TWI325013B - - Google Patents

Description

1325013 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係相關於一種新穎的篩選標記及其應用，、匕 -種可以應用在轉基因生物上的新穎篩選標記及其應用、。曰 【先前技術】 目前不斷的有新的轉基因作物及其相關食品， 傳統品種及食品在市場上銷售，基於消費者對基因改:食 品享有知的㈣，各國政府均已將基因改造生物 (genet丨cally modified organisms; GM〇)標示工作納入其基 因改造食品管理體系中。而歐盟國家向來對於gm〇產:^ 行之高標準風險評估與客觀科學的高科技檢測水準，Z 了 降低基因水平轉移的風險，並確保歐盟境内人體健康及環 保，歐盟於2001年4月通過2〇〇1/18/EC號指令，主要規範 GMO產品在歐盟境内的市場㈣。該項指彳規定凡gm〇 含置超過0.9 %之食品、種子或飼料在市場流通的任何階段 均須提出申請，審慎評估。而關於標識基因安全性之問題， 特別疋在對抗生素抗性基因，歐盟於2〇〇8年丨2月3 1將禁 止抗藥性基因使用於GM0產品上，以避免其將會對人類或 環境有不利的影響’保護人類與環境的安全。 美國疋世界上最大的GMO食品及飼料的出口國，於 2008年，歐盟將抗藥性基因使用於gM〇及其產品，加以設 限後，將壓迫美國及其他國家之從業人員，轉而採用非抗 藥性基因，作為植物基因轉形之篩選標記，因此非抗藥性 篩選標記，有相當高的需求性。 6 J^U13

基因改造植物是指利用”以基因改造技術處理的生物，， 所製造或生產的產物’利用分子生物與基因轉殖技術對生 物在基因層次上進行修改或重組。基因改造植物的發展， 主要源於基因工程技術的發展’而基因工程技術的關鍵在 於適當的篩選標記。篩選標記可區分為兩類：抗藥性與非 抗藥性。目前，植物的基因選殖技術，主要利用抗藥性、 抗殺草劑基因進行轉殖基因篩選。例如：植物常用之抗生 素藥物有：新黴素（neomycin)、康黴素（kanamycin)、 巴龍黴素（paramomycin)、G418、觀黴素（spectinomycin)、 鏈黴素、濕黴素B(hygromycin B)、平陽黴素（bleomyCin)、 腐草霉素（phieomycin)、磺胺類藥物（sulfonarnide)及氣擻素 (chloramphenicol)。藥物相似物、代謝中間產物的相似毒 物’例如：2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose)、甜菜驗經（betaine aldehyde)、S-胺乙基 L-半胱胺酸（S_amino ethyl L-cysteine)、4-甲基色胺酸（4-methyltryptophan)及滅殺除癌 錠（methotrexate)。 殺草劑藥物有：固殺草 (phosphinothricin)、嘉磷塞（glyphosate)、磺醯尿素類 (sulfonylures)、。米唾 _ 類（imidazolinones)、〇xynils、植物 毒素（gabaculine)及氰胺（cyanamide)。 以抗藥性及抗殺草劑基因來篩選，僅適用於一般的基 礎研究，但所轉形的外來基因與其連接之抗藥性篩選基 因，可能會發生基因流動的問題，影響生態平衡。或在消 化過程中由消化道水平轉移至其他致病微生物中，產生抗 藥性，致使抗生素治療失效，危害食用者的健康，使其安 1325013 錄多所疑慮。因此，目前科學家們致力發展出利用非抗 藥性基因，作為植物基因選殖時的篩選標記。目前常用的 基因有A·^山（木糖異構酶）、磷酸甘露醇異構酶）、 W以（β_葡萄醣醛酸苦酶）、&〇/(D_胺基酸氧化酶）、…（異戊 錯轉移酶）、卿22(異戊輯轉移酶）、〜/(，，根毛”外表型）、 刪（轉錄因子）、〇尺"（組胺酸激酶）。此外，利用植物激 素前趨物或特定的碳源、敗源作為筛選，也是利用非抗藥 性基因為篩選標記的篩選方式。 —目前已發表的非抗藥性筛選標記，例如D•胺基酸氧化 酶（D-胺基酸氧化酶），主要是利用選殖酵母菌的而w基 口拕配D-丙氨醆（D_alanine)作為特定的受質，利用轉 殖株與未轉殖株在型態上的差異來進行筛選，但是此種薛 選方式僅適用於對D-丙氨酸敏感的植物種類。而利用& rwhgmom的叮以基因作為篩選標記以d_木糖當作唯— 的奴源，進订轉殖株的筛選，但此種標諸基因僅可用於於 草、馬鈐薯以及番茄這三種缺乏木糖異構酶㈨ —_作物的基因改造物之㈣。另一方面，尚^ 用甘露糖（ma_Se)作為唯一的碳源，來進行轉殖株的筛 選’格配K d⑻基因作為蒒選標記。當植物分解甘露 糖產生甘露糖·6_磷酸（man議e-6-phosphate)時，由於缺乏 PMI因此無法將甘露糖轉換成果糖，導致甘露糖 < 碟酸大 =，：制了酿解作用’致使植物無法生長。但此種筛 堇適用於阿拉伯芬、大白菜及玉来等植物的基因 轉殖之師選。這此餘還古 、二師選方式所能使用的植物種類皆有所限 8 1325013 制’因此必需再開發其他種類的非抗藥性篩選標記。 【發明内容】 本發明的目的，係利用消旋化酶的生物轉換特性，催 化胺基醆之消旋化作用’轉換質子的移動，產生不同旋光 性’利用不同旋光性的氨基酸作為基因改造植物生長時的 抑制劑。 +為達成本發明的前述目的，本發明係相關於一種經分 耱離之基㈣選標記，其編碼包含SEQ id n◦•丨或其簡併序 列；較佳的是，該簡併序列與SEQ m N〇〗具有6⑽ 99%的相似性。 較佳的是，該核酸分子轉錄SEQ ID N〇 4蛋白 的是，SEQ ID NO. 4蛋白具有離胺酸消旋酶的活性。

