物來抑制血 鲁液的凝結。 更特定例中，本發明提供於哺乳類抑制血液凝結之方 法，包括對該哺乳類投予治療有效量之此處揭示之人類化 抗體或其片段。典型抗體及片段係專一性結合至人組織因 子（TF)而形成複合物，此外其中因子X或因子IX結合至 TF或TF : FVIIa以及藉TF : FVIIa活化受到抑制。較佳人 類化抗體或其片段於重鏈包括下列成分之至少一者且較佳 包括全部成分： a)第一 CDR(CDRl)，其係與第13B圖所示CDR1胺基酸 54 92214(修正版) 1338009 第911251^73號專利申請案 (99年9月23日） 序列（SEQ ID Ν0..134)之相同性至少為95%， b) 第二CDRCCDR2)，其係與第13C圖所示CDR2胺基酸 序列（SEQ ID N0S. 9或101)之相同性至少為95°/〇， c) 第三CDRCCDR3)，其係與第13D圖所示CDR3胺基酸 序列（SEQ ID N0. 10)之相同性至少為95%， d) 第一架構（FR1)，其與第13A圖顯示為「FR1 HC-08」 之FR1胺基酸序列（SEQ ID NO. 129)之相同性至少為95%， e) 第二架構（FR2)，其與第13A圖顯示為「FR2HC-08」 之FR2胺基酸序列（SEQ ID NO. 123)之相同性至少為95%， · f) 第三架構（FR3)，其與第13A圖顯示為「FR3HC-08」 之FR3胺基酸序列（SEQ ID NO. 126)之相同性至少為95%， g) 第四架構（FR4)，其與第13A圖顯示為「FR4HC-08」 之FR4胺基酸序列（SEQ ID NO[NO].122)之相同性至少為 95%。 於更特定發明具體實施例中，人類化抗體於輕鏈包括 下列成分之至少一者且較佳包括全部成分： 籲 h) 第一 CDR(CDRl)，其係與第12B圖所示CDR1胺基酸 序列（SEQ ID NO. 116)之相同性至少為95%， i) 第二CDR(CDR2)，其係與第12C圖所示CDR2胺基酸 序列（SEQ ID NO. 6)之相同性至少為95%， j) 第三CDRCCDR3)，其係與第12D圖所示CDR3胺基酸 序列（SEQ ID NO. 7)之相同性至少為95%， k) 第一架構（FR1)，其與第12A圖顯示為「FR1 LC-09」 之FR1胺基酸序列（SEQ ID NO. 109)之相同性至少為95%， 55 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申猜案 (99年9月23日） • 1)第二架構（FR2) ’其與第12A圖顯示辱「FR2LC-09」 ^ 之FR2胺基酸序列（SEQ ID N0· 108)之相同性至少為95% ’ m)第三架構（FR3) ’其與第12A圖顯示為「FR3LC-09」 之FR3胺基酸序列（SEQ ID N0. 112)之相同性至少為95% ’ η)第四架構（仰4) ’其與第12A圖顯示為「FR4LC-09」 之FR4胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ[ΝΟ]·110)之相同性至少為 95%， 〇)輕鏈保留區其與第14Α圖（SEQ Π) Ν0[Ν0]·97)或第 籲15Α圖（SEQ ID ΝΟ[ΝΟ].99)所示胺基酸序列之相同性至少 為95% ;以及 Ρ)重鏈保留區其與第HB圖（SEQ ID ΝΟ[ΝΟ]·98)或第 15Β圖（SEQ ID ΝΟ[ΝΟ]·100)所示胺基酸序列之相同性至少 為 95%。 前述方法之更特定具體實施例中’人類化抗體或其片 段於重鏈包括下列成分之至少一者且較佳包括全部成分： # a)第一 CDR(CDRl) ’其係與第13Β圖所示CDR1胺基酸 序列（SEQ ID N0. 134)相同， b) 第二CDR(CDR2)，其係與第13C圖所示CDR2胺基酸 序列（SEQ ID N0S. 9 或 101)相同， c) 第三CDR(CDR3) ’其係與第13D圖所示CDR3胺基酸 序列（SEQ ID N0. 10)相同， d) 第一架構（FR1) ’其與第13A圖顯示為「FR1 HC 〇8」 之FR1胺基酸序列（SEQ ID NO. 129)相同， e) 第二架構（FR2) ’其與第13A圖_示為「FR2HC_〇 92214(修正版) 56 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 之FR2胺基酸序列（SEQ N0. 123)相同， f) 第三架構⑽其與第__示為「fr3hc〇8 之FR3胺基酸序列（SEQ 丨26)相间， g) 第四架構则，綱則_示為「fr4hc〇8 之FR4胺基酸序列（SEQ ID NO[NO].122)之相同. 以及於輕鍵： _所示CDR1胺基酸 _所示CDR2胺基酸
®所示CDR3胺基酸 h) 第一 CDR(CDRl)，其係與第 12B 序列（SEQ ID N0. 116)相同， i) 第二 CDRCCDR2)，其係與第 12C 序列（SEQ ID N0. 6)相同， j)第三CDR(CDR3)，其係與第12D 序列（SEQ ID N0. 7)相同， 1貝示為「FR1 LC-09」 同， k)第一架構（FR1)，其與第12A圖 之FR1胺基酸序列（SEQ ID N0. 109)相
l) 第二架構（FR2)，其與第12八圖_示為「fr2lc 〇9 之FR2胺基酸序列（SEQ ID NO. 108)相同， m) 第三架構（FR3)，其與第12A圖顯示為「FR3LC_〇9 之FR3胺基酸序列（SEq ID no. 112)相同， _ η)第四架構（FR4)，其與第12A圖顯示為「FR4LC_〇9_ 之FR4胺基酸序列（SEQ ID N〇[N〇]11〇)相同， 0)輕鏈保留區其係與第14A圖（SEQ ID N0[N0].97)或 第15A圖（SEQ ID NO. [N0]99)所述胺基酸序列相同，以及 P)重鏈保留區其係與第14B圖（SEQ ID NO[NO].98)或 第15B圖（SEQ Π) Ν0[Ν0]. 100)所述胺基酸序列相同。 57 922M(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） 本發明也提供多種偵測生物樣本中之組織因子（TF)之 方法。一具體貫施例中，該方法包括於可誘導形成複合物 之條件下，讓生物樣本與此處揭示之人類化抗體或其片段 接觸，以及偵測該複合物做為生物樣本存在有組織因子之 指示。 此處所述全部文件皆以引用方式併入此處。 下列非限制性實施例係供舉例說明本發明。後文實施 例及它處提及抗體H36及H36. D2。該等抗體為H36. D2. B7 之相同抗體，但H36係衍生自母純株，H36. D2係得自一次 純株’而H36.D2.B7係得自二次純株。三純株間就抑制組 織因子能力或其它物理性質而言未觀察得任何差異。於概 略用途，H36常用以指示藉任一純株或可產生抗體之相關 細胞株產生的抗TF抗體。 【實施方式】 實施例Ι-Anti-rhTF單株抗體之製備及轉殖 抗rhTF之單株抗體製備如後。 A.免疫接種與追加接種 五隻BALB/c雌小鼠以各1〇微克經過脂質化且經純化 之rhTF進行免疫接種。小鼠最初係藉腹内接種使用漢特氏 (Hunter’s)最大力價（Titermax)輔劑敏化。最後三次追加 接種係於0.85%氯化鈉投予。追加接種分別係於初步敏化 後2、5. 5及6. 5個月實施。全部追加接種皆係由腹内投予， 第一次除外，第一次採用皮下注射。末次追加接種係於輸 注前3日投藥且投予20微克。 58 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申琦案 (9 9年9月2 3日） B. 小鼠脾淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合 得自接受一次rhTF免疫接種之BALB/c小鼠脾臟之淋 巴細胞使用PEG 1500而融合至X63-Ag8. 653小鼠骨髓瘤細 胞。暴露於PEG後，細胞於經過加熱去活化之胎牛血清於 37°C共同培養1小時。然後融合細胞再度懸浮於RPMI 1640，且於37 C以10%二氧化碳共同培養隔夜。細胞於次 曰接種，接種係使用RPMI 1640且補充巨嗟細胞培養上清 液。 C. ELISA展開 鲁 ELISA檢定分析用之孔板使用1〇〇微升重組組織因子 (0.25微克/¾升）於以碳酸鹽為主之緩衝液塗覆。各步驟 皆係於室溫施行。孔板使用BSA封阻，經洗滌，然後加入 試驗樣本及對照樣本。抗原/抗體結合之彳貞測方式係將孔板 與山羊抗小鼠HRP輛合物（傑克森（jackson)免疫研究實驗 室）共同培養’然後使用ABTS過氧化酶酶基質系統（柯格德 及派瑞（Kirkegaard and Perry)實驗室）偵測。於波長405 · 奈米於自動孔板讀取器讀取吸光值。 D· rhTF融合瘤細胞株之穩定化 融合後兩週開始藉專一性rhTF ELISA篩檢融合瘤純 株。新純株的篩檢持續三週時間。每一至二週試驗陽性純 株是否連續產生抗體直到共冷凍15株穩定純株。 —次及二次轉殖 對各個陽性穩定融合瘤施行限制性稀釋轉殖而獲得一 -欠純株。細胞經解凍，於培養中生長短時間，然後由1〇細 59 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 胞/孔稀釋為〇, 1細胞/孔。一次純株係藉anti_rhTF試驗， 5至6陽性純株經過擴大且經冷凍。 anti-rhTF抗體之二次純株H36. D2. B7係得自一次純 株H36.D2，如前文說明製備且儲存於液態氮。一次純株之 四種不同稀釋倍數亦即5細胞/孔、2細胞/孔、1細胞/孔、 0.5細胞/孔準備於9β孔微力價孔板内開始做二次轉殖。 細胞於IMDM組織培養基中稀釋，培養基含有下列添加物： 20%胎牛血清（FBS)、L-麩胺、1〇〇單位/毫升青黴素、 鲁100微克/毫升鏈黴素、1% GMS-S、0, 075%碳酸氫鈉。為了 測定何種純株可分泌anti-rhTF抗體，得自〇. 2細胞/孔微 力價孔板之五個個別孔之上清液經過生長兩週後取出，如 後述藉ELISA檢定分析試驗是否存在於anti-rhTF抗體。 全部五純株於ELISA檢定分析皆顯示陽性結果，以H36. D2, B7為最佳抗體製造者。全部五純株皆於rpmi培養基内適 應且擴大’培養基含有下列添加物：l〇%FBS、2mML-麩胺、 鲁100單位/毫升青黴素、1〇〇微克/毫升鏈黴素、1% GMS-S、 0,075%碳酸氫鈉及0.013毫克/毫升草酸代乙酸。 H36.D2.B7係藉蛋白質A親和層析術而由細胞培養上清液 純化，試驗其於FX活化檢定分析抑制TF : Vila之能力。 結果指出H36.D2.B7之抑制作用如同H36.D2抗體。全部細 胞皆儲存於液態氮。
F,由 H36.D2.B7 分離全 RNA 269微克全RNA係由2. 7xl05H36, D2. B7融合瘤細胞分 離。全RNA之分離係藉由夸貞（Qiagen)公司之RNeasy Midi 60 922 Η(修正版) 1338009 第91125173號專利中請索 (99年9月23日）
Kits方案所述進行。RNA樣本儲存於-20¾之水中直至需用 時。 G. H36.D2.B7基因可變區之cdna合成與轉殖 為了獲得第一股cDNA，製備反應混合物且於“它培養 1小時，反應混合物含有5微克如前述分離之全rna，後引 子JS300(全部引子皆識別如後）用於重鏈（hc)以及oka 57 用於輕鏈（LC)，RNase抑制劑、Dni:p，DTT以及超錄本II 反錄S#。然後反應试管於65°C培養15分鐘來停止轉錄。 冷卻後，加入5單位RNaseH’讓反應於37°C培養20分鐘。籲 cDNA樣本至需用前係儲存於-7〇t：。 分開進行PCR(聚合酶連鎖反應）來轉殖得自如上製備 之cDNA之anti-rhTF，H36.D2.B7輕鍵及重鍵二者之可變 區（輕鏈及重鏈可變區之核酸及胺基酸序列示於第丨人及1B 圖）。進行二回合PCR。第1回合：用於重鏈，使用前引子 JS002及後引子JS300於96°C、53t及72°C進行35週期 之PCR。用於輕鏈’使用前引子jS009及後引子〇ΚΑ 57， φ 於96。(：、63°C及72°C進行35週期之PCR。第2回合：重 鏈及輕鏈之PCR皆係如同第1回合進行，但使用pMC_18做 為重鏈之前引子以及pMC-15做為輕鏈之前引子。第3回 合：對重鏈使用H36HCF以及H36HCR引子於96°C、60至 65°C以及72 C進行30週期之pcr。用於輕鏈，使用JJ36LCF 及H36LCR引子於96°C、58。(：及72。(：進行PCR共30週期。 下列引子用於轉殖H36.D2.B7之重鏈及輕鏈之可變 區。 61 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 0KA57 ： 5，-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTC-3’（SEQ ID N0: 17) JS300 ： 5’-GAARTAVCCCTTGACCAGGC-3’ （SEQ ID NO : 18) JS009 ： 55-GGAGGCGGCGGTTCTGACATTGTGMTGWCMCARTC-3,(SEQ ID NO ： 19) JS002 ： 秦 5’-ATTTCAGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTYCARCTKCARCARYC-3, (SEQ ID NO ： 20) pMC-15 : 5’-CCCGGGCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKG-3’（SEQ ID NO : 21) pMC-18 ： 5’-CCCGGGCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTC-3’ （SEQ ID • NO ： 22) H36HCF ： -ATATACTCGCGACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGATCCAGCTGCAG CAGTC-3’ （SEQ ID NO : 23) H36HCR : 5’-GACCTGAATTCTAAGGAGACTGTGAGAGTGG-3’（SEQ ID NO:24) H36LCF ： 5’-TTAATTGATATCCAGATGACCCAGTCTC03’（SEQ ID NO: 25) H36LCR : 62 92214(修正版) 1338009 第911251·73號專利申請案 (9 9年9月2 3日>' TAATCGTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCSEQ ID NO ： 26) 其中於前述SEQ ID NOS : 17至26 : K為G或T ; Μ為A或 C;R為A或G;S為C或G;V為A、C或G; W為A或T;Y 為C或Τ。 實施例2-本發明抗體之結合活性 採用如上實施例1製備之本發明抗體。rhTF分子係於 大腸桿菌表現，且根據標準方法藉免疫親和層析術純化（參 考Harlow及Lane，參見上文、Ausubel等人，參見上文）。鲁 抗體結合常數（Ka)以及解離常數（Kd)係藉ELISA以及表面 細胞質粒基因體共振檢定分析（亦即（BI Acore)測定（參考 例如Har 1 ow及Lane ’參見上文；Ausube 1等人，參見上文； Altschuh等人，生物化學，31 : 6298(1992);以及法瑪西 雅生物感測盗公司揭不之BI Acore方法）。用於BI Acore檢 定分析’ rhTF根據製造商的指示制動於生物感測器晶片 上。測定各抗體於四種抗體濃度（〇. 125ηΜ、0. 25ηΜ、0. 5nM 籲 及InM)之常數。 蛋白質濃度係藉標準檢定分析（Μ·Μ. Bradford，分析 生物化學，72 : 248(1976))測定，該檢定分析係使用牛血 清白蛋白做為標準品以及使用市售染料試劑（拜雷公司 (Bio-Rad))。 第2圖顯示各種anti-TF抗體之結合常數與解離常 數。抗體H36具有前文試驗之任一種anti-TF抗體中之最 高結合常數（L=3. ΙχΙΟΙΟΜ-1)以及最低解離常數（Kd=3. 63 92214(修正版) 1338009 第911251·?3號專利中請案 (99年9月23日） 1〇-丨丨M)。 ’ , 實施例3-FXa專一性酶基質檢定分析 一般而言’此處所述實驗係使用以磷脂基膽鹼（〇·〇7 毫克/毫升）以及磷脂基絲胺酸（〇.〇3毫克/毫升）以70/30 w/w 比脂質化之 rhTF，於 50mM Tris-HCl，pH7. 5，0. 1%牛 血清白蛋白（BSA)於37。(：經歷30分鐘進行。預先形成TF : FVIIa複合物備用溶液係將5nM脂質化rhTF及5nM FVIIa 於37°c培養分鐘製造。TF : FVIIa複合物分成各等分且 •至需用前係儲存於-7(Tc。經純化之人類因子VII、Vila及 FX係得自酶研究實驗室公司。下列缓衝液用於全部FXa以 及FVIIa檢定分析：25mM Hepes-氫氧化鈉、5mM氯化i弓、 150mM 氣化鈉、0. 1% BSA、pH7. 5。 篩選單株抗體封阻TF : Vila媒介FX活化成為FXa之 能力。於二非連續步驟測定FX之活化。於第一步驟（FX活 化）’於Ca+2存在下檢定分析FX轉成FXa。於第二步驟（FXa •活性檢定分析），FX之活化係藉EDTA淬熄，使用FXa專一 性產色酶基質（S-2222)測定FXa之生成。S-2222及S-2288 (參見後文）產色原係得自克摩吉尼士（Chromogenix)公司 (法瑪西推希帕（Pharmacia Hepar)公司配銷）。FX之活化 係於1. 5毫升微離心管内，經由將反應以〇· 〇8nM TF : Vna 共同培養進行，可以ant i -rhTF抗體前培養或以緩衝液對 照前培養。隨後反應於37X：培養30分鐘，然後加入30 nM FX ’接著又於37°c培養10分鐘。i?xa活性係於96孔微力 價孔板測定。由步驟1取出20微升樣本’於各孔内混合等 64 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 . (99年9月23曰） 體積之EDTA(500mM)，接著加入0.144毫升緩衝液及〇 〇16 毫升5mM S-2222酶基質。反應又於37。〇培養丨5至別分 鐘。然後反應使用0.05亳升50%乙酸淬熄，隨後記錄各反 應於405奈米之吸光值。實驗（加抗體）以及對照（不含抗體） 樣本由OD405nm值求出TF : FVIIa活性之抑制。某些實驗 中同時加入anti-hTF抗體、TF : FVIIa及Fx俾檢測結合 競爭情況。第3圖顯示H36.D2.MAb(粗體）比其它接受試驗 之anti-rHTF Mabs可抑制TF : FVIIa對Fx之活性至顯著 較高程度（95%)。 籲 實施例4-FVIIa專一性酶基質檢定分析 單株抗體進一步藉FVIIa專一性檢定分析篩檢。本檢 定分析中’ 5nM脂質化rhTF首先於37t於96孔微力價孔 板與緩衝液（對照組）或50nM抗體（實驗組）共同培養30分 鐘，然後混合5nM經純化之人FVIIa(VT=0. 192毫升），接 著於37。(：培養30分鐘。然後8微升20mM FVIIa專一性酶 基質S-2288備用溶液加至各孔（終濃度0. 8mM)。隨後反應 籲 於37°C培養1小時。使用〇· 06毫升50%乙酸淬熄後測定於 奈米之吸光值。由實驗樣本及對照樣本，由〇j)4()5nin值求 出TF : fvi la活性抑制百分比。 第4圖顯示當抗體與TF前培養（FVIIa添加前）、或抗 體添力σ至與FVIIa前培養之TF(添加抗體前）時，H36抗體 未能顯著封阻TF : FVIIa對S-2288酶基質之活性。如此指 不H36並未干擾TF與FVIIa間之交互作用（結合），H36也 未抑制TF : FVIIa對胜肽酶基質之活性。 65 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23日） ' 實施例5-凝血酶原時間（PT)檢定分析， * 鈣化血漿於添加血栓形成質（TF)後之數秒内將凝血； 此種現象稱做「凝血酶原時間」（PT：^經延長之凝血酶原 時間典型地為抗凝血活性的有用指標（例如參考Gilman等 人，參見上文）。 根據標準方法使用市售人血漿（Ci-Tr〇i對照，第j階 得自巴士特（Baxter)#斷公司），研究JJ36. D2抗體影響凝 血酶原時間之能力。於Ca+2存在下，藉添加脂質化rhTj?而 籲引發凝血反應。藉自動凝血計時器（MLA伊雷徹（Electra) 800)監視凝血時間。藉將毫升脂質化；rhTF(於50mM Tris-HCl，pH7. 5，緩衝液含 〇· 1% BSA，14. 6mM 氣化鈣， 0.07毫克/毫升填脂基膽驗及〇. 03毫克/毫升磷脂基絲胺 酸）注射至塑膠雙孔試官内引發PT檢定分析。試管各含0. 1 毫升血漿，與〇. 01毫升緩衝液（對照樣本）或抗體（實驗試 樣）前培養1皇2分鐘。藉H36.D2抗體抑制TF媒介之凝血 •係使用TF標準曲線計异’標準曲線中l〇g[TF]對log凝血 時間作圖。 第5圖顯米H36.D2抗體實質抑制人血漿之TF-引發凝 血。H36.D2抗體顯著延長PT時間，顯示抗體為組織因子 引發凝血之有效抑制劑（南達約99%抑制）。 實施例6-FX及H36.D2抗體競爭結合至TF : FVHa複合物 介於TF : FVlIa、FX與H36· D2抗體間進行競爭實驗。 第6A圖顯示實驗緒果’貫驗中預先製成之TF : FVIIa複合
