KR20050040844A - 혈액 응고를 억제하기 위한 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

혈액 응고를 억제하기 위한 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고 친화성 및 특이성을 구비한 자생 인간 TF와 결합함으로써 뛰어난 항 응고제 활성을 제공하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 효과적으로 인 비보 혈액 응고를 억제할 수 있다. 본 발명의 항체는 단독이거나 또는 TF:FVIIa 복합체에 존재하는 자생(native) 인간 TF와 결합할 수 있어, TF 또는 그것의 복합체에 대한 인자 X 또는 FIX 결합을 효과적으로 방지하여, 혈액 응고를 감소시킨다. 본 발명의 바람직한 항체는 자생 인간 TF에 대해 뛰어난 입체적 에피토프를 특이적으로 결합하고, 그 에피토프는 의외의 강한 항체 결합 부위를 제공한다. 또한, TF와 결합하는 인간화된 항체 및 이의 프래그멘트가 제공된다.

Description

혈액 응고를 억제하기 위한 항체 및 이의 사용 방법{ANTIBODIES FOR INHIBITING BLOOD COAGULATION AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 혈액 응고, 혈관 형성, 종양 전이, 및 염증 등의 조직 인자-관련 기능을 억제하는 새로운 인간 조직 인자 항체 및 항체를 사용하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명은 고 친화성을 구비한 자생(native) 인간 조직 인자와 특이적으로 결합하고, 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 활성화를 방지할 수 있는 새로운 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 다양한 적용, 특히 인 비보 혈액 응고를 감소시키는데 유용하다
혈액 응고는 혈액 손실을 최소화함으로써 지원한다. 일반적으로, 혈액 응고는 혈관 손상, 혈소판 응집, 응고 인자의 활성화 및 섬유소 용해의 억제를 요구한다. 응고 인자는 혈관 손상을 응혈의 형성과 관련시키는 캐스케이드를 통하여 작용한다(일반적으로, L. Stryer, Biochemistry, 3rd Ed, W. H. Freeman Co., New York; 및 A. G. Gilman 외, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition, McGraw Hill Inc., New York, pp. 1311-1331 참조).
인자 Xa(FXa)로의 인자 X(FX) 활성화(또는 인자 IXa로의 인자 IX 활성화)는 혈액 응고 과정에서의 중요 단계라는 일반적인 동의가 있다. 일반적으로, FX(또는 FIX)는 "조직 인자"(TF)를 포함하는 접촉 활성 복합체를 결합함으로써 FXa(또는 FIXa)로 전환된다. TF는 접촉 활성 복합체(TF:FVIIa)를 생성하는 인자 VII/VIIa와 결합하는 제어성 발현 세포막 단백질이다. 응혈은 프로트롬빈의 FXa-매개(또는 FIXa) 활성화를 따른다. 혈액 응고는 TF:FVIIa 복합체를 최적으로 생성할 수 없는 비자생 형태로의 TF의 불활성화에 의해 최소화될 수 있다. FXa(또는 FIXa)의 형성을 통한 응고 캐스케이드의 과도한 활성화는 재협착을 포함하는 다양한 혈전증에 기여한다고 추정된다.
혈전증은 심장 수술(예를 들면, 혈관 형성술), 배와 흉곽의 양쪽에 관한 수술, 동맥 수술, 말초 혈관 바이패스 이식술, 실시의 전개(예를 들면, 스텐트 또는 카테터), 또는 동맥 내막 절제술 등의 방대한 의료 처치와 관계가 있을 수도 있다. 또, 혈전증은 각각의 발작, 폐 색전증(예를 들면, 색전형성법을 갖는 심방성 세동), 관상 동맥 질환 또는 급성 관상동맥 증후군(예를 들면, 불안정 협심증 또는 심근 경색), 아테롬성 동맥 경화증 또는 다른 혈전 폐색성 장해, 심부 정맥 혈전증 및 파종성 혈관내 응고 등의 다양한 혈전색전성 장해 및 응고장해를 동반할 수도 있다. 체액의 조작은 또한 바람직하지 않은 혈전, 특히 수혈 또는 액체 샘플링, 예를 들면, 체외 순환(예를 들면, 심폐의 바이패스 수술) 및 신장 투석을 포함하는 처치가 될 수 있다.
항 응고제는 혈전증과 관계가 있는 응혈을 완화하거나 회피하는데 흔히 사용된다. 혈액 응고는 종종 1개 이상의 쿠머린 유도체(예를 들면, 워파린, 쿠머딘(Coumadin) 또는 디큐마롤) 또는 대전 고분자(예를 들면, 헤파린, 저분자량 헤파린, 히루딘 또는 히루로그) 또는 항 혈소판제(예를 들면, 레오프로(ReoPro), 인테그릴린(Integrilin), 아그레스타트(Aggrestat), 플라빅스(Plavix), 티클리드(Ticlid) 또는 아스피린)를 포함하는 적합한 항 응고제 또는 이의 혼합물을 투여함으로써 최소화하거나 제거될 수 있다. 예를 들면, Gilman 외, 이하 동일(supra), R. J. Beigering 외, Ann. Hemato, 72: 177(1996); J. D. Willerson, Circulation, 94: 866(1996)을 참조한다. 그렇지만, 항 응고제의 사용은 종종 출혈, 재폐색, "백색 혈병(white-clot)" 증후군, 염증, 선청성 이상, 혈소판 감소증 및 간 장애 등의 부작용과 관계가 있다. 항 응고제의 장기간 투여는 생명 위협 질병의 위험을 특히 증가시킬 수 있다(예를 들면, Gilman 외, 이하 동일 참조).
항 혈소판 활성을 갖는 특정 항체는 또한 다양한 혈전증을 완화시키는데 사용되고 있다. 예를 들면, 레오프로(ReoPro) TM는 혈관 형성술, 심근 경색, 불안정 협심증 및 관상 동맥 협착으로부터 발생하는 다양한 혈전색전성 장해 등을 완화시키기 위해 정기적으로 투여되는 치료적 항체 프래그멘트이다. 게다가, 레오프로는 심근 경색 및 협심증의 위험을 감소시키는 예방약으로서 사용될 수 있다(J. T. Willerson, Circulation, 94: 866(1996); M. L. Simmons 외, Circulation, 89: 596(1994)).
특정 항 응고제 항체가 또한 알려져 있다. 구체적으로, 특정 TF-결합 항체는 아마도 접촉 활성 TF:FVIIa 복합체의 조립을 방해함으로써, 혈액 응고를 억제한다고 보고되고 있다(예를 들면, Jeske 외, SEM in THROM. 및 HEMO, 22: 213(1996); Ragni 외, Circulation, 93: 1913(1996); 유럽 특허 제 0 420 937 B1; W. Ruf 외, Throm. Haemosp., 66: 529(1991); M. M. Fiorie 외, 혈액, 8: 3127(1992) 참조).
그렇지만, 현재의 TF-결합 항체는 항 응고제로서의 이들 적합성을 최소화할 수 있는 중대한 문제점를 나타낸다. 예를 들면, 현재의 TF-결합 항체는 최적의 항 응고제 활성에 대해 충분한 결합 친화성을 나타내지 않는다. 따라서, 많은 혈전 상태에 대하여, 이러한 무효의 결합 친화성을 보상하기 위해, 부적격의 높은 항체 수준이 혈액 응고를 최소화하기 위해 투여되지 않으면 안된다.
따라서, 고 친화성 및 선택성을 구비한 자생 인간 TF와 결합하여, 바람직하지 않은 혈액 응고 및 응혈의 형성을 억제하는 항 응고제 항체를 갖는 것이 바람직할 것이다. TF:FVIIa 복합체와의 인자 X(또는 인자 IX)의 결합을 방지하는 이러한 항 응고제 항체를 갖는 것이 더욱 바람직하다.
도 1a 및 도 1b는 밑줄친(핵산 서열에 대해서는 단일 밑줄 및 아미노산 서열에 대해서는 이중 밑줄) 초가변 영역(CDRs 또는 상보성 결정 영역)을 갖는 H36.D2.B7의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 핵산(SEQ ID NOS: 1 및 3) 및 아미노산(SEQ ID NOS: 2 및 4) 서열을 도시한다.
도 2는 ELISA 또는 BIACore 분석에 의해 결정되는 바와 같이 항-조직 인자 항체의 결합(Ka) 및 분리(Kd) 상수를 나타낸다.
도 3은 항-조직 인자 항체의 프리인큐베이트(pre-incubation)에 의한 TF:FVIIa 복합체를 매개한 FX 활성화의 억제도를 나타낸다.
도 4는 항-조직 인자 항체에 의한 FVIIa-특이적 발색 기질 S-2288으로의 TF:FVIIa 활성의 억제도를 나타낸다.
도 5는 TF-개시 응고 검정법에서의 프로트롬빈 시간(PT)을 증가시키는 H36 항체의 용량을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 FXa 형성과 H36 항체 및 rHTF의 몰비 사이의 관계를 그래프적으로 나타낸다. 도 6a: H36는 FX를 첨가하기 전에 TF:FVIIa 복합체로 프리인큐베이트되었다. 도 6b: H36, TF:FVIIa 및 FX는 동시에 첨가되었다.
도 7은 J-82 세포 활성화 검정법에서의 H36 항체에 의한 TF:FVIIa 활성의 억제도를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 H36 항체가 rhTF 상의 입체적 에피토프와 결합하는 것을 나타내는 점 블롯(blot)의 표시이다. 레인 1 - 자생 rhTF, 레인 2 - 8M 우레아로 처리된 자생 rhTF, 레인 3 - 8M 우레아로 처리된 자생 rhTF 및 5nM DTT. 도 8a에 있어서, 블롯은 약 40초간 노출되었다, 도 8b에 있어서, 블롯은 120초간 노출되었다.
도 9a-도 9b는 인간 IgG1-cH36 HC 가변 영역 클로닝 및 발현 벡터를 도시하는 도면이다. HC 클로닝 벡터(도 9a) 및 HC 발현 벡터(도 9b).
도 9c-도 9d는 인간 IgG4-cH36 HC 가변 영역 클로닝 및 발현 벡터를 도시하는 도면이다. HC 클로닝 벡터(도 9c) 및 HC 발현 벡터(도 9d).
도 10a-도 10b는 cH36 LC 가변 영역 클로닝 및 발현 벡터를 도시하는 도면이다. LC 클로닝 벡터(도 10a) 및 LC 발현 벡터(도 10b).
도 11은 인간화된 항-TF IgG1 항체 발현 벡터(pSUN 34)의 플라스미드 맵을 도시하는 도면이다.
도 12a-도 12d는 부분적 및 완전히 인간화된 경쇄(LC) 가변 영역의 서열을 도시하는 도면이다. cH36의 경쇄 CDR 서열 CDR 서열이 도 12b-도 12d에 도시된다. "LC-09"로 명명된 서열은 완전히 인간화된 LC 프레임워크 영역을 도시한다.
도 13a-도 13d는 부분적 및 완전히 인간화된 중쇄(LC) 가변 영역의 서열을 도시하는 도면이다. cH36 및 HC-08에 대한 중쇄 CDR 서열은 도 13b-도 13d에 도시된다. " HC-08"로 명명된 서열은 완전히 인간화된 HC 프레임워크 영역을 도시한다.
도 14b-도 14b는 인간화된 IgG 1 항-조직 인자 항체(hOAT(IgG1) 일정 영역을 도시하는 도면이다.
도 15a-도 15b는 인간화된 IgG 4 항-조직 인자 항체(hFAT)(IgG4) 일정 영역을 도시하는 도면이다.
본 발명자는 고 친화성 및 특이성을 구비한 자생 인간 TF와 결합함으로써 뛰어난 항 응고제 활성을 제공하는 항체를 발견하였다. 본 발명의 항체는 효과적으로 인 비보 혈액 응고를 억제할 수 있다. 본 발명의 항체는 단독이거나 또는 TF:FVIIa 복합체에 존재하는 자생(native) 인간 TF와 결합할 수 있어, TF 또는 그것의 복합체에 인자 X(또는 인자 IX) 결합을 효과적으로 방지하여, 혈액 응고를 감소시킨다.
본 발명의 바람직한 항체는 모노클로널이고, 자생 인간 TF에 대해 뛰어난 입체적 에피토프(conformational epitope)를 특이적으로 결합하고, 그 에피토프는 의외의 강한 항체 결합 부위를 제공한다. 또한, TF와 결합하는 인간화된 항체 및 이의 프래그멘트가 제공된다. 사실, 본 발명의 바람직한 항체는 이전의 항 응고제 항체에 의해 나타나는 결합 친화성보다 적어도 약 5배, 보다 일반적으로 적어도 약 10배로 자생 인간 TF와 결합한다. 게다가, 본 발명의 바람직한 항체는 자생 인간 TF에 대해 선택적이고, 본질적으로 비자생 또는 변성 TF와 결합하지 않는다. H36.D2.B7(하이브리도마 ATCC HB-12255에 의해 분비되고, 종종 H36로 불린다)는 특히 본 발명의 바람직한 항체이다.
본 발명의 바람직한 항체는 TF와 결합하여, FX(또는 FIX)는 효과적으로 TF:FVIIa 복합체와 결합하지 않음으로써, 효과적으로 이의 활성 형태(FXa 또는 FIXa)로 전환되지 않는다. 본 발명의 바람직한 항체는 FX(또는 FIX) 결합 또는 TF 분자에 대한 접근을 효과적으로 방지함으로써 TF 기능을 억제할 수 있다. 예를 들면, 하기의 실시예 3의 결과를 참조한다.
본 발명의 바람직한 항체는 또한 TF와 인자 VIIa 사이에 상호 작용 또는 결합을 현저하게 억제하지 않거나, FX 및 인자 IX 이외의 재료에 대해 TF:FVIIa 복합체의 활성을 억제한다. 예를 들면, 하기의 실시예 4의 결과를 참조한다.
본 발명은 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산을 추가로 제공한다. H36.D2.B7의 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열(SEQ ID:NOS 1-4)는 도 1a 및 도 1b에 개시된다.
바람직한 측면에 있어서, 본 발명은 혈액 응고 및 응혈 형성을 억제하는 방법, 및 인간 TF 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 발명의 항체는 상기 논의된 바와 같은 혈액 응고, 염증, 종양 혈관 형성과 전이, 및 다른 장해를 포함하여, TF 또는 TF:FVIIa 복합체에 대한 FX(또는 FIX) 결합에 의해 매개된 임의의 생물 반응을 사실상 변조시키는데 유용할 것이다.
본 발명의 항체는 다양한 혈전증을 특히 완화시키고, 동맥 또는 심장 수술 등의 방대한 의료 처치(예를 들면, 혈관 형성술)에 이어지는 다른 혈전증, 또는 재협착을 특히 방지하거나 억제하는데 유용하다. 본 발명의 항체는 또한, 관상 동맥 질환에 한정되는 일 없이, 급성 관상동맥 증후군(예를 들면, 불안정 협심증 및 심근 경색) 및 아테롬성 동맥 경화증을 포함하는 이러한 외과적이지 아닌 심장 혈관 조건에서 혈액 응고의 활성화로부터 발생하는 혈전 폐색을 감소시키거나 심지어 효과적으로 제거하기 위해 채택될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 의료 실시(예를 들면, 카테터, 스텐트 또는 다른 의료 용구)로부터 발생하는 혈액 응고를 감소시키거나 심지어 효과적으로 제거하기 위해 채택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체는 많은 항 응고제, 항 혈소판 및 전혈용해 조성물에 적합하기 때문에, 칵테일 포맷의 투여에 의해 혈액 응고의 억제를 촉진시키거나 연장시킨다.
본 발명의 항체는 또한 포유 동물, 특히 인간 피험자의 체외 순환에서의 항 응고제로서 채택될 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 본 발명의 1개 이상의 항체는 예를 들면 심폐의 바이패스 수술, 장기 이식 수술 또는 다른 장기 수술의 경우에 발생할 수도 있는 체외 순환 이전 또는 동안에 혈액 응고를 방지하는데 충분한 양으로 포유 동물에 투여된다.
본 발명의 항체는 또한 응혈과 상호 작용하는 것을 목적으로 하는 약, 특히 의약품 예를 들면 스트레포키나아제, 조직 플라즈미노겐 액티베이터(t-PA) 또는 우로키나아제 등을 위한 담체로서 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 본 발명의 항체는 적합한 독소를 항체에 결합함으로써 세포 독성제(cytotoxic agent)로서 사용될 수도 있다. 본 발명의 항체의 결합체(Conjugate)는 또한 세포 독성제 또는 이펙터 분자(effector molecule)에 공유결합적으로 연결되어 보체 결합 능력 또는 항체 의존성 세포 매개성 세포 독성(cytotoxicity)를 제공하는 본 발명의 항체의 유효량을 포유 동물에 투여함으로써, 포유 동물, 특히 인간에서의 조직 인자 수준을 감소시키는데 사용될 수 있어, 항체 결합체는 조직 인자를 발현하는 세포와 접촉하여, 포유 동물에서의 조직 인자 수준을 감소시킨다.
본 발명의 항체는 또한 자생 인간 TF의 인 비보 화상 진단을 포함하는 인 비보 진단 방법에서 채택될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 체액(예를 들면, 혈장 또는 혈청) 또는 조직(예를 들면, 생체 조직 검사 샘플)을 포함하는 생물학적 샘플 중의 자생 TF를 검출하는 인 비트로 검정법에서 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 다양한 이종 및 동질의 면역학적 측정법은 생물학적 샘플 중의 자생 TF의 존재 및 바람직하게는 양을 검출하는 경쟁적 또는 비경쟁적 포맷으로 채택될 수 있다.
본 발명의 이러한 검정법은 혈액 응고 또는 응혈을 갖는 환자의 존재 또는 가망성을 결정하는데 매우 유용하다. 즉, 혈액 응고는 단핵 세포, 매크로파지, 및 맥관 구조를 라인하는 내피 세포 등의 세포 표면 상의 TF 발현의 결과 및 이를 통상 수반한다. 따라서, 본 발명의 검정법에 의한 체액 샘플에서의 TF의 검출은 혈액 응고를 나타낼 것이다.
본 발명의 항체는 또한 생물학적 샘플로부터 본질적으로 순수 자생 TF, 특히 자생 인간 TF를 조제하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 자생 TF를 발현하는 세포를 검출 및 정제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 예를 들면 생물학적 샘플 중의 자생 TF를 검출 및 바람직하게는 정량하기 위한 진단 키트의 구성 요소로서 채택될 수 있다.
본 발명은 또한 인간 조직 인자(TF)와 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 인간화된 항체를 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 복합체에 대한 혈액 인자 X 또는 인자 IX 결합은 현저하게 억제된다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 적어도 1개의 뮤린 상보성 결정 영역(CDR), 바람직하게는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 이러한 뮤린 CDR을 포함한다. 또한, 이러한 인간화된 항체의 TF 결합 프래그멘트를 제공한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 유효량을 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서 이용하는 바람직한 항체는 복합체에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합을 현저하게 감소시킨다. 바람직한 방법은 항체와 TF 또는 TF:FVIIa 복합체 사이에 특이적 복합체를 형성하여 혈액 응고를 억제하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 적어도 1개의 뮤린 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 유효량을 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법에서 사용하는 바람직한 인간화된 항체는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성한다. 바람직한 방법은 항체와 TF 사이에 특이적 복합체를 형성하여 혈액 응고를 억제하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 하기에 논의한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 항체는 자생 인간 TF에 대한 상당한 친화성을 나타낸다. 보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 항체는 표면 플라즈몬 분석(특히, 하기의 실시예 1의 처치에 따른 BIACore 분석)에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 약 1×108, 보다 바람직하게는 표면 플라즈몬 분석에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 약 5×108의 자생 인간 TF에 대한 결합 상수(Ka, M-1), 가장 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 약 1×1010의 자생 인간 TF에 대한 Ka(Ka, M-1)를 나타낸다. 본 발명의 항체의 이러한 상당한 결합 친화성은 이전에 보고된 항체의 훨씬 낮은 결합 친화성과 확실하게 대비된다.
이 점에서, 본 발명의 항체의 상당히 낮은 유효 농도가 채택될 수 있고, 예를 들면, 항체의 비교적 낮은 농도가 채택되어 하기의 실시예 3에 설명된 바와 같이 인 비트로 검정법에서 소망되는 바와 같이(예를 들면, 적어도 약 95, 98 또는 99% 억제도) TF 기능을 억제할 수 있다.
바람직한 항체는 또한 자생 인간 TF에 대해 매우 특이적이고, 바람직하게는 비자생 TF와 본질적으로 결합하지 않는다. 바람직한 항체는 예를 들면 표준 점 블롯팅 검정법(예를 들면, 이러한 점 블롯팅 검정법에 의해 시각적으로 검출된 비자생 TF와 전혀 또는 본질적으로 결합 없음)에 의해 결정된 비자생 TF 또는 다른 면역학적으로 무관련 분자와 본질적으로 결합하지 않는다. "비자생 TF"는 카오트로픽제(chaotropic agent)로 처리되어 TF가 변성되는 자연 발생 또는 재조합 인간 TF를 의미한다. 일반적인 카오트로픽제는 계면 활성제(예를 들면, SDS), 디티오쓰레오톨(dithiothreotol) 또는 β-메르캅토에탄올;염산구아디닌(guanidine hydrochloride) 등과 결합한 우레아를 포함한다. H36, H36.D2 또는 H36.D2.B7 항체는 이러한 비자생 TF와 본질적으로 결합하지 않는다. 예를 들면, 점 블롯팅 검정법인 하기의 실시예 8의 결과를 참조한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 항체는 또한 TF와 결합하여, FX(또는 FIX)는 FX(또는 FIX)는 TF:FVIIa 복합체와 효과적으로 결합하지 않음으로써, FX(또는 FIX)는 이의 활성 형태(FXa 또는 FIXa)로 효과적으로 전환되지 않는다. 특히 본 발명의 바람직한 항체는 본 발명의 항체의 존재(즉, 실험 샘플)와 비존재(즉, 대조군 샘플) 모두에서 FX(또는 FIX)를 TF:FVIIa 복합체에 접촉시키는 단계, 실험과 대조군 샘플 사이에 FX로부터 FXa(또는 FIX로부터 FIXa)의 전환의 퍼센트 차이를 결정하는 단계를 포함하는 하기의 실시예 3과 같은 표준 인 비트로 결합 검정법에 의해 결정되는 바와 같이, 예를 들면, 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 95%의 억제도, 약 1.0nM 미만의 TF, 또는 심지어 약 0.20nM 미만 또는 약 0.10nM 미만의 TF와 같은 낮은 TF 농도에서, TF:FVIIa 복합체에 의해 FX 활성화를 강하게 억제한다.
본 발명의 항체는 개시된 방법 및 검정법에서 사용된 경우에는 바람직하게는 본질적으로 순수하다. "본질적으로 순수"인 항체는 천연천연로 이를 수반하는 구성 요소로부터 분리된 항체 또는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 표준 면역 친화성(immunoaffinity) 또는 단백질 A 친화성 정제 기술을 사용함으로써, 본 발명의 항체는 항원 또는 단백질 A 수지로서 자생 TF를 사용하여 하이브리도마 배양(hybridoma culture)으로부터 정제될 수 있다. 마찬가지로, 자생 TF는 표준 면역 친화성 정제 기술로 본 발명의 항체를 사용하여 본질적으로 순수 형태로 얻을 수 있다. 특히, 항체 또는 단백질은 전체 단백질(주어진 샘플 A에서의 전체 단백질의 중량%)의 적어도 50%가 본 발명의 항체 또는 단백질인 경우에는 본질적으로 순수하다. 항체 또는 단백질은 바람직하게는 전체 단백질의 적어도 60중량%, 보다 바람직하게는 적어도 75중량%, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 90중량%, 및 가장 바람직하게는 적어도 전체 재료의 98중량%이다. 순도는 SDS(PAGE) 겔 전기 영동, 칼럼 크로마토그래피(예를 들면, 친화성 크로마토그래피) 또는 HPLC 분석 등의 알려진 방법에 의해 쉽게 검정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체(H36.D2.B7)의 핵산(SEQ ID NOS: 1 및 3) 및 아미노산(SEQ ID NOS: 2 및 4) 서열은 도 1a 및 도 1b에 도시된다. SEQ ID NOS. 1 및 2는 각각 경쇄 가변 영역의 핵산 및 아미노산이고, SEQ ID NOS. 3 및 4는 각각 중쇄 가변 영역의 핵산 및 아미노산이고, 이들 서열의 모두에서 밑줄친 초가변 영역(CDRs 또는 상보성 결정 영역)을 갖는다.