本發明另相關於一種重組載體，其係包含如申請專利 範圍第1項所請之基因㈣標記，及—調控較佳的 是，該調控序列為CaMV 3SS ( caulin〇wer邮⑽ promoter) 〇 本發明另相關於一種含有前述之重組載體之微生物； 較佳的是，該微生物係為農桿菌或農桿根瘤菌或大腸桿 菌；更佳的是，該微生物為寄存於食品工業發展研究所2 寄存編號BCRC 940520之大腸桿菌。 本發明另相關於一種生產離胺酸消旋酵素的方法， 係包括培養前述所請微生物以分離純化離胺酸消旋酵素其 較佳的是，該微生物係為大腸桿菌。 ' 較佳的是，分離純化之方法係以管桎層析進行。 9 本發明另相關於一種生產 1 生物的方法，其係包括： “述所請之筛選標記之 提供含有將申請專利範圍第 共同培養； / '作為氮源的M S培養基 在含有D-或L·離胺酸作為氮 成功的4Λ ^ 。’丞上，師選轉殖 ，’’田I或组織或癒傷組織。 卓父佳的是’微生物俜為 是，該微生物為寄Λ1 及農桿根瘤a;更佳的 BCRC_: 業發展研究所之寄存編號 BCRC 940520之大腸桿菌。 較佳的是，該生物細胞盆俜 敏感之細胞。 為對L，胺酸或㈣胺酸 較佳的是，培養基係為MS培養基。 本發明另相關於—種且右 所 楂〇有SEQ ID NO. 4序列之蛋白 貝，其表現離胺酸消旋酵素之活性。 較佳的是，該蛋白質之最適反應緩衝液為緩衝 液(pH 7_。0至9.0)，更較佳的是，該蛋白質之最適反應溫度 為 2 5 〜40°C。 較佳的是，該蛋白質在含有二價金屬離子之溶液下展 現酵素活性；最佳的是’該蛋白質在含有2mM選自包含

