TWI314580B

TWI314580B - Chimeric infectious nda clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof

Info

Publication number: TWI314580B
Application number: TW091135955A
Authority: TW
Inventors: Meng Xiang-Jin; Fenaux Martijn; G Halbur Patrick
Original assignee: Virginia Tech Intell Prop; Univ Iowa State Res Found Inc
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2002-12-12
Publication date: 2009-09-11
Also published as: AU2011200843A1; SI1487483T1; CO5590938A2; FR11C0014I1; CY1111167T1; CY2011004I1; PL215058B1; EP1487483A2; KR101014544B1; MXPA04005364A; CN1620310B; CN1620310A; ATE487490T1; EP2264050A3; CN103536911B; AU2008202333B2; US7276353B2; EP1487483A4; ES2355814T3; EP2263690A2

Description

1314580 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、內容、實施方式及圖式簡單說明) (一）發明所屬技術領域發明領域本發明係關於作爲疫苗是有用的之感染性豬環狀病毒型-1 (PCV1)及型2(PCV2) DNA選殖株、嵌合型PCV1-2感染性DNA選殖株，以及衍生自嵌合型DN A選殖株之活嵌合型病毒。

(二）先前技術在此說明書中引用之所有專利及公告案在此皆完整併 1314580 入參考文獻中。豬環狀病毒（PC V)原始分離自豬腎臟細胞株PK-15(1. Tischer e t α/.，” A very small porcine virus with circular single-stranded DNA?" Nature 295:64-66 (1982); I. Tischer e t al.，"Characterization of papo vavirus and picomavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines," Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2): 153-167 (1974)) 之細胞培養污染物。PC V是一種小的二十面體無封套病毒，含有約1.76kb之單股環狀DNA基因體，PCV被分類在環狀病毒科（Circoviridae)，其由3個其他動物環狀病毒（雞貧血病毒（CAV)、鸚鵡瞻及羽毛病病毒（psittacine beak and feather disease virus(PBFDV))及最近自韻子中發現之古氏環狀病毒（Columbid circovirus ; CoCV))，以及3個植物環狀病毒（香蕉叢簇頂點病毒（banana bunchy top virus )、椰子葉腐爛病毒（coconut foliar decay virus)及地下苜菅萎縮病病毒（subterranean clover stunt virus))所組成（Μ· R. Bassami e t al., "Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses， and chicken anemia virus," Virology 249:453-459 ( 1 998); J. Mankertz e t al., "Transcription analysis of porcine circovirus (P C V)," Virus Genes 16:267-276 (1998); A. Mankertz et al., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV)，a new circovirus from pigeons,

Arch. Virol. 145:2469-2479 1314580 (2000); B. M. Meehan et al., "Sequence of porcine circovirus D N A : affinities with plant circoviruses," J . Gen. Virol. 78:221-227 ( 1 997); B. M. Meehan e t al., "Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs," J. Gen. Virol. 79:2171-2 1 7 9 ( 1 9 9 8); D. Todd e t al., "Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes," Arch. Virol. 1 1 7:1 29 - 1 3 5 ( 1 99 1 ))。先前所認定之3種動物環狀病毒（PCV，CAV, and PBFDV)各自與其他兩種並不享有核苷酸序列同源性或抗原決定位（M· R. Bassami ei α/·, 1 99 8, supra, D. Todd e t al., 1991，supra) 1 最近鑑定出之 CoCV 基因體則與PCV享有約40%核苷酸序列一致性（A. Mankertz et al., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons," Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000))。最近，一種新穎的人類具有環狀基因體之環狀病毒，被指名爲輸血傳染病毒或TT病毒 (TTV)，與輸血後之肝炎有關之個體中鑑定出（H. Miyata " al., "Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded D N A genome of TT virus, the first human circovirus，” J. Virol. 73:3 5 82-3 5 8 6 ( 1 999); T. Nishizawa et al,, nA novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology，’’ Biochem Biophys. Res· Commun. 241:92-97 (1997))。此夕t，人類類 1314580 似TTV迷你病毒（TLMV)自正常血液捐贈者中被鑑定出來（P. Biagini e t al., "Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates," J. Gen. Virol. 82: 379-383 (2001); K.

Takahashi et a 1., "Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus,” Arch. Virol. 145:979-93 (2 00 0))，且第三個新穎人類環狀病毒，已知爲SEN病毒 (SENV)，亦自具輸血後肝炎之人類中鑑定出（T. Umemura e t al., "SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis," Hepathology 3 3:1 3 03 -1 3 1 1 (200 1 ))。人類TTV及TLMV之基因體結構相似於CAV (P. Biagini et al., 2001, supra; H. Miyata et al., 1 999, ywpra; K. Takahashi ei a/·, 2000，supra)，儘管在各種動物種類中，包括人類、鼠、牛及豬中，皆發現有抗PCV之抗體（G. M. Allan e t al., "Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus," Vet. Immunol. Immunopatho 1. 43:3 57-3 7 1 ( 1 994); G. C. Dulac and A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-1 5 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs," Can. J. Vet. Res. 53:43 1 -4 3 3 ( 1 9 8 9); S. Edwards and J. J. Sands, "Evidence of circovirus infection in British pigs," Vet. R e c . 134:680-1( 1994); J. C. Harding and E.G. dark, 1314580 11 Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome ( P M W S ),11 Swine Health and Production 5:20 1 -203 (1 997); R. K. Hines and P. D. Lukert，"Porcine circovirus; a serological survey of swine in the United States,f, Swine Health and Production 3:71-73 (1995); G. P. Nayar e t al.， "Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses，'’ Can. Vet. J. 40:277 -27 8 ( 1 9 99); I. Tischer etal.，"Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms," Arch. Virol. 140:737-743 ( 1 9 9 5); I, Tischer e t a Ϊ ” "Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans，mice, and cattle，" Arch· Virol. 140:1427-1439 (1995))，但關於PCV在此等動物種類中之病理機制則所知甚少，豬以衍生自ΡΚ· 1 5細胞之 PCV所作之實驗感染並不會產生臨床疾病，因此，此認爲此病毒對豬無病原性（G. Μ. Allan " d.，"Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material," Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995); I. Tischer e t al., "Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus," Arch. Virol. 91:27 1 -276 ( 1 986))，而將衍生自受污染的 PK-15細胞株之無病原性PCV指名爲豬環狀病毒第1型或 PCV1。首先被描述於1 9 9 1年之斷奶後多系統消耗症候群 -10- 1314580 (P M W S ) (J. C . H a r d i n g a n d E · G · C 1 a r k, 1 9 9 7，5· wr α) ’ 爲一種逐漸增加並廣泛於斷奶仔豬之複合疾病’在潛藏嚴重經濟衝擊威脅之養豬業間，其已成爲對抗pc V2 ( P M WS之原始傳染物質）所急迫發展之疫苗。PMWS主要影響5-1 8週齡的豬，PMWS之臨床症狀包括漸進性體重減輕、呼吸困難、呼吸迫促、貧血、下痢及黃疸。在U.K.之一些複雜病例中，死亡率可由1%-2%而高至40%之間變化（M. Muirhead， "Sources of information on PMWS/PDNS," Vet. Rec_ 150:456 (2002))。PMWS之顯微病變特徵包括肉芽腫性間質性肺炎、淋巴腺病、肝炎及腎炎（G. M. Allan and J. A. Ellis， "Porcine, circoviruses: a review，" J. Vet. D i agn. Invest. 12:3 - 1 4 (2000); J. C. Harding and E.G. Clark, 1 997, wpra)。在加拿大、美國已鑑定出PMWS (G· M· Allan " a/·， ’’Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes," Vet. Rec. 142:467-468 (1 9 9 8); G. M. Allan e t al.，"Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe，’’ J. Vet. Diagn. Invest. 1 0:3 - 1 0 ( 1 998); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000， supra; J. Ellis et al., "Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome,1' Can. Vet. J. 39:44-51 (1998); A. L. Hamel et al., "Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs，” J. Virol. 72:5262-5267 (1 9 9 8); M . K i up e 1 e t al ·，"Circovirus- 1314580 like viral associated disease in weaned pigs in Indiana，" Vet. Pathol. 3 5:3 0 3 - 3 07 ( 1 99 8 ); R. Larochelle et aL, "Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR，’’ Vet. R e c . 145:140-142 (1999); B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov e t al"Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with post weaning multi systemic wasting syndrome，” J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 ( 1 998)), most European countries (G.M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus- like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe，” J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra\ S. Edwards and J. J. Sands， 1994， supra·， S. Kennedy e t al ·， "Porcine circovirus infection in Northern Ireland，” Vet· Rec. 142:495-496 (1 9 9 8); A. Mankertz e t al ·，"Characterization of PCV-2 isolates from Spain，Germany and France，" Virus Res. 66:6 5 -77 (2000); C. Rosell e t aL，"Identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome. Vet. Rec. 146:40-43 (2000); P. Spillane e t al ” "Porcine circovirus infection in the Republic of Ireland," Vet. Rec. 143:511-512 (1998); G. J. Wellenberg e t al.， "Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of p o s t -weaning multisystemic wasting syndrome in the -12- 1314580