추가적인 본 발명의 바람직한 항체는 도 1a 및 도 1b에 도시된 경쇄 또는 중쇄 서열 중 어느 1개와 상당한 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 보다 구체적으로, 바람직한 항체는 SEQ ID NOS. 2 및/또는 4에 대해 적어도 약 70% 상동성(아미노산 서열 동일성), 보다 바람직하게는 SEQ ID NOS. 2 및/또는 4에 대해 약 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 SEQ ID NOS. 2 및/또는 4에 대해 약 85, 90 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 항체는 SEQ ID NOS. 2 및 4의 초가변 영역(도 1a 및 도 1b에서 이중 밑줄로 도시된)에 대해 높은 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 특히 본 발명의 바람직한 항체는, H36.D2.B7의 경쇄 가변 영역의 대응하는 초가변 영역(도 1a에서 밑줄친 이들 초가변 영역은 하기와 같다: 1) LASQTID(SEQ ID NO:5); 2) AATNLAD(SEQ ID NO:6); 및 3) QQVYSSPFT(SEQ ID NO:7))의 1개, 2개 또는 3개와 같거나 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성)을 갖는 경쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 3개의 초가변 영역을 가질 것이다.
특히, 본 발명의 바람직한 항체는, H36.D2.B7의 중쇄 가변 영역의 대응하는 초가변 영역(도 1b에서 밑줄친 이들 초가변 영역은 하기와 같다: 1) TDYNVY(SEQ ID NO:8); 2) YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQ ID NO:9); 및 3) DVTTALDF(SEQ ID NO:10))의 1개, 2개 또는 3개와 동일하거나 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성)을 갖는 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 3개의 초가변 영역을 가질 것이다.
본 발명의 핵산은 바람직하게는 하기의 적당하게 엄격한 조건(여기서, "정상의 엄격(normal stringency)" 조건으로 불린다): 37℃의 온도에서 0.8M 염류/0.08M 구연산 나트륨(SSC) 버퍼 중의 20% 포름아미드를 포함하고, 37℃에서 이 SSC 버퍼로 한 번 세정시키는 경우에 결합되어 있는 하이브리다이제이션 버퍼의 사용하에서 SEQ ID NO:1 및/또는 SEQ ID NO:3의 서열과 결합하기에 충분한(바람직하게는 적어도 약 100, 200 또는 250 염기쌍) 길이를 갖는다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 핵산(바람직하게는 적어도 약 100, 200 또는 250 염기쌍)은 하기의 매우 엄격한 조건(여기서, "높은 엄격(high stringency)" 조건으로 불린다): 42℃의 온도에서 0.9M 염류(염류)/0.09M 구연산 나트륨(SSC) 버퍼 중의 20% 포름아미드를 포함하고, 42℃에서 이 SSC 버퍼로 두 번 세정시키는 경우에 결합되어 있는 하이브리다이제이션 버퍼의 사용하에서 SEQ ID NO:1 및/또는 SEQ ID NO:3의 서열과 결합할 것이다.
본 발명의 핵산은 바람직하게는 적어도 20 염기쌍, 보다 바람직하게는 적어도 약 50 염기쌍을 포함하고, 가장 바람직하게는 본 발명의 핵산은 적어도 약 100, 200, 250 또는 300 염기쌍을 포함한다.
일반적으로 바람직한 본 발명의 핵산은 여기에 개시된 바와 같이 바람직한 결합 친화성 및 다른 특성을 나타내는 본 발명의 항체를 발현할 것이다.
바람직한 본 발명의 핵산은 또한 도 1a 및 도 1b에 도시된 경쇄 또는 중쇄 서열의 1개 또는 모두의 어느 것과 상당한 서열 동일성을 가질 것이다. 보다 구체적으로, 바람직한 핵산은 SEQ ID NOS. 1 및/또는 3에 대해 적어도 약 70% 상동성(뉴클레오티드 서열 동일성), 보다 바람직하게는 SEQ ID NOS. 1 및/또는 3에 대해 약 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 SEQ ID NOS. 1 및/또는 3에 대해 약 85, 90 또는 95% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함할 것이다.
특히 바람직한 본 발명의 핵산 서열은 SEQ ID NOS. 1 및 3의 초가변 영역(도 1a 및 도 1b에서 밑줄친)에 대해 높은 서열 동일성을 가질 것이다. 특히 바람직한 핵산은 항체 경쇄 가변 영역에 대해 코딩하는 것을 포함하고, H36.D2.B7의 초가변 영역(도 1a에서 밑줄친 이들 초가변 영역은 하기와 같다: 1) CTGGCAAGTCAGACCATTGAT(SEQ ID NO:11); 2) GCTGCCACC AACTTGGCAGAT(SEQ ID NO:12); 및 3) CAACAAGTTTACAGTTCT CCATTCACGT(SEQ ID NO:13))에 대해 코딩하는 서열의 1개, 2개 또는 3개와 동일하거나 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 뉴클레오티드 서열 동일성)을 갖는, 초가변 영역에 대해 코딩하는 1개, 2개 또는 3개의 서열을 갖는다.
특히 바람직한 핵산은 또한 항체 중쇄 가변 영역에 대해 코딩하고, H36.D2.B7의 대응하는 초가변 영역(도 1b에서 밑줄친 이들 초가변 영역은 하기와 같다: 1) ACTGACTACAACGTGTAC(SEQ ID NO:14); 2) TATATTGAT
CCTTACAATGGTATTACTATCTACGACCAGAACTTCAAGGGC(SEQ ID NO:15); 및 3) GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC(SEQ ID NO:16))에 대해 코딩하는 서열의 1개, 2개 또는 3개와 동일하거나 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 서열 동일성)을 갖는, 초가변 영역에 대해 코딩하는 1개, 2개 또는 3개의 서열을 갖는다.
본 발명의 핵산은 분리되고, 통상, 소정의 단편(fraction)에 존재하는 전체 핵산의 적어도 약 0.5중량%, 바람직하게는 적어도 약 2중량%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 5중량%를 구성한다. 부분적으로 순수한 핵산은 소정의 단편에 존재하는 전체 핵산의 적어도 약 10중량%, 바람직하게는 적어도 약 30중량%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 60중량%를 구성한다. 순수한 핵산은 소정의 단편에 존재하는 전체 핵산의 적어도 약 80중량%, 바람직하게는 적어도 약 90중량%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 95중량%를 구성한다.
본 발명의 항체는 일반적으로 종래의 기술에 의해 제조될 수 있고, 자생 TF, 일반적으로 자생 인간 TF, 바람직하게는 정제된 재조합 인간 조직 인자(rhTF)의 정제된 샘플로 일반적으로 생성된다. 절단형(truncated) 재조합 인간 조직 인자 또는 "rhTF"(243 아미노산으로 이루어지고 및 세포질 도메인이 부족한)은 본 발명의 항체를 생성시키기에 특히 바람직하다. 항체는 또한, 비자생 TF에 의해 나타나지 않는 자생 TF의 1개 이상의 에피토프를 포함하는 면역 항원성 펩티드로부터 생성될 수 있다. 여기서 "자생 TF"는 이러한 TF 샘플을 포함하고, 이러한 rhTF를 포함한다. 상술한 바와 같이, 폴리클로널 항체가 채택될 수 있지만, 모노클로널 항체가 일반적으로 바람직하다.
보다 구체적으로, 항체는, 단독이거나 담체와 복합된 상기 논의된 바와 같이, 자생 인간 TF의 정제된 샘플, 또는 면역 항원성 펩티드로 포유 동물에 면역을 부여함으로써 제조될 수 있다. 적합한 포유 동물은 양, 염소, 토끼, 기니아 피그, 랫트 및 마우스 등의 일반적인 실험 동물을 포함한다. 랫트 및 마우스, 특히 마우스가 모노클로널 항체를 얻기에 바람직하다. 항원은 피하의, 복강내, 정맥내, 근육내 또는 피부내 주입 등의 다수의 적합한 경로 중의 어느 것으로 포유 동물에 투여될 수 있다. 최적의 면역 간격, 면역 투여량, 등은 비교적 넓은 범위 내에서 변화될 수 있고, 이 개시에 기초하여 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적인 처치는 다수의 달에 걸쳐 수회의 항원 주입을 필요로 한다. 항체는 표준 기술에 의해 면역화된 동물의 혈청으로부터 수집되어, 자생 인간 TF에 대해 특이적 항체를 발견하기 위해 스크리닝된다. 모노클로널 항체는 항체를 제조하는 세포 내에서 제조될 수 있고, 이들 세포는 하이브리도마 세포를 형성하는 표준 융합 기술을 사용함으로써 모노클로널 항체를 생성하는데 사용된다. G. Kohler, 외, Nature, 256: 456(1975)을 참조한다. 일반적으로 이것은 잡종 세포를 제조하는 골수종 세포 등의 불멸화 세포주와 항체-생산 세포를 융합하는 것을 필요로 한다. 또는, 모노클로널 항체는 Huse, 외, Science, 256: 1275(1989)에 기재된 방법으로 세포로부터 제조될 수 있다.
1개의 적합한 프로토콜은 약 2 내지 7달의 기간에 걸쳐 실시된 정제된 rhTF 복합체를 포함하는 조성물을 마우스의 복강내 면역화를 위해 공급한다. 다음에 지라 세포는 면역화된 마우스로부터 제거될 수 있다. 면역화된 마우스로부터의 혈청은 지라 세포의 절제 전에 rhTF에 대해 특이적인 항체의 타이터에 대해 검정된다. 다음에, 절제한 마우스 지라 세포는 하이포크산틴-구아닌 인산리보전이효소 결핍(HGPRT-) 또는 티미딘 키나아제 결핍(TK-) 등의 마커를 갖는 적절한 동질 또는 이질 (바람직하게는 동질) 림파 세포주에 융합된다. 바람직하게는 골수종 세포는 림파 세포주로서 채택된다. 골수종 세포 및 지라 세포는 예를 들면, 골수종 세포 대 지라 세포가 1 대 4의 비율로 서로 혼합된다. 세포는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 방법에 의해 융합될 수 있다. G. Kohler, 외, Nature, 이하 동일을 참조한다. 따라서, 클론화된 하이브리도마는 배양지, 예를 들면 RPMI-1640에서 성장한다. G. E. More, 외, Journal of American Association, 199: 549(1967)를 참조한다. 융합 처치 후에 성장한 하이브리도마는, 정제된 rhTF와 특이적으로 결합하는 항체의 분비에 대해 예를 들면 방사 면역 측정법 또는 효소 면역학적 측정법에 의해 스크리닝된다. 예를 들면, 항체는 선택되어, 정제된 rhTF와 결합하지만, 비자생 TF와는 결합하지 않는다. 바람직하게는 ELISA가 스크리닝을 위해 채택된다. 하이브리도마는 한계 희석 방법에 의해 확장되고 클론화될 수 있는 이러한 스크리닝에 대한 긍정적인 결과를 나타낸다. 또한, 스크리닝은 용액 이외에 인간 유체 샘플 중에서 rhTF와 결합할 수 있는 항체를 선택하기 위해 실시되는 것이 바람직하다. 분리된 항체는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 임의의 적합한 면역학적 기술로 더욱 정제될 수 있다. 특히 바람직한 H36.D2.B7 항체를 제조하는 하이브리도마 배양은 부다페스트 조약에 기초하여, 미국 10852, 메릴랜드, 록빌레, 12301 파크론 드라이브(12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 10852)에 있는 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁하였다. 하이브리도마 배양은 1997. 1. 8에 ATCC에 기탁되고, 액세션 넘버(Accession Number) ATCC HB-12255로 지정되었다.
인간 치료 적용에 대하여, 키메릭 항체 유도체, 예를 들면, 비인간 동물 가변 영역 및 인간 일정 영역과 결합하는 항체 분자를 제조함으로써, 대응하는 비-키메릭 항체보다 인간 피험자 중에서 항체가 보다 면역 항원성이지 않게 하는 것이 바람직할 수도 있다. 다양한 타입의 이러한 키메릭 항체는, 예를 들면 인간 가변 영역을 제조함으로써, 특히 항원-결합 도메인의 보존된 영역인 가변 영역의 일부가 인간 유래이고, 초가변 영역만이 비인간 유래인 키메라를 포함하여, 제조될 수 있다. 또한 S. L. Morrison, Science, 229: 1202-1207(1985); Oi 외, BioTechniques, 4: 214(1986); Teng 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 80: 7308-7312(1983); Kozbor 외, Immunology Today, 4: 7279(9183); Olsson 외, Meth. Enzymol., 9: 3-16(1982)에 있는 인간화된 키메릭 항체의 논의 및 이를 제조하는 방법을 참조한다. 게다가, 유전자 도입 마우스가 채택될 수 있다. 예를 들면, 인간화된 키메릭 항체를 갖고 있는 유전자 도입 마우스는 제조되어, 자생 인간 TF로 면역화될 수 있다. 이러한 면역화된 유전자 도입 마우스로부터의 비장 세포는 이후에, 상술의 자생 인간 TF와 특이적으로 반응하는 인간 모노클로널 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하는데 사용된다. N. LONBERG 외, Nature, 368: 856-859(1994); L. L. Green 외, Nature Genet., 7: 13-21(1994); S. L. Morrison, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81: 6851-6855(1994)를 참조한다.
본 발명의 항체에 대해 코딩하는 핵산은 또한 폴리메라아제 연쇄 반응에 의해 제조될 수 있다(하기의 실시예 1에 개시된 프라이머 참조). 일반적으로, Sambrook 외, Molecular Cloning(2d ed. 1989)을 참조한다. 이러한 핵산 또한 공지의 방법 예를 들면, 인산 트리에스터 방법(Oligonucleotide Synthesis, IRL Press(M. J. Gait, ed., 1984))에 의해, 또는 상업적으로 이용 가능한 자동 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용함으로써 합성될 수 있다. 이러한 바람직한 본 발명의 핵산이 채택되어 공지의 기술에 의해 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체에 대한 핵산 코딩은, 구조물의 삽입을 위한 벡터를 삭감하기 위해 제한 효소 사용에 의해, 그 후에 결찰법(ligation)에 의한 것과 같은 공지의 방법에 의해 적합한 벡터에 삽입될 수 있다. 적합하게 실시 가능하게 프로모터 서열에 연결된, 삽입된 핵산 서열을 포함하는 벡터는 다음에 발현을 위해 숙주 세포에 삽입된다. 일반적으로, Sambrook 외, 이하 동일을 참조한다. 적합한 벡터의 선택은 클로닝 프로토콜에 관계가 있는 인자에 기초하여 경험적으로 행하여질 수 있다. 예를 들면, 벡터는 적합해져야 하고, 채택되는 숙주 세포에 대해 번역후 변형을 갖는다. 또, 벡터는 삽입된 핵산 서열에 적응시킬 수 있어야 한다. 적합한 숙주 세포는 대장균(E. coli) 등의 각종의 진핵 또는 원핵 세포를 포함할 것이다.
본 발명의 항체의 분자량은 사용 목적 및 항체가 결합된 또는 재조합적으로 융합된 독소, 의약, 또는 검출가능 표식 등을 포함하고 있는지 아닌지 등의 몇몇 인자에 따라 변화할 것이다. 또한 분자량은 만약 항체에 대해 어떤 것(당화 등)이 있다면 번역후 변형의 범위 및 성질에 따라 변화할 것이다. 변형은 비당화된 항체를 제조하는 대장균 및 당화된 항체를 제조하는 포유류 세포를 가진 발현에 사용되는 숙주의 기능이다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 약 20 내지 150kDa 사이의 분자량을 가질 것이다. 이러한 분자량은 SDS-PAGE 겔 전기 영동, 그 후 단백질 염색 또는 웨스턴 블롯팅 분석법 등의 분자 사이징(sizing) 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
"본 발명의 항체" 또는 유사한 용어는 전체 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 이외에, 자생 TF와 결합하는 면역학적으로 활성 프래그멘트를 참조한다. 이뮤노글로불린 및 이의 면역학적으로 활성 프래그멘트는 항체-결합 부위(즉, 자생 인간 TF와 특이적으로 결합할 수 있는 자생 인간 TF를 인지하는 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 에피토프)를 포함한다. 모범적인 항체 프래그멘트는 예를 들면, Fab, F(v), Fab', F(ab')2 프래그멘트, 이뮤노글로불린의 디설피드 결합을 감소시켜서 유도된 "반 분자(half molecule)", 단쇄 이뮤노글로불린, 또는 다른 적합한 항원 결합 프래그멘트(예를 들면, Bird 외, Science, pp. 242-424(1988); Huston 외, PNAS,(USA), 85: 5879(1988); Webber 외, Mol. Immunol., 32: 249(1995)를 참조)를 포함한다. 항체 또는 이의 면역학적으로 활성 프래그멘트는 동물(예를 들면, 마우스 또는 랫트 등의 설치류) 또는 키메릭 형태(Morrison 외, PNAS, 81: 6851(1984); Jones 외, Nature, pp. 321,522(1986)를 참조)일 수도 있다. 본 발명의 단쇄 항체는 바람직할 수 있다.
마찬가지로, "본 발명의 핵산"은, 발현되어 본 발명의 항체를 제공할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 참조하고, 이러한 용어가 명기되어 바로 위를 의미한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 항체는 일반적으로, 1개 이상 약리학적으로 허용가능한 멸균수 또는 염류 등의 비-독성 담체, 폴리에틸렌글리콜 등의 글리콜, 식물 유래의 오일, 등을 포함하는 조성물로 포유 동물, 바람직하게는 인간과 같은 영장류에게 투여될 수 있어, TF-매개된 응고의 활성화에 원인이 있는 혈전 폐쇄성 장해를 방지하거나 감소시킬 수 있다. 특히, 생물학적 적합성, 셍체 분해성, 락티드 글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 공중합체는 여기에 설명된 항체-함유 조성물의 방출을 제어하는 유용한 부형제일 수도 있다. 다른 잠재적으로 유용한 투여 시스템은 에틸렌비닐아세테이트 공중합체 입자, 침투압 펌프, 및 이식가능한 주입 시스템 및 리포솜을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 항 응고제 조성물은 용액 또는 현탁액(또는, 용액 또는 현탁액으로 재구성될 수 있는 동결 건조된 형태)의 형태로 있고, 바람직하게는 본 발명의 항체 약 0.01% 내지 10%(w/w), 바람직하게는 항체의 약 0.01% 내지 5%(w/w)를 포함할 것이다. 항체는 조성물에서 단독 유효 성분으로서, 또는 1개 이상 다른 항 응고제(예를 들면, 헤파린, 히루딘 또는 히루로그, 쿠머딘, 워파린), 항 혈소판(예를 들면, 아스피린, 플라빅스(Plavix), 티클리드(Ticlid), 레오프로(ReoPro), 인테그릴린(Integrilin) 또는 아그레스타트(Aggrestat), 또는 전혈용해제(예를 들면, 조직 플라즈미노겐 액티베이터, 스트레포키나아제 및 우로키나아제)를 포함하는 칵테일로서 투여될 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체는 바람직한 항 응고 활성을 촉직하거나 연장하는 1개 이상 적합한 항 응고제, 항 혈소판 또는 전혈용해제를 투여하기 전 또는 후에 투여될 수 있다.
또한 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 의료 실시, 예를 들면, 카테터, 스텐트, 등의 내재하는 장치를 사용하여 발생하는 잠재적 혈액 응고를 감소시키기 위해 채택될 수 있다. 하나의 바람직한 방법에 있어서, 상기 실시는 체액과 접촉하기 전에, 본 발명의 항체(예를 들면, 1mg/㎖ 염류 용액과 같이)로 치료될 수 있다. 또는, 게다가, 본 발명의 항체는 혈액 응고를 감소시키기에 충분한 양으로 체액과 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 치료의 항 응고제 조성물은 특히 액체 용액의 형태로, 비경구적 또는 정맥내 투여에 사용하기에 적합하다. 이러한 조성물은 단위 투여량으로 편리하게 투여될 수도 있고, 의약 기술에서 공지된 방법에 따라 제조될 수도 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences,(Mack Publishing Co., Easton PA,(1980))를 참조한다. 용어 "단위 투여량"은 인간과 같은 영장류에 대한 단위의 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위로 채택된 본 발명의 치료의 조성물을 의미하고, 각각의 단위는 필요한 희석제 또는 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 발휘하기 위해 계산된 활성제의 소정량을 포함한다. 단위 투여량은 치료되는 혈전증의 타입과 중대성, 항체를 이용하는 피험자의 혈액 응고 시스템의 용량, 및 억제도 또는 바람직한 FX(또는 FIX) 활성화의 중화도를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 투여되는 항체의 정확한 양은 일반적으로 숙련자의 판단에 의해 유도되지만, 단위 투여량은 일반적으로 투여의 경로에 의존하고, 1일 당 10ng/kg 체중 내지 50mg/kg 체중의 범위이고, 보다 일반적으로 1일 당 100ng/kg 체중 내지 약 10mg/kg 체중의 범위이다. 추가 항원 주사(booster shot)에서의 초기 투여에 대한 적합한 투여 계획은 또한 가변적이지만, 초기 투여, 그 후에 1시간 이상의 간격에서 이어지는 주입 또는 다른 투여에 의한 반복 투여에 의해 전형화된다. 또는, 연속적인 또는 단속적인 정맥내 주입은 혈액 중의 항체의 약 10나노몰 내지 10마이크로몰의 농도를 유지하기에 충분해질 수도 있다.
일부 예에 있어서, 바람직한 생물학적, 화학적 또는 물리학적 특성을 본 발명의 항체에 부여하기 위해 상기 항체를 변경하는 것이 바람직할 수도 있다. 보다 구체적으로, 의약제, 예를 들면, 섬유소용해 활성을 제공하는 t-PA, 스트렙토키나아제, 또는 우로키나아제 등의 섬유소용해 약에 또는 섬유소-결합 도메인 등의 타켓팅제에 항체를 결합(즉, 공유적 연결)시키는데 유용할 수도 있다. 이러한 연결은 이질 이관능성 단백질 가교제, 예를 들면, SPDP, 카르보디바이드(carbodimide), 등과 같은 연결 분자의 사용을 포함하는 몇몇 방법에 의해, 또는 재조합 방법에 의해 성취될 수 있다.