Zn2+、Co2 +及Mg2 +所組成之二價金屬離子族群的溶液下展現 酵素活性’且其活性大小依序為c〇2+ >Mn2+〉Ni2+。 【實施方式】 基因改造植物是指利用”以基因改造技術處理的生物” ==的產⑼，利用分子生物與基因轉殖技術對生 主要源於基因工程技術改物的發展’ …^ 技術的發展’而基因工程技術的關鍵在 ϋ w 己了“為兩卖員：抗藥性與非 抗桌性。目前，植物的基因 抗殺草#1基因進行I帛選。 ， 利用抗藥性、 但所轉形的外來基因與其連接之抗藥性薛選基因，可 志會發生基因流動的問題影響生態平冑，或在消化過程中 由消化道水平轉移至其他致病微生物中，1生抗藥性，致 =生素治療失效’危害食用者健康，使其安全性多所疑 〜'。因此，需尋找另-種非抗藥性基因作為筛選標記 替代藥物。 本發明係利用由土壤多元基因體基因庫所選殖出之〜· 基因’搭配D·或L·離胺酸為特定氮源’作為植物基因選殖 的篩選標記。|筛選標記可應用在菸草的基因轉殖，未來 尚可應用到其他對L_離胺酸（L.lysinem D•離胺酸（D々si叫 敏感之生物或植物種類。 本發明的主要目的，係利用消旋化酶（race_e)的生物 轉換特性，催化胺基酸之消旋化作用，轉換質子的移動， 產生不同&光性，制不同旋光性的氨基酸作為基因改造 植物生長時的抑制劑。目前消旋化酶可依照其對於吡哆醛 5’-磷酸鹽（pyndoxal 5，_ph〇sphate ; pLp)的需求分為 pLp•非 依賴型以及PLP-依賴型兩類，其中pLp_非依賴型消旋化酶 需要外加二價金屬離子，作為schiff *(schiff 協助質 1325013 子的轉移，此類消旋化酶在其活性區皆有一對半胱氨酸 (cysteine)鹼基，作為共軛酸鹼對。而pLp_依賴型的消旋化 酶需要PLP協助質子的轉移，催化消旋化反應進行。 利用七草（Domin.)為模式植 物，以平板生長測試，分析菸草種子對不同旋光性氨基酸 之敏感性，結果顯示D〇min種子可以生長 在含有D-離胺酸的平板上，但L_離胺酸卻對菸草的生長有 所抑制，因此可利用離胺酸消旋化酶的生物轉換特性，來 轉換離胺酸的鏡像結構，利用消旋化作用，將^離胺醆轉 換為D-離胺酸，作為轉基因植物生長時的氮源，以離胺酸 消旋化酶基因取代抗藥性基因，作為植物基因選殖時的筛 選標記。 Η職g等人（1958)於p⑼_㈣如❿，凡•以 J ^ »