Netherlands," Vet. Quart. 22:167-72 (2000)) and some countries in Asia (C. Choi et al., "Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Korean pig： detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polymerase chain reaction," J. Vet. Diagn. Invest. 12:151-153 (2000); A. Onuki e t al., "Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan，" J. Vet. Med. Sci. 61:1119-1123 (1999))。PMWS 可能已對世界各地養豬業造成嚴重經濟衝擊。 PMWS之原始傳染物質爲PCV之病原株，其被指名爲豬環狀病毒第 2 型或 PCV2(G. M. Allan ei fl/·, "Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes," Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-1 0 (1998); G. M. Allan e t al., "Isolation and characterisation of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland," Vet. Microbiol. 66:1 1 5-23 ( 1 999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra·, J. Ellis et al., 1 99 8, supra; A. L. Hamel et al., 1998, supra·, B. M. Meehan et al., 1 9 9 8, supra; I. Morozov αΛ，1998, swpriO，已決定PMWS相關的PCV2之完整基因體序歹U (M. Fenaux et al., "Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning -13- 1314580 multisy stemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2，" J. Clin. Microbiol. 38:2494-503 (2000); A. L.

Hamel et al., 1 99 8, supra·, J. Mankertz et al., 1 998, supra·, B. M. Meehan et al., 1997, supra; B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., 1 99 8, supra) ° PCV1在豬中是無所不在的，但對豬並無病原性，相反地，基因上相關之PC V2則爲病原性的，並在豬中可引起 PMWS。序列分析顯示PMWS相關之PCV2與無病原性PCV1 只享有約75 %核苷酸序列一致性。無病原性PCV1及病原性 PCV2之ORF2基因皆編碼主要的免疫生成性病毒衣殼蛋白質（P. Nawagitgul e t al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2 002); P. Nawagitgul e t al., "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 8 1:2 2 8 1 -22 87 (2000))。在傳統豬隻中首先嘗試接種PCV2以產生臨床PMWS是不成功的（M. Balasch ei α/·，"Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multi systemic wasting syndrome," J. Comp. -14- 1314580

Pathol. 121:139-148 ( 1 999); M. Fenaux et al,， "Cloned

Genomic D N A of Type 2 Porcine Circovirus (P C V - 2) Is Infectious When Injected Directly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinical Disease, Virus Distribution, and Pathologic Lesions，” J. Virol. 76:541-551 (2002))。在無菌（gnotobiotic)豬隻及傳統豬隻中，以自然發生之PM WS豬中得到的組織均質物以及以細胞培養增殖的PC V2產生臨床PMWS實驗重現之混合結果。在無菌（SPF)豬及剝奪初乳和剖腹產豬隻中以PC V2及豬小病毒（parvovirus (PPV))共同感染產生臨床PMWS(G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus，" J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); S. Krakowka et al., "Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multi systemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus," Vet. Pathol. 37:254-263 (2000))，以及在接種PC V2之無菌豬隻，當其免疫系統以在不完全佛氏佐劑中之血藍質（keyhole hemocyanin)來活化時，無菌豬會產生臨床症狀（S. Krakowka e/d., "Activation ofthe immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2)，” Vet. Pathol. 38:3 1-42 (200 1 ))。在剖腹產豬及剝奪初乳之豬隻（CD/CD)中單獨接種PCV2 1314580 亦可產生臨床症狀（P. A. Harms " α/.，"Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circo virus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus，1* Vet. Pathol. 38:528-5 3 9 (200 1 ))，以及在傳統豬中以PCV2及豬小病毒 (PPV)或豬繁殖及呼吸道症候群病毒（PRRSV)共同感染時亦可產生(A. Rivora e t al,， "Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2，" J. Virol. 76: 3232-3239 (2002))。在 PRRSV/PCV2 共同感染之情形，PMWS 之特徵病理徵候如淋巴消耗、肉芽腫性炎症及壞死性肝炎會被PCV2誘導，但不會被PRRSV誘導 (P. A. Harms et aL, 200 1，心;然而，臨床PMWS在單獨感染PCV2之無菌豬中不會產生（G. M. Allan fl/.，"Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (P C V 2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421 -2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation，J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan e t al ” "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine -16- 1314580 circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 12 1:1 -1 1 (1 999); M. Balasch et aL·, 1 999, supra; J. Ellis et a l.，11 Reproduction of lesions of postweaning multi systemi c wasting syndrome in gnotobiotic piglets,” J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); S. Kennedy et al. ^ "Reproduction of lesions of postweaning multisy stemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus" J . Comp. Pathol. 122:9-24 (2000); S. Krakowka et al., 2001, supra; S. Krakowka et al ·，2000，supra; R. M. Pogranichny y et al ·， "Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection," Viral. Immunol. 13:143-153 (2000))。在此等硏究中使用之接種病毒來自與自然發生PMWS之豬的組織均質物或在PK-15細胞培養之病毒(G. M. Allan e t a l.， "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication,n Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G · M. Allan et aL，’’A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of -17- 1314580 severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circo virus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1 - 1 1 (1 9 9 9); M. Balasch et al., 1 999, supra; J. Ellis et al.， 1 999， supra; S . Kennedy et al.， 2000， supra; S. Krakowka e t a l ·，200 1, supr a\ S. Krakowka e t al ·，2000, supra; R. M. Pogranichnyy etal·，2000， supra)。比匕等糸且織均質物可含有其它常見豬傳染物如PPV及豬繁殖及呼吸道症候群病毒（PRRSV)(G. M. Allan ei a/.，"Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circo virus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates P C V 2 replication,!, Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M.