物（0. 08nM)於分別包括 0. 02nM、〇. 〇4ηΜ、0. 〇8nM 及 〇. 16nM 92214(修正版) 66 丄338〇〇9 第91125173號專利申請案 UQo ^ . (99年 9月 23 日> .D2單株抗體之緩衝液内於37它前培養30分鐘。然後 添加FX(30nM)至TF : FVIIa與H36 D2抗體混合物，讓混 =物又於37。(：培養10分鐘。Fx活化係如前述使用脆淬 :。如此產生之FXa係如前文實施例3所述ρχ&專一性檢 疋分析測定。 第6B圖顯示遵照前述方式進行實驗結果，但同時添加 肋6. D2抗體、預先形成之TF : Fvna以及π來開始fx活 化檢定分析。 第6A及6B圖所示資料顯示H36. D2抗體及π係競爭籲 結合至該預先形成TF : FVIIa複合物。 實施例7-於細胞培養之TF活性之抑制 J-82為人類膀胱癌細胞株（得自ATCC)，其可豐富表現 天然人類TF為細胞表面蛋白質。為了了解H36卯抗體是 否可阻止FX結合至顯示於細胞表面之天然TF，J 82 活 化檢定分析係於FVII存在下於微力價孔板進行（參考D s.
Fair等人，生物化學期刊，262 : 1 1692(1987))。各孔内， 加入2xl〇5細胞，於37t與50毫微克FVII、緩衝液（對照 樣本）或anti-TF抗體（實驗樣本）共同培養2小時。隨後各 孔以緩衝液溫和洗滌，將〇· 3毫升FX(0. 05毫克/毫升）於 室溫添加至各孔歷30分鐘時間。某些情況下，抗體係與 Fx同時添加來偵測對天然TF的結合競爭作用。隨後，移 出—份0. 05毫升且添加至96孔微力價孔板的新孔内，孔 内含有0. 025毫升100mM EDTA。FXa活性係如前文實施例 3所述藉FXa專一性檢定分析測定。J-82細胞表面之活 67 92214(修正版） 1338009 第9112517 3號專利申請案 (99年9月23日） 性之抑制係於無抗體（對照樣本）以及有抗體（實驗樣本）存 在下，由ODmrnn求出。 第7圖顯不H36. D2抗體結合表現於J_82細胞膜的天 然TF，且抑制TF媒介之FX的活化。此等結果指示抗體與 FX競爭結合至顯不於細胞表面的天然組織因子。利用如下 實施例8之資料，結果顯示1136.1)2抗體可結合細胞膜之天 然TF之組態抗原決定部位。
實施例8-H36.D2抗體專一性結合至天然rhTF H36. D2結合至天然rhTF以及非天然rhTF之評估係藉 簡化之點墨檢定分析進行。特別r h T F於如下三種緩衝液内 個別稀釋至30微克/毫升：_ Tris_HC1、pH8. 〇 ;顧 Tris-ΗΠ、pH8. 0 及 8M 尿素；以及 1〇mM Tris_HC卜 pH 8. 〇、 8M尿素及5mM二硫赤絲醇。於THs緩衝液内培養可維持 rhTF於天然形式’使用8M尿素及5mM二硫赤絲醇處理則 產生非天然（變性）rhTF。各樣本於室溫培養24小時。培養 後，MiUipore Imm〇bil〇n㈤厘米面積）膜預先使用甲醇 濕潤，接著使用漏Tris，侧.4含2⑽甲醇濕潤。膜 經風乾後，約G，5微升' 1微升及2微升樣本⑽微克/毫 升）各自施用至膜上及風乾。藉含5%(w/v)脫脂乳及⑽ NP-40之PBS封阻膜之後 接著與山羊抗小鼠IgG過氧化㈣2抗體探測’ 研究實驗室公司)培養二傑克森免疫 以ECL西方墨點試劑共同讲養"腺曰7^阿莫杉公司） 培養後，犋以塑膠薄膜（Saran 92214(修正版) 68 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日）
Wrap)包裹且曝光於X光底片經歷不等時間。 第8^圖顯示於Tris緩衝液或Tris緩衝液含8M尿素 存在:（第1線道及第2線道）H36.D2單株抗體結合天然TF 之組態抗原決定部位。進行自動放射線攝影4G秒。但當天 然TF使用8M尿素及5mM DTh性時，H36 D2之結合顯著 減乂或被驅逐（第3線道）。第8B圖為過度曝光的自動放射 線攝影相片，顯示腿抗體殘餘結合至非天然（亦即變 性）rhTF。過度曝光時間約12〇秒。單獨使用8M尿素處理 可能導致天然rhTF的部分變性，原因在於組織因子的兩個ί 雙硫鍵並未被還原故。也可能部分變性的組織因子於尿素 被去除後’後來進行墨點處理時再度摺疊回天然組態。此 等、，’σ果月白區別本發明之較佳抗體不會結合變性組織因 子、與先前報告之抗體，先前報告之抗體不會選擇性結合 至組態抗原決定部位，而會結合至變性組織因子（參考美國 專利案第5’437, 864 ’第8圖之西方墨點分析顯示結合至 藉SDS變性的組織因子）。 · 實施例9-抗組織因子抗體之人類化 先刖貫施例說明如何製造以及使用稱做H36. D2(如前 文討論偶爾也稱做H36)之特定鼠抗體。本實施例顯示如何 製造及使用該抗體之人類化版本。人類化H36抗體有多項 用途，包括輔助減少對人抗小鼠抗體（HAMA)免疫反應之可 能。此等及其它非期望之反應造成H36抗體用於人類 用途時的問題。 、 A.嵌合體抗組織因子抗體（CH36)之製備 92214(修正版) 69 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23曰）
前述H36抗體為IgG2a鼠抗體。H36·首朱被轉成鼠-人 嵌合體抗體進行臨床發展。為了達成此項目的，轉殖H36 之重鏈及輕鏈基因（參考美國專利案第5, 986,065號）。重 鏈可變區融合至人IgG4保留（Fc)領域，輕鏈可變區則係融 合至人/c輕鏈保留領域。結果所得igG4/c嵌合體抗體定名 為Sunol-cH36。對H36或cH36用於慢性病病人之多重用 途而言，以完全人類化之cH36為佳，故可減少或消除任何 人抗小鼠抗體免疫反應。cH36之人類化作用說明如後。 B· cH36抗體之人類化 嵌合體抗組織因子抗體CH36之人類化係使用「最匹 配」方法達成。此種方法完全利用下述事實，於公開資料 庫可取得大量帶有已知胺基酸序列之人IgGs。小鼠重及輕 可變區於cH36之個別架構與於Kabat資料庫（參考http:// immuno.bme.nwu.edu)之對應人架構做比較。使用下述標 準來選擇人類化所需之人IgG架構：（1)不相匹配的胺基酸 數目儘可能維持少數。（2)「微調」區段（此區段的胺基酸 可調整CDR結構，且微調而匹配抗原，參考Foote，j.及 Winter，G. ’ 分子生物學期刊 224，（2)487-499[1992])内 之胺基酸保持不變。（3)評估類似候選者時以保留性胺基 酉文取代較為有利。供此項比較用之匹配程式可參考Kabat 首頁，，祠址 i職uno· bme. nwu. edu( Johnson G，Wu T.「Kabat 貝料庫及其應用：未來方向」核酸研究（2001 )29 : 205-2〇6) °該程式找出且排齊Kabat’s資料庫中小鼠序列與人 序列間之同源區。經由使用此種獨特的最匹配方法，預期 70 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日）
目標IgG的人類：ί匕輕鏈或重鏈可變區可有全 9 J 。丨5四個FRs得、 衍生自少至一個人類IgG分子或多至四個不 ’ 子 . 丨〗人類IgG分 (i)人IgG/c輕鏈可變區架構之選擇 各cH36輕鏈架構之胺基酸序列與Kabat咨 τ ^ 貝抖庫中人類
IgG/c輕鏈可變區之對應fr之胺基酸序列做比對 '乂 述三項標準而選出最匹配的FR。 。基於前 選用帶有Kabat資料庫ID No· 005191之乂 人頬IrG/c輕 鏈可變區之胺基酸序列進行CH36 LC FR1之人丰 〜人頰化作用。 選用帶有Kabat資料庫ID No. 019308之人_ τ 、ISG /c輕鍵可 變區之胺基酸序列進行cH36 LCFR2之人類化补m 只化作用。對cH36
LC FR1做下列突變來匹配帶有Kabat資料庫ϊη M 早 iD No· 005191 之人類IgG/c輕鏈可變區之胺基酸序列：qu、 ^ * L1〇—> V » E17-D，S18-R。對 cH36 IX FR2 做一項突變 Q37〜L，來 匹配帶有1(心^資料庫1〇此.019308之人類1的/€輕鍵可 變區之胺基酸序列（參考表1A有關序列資訊）。 選用帶有Kabat資料庫ID No. 038233之人類Ig(J/c幸5 鏈可變區之胺基酸序列進行cH36 LC FR3之人類化作用f 選用帶有Kabat資料庫ID No. 004733之人類IgG/c_鍵可 變區之胺基酸序列進行cH36 LC FR4之人類化作用。_ cH36 LCFR3做下列突變來匹配帶有Kabat資料庫❿此⑽犯犯 之人類IgG/c輕鏈可變區之胺基酸序列：K7〇4j)，KM—T， A80—P ’ V84—A，N85—T。對 cH36 LC FR4 做兩項突變 M 〇〇 以及L106->I ’來匹配帶有Kabat資料庫ID N〇 〇〇4733 92214(修正版) 71 1338009 ，ϋ5173號專利申請案 〆 （99年9月23曰> 之人類IgG/c輕鏈可變區之胺基酸序列（參考表1β有關序 列資訊）。 (11)人IgG重鏈可變區架構之選擇 各cH36重鏈架構之胺基酸序列與Kabat資料庫中人類 IgG重鏈可變區之對應FR之胺基酸序列做比對。基於前述 三項標準而選出最匹配的FR。 選用帶有Kabat資料庫IDNo. 〇〇〇〇42之人類IgG重鏈 可變區之胺基酸序列進行cH36 HC FR1之人類化作用。選 用帶有Kabat資料庫iDNo.〇2396〇之人類IgG重鏈可變區 之胺基酸序列進行CH36HCFR2之人類化作用。對cH36hc FR1做下列突變來匹配帶有Kabat資料庫ID N〇. 〇〇〇〇42之 人類IgG重鏈可變區之胺基酸序列：E1 —Q，Q5—V，p9—G，
Lll —V ’ V12—K HR’ T24-A。對 cH36 HC FR2 做兩 項突變H41—P以及S44-G，來匹配帶有Kabat資料庫ID No. 023960之人類IgG重鏈可變區之胺基酸序列（參考表以 籲有關序列資訊）。
選用帶有Kabat資料庫ID No. 〇37〇1〇之人類丨的重鏈 可變區之胺基酸序列進行cH36 HC Fr3之人類化作用。選 用帶有Kabat資料庫IDNo· 000049之人類IgG重鏈可變區 之胺基酸序列進行卿HC FR4之人類化作用。對咖6 hc FR3做下列突變來匹配帶有Kabat資料庫ID N〇 〇37〇1〇之 人類IgG重鏈可變區之胺基酸序列：S76〜τ，s，F8Q —γ，H82—E，N84—S ’ T87— HC FR4 做一項突變 LI 13—V，
R ’ D89、E ’ S91 —T。對 cH36 來匹配帶有Kabat資料庫ID 92214(修正版) 72 1338009 第911251*7 3號專利申請案 (99年9月23日）
No. 000049之人類IgG重鏈可變區之胺基酸序列（參考表2B 有關序列資訊）。 表1A及IB : cH36與人類輕鏈（LC)FR序列之比較 表 1A____ FRl (23AA)_FR2 (15AA)_____ 1 10 20 35 48 DIQMTQSPASQSASLGESVTITC WYQQKPGKSPQLLIY cH36-LC (SEQ ID NO : I〇2) DIQMTQSPASLSASVGDRVTITC WYLQKPGKSPQLLIY 人類-LC (SEQ ID NO : 27)— •
EIQLQQSGPELVKPGASVQVSCKTSGYSFT ffVRQSHGKSLEWIG cH36-LC (SEQ ID NO : 83 片斷） QIQLVQSGGEVKKPGASVRVSCKASGYSFT WVRQSPGKGLEffIG 人類-LC (SEQ ID NO : 29)
表IB FR3 (32AA) FR2 (15AA) 名稱 57 60 70 80 86 98 107 GVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVNYYC FGAGTKLELK CH36-LC (SEQ IDNO: 72 片斷） GVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLQPEDFATYYC FGQGTKLEIK 人類-LC (SEQ ID NO : 28) 表2A及2B : cH36與人重鏈（HC)FR序列之比較 表2A FRl (32AA) FR2 (14AA) 名稱 1 10 20 29 36 44
表2B FR3 (32AA) FR4 (11AA) 名稱 67 75 85 95 107 177 KATLTVDKSSTTAFMHLNSLTSDDSAVYFCAR ffGQGTTLTVSS cH36-HC (SEQ ID NO : 83 片斷） KATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR ffGQGTTVTVSS 人類-HC (SEQ ID NO : 30) 73
V 1338009 第9112517 3號專利申請案 (99年9月23曰） 一旦對所需之人架構做決定，採用以下，三項技術來達 成輕鏈及重鏈二者中之期望胺基酸取代：（1)常規PCR用於 轉殖’導入轉殖或診斷用之核酸内切酶位置，以及變更位 於可變區末端的胺基酸殘基。（2)基於pcr之突變發生係用 來一次改變多個胺基酸殘基，特別當此等殘基係位於可變 區中央時。（3)位置導向之突變發生係用來一次導入一或二 個胺基酸取代。位置導向突變發生係遵照史崔貞 鲁（Stratagene)公司「速變位置導向突變發生套件組」（型錄 編號200518)所述方案進行。 於各步驟後，將經過部分人類化之純株定序，若干可 變區後來轉殖入表現載體。質體tKMC180用來表示輕鏈突 變株，pJRS 355或pLAM 356載體用來表現重鏈突變株成 為IgGl或IgG4。然後將部分純株組合且於COS細胞中過 性表現俾藉ELISA測定表現程度。 將anti-TF重及輕可變區之最終完全人類化形式轉殖 鲁入偶爾於此處稱做為「大載體」中，且轉移感染至CH0細 胞及NS0細胞使IgG表現。然後使用穩定細胞株以產生足 夠分析量之人類化抗組織因子。結果所得人類化版本來源 為100%人類來源（當未考慮CDR序列時）。人類化/c版 本被定名為hFAT(人類化IgG4抗組織因子抗體）以及1SG1 /c版本被定名為hOAT(人類化IgGl抗組織因子抗體）。此 等cH36之完全人類化版本係用於治療慢性病適應症如血 才全、癌症及發炎疾病。 C. anti-TF抗體重鏈之人類化 74 92214(修正版) 1338009 第91125：Π3號專利申爷宏 (99 年 9 月 23:)' 1. anti-TF mAb cH36重鏈（HC)可變區藉户⑶擴大以及 轉殖入pGem T-easy係使用質體pJAIgG4TF. A8(嵌合體H36 之表現載體）做為樣板以及使用引子TFHC1s2以及 TFHClas2進行。引子TFHC1S2於起始密碼子上游導入BsiW1 位置’也使架構（FR)1中胺基酸El改變成Q。引子TFHClas2 於FR4中導入胺基酸使LI 13改變成V。本步戰獲得構成體 HC(U。 2. 使用先前構成體（HC01)以及如下四種引子進行基於 PCR之突變發生’產生構成體HC02。上游PCR使用引子 · TFHCls2及TFHC7as。下游PCR使用引子TFHC7s及 TFHClas2。使用上游及下游PCR產物做為樣本以及使用引
子TFHCls2及TFHClas2重疊PCR獲得HC02。使用引子 TFHC7s及TFHC7as於FR2導入胺基酸變化：H41改變成P 以及S44改變成G。
3. 使用HC02做為樣板以及如下四種引子進行基於pCR 之突變發生’產生構成體HC03。上游PCR使用引子TFHCls2 φ 及TFHC5as2。下游PCR使用引子TFHC5s及TFHClas2。使 用上游及下游PCR產物做為樣板以及使用引子tFHC1s2及 TFHClas2進行PCR，獲得HC03。使用引子TFHC5s及 TFHC5as2於FR3導入三個胺基酸變化：T87改變成R，D89 改變成E ’以及S91改變成τ。也於位置87導入Bgl II位 置。 4. 使用引子TFHC2s及TFHC3as以及使用HC03於pGem 做為樣板，進行PCR擴大。TFHC2s係位於pGem之轉殖位 75 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） 置上游。TFHC3as係位於架構3 ’且於FR3導入兩個胺基酸 變化：H82改變成E以及N84改變成S。將結果所得之PCR 帶轉殖入pGem ’然後將適當大小之插入序列使用BsiWl及 Bgl II切割。本片段轉殖入HC03，獲得HC04。 5. 使用HC04做為樣板以及使用下列引子進行基於PCR 之突變發生，結果獲得HC05。上游PCR係使用引子TFHCls2 及TFHC6as。下游PCR係使用引子TFHC6s及TFHClas2。使 用上游及下游PCR產物做為樣板以及使用引子TFHCls2及 TFHClas2進行突變發生PCR，獲得HC05。本步驟於FR3導 入下列胺基酸變化：S76改變成T，T77改變成S，以及F80 改變成Y。 6. 使用HC05做為樣板以及下列四種引子進行基於PCR 之突變發生，產生HC06。上游PCR使用引子TFHC2s及 TFHC2as2。下游 PCR 使用引子 TFHC3s2 及 TFHClas2。使用 TFHC2as2進行擴大，於FR1導入一個胺基酸變化：P9改變 成G。引子TFHC3s2將Q19改變成R以及T24改變成A。使 用上游及下游PCR產物做為樣板以及使用引子TFHCls2及 TFHClas2 之 PCR，獲得 HC06。 7. 於FR1位置2之點突變，由I突變成Μ，係於HC06 之建構期間自發導入其中。使用HC06做為樣板以及 TFHCls3及TFHClas2做為引子進行PCR擴大，可校正此項 錯誤取代，也於FR1導入一個胺基酸變化：Q5改變成V。 結果所得構成體為HC07。 8. 使用HC07做為樣板以及下列引子，藉基於PCR之突 76 92214(修正版) 1338009 第911251*73號專利申請案 (99年9月23日） 變發生製造構成體HC08。TFHC2s及TFHC2as3用於上游產 物。下游產物事先使用TFHCls3及TFHClas2擴大（參考步 驟7)。使用引子TFHC2as3，於FR1導入兩個胺基酸變化： L11改變成V以及V12改變成K。自發點突變，導致於CDR2 位置64之F改變成L。進一步篩選及定序獲得之構成體 HC08R1，其於CDR2位置64之F具有正確序列。 9. 二構成體，HC11及HC12係藉位置導向之突變發生 而由HC07產生。兩個互補引子TFHC8sP及TFHC8asP連同 以HC07做為樣板而製造HC11，其於FR1含有三個胺基酸 籲 變化：G9改變成P，L11改變成V ’以及V12改變成K。然 後HC11經過曱基化處理，以及接受管柱純化，進行下一回 合的位置導向突變發生作用。