mirabilis, P. americanus, P. para-americanus, P. rettgeri, P

spingidis，P. inconstans，Escherichia anind〇Uca 以反，e 等菌體中，發現其具有離胺酸消旋化酶（離胺酸消旋 酵素，Ly〇的催化活性，此酵素具有消旋化D或l_型離胺 酸旋光性之能力，能將經由化學法所形成的d，l_型離胺 酸，進行生物轉換以增加L_型離胺酸的含量。惟未曾由上 述菌體中，選殖出/少r基因。 本發明係利用土壤多源基因體萃取方法，由土壤樣品 中獲得基因體DNA，搭配高複製套數的載體，建立土壌多 源體基因庫，選殖出基因，並將所選殖之基因置入大腸 桿菌中，該大腸桿菌係於96年5月16曰寄存於食品工業 丄 發展研究所，寄在说％ & 吁存編唬為BCRC 940520。利用Lyr生物轉 換特性’來轉換雜吐缺k & 、胺文的紅光性，作為宿主之氮源，替代 抗藥性基因，竹盔I m .re ’’’’ 土因、殖時之篩選標記，搭配不能利用 D-離胺酸作為氣, μ ··“ ·’’、、·.田囷作為宿主細胞，以基因作為基 因選殖的篩選桿巧 土 知屺使轉形菌株能生長於以D-離胺酸作為 氮源的培養基I· , m lL丄 因此本項發明有其原創性。 本發明為新的@ έ ^ Α 、 的師選糸統，適用於基因改造植物的基因 、殖透過對於特定氮源的生長需求，即可進行轉殖株的 筛選；而且由土壤多源基因體選殖出&基因，其轉譯出的 離胺酉九/肖紅化酶具有相當好的轉換效率，利用其生物轉換 特I·生替代k藥性基因，作為基因選殖時之筛選標記。另 方面刀析基因轉殖後的菸草種子對不同旋光性氨基酸 之敏感性’並與野生型菸草種子相比較，實驗結果顯示， 其發芽速度'植物體質量、葉片》目與根的長度上並無顯 著差異。因此本發明所使用的基因，可搭配D或L·離 胺鲅作為特疋的欠質，利用轉殖株與未轉殖株在型態上的 差異來進行筛選，使用於對0_或L_離胺酸敏感的植物種 類，目前已成功的使用於菸草之基因選殖上，未來尚可使 用在一些對L-離胺酸或D_離胺酸敏感之生物或植物種類。 本發明係利用土壤多源基因體方式選殖出離胺酸消旋 化酶（離胺酸消旋酵素，Lyr)，此酵素對離胺酸具有消旋 化之能力，利用此能力轉換離胺酸鏡像結構，作為宿主之 氮源或必需營養成分，替代抗藥性基因，作為基因選殖時 1325013 之蒒選標記。本發明利用Lyr的生物轉換系統，將d。 離胺酸轉換成相對應之氨基酸。所形成的 或L_ 卜 u双日7虱基酸可作為宿 主之氮源，且宿主細胞不需突變處理成營養缺陷株 進行轉殖株的筛選，以應用於基因改造植物的轉殖系统。° 本發明係利用由土壞多元基因體中分 丁* 甘站巧> , 出之^^基因， ，、轉#出的Lyr具有轉換離胺酸鏡像結構之活性，催J 型或L型離胺酸之消旋化作用’其作用在不對稱碳原子化上D 轉換質子的位置，改變氨基酸之旋光性。 將L-離胺酸與本 發明之 Lyr，在 3(TC，5〇 mM T i 认成从 緩衝液pH值為8.0 的條件下反應，經作用16小時後，酵素的活性達到最高， 轉換率可達36%。本發明所使用的Lyr，包含純化的酵素， 含有此基因的基因選殖菌體或其粗萃取液。可作為反庠的 基質分別包含了 D-與L•離胺酸，本發明由土壤多源基因體 選殖出⑼基因，其轉譯出的離胺酸消旋酵素具有相當好的 轉換效率’利用其生物轉換特性，替代抗藥性基因，作為 基因選殖時之筛選標記，能有效率的轉換這些基質之鏡像 結構，而經由消旋反應所形成的氨基醆可作為宿主之氮 源’替代抗藥性基因’作為基因選殖時之篩選標記。 主要是利用土壤多源基因體選殖出&基因，將其選殖 在丁卜载體上作為筛選標記，利用35S啟動子表現⑼基因， 並除去載體上的抗藥，1·峰其 几樂’生基因，使用農桿菌法將攜有⑼基因 的τ卜載體轉殖入模式植物·於草的癒傷組織中。搭配以 或L-離胺酸作為氮源的_培養基進行培養，利用轉殖株 與未轉殖株在生長上的差里步― 差/、來進订師選，已成功獲得轉殖 1325013 株，以南方轉潰雜交法進行確認轉殖植株中含有/少〃基因訊 號，並分析基因轉殖後的菸草種子對不同旋光性氨基酸之 敏感性，並與野生型菸草種子相比較，實驗結果顯示，其 發芽速度、植物體質量、葉片數目與根的長度上並無差異。 確定汐"基因可作為菸草在進行基因轉殖時之篩選標記，未 來可擴及其他農作物之應用。