섬유소용해 약(fibrinolytic agent) 등의 의약품 이외, 본 발명의 항체는 디프테리아 독소(즉, DT), 시가(shiga) 독소, 아브린(abrin), 콜레라 독소, 리신, 사포린(saporin), 슈도모나스(pseudomonas) 외독소(exotoxin)(PE), 미국자리공 항바이러스성(pokeweed antiviral) 단백질, 또는 겔로닌(gelonin) 등의 예를 들면, 식물 또는 세균성 유래의 독소에 결합될 수 있다. 이러한 독소의 생물학적으로 활성 프래그멘트는 기술적으로 잘 알려져 있고, 예를 들면, DT A쇄(chain) 및 리신 A쇄를 포함한다. 상기 독소는 또한 포스포리파아제(phospholipase)(예를 들면, 포스포리파아제 C)와 같은 세포 표면에서 활성인 약제일 수 있다. 다른 실시예와 같이, 상기 독소는 예를 들면, 벤데신(vendesine), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastin), 메토트렉사트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 독시루비신(doxirubicin), 블레오마이신(bleomycin), 또는 시스플라틴(cisplatin) 등의 화학적 치료 약일 수 있거나, 상기 독소는 예를 들면, 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188 또는 비스무트-212 등의 방사성 핵종(radionuclide)일 수 있다(일반적으로, Moskaug 외, J. Biol. Chem., 264: 15709(1989); 1. Pastan 외, Cell, 47: 641(1986); Pastan 외, Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem., 61: 331(1992); Chimeric Toxins Olsnes 및 Phil, Pharmac. Ther., 25: 355(1982); PCT 출원 공보 제 WO 94/29350 호; PCT 출원 공보 제 WO 94/04689 호; 및 미국 특허 제 5,620,939호). 또한, 상기 논의한 바와 같이, 독소 이외, 본 발명의 항체는 포유 동물에 투여시에 보체 결합 능력 및 항체-의존 세포-매개된 사이톡시서티(cytoxicity)를 제공하기 위해 이펙터 분자(예를 들면, IgG1 또는 IgG3)에 결합될 수 있다.
이러한 항체-세포 독소 또는 이펙터 분자 결합체는 포유 동물, 바람직하게는 인간과 같은 영장류에 치료적인 유효량으로 투여될 수 있고, 상기 포유 동물은 TF를 발현할 수 있는 종양 세포, 면역 시스템 세포, 또는 내피를 갖고 있다고 알려지거나, 갖고 있다고 의심된다. 전형적인 이러한 종양 세포, 면역 시스템 세포 및 내피는 가슴 및 폐의 악성 종양, 단핵 세포 및 혈관의 내피를 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 상술된 것들 이외 다양한 다른 약제, 예를 들면, 약(drug), 효소, 호르몬, 방사성 핵종(radionuclide)과 결합할 수 있는 킬레이트제 뿐만 아니라, 병의 진단 또는 치료에 유용한 다른 단백질 및 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 진단 목적을 위해, 본 발명의 항체는 검출할 수 있게 표식(label)되거나 표식되지 않게 사용될 수 있다. 예를 들면, 각종의 표식은 예를 들면, 합텐, 등과 같은 배위자, 방사성 핵종(radionuclide), 형광체(fluor), 효소, 효소 기질, 효소 인자, 효소 억제제 등에서 검출가능-표식 항체에 적합하게 채택될 수도 있다.
진단 방법은 또한 인 비보 화상 진단을 포함하여 제공된다. 예를 들면, A. K. Abbas, Cellular 및 Molecular Immunology, pg. 328(W. B. Saunders Co. 1991)을 참조한다. 대부분의 인 비보 화상 적용을 위해, 본 발명의 항체는 예를 들면, 125I, 32P, 99Tc, 또는 다른 검출가능 태그로 검출가능하게 표식될 수 있고, 이어서, 항체를 소망의 목표에 접촉시키는데 충분한 소정 시간 동안 포유 동물, 특히 인간에 투여된다. 다음에 피험자는 항체의 결합을 검출하는 신티그램 촬영 카메라 분석 등의 공지의 처치에 의해 스캔된다. 상기 분석은 특히 본 명세서에서 개시된 것과 같은 다수의 혈전증의 진단 및 치료를 목적으로 한다. 상기 방법은 바람직하지 않은 혈액 응고의 형성이 발생할 수 있는 심장 수술, 특히 혈관 형성술, 또는 다른 외과 수술과 관련하여 채택되는 경우 특히 유용하고, 응혈의 발생 또는 이동을 시각화한다.
본 발명의 항체는 또한 본질적으로 순수한(예를 들면, 적어도 약 90% 순수, 바람직하게는 적어도 약 96 또는 97% 순수) 자생 TF, 특히 생물학적 샘플로부터의 자생 인간 TF를 제조하는 사용될 수 있다. 예를 들면, 자생 TF는 상술한 바와(예를 들면, L. V. M. Rao 외, Thrombosis Res., 56: 109(1989) 참조) 같이 얻을 수 있고, 용액을 항체를 포함하는 고체 지지체(support)와 혼합합으로써 정제되어, 커플링 반응 혼합물을 형성하다. 모범적인 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 세파덱스(Sephadex)TM (Pharmacia Fine Chemicals)와 같은 가교 덱스트란, 아가로우스, 폴리스티렌 비드(Abbott Laboratories), 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌, 가교 형태의 폴리아크릴아미드, 니트로셀룰로우스 또는 나일론 등을 포함하거나 이들로 이루어지는 지지체 뿐만 아니라, 마이크로타이터 판(microtiter plate) 등의 판의 벽을 포함하다. 다음에 TF는 표준 면역학적 기술에 따라 본진적으로 순수한 형태로 고체 지지체로부터 분리될 수 있다. 일반적으로 Harlow 및 Lane 이하 동일 및 Ausubel 외 이하 동일을 참조한다.
또한 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 생물학적 샘플 중의 자생 인간 TF, 특히 응혈과 관계가 있는 자생 TF를 검출하기 위해 채택될 수 있다. 모범적인 생물학적 샘플은 혈액 혈장, 혈청, 타액, 소변, 대변, 질의 분비물, 담즙, 림프, 눈의 체액, 뇌척수 유체, 세포 배양지, 및 조직, 특히 심장 조직 등의 혈관의 조직을 포함한다. 샘플은, 예를 들면, 경피적 경혈관 관동맥 개입, 심폐의 바이패스 수술, 동맥 내막 절제술, 말초 혈관 바이패스 이식술, 재건 또는 성형 수술, 관절 치환술 등의 방대한 의료 처치; 심근 경색, 심근증, 심장 판막증, 안정 협심증, 불안정 협심증, 또는 색전형성법과 관계가 있는 심방성 세동 등의 심장 병; 파종성 혈관내 응고를 포함하는 응고 장애, 심부 정맥 혈전증, 스텐트 또는 카테터 등의 실시의 전개(deployment); 쇼크(예를 들면, 패혈성 쇼크 증후군), 혈관의 트라우머(trauma), 간 질환, 출혈 발작, 열 발작, 악성 종양(예를 들면, 췌장, 난소, 또는 작은 폐 세포 암종), 낭창, 경련, 혈관 주위의 폐쇄성 질환, 및 신장병과 관계가 있는 혈전증, 바람직하게는 재협착으로 고생하거나 고생한다고 의심되는 포유 동물로부터 적합하게 얻어질 수도 있다.
이러한 검정법에 있어서, 본 발명의 항체는 공지의 방법에 따라, 원자 또는 분자 예를 들면 방사능의 요오드, 트리튬, 비오틴, 또는 β-갈락토시다아제 또는 양고추냉이 페록성시다아제 등의 효소에 부착된 항-요오드타입의(anti-iodiotypic) 항체 등의 검출가능 생성물, 또는 형광성 태그(예를 들면, 플루오레세인 또는 로다민)를 생성시킬 수 있는 시약으로 검출가능하게 표식될 수 있다. 생물학적 샘플을 검출가능하게 표식된 항체와 접촉시킨 후, 임의의 비반응 항체는 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있고, 표식(또는 생성물)은 항체 포획 검정법, 항체 샌드위치 검정법, RIA, ELISA, 면역 침강, 면역 흡착 등(Harlow 및 Lane, 이하 동일; Ausubel 외 이하 동일을 참조)을 포함하는 종래의 면역학적 방법에 의해 검출된다. 적합한 대조군 샘플에서 검출된 것을 초과하는 임의의 표식(또는 생성물)은 생물학적 샘플 중의 자생 TF, 보다 구체적으로 응혈의 존재를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 검출가능하게 표식되어, 항체 포획 검정법, ELISA, 항체 샌드위치 검정법, RIA, 면역 침강, 면역 흡착 등과 같은 표준 면역학적 기술에 따라 자생 TF를 검출 및 바람직하게는 정량할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 조직이 사용되는 경우, 면역학 기술은 단백질 구조(예를 들면, 희석 포름알데히드)를 본질적으로 유지하는 것이 알려진 시약과의 조직 고정을 포함할 수도 있다. 일반적으로, Ausubel 외, Current Protocols in molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,(1989); Harlow 및 Lane in antibodies:A Laboratory Manual, CSH Publications, NY(1988)를 참조한다.
본 발명의 항체는 또한 악성 세포 이외에 섬유아 세포, 뇌 세포, 면역 세포(예를 들면, 단핵 세포), 내피(epithelia)를 포함하여, 자생 TF를 발현하는 세포를 검출 및 정제하는데 사용될 수 있다. 세포를 검출 및 정제하는 바람직한 방법은 종래의 면역학적 방법(예를 들면, FACS 등의 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 방법 및 이뮤노팬닝(immunopanning))을 포함한다. 자생 TF를 발현하는 본질적으로 순수한 세포의 집단은 임상 및 연구 세팅, 예를 들면, TF-결합 항체를 스크리닝하기 위한 배양된 세포로서의 세포를 수립하는데 유용하다.
본 발명은 또한 상술한 바와 같이 테스트 샘플, 특히 혈액, 혈장, 등의 체액, 또는 조직 중의 자생 TF, 특히 자생 인간 TF를 검출하기 위한 테스트 및 진단 키트를 제공한다. 바람직한 키트는 검출가능하게 표식된 본 발명의 항체를 포함한다. 진단 키트는 생물학적 샘플 중의 자생 TF의 존재 또는 양을 검출하는 ELISA 포맷 등의 임의의 허용가능한 면역학적 포맷으로 사용될 수 있다.
논의된 바와 같이, 본 발명은 또한 인간 조직 인자와 특이적으로 결합하여 결합 복합체를 형성하는 인간화된 항체를 특징으로 한다. 조직 인자는 자연 발생 또는 재조합(rHTF)일 수도 있다. 바람직하게는, 복합체에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합이 억제된다. 바람직한 본 발명의 실시 형태에 있어서, 인간화된 항체는 약 1nM 미만, 바람직하게는 약 0.5nM 미만, 보다 바람직하게는 약 O.O1nM 내지 약 0.4nM 범위의 hTF에 대한 친화성 상수(Kd)를 갖는다. 인간화된 항체에 대한 친화성 상수를 결정하는 것에 대한 더 많은 정보에 대해 하기의 실시예 11을 참조한다. 성구 "특이적 결합(specific binding)"은 인간화된 항체가 RIA, 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA 등의 표준 면역학적 기술의 의해 결정되는 바와 같이, 다른 항원 없이 TF와 검출가능한 결합 복합체를 형성한다는 것을 의미한다.
추가적인 인간화된 본 발명의 항체는 표준 프로트롬빈(PT) 응고 검정법에 의해 결정하여, 적어도 약 5초까지 혈액 응고 시간을 증가시키는 능력을 추가로 특징으로 한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 인간화된 항체의 양은 검정법에서, 약 5nM 내지 약 75nM, 보다 바람직하게는 약 10nM 내지 약 50nM 범위일 것이다. 예를 들면, 하기의 실시예 11를 참조한다(인간화된 항체를 갖고 표준 PT 응고 검정법을 어떻게 실시하는지를 설명한다).
본 발명에 일치하는 추가적으로 바람직한 인간화된 항체는 ATCC Accession No. HB-12255에 기탁된 H36.D2.B7.로부터 얻은 항체와 대략 동일하거나 보다 큰 조직 인자, 바람직하게는 인간 TF에 대한 결합 특이성을 갖는다. 또한, ATCC Accession No. HB-12255에 기탁된 H36.D2.B7로부터 얻은 항체와 대략 동일하거나 보다 큰 TF에 대해 결합 친화성을 갖는 인간화된 항체가 바람직하다. 결합 특이성 및 친화성을 결정하는 방법은 현장에서 알려져 있고, 상술한 특이적 검정법(specific assay)을 포함한다.
또, 본 발명과 일치하는 인간화된 항체는 적어도 1개의 뮤린 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 상기한 바와 같이, 이뮤노글로빈 경쇄 및 중쇄는 예를 들면, 서열이 비교적 보존되는 4개 영역(FR1-4)의 프레임워크를 각각이 포함하는 어떤 구조적 유사성을 공유한다. FR1-4(FR1, FR2, FR3, FR4)의 각각은 3개의 CDR(CDR1, CDR2, CDR3)에 의해 공유 결합적으로 연결된다. 4개의 FR이 주로 베타-시트 구조(beta-sheet configuration)를 채용하고, 상호 연결된 CDR은 루트 연결을 형성하고, 일부 예에 있어서, 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 대부분의 CDR은 인접하는 FR에 가깝게 유지되어, 반대의 경쇄 또는 중쇄로부터 대응하는 CDR에서는 항원 결합 부위를 형성하는 것을 돕는다. 광범위의 CDR 및 FR이 개시되고 있다. 예를 들면, Kabat 외 in Sequences of Proteins of Immunological Interest US Dept. of Health 및 Human Services, US Government Printing Office(1987)를 참조한다.
또한 EP-A-0239400 및 미국 특허 제 5,985,279 호(CDR이 FR 이외의 다른 종으로부터 유래되는 변화된 항체를 제조하는 방법을 설명한다)를 참조한다.
성구 "인간화된(humanized)"은 랫트 또는 마우스 이뮤노글로빈 등의 통상적으로 설치류인 비인간 원(source)으로부터의 1개 이상 CDR과 인간 프레임워크 영역을 포함하는 이뮤노글로빈을 의미한다. CDR을 제공하는 비인간 이뮤노글로빈은 "도너(donor)"로서 불리고, 인간 이뮤노글로빈은 "수용체(acceptor)"로서 불린다. 일정 영역은 예를 들면 이러한 이뮤노글로빈의 어떤 TF 결합 프래그멘트에서와 같이, 존재할 필요가 없다. 존재하는 경우는 바람직한 일정 영역은 인간 이뮤노글로빈 일정 영역에 대해 본질적으로 일치하고, 즉, 적어도 약 90% 아미노산 서열과 일치하고, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 일치한다. 따라서, CDR의 있을 수 있는 예외를 가지면서, 인간화된 이뮤노글로빈의 거의 모든 부분은 자연 발생 인간 이뮤노글로빈 서열의 대응하는 부분과 본질적으로 일치한다.
성구 "인간화된 항체(humanized antibody)"는 인간화된 경쇄 및 인간화된 중쇄 이뮤노글로빈을 포함하는 항체를 의미한다.이러한 항체를 제조 및 사용하는 방법은 상기에 논의하였다. S. L. Morrison, 이하 동일; Oi 외, 이하 동일; Teng 외, 이하 동일; Kozbor 외, 이하 동일; Olsson 외, 이하 동일; 및 다른 미리 인용된 참조 문헌을 참조한다.
예를 들면, 설명의 인간화된 항체는: 1) 아미노산 서열에 각각 적어도 약 90% 일치하고, 대응하는 인간 FR에 바람직하게는 적어도 95% 일치한 경쇄 및 중쇄 프레임워크(FRs), 2) 마우스로부터의 적어도 1개의 CDR, 바람직하게는 마우스로부터의 모든 CDR, 3) 대응하는 인간 이뮤노글로빈 일정 영역에 적어도 약 90% 일치하고, 적어도 약 95% 일치한 이뮤노글로빈 일정 영역을 포함한다. 얻어진 인간화된 항체가 CDR을 공급하는 도너 항체와 일치한 항원과 결합하는 것이 기대되기 때문에, 도너 항체는 "인간화(humanization)"의 공정에 의해 "인간화되었다"는 것을 알 수 있다.
여기서 공급된 인간화된 항체는 필요에 따라 인접하거나 비인접할 수 있는 1개 이상 추가적인 보존적인 아미노산 치환을 가질 수도 있다. 예를 들면, 일반적으로 이러한 치환은 항원 결합 또는 다른 이뮤노글로빈 기능에 대해 영향을 본질적으로 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는다. 복수의 형태를 포함하는 성구 "보존적인 치환"은 gly↔ala; val↔ile↔leu; asp↔glu; asn↔gln; ser↔thr, lys↔arg; 및 phe↔tyr의 조합을 의미한다.
추가적인 인간화된 항체는 1개 이상의 자생 인간 이뮤노글로빈 서열의 대응하는 가변 영역에 대해 아미노산 서열(예를 들면, 약 73% 내지 75% 일치한)에서 적어도 70% 일치한 가변 영역을 특징으로 한다. 또, 본 발명의 인간화된 항체는 1개 이상 인간 항체에 대해 전체 항체에 걸쳐 적어도 90% 동일성을 갖는다.
보다 구체적인 인간화된 본 발명의 항체는 프레임워크(FR) 1, 2, 3 및 4의 각각이 도 12(a)에 도시된 경쇄 FR 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상의 동일성을 갖는 것이다. 바람직하게는, 서열은 도 12a에서의 "LC-09"로서 도시되었다. 인간화된 항체는 도 14a 또는 도 15a에 도시된 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 95% 서열 동일성 이상을 갖는 경쇄 일정 영역을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
또, 특정 인간화된 항체는 프레임워크(FR) 1, 2, 3 및 4의 각각이 도 13a에 도시된 중쇄 서열(SEQ ID NO.－)에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 약 95% 동일성 이상 이상을 갖는 것이다. 바람직하게는, 서열은 도 13a에서의 "HC-08"로서 도시되었다. 추가적인 인간화된 항체는 도 14b 또는 15b에 도시된 서열(SEQ ID NO.－)에 대하여 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 95% 동일성을 갖는 중쇄 일정 영역 갖는다.
특정 실시 형태에 있어서, 인간화된 항체는 IgG1(hOAT) 또는 IgG4(hFAT) 이소타입(isotype)을 갖는다. 실시예 9를 참조한다.
여기서 개시된 인간화된 항체의 기능적인 프래그멘트가 또한 본 발명에 의해 제공된다. 바람직한 프래그멘트는 약 1nM 미만의, 바람직하게는 약 0.5nM 미만의, 보다 바람직하게는 약 0.01nM 내지 약 0.4nM 범위의 친화성 상수(Kd)를 갖는 TF와 특이적으로 결합한다. 특히 바람직하게는 항원 결합 Fab, Fab', 및 F(ab)2 프래그멘트이다.
논의된 바와 같이, 본 발명은 적어도 1개의 뮤린 상보성 결정 영역(CDR), 예를 들면, CDR1, CDR2, CDR3를 포함하는 인간화된 항체를 특징으로 한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 항체는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성한다. 일반적으로, TF 또는 TF:VIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제된다. 상술한 바와 같이, 바람직한 CDR(경쇄 및 중쇄)은 설치류 원, 일반적으로 마우스로부터 유래한다.
인간화된 본 발명의 항체의 일실시 형태에 있어서, 항체는 적어도 1개의 완전 인간 프레임워크(FR) 영역을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 모든 FR 영역(경쇄 및 중쇄)은 인간이다.
보다 구체적인 실시 형태에 있어서, 중쇄 초가변 영역의 제1 CDR(CDR1)은 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 그 서열과 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 일치한다. 일반적으로, 중쇄 초가변 영역의 제2 CDR(CDR2)은 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 일치한다. 바람직하게는 또한, 중쇄 초가변 영역의 제3 CDR(CDR3)은 도 13d에 도시된 CDR3 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 보다 바람직하게는 그 서열과 약 95% 이상 일치한다.
2개의 핵산 서열 사이의 동일성은 검사에 의해 및/또는 BLAST 및 FASTA 등의 종래의 컴퓨터 소프트웨어의 사용에 의해 결정될 수 있다.
다른 본 발명의 실시 형태에 있어서, 경쇄 초가변 영역의 제1 CDR(CDR1)은 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 일치한다. 일반적으로, 경쇄 초가변 영역의 제2 CDR(CDR2)은 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 바람직하게는 약 95% 이상 일치한다. 바람직하게는, 경쇄 초가변 영역의 제3 CDR(CDR3)은 도 12d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 그 서열과 보다 바람직하게는 약 95% 이상 일치한다.
추가적인 인간화된 본 발명의 항체는 "FR1 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 바람직하게는 그 서열과 약 95% 이상 일치한 중쇄 초가변 영역의 제1 프레임워크(FR1)를 포함한다. 일실시 형태에 있어서, FR1은 다음의 E1로부터 Q로; Q5로부터 V로; P9로부터 G로; L11로부터 V로; V12로부터 K로; Q19로부터 R로; 및 T24로부터 A로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함한다. 바람직하게는, FR1은 그 변화의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개를 포함하고, 그 아미노산 변화의 전부는 모든 적용에 대해 바람직하다.
또, 인간화된 본 발명의 항체는 "FR2 HC-08"로서 도 13a에 도시된 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 바람직하게는 그 서열과 약 95% 이상 일치한다. 일실시 형태에 있어서, FR2는 다음의 41H로부터 P로; 및 44S로부터 G로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함한다. 바람직한 FR2는 그 아미노산 변화 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 "FR3 HC-08"로서 도 13a에 도시된 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 바람직하게는 그 서열과 약 95% 이상 일치한 인간화된 항체를 특징으로 한다. 일실시 형태에 있어서, FR3는 다음의 76S로부터 T로; 77T로부터 S로; 80F로부터 Y로; 82H로부터 E로; 84N로부터 S로; 87T로부터 R로; 89D로부터 E로; 및 91S로부터 T로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함한다. 바람직한 FR3는 그 아미노산 변화의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개를 포함하고, 그 아미노산 변화의 7개 전부는 일반적으로 바람직하다.
또한, 인간화된 항체는 중쇄 초가변 영역의 제4 프레임워크(FR4)가 "FR4 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 90% 일치하고, 바람직하게는 그 서열과 적어도 약 95% 이상 일치한 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, FR4는 다음의 113L로부터 V로의 아미노산 변화를 포함한다.
본 발명에 일치하는 추가적인 인간화된 항체는 경쇄 초가변 영역의 제1 프레임워크(FR1)가 "FR1 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 90% 일치하고, 바람직하게는 그 서열과 적어도 약 95% 이상 일치한 것을 특징으로 한다. 일실시 형태에 있어서, FR1는 다음의 11Q로부터 L로; 15L로부터 V로; 17E로부터 D로; 및 18로부터 R로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함한다. 바람직한 FR1는 이러한 아미노산 변화의 2개 또는 3개를 포함하고, 모든 4개의 아미노산 변화가 일반적으로 바람직하다.
본 발명은 또한 경쇄 초가변 영역의 제2 프레임워크(FR2)가 "FR2 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 90% 일치하고, 바람직하게는 그 서열과 적어도 약 95% 이상 일치한 인간화된 항체를 특징으로 한다. 바람직한 FR2는 다음의 37Q로부터 L로의 아미노산 변화를 갖는다.
본 발명은 또한 경쇄 초가변 영역의 제3 프레임워크(FR3)가 "FR3 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 90% 일치하고, 바람직하게는 그 서열과 적어도 약 95% 이상 일치한 인간화된 항체를 포함한다. 일실시 형태에 있어서, FR3는 다음의 70K로부터 D로; 74K로부터 T로; 80A로부터 P로; 84A로부터 V로; 및 85N로부터 T로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 갖는다. 바람직하게는, FR3는 이러한 아미노산 변화의 2개, 3개, 또는 4개를 갖고, 변화의 5개 전부는 일반적으로 바람직하다.
추가적인 인간화된 본 발명의 항체는 "FR4 LC-09"로서 도 12a에 도시된 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 90% 일치하고, 바람직하게는 그 서열과 적어도 약 95% 이상 일치하는 경쇄 초가변 영역의 제4 프레임워크(FR4)를 포함한다. 일실시 형태에 있어서, FR4는 다음의 100A로부터 Q로; 및 106L로부터 I로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개, 바람직하게는 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 상기의 인간화된 항체의 인간 TF 결합 프래그멘트를 특징으로 한다. 이러한 프래그멘트의 실시예는 Fab, Fab', 및 F(ab)2를 포함한다.