使用以HC11做為樣板，及互 補引子TFHC9sL及TFHCOasL之PCR產生HC12，其於FR1 中具有VII突變成為L。 10. 經由使用HC12做為樣板以及互補引子tfhC 10sK及 TFHClOasK進行PCR，由HC12衍生得構成體hc〇9。HC09於 籲 FR1含有胺基酸變化：Κ12改變成V。 11‘構成體HC10係由HC09製成。使用以HC〇9做為樣 板以及互補引子LV-1及LV-2進行PCR，結果產生HC1〇， 其於FR1含有L11突變成為V。 於各個突變步驟後，將經過部分人類化以及完全人類 化之純株定序，之後將若干可變區轉殖至表現載體。pJRS 355或pLAM 356載體係用來表示融合至人類丨邱丨或IgG4 之Fc之重鏈突變株。 92214(修正版) 77 1338009 第911251·73號專利中請案 (99年9月23日） 第13Α圖摘述步驟1-11，顯示被導入FR1至4中增加 之胺基酸變化。HC08除外，所有其它重鏈突變株及cH36 含有F位於CDR2之位置64°HC08於位置64含有F突變成 為L。第13B至D圖顯示重鏈CDR序列。 用於重鏈人類化作用之引子 TFHCls2 5,TTTCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGCAGCAGTS3, (SEQ ID NO. 31) TFHClas2 5’ AGCGAATTCTGAGGAGACTGTGACAGTGGTGCCTTGGCCCCAG3’（SE Q ID NO.32) TFHC7s 5JGTGAGGCAGAGCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGG3,(SEQ ID NO. 33) TFHC7as ® 5’ CCAATCCACTCAAGGCCCTTTCCAGGGCTCTGCCTCAC3’（SEQ ID NO. 34) TFHC5s 5, GCATCTCAACAGCCTGAGATCTGAAGACACTGCAGTTTATTTCTGTG3, (SEQ ID NO.35) TFHC5as2 5* CTGCAGTGTCTTCAGATCTCAGGCTGTTGAGATGCATGAAGGC3, (SE Q ID NO.36) TFHC3as 78 92214(修正版) 1338009 第91125Π3號專利申請案 (99年9月 23日） 5’ GTCTTCAGATCTCAGGCTGCTGAGCTCCATGAAGGCTGTGGTG3’（SE Q ID NO.37) TFHC2s 5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3’（SEQ ID NO. 38) TFHC6s 5’ CTGTTGACAAGTCTACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAG3’（SE Q ID NO.39) TFHC6as 5’ CTGCTGAGCTCCATGTAGGCTGTGCTGGTAGACTTGTCAACAG3’（SE ® Q ID NO. 40) TFHC2as2 5,GCACTGAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCACCTCCAGACTGCTGCAGC3, (SEQ ID NO.41) TFHC3s2
5’ CTGGGGCTTCAGTGCGGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCA C3’（SEQ ID NO. 42) · TFHCls3 5’ TCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGTGAGC3’ (SEQ ID NO.43) TFHC2as3 5’ GCACTGAAGCCCCAGGCTTCTTCACCTCACCTCCAGACTGCACC3’（S EQ ID NO.44) TFHC9S1 51 GCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGG3, (SEQ ID NO.45) 79 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利_請案 (99年9月23曰）
TFHC9asL
5’CCCCAGGCTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGC3’（SEQ ID NO.46) TFHC8sP
5’ GCTGGTGCAGTCTGGACCTGAGGTGAAGAAGCC3’（SEQ ID NO. 47) TFHC8asP
5’ GGCTTCTTCACCTCAGGTCCAGACTGCACCAGC3’（SEQ ID NO. 48) TFHClOsK 5,GCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC3, (SEQ ID NO. 鲁49)
TFHClOasK 5’ GAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGGTCCAGACTGC3,（SEQ ID NO.50) LV-1 5*CAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGG3, (SEQ ID NO. 51) LV-2 • 5, CCCAGGCTTCACCACCTCAGGTCCAGACTG3, (SEQ ID NO.52) D.抗組織因子抗體輕鏈之人類化 1. PCR擴大係使用質體pJAIgG4TF. A8(嵌合體H36之表 現載體）做為樣板以及引子TFLCls2. 1以及TFLClas2進 4亍。本步驟於編碼區上游導入轉瘦位置Age I。本步驟也於 FR4導入L106I突變。本步驟獲得構成體LC03。 2. 位置導向突變發生係使用互補引子TFLC5s及 TFLC5as以及使用LC03做為樣板進行。本步驟於FR2導入 突變Q37L，以及加入Pst I位置以供診斷目的之用。本新 80 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23曰） 構成體定名為LC04。 3. PCR擴大係使用LC04做為樣板以及引子TFHC2s及 TFLC2asl進行。本步驟產生片段A，片段A將用於步驟6。 本步驟於FR1導入Q11L及L15V突變。 4. PCR擴大係使用LC04做樣板以及使用引子 TFLCls2. 1及TFLClasR進行。如此於輕鏈可變區終端導入 ΚρηΙ位置。將本PCR片段轉殖入pGEM，獲得PGEM04K，其 將用於步驟6。 5. PCR擴大係使用LC04做樣板以及使用引子TFLC2s 及TFLC4as進行。本步驟產生片段C，其將用於步驟6。於 本步驟導入三個突變亦即於FR1之E17D、S18R以及於FR4 之 A1Q0Q 。 6. 使用片段A及片段C做為樣板以及使用引子TFHC2s 及TFLC4as，進行基於PCR之突變發生，獲得片段D°將片 段D轉殖入pGEM04K，獲得構成體LC05。 7. PCR擴大係使用pGEM04K做樣板以及使用引子 TFLCls2. 1及TFLC4as進行。本步驟產生片段Η ’其隨後轉 殖入PGEM04K。如此於FR4導入A100Q突變且構成體定名 為 LC06 。 8. PCR擴大係使用LC06做樣板以及使用引子 TFLCls2. 1及TFLC3as進行。本步驟產生片段I ’其將用於 步驟10。如此於FR3導入K70D及K74T突變。 9. PCR擴大係使用LC06做樣板以及使用引子TFLC3s2 及TFLC4as進行。本步驟產生片段F，其將用於步驟1〇 ° 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日）' 如此於FR3導入A80P突變。 10. PCR係使用片段I及>ί段F做為樣板以及使用引子 TFLCls2. 1及TFLC4as，獲得片段J。片段J轉殖入PGEM 獲得構成體LC07。 11. 位置導向突變發生係使用互補引子TFLC08sds及 TFLC08sdsa以及使用LC07做為樣板進行。本步驟於FR3 導入突變V84A及N85T。此構成體定名為LC08。 $ 12.得自 LC05 含有突變 Q11L、L15V、E17D、S18R 及 Q37L之Agel至EcoO 1091片段轉殖入LC〇8。如此獲得構 成體LC09。 13. 位置導向突變發生係使用[cog做樣板以及使用互 補引子LC105及LC103進行=本步驟於FR3導入T85N突變， 獲得構成體LC10。 14. 位置導向突變發生係使用做樣板以及使用互 補引子LC115及LC113進行。本步驟於FR3導入D7〇K突變。 #如此獲得構成體LC11。 15. 位置導向突變發生係使用LCU做樣板以及使用互 補引子LC125a及LC123a進行。本步驟於FR2導入K42Q突 變。如此獲得構成體LC12。 各突變步驟後，部分人類化或完全人類化之IX純株經 定序，之後將若干此等可變區轉殖入表現載體讎18〇。 第12A圖摘述步驟！至15，顯示導入輕鍵之FRl至4 中之增加之胺基酸變化。第12B至D圖顯示輕鏈CDR序列。 供輕鏈人類化用之寡核苷酸引子 92214(修正版) 82 1338009 第91125113號專利申請案 (99年9月 23日） TFLClas2 ： 5’ TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAG3’（SEQ ID NO.53) TFLC1S2.1 ： 5’ACCGGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC3’（SEQ ID N0.54) TFLC5s : 5’GGTTAGCATGGTATCTGCAGAAACCAGGG3’（SEQ ID NO.55) TFLC5as · 5’CCCTGGTTTCTGCAGATACCATGCTAACC3’ （SEQ ID NO.56) ® TFHC2s ： 5*TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3, (SEQ ID NO.57) TFLC2asl ： 5*CCACAGATGCAGACAGGGAGGCAGGAGACTG3'(SEQ ID NO.58) TFLClasR ： 5’ TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTACCAGCACCGA ACG3, (SEQ ID NO. 59) · TFLC2s ： 5’ CCTGTCTGCATCTGTGGGAGATAGGGTCACCATCACATGC3,（SEQ ID NO.60) TFLC4as · 5,GATCTCCAGCTTGGTACCCTGACCGAACGTGAATGG3, (SEQ ID NO.61) TFLC3as ♦
5’ GTAGGCTGCTGATCGTGAAAGAAAAGTCTGTGCCAGATCC3’（SEQ 83 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申言奩宏 (99年9月23日， ID N0.62) * TFLC3s2 ： 5,CACGATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGTAAATTATTACTGTC3, (SEQ ID NO.63) TFLC08sds ： 5’GCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAAG3’ (SEQ ID NO. 64) TFLC08sdsa ： ® 5’ CTTGTTGACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGC3’ (SEQ ID NO.65) LC105 : 5'CAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAAATTATTACTGTCAAC3, (SEQ ID NO.66) LC103 ： 5,GTTGACAGTAATAATTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGCTG3, • (SEQ ID NO.67) LC115 : 5’ CAGTGGATCTGGCACAAAGTTTTCTTTCACGATCAGCAGC3,（SEQ ID NO.68) LC113: 5’ GCTGCTGATCGTGAAAGAAAACTTTGTGCCAGATCCACTG3,（SEQ ID NO.69) LC125a ： 5,CTGCAGAAACCAGGGCAATCTCCTCAGCTCCTG3, (SEQ ID NO. 70) 84 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月 23曰） LC123a ： 5’ CAGGAGCTGAGGAGATTGCCCTGGTTTCTGCAG3’（SEQ ID NO. 71) 第14圖顯示輕鏈（第14A圖）（SEQ ID NO. 97)以及重鏈 (第 14B 圖）（SEQ ID NO: 98)之 hOAT(人類化 cH36-IgGl) 保留區序列。第15圖顯示輕鏈（第15A圖）（SEQ IDNO: 99) 以及重鏈（第15B圖）（SEQ ID Ν0[:]·1〇〇之hFAT(人類化 cH36-IgG4)保留區序列。各圖中，架構4(FR4)可變區之最 末胺基酸殘基係連結至hOAT及hFAT保留區之第一胺基酸 殘基。 · 實施例10 :人類化抗TF抗體之表現與純化 將部分人類化或全部人類化之輕鏈及重鏈純株轉殖入 表現載體。質體tKMC180(參考第10A至B圖）用以表現融 合至人類/c鏈之輕鏈突變株，而pjRS 355(參考第9A至β 圖）或pLAM 356(參考第9C至β圖）載體用來表現融合至人 類IgGl《IgG4 Fc之重鏈突變株。然後將重鏈及輕鏈純株 之若干組合共同轉移感染至C0S細胞。於c〇s細胞過性表 φ 現的IgGs藉ELISA檢定分析全部IgG的產量以及結合至 TF。 將抗TF重鏈及輕鏈可變區之最終全部人類化形式 (HC08與LC09的組合）轉殖入蘇諾爾公司之大表現載體 (PSUN34，參考第11圖），且轉移感染CH〇及NS〇細胞供 IgG表現用。可產生IgG4/c或lgG1/c人類化抗吓抗體之 穩定轉移感染細胞株經過轉殖。然後選出的穩定細胞株用 來製造足夠分析用量的人類化抗Τρ^結果所得人類化版本 92214(修正版) 85 1338009 第91125Π3號專利申請案 (99年9月23曰） 的來源約為95%來自人類（未考慮CDR序列）。人類化IgG4 /c版本定名為hF AT (人類化I gG4抗組織因子抗體）’而I gG 1 /c版本定名為hOAT(人類化IgGl抗組織因子抗體）。此等 cH36的全部人類化版本係用於治療慢性適應症如癌症及發 炎病。 可表現hOAT(HC08與LC09)的組合之NS0細胞株之一 (OAT-NSO-P10A7)經解洗且於15毫升試管内於10毫升補充 10%FBS之IMDM培養基擴大以及離心。將細胞沈殿物再度 鲁懸浮於10毫升新鮮培養基，以及移入T25燒瓶内且於37 。(：於5%二氧化碳下培養。為了製備足量細胞來接種中空纖 維生物反應器’細胞經擴大而獲得總數6x108細胞。生物 反應器係遵照製造商指南手冊架設。收穫的細胞經沈澱， 再懸浮於60毫升含35%FBS之IMDM，且注入生物反應器之 毛細管外空間。每日監視葡萄糖及乳酸鹽濃度，收穫物質 經過離心與匯集。收穫材料藉ELISA檢定分析試驗抗TF抗 •體濃度。然後使含抗TF抗體（hOAT)之匯集樣本如後述經純 化及分析。 A.重組蛋白質A Sepharose快速流動層析術 重組人類化抗TF單株抗體係由兩個輕鏈以及兩個重 鏈組成。重鏈為錢可魏（未經改變或如前述經過人類化） 與人IgG 1或I gG4 Fc領域之融合物，而輕鏈含有小鼠可變 區（未經改變或如前述經人類化）與人κ領域。明白確立人 1扣Fc區對蛋白質a或重組蛋白質A(rPr〇tein a)有高度 親和力。 92214(修正版) 86 丄338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 含人類化抗TF抗體（hOAT)之收穫匯集物藉相對於每 笔升樣本添加〇. 〇8毫升a Tris-HCl，pH8. 0，而調整至 PH8, 〇±〇.丨。然後樣本通過低蛋白質結合性〇. 22微米過濾 盗過據（例如附有聚醚颯膜之奈貞（Nalgene)無菌拋棄式組 織培養過遽單元’得自奈哲努克（Naige Nunc)國際公司， 型戒167-0020)。於施用樣本後，重組蛋白質a管柱（得自 法瑪西雅公司）以5基礎體積之20mM Tris-HCl，pH8. 0洗 務’去除未結合之材料如培養基蛋白質。因該收穫培養基 中含高含量牛血清，故使用階梯式p H梯度洗滌來由管柱去鲁 除牛IgG。階梯式PH梯度係經由提高緩衝液B(i〇〇mM乙酸） 於緩衝液A(100mM乙酸鈉）之相對百分比而達成。典型pH 階梯式洗滌係採用20%'40%及60%缓衝液B。管柱使用100% 緩衝液β洗提，且基於A280而收集洗提分。匯集之洗提分 藉添加1Μ Tris鹼而調整至p{j8. 5。 B· QSepharose快速流動層析術 陰離子性離子交換層析術可根據其電荷而極為有效地鲁 分離蛋白質。得自重組蛋白質A管柱之經過洗提樣本以及 PH經過調整之樣本以兩倍容積水稀釋，檢驗pH且調整至 8.5。然後樣本載荷於5毫升（16χ25厘米）Q Sephar〇se 快速流動管柱，管柱使用20mMTris-HCl，pH8. 5平衡，且 官柱使用（1)5基礎體積20mM Tris-HCl，PH8.5洗滌；及 (2)4基礎體積含l〇〇mM氣化鈉之20 mM Tris-HCl，pH8.5 洗滌。然後IgG蛋白質使用基礎體積之含5〇〇mM氯化鈉之 20mM Tris-HCl，PH8. 5洗提。匯集蛋白質尖峰洗提分，使 87 922丨4(修正版) 1338009 参 用超濾裝置將缓衝液交換入PBS。 亦使用相同轉移感染方法、細胞培養法、 製造且純化hFAT。 173鱿專利申請索 9月2 3曰）
實施例11 :人類化抗TF抗體之性質 A.藉人類化抗TF抗體抑制TF功能 抗TF抗體之關鍵性質之一為其可抑制組織因子弓丨發 的血液凝結。純化後之hOAT及hFAT於標準PT檢定分析^ 量其抑制TF活性之能力。PT檢定分析廣用於測定級織因 子相依性凝血時間。本檢定分析之原理為組織因子（Τρ)與 血漿之Vila因子形成複合物。然後複合物將χ因子活化成 為FXa ;然後FXa於Va因子以及磷脂質存在下，將凝血二 原轉成凝血酶。最終凝血酶導致形成血塊。於標準， 分析，添減質化τ F至血漿中來引魏血，凝血 1 佳農(〇，_)技術公司可格麥特(c〇ag_A_M : 儀或相當裝置記錄。 刀析 該抗TF抗體’ H36，係藉猶姓施η 猎獨特機轉抑制人TF活从 結合至TF(自由態、或與vna因早〜 古性。H36 子結合至TF: Vila複合物受到抑制硬^)，因此X及IX因 引起之FX及m活化作用受到封随：此’^5,986,065號）。？1'試驗中，抗作^/—可杲_專利案第 延長凝血時間’明白指示此種τρ相:體添加至人類血漿， 凝血時間係與TF活性數量相μ _、性之凝4受 關 邛標準曲線係麫 到抑制 一系列經過稀釋之TF之ΡΤ凝血時間二，曰1 %诉經由測定 之資料，測定藉抗TF抗體對邛体二:侍。由邝標準曲線 ^生之抑制作 用 92214(修正版) 88 1338009 ，991125173號專利申請案 試劑：伊諾文（Innovin，型號681〇〇〜392“7 9月:曰） 血對照，第ί級（型號關係得自VWR。脂， 人订係如實施例3所述製造。 、 ，、且 方法：PT試驗係使用凝血分析儀於 f) 9古 "進行。經由將 ’ 笔升脂質化重組人組織因子（例如伊·等文）界力 毫升含0.01毫升緩衝液（50mMTris-HCl，〇入〇. 1 次抗TF抗體之人血漿（希仇對照第i級）而引發打反應。 1.根據製造商指示，添加純水至伊羊 埶 诺文小瓶。試劑溫 :、至37C。該試劑儲存於4至8。。下可保持於穩定狀離下孀 數日時間。 〜 丄添加1毫升純水至各個希仇小瓶。混合而溶解。若 使用多個小瓶，則合併入單一容器（亦即1〇毫升之試管 内）。1毫升希仇可從事5次檢定分析（各次檢定分析使用2 x0. 1亳升= 0·2毫升）。希仇可儲存於冰上持續數小時時 間。 3. 由抗TF抗體備料，使用50 mM Tris-HCl，ρΗ7· 5， 0·1% BSA做出一系列抗TF抗體溶液（200_至1600ηΜ)。 4. 添加 1〇 微升 50 mM Tris-HCl ’ ΡΗ7· 5，0. 1% BSA 或 W微升經稀釋之抗組織因子至雙孔試管之各孔，各孔含有 0.1毫升希仇。使用帶有0.1毫升尖端之吸量管來混合各 孔。確保孔内不存在有氣泡。混合抗組織因子（或緩衝液） 與血漿（希仇）後，藉加入0.2毫升伊諾文至血漿於1〇分鐘 以内測定凝血時間。 5. 為了獲得TF標準曲線，首先使用5〇 _ Tris_HCl， 89 92214(修正版) 獨U09 第91125173號專利申請索 t)H7 R ( 99 年 9 月 23 曰） 。’ ，0. 1% BSA將伊諾文（loo%組織因子）稀釋為2〇%、 1〇%、5%及2.5%。然後如步驟4進行PT檢定分析，但係使 用稀釋後之伊諾文樣本。 表3為cH36、hOAT及hFAT對PT凝血時間之影響之摘 要。比較表4所示資料’ CH36、hFAT及h0AT顯示極強烈 的汀功能抑制作用。於蛋白質濃度高於12. 9nM時，全部