本發明將以下述實施例進一步說明本發明之技術内 容，然而所列之實施例僅作說明之用，而無意於限定本發 明之範圍。任何習知該項技術人士，皆可根據本發明及具 體實施例所述，在不偏離本發明精神及範圍下，作任意修 飾及更改，惟仍應涵括於本發明之範圍内。 實施例： 實施例一：Lyr酵素基因的選殖

Lyr酵素基因表現載體之構築 由油污田中採集受污染之土壌，抽取土壤DNA。經純 化後，將所得之DNA片段，為SEQ ID NO. 1，其相對應之 胺基酸序列為SEQ ID NO. 4。 構築在Epicentre公司之pCCIFOS載體上，完成多源 基因庫（metagenomic library)製備。根據目前已發表的11種 消旋化酶基因，設計退化性引子，分別為SEQ ID NO. 2及 SEQ ID NO. 3。 引子 1: 5’GCGGGATCCATGGCNCAYACNGGNCGN 3, (SEQ ID NO. 2) 弓I 子 2: 5’GACCCAAGCTTTTACGNTTRCNGGNTN 3, 15 1325013 (SEQ ID NO. 3) 其中，引子中所表示之代號代表如下：N表示可為丁、 C、A、G所取代；Y表示可為T、C所取冲·ρ主 , 表示可為Α、 G取代。 利用所萃取的土壌微生物多源基因體DNA做為模板， -使用PCR方法增幅DNA片段，做為篩選特殊消旋化酶基因 的探針，其中探針序列係與SEQ ID NO. 1相同。 並以此探針自多源基因庫中篩選出具有消旋化酶基因 的菌株。將所選殖的基因構築於表現載體上，並送入宿 主細胞£. JM109内，抽取質體以電泳分析加以確認。 重組蛋白質之大量表現 將含有Lyr酵素基因之表現載體的菌株，以(最 終濃度為〇·1〜1 mM)誘導蛋白質大量表現。將菌液以12,〇〇〇 rpm離心10分鐘，以菌液體積約1/1〇量的TE緩衝液懸浮 經離心沈澱後的[cd/ ’加入SDS_PAGE兩倍樣本緩衝液 混合均勻，以100°C加熱約1〇分鐘後，進行蛋白質電泳分 析。 蛋白質之純化 ' 將誘導過後之菌液，以3,〇〇〇 rpm離心丨5分鐘，倒去

上清液，回收菌體。加入50 mM Tris-HCl (pH8.0)緩衝液20 ml ’劇烈震盪清洗菌體。再以相同條件離心，倒掉上清液 後，加入相同之緩衝液丨〇 m丨，以回溶菌體。利用超音波磨 碎機打破細胞，隨後置於4。〇離心機以n，5〇〇rpm離心2〇 刀雀里。取上清液，以0.45 μηι的濾膜過濾後，通過含N丨·NTA 16 1325013 樹脂（Qiagen)的管柱回收純化蛋白。 酵素活性及生化性質的分析 酵素活性的偵測是利用HPLC方法，在彻nm波長下 ^產物的變化量’·酵素反應的緩衝液為50 mM THs-HCi 緩衝液（pH8.0)、苴中包含i〇 其奸 Λ ，、丫 已> 3 m!vi 丞貝、〇 5 mM c〇cl2 以及 適當量之純化酵专，於301下月雁1 ^ U卜汉4 1小時，之後再置於沸 j中作用5分鐘，以終止酵素反應，再搭配Cr〇wnpak cr( + ) t柱以HPLC方法分析酵素活性，得知此…酵素將d_離 胺酸轉換為L-離胺酸之轉換率為15%，將L_離胺酸轉換為 D_離胺酸之轉換率為36.1% (表一）。 I 一 . Lyr酵素對於離胺酸之鏡像結構的轉換能力 " " ^ ~~-~~-'- 離胺醆消旋酵 轉換能力（％) 素 L -離胺酸轉換成D -離胺酸轉換成 _____D -離胺酸__L -離胺酸