Allan e t al.，"Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-1 1 ( 1 999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. A. Ellis et al., "Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Vet. Diagn. Invest. 12:21-27 (2000); C. Rosell er a/_5 2000，npra)，且自此後用來作爲PCV2增殖使用之ATCC PK-15細胞株則持續以 PCV1 感染（G. C. Dulac and A. Afshar 5 1 9 8 9，supra), the clinical disease and pathological lesions reproduced in those studies may not be solely attributable to P C V 2 18- 1314580 infection (G. M. Allan e t al.，"Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (P C V 2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication,f, Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan e t αϊ.，"A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 4 7:81-94 (2 000); G. M. Allan e t fl/.，"Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus，’’ J. Comp. Pathol. 121:1 - 1 1 (1 999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. A . E11 i s e ί a / ·，2 0 0 0，5 w p r a)。當以胸膜肺炎黴槳菌（Mycoplasma hyopneumoniae)免疫時，臨床PMWS亦已在接種PCV2之CDCD豬中產生（G· Μ. Allan etal.，'’Immunostimulation，PCV-2 and PMWS，" Vet. Rec. 147:1 7 1 - 1 72 (2000))，最近由 G. M. Allan " a/.， "Neonatal vaccination for Mycoplasma hyopneumoniae and post weaning multisystemic wasting syndrome: a field trial，，，Pig J. 4 8:3 4 -4 1 (200 1 )及 S. C. Kyriakis " a/.，"The effects of immuno-modulation on the clinical and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Comp. Pathol. 1 2 6 : 3 8 - 4 6 (2 0 0 2)之兩個領域硏究，試驗以胸膜肺炎黴漿菌疫苗在地方上之家畜 -19- 1314580 群之PMWS發展之免疫調節效果，並顯示在PMWS案例未免疫群與免疫群動物比較上有顯著降低，然而，另一最近硏究使用傳統SPF仔豬在對照實驗條件下可不產生此效果，而認爲以胸膜肺炎黴漿菌免疫可能可以影響臨床PMWS之發展，但淸楚地其對爲PCV2感染爲二次性角色。基於此等及其他硏究，PCV2仍被認爲是原始的但非單獨的PMWS傳染物質。缺乏生物學純粹形式之PC V2感染病毒群已妨礙對PC V2 病理機制及PCV2在PMWS之病因學角色之了解，免疫對抗 PPV及可能之PRRSV已被顯示與可預防PMWS在感染PCV2 豬之開始並不符合，因此，發現一種安全且有效專一性對抗PMWS標的之疫苗是困難的。在獸醫領域需要有一種明確技術認定可產生對抗PCV2感染及PMWS之有效的、安全的疫苗。 U · S ·專利案 6，2 8 7，8 5 6 號（P 〇 e t e ί α / ·)及 W Ο 9 9 / 4 5 9 5 6 號係關於來自鸚鵡喙及羽毛病病毒（BFDV)，一種感染禽類之環狀病毒，及來自豬環狀病毒（PC V)之核酸，此專利提議之疫苗組成物包含裸露的DNA或mRN A，並揭示一種在真核細胞中暫時表現PC V之核酸載體，其含有衍生自人類巨大細胞病毒之功能性與核酸序列連結之立即或早期基因增強子或啓動子之cis-作用的轉抑或轉錄調節序列。然而，自從PC V DNA單獨衍生自PK-1 5細胞株後，其似乎包含將近30年前由 1.1^£：1^1"€以/.，1974，1^;^^發現之無病原性？(^1，因此， 1314580 其在激發PC V2或由PCV2引起之感染上之免疫似乎是無效的。在專利中亦提及由含有開放讀碼區之載體所製成之婁組蛋白質次單位疫苗’但得自PCV之開放讀碼區並未完全被辯別出或與其他區別出來。既然PCV DNA之來源爲PK-15 細胞’包含PCV1開放讀碼區之載體所製之蛋白質不會具有任何可能對抗PCV2之可靠免疫反應性質。 U.S.專利案6,217,883號（Allan ei α/·)及法國專利案 2,78 1，159B號係關於由取自在加拿大、加州及法國不列塔尼 (Brittany)所感染PMWS之豬肺臟或神經結樣品中分離之五種PCV株，及其與至少一種豬小病毒抗原合併之免疫生成性組成物。由ORF1至ORF13所組成PCV2開放讀碼區（ORF)所編碼之蛋白質則廣泛描述於此專利中，但卻無展現免疫生成性性質之任何專一性蛋白質之實例。此專利進一步揭示由DNA質體、線狀DNA分子及重組病毒所組成之載體，其含有並在活體中可表現所編碼之PC V抗原之核酸分子。其他數種參考文獻，例如'11.3.專利案6,391,314 81號；1；.3.專案 6,368,601B1號；法國專利案2,769,321號；法國專利案 2,769,322 號；WO 0 1 /963 77 A2 號；WO 00/01409 號；WO 99/18214 號；WO 00/77216 A2 號；WO 01/16330 A2 號；WO 99/2 9 87 1號等，亦描述PCV1或PCV2多胜肽或編碼各種病毒株的多胜肽之核酸。然而，無病原性PCV1對抗PCV2感染將不會有用的，且描述於此項技藝中之病原性PCv2株即使經減毒’由於活毒 1314580 通常傾向恢復成其毒力狀態而很可能地會限制其價値。因此，在此項技藝中對於將活的、感染性之非病原性抗原接種於豬中以對抗嚴重感染或由PC V2引起之PMWS，並在獸醫疫苗上是有效的及保有安全性的，則仍有長期的需要。