특정 실시 형태에 있어서, 본 발명은 적어도 1개의 설치류, 통상적으로 마우스 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 인간화된 항체를 특징으로 한다. 바람직하게는, 그 항체는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여, TF 또는 TF/VIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 TF/VIIa에 의한 활성화가 억제되는 복합체를 형성한다. 또한 바람직하게는, 인간화된 항체는 중쇄 상에, 다음의 구성 요소:
a) 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 CDR(CDR1),
b) 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 CDR(CDR2),
c) 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 CDR(CDR3),
d) "FR1 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
e) "FR2 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
f) "FR3 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
g) "FR4 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제4 프레임워크(FR4)
를 적어도 1개 및 보다 바람직하게는 모두 포함한다.
특정 실시 형태에 있어서, 인간화된 항체는 또한, 경쇄 상에, 다음의 구성 요소:
h) 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 CDR(CDR1),
i) 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 CDR(CDR2),
j) 도 12c에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 CDR(CDR3),
k) "FR1 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
l) "FR2 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
m) "FR3 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
n) "FR4 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제4 프레임워크(FR4)
를 적어도 1개 및 보다 바람직하게는 모두 포함한다.
바람직하게는, 인간화된 항체는 도 14a(SEQ ID NO.－) 또는 도 15a(SEQ ID NO.－)의 경쇄 일정 서열을 추가로 포함한다. 또한 바람직하게는, 상기 항체는 도 14b(SEQ ID NO.－) 또는 도 15b(SEQ ID NO.－)의 중쇄 일정 영역을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 중쇄 상에, 다음의 구성 요소:
a) 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 CDR(CDR1),
b) 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 CDR(CDR2),
c) 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 CDR(CDR3),
d) "FR1 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
e) "FR2 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
f) "FR3 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
g) "FR4 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제4 프레임워크(FR4)
를 적어도 1개 및 바람직하게는 모두를 포함하는 인간화된 항체를 특징으로 한다.
일실시 형태에 있어서, 인간화된 항체는 경쇄 상에, 다음의 구성 요소:
h) 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 CDR(CDR1),
i) 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 CDR(CDR2),
j) 도 12d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 CDR(CDR3),
k) "FR1 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
l) "FR2 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
m) "FR3 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
n) "FR4 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제4 프레임워크(FR4)
를 적어도 1개 및 바람직하게는 모두를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 인간화된 항체는 도 14a(SEQ ID NO.－) 또는 도 15a(SEQ ID NO.－)의 경쇄 일정 서열을 추가로 포함한다. 또한 바람직하게는, 항체는 도 14b(SEQ ID NO.－) 또는 도 15b(SEQ ID NO.－)의 중쇄 일정 영역을 포함한다.
인간화된 본 발명의 항체는 예를 들면, Fv, Fab, 및 F(ab')2 및 이관능성 하이브리드 항체(예를 들면, Lanzavecchia 외, Eur. J. Immunol. 17,105(1987))를 포함하여, 전체 항체 이외에 다양한 적합한 형태로 및 단쇄(예를 들면, Huston 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85, 5879-5883(1988) 및 Bird 외, Science 242,423-426(1988), 본 명세서에 참조로서 포함된다)로 존재할 수도 있다(본 명세서에 참조로서 포함되는 Hood 외, Immunology, Benjamin, N. Y., 2. sup. nd ed.(1984), Harlow 및 Lane, antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988) 및 Hunkapiller 및 Hood, Nature, 323,15-16(1986)를 참조한다.).
성구 "키메릭 항체" 또는 관련 성구는 경쇄 및 중쇄 유전자가 다른 종에 속하는 이뮤노글로불린 유전자 세그멘트로부터 일반적으로 유전자 공학에 의해 구성되었다는 것을 의미한다. 예를 들면, 마우스 모노클로널 항체로부터의 유전자의 가변(V) 세그멘트는 γ1γ3와 같은 인간 일정(C) 세그멘트에 결합될 수도 있다. 따라서, 일반적인 치료의 키메릭 항체는 다른 포유류 종이 사용될 수도 있지만, 마우스 항체로부터의 V 또는 항원-결합 도메인 및 인간 항체로부터의 C 또는 이펙터 도메인으로 이루어지는 하이브리드 단백질이다. 특히 바람직한 키메릭 항체는 여기에 개시된 cH36 마우스-인간 키메라이다.
인간화된 본 발명의 항체는 필요에 따라 폴리클로널 또는 모노클로널일 수 있고, IgG1 또는 IgG4 이소타입을 가질 수도 있다.
여기에 개시된 인간화된 항체는 상기 참조된 방법(strategy)을 포함하여 이의 1개 또는 조합으로 제조될 수 있다. 예를 들면, S. L. Morrison, 이하 동일; Oi 외, 이하 동일; Teng 외, 이하 동일; Kozbor 외, 이하 동일; Olsson 외, 이하 동일; 및 상기 인용된 다른 참조 문헌을 참조한다.
1개의 어프로치에 있어서, 4개의 일반적인 단계가 채택되어 항체를 인간화한다. 우선, 마우스 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 cH36 마우스-인간 키메릭 항체로부터 얻어졌다. 둘째로, cH36 항체는 인간 항체 프레임워크 영역이 "베스트 피트(best fit)"를 부여하는, 즉, 대응하는 마우스 프레임워크 아미노산 서열과 가장 유사한 것을 결정함으로써 인간화되었다. 셋째로, 관련한 경쇄 및 중쇄 FR 서열은 인간화되고, 마지막으로, 분리된 핵산의 트랜스펙션 및 발현은 인간화된 경쇄 또는 중쇄(또는 인간화된 경쇄 및 중쇄, 예를 들면, 하기에 설명되는 메가 벡터를 참조한다)를 인코딩한다.
일부 예에 있어서, 인간화된 이뮤노글로빈의 소수의 프레임워크 아미노산이 선택되어, 수용체보다는 도너에서의 이들 위치에서 아미노산과 일치한다. 이 기술의 1개의 이점은 인간화된 이뮤노글로빈 쇄를 포함하는 항체의 친화성을 향상시키는 것이다. 또한, 미국 특허 일련 번호 5,985,279; 5,693,762; 및 EP-A0239400(인간화된 항체를 제조하는 일반적인 방법을 개시한다)를 참조한다.
보다 구체적으로, "베스트 피트" 어프로치는 특히 바람직한 키메릭 항-조직 인자 항체 cH36를 인간화하기 위해 적용되었다. 이 어프로치에 있어서, 도 1a 및 도 1b(SEQ ID NOS: 2 및 4)에서 도시된 뮤린 경쇄 및 중쇄 가변 서열은 뮤린 가변 도메인에 가장 일치하는 인간 항체 가변 도메인 서열에 대한 모든 이용가능 단백질 데이터베이스를 조사("비교")하는데 이용하였다. 예를 들면, Kabat 외, 이하 동일을 참조한다. 다수의 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램 예를 들면 BLAST, FASTA 및 관련 프로그램은 이 단계를 실시하는데 이용될 수 있다. 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 1, 2, 3, 및 4는 이들 부위가 항원 결합에 대해 적절한 배향에서 CDR을 유지하는 것으로 대체로 보편적으로 이해되기 때문에, 특히 이점을 갖는다. 연구로부터 기인하는 출력(output)은 조회(query) 마우스 서열, 각각의 서열에 대한 % 상동성, 및 대응하는 뮤린 서열에 대한 각각의 인간 서열의 정렬과 가장 일치하는 일반적으로 서열의 리스트였다. 상기 분석은 경쇄 및 중쇄에 독립적으로 실시되었다.
"베스트 피트" 어프로치에 따르면, 불일치 아미노산의 수가 데이터베이스에서 조회 마우스 프레임워크 서열과 대응하는 인간 프레임워크 서열 사이에서 최소화되었다. 대부분의 경우에 있어서, 적합한 인간 프레임워크 영역은 다음의 동일성 판정 기준에 기초하여 선택되었다. 경쇄 상에, 뮤린 FR1의 아미노산 서열은 대응하는 인간 FR1과 적어도 약 80% 일치하였다; 뮤린 FR2는 대응하는 인간 FR2와 적어도 약 90% 일치하였다; 뮤린 FR3는 인간 FR3와 적어도 약 90% 일치하였다; 뮤린 FR4는 대응하는 인간 FR4과 적어도 약 75% 일치하였다. 그리고 중쇄 상에, 뮤린 FR1의 아미노산 서열은 대응하는 인간 FR1과 적어도 약 80%가 일치하였다; 뮤린 FR2는 인간 FR2와 적어도 약 85% 일치하였다; 뮤린 FR3는 대응하는 인간 FR3과 적어도 약 70% 일치하였다; 및 뮤린 FR4는 대응하는 인간 FR4와 적어도 약 90% 일치하였다. 일반적으로, 보존적인(conservative) 아미노산 치환은 유사한 후보 인간 프레임워크 서열을 평가하는 경우에 선호되었다. 이것은 이러한 인자가 키메릭 cH36 항체의 인간화에 대한 뛰어난 기준점으로서 결과의 인간 프레임워크로 간주되는 경우라는 것을 발견하였다.
또한 바람직하게는, "베스트 피트" 어프로치에 따르면, 경쇄 및 중쇄 상의 모든 인간 프레임워크는 가능한 경우에 일치한 인간 항체 클론으로부터 유도되었다.
소망의 인간 프레임워크에 대한 결정이 일단 행하여지면, 재조합 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR) 기술은 경쇄 및 중쇄 모두에서 소망의 아미노산 치환을 실시하는데 사용되었다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드가 제조되어, 소망의 잔기를 포함하는 마우스 가변 도메인 프레임워크를 돌연변이시키는데 사용하였다. 다양한 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드가 채택되었다. 재조합 PCR 및 관련 방법과 관계가 있는 일반적인 개시에 대한 WO 92/07075를 참조한다.
일반적으로, 정식 PCR은 클로닝에 사용되고, 클로닝 또는 진단 엔도누클레아제 부위를 도입하는데 사용되고, 가변 영역의 말단에 위치한 아미노산 잔기를 변화시키는데 사용되었다. PCR계 돌연 변이 유발(mutagenesis)은 특히 이들 잔기가 가변 영역의 중간에 있는 경우에 다수의 아미노산 잔기를 일시에 변화시키는데 사용되었다. 부위에 따른(Site directed) 돌연 변이 유발은 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 일시에 도입하는데 사용되었다. 각각의 단계 이후에, 부분적으로 인간화된 클론은 서열이 부여되고, 일부의 이들 가변 영역은 발현 벡터로 이후에 클론화되었다. 이들 조작을 실시하는 보다 구체적인 방법은 실시예 부분에서 설명된다.
키메릭 cH36 항체를 인간화하는 상기의 "베스트 피트" 어프로치를 실시한 후에, 프레임워크 및/또는 CDR을 인코딩하는 돌연변이화된 핵산은 경쇄 또는 중쇄 일정 영역을 인코딩하는 적절한 DNA에 연결되었다. 다음에, 이러한 구조는 발현 벡터로 클론화되고, 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포로 트랜스펙팅되었다. 이들 단계는 현장에서 공지의 재조합 및 세포 배양 기술을 사용하여 달성되었다. 따라서, 인간화된 본 발명의 항체는 다음의 일반적인 방법:
(a) 발현 숙주에 적합한 레플리콘 및 Ig 중쇄 및 경쇄의 적어도 가변 도메인을 인코딩하는 DNA 서열에 실시가능하게 연결된 적절한 프로모터를 포함하는 제1 발현 벡터를 제조하는 단계, 상기 가변 도메인은 "베스트 피트" 어프로치에 따라 제조된 인간화된 프레임워크 영역 1-4 및 cH36 항체로부터의 뮤린 CDR 1-3을 포함하고,
(b) 상보적인 Ig 경쇄 또는 중쇄의 적어도 가변 도메인 각각을 인코딩하는 DNA 서열에 실시가능하게 연결된 적절한 프로모터를 포함하는 제2 복제가능한 발현 벡터를 제조하는 단계, 상기 가변 도메인은 상기의 "베스트 피트" 어프로치에 따라 제조된 상보적인 인간화된 프레임워크 영역 1-4 및 cH36 항체로부터의 뮤린 CDR 1-3을 포함하고,
(c) 제1 또는 양쪽의 제조된 벡터로 세포주를 트랜스펙팅하는 단계; 및
(d) 상기 트랜스펙팅된 세포주를 배양하여, 상기 변화된 항체를 생산하는 단계
에 의해 제조될 수 있다.
바람직하게는 단계(a) 및 단계(b) 중의 DNA 서열은 인간 항체 쇄로부터의 적합한 일정 도메인(constant domain)을 인코딩한다. 적합한 이소타입은 예를 들면, IgG1 및 IgG4를 포함한다.
또는, 적합한 인간화된 본 발명의 항체는 Ig 중쇄 및 경쇄의 적어도 가변 도메인을 인코딩하는 DNA 서열에 실시 가능하게 연결된 적절한 프로모터를 포함하는 단일 복제가능한 "메가" 벡터를 제조함으로써 제조될 수 있고, 상기 가변 도메인은 "베스트 피트" 어프로치에 따라 제조된 인간화된 프레임워크 영역 1-4 및 cH36 항체로부터의 뮤린 CDR 1-3를 포함한다. 바람직하게는, 메가 벡터는 상보적인 Ig 경쇄 또는 중쇄의 적어도 가변 도메인 각각을 인코딩하는 DNA 서열에 실시가능하게 연결된 적절한 프로모터를 추가로 포함할 것이고, 상기 가변 도메인은 상기의 "베스트 피트" 어프로치에 따라 제조된 인간화된 프레임워크 영역 1-4 및 cH36 항체로부터의 뮤린 CDR 1-3을 포함한다. 상기 메가 벡터의 사용이 단일 벡터로부터의 인간화된 항체 발현이 필요한 본 발명의 실시 형태에서 종종 적절할 것이다.
다른 방법은 본 발명의 인간화된 항체 및 프래그멘트를 제조하는데 매우 적합하다. 일실시 형태에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계:
a) 대응하는 인간 항체, 바람직하게는 마우스 항체 프레임워크 서열의 집합에 대하여 설치류 항체로부터의 경쇄 프레임워크의 아미노산 서열을 비교하는 단계,
b) 대응하는 설치류 경쇄 프레임워크에 대해 최고의 아미노산 서열 동일성(즉, 적어도 약 70% 서열 동일성)을 갖는 집합으로부터의 인간 프레임워크 서열을 선택하는 단계,
c) 설치류 경쇄 프레임워크를 인코딩하는 DNA 단편을 돌연변이시켜, 실질적으로 일치하는(즉, 단계 b)에서 선택된 인간 프레임워크 서열과 적어도 약 95% 동일) 아미노산 서열을 갖는 인간화된 경쇄 프레임워크를 인코딩하는 단계,
d) 설치류 경쇄의 각 개체 프레임워크에 대해 단계 a)에서 c)를 반복하여, 각 서열이 인간화된 경쇄 프레임워크를 인코딩하는 다수의 DNA 서열을 제조하는 단계, 여기에서, 단계 b)에서 선택된 대응하는 인간 프레임워크 서열의 각각이 바람직하게는 동일 또는 상이한 인간 항체로부터 유래하고,
e) 단계 d)에서 제조된 인간화된 프레임워크 서열을 인코딩하는 DNA 서열을, 설치류 항체의 적어도 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 제1 벡터로 조립하는 단계, 및
f) 인간화된 항체를 제조하기에 충분한 조건하에서 조립된 벡터를 숙주에 도입하는 단계
를 적어도 1개 및 바람직하게는 모두를 포함한다.
상기 방법과 함께 사용하기 위해 바람직한 인간화된 경쇄 프레임워크 서열은 여기에 개시된 그 특이적 마우스 및 인간화된 경쇄 프레임워크를 포함한다.
일실시 형태에 있어서, 인간화된 항체를 제조하는 상기의 방법은 다음의 단계:
g) 대응하는 인간 항체 프레임워크 서열의 집합에 대하여 설치류 항체로부터의 중쇄 프레임워크의 아미노산 서열을 비교하는 단계,
h) 대응하는 설치류 중쇄 프레임워크와 최고의 아미노산 서열 동일성(즉, 적어도 약 70% 서열 동일성)을 갖는 집합으로부터의 인간 프레임워크 서열을 선택하는 단계,
i) 설치류 중쇄 프레임워크를 인코딩하는 DNA 단편을 돌연변이시켜서, 실질적으로 일치하는(즉, 단계 h)에서 선택된 인간 프레임워크 서열과 적어도 약 95% 동일) 아미노산 서열을 갖는 인간화된 중쇄 프레임워크를 인코딩하는 단계, 및
j) 설치류 중쇄의 각각의 개개 프레임워크에 대해 단계 g)에서 i)를 반복하여, 각 서열이 인간화된 중쇄 프레임워크를 인코딩하는 다수의 DNA 서열을 제조하는 단계
를 적어도 1개 및 바람직하게는 모두 추가로 포함한다. 바람직하게는, 단계 h)에서 선택된 대응하는 인간 프레임워크 서열의 각각은 동일 또는 상이한 인간 항체로부터 온다. 이 방법과 함게 사용하기 위해 바람직한 중쇄 프레임워크 서열은 그 특이적 마우스 및 인간화된 중쇄 프레임워크를 포함한다.
인간화된 항체를 제조하는 보다 구체적인 방법은 단계 j)에서 제조된 인간화된 프레임워크 서열을 인코딩하는 DNA 서열을, 설치류 항체의 적어도 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 제2 벡터로 조립하는 단계, 및
인간화된 항체를 제조하기에 충분한 조건하에서 상기 조립된 제1 및 제2 벡터를 숙주에 도입하는 단계를 포함한다.
논의된 바와 같이, 때때로 "메가" 벡터일 수 있는 단일 벡터로부터 본 발명의 인간화된 항체를 발현시키는 것이 종종 바람직할 것이다. 일실시 형태에 있어서, 상기 방법은 단계 j)에서 제조된 인간화된 프레임워크 서열을 인코딩하는 DNA 서열을, 설치류 항체의 적어도 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 제1 벡터로 조립하는 단계, 및 인간화된 항체를 제조하는데 충분한 조건하에서 추가로 조립된 제1 벡터를 숙주에 도입하는 단계를 포함한다.
용어 "조립하는(assembling)" 또는 "조립된(assembled)"이란 인간화된 프레임워크를 인코딩하는 피험자 DNA 서열을 벡터에 도입하는 표준 재조합 기술의 사용을 의미한다. 이러한 조립은 하기에 한정되지 않지만, 반복 변화를 단일 프레임워크 서열에 도입하는 것, 프래그멘트를 함께(제한 엔도누클레아제(restriction endonuclease) 및 리가제의 사용을 통하여) 절단 및 접착시키는 것을 포함하는 어프로치의 1개 또는 조합으로, 또는 합성 DNA의 합성 기술에 의해 실시될 수 있다. 일반적으로 Harlow 및 Lane 이하 동일 및 Ausubel 등 이하 동일을 참조한다.
인간화된 항체를 제조하는 상기의 방법은 대체로 임의의 허용가능한 돌연 변이 유발 기술로 실시될 수 있다. 특히, 상기의 단계 c) 및 i)의 1개 또는 양쪽은 부위에 따른 돌연 변이 유발 또는 표준 PCR 방법을 채택하여, 프레임워크 중의 소망의 설치류 아미노산을 적절한 인간 아미노산으로 치환할 수 있다. 일반적으로, 변경된(인간화된) 프레임워크의 서열은 데이터베이스로부터 선택된 인간 프레임워크 서열에 대응한다.
인간화된 항체는 S. L. Morrison, 이하 동일; Oi 외, 이하 동일; Teng 외, 이하 동일; Kozbor 외, 이하 동일; Olsson 외, 이하 동일; 및 상기 인용된 다른 참조 문헌에 개시된 바와 같은 임의의 적합한 재조합 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다.
예를 들면, 적합한 본 발명의 핵산은 여기에 개시된 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 중쇄 또는 경쇄 중의 적어도 1개를 인코딩한다. 일반적으로, 핵산은 분리된 핵산(isolated nucleic acid)을 포함하는 재조합 DNA 벡터이다. DNA 벡터는 자연적으로-결합한 또는 이종의 프로모터 영역을 포함하여, 인간화된 이뮤노글로불린 코딩 서열에 실시가능하게 연결된 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열을 일반적으로 추가로 포함할 것이다. 바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 변환 또는 트랜스펙팅할 수 있는 벡터 중의 진핵 프로모터 시스템이지만, 원핵 숙주에 대한 제어 서열이 또한 사용될 수도 있다. 벡터가 적절한 숙주에 한 번 삽입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고 수준 발현에 대해 적합한 조건하에서 유지되고, 소망대로, 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 무손상 항체의 집합 및 정제, 결합 프래그멘트 또는 다른 이뮤노글로불린 형태가 따라올 수도 있다. 소망의 인간화된 항체를 결국 발현할 수 있는 본 발명의 핵산 서열은 다양한 다른 기술에 의해서 뿐만 아니라, 다양한 다른 폴리뉴클레오티드(게놈 또는 cDNA, RNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 등) 및 구성 요소(예를 들면, V, J, D, 및 C 영역)로부터 형성될 수 있다. 적절한 게놈 및 합성 서열을 결합하는 것은 현재 제조의 가장 흔한 방법이지만, cDNA 서열이 또한 이용될 수도 있다. 예를 들면, S. L. Morrison, 이하 동일; Oi 외, 이하 동일; Teng 외, 이하 동일; Kozbor 외, 이하 동일; Olsson 외, 이하 동일; 유럽 특허 공보 No. 0239400 및 Riechmann, L. 외, Nature, 332,323-327(1988); 및 여기에 인용된 참조 문헌을 참조한다.
일실시 형태에 있어서, 적합한 DNA 발현 벡터는 소망의 DNA 서열로 변환된 이들 세포를 검출하도록, 1개 이상의 선택 마커(selection marker), 예를 들면, 테트라사이클린, 암피실린, 또는 네오마이신을 포함한다(예를 들면, 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국 특허 제 4,704,362 호를 참조한다). 대장균은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는데 특히 유용한 1개의 원핵 숙주이다. 사용에 적합한 다른 미생물의 숙주는 바칠루스 서브틸루스(Bacillus subtilus) 등의 바칠리(bacilli), 및 살모넬라, 세라티아(Serratia), 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종 등의 다른 장내세균, 및 방선균(예를 들면, 서트렙토마이세스(Streptomyces) 종), 이스트(예를 들면, 삭카로마이세스(Saccharomyces) 종) 또는 균류(예를 들면, 애스퍼질러스(Aspergillus) 종) 등의 다른 미생물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 원핵 숙주에 있어서, 1개는 또한 발현 벡터를 제조할 수 있고, 이것은 숙주 세포(예를 들면, 프로모터 및 복제의 유래(origin))와 적합한 발현 제어 서열을 일반적으로 포함할 것이다. 게다가, 얼마든지 다양한 잘 알려진 프로모터가 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마아제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템과 같이 존재할 것이다. 상기 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열을 갖고서 일반적으로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하여 완성하는 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다. 이스트 등의 다른 미생물은 또한 발현에 사용될 수도 있다. 삭카로마이세스는 바람직한 숙주이고, 적합한 벡터는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 해당 효소를 포함하여, 프로모터, 및 복제의 유래와 같은 발현 제어 서열, 소망대로의 종지 서열 등을 갖는다. 식물(예를 들면, 아라비도프시스(Arabidopsis), 니코티니아(Nicotinia), 등 ) 및 식물 세포 배양은 또한 본 발명의 항체를 발현하고 제조하는데 사용될 수도 있다. 상기의 미생물계 시스템 이외에, 포유류 조직 세포 배양은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 제조하는데 사용될 수도 있다(본 명세서에 참조로서 포함된 Wimiacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y.(1987)를 참조한다).