抗雜皆 < 達成約95%抑制°*3結果也指示藉前述方法人 難一 TF抗體、CH36，cH36之抑制活性未造成顯著影 響，雇因在於hFAT及hOAT顯示抑制組織因子相依性血液 躁鱗;^能力極為類似對6所見之抑制能力。 表7嵌合體（CH36)以及人類化抗TF抗體（hFAT及h〇AT)對黩3 _原時間的影響# 定分析之抗TF抗體濃度（nM)
0 6.45 9. 7 12. 9 25. 51. 86 __時間（秒） cH36 ------ hOAT hFAT 12.2 12. 2 12. 2 14. 9 nd nd 17.8 16. 5 nd 19.8 18. 9 20. 5 40 33. 7 41. 7 101.3 — 82. 1 94.8 定分析皆使用如同表4之議TF活性（遭度）樣本。 92214(修正版) 90 1338009
B.親和常數之測定 人類化机級織因子抗體對組織因子之親和力係以共價 CM5感心晶片上之重組人組織因子，藉表面細胞 測：二因體ί振(百歐可，得自法瑪西雅生物感測器公司) 織因子糸藉百歐可（M八⑽）電腦軟體由四種抗組 出之平濃度（M25nM、Q.25nMU及lnM)求 力類似，故卜表5結果指示因CH36及hFAT對TF的親和 組織因子的：TF抗體cH36對於cH36對
表5,造成任何顯著影響。 一二-- ^ _ 表現—LQT1) 表現Kd (M) 1· 56x10'° 6.4x10'" 7.94x1〇9 1.26x1ο'1。 2. 99xl〇9 1 3. 35xl〇'10 " -----—~~-- 技藝人士 已經參照㈣具體實_朗本發明之細節 但熟諳 顯然易知考慮本揭 示’可於本發明之精髓及範圍 92214(修正版) 91 1338009 第9112δ1·73號專利申請案 (99年9月23日） 内做出多項修改與改良。 【圖式簡單說明】 第1Α及1Β圖顯示H36.D2. Β7之輕鏈及重鏈可變區之 核酸序列（SEQ ID NOS : 1至3)及胺基酸序列（SEQ ID N0S : 2及4)，其中高可變區（CDRs或互補決定區）均劃底線（核 酸序列劃單線，及胺基酸序列劃雙線）（分別SEQ ID N0S. 5-10分別依序排列）。 第2圖顯示抗組織因子抗體以ELISA或BIACore分析 *決定之結合常數（Ka)及分離常數（Kd)。 第3圖顯示與抗組織因子抗體預培育，而抑制TF : FV11 a複合體媒介FX活化作用。 第4圖顯示以抗組織因子抗體，抑制對FVIIa-專一性 染色體基因受質S-2288之TF : FVIIa活性。 第5圖顯示於TF-啟始凝結分析，增加凝血酶原時間 (PT)之H36抗體容量。 ® 第6A及6B圖顯示FXa形成及H36抗體和rHTF之比例 間之關係。第6A圖：加FX之前，H36以TF : FVIIa複合 體預培育。第6B圖：同時加入H36、TF : FVIIa及FX。 第7圖顯示於J-82細胞活化分析，以H36抗體抑制 TF : FVIIa 活性。 第8A及8B圖圓點顯示H36抗體結合rHTF之構形抗原 決定部位。欄卜天然rhTF、攔2-以8M尿素處理之天然 rhTF、欄3-以8M尿素及5mM DTT處理之天然rHTF。於第 8A圖，圓點經暴露約40秒，而第8B圖，圓點暴露120秒。 92 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年 9月 23曰） 第9A及9B圖顯示人類IgGl-CH36HC可變區選殖及表 現載體。HC選殖載體（9A)及HC表現載體（9B)。 第9C至9D圖顯示人類IgG4-CH36HC可變區選殖及表 現載體。HC選殖載體（9C)及HC表現載體（9D)。 第10A及10B圖顯示cH36LC可變區選殖及表現載體。 LC選殖載體（10A)及LC表現載體（10B)。 第11圖顯示人類化抗-TF IgGl抗體表現載體（pSUN 34) 之質體圖。 第12A至12D圖顯示部分及全部人類化輕鏈（LC)可變 · 區之序列。第12A圖之序列分別依序對應於SEQ IDN0S. 72-82。而cH36之輕鏈CDR序列示於第12B至12D圖。（分別 為 SEQ ID NO : 2、SEQ ID N0 : 6 及 SEQ ID N0 : 7 片斷） 序列名稱 “LC-09”（SEQ ID NOS : 109、108、112 及 110 分別對應LC-09的FR1、2、3及4)表示全部人類化LC骨 架區。 第13A至13D圖顯示部分及全部人類化重鏈（HC)可變 · 區之序列。第13A圖之序列分別依序對應於SEQ IDN0S. 83-96。而cH36及HC-08之重鏈CDR序列示於第13B至13D圖 (SEQ ID N0S : 134、9 及 10 分別對應 CH36 的 C0R1 至 3 ; SEQ ID N0S : 134、101 及 10 分別對應 HC-08 的 CR1 至 3)。 分別依序為 SEQ ID NO. 8、SEQ ID N0S. 9 及 101 及 SEQ NO. 10。序列名稱 “HC-08”（SEQ ID NOS : 129、126 及 122 分 別對應HC-08的FR1、2、3及4)為全部人類化HC骨架區。 第14A及14B圖（分別依序為SEQ ID N0S. 97及98)顯 93 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） ’ 示人類化IgGl抗組織因子抗體（hOAT(IgGl)保留區。 第15A及15B圖（分別依序為SEQ ID NOS. 99及100) 顯示人類化IgG4抗組織因子抗體（hFAT)(IgG4)常數區。
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Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Gin Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 gaa agt gtc acc ate aca tgc ctg gca agt cag acc att gat aca tgg 96
Glu Ser Val Thr lie Thr Cys Leu Ala Ser Gin Thr lie Asp Thr Trp 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct cag etc ctg att 144
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu lie 35 40 45 tat get gcc acc aac ttg gca gat ggg gtc cca tea agg ttc agt ggc 192
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggc aca aaa ttt tct ttc aag ate age age eta cag get 240
Ser Gly Ser Gly Thr tys Phe Ser Phe Lys lie Ser Ser Leu Gin Ala
65 70 75 BO gaa gat ttt gta aat tat tac tgt caa caa gtt tac agt tct cca ttc 288
Glu Asp Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Tyr Ser Ser Pro Phe 85 90 95 aeg ttc ggt get ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 1338009
<2ll> 107 <212> PRT <21 lius inus：culu5 <400> 2
Asp lie Gin Ι-Set Thr Gin Ser Pro Ala Ser G.ln .c^r Ala Sex Leu Gly 1 5 10 15
Glu Ser Val Thr 11¾ Thr Cvs Leu Ala ?er Gin Thr lie hsp Thr Trp 20 ' 25 30
Leu Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy I-ys Ser Pro Gin Leo Le-u lie 35 4 0 -15 丁yr Ala Ala Tiu Asn Leu Ala p Gly Val Pro kr Arg r'he iej: Gly 50 55 00
Ser Gly $er Gly Thr Lys t*he iJer Phe Lys I le S<?r Ser Leu Gin /'.la 65 70 ?5 ε〇
Glu A?p Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Tyr Ser Ser Pro Phe HI 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leo Lys 100 105 <210> 3 -211> 3^1 2> Dm ^213> Mus niu5culus <220> <221> <222>
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Leu Thr Val Ser Ser 115
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Asp Phe Trp Gly Gin GJ ·,； Thr Thr 100 110
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Leu Ala Ser Gin Thr lie A£p 1 5 <210：* 6 <2U> 7
<212> F'FT <-213> Nus musculus <400> 6
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<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> ί-ius musculus < ?00> Ί
Glu Gin Val Tvr Ser Sei Pro Phe Tlu" 1 " 3
0> S <21 1> 6 <2I2> F'RT <2]3> Wus musculus <-?00> 8
Thr Αερ Tyr A.sn Val Tyr <210> 9 1338009 <211> 17 <212> F'RT <213> Hus jnu^culus <*100> 9 Tyr lie Asp Pro Tyr ί l Gly
Asn Gly lie Thr lie Tyr Asp Gin Asn Ph<3 Lys 〕0
<21()> ]〇 <21]> 8 <212> PKT <213> I-)us mui-colus <>3 00> 10 Asp Val Thr Thr .-.1 a Leu Asp F*he <210> 11 <211> 21 <212> 0ΙΊΑ < 213 > Hus mu s c υ1υ s•^00> 11 ctggca^gtc iigacciJttcia t <210> 12 <vn> 2i<212：> DMA v 2 1 3 > Mur. musculo? ΊΓΦ:，L? qct(]ccac«: a act c^igcaga t <210> 13 ^211> ：:S <?12> DMA <21 3> Mus mu.scul us•:400> 13 caaca^gz.x t acc：yttctcc at ticaccit <^10> l^J <?.}!> IS •；2.U> '：213> Mu:· inusculu<\Q0> 14 c a a c o t ".j t ci c<2in> <212> OHA <2 '1 3> Mus inusculus <-100> 1 5 c.ΰV. v-：iat.c cttac.'oaL ;j〇 t .net^c^nV.c r :-iCttc〇fi j〇cj 21 21
IB rs) 51 1338009
<210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> I'lus muscuius <400> )6 cjatgtg^cta cggcccttga c^tc 24 <210> 17 <2U> 23 <21 2> mh <23 3> Artificial Sequence <220> <223> PCR Pi-itner <400> 17 gcaccl:ccaq atgttaactcj etc 23
<210> 18 <21]> 20 <212> DNA <"213> Aitiiiciol Sequence <220> <223> r-*CR Priir,er 18 gaiirtdvccc t t.gaccc：cjgc 20 <210> 29 <m> :-:3 <212> Dun <21 3> Ajl" t i f ；t ca a 1 Sirqaei'ice <220> <223> PCR Primer <A0Q> 19 cjga^iCK-ocjcg q11<:：t^：jcat tgtamtcjv.-cm carte 3j
<210> 20 <211> 45 <212> DIJA <? 1 .hr t i f i cia 1 Sequence <220：· <22 i> PC：R Primer ^400> ：：0 att tcaqycc cage t:cjqci：：gcir ci t yenj cV }：<：-ar ca rye 45 <210> 2i <21l> <3 <212> <2\3> Art i tic iftl Si ^jiKince <；?0> <22 3> ?CR Vvi πι·:·ί" 1338009 cccgqqccac ciJtgkccccw rctc£igytyc tl.g 33
<210> 22 <211> 35 <23 2> VViA <213> icidl Sequence <2 20> <22?> FCR Γ-rimer <-3 00> ^'2 ccccigejccoic ccicggratcjs tsctc 3j <210> 23 •r2]l> 52 <212> mh <21 3> 八rtii ficial Sequence
<223> ?CF: Primer <4 00 23 atotactccic qac^qctaca 〇ς·tccciot Cf.-〇7jaatcca octoc^r/cag tc b2 <.210> 24 <21l> 31 <212> D\'U\ <213> Artificial Sequence <220> PCR Primer <AOO> 24
Cl^iCCt C)0cir t： C-1： ：l ΰ Cj c: ϋ 0 C t 〇 t Q ύ O vi C： t rJ -：j 31
<210> ；i5 <2U> 29 <212；· mA
< 2 13> A it i f 1 c i .fi 1 Seciuen.'.^ <2 20> <2 23> PCR l-rim-?r 'A00> 7b 2 9 11όλt r,q jttd t*n tqric i：xv,cjt:ctcc
<2]〇> ?6 < 2 ] 1 > -13 <212> L'-NA <23 3> Art if.icial i'eqneiice
<2 20 <223> PCR <-100> 26 taatcgr ί.οςί a.-iaacj LCjt.^c t.tficgttrc^ (：).;-tc>:a(：icti： gcjt cc
<230> 27 <λ!1> 33 <212> PKT ‘11、 1338009 <400> 21
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Asp Arg a 1 Thj： lie Thr Cys Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Lys .?.^r 20 25 ：-0
Pro Gin beu Ltu He 丁yr
<Z\0> 28 <211> 42 <212> PF'.T <213> Homo sapiens <A00> 23
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Phe Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ph·-? Thr 20 25
Pile Gly Gin Gly Thr Lys Lea Glu lie Lys 35 4 0
<210> 29 <211> 44 PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Gin He Gin Lc-u Val Gin Ser Gly Gly Glu Lys Lys Pro Gly hi a 1 10 S^-r Val Arq Val Sen Cys Lys A.lό Ser G1 y Tyr Ser Phe Thr Trp Val 20 25 '?·0
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<212> F-P；T <21 3> V)ojuo εjipi-iii'js <-3 00> 30
Lys hi a Thr L.-ni Thr Val I-vs. \? Lys Ser Thr 3ei: Tlu r.la Tyr Glu ί r3 10
Leu Sc'e t Leu kr q Ser G.ln P-.sp Thr Ala V〇l Tyr Vho Cye.. Al.ji Arg 20 25 3〇
Trp Gly Gin Gly Tlir Tiir Val Thr Va 1 Ser 〇er
<：>)0> 31 -211> 3Ί O DUA <51 ；»> Ar t:if i.: 1 a 1 Sequence ：220> <223> ?C：K Pr.i)：ier %100> 31 7 1338009
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<223> PC：R Primer •：4 00> 3A
3S ccaatcc^ct c3Jn；igcccL*c tcca-jriqctc tc；cctca·?.