Lyi 36.1 15.0 酵素反應最適pH值的分析

將L-離胺酸（30 mg/mi)容於不同PH值的緩衝溶液中， 包括··檸檬酸-Na2HP〇4(pH2.6〜7.6)、磷酸鈉緩衝液 (PH6.0〜8.0)、Tris_HCl (PH7.卜8.9)以及 glycine Na〇H (PH8.6〜10.6) ’加入〇·5 mM CoCl2以及適當量之Lyr酵素， 於3(TC下反應1小時，再置於沸水中作用5分鐘，以終止 酵素反應，隨後進行酵素活性分析。由分析結果得知，請 17 1325013 序列表 < 110> 許文輝/ Hsu，Wen-Hwei 陳恰潔/ Chen, I-Chieh <120>新穎基因篩選標記及其應用 <130〉 <160> 4 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 1182 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉合成序列 <400〉 1

atggcgcata ctggccgtat gttcaaaatc gaagctgctg aaatcgtcgt ggcgcggctg 60 ccgctcaagt tccgctttga aacgagtttc ggggtgcaga cccacaaggt ggtgccgctg 120 ctcattctcc acggcgaagg cgtgcagggc gtcgccgagg gcaccatgga agcgcggccc 180 atgtaccgcg aggaaacgat tgccggggca ctggacctgc tgcgcggcac ctttttgccc 240 gccatcctgg ggcagacctt cgccaacccc gaagcggtga gcgacgcact cggcagctac 300 aggggcaacc gcatggcgcg ggcgatggtg gaaatggcgg cctgggacct ctgggcgcgc 360 acgctggggg tgccgctcgg aacactactc ggcggtcaca aggagcaggt ggaggtgggg 420 gtcagcctcg gcattcaggc ggacgagcag gcgacggtgg acctcgtgcg ccggcatgtc 480 gagcagggct accgccgtat caaactcaag atcaaacccg gctgggacgt gcagccggta 540 cgcgcgaccc gcgaggcctt ttatgttgaa tacgctgatt gtgggtgcca gcggctacgc 600 tggcgcagag ctagtgacct atgtaaatcg ccatccgcat atgaacataa ccgctttgac 660 tgtttcagcg caaagcaacg atgcgggaaa gttaatctcc gatttgcatc cgcagctaaa 720 aggcatcgtc gatctgccgt tgcagccgat gtcggatatc agcgagttaa gcccaggggt 780 ggacgtagtg tttctcgcca ccgcccacga agtaagccac gatttagcgc cgcagtttct 840 cgaagcgggc tgcgtggtgt tcgacctttc cggcgcgttt cgtgtcaacg acgccacctt 900 ctaagaaaaa tattacggct ttacccatca tacccggaac tgttggaaca ggcagcctac 960 1325013