많은 예에 있어서, 진핵 세포는 일반적으로 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, NS0 세포, BK 세포, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 등, 또는 하이브리도마의 전환된 B-세포가 일반적으로 바람직할 것이다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 복제의 유래, 프로모터, 및 인핸서(Queen 외, Immunol. Rev. 89, 46-68(1986))와 같은 발현 제어 서열, 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 부위, 및 전사적인 종지 서열(terminator sequence)과 같은 필요한 프로세싱 정보 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 이뮤노글로불린 유전자, SV40, 아덴노바이러스(Adenovirus), 우 유두종 바이러스(Bovine Papilloma Virus), 사이토메갈로(cytomegalovirus) 바이러스 등으로부터 유래하는 프로모터이다.
본 발명을 실시하는 바람직한 DNA 벡터는 다음의 동작가능하게 연결된 서열: 항생물질 저항성 마커 예를 들면, 암피실린 저항성, F1 유래(origin), 및 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC) 가변 영역을 포함한다. 그 가변 영역은 동작가능하게 서열 중에 연결되어 다음의 구성 요소: HC 가변 영역, 인간 IgG1 또는 IgG4 일정 영역, 제1 폴리 A 부위, SV40 프로모터, 네오마이신 저항성과 같은 항생물질 저항성 마커, 제2 폴리 A 부위, 사이토메겔로바이러스(cytomegelovirus)(CMV) 프로모터/인핸서, 및 적합한 리더 서열을 포함하는 적절한 HC 발현에 삽입될 수 있다.
추가적으로 바람직한 DNA 벡터는 적합한 인간 카파 일정 영역; 및 네오마이신 저항성과 같은 항생물질 저항성 마커에 동작가능하게 연결되는 설치류 카파 인트론(예를 들면, 마우스)에 동작가능하게 연결된 LC 가변 영역을 포함한다.
논의된 바와 같이, 이것은 종종 단일 핵산으로부터 인간화된 본 발명의 항체를 발현하는데 매우 유용할 것이다.
바람직한 DNA 벡터는 때때로 여기서 "메가" 벡터로 불리고, 서열 중에 동작가능하게 연결된 다음의 구성 요소: SV40 프로모터, 네오마이신과 같은 항생물질 저항성 마커, 제1 폴리 A 부위, 제1 CMV 프로모터/인핸서, LC 가변 영역, 설치류 카파 인트론(예를 들면, 마우스), 인간 카파 엑손, 제2 폴리 A 부위, 제2 CMV 프로모터/인핸서, HC 가변 서열, 및 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 일정 영역을 포함한다. 이러한 메가 벡터의 특정 예는 하기의 실시예에서 설명되는 인간화된 항-TF IgG1 항체 발현 벡터이다. 도 11을 또한 참조한다.
다음의 3개의 핵산 벡터 pSUN36(인간화된 항-TF 항체 Ig G1-HC 발현 벡터), pSUN37(인간화된 항-TF 항체 Ig G4-HC 발현 벡터), 및 pSUN38(인간화된 항-TF 항체 LC 발현 벡터)는 부다페스트 조약에 따라 미국, 버지니아 20110-2209 마나사스, 10801 유니버시티 불바르에 위치한 ATCC(American Type Culture Collection)에 예탁되었다. 벡터는 다음의 액세션 넘버(Accession Number): PTA-3727(pSUN36); PTA-3728(pSUN37); 및 PTA-3729(pSUN38)로 지정되었다.
다양한 적합한 숙주 세포는 여기에 개시된 인간화된 항체 또는 프래그멘트를 제조하는데 사용될 수 있다. 일실시 형태에 있어서, 방법은 1) 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 벡터 및 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 벡터, 또는 2) 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 경쇄와 중쇄 모두를 인코딩하는 단일 발현 벡터 중의 어느 하나로 트랜스펙팅된 숙주 세포를 제공하는 단계, 각 쇄가 발현되는 성장 조건하에서 숙주 세포를 유지하는 단계, 및 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트를 분리하는 단계를 포함한다.
예를 들면, 트랜스펙팅되어 인간화된 항체를 제조하는 세포주는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)(CHO) 세포주, BK 세포주 또는 NSO 세포주일 수 있다. 추가로 허용가능한 세포주는 인식되는 불멸화된 포유류 세포주, 바람직하게는 림파 유래의 세포주, 골수종, 하이브리도마, 트리오마(trioma) 또는 쿼드로마(quadroma) 세포주 등을 포함한다. 세포주는 또한 B-세포와 같은 정상적인 림파 세포를 포함할 수도 있고, 이것은 엡스타인 바르(Epstein-Barr) 바이러스와 같은 바이러스로 전환됨으로써 불멸화되었다. 다양한 단백질의 발현을 위해 CHO 세포를 사용하는 방법이 보고되어 있다. 예를 들면, Urlaub 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77 4216-4220(1980)) 및 WO 87/04462를 참조한다. 하기의 실시예 부분에서 설명되는 바와 같이, NSO 세포가 또한 바람직하다.
인간화된 항체를 제조하는데 사용된 세포주가 바람직하게는 포유류 세포주이지만, 세균성 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 이스트 세포와 같은 임의의 다른 적합한 세포가 대안적으로 사용될 수도 있다. 특히, 대장균 유래의 세균성 균주가 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
적절한 세포 원으로부터 일단 발현되면, 전체 항체, 이들의 이량체, 개개의 경쇄 및 중쇄, 또는 기능적인 인간화된 항체 프래그멘트와 같은 본 발명의 다른 이뮤노글로불린 형태는 표준적인 방법에 따라 회수되어 정제될 수 있다. 이러한 방법은 황산암모늄 정제(ammonium sulfate precipitation), 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기 영동 등(일반적으로, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y.(1982)를 참조한다)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본질적으로 본 발명의 순수한 인간화된 항체 및 이의 프래그멘트는 적어도 약 90 내지 95% 균질성을 특징으로 하고, 약 98 내지 99% 또는 한층 더의 균질성이 대부분의 의약 용도에 대해 일반적으로 바람직하다. 부분적으로 또는 소망의 균질성까지 일단 정제되면, 다음에 인간화된 항체는 치료적으로, 또는 분석 처치(assay procedure), 면역 형광 염색, 등(일반적으로, 면역학적 방법, Vols. I 및 II, Lefkovits 및 Pernis, eds., Academic Press, New York, N. Y.(1979 및 1981)를 참조한다)을 발현하고 실시하는데 사용될 수도 있다.
본 인간화된 항체를 정제하는 바람직한 방법은 바람직하게는 재조합 단백질 A 세파로스(Sepharose)(인간 Ig G Fc가 고 친화성을 인식하는)를 사용하는 종래의 친화성 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 단편(fraction)을 포함하는 항체는 수집되어, 바람직하게는 Q 세파로스를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피가 추가로 가해진다. 단백질 피크를 포함하는 항체는 적절한 용액 또는 버퍼, 예를 들면, PBS에 대하여, 푸울(pool)되어 석출된다.
본 발명에 따른 인간화된 항체 및 이의 프래그멘트는 표준 방법의 1개 또는 조합으로 기능에 대해 테스트될 수 있다. 바람직한 검정법은 TF 기능의 억제에 대해 테스트한다. 바람직한 방법은 때때로 여기서 "표준 프로트롬빈 시간" 검정법 또는 관련 성구로 불리는 것이다. 표준 프로트롬빈 시간(PT) 검정법은 다음의 단계:
a) TF와 인자 VIIa를 결합하여 결합 복합체를 형성하는 단계,
b) 인자 Xa(또는 인자 IXa)를 형성하는 것에 이어지는 조건하에서 결합 복합체를 인자 X(또는 인자 IX)와 접촉시키는 단계,
c) 바람직하게는 인자 Va 및 지질의 존재하에서, 인자 Xa를 프로트롬빈과 접촉시켜 트롬빈을 제조하는 단계,
중 일반적으로 적어도 1개 및 바람직하게는 모두를 포함한다.
표준 PT 검정법을 실시하는 TF의 바람직한 원(source)은 상업적으로 히노빈(Hinovin)으로서 이용가능하다. 혈액 인자에 대한 바람직한 원은 씨-트롤 응고 대조군(Ci-Trol Coagulation Control)로 불리는 인간 혈장 제제(human plasma preparation)이다.
여기에 제공된 인간화된 항체 및 이의 프래그멘트는 검정법에서 쉽게 테스트될 수 있다. 검정법의 다른 지점에서의 첨가가 일부 적용에 대해 바람직할 수도 있지만, 정제된 항체 또는 프래그멘트의 분취량(aliquot), 바람직하게는 약 200nM 내지 약 2000nM가 바람직하게는 단계 a) 전에 상기 방법에서 첨가된다. 일반적으로, 인간화된 항체 또는 프래그멘트가 씨-트롤 응고 대조군에 첨가되고 이어서 TF의 첨가가 이어진다.
전체 IgG, Fab, Fab', F(ab)2, 및 단쇄 항체(인간화된 항체의 항원 결합 가변 영역을 포함한다)를 포함하는 매우 바람직한 인간화된 항체 및 이의 프래그멘트는 표준 검정법에서 적어도 약 1nM 내지 약 20nM, 바람직하게는 약 5nM 내지 약 15nM, 보다 바람직하게는 약 10nM의 농도로 존재하는 경우, 적어도 약 5초까지 혈액 응고 시간을 증가시킬 것이다. 일반적인 대조군은 프래그멘트의 어떤 항체의 첨가 없이 실시된 표준 PT 검정법이다. 본 발명의 추가적으로 바람직한 항체 및 프래그멘트는 대조군과 비교한 경우 TF-의존 응고의 적어도 약 90% 억제도, 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 억제도를 달성한다. 표준 PT 검정법의 특정 예는 실시예에서 설명된다.
본 발명의 치료의 항 응고제 조성물의 범위가 상기 설명되었지만, 인간화된 항체 및 이의 프래그멘트를 포함하는 다른 조성물이 검토된다. 예를 들면, 이러한 항체 및 프래그멘트는 소망의 결과를 얻기 위해 단일 치료제 또는 1개 이상 다른 인간화된 항체 또는 프래그멘트와 병용으로 사용될 수도 있다. 이러한 항체 및 프래그멘트는 또한 다른 항체, 질병의 원인인 세포 상에 다른 마커에 반응적인 특히 인간 모노클로널 항체와 병용으로 사용될 수 있다.
본 항체 및 프래그멘트에 대한 중요한 용도의 넓은 범위는 상기 설명되었고, 예를 들면, 생물학적 샘플 중의 자생 TF를 검출하는데 사용, 세포 발현 TF를 검출 및 정제하는데 사용, 및 인간 환자 중의 바라지 않는 혈액 응고와 같은 병상을 방지 또는 치료하는데 사용하는 것이다. 실제예는, 인간화된 항체는 아스피린, 쿠머딘, 헤파린, 히루딘, 또는 히루로그를 포함하는 다른 항-응고제와 함께 주어진 개개로 투여된 조성물로서 사용될 수 있다. 또한, 항 혈소판(예를 들면, 레오프로(ReoPro), 인테그릴린(Integrilin), 아그레스타트(Aggrestat), 플라빅스(Plavix), 및/또는 티클리드(Ticlid)) 및/또는 전혈용해제(예를 들면, 조직 플라즈미노겐 액티베이터, 스트레포키나아제 및 우로키나아제)와의 공동투여가 고려된다.
여기서 설명된 치료의 항 응고제 조성물이 1개 이상 인간화된 항체 또는 프래그멘트를 포함하는 실시 형태에 있어서, 그 조성물은 항체의 용액 또는 허용가능 담체, 바람직하게는 수용성 담체 중에 용해된 이의 칵테일을 포함할 수도 있다. 다양한 수용성 담체는 물, 버퍼화된 물, 0.4%의 염류(saline), 0.3%의 글리신 등과 같은 것이 참조되었다. 이들 용액에서는 바람직하게는 미립상 물질이 멸균되고, 일반적으로는 존재하지 않는다. 이들 조성물은 종래의 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 적절한 생리학적 조건의 필요에 따라 pH 조절제 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들면 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 유산나트륨, 등과 같은 약리학적으로 허용가능한 보조 물질을 포함할 수도 있다. 이들 제제 중의 항체의 농도는 넓게, 예를 들면 약 0.5% 미만으로부터, 또는 보통 적어도 약 1중량% 내지 약 15중량% 또는 20중량%의 범위에서 변화할 수 있고, 선택된 투여의 특정 모드에 따라 유량, 점도, 등에 주로 기초하여 선택될 것이다. 일반적으로, Remington's Pharmaceutical Sciences, 이하 동일을 참조한다.
필요하다면, 여기에 설명된 치료의 항 응고제 조성물은 저장을 위해 동결 건조되어, 사용하기 전에 적합한 담체에서 회복될 수 있다. 이 기술은 종래의 면역 글로불린에 효과적이라는 것이 보여졌다. 임의의 적합한 동결건조 및 회복 기술이 채택될 수 있다. 당업자들은 동결건조 및 회복이 항체 활성 손실(예를 들면, 종래의 면역 글로불린에서는, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 갖기 쉽다)의 정도를 변화시키는 것이 될 수 있고, 사용 수준이 보상을 위해 조절되어야 할 수도 있다는 것을 알 수 있다.
일부 예방적 적용에 있어서, 질병에 대한 환자의 저항성을 향상시키기 위해 아직 검출가능한 질병 상태에 있지 않은 환자에 치료의 항 응고제 조성물을 투여하는 것이 유용할 것이다. 이러한 양은 "예방적으로 유효 투여량"이라고 규정된다. 이 사용에 있어서, 정확한 양은 다시 환자의 건강 상태 및 일반적인 면역 수준에 의존하였지만, 일반적으로 투여량당 0.1 내지 25mg, 특히 환자당 0.5 내지 2.5mg의 범위이다. 바람직한 예방약 사용은 계획적인 침습성 의료 처치(invasive medical procedure)가 따르는 바라지 않는 혈액 응고를 예방하기 위해서이다.
논의된 바와 같이, 본 발명은 또한 피험자 항체(subject antibody) 또는 이의 프래그멘트를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 일실시 형태에 있어서, 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트는 TF 항원의 검출에 대해 또는 중에서 사용을 위해 제공될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 1개 이상 인간화된 항체, 이의 프래그멘트, 또는 단쇄 항체는 용기 중에 보통 동결 건조된 형태로 제공될 수도 있다. 상술의 표식(label) 또는 독소와 연결되거나 연결되지 않을 수도 있는 이러한 항체, 프래그멘트, 또는 단쇄 항체는 키트 중에 트리스(Tris), 인산염, 탄산염, 등의 버퍼, 안정제, 살충제, 불활성 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 등과 함께 포함된다. 일반적으로, 이들 재료는 활성 항체의 양에 대해 약 5중량% 미만으로 존재하고, 보통 항체 농도에 대하여 적어도 약 0.001wt%의 총량으로 존재할 것이다. 종종, 유효 성분을 희석하기 위해 전체 조성물의 약 1 내 99wt%의 범위로 존재할 수도 있는 불활성 증량제 또는 부형제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 키메릭 항체와 결합할 수 있는 제2 항체가 검정법에서 채택되고, 이것은 보통 별도의 유리병에 존재할 것이다. 제2 항체는 일반적으로 표식에 결합되고, 상술의 항체 제제와 유사한 방식으로 제형화될 것이다. 키트는 일반적으로 또한 한 세트의 사용 설명서를 포함할 것이다.
논의된 바와 같이, 본 발명은 포유 동물 바람직하게는 인간 환자와 같은 영장류에서의 혈액 응고를 억제하는 다양한 방법을 또한 제공한다.
예를 들면, 일실시 형태에 있어서, 상기 방법은 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 여기에 제공된 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 적어도 1개, 바람직하게는 1개, 2개 또는 3개의 치료적으로 유효한 양을 포유 동물에 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제된다. 대부분의 실시 형태에 있어서, 상기 방법은 항체와 TF 사이에 특이적 복합체를 형성하여 혈액 응고를 억제하는 것을 추가로 포함한다.
또한, 여기에 개시된 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 치료적으로 유효한 양을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법이 제공된다. 일반적인 항체 및 프래그멘트는 인간 조직 인자(TF)와 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하여, TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제된다. 대부분의 실시 형태에 있어서, 상기 방법은 항체와 TF 사이에 특이적 복합체를 형성하여 혈액 응고를 억제하는 것을 추가로 포함한다.
보다 구체적인 예에 있어서, 본 발명은 여기에 개시된 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 치료적으로 유효한 양을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 항체는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하고, TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제된다. 바람직하게는, 인간화된 항체 또는 프래그멘트는, 중쇄 상에, 다음의 구성 요소:
a) 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 CDR(CDR1),
b) 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 CDR(CDR2),
c) 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 CDR(CDR3),
d) "FR1 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
e) "FR2 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
f) "FR3 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
g) "FR4 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제4 프레임워크(FR4)
의 적어도 1개 및 바람직하게는 모두를 포함한다.
보다 구체적인 발명 실시 형태에 있어서, 인간화된 항체는 경쇄 상에 다음의 구성 요소:
h) 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 CDR(CDR1),
i) 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 CDR(CDR2),
j) 도 12d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 CDR(CDR3),
k) "FR1 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
l) "FR2 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
m) "FR3 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
n) "FR4 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제4 프레임워크(FR4),
o) 도 14a(SEQ ID NO.－) 또는 도 15a(SEQ ID NO.－)에 도시된 아미노산 서열과 적어도 95% 일치하는 경쇄 일정 영역, 및
p) 도 14b(SEQ ID NO.－) 또는 도 15b(SEQ ID NO.－)에 도시된 아미노산 서열과 적어도 95% 일치하는 중쇄 일정 영역
의 적어도 1개 및 바람직하게는 모두를 포함한다.
상기의 방법의 보다 구체적인 실시 형태에 있어서, 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트는 중쇄 상에, 다음의 구성 요소:
a) 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 CDR(CDR1),
b) 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 CDR(CDR2),
c) 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 CDR(CDR3),
d) "FR1 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
e) "FR2 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
f) "FR3 HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
g) "FR HC-08"로서 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제4 프레임워크(FR4), 및
경쇄 상에:
h) 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 CDR(CDR1),
i) 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 CDR(CDR2),
j) 도 12d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 CDR(CDR3),
k) "FR1 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
l) "FR2 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
m) "FR3 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
n) "FR4 LC-09"로서 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제4 프레임워크(FR4),
o) 도 14a(SEQ ID NO.－) 또는 도 15a(SEQ ID NO.－)에 도시된 아미노산 서열과 일치하는 경쇄 일정 영역, 및
p) 도 14b(SEQ ID NO.－) 또는 도 15b(SEQ ID NO.－)에 도시된 아미노산 서열과 일치하는 중쇄 일정 영역
의 적어도 1개 및 바람직하게는 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플 중의 조직 인자(TF)를 검출하는 다양한 방법을 제공한다. 일실시 형태에 있어서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서의 TF를 나타내는 것으로서 복합체를 형성 및 복합체를 검출하는 것에 이어지는 조건하에서 생물학적 샘플을 여기에 개시된 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트와 접촉시키는 것을 포함한다.
언급된 모든 문헌은 참조로서 그대로 본 명세서에 완전히 포함된다.
다음의 한정되지 않은 실시예는 본 발명을 설명한다. 다음의 실시예 및 그 밖에 있어서, 항체 H36 및 H36.D2가 참조된다. 그 항체는 H36.D2.B7과 동일한 항체이지만, H36은 모클론(mother clone)으로부터 유래되고, H36.D2는 1차 클론(primary clone)으로부터 얻고, 반면에 H36.D2.B7은 2차 클론으로부터 얻는다. TF를 억제하는 능력 또는 다른 물성에 대하여 이들 3개의 클론 사이에 어떠한 차이도 발견되지 않았다. 일반적인 사용에 있어서, H36는 이들 클론 또는 항체를 생산하는 관련된 세포주 중의 어느 것에 의해 생산된 항-TF 항체를 지시하는데 종종 사용된다.
실시예 1 - 항-rhTF 모노클로널 항체의 제조 및 클로닝
rhTF에 대한 모노클로널 항체는 하기와 같이 제조된다.
A. 면역화 및 부스트(Boost)
5마리의 암컷 BALB/c 마우스를 각각 지질화되고, 정제된 rhTF 10㎍으로 면역화시켰다. 마우스를 복강내적으로 헌터 티터맥스(Hunter's Titermax) 보조제를 사용하여 처음에 민감하게 하였다. 3개의 최종 부스트를 0.85% NaCl로 투여하였다. 부스트는 초기 민간화 후에 2, 5.5, 및 6.5개월이었다. 최초의 부스트를 피하에 부여하는 이외는 모든 부스트는 복강내적으로 부여하였다. 최종 부스트는 융합 전 3일에 부여하고, 20㎍를 투여하였다.
B. 마우스 골수종 세포와 마우스 지라 림프구의 융합
1마리의 rhTF 면역화된 BALB/c 마우스의 지라로부터의 림프구를 PEG 1500을 사용하여 X63-Ag8.653 마우스 골수종 세포와 융합하였다. PEG에 노출시킨 후, 세포를 37℃의 열 불활성화된 우태 혈청(fetal bovine serum) 중에서 1시간 동안 배양시켰다. 다음에, 융합된 세포를 RPMI 1640 중에서 재현탁시키고, 10%의 C02로 37℃에서 밤새 배양하였다. RPMI 1640를 사용하여 다음날에 세포를 평판 배양하고, 매크로파지 배양 상청액(매크로파지 배양 상청액)으로 보충하였다.
C. ELISA 개발(development)
ELISA 검정법을 위한 평판 배양은 탄산염계 버퍼 중에서 100㎕의 재조합 조직 인자(0.25㎍/㎕)로 코팅하였다. 모든 단계를 실온에서 실시하였다. 평판 배양을 BSA로 차단하여, 세정하고, 다음에 테스트 샘플과 대조군(control)을 첨가하였다. 항원/항체 결합을 염소 항-마우스 HRP 결합체(conjugate)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)로 플레이트를 배양 및 다음에 ABTS 페록성시다아제(peroxidase) 기질 시스템(Kirkegaard 및 Perry Laboratories)을 사용함으로써, 검출하였다. 405㎚의 파장에서 자동 플레이트 리더로 흡광도를 읽어낸다.
D. rhTF 하이브리도마 세포주의 안정화
융합 후 2주 후에, 특이적 rhTF ELISA에 의한 하이브리도마 콜로니(colony)의 스크리닝을 개시하였다. 새로운 콜로니에 대한 스크리닝을 3주간 계속하였다. 연속적인 항체 생산을 위해 양성 클론(positive clone)을 5번째 안정한 클론이 정착하기까지 1 내지 2주마다 테스트하였다.
E. 1차 및 2차 클로닝
1차 클론을 얻기 위해, 한계 희석 클로닝을 양성의 안정한 하이브리도마의 각각에 실시하였다. 세포를 단기간의 배양 중에서 해동하여 성장시키고, 다음에 10세포/웰로부터 0.1세포/웰까지 희석하였다. 1차 클론을 항-rhTF ELISA에 의해 테스트하고, 5개 내지 6개의 양성 클론을 확대하여 냉동하였다.