<210> 35 <212> PMA <'213> Ax fi iici -i.l e
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<2i0> 33 <211> 25 <2}2> DHA <213> Artificial Sc-quence <?20> <223> FJCR Primer <400> 38 tac^actcac tatagggcga ά11c!g
<.'210> 39 <211> 43 •：212^ DViA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOR Primer <400> 39 ctgttg^caa ql;ct^ccaqc acacjcctaca tcjrpgctci-.g caq <210> ·0〇 <211> A3 <212> Dm <23 3> i ci〇l Sequence <220>
^22Ji> PCf·; Ριίη,^ΐ <A00> AO 43 ctqcta jyct- ccti to t agqc tqt cjctnot a qact cacj
<210> *11 *r211> 41 ^212> Cil-IA <21 3> Ar ti i'icial Sequc- n-;e <220> 仏3> PCR Pi'imc.r <·Ηΐ〇> Al -r? gc:：ctcjac：cjc ccc^qoct: tc sccaqctc^c ci:cc^qi\〇ri.; ct<：ic：f jc <?.：0> 4 2 <211> -19 <212> ΡΝΛ <213> Ar r. Sequence <220> <22 3> r;CR Primer d00> 4 2 ctoqgcicv tc igl qccKigto tcct 0Cfi：i'：ta c11:ct.:it,t a cr.cat !:cc：c •;9 1338009 <210> 43 <211>
<212> DNA *;213> Artificial Sequence <220> <223> PCF； Primer <Δ〇〇> 43 tcgi'-cfcgtct totccc^gat cce：9ct:cicjt;ci oogtctncj^g gtcjagc ^ 6 <21〇> A4 ·
<211> 44 <212> DIJA
<213> Artificial C-equence <220> <223> PCR Priaier <4〇0> 4-3 gcactociaoc cc<raqcjcttc ttcacctcoc ctccacjdctg c^cc ^^
<210> 45 <211> 32 <212> DMA <213> Artificial Sequence <22 0> <223> f'CR Primer <-100> 45 gcagtctqga cctOcigctqa ^gaacjcctcjg οςι
<23 0> *16 <211> 32 <232> DNA
<213> Artificicil Sequence <220 <223> i'CR Pr.imoi <400 46 32 ccccaggct t ct tc^gct ca cjqtccjiaact; gc
<210 *37 <211> 33 <212> I；NA <213> Ar ti f icia.1 S-rquence <220> <22〇> TCR Fiiuier <^00> -17 cjct; cjqtgcaa t c t cj o a c c c g £i a g t a a a q 〇 a o c c
<210> 48 <?J1> 33 <212> DMA <213> Artificial Seqoc-nce 10 1338009 <220> <223> PCR Primer <400> 48 ggct.ti :ttca cctcaggtcc agactgcacc <210> 49 <211> 36 ^：21 2> Wh <213> Artif: ciqil Seouenee <220> <223> f_CR Primer <400> 49 cjcagtctgga c c L 9 ii g c 19 g tCjac'jfjCCta^ <210> 50 <211> 36 <212> [)ϊ‘1Α <21 3> Artificial 〔々quence <220> <22 3> I*CR Γ-τ irner <400> 50 gai.igccccag gcttcaccacj ctcaggt: c ca <210 SI •^211> 30 <212> Γ-ΙΊΑ <213> AI t i f i c i 01 Seqoc-nce ^220> <223> PCR Pi init-r <4 00> SI Cc'iqtctQqao vtq -uj 9(:991: oajjacct 999 <210> 52 <2U> 30 <212> <213> Ar t.i ricial 〇equ·： ce <220> <223> PCR FTirri-?r <.；00> s? coca 9·: 1 c 1.1 c accaomcj at'ocaqjictc <210> 53 <2 J! > <2'i 2> DMA .^rt.i f ici al Sr-qnc 七nee <220 <2 23> PCR Γ·ΐ：：::Γι·? 1' 36 :0 30 <J〇0> 33 t.tccicic： ac：Cj t. a t -j c t r. 3 c 01 11 ο λ r. c t. c c a 9 ·.·: t α ·：ι t. c c c ji -:j I 1 1338009 <210> 54 . <2il> 2S« <212> DMA <v 1 j> Artificial ：Sfccjuer!c；(? <220> <223> PCR Primer <400> i4 cCcg'iiLOc'itrj tcccicjatgiic ccagt.ct.cc <210> ib <21l> 29 <212> ΟΠΑ <2X3> Artificial Sequence
<220> <22 3> PCR Piimer <400> 55 ggttaycat^ gtatctcjcaq c：aacc：<ftqgg 29 <210> ί·6 <2H> 29 ί212> Γ>ΚΛ <213> Artificial Sequence <220> <223> tCP. ^nm-sr
<400> 56 ccctcjgtttc tgcagatacc atgctacicc <210> ^.7 <211> 25 <212> DHA <213> Artificial SeqLienee <220 c?23> PCR Primer <400> S7 tacqjictcac 1： 〇 t ci α ο a c 9 a at tqg 10> ：,8 <2]]> <212> L.'IJA <23 3> Avt.if.icini Sequence d <223> PCR Primer <A00> ccac：aq〇it：(jc aoac-igcic：;-i0 gr；acicjacact <2]〇> 59 <211> 51 <y.}2> w：?. <2 i 3;· ci 1'icicii ?equev；ce <22 0> 29
2S 12 511338009 <223> PCR Primer <400> 59 LLcgieeiigt g t ci c 11 a eg t ttcjatctcca cjcttgqtcicc i-.qcbcc^^.hc g <210> 60 <211> 40 <.212> 0ΠΑ <213:'· Artificial Sequence <220 <22 3> PCR Pr ini〇：r <彻> 60 ccr.gtctgca tctc;tcciciag c-;t^ggT：C0C <210> 61 <211：· 36 <21 2> DNA <21 3> Artificial Sequence <^2 0> <223> ?CR Primer 61 gi；t cuccagc l: t'：igtaccct gaccgaacat <210> 62 <211> 40 <212> DI'JA <213：· Artificial Sequence <220> <22 3> PCR Primer <^00> 62 gcaqcjctqct oatccitcjaacj q a ά a ；i C) t c t q <：'!0> 63 <211；· 47 <212> L'-NA <21 3> 7U t i f i c l 〇 1 Sequ·: 'wze <220> <：<23> VCR [r i.jne'r <400> 63 c；icgatc\-igc ci^cct ao〇k；)C ctg:-».-：c；：nt 11 <2!0> <2Π> 45 <212> D!'?A <213> P.rti f i c i ά 1 Seqii·.: ：'nce <220 <222> PCR Pr iiiioi <400> 64 vK.：aC|^c ：ca('a ；t LOCcifiCC r <210> G〔、 tcrat-icit. tnf tJictqtc 40 36 40 4 7 1338009 <211> 45 <2 3 2> DMA <2)3> Artificial <220> <223> PCR Primer <】00> 65 ctitgttgacci gcaa^at:ctt cacjoctcjt.aq gct.gc
<2\0> 66 •：2U> 4-1 <21 2> WA <213> Artificial Sequence <220>
<223> PCR Primer <_> 66 44 cagcagccta cagcct〇iiag 〇ttttgctiaa icattacUjt:
<210> 67 -：2U> A4 <212> DMA •v.?13> Artificic'il ic-quenee <220> <223> PCR Primer <A00> 67 cittyjicacjt-a ataatt tcjcci oaatcttcaq 9ctcjt aycjct gct.g <210> 〇?
<212> DNA <213> Artificial ί eqoc-nce <220> <22：s> rCP. rrimtrr
<^00> 68 40 caylycjatct cjqc.^caaagt; tttcutt.cai： gatcaycsςιc <:no> ^:-9 <21i>
DNA <213> Ar'ciiici?.! Sequence < 2 0 > ;223> I'CR F'ci;uc:-r <400 G9 9 c t g c t a ci t c. c t t-»a 〇g λ a a aett t.qt <；cc t'.cccctiq •;210> 7 C_ 3 3 <2i^> om <2)3> Arr.i ficiai ir-quence <.220> <223> PCR Primer 14 1338009 <400> 70 3 3 ctgcaqaaac cacjggcaatc tcctcc；gctc ctg
<210 71 <211> 33 <212> DHA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR ^rimer <400> 71 33 caggayctoa ogag^ttgcc c.t^cjtttctg cag
<210> 72 <211> 79 <212> PRT ：213> Artificial Sequence <220>
<223> Syntljetic FF.l, FR2, FR3 and F?A of CH：-：C-LC <^00> Ί2 hzp lie Gin Het Thr Gin Ser Γίο 1 5
Glu Ser Val Thr lie Thr Cys Trp ：'0
Pro Gin Leu 1 .le Tyr Gly Val E'ro 35 4 0
Gly Thr Lys f'he Ser F-he L.ys lie 50 55
Val Asn Tyr Tyr Cys Phe Gly ,Z!J a 65 - 10
Ala Ser Gin Ser Ala S--r Leu Gly 10 15
Tvr Gin Gin Lys Pi o CA y Lys Ser 2b ^ 30 S-r：)： Arg Ρ1'；β Ser Gly Sor G1 y .S*?r
Ser fer Leu Gin Ala Giu Asp Phe tO
Gi v Tin- Lys Len Glu L*ru Lyr. " 75
<210> 73 <2U> 79 PRT .:213:. Ai. tif iciiil Sequence <2-20> <22?> Synthetic: humanized ΓΗ1 # <400> 73
Asp I 1g Gin Met Tlix Gin ί-er Pro ] 5 G]u Sex V〇l Tin: lie TJu. Cys Trp 20
Pro Gin Leu 11 e Tyr Gly Veil Pro 35 " 4 0 GJ y Thr Lys Phe Sc-ϊ Phe I-y.-: Ue 50 ' 6 V^l *Iyr Tyr Cy.? ΓΊκϊ GJ y Ala 65- " " 70 . ΓΚ2, E'R3 .：inci PF.4 of I.C-03 A] S >:? r Gin Ser A .la Seu Leu G1V' JO 15
Tyr Gin Gίn Lys E'ro Gly Ly.s 〇er 2 b 30
Ser .^rg The CUy Ser Gly 5；er A [) 5er iei- Lcnj GJ n Aid Glu Asp Phe 60 G.1 y 'TYiX Lys 1-eu Glu lie Lys <：< ]0> 7.-3 <2i1> 79 <?Λ2> ΡΚΊ- <21 3> Art i via al :.:；equeno.e 15 <220：·1338009 <22 3> Synthetic humanized ΓΡΛ, FF.2 f FR3 and FR4 of LC-04 <*}〇0> 7 4
Asp I le Gin Met Thi Gin .r：er Pro Ala Sex C-ln Ser 7-la Ser L々u G1 y 1 5 10 15 G) u Ser J Thr Tie Thr Cy.s Tip 丁;/.v Leu Gin Lys Pro Gly Lys .?er 20 " 25 30
Pro Gin Leu lie Tyr Gly Val Pro 2-er Acg Phe Se.r G]y Ser Gly 35 -10 4 5'
Gly Thr Lys Vhe S^r Phe Lys lie Ser S*?r Leu Gin Ala Glu sp f-he SO 60
Vά 1 Asn Tyr Tyr Cys Pho Gly Ala Gly Thr Lys Lc-u Glu lie Lys 65 70 " 7S
•；210> 75 <2ll> 79 <212> PRT <213> Artificial Stcjurrnce <：'20>
Synthetic hiimaru ^c：d FR1, FH?, F'P3 a.'id F'R4 of LC- 05 <400> 75 Αε-ρ lie Gin Met Thr Gin Ser F-ro Ala Sir Leu ?er A .la Vjl Gly 1 S iu 15 A.sp Arq Val Tiir lie 丁hr Cys Trp Tvr Leu Gin Lys F'ro Gly Lys Ser 20 " 25 ^ :.,ϋ F'l o Glii Leu lie Tyr Gly Val Γτο S<?r Arg Phe Set' Gly Gly S-jr 5S 40 *35 G1 y Thr Lys Phe Sei. Ph·? Lys lie 〇er r Leu Gin Ala Glu A.^.p F !ie SO b5 60
Veil Αξπ Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Tlir Ly? Leu Glu lie Lys 65 * 7 0 7Γ-.