此等目標藉由描述於此之新活的嵌合豬環狀病毒之建構而達成，其係基於自I. Tischer等人於30年前所分離之無病原性PCV 1之基因體骨架，本發明之新穎嵌合型豬環狀病毒經由獨特及進步性地保有PCV 1之無病原性基因型，但卻能激發對抗PCV2之專一性免疫反應，而於長期需要上能夠具安全性的。 (三）發明內容發明簡要摘述本發明係關於作爲疫苗是有用的豬環狀病毒（PC V)之感染性嵌合型DN A選殖株及衍生自該選殖株之活的嵌合型病毒。此新活的嵌合型、基因工程上無毒的病毒係由無病原性PCV1基因體結構所製成，其中用病原性PCV2株之免疫生成性基因取代PCV1的基因，一般是在相同位置上之基因。本發明包含生物學功能性質體、病毒載體等含有在此所述之新重組核酸分子，經由含有此DN A之載體所轉染之適當宿主細胞及免疫生成性多胜肽表現產物。一種新穎之保護豬對抗病毒感染或由PC V2引起之斷奶後多系統消耗症候群 (PMWS)之方法亦包含於本發明範疇中，其包含給與保護豬隻所需之免疫學有效量之疫苗，此疫苗包含例如在質體中 -22- 1314580 經選殖之嵌合型DNA、衍生自嵌合型DNA選殖株之嵌合型病毒、由在此所述DNA所表現之多胜肽產物等。本發明進一步提供一種新的感染性PCV2分子DNA及PCV之互相嵌合型DNA選殖株，發現可作爲實驗模式之用途以獲得或分辨新穎之無毒力病毒疫苗。發明詳細說明依據本發明其提供豬環狀病毒（PCV)之感染性分子及嵌合型核酸分子、產自嵌合型核酸分子之活嵌合型病毒以及獸醫用疫苗，以保護豬隻免於病毒感染或由PC V2所導致之斷奶後多系統症候群（PMWS)。本發明進一步提供可作爲疫苗使用之免疫生成性多胜肽表現產物。 PCV之新的無毒力、感染性嵌合DNA分子（PCV1-2)包含編碼感染性、無病原性PCV 1之核酸分子，其含有病原性 PCV2免疫生成性開放讀碼區（ORF)基因以取代在PCV1基因體中之ORF基因。感染性嵌合型PCV1-2 DNA選殖株較佳爲含有PCV2 DNA之免疫生成性衣殼基因（ORF2)被選殖在感染性、無病原性PC VI DN A選殖株之基因體骨架中。一般而言’在PCV1基因體結構中，以PCV2 DNA之衣殼基因取代 PCV1 DNA之ORF2基因，但估算藉由基因工程應可建構各種位置的互換，以獲得其他無毒力或減毒的嵌合DNA選殖株。在PCV1及PCV2間相互嵌合的感染性PCV2-1 DNA選殖株被揭示以作爲對照組來分析本發明之嵌合型PCV 1 -2，並在病原性P C V 2感染性DN A選殖株之骨架中經由以P C V 1之 -23- 1314580 衣殼基因取代PC V2之衣殼基因。除了成爲實驗模型外，可發現相互嵌合的PCV2-1 DNA選殖株使用在特製的疫苗中。在此所描述之PCV2經選殖基因體DNA，當經轉染至PK-1 5細胞及給於豬隻時，顯示其在活體外及活體中爲感染性的，感染性PCV2 DNA選殖株在豬隻中產生PMWS之病原性傷害特徵，使其可用於改進臨床疾病之鑑定並了解病毒在組織細胞之分布。此新的、快速產生的病原物質本身適於適當疫苗計畫之發展以防止在豬隻中的PMWS。在活體外PK-15細胞之轉染及在活體中給與豬隻時，新穎的嵌合型PCV1-2 DNA亦爲感染性的，在經轉染之PK-15 細胞中，嵌合型PCV1-2 DNA選殖株表現了 PCV2衣殻抗原 (PCV2之免疫生成性衣殼蛋白質），因此相互嵌合型 PCV2-1 DNA選殖株表現PCV1衣殼抗原，其藉由使用專一性抗PCV1或PC V2衣殻抗原之免疫螢光試驗（IF A)來展現。在接種感染性PCV2選殖株以及嵌合型PCV1-2選殖株之豬隻中偵測到血淸轉變成P C V · 2專一性抗體，偵測血淸轉變成 PCV2專一性抗體建立了嵌合型PCV1-2 DNA選殖株誘導感染豬中之PCV2專一性抗體，並隨後產生保護接種豬免於 PCV2感染之作用。下列實例更詳細描述在接種豬中嵌合DNA選殖株免疫生成性疾病原性疾病原性之評估，基本上，在接種P C V 2 D N A 選殖株（第3組）及嵌合型PCV 1-2選殖株（第4組）偵測到 1314580 血淸轉變成對PCV2 ORF2抗原之抗體。所有接種PCV1選殖株及相互嵌合型PCV2-1 DNA選殖株（分別爲第2及5組）之豬隻則血淸轉變成對P CV 1的抗體。在每一群中由所選擇的豬隻所恢復的病毒被部分定序，並確定爲真實之各別用來接種之感染性DN A選殖株。在接種PC V 2 DN A選殖株之各種動物組織在巨觀及顯微傷害上是顯著地較彼等發現於接種 PCV1、嵌合型PCV1-2及相互嵌合型的PCV2-1 DNA選殖株爲嚴重的。令人驚訴及有益地，將具有病原性PCV2之免疫生成性衣殻基因（ORF2)之嵌合CV1-2感染性DNA選殖株選殖入無病原性PCV1基因體骨架中，雖然其在豬隻中獨特地保有PC V1 之無病原性性質，但卻誘導出對病原性PCV2衣殼抗原之專 —性抗體反應。當血淸轉變成對抗病原性PC V2之ORF2衣殼蛋白質時，接種嵌合型PCV 1-2感染性DNA選殖株之動物會發展出類似於接種PCV1動物之輕微的感染。在接種PCV1 及嵌合型PCV1-2之動物中所觀察到之毒血症平均長度則較短’分別爲0.6 2 5週及1週，接種病原性PC V2之動物則約2.12 週。缺乏可偵測的嵌合型PC VI-2毒血症在一些接種動物中不會影響血淸轉變成在接種PCV1-2的豬中對抗PCV2 ORF2 衣殻蛋白質（第4組）。此結果說明了即使嵌合型PCV 1-2 毒血症在一些接種動物中是較短或不可偵測的，嵌合型 PCV1-2病毒仍能夠誘導抗體反應對抗PCV2 ORF2衣殼蛋白質。嵌合型PCV1-2感染性DNA選殖株之專一性能力可誘導對病原性PCV2免疫生成性PRF2衣殼蛋白質之專一性免疫 1314580 反應上，仍保有對豬爲無病原性的，使嵌合型PC VI-2選殖株作爲基因工程上活的減毒疫苗及其他形式的疫苗上是特別有用的。本發明之新穎的純化並分離的核酸分子包含經選殖的嵌合型PCV1-2 DNA之陳述於SEQ ID NO:2之全長DNA序歹IJ，其顯示於第9圖中，並存放在American Type Culture Collection之專利存放PTA-3912號，以及具有財團法人食品工業發展硏究所寄存編號BCRC 94〇424:其互補股（即反轉及相對位鹼基對）或具有相對於嵌合型核苷酸序列（即全部基因之顯著活化部份）之至少9 5 %同源性核苷酸序列。在此項技藝中熟知之傳統方法可被用來製作互補股或具有高同源性之核苷酸序列，例如，藉由此技藝認定標準化或高嚴格雜交技術。經純化及分離之核酸分子包含經選殖的嵌合型PCV1-2 DNA之免疫生成性衣殼基因之DNA序列，亦陳述於SEQ ID NO:3及第10圖。含有嵌合型核酸分子之適當細胞獨特地生產活的、感染性的嵌合豬環狀病毒，此活的、感染性嵌合病毒衍生自如在此說明之經由活體外及活體中轉染來轉染PK-1 5細胞之嵌合DNA選殖株。較佳經選殖嵌合型PCV1-2 DNA之實例爲陳述於SEQ IDN0:2及第9圖之核苷酸序列。本發明範疇亦包括生物學功能性質體、含有在此所述新重組核酸分子之病毒載體等、經含有嵌合及分子DN A之載體所轉染之適當宿主細胞，以及免疫生成性多胜肽表現 -26- 1314580 產物。一特別較佳之免疫生成性蛋白質具有陳述於SEQ ID NO: 4及第1 1圖之胺基酸序列。