항-rhTF 항체, H36.D2.B7의 2차성 클론을 제조된 1차 클론 H36.D2으로부터 얻어, 상술한 바와 같은 액체 질소 중에 저장하였다. 1차 클론의 4개의 다른 희석용액, 5세포/웰, 2세포/웰, 1세포/웰, 0.5세포/웰을 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중에서 제조하여 2차 클로닝을 개시하였다. 세포를 다음의 첨가제: 20% 우태 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100유닛/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신, 1% GMS-S, 0.075% NaHCO3을 포함하는 IMDM 조직 배양지에서 희석하였다. 항-rhTF 항체를 분비하는 클론을 결정하기 위해, 0.2세포/웰 마이크로타이터 플레이트의 5개의 개개의 웰로부터의 상청액을 2주의 성장 후에 회수하여, 상술한 바와 같은 ELISA 검정법에 의해 항-rhTF 항체의 존재에 대해 테스트하였다. 모든 5개의 클론은 ELISA 검정법에서 긍정적인 결과를 보이고, H36.D2.B7은 최고의 항체 생산자였다. 모든 5개의 클론을 적응시켜서 다음의 첨가물: 10% FBS, 2mM L-글루타민, 100유닛/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신, 1% GMS-S, 0.075% NAHCO3, 및 0.013mg/㎖의 옥살아세트산을 포함하는 RPMI 배지(media) 중에서 확대하였다. H36.D2.B7를 세포 배양의 상청액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, FX 활성화 검정법에서 TF:VIIa를 억제하는 이의 능력에 대해 테스트하였다. 상기 결과에 의해 H36.D2.B7는 H36.D2 항체와 동일한 억제를 갖는다는 것을 알 수 있다. 모든 세포를 액체 질소 중에 보관하였다.
F. H36.D2.B7로부터 전체 RNA의 분리
269㎍의 전체 RNA를 2.7×105 H36.D2.B7 하이브리도마 세포로부터 분리하였다. 전체 RNA의 분리를 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 RNeasy Midi Kits 프로토콜 중에서 상술한 바와 같이 실시하였다. 상기 RNA 샘플을 필요시까지 -20℃에서 물 중에 저장하였다.
G. cDNA 합성 및 H36.D2.B7 유전자의 가변 영역의 클로닝
CDNA의 제1 가닥을 얻기 위해, 상기와 같이 분리된 전체 RNA 5㎍, 중쇄(HC)에 대한 백 프라이머 JS300(모든 프라이머는 하기와 동일하다) 및 경쇄(LC)에 대한 OKA 57, RNase 억제제, dNTP's, DTT, 및 슈퍼스크립트(superscript) II 역전사 효소(reverse transcriptase)을 포함하는 반응 혼합물을 제조하여, 1시간, 42℃에서 배양하였다. 다음에 반응물 관을 15분간, 65℃에서 배양하여 전사를 정지하였다. 냉각한 후에, RNase H의 5개의 유닛을 첨가하여, 반응물을 20분간, 37℃에서 배양시켰다. cDNA 샘플을 필요시까지 -70℃에서 저장하였다.
PCR(폴리메라아제 연쇄 반응)을 개별적으로 상기(도 1a 및 도 1b에 개시된 이들 HC 및 LC 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열)와 같이 제조된 cDNA부터의 항-rhTF, H36.D2.B7의 HC 및 LC 모두의 클론 가변 영역들에 실시하였다. PCR의 3개의 라운드(round)를 실시하였다. 라운드 1: HC에 대해 프론트 프라이머 JS002 및 백 프라이머 JS300를 사용하여 96℃, 53℃ 및 72℃에서 35사이클 동안 PCR을 실시하였다. LC에 대해, 프론트 프라이머 JS009 및 백 프라이머 OKA 57를 사용하여, 96℃, 63℃ 및 72℃에서 35사이클 동안 PCR을 실시하였다. 라운드 2: HC 프론트 프라이머에 대해 pMC-18 및 LC 프론트 프라이머에 대해 pMC-15를 사용한 이외는 HC 및 LC 모두의 PCR을 라운드 1과 동일하게 실시하였다. 라운드 3: HC에 대해 H36HCF 및 H36HCR 프라이머를 사용하여 96℃, 60-65℃ 및 72℃에서 30사이클 동안 PCR을 실시하였다. LC에 대해 H36LCF 및 H36LCR 프라이머를 사용하여 96℃, 58℃ 및 72℃에서 30사이클 동안 PCR을 실시하였다.
다음의 프라이머를 HC 및 LC의 H36.D2.B7 가변 영역을 클로닝하는데 사용하였다.
(서열번호: 26)
(상기 서열번호 17 내지 26에서, K는 G 또는 T이고; M은 A 또는 C이고; R은 A 또는 G이고; S는 C 또는 G이고; V는 A, C 또는 G이고; W는 A 또는 T이고; Y는 C 또는 T이다).
실시예 2 - 본 발명의 항체의 결합 활성
실시예 1에서 제조된 바와 같은 본 발명의 항체를 이용하였다. rhTF 분자를 대장균에서 발현시키고, 표준 방법에 따른 면역친화성 크로마토그래피로써 정제하였다(참조: Harlow 및 Lane, 이하 동일, Ausubel 외, 이하 동일). 항체 결합(Ka)(antibody association) 및 항체 분리(Kd)(antibody dissociation) 상수를 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명(즉, BIACore) 검정법으로써 결정하였다(참고예: Harlow 및 Lane, 이하 동일; Ausubel 외, 이하 동일; Altschuh 외, Biochem., 31:6298 (1992); 및 [Pharmacia Biosensor]에서 개시된 BIAcore법). BIACore 검정법에서, rhTF를 제조업자의 지시에 따라 바이오센서 칩에 고정화하였다. 각 항체에 대한 상수를 4개의 항체 농도에서 결정하였다(0.125nM, 0.25nM, 0.5nM, 및 1nM).
단백질 농도를 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하고, 시판용 염료제(Bio-Rad)를 사용하여, 표준 검정법에 따라 결정하였다(M.M. Bradford, Anal. Biochem., 72: 248 (1976)).
도 2는 각 항-TF 항체에 대한 결합 및 분리 상수를 보여준다. 항체 H36는 시험된 항-TF 항체들 중 임의의 것에서 최고 결합 속도(Ka = 3.1×1010 M-l) 및 최저 결합 속도(Kd = 3.2×10-11 M)를 나타냈다.
실시예 3 - FXa-특이적 기질 검정법
일반적으로, 여기에 기술된 실험들은 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 중, 70/30w/w 비의 포스파티딜콜린(0.07mg/㎖) 및 포스파티딜세린(0.03mg/㎖)으로 30분간 37℃에서 지질화된 rhTF를 사용하여 실시되었다. 5nM의 지질화된 rhTF 및 5nM의 FVIIa을 30분간 37℃에서 배양(incubation)함으로써, 예비 형성된 TF:FVIIa 복합체의 원액을 제조하였다. TF:FVIIa 복합체를 분취하고(aliquoted), 필요시까지 -70℃에서 저장하였다. 정제된 인간 인자 VII, VIIa 및 FX를 [Enyzme Research Laboratories, Inc.]로부터 얻었다. 모든 FXa 및 FVIIa 검정법에서, 하기 버퍼를 사용하였다: 25mM Hepes-NaOH, 5mM CaCl2,150mM NaCl, 0.1% BSA, pH 7.5.
FX의 FXa로의 TF:VIIa-매개 활성화를 억제하는 용량(capacity)을 대해, 모노클론 항체를 스크리닝하였다. FX 활성화를 2개의 연속 단계에서 결정하였다. 제1 단계(FX 활성화)에서, Ca+2의 존재하에서, FX의 FXa로의 전환을 검정하였다. 제2 단계(FXa 활성 검정)에서, FX 활성을 EDTA로써 급냉(quench)하고, FXa의 형성을, FXa-특이적 발색 기질(S-2222)을 사용하여 결정하였다. S-2222 및 S-2288(하기 참조) 색원체를 Chromogenix(Pharmacia Hepar Inc. 배급)로부터 얻었다. 반응물을 항-rhTF 항체와 함께 프리인큐베이트하거나, 버퍼 대조군인 0.08nM TF:VIIa와 함께 배양함으로써, FX 활성화를 1.5㎖ 마이크로퓨즈 관(microfuge tubes)에서 실시하였다. 반응물을 계속해서 30분간 37℃에서 배양한 후, 30nM FX를 첨가하고, 이어서 10분간 37℃에서 부가적으로 배양하였다. FXa 활성을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 결정하였다. 20㎕의 샘플을 제1 단계에서 인취하고, 각 웰에서 동적의 EDTA(500mM)와 혼합한 후, 0.144㎖의 버퍼 및 0.016㎖의 5mM S-2222 기질을 첨가하였다. 반응물을 부가적으로 15 내지 30분간 37℃에서 배양하였다. 이어서, 반응물을 0.05㎖의 50% 아세트산으로 급냉하고, 그 후, 각 반응에 대해 405㎚에서의 흡광도를 기록하였다. TF:FVIIa 활성의 억제를, 실험 샘플(항체 포함) 및 대조군 샘플(항체 비포함)에서의 OD405㎚ 값으로부터 계산하였다. 일부 실험에서, 항-hTF 항체, TF:FVIIa 및 FX를 각기 동시에 첨가하여, 결합 경쟁력을 검침하였다. 도 3은 H36.D2 MAb(굵은 체)는 시험한 다른 항-rhTF Mab보다 상당히 더 큰 정도(95%)로, FX에 대한 TF:FVIIa 활성을 억제하였음을 보여준다.
실시예 4 - FVIIa-특이적 기질 검정법
모노클론 항체를 FVIIa 특이적 검정법으로 더 스크리닝하였다. 이 검정법에서, 5nM 지질화된 rhTF를 먼저 37℃에서 30분간 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 버퍼(대조군) 또는 50nM 항체(실험군)와 함께 배양한 후, 5nM 정제된 인간 FVIIa(VT = 0.192㎖)와 혼합하고, 이어서, 37℃에서 30분간 배양하였다. 이어서, 8㎕의, FVIIa 특이적 기질 S-2288의 20mM 원액을 각 웰에 첨가하였다(최종 농도: 0.8mM). 계속해서, 반응물을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.06㎖의 50% 아세트산으로 급냉한 후, 405㎚에서의 흡광도를 측정하였다. TF:FVIIa 활성 억제도(%)를, 실험군 샘플 및 대조군 샘플의 OD405㎚ 값으로부터 계산하였다.
도 4는 H36 항체가, (FVIIa 첨가 전) TF와 프리인큐베이트되거나, 또는 (항체를 첨가하기 전) FVIIa와 함께 프리인큐베이트된 TF에 첨가할 때, S-2288 기질에 대한 TF:FVIIa 활성을 상당히 막지 않음을 보여준다. 이는, H36가 TF 및 FVIIa 간의 상호작용(결합)을 방해하지 않음과, H36가 또한 펩티드 기질에 대한 TF:FVIIa 활성을 방해하지 않음을 가리킨다.
실시예 5 - 프로트롬빈 시간(PT) 검정법
석회화된 혈장은 트롬플라스틴(TF)를 첨가한 후, 수초 내에 응고가 되며, 이는 "프로트롬빈 시간"(PT)이라고 하는 현상이다. 연장된 PT는 전형적으로 항-응고 활성의 유용한 척도이다(참고 예: Gilman 외, 이하 동일).
시판용 인간 혈장(Ci-Trol Control, Level I(Baxter Diagnostics Inc. 제공))을 사용하여 표준 방법에 따라, PT에 영향을 주는 용량에 대해 H36.D2 항체를 조사하였다. 응고 반응은 Ca+2의 존재하에 지질화된 rhTF의 첨가로써 개시된다. 응고 시간은 자동화된 응고 타이머(MLA Electra 800)로써 모니터한다. PT 검정법을, 0.2㎖의 지질화된 rhTF(버퍼 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA, 14.6mM CaCl2, 0.07mg/㎖의 포스파티딜콜린 및 0.03mg/㎖의 포스파티딜세린 함유)를 플라스틱 2-웰 큐벳(cuvette)에 주입함으로써 개시하였다. 각 큐벳은, 0.01㎖의 버퍼(대조군 샘플) 또는 항체(실험군 샘플)와 함께 1 내지 2분간 배양된 0.1㎖의 혈장을 함유하였다. H36.D2 항체에 의한 TF-매개 응고의 억제를, TF 표준 곡선(여기에서, log[TF]를 log 응혈 시간에 대해 플롯팅하였다)을 사용하여 계산하였다.
도 5는 H36.D2 항체는 실질적으로 인간 혈장 내 TF-개시 응고를 상당히 억제함을 보여준다. H36.D2 항체는 PT 시간을 상당히 증가시켰는데, 이는 항체가 TF-개시 응고의 효과적 억제제(대략 99% 억제까지)임을 보여주는 것이다.
실시예 6 - TF:FVIIa 복합체와의 결합을 위한 FX 및 H36.D2 항체 경쟁
TF:FVIIa, FX 및 H36.D2 항체 간에 경쟁력 실험을 실시하였다. 도 6a는 미리 형성된 TF:FVIIa 복합체(0.08nM)를 각기 0.02nM, 0.04nM, 0.08nM 및 0.16nM의 H36.D2 모노클론 항체를 포함하는 버퍼에서 37℃에서 30분간 프리인큐베이트한 실험의 결과를 설명한다. 이어서, FX(30nM)를 TF:FVIIa 및 H36.D2 항체 혼합물을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 부가적으로 10분간 배양하였다. FX 활성화를 전술한 바와 같이 EDTA로 급냉하였다. 그로써 생성된 FXa를 상기 실시예 3에서 기재된 FXa-특이적 검정법으로 결정하였다.
도 6b는 바로 앞에서 전술한 실험의 결과를 보여주나, 단 H36.D2 항체, 미리 형성된 TF:FVIIa 및 FX를 동시에 첨가하여, FX 활성화 검정법을 개시하였다.
도 6a 및 도 6b에 설명된 데이터는, H36.D2 항체 및 FX가 미리 형성된 TF:FVIIa 복합체에 대한 결합을 위해 경쟁함을 보여준다.
실시예 7 - 세포 배양에서의 TF 활성 억제
J-82는 세포 표면 단백질로서 자생 인간 TF를 충분히 발현하는 인간 방광암 세포주(ATCC로부터 구입가능)이다. H36.D2 항체가 FX가 세포 표면 상에 표시된 자생 TF에 결합하는 것을 방지할 수 있을지 확인하기 위해, FVII의 존재하에 마이크로타이터 플레이트에서 J-82 FX 활성화 검정법을 실시하였다(참고: D. S. Fair 외, J. Biol. Chem., 262: 11692(1987)). 각 웰에 2×105개 세포를 첨가하고, 50ng FVII, 버퍼(대조군 샘플) 또는 항-TF 항체(실험군 샘플) 중에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 후에, 각 웰을 버퍼로 서서히 세척하고, 0.3㎖의 FX(0.05mg/㎖)을 실온에서 30분간 각 웰에 첨가하였다. 일부의 경우, 항체를 자생 TF에 대한 결합 경쟁력을 검출하기 위해, FX와 동시에 첨가하였다. 그 후, 0.05㎖의 분취량을 제거하고, 0.025㎖의 100mM EDTA를 함유하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 새로운 웰에 첨가하였다. 상기 실시예 3에 기재된 바와 같은 FXa-특이적 검정법에 의해, FXa 활성을 결정하였다. 항체의 부재(대조군 샘플) 및 존재(실험군 샘플) 하에서, J-82 세포의 표면 상의 TF 활성의 억제를 OD405㎚로부터 계산하였다.
도 7은 H36.D2 항체가 J-82 세포막 상에 발현된 자생 TF에 결합하여, FX의 TF-매개 활성화를 억제함을 보여준다. 이 결과는, 항체가 세포 표면 상에 표시된 자생 TF에 결합하기 위해 FX와 경쟁함을 가리킨다. 하기 실시예 8의 데이터에 있어, 그 결과는 또한 H36.D2 항체가 세포막에 있는 자생 TF 상의 입체적 에피토프에 결합할 수 있음을 가리킨다.
실시예 8 - 자생 rhTF에 대한 H36.D2 항체의 특이적 결합
자생 및 비자생 rhTF에 대한 H36.D2의 결합력 평가를 단순화 도트 블롯(dot blot) 검정법으로 실시하였다. 구체적으로, rhTF를 각각의 하기 3 가지 버퍼에서 30㎍/㎖로 희석하였다: 10mM Tris-HCl, pH 8.0; 10mM Tris-HCl, pH 8.0 및 8M 우레아; 및 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 8M 우레아 및 5mM 디티오트레이톨. Tris 버퍼에서의 배양은 rhTF를 자생 형태로 유지시키는 반면, 8M 우레아 및 5nM 디티오트레이톨로의 처리는 비자생(변성) rhTF를 생성시킨다. 각 샘플을 실온에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 밀리포어 임모빌론(Millipore Immobilon)(7×7㎝ 단면) 막을 메탄올로 예비 습윤시킨 후, 20% 메탄올 함유의 25mM Tris, pH 10.4로 습윤시켰다. 막을 공기 건조시킨 후, 약 0.5㎕, l㎕ 및 2㎕의 각 샘플(30㎕/㎖)을 막에 도포하고 공기 건조시켰다. 5%(w/v) 탈지유 및 5%(v/v) NP-40 함유의 PBS로 막을 막은 후, 막을 H36.D2 항체로 검출한 후, 염소 항-마우스 IgG 퍼옥시다제 복합체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)로 배양하였다. 제조업체의 지시에 따라(Amersham) ECL 웨스턴 블롯팅 시약(Western Blotting reagent)과 함께 배양한 후, 막을 플라스틱 필름(Saran Wrap)으로 싸고, X-선 필름에 각종 시간 동안 노출시켰다.
도 8a는 H36.D2 모노클론 항체가 Tris 버퍼 또는, 8M 우레아 포함의 Tris 버퍼(레인 1 및 레인 2 )의 존재하에서의 자생 TF 상의 입체적 에피토프에 결합함을 보여준다. 방사능사진을 40초간 노출시켰다. 그러나, 자생 TF를 8M 우레아 및 5mM DTT로 변성시켰을 때, H36.D2 결합력은 상당히 감소되거나 제거되었다(레인 3). 도 8b는 H36.D2 항체의 비자생(즉, 변성) rhTF에 대한 잔류 결합을 나타내는 과노출 방사능사진을 보여준다. 과노출은 약 120초간 이루어진다. 8M 우레아만의 단독 처리는, 대개 TF에서의 2개의 디술피드 결합이 감소되지 않기 때문에, 자생 rhTF의 부분적 변성만을 초래하였다. 또한, 부분적으로 변성된 TF는 우레아가 제거될 때, 후에 블로팅 공정 중 자생 입체형태로 다시 접힐 가능성이 있다. 이 결과는 또한 입체적 에피토프에 선택적으로 결합하지 않고, 변성 TF에 결합하는 미리 보고된 항체와, 변성 TF에 결합하지 않는 본 발명의 바람직한 항체를 분명히 구분시킨다(참고: 미국 특허 제 5,437,864 호; 이 특허 문헌에서, 도 18의 웨스턴 블롯팅 분석법(Western Blot analysis)은 SDS에 의해 변성된 TF에 대한 결합을 보여준다).
실시예 9 - 항-조직 인자 항체의 인간화
전술한 실시예들은 H36.D2라고 불리는(간혹 상기 언급된 바와 같이 H36라고도 불리는) 특별한 뮤린 항체를 제조하고 사용하는 방법을 기재하고 있다. 본 실시예는 그 항체의 인간화된 버전을 제조하고 사용하는 방법을 보여준다. 인간화 H36 항체는 인간 항-마우스 항체(HAMA) 면역학적 반응에 대한 잠재능을 최소화시키는 것을 도와주는 것을 비롯한 다양한 용도를 가진다. 이들 반응, 및 기타 바람직하지 않은 반응들은 인간 치료 용도에서 H36 항체의 사용에 있어 문제를 제기한다.
A. 키메릭 항조직 인자 항체(cH36)의 제조
전술한 H36 항체는 IgG2a 뮤린 항체이다. H36를 임상적 개발을 위해, 먼저 마우스-인간 키메릭 항체로 전환시켰다. 이를 실시하기 위해, H36를 위한 중쇄 및 경쇄 유전자를 클로닝하였다(참고: 미국 특허 제 5,986,065 호). 중쇄 가변 영역을 인간 IgG4 일정(Fc) 도메인(domain)에 융합시키고, 경쇄 가변 영역을 인간 κ경쇄 일정 도메인에 융합시켰다. 얻어진 IgG4κ키메릭 항체를 Sunol-cH36으로 명하였다. 만성 질병을 앓는 환자에 있어 H36 또는 cH36의 다중 사용을 위해, 임의의 인간 항-마우스 항체 면역학적 반응을 감소시키거나 제거하게 되는 완전 인간화된 cH36가 바람직하다. cH36의 인간화를 이하에 설명한다.
B. cH36 항체의 인간화
복합 항조직 인자 항체 cH36의 인간화를 "베스트-피트" 방법을 이용함으로써 달성하였다. 이 방법은 아미노산 서열이 알려진 수많은 인간 IgGs가 공개 데이터베이스에 이용가능하다는 사실을 충분히 이용한다. cH36에서 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크를, Kabat 데이터베이스에서 대응하는 인간 구조와 비교한다(참고: http://immuno.bme.nwu.edu). 하기 기준을 사용하여, 인간화를 위한 원하는 인간 IgG 프레임워크를 선택한다: (1) 잘못 짝지어진 아미노산의 수를 가능한 한 적게 하였다. (2) "버니어(vernier)" 영역 내부의 아미노산(이 도메인 내의 아미노산은 CDR 구조를 조정하고, 피트를 항원에 미세 조정할 수 있다; 참고: Foote, J. 및 Winter, G., J. Mol. Bio. 224, (2) 487-499 [1992])이 변화되지 않도록 하였다. (3) 보존적 아미노산 치환이, 유사한 후보(candidate)를 평가할 때 유리하였다. 이 비교를 위해 사용된 매칭 프로그램은 Kabat의 홈페이지 immune.bme.nwu.edu에서 찾아볼 수 있다(Johnson G, Wu T. "Kabat database and its application: Future directions. "Nucleic Acids Res. (2001) 29: 205-206). 그 프로그램은 Kabat의 데이터베이스에서 마우스 서열과 인간 서열 사이의 동종성의 도메인을 찾고 배열한다. 이 독특한 베스트-피트 방법을 이용함으로써, 표적 IgG의 인간화 LC 또는 HC 가변 영역이, 하나의 인간 IgG 분자만큼 적은 수의 분자로부터 유도되거나 4개의 상이한 인간 IgG 분자만큼 많은 수의 분자로 유도된 4개의 FR을 모두 가질 수 있음이 예기된다.
(i). 인간 IgG κ경쇄 가변 영역 프래임워크의 선택
cH36 LC에서 각 프레임워크의 아미노산 서열을, Kabat 데이터베이스에서 인간 IgG κ경쇄 가변 영역에서의 대응하는 FR의 아미노산 서열과 비교하였다. 베스트-피트 FR을, 상기 기술된 3개의 기준에 기초하여 선택하였다.
cH36 LC FR1의 인간화를 위해, Kabat 데이터베이스 ID 제 005191 호에 있어서 인간 IgG κ경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 선택하였다. cH36 LC FR2의 인간화를 위해, Kabat 데이터베이스 ID 제 019308 호에 있어서 인간 IgG κ경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 선택하였다. Kabat 데이터베이스 ID 제 005191 호에서의 인간 IgG κ경쇄 가변 영역의 아미노산 배열에 매칭시키기 위해, cH36 LC FR1에서 하기 돌연변이를 일으켰다: Q11 L, L15 V, E17 D, S18 R. Kabat 데이터베이스 ID 제 019308 호의 인간 IgG κ경쇄 가변 영역의 아미노산 배열에 매칭시키기 위해, 한 돌연변이 Q37 L을 cH36 LC FR2로 만들었다(서열 정보 참고: 표 1a).
cH36 LC FR3의 인간화를 위해, Kabat 데이터베이스 ID 제 038233 호에서의 인간 IgG κ경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 선택하였다. cH36 LC FR4의 인간화를 위해, Kabat 데이터베이스 ID 제 004733 호에서의 인간 IgG κ경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 선택하였다. Kabat 데이터베이스 ID 제 038233 호에서의 인간 IgG κ경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 매칭시키기 위해, cH36 LC FR3에서 하기 돌연변이를 행하였다: K70 D, K74 T, A80 P, V84 A, N85 T. Kabat 데이터베이스 ID 제 004733 호에서의 인간 IgG κ경쇄 가변 영역의 아미노산 배열에 매칭시키기 위해, 두 가지 돌연변이 A100 Q 및 L106 I를 cH36 LC FR4로 만들었다(서열 정보 참고: 표 1b).