<210> 76 <?] 1> ?9
<212> pRT "21 ?·> Artificial .Sequence <223> Synt)j'：-t ic Inun^riized FF;iy ΓΡ.2, FP.3 and Π''.4 of LC-Oo <^J00> 7 6
He 卜丁Ju. G].;〕S-:r Pro Α.ίό Ser G.n r.e'r Ain Ser 〕 5 10 " OUu Ser Val Thr lie- Thr Cys T: p Tyr heu Gin lys Pro G]y Lys 20 ' 2 b ' ：<0 P i' 〇 Gin L-?u IJ e Tyr G i y V,、】P i o Ser T-.r c, rhe S o r G.ly ·? i G1 y S e r
35 ' 40 ' C
Gly T1 \x Lys Ser Lys Tie 5jer Ser Leu Gin Ala Glu A.sp i'l/e 50 " 55 ('0 '
Asn 丁yr Tyr C\.s 『-'he C;lv C;lr) Gly Thr ].,v$ I.eu Glu l.le Lys tS 70 ^ 75 <210> 77 ⑧ 16 1338009 <2U> 79 <212> PP.T <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic humanized FT、], FR2, FR3 and FRA of LC-07 <A00> 11 A.c.p He Gin 1-5Thr Gin Ser Pro Ala Ser Gin Ser Ala Ssr Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr lie Thr Cys Trp Tyr Lou Gin Lys Pro Gly Lys Ser 20 25 Pro Gin Leu I le Tvr Gly Val Pro Ser Arq Ph-3 Ser Gly ?r r GJ y Zer ：；S " -10 " i Gly Thr Asp Γ-'he Ser Phe Thr 1 le C-er 〇er Leu Gin Pro Glu Asp Phe 50 55 60 Val Asn Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 65 70 73 <210> 78 <211> 79 <212> FRT <213> Artilicicil Sequence <220> <223> Synthetic liumanized FR1, ΓΡ.3 and ΓΡ4 of LC-08 <·]00> 78 Aί p 11¾ G1 n Met Thr Gin $er Pro Ala 3er Gin Ser Ala 〇·ξ r Leu Gly 1 5 10 Icj Glu Ser Val Thr He Tlir Cys Trp Tyr Leu G] n Lys Pro Gly Ly3 Ser 20 " 25 30 Pro Gin Leu lie Tyr Gly Val Pro .?c-r hrq Vho "er Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Asp rne Ser Phe Thr He Sor Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 50 55 tO ΛJ a Thr Tyr Tyi Cy.s Die Gly Gin Gly 丁hr Lys Leu Glu He Lys es 70 lb •:210> 79 <211> 79 <21?> PRT <2 I 3> ?.r t i f i c i a 1 Sequence <22 0> ί'νηι he-t ic humani :.ed PR], ：'R3 U of 1C-09 <400> 79 Asp Π G.ln 1 Afp Arg Val Γίό G]n Leu 35 Gly Thr Asp 50 Ala Thr Tyr 65 •’ t ls .no 丁 2 ..r T e Ί ο e s e h, o p 7 s 'y e s
h c·.. 1 T h. G :l o 0^1 ύ 1 " r;
•e 0..- ΐ L - p T! e -J,, e s
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r Γ F 5 Li n r:J y 1 >/、 G 4 - e ? e h p VI r 1-0 c G ·、-'Γ·'· e co s
u s y 5 Lr. e :〇
c> ph p - A u 2 G o u V* Ί F G η u loc G G L e i 17
<210 SO <211> 79 <232> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic i'lUinc'inizod FR1 ； FP.2, FR’i and TRA of LC-10 <4 00·：· 80
Asp lie Gin Met： Thr G3.n .?.er Pro Ala .?er .Ma Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg V«?.l Tlir He Thr Cys Trp Tyr Leu Gin Lys E)ro Gly l_ys Ser * 20 " 25 " 30 " F*ro Gin Leu 11^ Tyr Gly Val Pro Sei Arg ?he Sex Gly Ser Gly Ser 35 40 " 40
Gly Thr Asp Fhe Ser F'he Thr I le 〇er Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 50 55 60 A.la Αεη Tyr Tyr Cys PV.e Gly Gin Gly Thr Ly.s Leu G].u He Ly? 65 70 75
<210> 81 <211> 79 <232> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic human! FR1,厂R2, PR3 arid TF:4 ct LC- i 1 <400> 81
Asp lie G3 n Met Thr Gin Ser Pro k1 a Ser Leu Ser A]a Sor Val Gly 1 S 10 15
Asp 7u；9 Val Thr 11*3 *J'iir Cys Trp Tyr Leu Cli'i Lys Pro Gly Lys Ser ' 20 25 30 Γίό G.ln Leu I le Tyr G1 v Val Fro Ser Arc] Flic Gly Ser Gly Ser 35 _ ‘·!〇 ' *15 ' G] ). Thr Lvs Phe Ser Fhe Thr lie Fer r.er I,eu Gin Pro Gj u hso Phe 50 ' 55 CO '
Ala Asn Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu CIu lie Ly·? 65 70 lb '
<210> &2 <?：} 2> 79 <212> PRT <213> Arc.ificia.l Sequence <2^ 0> <22 3:· Synthetic hun.oniied ΓΚ1, FR2, ΓΚ3 ό-.nd ΓΚ4 of LC-.12 <400> B2 hr-yj I.l.o Gin Met. Thr Gin Pro Ala ?·>υ Lo：u Sfr-r Ala Sor Val Gly 1 5 :0 j ^ Λι·(·ι Va]. 丁hr 丁hr Cvs 丁λ*ρ Tyr L.eu Gin J..ys Γιο Gly Gin Sei: ' 20 ^ 25 — ·〇" \：'ro Gin Leu He Tyr G1 v Val Pro Sei' Arc; rho Ser Gly Sor G1 y Ser ?S " .10 * Alj
Gly Thr !,ys Plw Gei: Phe Thr ：Ug iei: 5:e?: Leu Gin 「ro '·?ΐυ
50 SS tO kla Λ5：ιι T\t 'Γνΐ' Cys P!'ie G2.y Gin G.ly Thr Ly:； Leu G.! u i]e Ly^ 18 1338009 ί-b 70 7 5 <210> 83 <^31> 87 <2Ϊ2> ΡΚΤ <213> hitificial oequence ：.220> <223> SyntheCic FPJ, ΓΗ2, FR3 and FR4 of CH3C-iIC 83
Glu 3 le Gin Len Gin G2 n S^r Glv Pro Glu Leu Vci 1 Lv? Pro Gly Ala 1 b 10 IS V〇l Gin Vc^l Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Sor Pile Thr Tip Val 20 "* 25 30
Arg Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie G1y Lys Ala Thr Leu
35 40 4S 丁hi: Val Asp Lys Ser Ser Tl*ir I'hr Ala Phe Met His Lea ^.sn Ser Leu 5,0 S5 60
Thr Ser Λ.ερ Asp Ser hi a Val Tyr Phe Cvs Ala hT g 丁 rp Gly Gin Gly 65 70 75 ' 30
Thr Thr L^ru Thr Val Ser Ser & 5
<210 B4 <221> 87 <212> PRT -：.21 3> Artificial ?oquence <2^0> < 22 3> Synthetic lioman i zed FR1, FR 2, FF.3 aiici FM of HC-01 <·!〇0> G4
Gin lie Gin I.，:u Gin GJVi Ser Gly Pro G1 u Leu V>.1 hys Pro Gly hla 1 5 " 10 15
Ser Val Gin V〇l Sor Cys Lys Thr Gly Tyr Scjr Phe Thr Trp Veil 20 25 30 P.xg GXn 〇er H i 3 Gly Lys Sol Leu G3 u Trp 11^ Giy Lys Thr Ι.·：：υ ' 35 ' JO 4r)
Thr Va 1 Lys Sov Sei 7'ϊϊ?. T)u* Ala Phe Net His Li?：u Asn Ser Leu rj〇 ' 55 60 'J'hr Ser Asp Asj^ ?ei* Ala Vai Tyr Pbe Cys Ala 7-.rq Trp Gly GJn Gly 65 7 0 lb 8 0
Thr Thr Val 丁hr Val $e-v Ser S5 <：n〇> B!：'
<21)> 97 <212> PRT ·: ? J 3> Ar t: i f i ci ?Λ Sequence <2/0> 223> Synthet :i c zed r'Rj , FR?, ΓΒ3 anci FK-l or HC -0? <·；00> 95
Gin lit! G]n (U n Ser y Pro 1〆二'u VV: i Ly+? F’i'o G] y· Λ] 〇i .1 S 10 16
Ser Val Gin $er Cys Lys Thr Gly Tyr Tor Pho Thr Trp V〇l 19 1338009 20 25 30 Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tip life Gly Lys Ala Thr 35 ‘i0 45 Tiir Val Asp Lys Ser Or Thr Thr Ala r-he M^t His Leu Asn Ser 50 55 CO Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gly Gin 65 70 75 Thr Thr Veil Thr Vcl Ser Ser
Leu LeuGly 30
<210> 86 <231> B7 <2)2> FBT <213> Artificial Sequence <2^0> 2 2 3> .Synthetic hurnani 二 ecJ FRl, FR2, FR3 aiKl ΓΕ4 of HC-03 <^00> 86 Gin He Gi ii beo G1 n Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lvs Γιο Giy 1 5 10 Ser Val Gin V-=i 1 Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Γίr the Thr 丁Jp 20 2S SO Arg Gin 5c-r ΕΊ〇 Gly Lys Gly Lc-u Glu Trp lie Gly Lys Ala Tin: 35 40 45 Thr Val Asp Lys 〇er Ser Thi Thr P.la Phe Met His Leu Asn Ser 50 05 GO Arcj ier Glu Α?ρ Thr Ai-·二，Vei T:..r j'he Cys Aid Arq Trp Gly Cln •Γ-S 7〇 — lh Thr 丁lir Val. Thr Val Ser $er es
Ala Val Leu Leu r 1 .'， j 80
<210> 87 <2]\> 87 <212> PRT <2)3> Ar t i ci^i S'--qu-:-r；ce <220> -'223> SynUieiiic hnmanired ΪΊ'<11 ΓΗ2, FF；3 cmd FRA of HC-04 <4 00:. 87 Gin J.1 ·? Gin 1-eli G.lη 0Xn Ser G1 v Fro Glu I..en Vs] Lvs Pro G)n·· 1 b 10 15' Srri Val Gin Val Ser Cys Lys Till Π l G1 y Tyr .ver l'!ie Thr Tj. p ；：0 " >：5 " 30 P-.r a Gin P r o C.1 y Lys G.l y Leu Glu Trp j .] e Giy I.ys Ala Tin 5S -10 - ύ Thr Val λ.?.ρ Lys .?er 〇*:-*r T)ir Thr A1 a D；e !'j-rt Gin I_eu ?-?r Ser 50 " ：:：·； 60 Ara S.d Gli.i Asp Ti'-r Ala Vc-ιϊ Tyr Cys Ala Arcj 丁吓（？] y Gin 65 ?〇 7i：· Ti'：r Thr V〇l Thr V^l Sg:: Ser Sl:.· ；'.] Λ V〇l
L-rU
<2)0> <211> 87 <2i2> vkt 2 1 3> Λr i i I’ i c i，: ] ."vc-jence 20 <220>1338009 <223> Synthetic hunumizr-d FP.l, FK2, ΙΎ'3 and FR4 of HC-05 <400> &3
Gin lie Gin Leu Oln Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys FJro Glv Ala 1 5 10 is"
Ser 'veil Gin Va.l Ser Cys Lys Thr ί-er Gly Tyr Zer Phe Thr Trp Val 20 ' 25 ：；0
Arg GJ n Ser Fro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Gly Lys Thr i.eu
Thr Val Λ5μ» Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Hec Glu 3.,eu Ser ?er Leu SO 55 eo
Arg Ser Giu Asp Tlir Ala Val Tyr 65 70 丁)ir Thr Val Thr Val Ser Ser 85
Ph*； Cj'S Ala Arej 了rp Gly Gin Gly 75 80
<210> &9 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic huin^ni -ed FR1 y <4 00 8 9
Gin Met Gin Leu Gin Gin Ser Gly 1 S
Ser Vai Arcj Val Ser Cys Lys Ala 20 I\i g Gin Γ-er Pro Gly Lys Gly Leu 35 " 40
Tin Val Lys Sc~r Thr £：er Thr 50 55
Arg Glu Asp Tlir Ala Val Tyr 65 70 "
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser FP.2, FP.3 and FR4 of HC-06 G i y Glu L.3U Vjil Lys Pro G]y Ala ]0 15 6'or G3.y Tyr Ser ?he Tnr Trp V〇l /5 " 30
Glu Tip lie Gly Lys Ala Thr Leu j s A13 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Liu 60
Phe Cys A1a Aig Trp Gly Gin Gly 75 &0
<210 90 <211> bl <212> ?Γ；Τ •c213> Art i f ic：i al Sequence <220> <2 23> Synthetic h.um^ni z«?d FR'l, FR2, ΓΚ3 and KK-1 oi i-lC-〇7 <400> 90
Gin He Gin I.eu Val Cl ii Ser Glv G.lv Glu l.eu Val hys Pio CO y Ala 1 5 10 .11)
Ser Val >'.icj Val Cys l..v+ε AJd Glv Tvr Ser Thi. Trp Va] 20 ^ .>5 30 '
ArC| Gin S-?r Pro GJ.y Lys G1 y Leu G1 u Trp lie G1 y Lys ,-.1 a Thr Leu 3d 40 45
Tl'ii. Va 1 hsv Ly.s 5；er Thr Sor Thi* Ala Tyr Mer, G.1 u Leu $cr Sc-*r Leu 50 ' " 55 60
Arg Ser Glu Asp Thr ?.la Val Tyr Phe Cys Aia Arc Trp niy C〕n Giy 65 ΙΟ 7 5 &0 21 1338009
Thr Thr Val 丁hr Val Ser Ser ii5
<210> 91 :2U'；· F'RT <213> Arta ficial Sequence <220> <223> Syrillietic hun、0ini:：6cl FR1, FR2, FR3 rjnrj [.’R4 of HC-08 ·：!00> 91
Gin lie Gin Lti-u Val Gin _?er Gly Gly Glu Val Lys Lys F-ίό Gly 1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Sei: Gly Tyr Ser Fhe Thr Tip
2 e Val Leu Leu G]y 80 20 ' " 2S 30
Arq Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leo Glu Trp lie Gly Lys hi a Thr 35 " 40 45 TJir Val A;sp Lys 3et Thr Ser Thr Ala Tyr Mot Glu L-su Ser Ser SO cj5 k-0
Arg 〇er Glu Ar>p Thr Ala Val Tyr Flie Cys Ala Arcj Tip G2 v Gin
^S' 7〇 75 J
Thr Thr Val Thr Val Ser Seu οΊ.