其生物學活性變異體進一步包含在本發明中，因爲熟習此技藝中之通常技藝者不需過度的努力即可能知道如何自多胜肽序列來修飾、置換、刪除等，並產生保有如本專利申請序列之相同或實質上相同之生物學活性變異種。爲了生產本發明之免疫生成性多胜肽產物，其製程可包括下列步驟：在適當營養條件下，使經轉染在此所述之新重組核酸分子之原核或真核宿主細胞生長，以可表現該多胜肽產物之方法，並以此項技藝中已知的標準方法分離所欲之該核酸分子所表現之多胜肽產物。打算以其他技術例如生化合成等來製備免疫生成性蛋白質。嵌合型病毒及分子DN A選殖株之疫苗，及使用此等疫苗之方法亦被包括在本發明範疇中，可保護經接種的豬免於嚴重的病毒感染及由PC V2所引起之PMWS。依據本發明，此新穎方法經由給與豬免疫有效量之疫苗來保護需要保護的豬隻對抗病毒感染或PMWS，例如，包含免疫生成性量之嵌合型PCV1-2 DNA、經選殖嵌合型病毒、含有PCV1-2 之嵌合型DN A之質體或病毒載體、多胜肽表現產物、重組 PCV2 DNA等之疫苗。可一起將其他抗原如PRRSV、PPV、其他感染豬的物質及免疫刺激劑給與豬以提供廣範圍之保護以免受病毒感染。此疫苗包含例如感染性嵌合型PCV1-2 DNA、在適當質 -27- 1314580 體或載體如PSK載體中之經選殖的PCV嵌合型DNA基因體、無毒力之活嵌合型病毒、不活化之嵌合型病毒等，與無毒性之生理學上可接受的載體合倂，且可選擇地有一或更多佐劑。此疫苗亦可包含在此描述之感染性PCV2分子 DN A選殖株。感染性嵌合型PC VI-2 DNA、含有感染性嵌合型病毒基因體等之質體DN A及活的嵌合型病毒爲較佳，以活的嵌合型病毒爲最佳。本發明之無毒活的疫苗提供了一種較傳統病毒疫苗有利的疫苗，其使用減毒之活病毒，減毒病毒疫苗承受其恢復成毒力狀態之危險或者殺死細胞培養所增殖的全病毒但其不會誘導足夠的抗體免疫反應來對抗病毒疾病。可與本發明之疫苗結合一起被給與之佐劑，爲一種可增加豬對此疫苗之免疫學反應的物質，佐劑可與疫苗在相同時間及相同位置上被給與，或者在不同時間給與，例如作爲加強劑。佐劑亦可被有利地以同一種方法或不同於給與疫苗之方法或位置來給與豬。適當佐劑包括（但不限於）氫氧化鋁（alum )、免疫刺激複合物（ISCOMS)、非離子塊狀聚合物或共聚物、胞激素（如IL-l、IL-2、IL-7、IFN-a、 IFN-p、IFN-y等）、皂素、單磷酸脂質A、胞壁醯基二胜肽 (MDP)等。其它適當佐劑包括，例如硫酸鋁鉀、分離自大腸桿菌之熱不穩定或熱穩定內毒素、霍亂毒素或其B次單位、白喉毒素、破傷風毒素、白日咳毒素、費氏不完全或完全佐劑等。以毒素爲基礎之佐劑，如白喉毒素、破傷風毒素及白日咳毒素，在使用前可先被不活化，例如以甲醛 -28- 1314580 處理。疫苗可進一步含有額外的抗原以促進感染性嵌合型PC V DNA選殖株之免疫活性，例如豬繁殖及呼吸道症候群病毒 (PRRSV)、豬小病毒（PPV)、其它豬感染性物質及免疫朿丨J激劑。本發明之新疫苗未被限制成任何特別型式或製法，經選殖的病毒疫苗包括（但不限於）感染性DNA疫苗（即使用質體、載體或其它傳統載劑以直接注射DNA至豬隻中）、活毒疫苗、經修飾之活的疫苗、不活化疫苗、次單位疫苗、減毒疫苗、基因工程疫苗等。此等疫苗以此項技藝中已知的標準方法來製備。活病毒疫苗一般爲在所有可能的免疫反應中最希望的疫苗，其在疫苗之接受者中被活化，包括系統系統的、局部的、體液的及細胞媒介免疫反應，在一方面死病毒疫苗只可誘導體液免疫反應。雖然是最希望的，然而活病毒疫苗有數種缺點，如有污染活的偶發病毒物質之潛在風險或病毒在野外可能恢復成毒力的風險。値得注意地，本發明之獨特的PCVI-2嵌合型DNA克服彼等缺點，僅使用病原性 PC V2之免疫生成性基因，此嵌合型DN A建構了一種活的、可複製之嵌合型病毒，其爲無病原性尙且激發了活病毒疫苗之完全的、有利的免疫反應來對抗病原性PCV2病毒。此以嵌合型病毒爲基礎之活病毒疫苗將具有些許的危險，若有任何可能則會回復成病原性表現型。因此，基於無病原性PCV1結構之新嵌合型病毒較任一重組PCV2 DNA病毒、 -29- 1314580 任一活的減毒PCV2疫苗或任何其它形式單獨以pcv2爲基礎來對抗PC V 2感染之疫苗而言則有很大的優點。雖然活病毒疫苗爲最佳的，但以新嵌合型病毒及其它在此所述抗原之其它形式疫苗可用來接種藉隻。爲了製備不活化病毒疫苗，例如，以此項技藝中或已知在此所描述之方法自感染性DN A選殖株來增殖病毒。然後以此項技藝中彼等熟習此藝者一般已知步驟來充分運用連續病毒不活化。可藉由以不活化劑如福馬林或厭水性溶劑、酸等或以紫外光或X射線之刺激或經由加熱等來處理衍生自經選殖 PC V DN A之嵌合型病毒，以製備不活化病毒疫苗。以此項技藝中所知之方法來實行不活化，例如在化學不活化中，含有此病毒之適當病毒樣品或血淸樣品，以充足量或濃度之不活化劑在充分高的（或低的，依據使用之不活化劑）溫度或p Η値下作用足量時間而不活化此病毒。以加熱來不活化則在一個溫度下並於充分能不活化此病毒之時間下執行。經由刺激來不活化則使用一種光波長或其他能量來源作用足量時間以不活化此病毒。若病毒不能感染對於感染有感受性的細胞，則此病毒已被不活化。次單位疫苗之製備一般不同於經修飾活的疫苗或減毒疫苗或不活化疫苗之製備，在製備次單位疫苗前，疫苗之保護性或抗原性成分須先被鑑定出來，此等保護性或抗原性成分包括可在豬隻中增加特別強的保護性或免疫學反應之某些胺基酸片段或病毒衣殻蛋白質片段；由病毒次結構或視爲相同部份或單位之此次結構之單一或多種病毒衣殻 -30- 1314580 蛋白質、其寡體及較高次序關連之病毒衣殻蛋白質；存在或靠近病毒表面之寡配糖體、醣脂質或醣蛋白，或在病毒次結構中如脂蛋白或與病毒連結之脂質群等。較佳地’衣殻蛋白質如由ORF2基因所編碼之蛋白質，作爲次單位疫苗之抗原成分來實行，亦可使用以感染性DN A選質株所編碼之其他蛋白質。以此項技藝中已知方法可迅速地鑑定此等免疫生成性成分，一旦鑑定出來，此病毒之保護性或抗原性部分（即”次單位”）隨後以此項技藝中已知方法純化及/ 或選殖。次單位疫苗提供較以活病毒爲基礎之疫苗的優點，因爲此次單位，尤其是高度純化的病毒係較全病毒少毒性的。若次單位疫苗係經由重組基因工程技術所產生，例如經選殖的次單位如ORF2 (衣殻）基因之表現，可以在此項技藝中彼等已知方法來充分運用（例如可見 Maniatis d α/.5π Molecular Cloning:A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，MA·，1989)。若所實行之次單位表現出病毒之完整結構特徵，如完整的衣殼蛋白質，則其與病毒分離之步驟必須盡量充分地達成。在兩者之情形中，不活化步驟之理想化後，次單位純化步驟可在生產前先理想化。爲了自病原性選殖株製備減毒疫苗，以此項技藝中已知方法將馴化之組織培養、活的病原性PCV2首先減毒（表示無病原性或無害的），一般經由細胞培養連續繼代。病原性選殖株之減毒亦可由基因刪除或病毒所產生的基因突 -31 - 1314580 變而製成。然後此減毒PCV2病毒可用來建構附加之保有 PCV1之無病原性表現型之嵌合型PCV1-2病毒，但可以選自透過重組技術之PCV2基因體之免疫生成性特徵之強度而變化。