(ii). 인간 IgG 중쇄 가변 영역 프래임워크의 선택
cH36 HC에서 각 프레임워크의 아미노산 서열을, Kabat 데이터베이스에서 인간 IgG 중쇄 가변 영역에서의 대응하는 FR의 아미노산 서열과 비교하였다. 베스트-피트 FR을, 상기 기술된 3개의 기준에 기초하여 선택하였다.
cH36 HC FR1의 인간화를 위해, Kabat 데이터베이스 ID 제 000042 호에 있어서 인간 IgG 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 선택하였다. cH36 HC FR2의 인간화를 위해, Kabat 데이터베이스 ID 제 023960호에 있어서 인간 IgG 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 선택하였다. Kabat 데이터베이스 ID 제 000042 호에서의 인간 IgG 중쇄 가변 영역의 아미노산 배열에 매칭시키기 위해, cH36 HC FR1에서 하기 돌연변이를 일으켰다: E1 Q, Q5 V, P9 G, L11 V, V12 K,Q19 R, T24 A. Kabat 데이터베이스 ID 제 023960 호의 인간 IgG 중쇄 가변 영역의 아미노산 배열에 매칭시키기 위해, 두 가지 돌연변이 H41 P 및 S44 G를 cH36 HC FR2로 만들었다(서열 정보 참고: 표 2a).
cH36 HC FR3의 인간화를 위해, Kabat 데이터베이스 ID 제 037010 호에서의 인간 IgG 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 선택하였다. cH36 HC FR4의 인간화를 위해, Kabat 데이터베이스 ID 제 000049 호에서의 인간 IgG 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 선택하였다. Kabat 데이터베이스 ID 제 037010 호에서의 인간 IgG 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 매칭시키기 위해, cH36 HC FR3에서 하기 돌연변이를 행하였다: S76 T, T77 S, F80 Y, H82 E, N84 S, T87 R, D89 E, S91 T. Kabat 데이터베이스 ID 제 000049 호에서의 인간 IgG 중쇄 가변 영역의 아미노산 배열에 매칭시키기 위해, 한 돌연변이 L113 V를 cH36 HC FR2로 만들었다 (서열 정보 참고: 표 2b).
원하는 인간 구조에 대한 결정이 이루어졌을 때, 하기 3가지 기술을 사용하여, 경쇄 및 중쇄 모두에서 원하는 아미노산 치환을 달성하였다: (1) 클로닝에 정식 PCR을 사용하여, 클로닝 또는 진단 엔도뉴클레아제 부위를 도입하며, 가변 영역 말단에 위치한 아미노산 잔기를 변화시킨다. (2) PCR계 돌연변이를 사용하여, 한 번에, 특히 그 잔기들이 가변 영역의 중앙에 있을 때, 다중 아미노산 잔기를 변화시켰다. (3) 부위에 따른 돌연변이 발생을 사용하여, 한 번에 1 또는 2개의 아미노산 치환을 도입하였다. Stratagene의 "급변 부위에 따른 돌연변이유발 키트(Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit)"(카달로그 제 200518 호)에 기재된 방식에 따라, 부위에 따른 돌연변이 유발법을 행하였다.
각 단계 후, 부분적으로 인간화된 클론을 시퀀싱하고, 이들 가변 영역들 중 일부를 후에 발현 벡터로 클로닝하였다. 플라스미드 tKMC180을 사용하여, LC 돌연변이체를 발현시켰고, pJRS 355 또는 pLAM 356 벡터를 사용하여, IgG1 또는 IgG4로서 HC 돌연변이체를 각기 발현시켰다. 이어서, 그 클론들 중 일부를 조합하여, COS 세포에서 일시적으로 발현시켜, ELISA에 의해 발현 수준(level)을 결정하였다.
항-TF 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 최종 완전 인간화 형태를, 간혹 본원에서 "메가 벡터"라고 불리는 것으로 클로닝하여, IgG 발현을 위해 CHO 및 NSO 세포로 트랜스펙션시켰다. 이어서, 안정한 세포주를 사용하여, 분석에 충분한 양의 인간화된 항-TF를 생성시켰다. 얻어진 인간화된 버전은 기원이 100% 인간이다(CDR 서열을 고려하지 않을 경우임). 인간화된 IgG4 κ버전을 hFAT(인간화된 IgG 4 항-조직 인자 항체)라 명하고, IgG1 κ버전을 hOAT(인간화된 IgG 1 항-조직 인자 항체)라 명한다. cH36의 상기 완전 인간화된 버전은 만성적 증세, 예컨대 혈전증, 암 및 염증성 질병을 치료하기 위한 것이다.
C. 항-TF 항체 중쇄의 인간화
1. 항-TFmAb cH36 중쇄(HC) 가변 영역의 PCR 증폭 및, pGem T-easy로의 클로닝을, 주형으로서의 플라스미드 pJAIgG4TF.A8(키메릭 H36를 위한 발현 벡터), 및 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2를 사용하여 실시하였다. 프라이머 TFHCls2는 개시 코돈의 상류에 BsiW1 부위를 도입하였고, 또한 프레임워크(FR) 1에서, E1로부터 Q로의 아미노산 변화를 도입하였다. 프라이머 TFHClas는 FR4에서, L113로부터 V로의 아미노산 변화를 도입하였다. 이 단계의 결과는 구축물 HC01이다.
2. 하기 4개의 프라이머 및 상기 구축물(HC01)을 사용하여 PCR계 돌연변이 유발 방법으로, 구축물 HC02를 발생시켰다. 상류 PCR은 프라이머 TFHCls2 및 TFHC7as를 사용하였다. 하류 PCR은 프라이머 TFHC7s 및 TFHClas2를 사용하였다. 주형으로서 상류 및 하류 PCR 생성물을 사용하고, 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2를 사용하여 오버랩 PCR에 의해 HC02가 수득되었다. 프라이머 TFHC7s 및 TFHC7의 사용은, FR2에서, H41로부터 P로, 또한 S44로부터 G로의 2개 아미노산 변화를 도입하였다.
　3. PCR계 돌연변이 유발 방법은 주형으로서 HC02를 사용하고, 하기 4개의 프라이머는 구축물 HC03를 발생시켰다. 상류 PCR은 프라이머 TFHCls2 및 TFHC5as2를 사용하였다. 하류 PCR은 프라이머 TFHC5s 및 TFHClas2를 사용하였다. 주형으로서 상류 및 하류 PCR 생성물을 사용하고, 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2를 사용하여 오버랩 PCR에 의해 HC03가 수득되었다. 프라이머 TFHC5s 및 TFHC5as2의 사용은 FR3에서, T87로부터 R로, D89로부터 E로, 또한 S91로부터 T로의 3개 아미노산 변화를 도입하였다. A Bgl II 부위는 또한 위치 87에 도입되었다.
　4. 프라이머 TFHC2s 및 TFHC3as를 사용하고, 주형으로서 pGem에서 HC03를 사용하여, PCR 증폭을 실시하였다. TFHC2s은 pGem에서 클로닝 영역의 상류에 위치한다. TFHC3as는 프레임워크 3에 위치하고, FR3에서, H82로부터 E로, 또한 N84로부터 S로의 2개 아미노산 변화를 도입한다. 얻은 PCR 밴드를 pGem으로 클로닝한 후, 적절한 크기의 삽입부를 BsiW1 및 BglII로 절단하였다. 이 프래그먼트를 HC03로 클로닝하여, HC04가 얻어진다.
5. 주형으로서 HC04를 사용하고, 하기 프라이머들을 사용하는 PCR계 돌연변이 유발 방법으로, HC05가 수득되었다. 상류 PCR은 프라이머 TFHCls2 및 TFHC6as를 사용하였다. 하류 PCR은 프라이머 TFHC6s 및 TFHClas2를 사용하였다. 주형으로서 상류 및 하류 PCR 생성물을 사용하고, 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2를 사용하는 돌연변이 유발 PCR로, HC05가 수득되었다. 이 단계는 FR3에서, S76로부터 T로, T77로부터 S로, 또한 F80로부터 Y로의 아미노산 변화를 도입하였다.
6. 주형으로서 HC05를 사용하고, 하기 4개의 프라이머들을 사용하는 PCR계 돌연변이 유발 방법으로, HC06이 수득되었다. 상류 PCR은 프라이머 TFHC2s 및 TFHC2as2를 사용하였다. 하류 PCR은 프라이머 TFHC3s2 및 TFHClas2를 사용하였다. TFHC2as2를 사용한 증폭은 FR1에서, P9로부터 G로의 1개 아미노산 변화를 도입하였다. 프라이머 TFHC3s2는 Q19를 R로, 또한 T24를 A로 도입하였다. 주형으로서 상류 및 하류 PCR 생성물을 사용하고, 프라이머 TFHCls2 및 TFHClas2를 사용하는 PCR로써 HC06가 수득되었다.
7. FR1의 위치 2에서의 I의 M으로의 한 점 돌연변이가, HC06의 구축 동안에 자발적으로 도입되었다. 주형으로서 HC06를 사용하고, 프라이머로서 TFHCls3 및 TFHClas2를 사용하는 PCR 증폭은, 상기 이상 치환(erroneous substitution)을 보정하였고, 또한 FR1에서, Q5로부터 V로의 한 아미노산 변화를 도입하였다. 얻어진 구축물은 HC07이었다.
8. 구축물 HC08은 주형으로서 HC07를 사용하고, 하기 프라이머들을 사용하는 PCR계 돌연변이 유발 방법에 의해 제조되었다. TFHC2s 및 TFHC2as3은 상류 생성물을 위해 사용되었다. 하류 생성물은 TFHCls3 및 TFHClas2를 사용하여 미리 증폭되었다(참고: 단계 7). 프라이머 TFHC2as3의 사용은 FR1에서, Lll로부터 V로, 또한 V12로부터 K로의 2개 아미노산 변화를 도입하였다. 자발적 점 돌연변이의 결과로, CDR2의 위치 64에서 F이 L로 변화되었다. 부가적 스크리닝 및 시퀀싱으로, CDR2의 위치 64에서의 F의 보정된 서열을 갖는 구축물 HC08R1이 수득되었다.
9. 2개의 구축물 HC11 및 HC12가, HC07로부터 른 돌연변이 유발 방법에 의해 생성되었다. 상보적 프라이머 TFHC8sP 및 TFHC8asP를 주형 HC07과 함께 사용하여, FR1에서, G9 P, Lll로부터 V로, 또한 V12로부터 K로의 3개 아미노산 변화를 갖는 HCll를 생성시켰다. 이어서, HCll를 메틸화하고, 차회 부위에 따른 돌연변이 유발 방법을 위해 칼럼 정제시켰다. 주형으로서 HC11를 사용하고, 상보적 프라이머 TFHC9sL 및 TFHCOasL를 사용하는 PCR로써, FR1에서, V11로부터 L로의 돌연변이를 갖는 HC12를 생성시켰다.
10. 주형으로서 HC12를 사용하고, 상보적 프라이머 TFHClOsK 및 TFHClOasK를 사용하는 PCR을 실시함으로써, 구축물 HC09이 HC12로부터 유도되었다. HC09은 FR1에서, K12로부터 V로의 한 아미노산 변화를 포함한다.
11. 구축물 HC10을 HC09로부터 생성시켰다. 주형으로서 HC09을 사용하고, 상보적 프라이머 LV-1 및 LV-2를 사용하는 PCR의 결과로서, FR1에서, Lll로부터 V로의 돌연변이를 포함하는 HC10가 생성되었다.
각 돌연변이화 단계 후, 부분적으로 인간화되거나 전부 인간화된 클론을 시퀀싱하고, 후에 그 가변 영역의 일부를 발현 벡터로 클로닝하였다. pJRS 355 또는 pLAM 356 벡터를 사용하여, 인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc로 융합된 HC 돌연변이를 발현시켰다.
도 13a는 단계 1 내지 11의 개요를 나타내고, FR1 내지 4에 도입된 증분 아미노산 변화를 보여준다. HC08를 제외하고는, 다른 모든 중쇄 돌연변이체 및 cH36은 CDR2의 위치 64에서 F를 포함한다. HC08은 위치 64에서, F에서 L로의 돌연변이를 가진다.
도 13b 내지 도 13d는 중쇄 CDR 서열을 보여준다.
중쇄 인간화에 사용되는 프라이머
D. 항-TF 항체 경쇄의 인간화
1. 주형으로서 플라스미드 pJAIgG4TF. A8(키메릭 항체 36를 위한 발현 벡터)을 사용하고, 프라이머 TFLCls2.1 및 TFLClas2를 사용하여, PCR 증폭을 실시하였다. 이 단계는 코딩 영역의 상류에 클로닝 부위 AgeI를 도입하였다. 또한 그것은 FR4에서 L106I의 돌연변이를 도입하였다. 이 단계는 구축물 LC03을 생성시켰다.
2. 상보적 프라이머 TFLC5s 및 TFLC5as을 사용하고, 주형으로서 LC03를 사용하여, 부위에 따른 돌연변이 유발 방법을 실시하였다. 이 단계는 FR2에서 돌연변이 Q37L를 도입하였고, 진단 목적을 위한 PstI 부위를 부가하였다. 이 새 구축물을 LC04라 명한다.
3. 주형으로서 LC04을 사용하고, 프라이머 TFHC2s 및 TFLC2asl을 사용하여, PCR 증폭을 실시하였다. 이 단계는 단계 6에서 사용하게 될 프래그먼트 A를 생성시켰다. 이 단계는 FR1에서 Q11L 및 L15V 돌연변이를 도입하였다.
4. 주형으로서 LC04을 사용하고, 프라이머 TFLCls2.1 및 TFLClasR을 사용하여, PCR 증폭을 실시하였다. 이 단계는 가변 영역의 말단에 KpnI 부위를 도입하였다. 이 PCR 프래그먼트를 pGEM에 클로닝하여, 단계 6에서 사용하게 될 pGEM04K를 얻었다.
5. 주형으로서 LC04을 사용하고, 프라이머 TFLC2s 및 TFLC4as을 사용하여, PCR 증폭을 실시하였다. 이 단계는 단계 6에서 사용하게 될 프래그먼트 C를 생성시켰다. 이 단계에서, 3개의 돌연변이, 즉 FR1에서 돌연변이 E17D, S18R, 또한 FR4에서 돌연변이 A100Q를 도입하였다.
6. 주형으로서 프래그먼트 A 및 프래그먼트 C를 사용하고, 프라이머 TFHC2s 및 TFLC4as를 사용하는 PCR계 돌연변이 유발 방법을 실시하여, 프래그먼트 D를 얻었다. 프래그먼트 D를 pGEM04K에 도입하여, 구축물 LC05을 얻었다.
7. pGEM04K을 사용하고, 프라이머 TFLCls2.1 및 TFLC4as를 사용하여, PCR 증폭을 실시하였다. 이 단계는 프래그먼트 H를 생성시켰고, 이를 이어서 pGEM04K에 클로닝시켰다. 이는 FR4에서 A100Q 돌연변이를 도입하였고, 이 구축물을 LC06으로 명한다.
8. 주형으로서 LC06을 사용하고, 프라이머 TFLCls2.1 및 TFLC3as를 사용하여, PCR 증폭을 실시하였다. 이 단계는 단계 10에 사용될 프래그먼트 I를 생성시켰다. 이는 FR3에서 K70D 및 K74T 돌연변이를 도입하였다.
9. 주형으로서 LC06을 사용하고, 프라이머 TFLC3s2 및 TFLC4as를 사용하여, PCR 증폭을 실시하였다. 이 단계는 단계 10에 사용될 프래그먼트 F를 생성시켰다. 이는 FR3에서 A80P 돌연변이를 도입하였다.
10. 주형으로서 프래그먼트 I 및 프래그먼트 F을 사용하고, 프라이머 TFLCls2.1 및 TFLC4as를 사용하는 PCR로써, 프래그먼트 J를 얻었다. 프래그먼트 J를 pGEM에 클로닝하여, 구축물 LC07을 얻었다.
11. 상보적 프라이머 TFLC08sds 및 TFLC08sdsa를 사용하고, 주형으로서 LC07을 사용하여, 부위에 따른 돌연변이 유발 방법을 실시하였다. 이 단계는 FR3에서 돌연변이 V84A 및 N85T를 도입하였다. 이 구축물을 LC08라 명한다.
12. 돌연변이 Q11L, L15V, E17D, S18R 및 Q37L를 포함하는 LC05로부터의 AgeI 내지 EcoO109I 프래그먼트를 LC08에 클로닝하였다. 이로써 구축물 LC09를 얻었다.
13. 주형으로서 LC09를 사용하고, 상보적 프라이머 LC105 및 LC103를 사용하여, 부위에 따른 돌연변이 유발 방법을 실시하였다. 이 단계는 FR3에서 돌연변이 T85N를 도입하였고, 구축물 LC10를 생성시켰다.
14. 주형으로서 LC10를 사용하고, 상보적 프라이머 LC115 및 LC113를 사용하여, 부위에 따른 돌연변이 유발 방법을 실시하였다. 이 단계는 FR3에서 돌연변이 D70K를 도입하였다. 이 구축물을 LC11라 명한다.
15. 주형으로서 LC11을 사용하고, 상보적 프라이머 LC125a 및 LC123a를 사용하여, 부위에 따른 돌연변이 유발 방법을 실시하였다. 이 단계는 FR2에서 돌연변이 K42Q를 도입하였다. 이 구축물을 LC12라 명한다
각 돌연변이화 단계 후, 부분적으로 인간화되거나 전부 인간화된 LC 클론을 시퀀싱하고, 후에 그 가변 영역의 일부를 발현 벡터 tKMC180로 클로닝하였다.
도 12a는 단계 1 내지 15의 개요를 나타내고, 경쇄의 FR1 내지 4에 도입된 증분 아미노산 변화를 보여준다. 도 12b 내지 도 12d는 경쇄 CDR 서열을 보여준다.
경쇄 인간화에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머
도 14는 경쇄(도 14a) 및 중쇄(도 14b)의 hOAT(인간화된 cH36-IgG1) 일정 영역 서열을 보여준다. 도 15는 경쇄(도 15a) 및 중쇄(도 15b)의 hFAT(인간화된 cH36-IgG4) 일정 영역 서열을 보여준다. 각 도면에서, 프레임워크 4(FR 4)의 마지막 아미노산 잔기는 hOAT 및 hFAT를 위한 일정 영역의 제1 아미노산 잔기에 연결된다.
실시예 10: 인간화된 항-TF 항체의 발현 및 정제
부분적으로 인간화되거나 전부 인간화된 LC 및 HC 클론을 발현 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드 tKMC180(참고: 도 10a-도 10b)를 사용하여, 인간 κ 쇄에 융합된 LC 돌연변이체를 발현시켰고, pJRS 355(참고: 도 9a-도 9b) 또는 pLAM 356(참고: 도 9c-도 9d) 벡터를 사용하여, 인간 IgG1 또는 IgG4의 Fc에 융합된 HC 돌연 변이를 발현시켰다. 이어서, HC 및 LC 클론의 일부 조합물을 COS 세포에 같이 트랜스펙션시켰다. 전체 IgG 생산 및 ELISA에 의한 TF 에의 결합을 위해, COS 세포에서 일시적으로 발현된 IgG를 검정하였다.
항-TF 중쇄 및 경쇄 가변 영역(HC08 및 LC09의 조합)의 최종 완전 인간화된 형태를 Sunol의 Mega 발현 벡터(pSUN34, 참고: 도 11)에 클로닝하고, 발현을 위해 CHO 및 NSO 세포로 트랜스펙션하였다. 안정하게 트랜스펙션된, IgG4κ 또는 IgG1κ 인간화된 항 -TF 항체를 생산하는 세포주를 클로닝하였다. 이어서 선택된 안정한 세포주를 사용하여, 분석에 충분한 양의 인간화된 항 -TF를 생산하였다. 얻어진 인간화된 버전은 기원이 약 95% 인간이다(CDR 서열은 고려하지 않음). 인간화된 IgG4κ 버전을 hFAT(인간화된 IgG 4 항-조직 인자 항체)라고 명명하고, IgG1κ 버전을 hOAT(인간화된 IgG 1 항-조직 인자 항체)라고 명명한다. cH36의 상기 완전 인간화된 버전은 만성 증세, 예컨대 암 및 염증성 질병을 치료하기 위한 것이다.
hOAT(HC08 및 LC09의 조합)을 발현시키는 NSO 세포주들(OAT-NSO-P10A7) 중 하나를 해동시키고, 15mL 튜브에서 10% FBS로 보충된 10mL의 IMDM 배지에 연장시켜 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10mL의 새 배지에 재현탁시키고, T25 플라스크에 보내어, 37℃에서 5% CO2 중에 배양하였다. 중공 섬유 생체반응기(bioreactor)를 배양하는 충분한 수의 세포를 제조하기 위해, 세포를 확장하여, 총 6×108개 세포를 얻었다. 생체반응기를 제조업체의 지시 매뉴얼에 따라 설치(setup)시켰다. 수획된 세포를 펠렛화하고, 35% FBS를 함유하는 60mL의 IMDM에 재현탁시켰으며, 이를 생체반응기의 과모세공간(extracapillary space)에 주입하였다. 글루코스 및 락테이트의 농도를 매일 검침하고, 수획 물질을 원심분리한 후, 푸울링하였다. 수획된 물질을 ELISA 검정법에 의해, 항-TF 항체 농도에 대해 시험하였다. 이어서 항-TF 항체(hOAT)를 함유하는 푸울링된 샘플을 하기 기술되는 바와 같이 정제하고, 분석하였다.
A. r프로테인(rProtein) A 세파로스(Sepharose) 고속 유동 크로마토그래피(Fast Flow Chromatography)
재조합 인간화된 항-TF 모노클론 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된다. 중쇄는(비변형되거나, 상술한 바와 같이 인간화된) 마우스 가변 영역과, 인간 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인이 융합된 것이며, 한편 경쇄는(비변형되거나, 상술한 바와 같이 인간화된) 마우스 가변 영역과, 인간 κ 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역이 단백질 A 또는 재조합 단백질(rProtein A)에 대한 친화성이 매우 크다는 것이 잘 확립되어 있다.