<210> 92 <2ll> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <?20> <22 3> Synthetic Ιιιυιι.-ιν：^ zed FRX, ΓΓ.2, ΓΡ.3 and FR·^ of HC-02R丄 92
Gin lie GJ.n Leu Val Gin G1 y G1 y G.1. u Ve i Lys Lys Pro G.1 y 1 5 iO 1 [-,
Ser Val Arq Vc：l Ser Cys Ly.v- Ala ?-;-r Gly Tyr Ser Phe Thr Trp
hi a V<:, 1 Leu Leu Glv SO 2 0 ' ：'5 y〇 .Arg G1 n 5er Pro Gly Lys G.1 y Lc-u Glu Trp lie Gly Lys Ala Thr
?·5 " .Ί0 M
Thr Val ksp Lys Ser Thr ?er Thr Ala Tyi Met Glu Lou Sor Ser 50 ：>S (.〇
Arci Sex Glu A.sp Tl'ir A] a Val Tyr Fhe Cys Ala Arq Trp C-ily Gin G5 7 0 ^ 75 "
Thr Thr Val Thr Veil ^er Ser &〔、 <210> 93 <211> H7
<?：'；：> PRT •'213> Artificial sequence <220 <22IS> S y ΙΊ t ；-j e t i c 1： u:n an^ied F' Γ·； 1, iH ΗΊ\3 and Γί\ 4 of <100> 93 G]n lie Gin ；,eu Val Glii Ser Gly ?ro Gju Val Lys l.y^ E'io Giy 1338009
Val ；ug Vai ‘c;ei: Cys L:/s Ala i:er Tyr Ser Phe Thr Τϊ：ρ νόΐ 20 25 30
Arg Gin :er Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie G]y byr, ΑΙόι Thr Leu * 35 40 45
Thr Val Asp L>.s _?,er Thr Ser Thr Ala Tyr Het Glu L·?、」Se-i· Ser ]>u
Γ;〇 55 t'O
Arg Ser Glu Αερ Thr Ala V&1 Tyr t'he Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly ¢5 70 7 5 S〇 rhr Thr Val Thf Val Ser Ser * 85
<210 9A <2U> 87 <212> F-F.T <213：- Artificial Sequence <220>
<223> if.yrjthetic humarjired FR1, ΓΡ.2, FP.3 cind F?A of HC-12 <400> 94
Gin He Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu I.ys: Lys Fro Gly Ala 1 5 10 15 ：；V-r Val Αι:ςι Va 1 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser ihe Thr Trp Val 20 25
Arcj Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He Gly I.ys hla Tin: Leu
40 4S
Thr Val 7七sp Lys Ser 丁hr S?r Thr Ala Tyi: Het Glu Leu r：；c-r Ser Leu 50 55 ¢0
Arcj Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyi Phe Cys Alo 7n<j Tip CJy Gin G3y 65 70 75 8〇"
Thi- TJu* Val Thr Val Sor Ser 85
<23〇-> 95 <211> 87 <212> IRT <213> riTtificial i^quence <220>
<22 3> Synthetic hmnanizecl FRl, FR2, FR3 and FR-1 of HC-09 <400> r；：i G.1 n 11^ G] j'i Lc-u Val Gin Ser GJ y Pro Glu Leu Viil Lys Pro Cly '：}3 1 5 10 15 ?er Val Avq V'^l Ser Cy.s Lys Ala Gly Tyr Ser Η，》·:! Ή·η· Trp· Val
20 ,?5 ' SO
Arcj G.ijj Ser Pro Glv hys G1 y Leu Glu Trp lie G^y Lys Alt! Tlir 1—c-u " .10 -15 T!ir Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser υ 50 55 60
Arg Ser Gin Ar-p Thr Al a Val Tvr Phe Cys Aia Ara Trp Gly Gin Gly 65 70 " 75 P0
Thr Thr Val Tiir Val 5--r Ser 85
<210> fi6 <213> 6-7 <212：· !*RT 1338009 <21 ?> Ar t：i f ici cil Sequence <220> <723> Synthetic hun\0ni zec\ FR1, FR2, FR3 c.nd FR4 HC-10 <_〉96 GJ n He Gin Leu Val Gin Ser Gly Γ-ro Glu Va 1 Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Va 1 Arq Val Zei Cys Lys Air〕C-l y Tyr Γ-er Fiie Thr Trp Vnl 20 25 30 P.vq Gin Ser Pro Gly Lys (j 1 y Leu Glu Trp IL·? Gly L·ys Ala Thr Leu 35 40 45
Tin \>al Asp Lvs ^er Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Sor Leu 50 " 55 〇0
Arg Ser Glu Asp Th?; Ala V^l Tyr Fh<= Cys Ala Arg Trp C-ly Gin Gly 6*3 70 15 &0
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
<210> 97 *：2] 1> 107 <212> PP.T <213> Homo 5〇i：>ie^3 <A00> 91
Aro 丁hr Val Ala Ala Pro Ser Val Die lie Phe Pro Pio 3-ri P.sp Glu 1 S 10 15
Gin Leu Lys Zei Glv Tlir Ala Sei: Vai Vai Cys L-?li bii Ad Γ!)。 20 " 25 ^ :、0
Tyr V i o h r y 1 u Λ 3 a Lys Val Gin Trp Lys Vjl .Γ-.ί：ρ P.sn Ala J.eu Gl/i 义- " 40 Γ·.?]: GJy Asii 〇c-r G]n Glu Sex Val Thr Glu Gin A.sp 〇er Lys 7J..^p Ser 〔-，0 5 3 00
Thl： Tyr 3cΐ Leu Ser 5:er Thr Leu Tlir Leu Ser Lys AJa Asp Tyr Glu >S5 " 70 75 i：0
Lys His Lvs Val Tyr A] a Cys G] u Vol Tiir His Gin Gly Leu Ser Ser ' ,Ί5 90 9: ?io Val TVir Lys ki: Hie- G\y Glu Cys
100 ]〇5 <210> 9S <211> 332 <i!2> Ph'.T <213> Homo <400> 93
Glu i'hij Ala $er 'l'lir Lys Gly t'ro i；e:: Val Vlie fro Leii f'ro :.;：er
] ^ ] 0 j S
Ser Lyf· ::、er Thr C-ly Gly Thr Ala 乙Gly Cys L 20 .?5 ：：0
Asp TVr Pl;^? Pro Glu Fro V.-il 丁hr Val r Trp A.sn Ser l-r 1 y A〕a Leu ' '35 -15 ’J'hr Cly Val His ’「hr Phe Pro /'.la Vai ku Gin l'：() CO "
Tyv r Leu :：-c；r VaL Thr VV，1 Pro Ser Sej Ser Leu GJy 丁hr 70 7S B0
Gin 7.h： 丁vr lie Cvs k^ii W-il Λλπ h；i.¾ Lys Pro :'er A^n TiiL' ：..ys V^l ' 巧 4 AS}：· Lys Lys Val Gic Γ·Ίό Lys Ccr.i: Cys, Λ^ρ Lys Tl-f Jii^ T!*<r .''y：,-. Pro 24 1001338009
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 115 120
Pro Γιο Lys Pro Lvs A.cjp Thr Leu 130 ^ 135
Thr Cy.s Val Vsl Vsl Asp Val Ser 1^5 150
Tip Tyr Val Asp Gly Val Glu 165
Arq Glu Glu Gin Tyr Asn 〇er Thr 190
Val Leu His Gin Asp Trp L.eu Α·?η 195 ' 200
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
210 21S
Lys Gly Gin Pro Arg Glu rro Gin 22:5 230 A：：：p G2u Leu Thr Lys Asn Gin Val 245
Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 260
Glu Asn A.?.n Tyr Lys Thr Thr Pro 275 280
Plie Plie Leu Tyr Lys Leu Thr 290 " 295 '
Gly Asn Val Phc Zer Cys Sc-；i Val 305 310
Tyr Thr Gin Lys 〇er Leu Ser Leu :-:25 105 110
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leo Phe — 125 !let lie Ser Arg Thr Pro Glu Val M0
His Glu Asp F'ro Glu Vai Lys Phe 15S 160
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 170 ' 1*75
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 185 ]90
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 205 lie Glu Lvs Thr lie Ser Lys k\a 220
Val 丁yjr Thr Lgu Pro Pro Ser Arq 235 240
Cer Leu Thr Cys Leu Val Lys G1v 250 2S5 -
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 26b 270
Pro Val Leu Asp S<?r Asp Gly Ser 285
Val Asp Lys Ser Aig Trp Gin Gin 300
Met His Glu Ala Leu Hi s Asn His 315 320
Ser Pro Gly Lys 330
<210> 99 <211> 107 <2}2> PRT <213> Homo sapiens <400> 99
Ar〇 Thr Val A1 a Ala F'ro 〇er Val 1 5 G] n Loo I-y.s Ser G1 y Tl*：r h 1 ;-i Ser "20
Tyr Pro Ar^ Glu ΡΛ a Lys Val Glri 35' 40
Ser Gly A.vm Ser Gin Glu Ser Val 5〇" rj^
Thr Tyr ier Leu Ser Ser Thr Leu 65 '/Ο
Lws His Lys Va1 Tvι λ Cys Gj υ ' "* P：'〇 Val Tlir Lys Ph，？ Asn Arg 100
Phe 11* Phe Pro Pro C-^r Glu 10 ]5
Vci 1 Val Cys Leu Lou Asn Asn rhe 2:- 30
Ti-p Lys Val Ai；p ht:n Ala ].-eu Gin 45
Thr G] u G'Jn hsp Lys Λι·ρ 〇ei
tO
Tl)r Leu $er I.ys Ala Asp Tyr Glu 75 " ^ 80
Val Thr Gin Gly Leu ?trr Ser 90
Gly Glu Cys 10S
<210> 100 <21X> 329 <2]2> PRT <212> Homo sapiens <A00> I 00
Ser V:-i 1 Piv? Pro li-v. Ala Γrc Cys 10 ϊ 5 G3. u Ph€： h： a S€*r Thr Lys Gjv Vra 1 5 s 25 1338009
Ser hzg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 20
Asp Tyr Phe Pro Glu Fro Va1 Thr 35 AO
Thr Ser Cly Val His Thr P!ie Pro 50 ·Γ.5
Tyr Ser Leu Ser Ser V〇l V^l Thr es 10
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val .^.sp " 85
Asp Lys .：l.rq Val Giu Ser Lys Tyr " 100 "
Ala [-.ro Glu Phe Leu G1 y Gly Fro 115 120
Pro Ly? A〇p Thr I.-rU Ket lie Ser 130 125
Val Val Asp Val Ser Gin Glu |：» 145 150
Val Asp Gly Val GIo Val His Asn )C5
Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 1&0
Gin Trp Leu Asn G1 y Lvs Glu 19S " 200
Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys 210 215
Pro Arg Glu Pro Gin Veil Tyr Thr 225 230
Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Tin 24S
Ser Asp lie Ala V.al G\ u Trp Glu 2 00
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Va1 Leu 'Slrj 2&0
Tyr Ser Arg Leu 丁hr Val Asp Lys 290 295
Plie Ser Cys £c-r Val Mot His Glu 305 310
Lys 1:6·γ Leu Ser LeuL.3u GI y ?2 5 *
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 25 30
Val Ser Trp Asn FSer Gly Ala L^u 45
Ala Veil Leu Gin Ser Ser GJ y Leu 60 "
Val Pro Ser Ser Ser L^u Gly Thr 75 SO
His Lys Pro i^r Asn Thr Lys Val 90 95
Gly Pio Pro Cys Pro Srr Cys Pro i〇5 no
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 125
Arg 丁hr E'ro Glu Val Thr Cy.s Val 140
Fto Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr 155 1G0
Ala Ws Thr Lys Pro Avg Glu Glu 170 Hb
VaX S_3r Val Leu Thr Val Leu His i85 190
Tyr L'v's Cys Lys Val Sc-*r Asn Lys ' 20b
Thr lie 〇e-r L\-s Ala Lys Gly Gl；( 220
Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met: 2 35 2^10
Cys L«?u Val Lys Cly Phe Tyr Pro 250 255
Ser γ'-.τπ Gly Gin Pro Glu Asn Asn 2¢5 270
Asp Ser G]y Ser Phe Plie Leu
St-r Aiq Trp Gin Glu Gly Asi'i Val :;00
Leu !!.i s Asn Hi ε Tyr Thr G1 n 315 320
Lys <210> 101 ，2U.> 17 <212 - PF:丁 <2' 13> Artificial Sequei'ice <223> Syntlietic Cl'.'F.2 of HO OS <400> 101
Tyr lie A.sp Γrο Tyr /^sn GJv Tie Tin; I.le '\'yx ksp Gin /-.sn l.eu Ly.? ：?]〇> 10>：
<^n> 3d <222> PRT --2 1 3> Artificial Sequence (S) 26 1338009 <220> <223> Synthetic FFJ and FR2 of CH36-LC <^00> 102
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Fro Al«h Ser Gin Ala Ser Leu Gly 1 S 10 15 G1u Ser Val 丁hr I]e Thr Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly hys S^r 20 25 30
Pro Gin L^u Leu lie Tyr 35 <210> 103 <211> 23 ΓΚΤ <213> Artificial Sequence <220
<223> Synthetic FR1 of CH:：6-LC <•100-· 10.3
Asp lie Gin K»?t； Thr Gin Flo Ser Gin Ser Ala Ser Gly 1 5 10 15
Gla Val Tlir lie Thr Cys 20
<210> 1CM <211> }A <212> PRT *^2Ϊ3> Artificial Sequence <220> <223> SynLhetic FR2 of CHl^C-LC <400> 104
Tip Tyr Gin Gin Lys Fio Gly Lys Ser Pro Gin Leu He Tyr 1 5 10
<210> 105 <2il> 32 <2J 2> PRT <21 3> Ar ti f icicil Soquerj«：-e 〈220〉 <223> Synthetic ΓΡ3 of CH36-U： <4 00> 3.05
Gly Val Fro Ser Arc* Phc- Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe c 1 5" 10 15 E'he Lys He Ser Ser Leu Gin Ala GIu Art：» Phe VaJ Ar.n Tyr Tyr Cys 20 2b . 30 <230> 106 10
<2)2> PRT <213> Art i i.i cial Socjoence 27 1338009
<220 <22 3> Synthetic FP.J of CH36-LC <^00> 3 05 f'hfe Giy Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <21〇> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <22'3> Synthetic humanized FR4 of LC-03 <4C)0> 107
Plie G1 y Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lvs 1 5 10
<210> 108 <2U> 14 <212> F'PT <213> Artificial Sequence <22 0,、 <223> Synthetic humanized FR2 of L.C-CM <400> 103
Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Le-u He Tyr 1 5 10 109
<211> 23 <212> FP.T <2i 3> Aitificir.l sequence d'0> <Γ：2 ：> Sy.ithetic humani.zed ΓΗ1 of LC-0〔 •·：4 00> 109 P.i'p lie Gin ] Asp Veil hr-' T- e o s 1 a 1 A Γ p r s e'- -c Π .VL 1 h - 丁
e el L e 05 u· 1
V- 1 G
<210 no <211> 10 <212> PRT <2 1 A11 i i ic.iol Squenc·? <220> <22z> Synthetic inj：itr：n.ized FR-3 οi LOO5 ci0d> l]〇
Phe dy Gin Glv Tin' ϊ-·ν^ Leu 〇lu He T.y.·：'· 1 10 28 1338009
<210> 111 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence -'220> <223> Synthetic hu/riarii^ed F?:3 of LC-07 <*100> 111
Gly 'v'i.l F'l'o Ser Arg t-h-i 3-:-r Gly Ser C-ly Ser Gly Thr ?.sp the Ser 1 s" 10 15
Pi'ie Thr lie Ser Sei Lou Gin Pro Glu ?.so Phe V〇i Asn T'/r Tyi' Cvs 20 25 .：·；0
<210> 112 <211·> 32 <2\2> PKT <21 3> /Artificial Sequence <220 <?2：v> Syntli6*tic humanii：rrcl FP.3 of LC-00 --100> 112
Gly Val Pro Ser Arg Phe So-r Gly Ser Gly 〇er Gly Tfir Ρ.ί-p Phe Ser 1 5 lcT 15 F-Jie Thu lie Ser Sex Leu G.1 n Pro Glu A.?p Phe Ala Thr Tyr Cys 20 25 30 <210> 11：?. <2U> 3?.
<'J12> PRT <21:0 Artificial Sequ^iice <220> <22?> Synt iietic hinnoni .ted FH3 of LC- 1 0 ，〔_> 113 Gly Val Fro Ser Arr； Phe Sex Gly Ser Gly Sf^r Gly Thr P.-sp Phe ι- 1 Phe Thr He Ser 5 Ser Leu Gin Fro 3 0 C1u Asp Phe A1 a Hill T vi- Tyr Ογ s 20 25 30 <210> no <?I]^ 32 <213> Artificial Sequence <??0> <222> Syijl'becic ΓΡ.3 ci LC -11
Avy Pile Ser Gly Ser Cly Γ-er Gly Tl'ir Ly.s Phe Ser 5 ^ ΙΟ" 15 .jer i/ni G1 n Pro G.l u A.op i'Jhc Ala Asn 7yr Tyc Cys 2 5 ：s〇 <·3 00> 114 Gjy Val Pro 〇ei Γ
Pl'ie Thr lie Sc-：r 20 2〇 1338009
<210> 115 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
SyntliG'tic humanized ΓΡ.2 of LC-12 <4 00> 115 丁rp 丁yr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro 1 5 10 <2]〇> 116 <211> 11 •<212> PF.T <213：- Artificial Sequence <220> <223'* Syrit het ic CDR1 of Ch*3f5 -LC <4 00> 116 Le υ A.la .Cer Gin Thr lie A ί:ρ Thr Trp Leu 1 5 10 •:210> 〕17 <211> 30 -:212> ΓΡ.Τ <-213> Artificial ?eo |uen ce <?20> <22?> Synthetic FP.l oi CH：-ib-HC <J〇0> U7 Glu lie Gin Leu Gin Gin Ser cay Pro Glu 1 5 ]0 Ser V.hl Gin vyi S-: r Cys L.ys Thr W Gly 20 25 <210> Π6 <2 11 > IA v> ΓΓ.: 丁 <21 3> Ar t if oO-C |aei*i c，？ <220> <222> ."'yrit lier i c FR2 of CH?G-HC <^\00> Trp V、: j! Arcj Gin Ser .His G ϋ. y Lys Leu 1 5 10 <；MU> 119 <211> <2'12> ΓΚΤ Λ r t: .1 f j v： i a j. Sec iU'?n C·：1 <?20> ;?23> Synt i'c-t i c Fr.；< ct CH?6-nc 15 .·0 30 1191338009
Lys P.la Thr l.eu Thr V〇l Asp Lys i 5
Leu ksT· Ser Leu Thr 3er Asp hsp 20
Ser Ser Thr Thi: P.la Phe Met His 10 15
Sex k] a V=>1 Tyr Phe Cys Ala Arc) 25 30 ' </]〇> 120 乂 2.11> 11
<2!2> PRT <21.3；> Artificial Sc-quenc.^· <220> <223> Synthetic TR4 of CH36-HC <400> 120
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Uju Thr Val Sei Ser 1 5 10
<210> 121 <2ll> ?0 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <22 3> Syntheti c l-iomanixtci FR1 c‘f HC-01 <400> 12]
Gin lie Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro GJ u L-rU Val Lys Fio Gly 1 5 ]〇 15
Ser Val Gin Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyt Ser Phe Thr 20 2b Λ0
<210> 122 <211> U <212> PKT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synth〇rt.n.c iiumani^e-d FR*1 of HC-01 <-!00> 122
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Veil Thr Val Ser Ser 1 S 3 0 <2KJ> i.23；
C/ll> 1-1 ^212> PRT <21 3> Art.i r icin 1 〇equence <220> <22 3> Synthetic humruii FP,2 or liC-02 <4 00;> ]23
Trp V.'-i.l Arcj Gin Ser Pro Gly I.y.? Gly Leu Gin 'J'rp I]e Gly ]' 5 10 31 1338009
：210> 12-3 <21 ]> ：；2 <212> FRT <213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic liumanized FR3 of HCO3 <400> }2A
Lys Ala Thr Leu T'nr Val ?.sp Lys ,::er 丁hr Thr Ala Phe Met Hi.s 1 5 10 15
Leu hsn Ser Leu Arq ?er Glu Asp Tlir Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arq 20 25 30 '
<210> 125 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence* <220> <22 3> Synthetic humanized FR3 or HC-04 <400> 125
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ly.? 3e-r $er Thr Τ)ίγ Ala Phe Met Glu 1 5 10 IS
Leu ?er Ser Leu Arq Ser Glu Asp Thr Ala Vi： 1 Tyr Phe Cys Ala Arg 20 ' 25 50 '
<210> 126 <211> ：；2 ^212> PRT -21 Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic hurrisni ued FR3 of HC-0S ，』00;、11.6
Lys Ala Thr Leu Tiu' Val A:：:p Lys Cer ΤΪΊr ：：'er Thr Ala Tyr Her. G.l u i 5 ^ 10 I：.