最佳疫苗使用活的嵌合型病毒DN A選殖株，具體而言，此選殖株含有以無病原性PCV1骨架中經選質的PCV2免疫生成性基因。透過基因工程所建構之自然無毒的活嵌合型病毒，具有不須耗費時間的減毒步驟之優點。此病毒獨特地提供活的但無病原性可複製病毒，在病毒複製時，產生免疫生成性蛋白質來對抗PC V2，然後其可激發全範圍免疫反應對抗病原性PCV2。

作爲進一步之優點，本發明之較佳活嵌合型病毒提供一種較其他減毒疫苗形式容易製作、儲存及分送之基因生成性穩定的疫苗。以嵌合型病毒爲基礎之無毒或減毒疫苗一般被認爲與傳統經修飾活的疫苗一樣安全（雖然較不安全)(J. Arroyo e t a/.," Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE)," J. Virol. 75(2):93 4-942 (200 1 ); F. Guirakhoo et al ·， "Recombinant chimera yellow fever-dengue type 2 virus is immunogenic and protective in nonhuman primates," J. Virol. 74(12): 5477-5485 (2000); S. Tang et al., "Toward a poliovirus-based simian immunodeficiency virus vaccine: correlation between genetic stability and immunogenicity," -32- 1314580 J. Virol. 71 (1 0):784 1 -785 0 ( 1 997))。例如，抗日本腦炎病毒（JEV)之ChimeriVax-JE疫苗’其爲黃熱病病毒疫苗 YFV17D之基因工程衍生物，其中編碼YFV17D之結構蛋白質prM及E之基因被經減毒的JEV SA 14-14-2株之相對基因所取代，已被顯示在活體外及活體中之延長繼代爲基因穩定的（J_ Arroyo 200 1，supra)。另一抗登革熱病毒第 2型之嵌合型病毒疫苗<：11丨11^1^¥&\-02，其爲減毒的嵌合型黃熱病（YF)-登革熱第2型（dengue-2)病毒，亦被發現爲基因穩定的；其所報告之序列在Vero細胞中經18次繼代仍未己文變(F. Guirakhoo et al., 2 0 0 0, supra) ° 本發明之另一較佳疫苗利用穩定的質體來給予豬隻此無病原性嵌合型DN A選殖株，相對於使用活的或死的經細胞繼代的全病毒之傳統疫苗，本發明提供了可直接接種於豬之含有感染性嵌合型病毒基因體之質體DN A。以此項技藝中已知技術可生產本發明中所欲之額外基因工程疫苗，此技術涉及（但未限制）重組DNA、重組蛋白質之胺基酸序列之修飾或取代等之進一步操作。以重組DNA技術爲基礎之基因工程疫苗被製成’例如經由鑑定病毒基因其編碼負責誘導豬隻較強免疫或保護性反應之蛋白質之可選擇部分（例如衍生自0RF3' ORF4等）。此等經鑑定的基因或免疫主體片段可被選殖至標準蛋白質表現載體，如昆蟲桿狀病毒（baculi)Vhus) 載體，而可用來感染適當宿主細胞（例如見〇'Reilly a/.,"Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual," -33- 1314580