인간화된 항-TF 항체(hOAT)를 함유하는 수획 푸울을, 샘플 ㎖ 당, 0.08㎖의 1M Tris-HCl, pH 8.0을 첨가함으로써, pH 8.0±0.1로 조정하였다. 이어서, 샘플을 단백질-결합력이 낮은 0.22마이크론 필터(예: Nalge Nunc International 사의, 폴리에테르술폰 막을 가진 Nalgene 무균 일회용 조직 배양 필터 유닛, Cat. No. 167-0020)를 사용하여 여과하였다. 샘플 적용에 따라, r프로테인 A 칼럼(Pharmacia 사제)을 5층 체적(bed volumes)의 20mM Tris-HCl, pH 8.0로 세척하여, 배지 단백질과 같은 비결합된 물질을 제거하였다. 수획 배지가 고함량의 소 혈청을 함유하기 때문에, 단계적 pH 구배 세척을 사용하여, 칼럼에서 소 IgG를 제거하였다. 버퍼 A(100mM 아세트산나트륨) 중, 버퍼 B(100mM 아세트산)의 상대 퍼센티지를 증가시킴으로써, 단계적 구배를 달성하였다. 전형적인 pH 단계적 세척은 20%, 40% 및 60% 버퍼 B를 이용하였다. 칼럼을 100% 버퍼 B으로 용출하고, A280에 기초한 분획물을 수집하였다. 푸울링된 분획물을 1M Tris 베이스 첨가로써, pH 8.5로 조정하였다.
B. Q 세파로스 고속 유동 크로마토그래피
음이온 이온교환 크로마토그래피는 단백질 전하에 따라 단백질을 분리하는데 매우 효과적이다. r프로테인 A 칼럼으로부터 용출되고, pH-조정된 샘플을 2체적의 물로 희석하고, pH를 확인하여 8.5로 조정하였다. 이어서, 샘플을 20mM Tris-HCl, pH 8.5로 평형을 이룬 5㎖(1.6×2.5㎝) Q 세파로스 고속 유동에 적하하였고, 칼럼을 (1) 5층 체적의 20mM Tris-HCl, pH 8.5; 및 (2) 100mM NaCl를 함유하는 4층 체적의 20mM Tris-HCl, pH 8.5로 세척하였다. 이어서, IgG 단백질을 층 체적의 20mM Tris-HCl, pH 8.5로 용출하였다. 단백질 피크를 푸울링하고, 초여과 장치를 PBS로 버퍼 교환하였다.
동일한 트랜스펙션, 세포 배양 및 정제 방법을 사용하여, hFAT를 또한 생성시키고 정제하였다.
실시예 11: 인간화된 항-TF 항체의 성질
A. 인간화된 항-TF 항체에 의한 TF 기능의 억제
항-TF 항체의 핵심적 성질들 중 하나는, 조직 인자-개시된 혈액 응고를 억제하는 능력이다. 정제된 hOAT 및 hFAT를 표준 PT 검정법으로 TF 활성 억제 능력에 대해 측정하였다. PT 검정법은 조직 인자-의존성 응혈 시간을 측정하는데 널리 사용된다. 이 검정법의 주된 내용은, 조직 인자(TF)가 혈장에서 인자 VIIa와 복합체를 형성한다는 것이다. 이어서 이 복합체는 인자 X를 FXa로 활성화시키고; 이어서, FXa는 인자 Va 및 인지질의 존재하에, 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킨다. 트롬빈은 궁극적으로 혈병을 형성시킨다. 표준 PT 검정법에서, 지질화된 TF를 혈장에 첨가하여, 혈액 응고를 개시하고, [Organon Teknika Coag-A-Mate 응고 분석기(Coagulation Analyzer)] 또는 그와 대등한 장치에 의해 기록된다.
항-TF 항체인 H36은 독특한 메커니즘에 의해 인간 TF 활성을 억제한다. 인자 X 및 IX가 TF:VIIa 복합체에 결합하는 것이 억제되어, TF:VIIa에 의해 FX 및 FIX 활성화가 방지되는 방식으로(참고: 미국 특허 제 5,986,065 호), 상기 H36가 TF(유리 상태 또는 인자 VIIa와의 복합체로)에 결합한다. PT 테스트에서, 인간 혈장에 첨가된 항-TF 항체에 의한 응혈 시간 연장은, 명백히 이 TF-의존성 응고가 억제됨을 가리키는 것이다. 응혈 시간은 TF 활성이 양과 관계된다. 일련으로 희석된 TF의 PT 응혈 시간을 측정함으로써 TF 표준 곡선이 만들어진다. TF 표준 곡선의 데이터로부터, 항-TF 항체 활성의 억제도를 구한다.
시약: 인노빈(Innovin)(Cat. 제 68100-392 호) 및 씨-트롤 응고 대조군, 레벨 I(Cat. 제 68100-336 호)를 VWR로부터 얻었다. 지질화된 재조합 인간 TF를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다.
방법: PT 테스트을 응고 분석기를 사용하여 37℃에서 실시하였다. 0.2㎖의 지질화된 재조합 인간 조직 인자(예: Innovin)를, 0.01㎖ 버퍼(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA) 또한 항-TF 항체를 함유하는 0.1㎖의 인간 혈장(씨-트롤 대조군 레벌 I)에 첨가함으로써, PT 반응을 개시하였다.
1. 제조업체의 지시에 따라, 인노빈의 유리병에 정제를 첨가한다. 시약을 37℃로 가온한다. 시약은 4 내지 8℃에서 저장 시, 수일간 안정하다.
2. 씨-트롤의 각 유리병에 정제수 1㎖를 첨가한다. 하나 초과의 유리병을 사용할 경우, 그들을 하나의 용기(예: 10㎖ 시험관)에 조합한다. 1㎖의 씨-트롤로 5회 검정법을 실시할 수 있다(각 검정법은 2×0.1㎖ = 0.2㎖을 사용한다). 씨-트롤은 얼음 상에 저장되어, 수 시간 동안 지속될 수 있다.
3. 항-TF 항체 원(stock)으로부터, 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA와 함께 일련의 항-TF 항체 용액을 제조한다(200nM 내지 1600nM).
4. 10㎕의 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA 또는 10㎕의 희석된 항-TF를, 0.1㎖의 씨-트롤을 함유하는 2-웰 큐벳의 각각에 첨가한다. 0.1㎖의 팁을 가진 피펫을 사용하여 각 웰을 혼합한다. 웰이 기포가 없도록 한다. 혈장(씨-트롤)과 항-TF(또는 버퍼)를 혼합한 후, 0.2㎖의 인노빈을 혈장에 첨가한 후, 10분 내에 응혈 시간을 측정한다.
5. TF 적정 곡선을 위해, 먼저 인노빈(100% TF)을, 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA로서 20%, 10%, 5% 및 2.5%로 희석한다. 이어서, 단계 4에서와 같이, 단 인노빈 샘플을 사용하여, PT 검정법을 실시하였다.
표 3은 PT 응혈 시간에 대한 cH36, hOAT 및 hFAT의 영향의 개요를 나타낸다. 표 4의 데이터와 비교 시, cH36, hFAT, 및 hOAT는, TF 기능을 매우 강력히 억제함을 보여준다. 상기 12.9nM의 단백질 농도에서, 모든 항체는 약 95% 억제도를 달성하였다. 표 3의 결과는 또한, 항-TF cH36의 인간화가, 상술한 방법에 의해, cH36에 대해서 본 바와 같이 hFAT 및 hOAT 모두가 TF-의존성 혈액 응고를 억제하는 매우 유사한 능력을 나타내기 때문에, cH36 억제 활성에 대한 어떠한 상당한 영향도 갖지 않았음을 가리킨다.
B. 친화성 상수의 결정
CM5 센서 칩에 공유 고정화된 재조합 인간 조직 인자를 사용하여, 표면 플라즈몬 공명법(BIAcore; Pharmacia Biosensor 사)에 의해, 인간화된 항-TF 항체의 TF에 대한 친화성을 결정하였다. 친화성 상수는 바이어코어(BIAcore) 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 4개 항-TF 모노클론 항체 농도(0.125nM, 0.25nM, 0.5nM 및 1nM)로부터 계산된 평균 데이터였다. 표 5의 결과는, 상술된 방법에 의해, 항-TF cH36의 인간화가, cH36 및 hFAT 모두가 TF에 대한 친화성이 유사하기 때문에, cH36 친화성에 대한 어떠한 상당한 영향도 가지지 않았음을 가리킨다.
본 발명은 그의 바람직한 실시 형태를 참고로 상세히 설명되었다. 그러나, 당업자라면, 개시 내용을 고려할 시, 본 발명의 취지 및 범위 내에서 변형 및 개선을 가할 수 있을 것으로 사료된다.
본 출원은 미국 특허 출원 일련 번호 09/990,586(2001. 11. 21 출원)에 우선권을 주장하고, 상기 출원은 미국 임시 출원 일련 번호 06/343,306(2001. 10. 29 출원)에 우선권을 주장하고, 상기 출원은 미국 특허 출원 제 09/293,854 호(1999. 4. 16)에 관계가 있고, USSN 08/814,806(현재, 미국 특허 제 5,986,065 호)의 분할 출원이고, 상기 미국 출원 일련 번호 09/990,586, 60/343,306, 09/293,854 및 미국 특허 제 5,986,065 호의 개시는 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.

Claims (72)

  1. 인간 조직 인자(TF, human tissue factor)에 특이적으로 결합하여, 복합체를 형성하는 인간화된 항체로서, 상기 복합체에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 TF:VIIa에 의한 상기 FX 또는 FIX 활성화가 억제되는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 약 0.5nM 미만의 상기 TF에 대해 해리 상수(Kd)를 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 15nM 미만의 항체 농도에서 표준 프로트롬빈(PT) 응고 검정법에 의해 결정하여, 적어도 약 5초까지 혈액 응고 시간을 증가시키는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 ATCC Accession No. HB-12255에 기탁된 세포주 H36.D2.B7로부터 얻은 항체 이상 정도의 TF에 대한 결합 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 ATCC Accession No. HB-12255에 기탁된 세포주 H36.D2.B7로부터 얻은 항체 이상 정도의 TF에 대한 결합 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 적어도 1개의 완전 뮤린 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 항체는 적어도 1개의 완전 인간 프레임워크(FR) 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체에 대해 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  9. 제1항에 있어서, 인간화된 항체의 가변 영역은 인간 항체 가변 영역에 대해 적어도 약 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  10. 제1항에 있어서, 프레임워크(FRs) 1, 2, 3 및 4의 각각은 도 12(a)에 도시된 경쇄 FR 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항체는 도 14a 또는 도 15a에 도시된 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 일정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  12. 제1항에 있어서, 프레임워크(FRs) 1, 2, 3 및 4의 각각은 도 13a에 도시된 중쇄 서열(SEQ ID NO.－)에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체는 추가로 도 14b 또는 15b에 도시된 서열(SEQ ID NO.－)에 대해 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 일정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG1(hOAT) 또는 IgG4(hFAT) 이소타입(isotype)을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  15. 제1항의 인간화된 항체의 인간 TF 결합 프래그멘트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 프래그멘트는 Fab, Fab', 또는 F(ab)2인 것을 특징으로 하는 인간 TF 결합 프래그멘트.
  17. 적어도 1개의 뮤린 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 인간화된 항체로서, 상기 항체는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하고, 추가로 TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제되는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  18. 제17항에 있어서, 모든 CDR(경쇄 및 중쇄)이 뮤린인 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체는 추가로 적어도 1개의 인간 프레임워크(FR) 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  20. 제19항에 있어서, 모든 FR(경쇄 및 중쇄)의 아미노산 서열은 인간이거나 인간인 것의 2 아미노산 치환 내에 있는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  21. 제17항에 있어서, 중쇄 초가변 영역의 제1 CDR(CDR1)은 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  22. 제17항에 있어서, 중쇄 초가변 영역의 제2 CDR(CDR2)은 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  23. 제17항에 있어서, 중쇄 초가변 영역의 제3 CDR(CDR3)은 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  24. 제17항에 있어서, 경쇄 초가변 영역의 제1 CDR(CDR1)은 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  25. 제17항에 있어서, 경쇄 초가변 영역의 제2 CDR(CDR2)은 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  26. 제17항에 있어서, 경쇄 초가변 영역의 제3 CDR(CDR3)는 도 12d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  27. 제19항에 있어서, 중쇄 초가변 영역의 제1 프레임워크(FR1)는 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 FR1는 다음의 E1로부터 Q로; Q5로부터 V로; P9로부터 G로; L11로부터 V로; V12로부터 K로; Q19로부터 R로; 및 T24로부터 A로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  29. 제19항에 있어서, 중쇄 초가변 영역의 제2 프레임워크(FR2)는 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 FR2는 다음의 41H로부터 P로; 및 44S로부터 G로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  31. 제19항에 있어서, 중쇄 초가변 영역의 제3 프레임워크(FR3)는 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 FR3는 다음의 76S로부터 T로; 77T로부터 S로; 80F로부터 Y로; 82H로부터 E로; 84N로부터 S로; 87T로부터 R로; 89D로부터 E로; 및 91S로부터 T로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  33. 제19항에 있어서, 중쇄 초가변 영역의 제4 프레임워크(FR4)는 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 FR4는 다음의 113L로부터 V로의 아미노산 변화를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  35. 제19항에 있어서, 경쇄 초가변 영역의 제1 프레임워크(FR1)는 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  36. 제35항에 있어서, 상기 FR1은 다음의 11QL로부터 L로; 15L로부터 V로; 17E로부터 D로; 및 18로부터 R로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  37. 제19항에 있어서, 경쇄 초가변 영역의 제2 프레임워크(FR2)는 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 FR2는 다음의 37Q로부터 L로의 아미노산 변화를 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  39. 제19항에 있어서, 경쇄 초가변 영역의 제3 프레임워크(FR3)는 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  40. 제39항에 있어서, 상기 FR3는 다음의 70K로부터 D로; 74K로부터 T로; 80A로부터 P로; 84A로부터 V로; 및 85N로부터 T로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  41. 제40항에 있어서, 경쇄 초가변 영역의 제4 프레임워크(FR4)는 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 약 95% 일치하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  42. 제41항에 있어서, 상기 FR4는 다음의 100A로부터 Q로; 및 106L로부터 I로의 아미노산 변화 중의 적어도 1개를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  43. 제17항의 인간화된 항체의 인간 TF 결합 프래그멘트.
  44. 제43항에 있어서, 상기 프래그멘트는 Fab, Fab', 또는 F(ab)2인 것을 특징으로 하는 인간 TF 결합 프래그멘트.
  45. 적어도 1개의 뮤린 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 인간화된 항체로서, 상기 항체는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하고, 추가로 TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제되고, 중쇄 상에,
    a) 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 CDR(CDR1),
    b) 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 CDR(CDR2),
    c) 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 CDR(CDR3),
    d) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
    e) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
    f) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 프레임워크(FR3), 및
    g) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제4 프레임워크(FR4)
    을 포함하는 것을 특징으로 인간화된 항체.
  46. 제45항에 있어서, 경쇄 상에:
    h) 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 CDR(CDR1),
    i) 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 CDR(CDR2),
    j) 도 12c에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 CDR(CDR3),
    k) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
    l) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
    m) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 프레임워크(FR3), 및
    n) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제4 프레임워크(FR4)
    을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  47. 제45항에 있어서, 도 14a(SEQ ID NO.－) 또는 도 15a(SEQ ID NO.－)의 경쇄 일정 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  48. 제45항에 있어서, 추가로, 도 14b(SEQ ID NO.－) 또는 도 15b(SEQ ID NO.－)의 중쇄 일정 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  49. 제45항의 인간화된 항체의 인간 TF 결합 프래그멘트.
  50. 제45항에 있어서, 상기 프래그멘트는 Fab, Fab', 또는 F(ab)2인 것을 특징으로 하는 인간 TF 결합 프래그멘트.
  51. 중쇄 상에:
    a) 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 CDR(CDR1),
    b) 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 CDR(CDR2),
    c) 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 CDR(CDR3),
    d) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
    e) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
    f) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
    g) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제4 프레임워크(FR4), 및
    경쇄 상에;
    h) 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 CDR(CDR1),
    i) 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 CDR(CDR2),
    j) 도 12d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 CDR(CDR3),
    k) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
    l) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
    m) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 프레임워크(FR3), 및
    n) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제4 프레임워크(FR4)
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  52. 제51항에 있어서, 도 14a(SEQ ID NO.－) 또는 도 15a(SEQ ID NO.－)의 경쇄 일정 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  53. 제51항에 있어서, 14b(SEQ ID NO.－) 또는 도 15b(SEQ ID NO.－)의 중쇄 일정 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  54. 제51항에 있어서, 상기 항체는 IgG1 또는 IgG4 이소타입을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  55. 제4항의 인간화된 항체의 인간 TF 결합 프래그멘트.
  56. 제55항에 있어서, 상기 프래그멘트는 Fab, Fab', 또는 F(ab)2인 것을 특징으로 하는 인간 TF 결합 프래그멘트.
  57. 제1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로널 항체인 것을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  58. 제1항의 항체의 초가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단쇄 항체.
  59. 제1항의 인간화된 항체의 중쇄 또는 경쇄 중의 적어도 1개를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  60. 제59항의 분리된 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터
  61. 제60항의 재조합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  62. 제1항의 인간화된 항체, 및 적어도 1개의 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법으로서, 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 제1항의 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 유효량을 포유 동물에 투여하는 단계와; 여기서 TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제되고, 항체와 TF 사이에 특이적 복합체를 형성하여 혈액 응고를 억제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법.
  64. 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법으로서, 제7항의 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 유효량을 포유 동물에 투여하는 단계와; 여기서 상기 항체 또는 프래그멘트는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하고, 추가로, TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제되고, 항체와 TF 사이에 특이적 복합체를 형성하여 혈액 응고를 억제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법.
  65. 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법으로서, 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 유효량을 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하고; 여기서, 상기 항체는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하고, 추가로, TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제되고, 상기 항체 또는 프래그멘트는 중쇄 상에:
    a) 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 CDR(CDR1),
    b) 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 CDR(CDR2),
    c) 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 CDR(CDR3),
    d) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
    e) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
    f) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
    g) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제4 프레임워크(FR4), 및
    경쇄 상에;
    h) 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 CDR(CDR1),
    i) 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 CDR(CDR2),
    j) 도 12d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 CDR(CDR3),
    k) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
    l) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
    m) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
    n) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 적어도 95% 일치하는 제4 프레임워크(FR4),
    o) 도 14a(SEQ ID NO.－) 또는 도 15a(SEQ ID NO.－)에 도시된 아미노산 서열에 적어도 95% 일치하는 경쇄 일정 영역, 및
    p) 도 14b(SEQ ID NO.－) 또는 도 15b(SEQ ID NO.－)에 도시된 아미노산 서열과 적어도 95% 일치하는 중쇄 일정 영역
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법.
  66. 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법으로서, 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 유효량을 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 항체는 인간 조직 인자(TF)에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하고, 추가로 TF 또는 TF:FVIIa에 대한 인자 X 또는 인자 IX 결합 및 이에 대한 TF:FVIIa에 의한 활성화가 억제되고, 상기 항체 또는 프래그멘트는 중쇄 상에:
    a) 도 13b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 CDR(CDR1),
    b) 도 13c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 CDR(CDR2),
    c) 도 13d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 CDR(CDR3),
    d) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
    e) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
    f) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
    g) 도 13a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제4 프레임워크(FR4), 및
    경쇄 상에;
    h) 도 12b에 도시된 CDR1 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 CDR(CDR1),
    i) 도 12c에 도시된 CDR2 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 CDR(CDR2),
    j) 도 12d에 도시된 CDR3 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 CDR(CDR3),
    k) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제1 프레임워크(FR1),
    l) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제2 프레임워크(FR2),
    m) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제3 프레임워크(FR3),
    n) 도 12a에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO.－)과 일치하는 제4 프레임워크(FR4),
    o) 도 14a(SEQ ID NO.－) 또는 도 15a(SEQ ID NO.－)에 도시된 아미노산 서열과 일치하는 경쇄 일정 영역, 및
    p) 도 14b(SEQ ID NO.－) 또는 도 15b(SEQ ID NO.－)에 도시된 아미노산 서열과 일치하는 중쇄 일정 영역
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물에서의 혈액 응고를 억제하는 방법.
  67. 생물학적 샘플 중에서 조직 인자(TF)를 검출하는 방법으로서, 생물학적 샘플 중에서의 TF를 나타내는 것으로서, 복합체를 형성 및 복합체를 검출하는 것에 이어지는 조건하에서 생물학적 샘플을 제1항의 항체에 접촉시키는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플 중에서 조직 인자(TF)를 검출하는 방법.
  68. 제1항의 인간화된 항체를 제조하는 방법으로서, 1) 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 경쇄를 인코딩하는 제1 발현 벡터 및 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 중쇄를 인코딩하는 제2 발현 벡터, 또는 2) 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트의 경쇄와 중쇄 모두를 인코딩하는 단일 발현 벡터 중의 어느 하나로 형질변환된 숙주 세포를 제공하는 단계, 각 쇄가 발현되는 성장 조건하에서 숙주 세포를 유지하는 단계, 및 인간화된 항체 또는 이의 프래그멘트를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 인간화된 항체를 제조하는 방법.
  69. 인간화된 항체를 제조하는 방법으로서,
    a) 대응하는 인간 항체 프레임워크 서열의 집합(collection)에 대하여 설치류 항체로부터의 경쇄 프레임워크의 아미노산 서열을 비교하는 단계,
    b) 대응하는 설치류 경쇄 프레임 워크에 대해 최고의 아미노산 서열 동일성을 갖는 집합으로부터의 인간 프레임워크 서열을 선택하는 단계,
    c) 설치류 경쇄 프레임워크를 인코딩하는 DNA 단편을 돌연 변이시켜 단계 b)에서 선택된 인간 프레임워크 서열과 실질적으로 일치하는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 경쇄 프레임워크를 인코딩하는 단계,
    d) 설치류 경쇄의 각 개체 프레임워크에 대해 단계 a)에서 c)를 반복하여, 각 서열이 인간화된 경쇄 프레임워크를 인코딩하는 다수의 DNA 서열을 제조하는 단계, 여기에서, 단계 b)에서 선택된 대응하는 인간 프레임워크 서열의 각각이 동일 또는 상이한 인간 항체로부터 유래하고,
    e) 단계 d)에서 제조된 인간화된 프레임워크 서열을 인코딩하는 DNA 서열을, 설치류 항체의 적어도 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 제1 벡터로 조립하는 단계; 및
    f) 인간화된 항체를 제조하기에 충분한 조건하에서 조립된 벡터를 숙주에 도입하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체를 제조하는 방법.
  70. 제69항에 있어서,
    g) 대응하는 인간 항체 프레임워크 서열의 집합에 대하여 설치류 항체로부터의 중쇄 프레임워크의 아미노산 서열을 비교하는 단계,
    h) 대응하는 설치류 중쇄 프레임워크에 대해 최고의 아미노산 서열 동일성을 갖는 집합으로부터의 인간 프레임워크 서열을 선택하는 단계,
    i) 설치류 중쇄 프레임워크를 인코딩하는 DNA 단편을 돌연 변이시켜 단계 h)에서 선택된 인간 프레임워크 서열과 실질적으로 일치하는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 중쇄 프레임워크를 인코딩하는 단계; 및
    j) 설치류 중쇄의 각 개체 프레임워크에 대해 단계 g)에서 i)를 반복하여, 단계 h)에서 선택된 대응하는 인간 프레임워크 서열의 각각이 동일 또는 상이한 인간 항체로부터 유래하고, 각 서열이 인간화된 중쇄 프레임워크를 인코딩하는 다수의 DNA 서열을 제조하는 단계
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체를 제조하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 단계 j)에서 제조된 인간화된 프레임워크 서열을 인코딩하는 DNA 서열을, 설치류 항체의 적어도 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 제2 벡터로 조립하는 단계, 및 인간화된 항체를 제조하기에 충분한 조건하에서 조립된 제1 및 제2 벡터를 숙주에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체를 제조하는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 단계 j)에서 제조된 인간화된 프레임워크 서열을 인코딩하는 DNA 서열을, 설치류 항체의 적어도 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 제1 벡터로 조립하는 단계, 및 인간화된 항체를 제조하기에 충분한 조건하에서 조립된 제1 벡터를 숙주에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체를 제조하는 방법.
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