Leu Ser Ser Lc-u Arcj Ser Glu Asp Tlir ΛJ a Va 1 Tyr Phe Cys AJ a Arq .?0 ' 25 ^ 30
<210> 127 <211> 30 <212> PRT <2 3 3> Artificial requenc··? <220> <,223> Syni： lietic iminam ΓΓ: 1 oi HC-06 00::.] 27
Gin Met ijJ n Leu G.1 jj Gin ；ver G1 y G} y Gin Leu V‘ril Lytf Pro G3.y Ala 1 5 10 - 15
Ser VaJ A- g Val ί-'r-r Cys Lys Ala Scr Gly Tyr Ser Pbe T)ir 20 25 〇0 32 1338009
<210> 128 <211> 30 <212> F.RT <213> Artificial Sequeiice <220> <223> Synthetic humctnized FF.l of HC-07 <_> 】28
Gly Gly Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala ' ;0 U. Lys ：\la .r-：er Gly Tyr Ser Phe Thr 25 30
Gin lie Gin Leu Val Gin 1 5
Set Val Arg V〇l Cys 20 "
<210> 129 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220:> <223> Synuhetic humanized FR1 of HC>08 <-1Ci〇> 129
Gin lie Gin Leu Val Gin 〇c-r Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro G] y Ala 1 5 ]ΰ 1.0
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Tin. 20 25 30
<210> 130 <211> 30 •：212> FRT <213> Artificial S«?quejice <220> <223> Synthetic l)um3nizcd TR1 of ΜΟΊ] <400：> 130
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Fro Glu Veil Lys I-ys Pto <^ 1 y 1 a 1 5 Ί0 !r'/
Zer Val Arg V1 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Tin 20 " " 30 131
<?M> 30 <212> PKT <213> P-.i:111 i.cia 1 Sequ <220> <223> Synthetic hninaniz^d FR1 of HC-12 *；-100> 131 ϋΐη He Gin Leu Val G1 n Sc-r G1 y l:'ro 0\u Leu Lys Lys Prc： Gly ] 5 ]0 1：)
Ser Vd 1 Arcj V0I Ser Cys l.y：i A] a Ser G1 y Tyr ?*?r Phe Ti>r ：^0 ^ ；i 5 30 210> 132 *» Λ 人> 1338009
<2U> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ovnthetic humanized FR1 of HC-09 <400> 132
Gin lie Gin L?u Val Gin Zex G1y Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly k1a 1 b 10 15
Ser Val Arg Val 3er Cvs Lys hi a Sei Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30
<210> 133 <211> 30 <212> PKT <213> Artificial Secjoence <2：O> <223> Synthetic humanized FP.l of HC-10 133
Gin lie Gin Leu Val Gin .：；er Gly Fro Glu Val Val Lys Pro G]y Ala 1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr S^r Phe Thr 20 25 30
<2i0> 134 <211> 5 <212> PRT •一213> /artificial .T-equeijce <220> <223> Synthetic CDR1 of CH36-HC •:^00> 134
Asi：. Tyr 7-.sn Val Tyr
34

Claims (1)

1338009
x ^ ««lO· %*'&SL J 、·！ X J 而形成:種複合物’其中因子x⑽或因子ix⑽）結 第91125173號專利申請索 (99年9月23日> 合至該複合物以及Fx或Fix藉TF :因子ViiaCFVIIa) 之/舌化义到抑制，該抗體包括輕鏈可變區及重鏈可變 區， 其中’該輕鏈可變區包括：（1)三個互補決定區 (CDR) ’ SEQ ID N0.為：116、6、7 ; (ii)架構（fr)i， 具有至少90%胺基酸序列與任一選自下列所組成之群 # 組的序列相同：SEQ Π) N0. 103及109 ; (ii〇FR2，具 有至少90%胺基酸序列與任一選自下列所組成之群組 的序列相同：SEQ ID NO· 104、108 及 115 ; (iv)FR3， 具有至少90%胺基酸序列與任一選自下列所組成之群 組的序列相同：SEQ ID NO. 105及111-114 ;以及（v) FR4，具有至少90%胺基酸序列與任一選自下列所組成 之群組的序列相同：SEQ ID NO. 106、107及110 ;以及 其中，該重鏈可變區包括：（i)三個CDR，SEq ID Ν〇· 鲁 為.134、9 及 10，或 SEQ ID NO.為：134、101 及 1〇， 以及，（ii)FRl，具有至少90%胺基酸序列與任一選自 下列所組成之群組的序列相同：SEq ID NO. 117、121 及127-133 ; (iii)FR2，具有至少9〇%胺基酸序列與任 —選自下列所組成之群組的序列相同：SEq ID N〇. 118 及123，（iv)FR3，具有至少90%胺基酸序列與任一選自 下列所組成之群組的序列相同：SEQ ID NO. 119及 92214(修正版) t338009
124-126 ;以及（V)FR4，具有至少9〇%胺基酸序列與任 一選自下列所組成之群組的序列相同：SEQ卟恥 及 122。 * 2. 如申請專利範圍…項之人類化抗體，其中該抗體具有 TF解離常數(；Kd)小於約5χ1(Γΐϋ M。 3. 如申請專利範圍第丨項之人類化抗體，其中該抗體之進 一步特徵為於抗體濃度低於15nM時，藉標準凝金酶原 (PT)凝血檢定分析測定，可延長血液凝結時間達至少約 響 5秒。 4. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體對 TF之結合專一性約略等於或大於得自以ATCC寄存編號 HB-12255寄存之細胞株H36· D2. B7之抗體。 5. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體對 TF之結合親和力約略等於或大於得自以atcc寄存編號 HB-12255寄存之細胞株H36. D2. B7之抗體。 鲁6.如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體於輕 鏈包括架構（FR)1，具有至少95%胺基酸序列與任一選 自下列所組成之群組的序列相同：SEQ id NO. 103及 109 ; FR2 ’具有至少95%胺基酸序列與任—選自下列所 組成之群組的序列相同：SEQ ID NO. 1〇4、ι〇8及115 ; FR3 ’具有至少95%胺基酸序列與任一選自下列所組成 之群组的序列相同.SEQ ID NO. 105及; FR4， 具有至少95%胺基酸序列與任一選自下列所組成之群 組的序列相同：SEQ ID NO. 106、107及。 92214(修正版) 2 丄⑽〇09
如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體於重 鏈包括架構（FR)1，具有至少95%胺基酸序列與任—選 自下列所組成之群組的序列相同：SEQ ID NO. 117、121 及127-133 ; FR2，具有至少95%胺基酸序列與任一選自 下列所組成之群組的序列相同：SEq IDN〇. 118及123 ; FR3，具有至少g5%胺基酸序列與任一選自下列所組成 之群組的序列相同：SEQ ID Ν0· Π9及124-126 ;以及 FR4，具有至少g5%胺基酸序列與任一選自下列所組成 之群組的序列相同：SEQ ID NO. 120及122。 · 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體復包 括輕鏈保留區’具有至少9〇%胺基酸序列與SEQ ID NO. : 97 相同。 9.如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體復包 括輕鏈保留區’具有至少95%胺基酸序列與SEQ ID Ν〇· : 97 相同。 10.如申請專利範圍第丨項之人類化抗體，其中該抗體復包 括重鏈保留區’具有至少90%胺基酸序列與SEQ ID Ν〇· : 98 或 SEQ ID NO. : 100 相同。 如申請專利範圍第丨項之人類化抗體，其中該抗體包括 重鏈保留區’具有至少9〇%胺基酸序列與SEq ID NO.: 98 或 SEQ ID NO. : 100 相同。 12. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，復包括保留區， 其中該保留區具有IgGl或IgG4同種型基因。 13. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體’其中該重鏈可變 3 92214(修正版) 丄⑽ϋ〇9 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 區的第一架構（FR1)係至少95%與SEQ ID NO. 117相同。 14. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體之重 鏈可變區的第一架構（FR1)，與SEQ ID N〇117相比， 具有一個或多個下列胺基酸改變：El改變成q ; Q5改 ’文成V，P9改變成G ; L11改變成V ; V12改變成κ ; Q19 改變成R ;以及T24改變成A。 15. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該重鏈可變 區的第二架構（FR2)係至少95。/◦與SEQ ID NO. 118相同。 16. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體之重 鍵可變區的第二架構（FR2)，與SEQ ID N0.118相比， 具有一個或多個下列胺基酸改變：6H改變成p ;以及 9S改變成g。 17. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該重鏈可變 區的第三架構（FR3)係至少95%與SEQ ID NO. 119相同。 18. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體之重 鏈可變區的第三架構（FR3)，與SEQ ID NO. 119相比， 具有一個或多個下列胺基酸改變：1 〇S改變成τ ; 11 τ 改變成S ; 14F改變成Y ; 16H改變成E ; 18N改變成S ; 21T改變成R ; 23D改變成E ;以及25S改變成τ。 19. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該重鏈可變 區的第四架構（FR4)係至少95%與SEQ ID NO. 120相同。 2〇·如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體之重 鏈可變區的第四架構（FR4)，與SEQ ID NO. 120相比， 具有下列胺基酸改變：7L改變成V。 92214(修正版) 4 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 21. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該輕鏈可變 區的第一架構（FR1)係至少95°/◦與SEQ ID N0. 103相同。 22. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體之輕 鏈可變區的第一架構（FR1)，與SEQ ID NO. 103相比， 具有一個或多個下列胺基酸改變：11Q改變成L ; 15L 改變成V ; 17E改變成D ;以及18S改變成R。 23. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該輕鏈可變 區的第二架構（FR2)係至少95%與SEQ ID NO. 104相同。 24. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體之輕 ® 鏈可變區的第二架構（FR2)，與SEQ ID NO. 104相比， 具有下列胺基酸改變：3Q改變成L。 25. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該輕鏈可變 區的第三架構（FR3)係至少95%與SEQ ID NO. 105相同。 26. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體之輕 鏈可變區的第三架構（FR3)，與SEQ ID NO. 105相比， 具有一個或多個下列胺基酸改變：14K改變成D，18K φ 改變成T，24A改變成P，28V改變成A，以及29N改變 成T。 27. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該輕鏈可變 區的第四架構（FR4)係至少95%與SEQ ID NO. 106相同。 28. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體之輕 鏈可變區的第四架構（FR4)，與SEQ ID NO. 106相比， 具有下列胺基酸改變：3A改變成Q;以及9L改變成I。 29. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體包括 5 92214(修正版) Γ338009 第91125173號專利申請案 <99年9月23日） (i)於輕鏈：架構（FR)1，具有至少95%胺基酸序列與任 一選自下列所組成之群組的序列相同：SEQ ID NO. 103 及109 ; FR2，具有至少95%胺基酸序列與任一選自下列 所組成之群組的序列相同：SEQ ID NO· 104、108及115 ; FR3具有至少95%胺基酸序列與任一選自下列所組成 之群組的序列相同：SEQ ID NO. 105及111-114 ;以及 FR4，具有至少95%胺基酸序列與任一選自下列所組成 之群組的序列相同：SEQ ID NO. 106、107及110 ;以及， (ii)於重鏈：架構（FR)i，具有至少gw胺基酸序 列與任一選自下列所組成之群組的序列相同：SEq iD NO. 117、121及127-133 ; FR2，具有至少95%胺基酸序 列與任一選自下列所組成之群組的序列相同：ID NO’ 118及123 ’· FR3，具有至少95%胺基酸序列與任一 選自下列所組成之群組的序列相同：SEq ID N〇. 119及 124-126 ;以及FR4,具有至少95%胺基酸序列與任一選 自下列所組成之群組的序列相同：SEQ ID Ν〇· 12〇及 122。 30.如申請專利範圍第！項之人類化抗體，其中該抗體包括 (0於輕鏈：架構（FR)1 ’具有選自下列所組成之群組中 任一者的序列：SEQIDN〇1〇3及i〇9;fr2,具有選自 下列所組成之群組中任一者的序列：SEQ ID N〇. 1〇4、 ⑽及115; FR3,具有選自下列所組成之群組中任一者 的序列：SEQiDN0.105及111-114;以及FR4，且有 選自下列所組成之群組t任-者的序列：SEQ ID 92214(修正版) 6 1338009 第91125173號專利申請案 (99年 9月 23日） N0. 106、107 及 110 ;以及， (ii)於重鏈：架構（FR)1，具有選自下列所組成之 群組中任一者的序列：SEQ ID NO. 117、121及127-133 ; FR2，具有選自下列所組成之群組中任一者的序列：SEq ID NO. 118及123 ’ FR3 ’具有選自下列所組成之群組中 任一者的序列：SEQ ID NO. 119 及 124-126 ;以及 FR4， 具有選自下列所組成之群組中任一者的序列：SEQ ID M0. 120 及 122。 31. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體包括 參 輕鏈，具有FR卜2、3及4，各自具有下列序列：SEq ID NO. 109、108、112 及 110。 32. 如申請專利範圍第1項之人類化抗體，其中該抗體包括 重鏈，具有FR卜2、3及4，各自具有下列序列：SEq ID NO. 129、123、126 及 122。 33. 如申請專利範圍第29項之人類化抗體，復包括輕鏈保 留區，具有SEQ ID NO. 97或SEQ ID NO. 99之序列。 擊 34. 如申請專利範圍第29項之人類化抗體，復包括重鏈保 留區，具有SEQ ID NO. 98或SEQ ID NO. 100之序列。 35. —種人類化之抗_tf抗體’包括：（i)於輕鏈：三個cj)R， 具有SEQ ID NO. : 116、6及7之序列；以及，fr卜2、 3 及 4 ’ 各具有 SEQ ID NO. 109、108、112 及 110 之序 列；以及，（ii)於輕鏈：三個CDR，具有SEQ ID NO.: 134、1〇1及1〇之序列；以及，FR1 ' 2、3及4，各具 有 SEQ ID NO. 129、123、126 及 122 之序列。 92214(修正版) 7 〜即〇9 第911251·73號專利_节案 oR (” 年 9 月 23 “ ，如申請專利範圍第35項之抗體，復包括具有SEQ ID NO. 97之序列的輕鏈保留區，以及具有SEQ iD膽.卯 之序列的重鏈保留區。 打.如申請專利範圍第祁項之抗體，復包括具有SEQ ID NO. 99之序列的輕鏈保留區，以及具有SEQ ID N〇. 1〇〇 之序列的重鏈保留區。 種單鏈抗體，包括如申請專利範圍第1項之抗體的可 變區。 39· —種如申請專利範圍第i或邪項之人類化抗體的人w 結合片段。 40·如申請專利範圍第39項之人TF結合片段，其中該片段 為 Fab、Fab’ 或 F(ab)2。 41. 一種經單離之核酸’其編碼如申請專利範圍第丨項之人 類化抗體之輕鏈。 42. —種經單離之核酸’其編碼如申請專利範圍第丨項之人 類化抗體之重鏈。 43. 一種重組載體，包括如申請專利範圍第41項或第 項或二者的單離之核酸。 44. 一種宿主細胞，包括如申請專利範圍第43項之重組載 體。 45. 一種於哺乳類抑制血液凝結之組成物，包括如申請專利 範圍第1或35項之人類化抗體或其TF結合片段，以及 至少一種醫藥上可接受之載劑。 46. —種於哺乳類抑制TF活性之組成物，包括如申請專利 92214(修正版) 8 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23曰） 範圍第1或35項之人類化抗體或其TF結合片段，以及 至少一種醫藥上可接受之載劑。 4 7. —種於哺乳類抑制血液凝結之藥物，包括如申請專利範 圍第1或35項之人類化抗體或人TF結合片段。 48. —種於哺乳類抑制TF活性之藥物，包括如申請專利範 圍第1或35項之人類化抗體或人TF結合片段。 49. 一種如申請專利範圍第1或35項之人類化抗體的用 途，係用於製備抑制血液凝結的藥物。 50. —種如申請專利範圍第1或35項之人類化抗體的用 途，係用於製備抑制TF活性的藥物。 51. —種於生物樣本偵測組織因子（TF)方法，該方法包括於 可形成複合物之條件下，讓生物樣本接觸如申請專利範 圍第1項之抗體，以及偵測該複合物做為生物樣本中存 在有組織因子（TF)之指示。 52. —種製造人類化抗體之方法，其中該方法包括：提供宿 主細胞，該宿主細胞係使用1)編碼如申請專利範圍第1 項之人類化抗體或其片段之輕鏈之第一表現載體、以及 編碼如申請專利範圍第1項之人類化抗體或其片段之 重鏈之第二表現載體，或使用2)編碼如申請專利範圍 第1項之人類化抗體或其片段之輕鏈及重鏈二者之單 一表現載體來轉形；以及，維持宿主細胞於可表現各鏈 之生長條件下。 53. 如申請專利範圍第52項之方法，復包括分離該經人類 化之抗體或其片段。 92214(修正版) 1338009 第91125173號專利申請案 (99年9月23日） 四、指定代表圖i 、 (一) 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 該代表圖無元件符號及其所代表之意義。
五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式·· 本案無化學式。
92214(修正版)
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