Fr e e m an & C ο ·，1 9 9 2)。培養宿主細胞，然後表現所欲的疫苗蛋白質，其可被純化成所欲的量並調配成穩定的疫苗產物。若此選殖株保有可引起疾病之任何不良的自然能力，其亦可能精確地指出負責此毒力之核苷酸序列在病毒基因體上之位置’並以基因工程徹底使其成爲無毒力的，例如，定點突變（site_directed mutagenesis)。定點突變能夠增加、刪除或改變一或多個核苷酸（例如可見於Ζ ο 11 e r e / α /.， DNA3:479_488, 1984)。含有所欲突變之寡核苷酸被合成並與單股病毒DNA之部分結合，將由此步驟所得到之雜交分子至轉形細菌執行，然後此被分離之含有適當突變之雙股 DNA，經由結合至後來的限制酶片段而用來生產全長的 DNA，其隨後轉染至適合的細胞培養中。基因體與適當載體結合之移轉可透過任一此項技藝中熟習此藝者已知的標準技術而達成。可使用任一傳統方法將載體轉染至宿主細胞以生產病毒後代，如磷酸鈣或DEAE-聚葡萄糖媒介之轉染、電穿孔、原生質體融合及其他已知技術（例如Sambro ok e t al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，然後所選殖之病毒會展現所欲之突變。可選擇地，含有適當突變之兩個寡核苷酸可被合成，其可被連結以形成雙股DNA而被插入病毒的DNA中以生產全長DNA。在疫苗中有用之基因工程蛋白質，例如，可在昆蟲細胞、酵母菌細胞或哺乳類細胞中表現’此等基因工程蛋白 -34- 1314580 質可以傳統方法純化或分離，而可直接給予豬隻以給予對抗病毒感染或由PCV2所引起之斷奶多系統徵候群 (PMWS)。 —種昆蟲細胞株（類HI-FIVE)可以含有獲自病毒或複製自病毒基因體之可編碼病毒之一或多種免疫主體蛋白質之核酸分子之轉移載體。此轉移載體包括，例如線狀昆蟲桿狀病毒DN A及含有所欲之多核苷酸之質體，爲了製作重組昆蟲病毒，宿主細胞株可與線狀昆蟲桿狀病毒DNA及質體共同轉染。可選擇地，由感染PMWS豬之DNA，其編碼一或多種衣殼蛋白質、感染性PCV2分子DNA選殖株或經選殖之PCV嵌合型DN A基因體可被插入活載體中，如痘病毒或腺病毒，並作爲疫苗使用。給予需要對抗病毒感染或PMWS來保護豬隻本發明之免疫學上有效量之疫苗，經由常規試驗可容易決定或快速定量接種豬隻之免疫學上有效量或免疫生成性量，有效量爲其中對疫苗之足夠的免疫學反應達到保護暴露於引起 PMWS病毒中之豬。豬較佳地被保護至其中病毒疾病之所有有害的生理症候或效果爲顯著降低的、改善的或完全避免。疫苗可以單一劑或重複劑方式給予，劑量變化例如以約 1至1,000毫克之含有感染性嵌合型DN A基因體（依據疫苗之免疫活化成分濃度而定）之質體DNA，但不應含有足以造成 1314580 病毒感染之副作用或生理徵候之以病毒爲基礎之抗原量。用來決定或定量以豬隻體重爲基礎之活性抗原物質之適當劑量、抗原濃度及其他典型因子爲此項技藝中已知的。用來作爲疫苗之感染性嵌合型病毒DN A選殖株或活感染性嵌合型病毒’較佳可在試管中產生，然後用來作爲疫苗之活嵌合型病毒’在此情形下’可給予豬隻100至200毫克經選殖之嵌合型PCV DNA或約1〇, 〇〇〇之活嵌合型病毒5〇%組織培養感染劑量（TCID5Q)。希望給疫苗於尙未暴露於PCV病毒之豬隻，此含有嵌合型PCV1-2感染性DNA選殖株或其其他抗原形式之疫苗可方便地以鼻內、經皮的（即塗抹於皮膚表面之全身性吸收）、腸胃外等方式給予’腸胃外途徑給予包括（但不限於）肌肉內、靜脈內、腹腔內、皮內（即經由注射或其它置入皮膚下之方式）途徑等。肌肉內及皮內接種途徑在其他使用病毒感染性DNA選殖株之硏究中已是成功的（E. E. Sparger al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); L. Willems et al.In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (19 92))，除了實用的鼻內接種途徑外，此等途徑爲最佳的。儘管較不方便，透過淋巴腺樣內接種途徑給予疫苗亦被考慮，一種獨特的、極佳之方法涉及以肌肉內、皮內、淋巴腺樣內等之直接注射含有PCV1-2嵌合型質體DNA至豬隻 -36- 1314580 中。當以液體給予時，本發明疫苗可以水溶液、糖漿、香酒、酊劑等形式來製備，此等調配物在此項技藝中爲已知的且一般經由抗原及其他典型添加劑在適當載劑或溶劑系統中分解而製備。適當載劑或溶劑包括（但不限於）水、食鹽水、乙醇、乙二醇、甘油等，典型添加劑例如爲合於標準之染料、香料、增甜劑及抗微生物防腐劑如硫柳汞 (thimerosal ;鄰乙汞硫基苯磺酸鈉）。此等溶液可被穩定化，例如經由加入部分水解的明膠、山梨醇或細胞培養液，且可以使用此項技藝中已知試劑之傳統方法來緩衝，此如磷酸氫鈉 '磷酸二氫鈉、氫酸氫鉀、磷酸二氫鉀、其混合物等。液體調配物亦包括含有懸浮或乳化劑與其他標準之共調配物之懸浮液及乳劑，使等形式之液體調配物可以傳統方法製備，懸浮劑例如可使用膠體硏磨機來製備，乳劑例如可使用均質器來製備。被設計用來注射入體液係統之腸胃外調配物，需要符合豬體液量之適切的等張性及pH緩衝。等張性可以氯化鈉及及它所需鹽類作適當地調整，適當的溶劑如乙醇或乙二醇，可被用來增加成分再調配物中之溶解性及液體製備之穩定性。此外可在本發明疫苗中使用之添加劑包括（但不限於）右旋糖、習用的抗氧化劑及慣用的螯合劑如乙二胺四乙酸（EDTA)。腸胃外劑量形式在使用前亦必須爲無菌 1314580 的。本發明之另一具體實施例涉及製備PC VI-2之感染性而無病原性嵌合型核酸分子之新方法，其包含移除編碼感染性而無病原性PCV1的核酸分子之開放讀碼區（ORF)基因，並在相同位置上以編碼感染性病原性PC V2的核酸分子之免疫生成性ORF基因來取代，並且恢復嵌合型核酸分子，此核酸分子爲典型的DNA。一較佳方法以在此所述PC V2之感染性病原分子DN A之免疫生成性ORF2衣殻基因取代無病原性PCV1 DNA之ORF2基因，依據在此所述方法，其他ORF 位置或其免疫生成性片段可在PCV1及PCV2 DNA間交換以建構減毒感染性嵌合型DN A選殖株被考慮。然後使用重組核酸分子建構本發明之活的感染性複製的嵌合型病毒，其有利地保有PCV1之無病原性性質，但表現病原性PCV2之免疫生成性ORF2蛋白質，而激發完全免疫反應對抗病原性PCV2。希望提供PCV1-2 DNA選殖株作爲經基因工程之無毒、活病毒疫苗以對抗在豬中之PC V2感染及PMWS。如在此所述建構PCV2之感染性DNA選殖株，因此可產生生物學純的及同源性的感染性病毒原料用於病原生成性硏究及無病原性嵌合型疫苗之發展。與PC V2感染有關之臨床疾病進展、病毒分布及病理學上傷害使用衍生自過去所觀察到的分子DNA選殖之分子DNA選殖及生物學純的及同源性感染性P C V 2病毒原料而被明確地作爲特徵。 1314580 PCV2分子選殖株以縱排連結兩個完全的PCV2基因體之複製至pSK載體中產生，與此項技藝所揭示之單一複製基因體爲鮮明相反的，以在此描述之方法製作之感染性DNA PCV2選殖株含有兩個PC V2縱排基因體之完全複製而重複連結在一起。連結兩個縱排之基因體提供一種相似的環狀基因體，其仿造PCV2通常的環狀基因體，在感染性DNA PCV2選殖株中具有兩個縱排基因體複製之優點爲此選殖株能後最大化複製，當感染性DNA選殖株在試管中及活體中被轉染時，因此本發明之選殖株較先前單一複製基因體有更效率及有效之運作。以分子病毒選殖株感染動物爲極有用之在宿主中病毒複製及毒力之基因決定物之硏究，型-2株環狀病毒（PC V2) 已被控訴爲斷奶後多系統消耗徵候群（PM WS)之傳染物， PMWS爲在豬中之一種複合症候且多重因子可涉及PMWS之臨床表現。然而，由於其他常見的豬感染物在染病的豬組織均質物中存在而妨礙明確分類是單獨由PCV2感染所造成之臨床疾病及病理傷害，故很難生產PC V2之生物學純的形式。此爲第一次由經建構的PCV2之感染性分子DNA選殖株，經由分子選殖株直接活體轉染豬隻，來分辨與PC V2感染有關之疾病及病理傷害。衍生自分子選殖株之同源性PCV2活病毒原料當轉染至 PK-1 5細胞時，在試管中顯示爲感染性的，當將經選殖之 PCV2基因體DNA直接注射至無特定性抗原（SPF)豬之肝臟 -39- 1314580 及表面腸骨淋巴結，其亦爲感染性的。注射經選殖PCV2質體DNA之動物會發展相似於以鼻內接種同源之感染性PC V2 活病毒原料所引起之感染及疾病。自接種後（DPI) 3 5天之接種組大多數豬隻中偵測到血淸轉變成PCV-2專一性抗體。接種嵌合型PCV 1-2 DN A選殖株之豬隻其毒血症之開始及期間相似於彼等接種無病原性PCV1 DNA選殖株之豬隻，然而接種PCV2選殖株豬隻之毒血症則出現的較早且持續較久。在14DPI開始並持續約2·4週，在大部分接種PCV2 之動物中偵測到毒血症，相似地，大部分接種豬在35DPI 血淸轉變成PCV2抗體時屍解。在經接種豬之各種組織及器官中偵測到PCV2抗原，巨觀傷害限制在肺臟及淋巴結，且以有規律地變大的黃棕色淋巴結、無法塌陷之肺臟及輕微多處黃棕色病變之聯合病變爲特徵。在接種無病原性PCV1 及嵌合型PCV 1-2的豬隻中，其影響淋巴結之巨觀傷害爲輕微的且只限制在少數動物中，因此所有病原性P C V 2接種豬具有中度至嚴重腫脹及退色的淋巴樣組織（下表9)。統計學分析顯示接種嵌合型PCV 1 -2動物之淋巴結巨觀傷害記錄相似於彼等在接種無病原性PCV1之豬，在 21DPI，接種PCV2豬隻具有較彼等接種PCV1及嵌合型 P C V 1 - 2豬隻之巨觀傷害爲統計上爲嚴重，組織病理學傷害及PCV-2專一性抗原在數種組織及器官中偵測到，包括在經接種（感染）豬隻之腦、肺臟、心臟、腎臟、扁桃腺、淋巴結 '脾臓、迴腸及肝臓。在多處組織和器官之組織病理 -40- 1314580 學傷害相似於彼等以PC V2分子DNA選殖株以及在試管中由分子DNA選殖株製備之感染性病毒產生PMWS。顯微鏡學上’在21及49DPIS兩者中，接種嵌合型PCV1-2動物比接種 PC V2動物具有統計學上較少的顯微傷害，在接種嵌合型 PCV1-2豬隻之淋巴結中之顯微傷害相似於彼等無病原性 PCV1、相互嵌合型PCV2-1及未接種對照組動物。在接種病原性PC V2動物之多處組織中發現中度至嚴重的顯微傷害，包括肺臟、肝臟、淋巴腺樣、脾臟、腦、心臟、腎臟及扁桃腺組織，然而，在接種嵌合型PCVI-2動物中，輕度至中度顯微傷害限制在肝臟、淋巴結及腎臟組織（見下表1 0 )。在對照組或任一接種豬中無引人注目之PMWS臨床症狀，雖然在經選殖PCV2質體DNA(感染性PCV2 DNA選殖株）或具有生物學上純的PCV2感染性病毒原料中未觀察到 PMWS之具特徵的臨床徵候，但在下列說明實例中pC V2淸楚地應對產生與PMW S相似的組織病理學傷害負責。一般相信PCV2爲主要但非單獨須對臨床PMWS負責的病理物質。本發明更明確地分類對於PC V2感染有完全貢獻之臨床進程及病理傷害，下列說明實例中存有之資料指出了在 PCV2病理生成及免疫硏究上，可快速生產之經選殖PCV2 基因體DNA是能夠取代感染性病毒。雖然顯示PCV2對 PMWS之發展是必需的，其它因子或物質如PRRSV、PPV等可能被需要來誘導與P M WS進一步情況有關之全部範圍的臨床症狀及傷害，然而知道了 PCV2爲關鍵因子，本發明之新穎的感染性複製性病毒選殖株可進一步透過彼等在免疫 -41 - 1314580 學及分子基因學上所熟知之方法來修飾或以基因工程達到所欲之理想免疫生成性效果。在此描述之PC V2感染性DN A選殖株之有效性，使其發展用來預防豬隻PCV2感染及PMWS之基因工程減毒疫苗是合宜的，自然感染時PC V2在淋巴結、肺臟及肝臓之複製是已知的，且主要病理效果之一爲由淋巴腺樣結構退化所造成之免疫系統傷害（S· Krakowka ei α/.，200 1，jwprfl，G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; S. Kennedy et al., 2000, supra, G. J. Wellenberg et al., 2000, supra, G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 ( 1 999); J. Ellis e t al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets," J. Vet. D i a g n. Invest. 11:3-14 (1999); J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, 。藉由使用此新穎感染性PCV2分子DNA選殖株，歸因於PC V2感染之臨床疾病、病理傷害及病毒分布則能更明確分類。由於在此所述之PCV、PCV2、PCV1、嵌合型PCV1-2及相互嵌合型PCV2-1感染性DNA選殖株之有效性，其基因之