ggtctggcgg agtggtgcgg taataaatta aaagaagcga atttgattgc ggtgccgggc 1020 tgttatccga cggcggcaca gctggcgctg aaaccgttga ttgatgccga tcttcttgac 1080 ctcaatcagt ggccggtgat caacgccacc agcggcgtga gcggtgcagg gcgtaaagcg 1140 gccatttcaa acagcttttg tgaagttagc ctgcaaccgt aa 1182 <210〉 2 <211> 27 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220 <223> 合成序列 <220> <221> misc一feature <222> (15):.(15) <223> η 爲 a, c，g， 或t <220 <221> misc feature <222> (21)..(21) <223> n 爲 a，c; g， 或t <220> <221> misc一feature <222> (24)..(24) <223> n 爲 a，c，g, 或t <220> <221> misc_feature <222〉 (27).(27) <223> n 爲 a，c, g， 或t <400> 2 gcgggatcca tggcncayac nggncgn <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <220 <223> 合成序列 1325013 <220 <221〉 mi sc一feature <222> (17)..(17) <223> n 爲 a，c，g， 或t <220 <221> misefeature <222〉 (22)..(22) <223> n 爲 a，c，g， St <220〉 <221〉 misc_feature <222〉 (25)..(25) <223> n 爲 a，c，g， 或t <220> <221> misefeature <222> (27)..(27) <223> n 爲 a，c，g， 或t <400〉 3 gacccaagct tttacgnttr enggntn <210> 4 <211〉 393 <212> PRT <213> 人工序列 <220〉 <223> 合成序列 <400〉 4

Met Ala His Thr Gly Arg Met Phe Lys lie Glu Ala Ala Glu He Val 1 5 10

Val Ala Arg Leu Pro Leu Lys Phe Arg Phe Glu Thr Ser Phe Gly Val 20 25 30

Gin Thr His Lys Val Val Pro Leu Leu He Leu His Gly Glu Gly Val 35 40 45

Gin Gly Val Ala Glu Gly Thr Met Glu Ala Arg Pro Met Tyr Arg Glu 50 55 60

Glu Thr lie Ala Gly Ala Leu Asp Leu Leu Arg Gly Thr Phe Leu Pro 65 70 75

Ala He Leu Gly Gin Thr Phe Ala Asn Pro Glu Ala Val Ser Asp Ala 1325013

85 90 95 Leu Gly Ser Tyr Arg Gly Asn Arg Met Ala Arg Ala Met Val Glu Met 100 105 110 Ala Ala Trp Asp Leu Trp Ala Arg Thr Leu Gly Val Pro Leu Gly Thr 115 120 125 Leu Leu Gly Gly His Lys Glu Gin Val Glu Val Gly Val Ser Leu Gly 130 135 140 lie Gin Ala Asp Glu Gin Ala Thr Val Asp Leu Val Arg Arg His Val 145 150 155 Glu Gin Gly Tyr Arg Arg lie Lys Leu Lys lie Lys Pro Gly Trp Asp 165 170 175 Val Gin Pro Val Arg Ala Thr Arg Glu Ala Phe Tyr Val Glu Tyr Ala 180 185 190 Asp Cys Gly Cys Gin Arg Leu Arg Trp Arg Arg Ala Ser Asp Leu Cys 195 200 205 Lys Ser Pro Ser Ala Tyr Glu His Asn Arg Phe Asp Cys Phe Ser Ala 210 215 220 Lys Gin Arg Cys Gly Lys Val Asn Leu Arg Phe Ala Ser Ala Ala Lys 225 230 235 Arg His Arg Arg Ser Ala Val Ala Ala Asp Val Gly Tyr Gin Arg Val 245 250 255 Lys Pro Arg Gly Gly Arg Ser Val Ser Arg His Arg Pro Arg Ser Lys 260 265 270 Pro Arg Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Leu Arg Gly Val Arg 275 280 285 Pro Phe Arg Arg Val Ser Cys Gin Arg Arg His Leu Leu Arg Lys lie 290 295 300 Leu Arg Leu Tyr Pro Ser Tyr Pro Glu Leu Leu Glu Gin Ala Ala Tyr 305 310 315 Gly Leu Ala Glu Trp Cys Gly Asn Lys Leu Lys Glu Ala Asn Leu lie 325 330 335 Ala Val Pro Gly Cys Tyr Pro Thr Ala Ala Gin Leu Ala Leu Lys Pro 340 345 350 Leu lie Asp Ala Asp Leu Leu Asp Leu Asn Gin Trp Pro Val lie Asn 355 360 365 Ala Thr Ser Gly Val Ser Gly Ala Gly Arg Lys Ala Ala lie Ser Asn 370 375 380 160 240 320 4 1325013

Ser Phe Cys Glu Val Ser Leu Gin Pro 385 390

Claims (1)

1325013 十、申請專利範圍 月丨广日修正替換頁| 1 . 一種經分離之基因篩選標記，其包含seqidn〇」 或其簡併序列，且編碼一具有離胺酸消旋酶的活性之蛋白 質，其中該簡併序列與SEQIDNO. 1具有60〇/〇至99%的相似 性0 2 ·如申請專利範圍第丄項所述之經分離之基因篩選 標記’其中該蛋白質具有SEQ ID NO. 4所示序列。 3 .如申請專利範圍第X項所述之經分離之基因篩選 標§己’其係由SEQ ID NO. 1所示之核酸序列所構成。 4 . 一種重組载體，其係包含一如申請專利範圍第工 至3項中任一項所請之基因篩選標記’及一調控序列。 5 .如申請專利範圍第4項所述之重組載體，其中該 調控序列為CaMV 35S promoter) ° cauliflower mosaic virus β.—種含有申請專利範圍第4至5項任一項所述之 重組載體之微生物。 7 .如申請專利範圍第6項所述之微生物，其係為農 桿菌或農桿根瘤菌。 8·如申請專利範圍第6項所述之微生物’其係為寄 存編號BCRC 940520之大腸桿菌。 9.一種生產離胺酸消旋酵素的方法，其係包括培養 申請專利範圍第6 8項任-項所請微生物以分離純化離 胺酸消旋酵素。 1 1325013 其中該微 細胞的方 1 0 ·如申請專利範圍第9項所述之方法 生物係為寄存編號為BCRC 940520之大腸桿菌。 1 1 · 一種生產含有基因篩選標記之植物 法’其係包括： 將含有申請專利範圍第6至8項中任一項所請之微生 物導入對D-離胺酸或L-離胺酸敏感的植物細胞 T ’搭"配以 D-或L-離胺酸作為氮源的培養基共同培養；以及 在含有D·離胺酸或L-離胺酸作為氮源的培養其上，筛 選轉殖成功的植物細胞或組織或癒傷組織。 1 2 . —種具有SEQ ID NO. 4序列之蛋白質，其表現 離胺酸消旋酵素之活性。 1 3 .如申請專利範圍第1 2項所述之蛋白質，其中 該蛋白質之最適反應緩衝液為Tris-HCl緩衝液。 1 4 ·如申請專利範圍第1 2項所述之蛋白質，其中 該蛋白質之最適反應溫度為25〜40°C。 1 5 ·如申請專利範圍第1 2項所述之蛋白質，其中 該蛋白質在含有二價金屬離子之溶液下展現離胺酸消旋酵 素之活性，其中該二價金屬離子係選自於由下列者所構成 之族群：Zn2+、Co2+、Mg2+、Mn2+以及犯2+。 1 6 ·如申請專利範圍第1 2項所述之蛋白質，其中 該蛋白質在含有2mM選自包含C〇2+、Mn2+以及Ni2+所組成 之二價金屬離子族群的溶液下展現酵素活性，且其活性大 小依序為 Co2+ > Mn2+ > Ni2+。 2 1325013 十 圖式 公告本 〇50 mM檸檬酸-ΝαΗΡΟ,緩衝液，pH 4.0-6.5 ▲ 50 mM Tris-HCl 緩·，pH 6.5-9.0 □ 50 mM K2HP04-KH2P04^M > pH 6.0-8.0 #50 mM glycine-NaOH 緩衝液，pH 8.5-10.5

pH 第一圖 月/#修正替換頁 〇 50 mM Tris-HCl 緩衝液(ρΗ8·0)、10 mM 的 L-離 胺酸、0.5 mM以邙以及Lyr蛋白質

第二圖