結構及功能關係較爲了解，Will等人之"Ci〇ned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees," Nature 299:740-742 (1982)，爲第一個展示使用經選殖的B型肝炎病毒DNA經由直接活體注射感染黑猩猩之可行性，此方法已被使用來硏 -42- 1314580 究病毒複製及數種其它病毒之制病機制（T. W. Dubensky ei a l.，"Direct transfection of viral and plasmid DN A into the liver or spleen of mice," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7529-7533 ( 1 9 8 4); R. Girones e t a l.， "Complete nucleotide sequence of a molecular clone of woodchuck hepatitis virus that is infectious in the natural host," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1 84 6- 1 849 ( 1 9 8 9); N. L. Letvin et al., "Risks of handling HIV," Nature 349:5 73 ( 1 99 1 ); C. Seeger e t al.， "The cloned genome of ground squirrel hepatitis virus is infectious in the animal. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 8 1:5 849- 5 8 5 2 ( 1 984); E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DN A of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 ( 1 9 9 7); R. Sprengel e t al., "Homologous recombination between hepadna viral genomes following in vivo DN A transfection: implications for studies of viral infectivity," Virology 159:454-456 (1987); H. Will et al., 1 9 8 2, supra; L. Willems e t al., "In vivo transfection of bovine leukemia pro virus into sheep," Virology 1 89:77 5 -777(1992))。在本發明內容中，感染性PC V2分子DN A選殖株之建構，以及藉由直接注射經選殖PCV2質體DNA至豬的肝臟及淋巴結中，有利於PCV2硏究，此在活體中之轉染系統將增強使用活體外建構之重組質體之PC V2基因之結構及功能性關係 -43- 1314580 硏究，來測試PCV2不同區域及基因在宿主中病毒複製及致病機制之角色。PCV2之複製及致病機制可在活體中硏究而不須再細胞培養增殖PC V2以生產感染性病毒原料。作爲連續細胞培養繼代是有利的，其可選擇病毒變異株。在動物硏究中使用經選殖的PC V 2基因體DN A來取代活病毒之另— 優點爲其在接種劑量之定量上相對上爲容易的，藉由分光光度劑可容易決定用來動物接種之經選殖PCV2 DNA，因爲在細胞培養中活PC V2病毒劑量需要感染力滴定並以IF a確認感染。動物直接注射經選殖PCV2質體則排除了動物硏究中之組織同源接種會有其他原有的豬感染原存在之問題。在本發明中，在病原性PCV2及無病原性PCV1間轉換之免疫生成性ORF2衣殼基因會產生獨特的嵌合型PCV1_2感染性D N A選殖株結構。令人驚訝地及有利地，嵌合型p c V 1 - 2 感染性選殖株在活體外及活體中複製、表現免疫生成性 ORF2衣殼抗原，並引起對抗PCV2 ORF2之專一性抗體反應但保有PCV1無病原性之本質。雖然只有在以相似於無病原性PCV1之輕微病理傷害限制感染誘導，嵌合型PCV1-2感染性DNA選殖株仍具有引起對抗PCV2之強烈免疫反應能力。爲了疫苗發展，相對上容易儲存及穩定之經選殖DNA，及大規模重組PCV2質體DNA及嵌合型PCV1-2 DNA選殖豬生產，提供了遞送活的感染性病毒DNA疫苗或基因工程之減毒疫苗至豬之具吸引力方法。因此，在本發明中，嵌合型 PCV1-2感染性DNA選殖株教示了抗PCV2感染及PMWS之有用候選疫苗。 -44- 1314580 應明瞭在此所使用之所有科學及技術名詞具有此項技藝中彼等熟習此藝者通常所了解之相同意義，於本發明之目的上，”感染性"之詞意指病毒會在豬隻中複製，而不管病毒是否會引起任何疾病。"SPF”豬隻係指無特定病原豬隻。"無菌（gnotobiotic ) ”豬隻意指無菌豬隻’被交替使用之"PCV2質體DN A"、"PCV2基因體DN A"及"PCV2分子 DNA"係指相同經選殖的核苷酸序列。感染性PCV1/PCV2嵌合型DNA選殖株（株指名爲 "PCV1-2嵌合體"）、感染性PCV2分子DNA選殖株（株指名爲"PCV2選殖株"）及衍生自由具有嚴重PMWS豬中分離出之PCV2愛荷華樣品之生物學上純及同源的PCV2母株，且被鑑定爲分離號碼40895(株指名爲7(：¥2 #40895 ") 寄存在由37 C.F.R. § 1.808授權之條件並依照布達佩斯條約在 American Type Culture Collection(ATCC),10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 201 10-2209, U.S.A中被維持。在此所述之DNA序列被含在6,490 bp 質體間而選殖入 pBluescript SK( + )載體（pSK) (Stratagene Inc·, La JolU，C A)並轉形至大腸桿菌DH5a勝任細胞中。含有感染性嵌合型PC VI-2 DNA選殖株之質體（被定義爲" 嵌合型豬環狀病毒第1型（PCV1)及第2型（PCV2)感染性 DNA選殖株"）且感染性PCV2分子DNA選殖株（被定義爲·· 第2型豬環狀病毒（PCV2)之感染性DNA選殖株"）已在200 1 年12月7日寄存在ATCC，且已分別被命名爲ATCC專利寄存標示號PTA-3912及PTA-3913。應了解其它使用定點 1314580 突變及在此所述技術可快速建構之質體，亦被包含在本發明範疇中。分離號40895之生物學上純的及同源的PCV2 樣品（定義爲"第2型豬環狀病毒（PCV2)")亦已在2001年12 月7日寄存在 ATCC，並被指名爲 ATCC專利寄存指名 PTA-3914。PCV2之基因體（核苷酸）序列分離號 40 8 95 已被存放在基因庫中並自2000年7月23日起已公開可取得，其編號爲AF264042。下列實例展示本發明之一些觀點，然而，應了解此等實例只係用來說明，而無意完全地限定本發明之條件及範疇於此。應明瞭當已給予典型反應條件（例如溫度、反應時間等），則亦可使用高於或低於此特定範圍之條件，雖然一般而言會較不方便。此等實例皆在室溫下實行（約23。C 至約28°C)及在大氣壓力下。除非有其他指定，否則在此所指之所有部分及百分比皆以重量爲基礎且所有表示之溫度爲攝氏溫度。 (四）實施方法由下列未限定實例可獲得本發明之進一步了解。實例1 生產無PCV1污染之ρκ-15細胞株 PCV2分離株之來源係來自自然發生PMWS之豬隻之脾臟組織樣品（PC V2系列鑑定號碼408 95，指名爲”分離株 40895 " )(M. Fenaux ei α/.，2000，以 PCV2 -專一性 -46- 1314580 抗體之免疫組織化學染色（IHC)確認PC V2抗原在組織中之存在，脾臟組織儲存在-8 0°C直到使用。 PK-15 細胞株購自 American Type Culture Colie ction(ATCC編號CCL-33)，持續以PCV1感染此細胞株 (G. C . Dulac and A. A f s h ar，1 9 8 9，s wpr a)，雖然只有 P K -1 5 細胞之次族群持續被感染（id.)，以終點稀釋生產無PCV1污染之PK-15細胞株。步驟進行程序如下：將PK-15細胞生長在含Earle's鹽類和L-穀醯胺酸之MEM培養基（Life Technologies, Inc.，Grand Island，NY)並補充 10 % 胎牛血淸 (FBS)及 IX 抗生素（Life Technologies，lnc.)，將群集單層細胞（con fluent cell monolayers)以胰蛋白酶分解開，然後計數細胞數，並依序稀釋至終點爲每0.2毫升中有一個細胞數，終點稀釋被放置在96孔平盤中並使其由單一細胞開始生長至單層細胞。每一孔中的細胞使用能夠偵測並區分 PCV1 及 PCV2 之 PCR-RFLP 分析來測試 PCV1 DNA(M. Fenaux αΛ，2000, 經試驗爲PCV1陰性之PK-15細胞， PCR-RFLP分析隨後被詳述。將無PCV1之PK-15細胞株經過 5次另外的繼代並由PCR發現每一繼代中PCV1 DNA爲陰性的。由終點稀釋持續感染之取自A T C C的P K -1 5細胞中產生4 個無PCV1污染之細胞株，再繼代5次後，細胞株保有PCVI 陰性之PCR試驗，隨後詳述其中之一種細胞株，且當以PC V2 分子DNA選殖株轉染細胞時，顯示其能夠支持PC V2複製（第 2圖）並被PCV2病毒感染。在活體外轉染PCV2分子DNA選 -47- 1314580 殖株進一步使用經選殖的細胞以生產用於動％胃驗$ 生物學上純的PCV2感染性病毒種源。實例2 PCV2感染性DNA選殖株之建構爲了建構PCV2分子DNA選殖株，依據PCV2分離株40895 號之已公告序列來設計一對PCR引子（M. Fenaux 2000， supra) : 向前引子 F-PCVSAC2(5'- GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3')，陳歹!J 在 SEQ ID NO:5中，以及反轉弓|子尺_卩(^8八€2(5，-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3，），陳歹[J 在 SEQ ID NO:6中，此對引子增幅含有獨特Sacll限制酶切割位重複區域之完全的PCV2基因體（第1圖）。使用QiAamp DNA Minikit (Qiagen，Inc·，Valencia，CA)由自然感染 PMWS豬的脾臟組織樣品中提取DNA (分離株40895號）（M. Fenaux ei «Λ，2000, 經提取之 DNA 以 AmpliTaq Gold 聚合酶（Perkin-Elmer，Norwalk, CT)之 PCR 增幅，PCR 反應由起始酵素在95°C作用9分鐘之活化步驟，隨後以在94°C1 分鐘之變性、48°C 1分鐘之退火結合及最終延展在72°C 7 分鐘之35次循環，以膠體電泳分離預期大小之PCR產物並以〇61^(：1^11套組之玻璃乳（§1^5111丨11〇步驟來純化（8丨〇101, Inc.，La Jolla，CA)。爲了建構含有PCV2基因體之成對二聚物之分子DNA選殖株，首先將含有完全PCV2基因體之PCR產物連接至 advanTAge質體載體（Clontech，Palo Alto, CA)。Co/z· -48- 1314580 DH5 a勝任細胞被轉形。重組質體以限制酶消化來確認，由a d v a η T A g e載體以 SacII限制酶消化而切割出全長度PCV2基因體DNA，經消化之PCV2基因體DNA與T4 DNA連接酶在37°C下只作用10 分鐘，其有利於縱列二聚物之生產。縱列二聚物隨後被選殖入 pBluescript SK( + )載體（pSK)(Stratagene Inc.，LaJolla， CA)(第1圖）’含有PCV2基因體縱列二聚物之重組質體（在此指PCV2分子DNA選殖株）以PCR、限制酶消化及DNA定序確認，重組質體之DNA濃度以分光光度計決定。以PCR來增幅PCV2之完全基因體（分離株40895號）明確地建構感染性PCV2分子DNA選殖株，將此完全PCV2基因體之兩個複製以縱列連結至pSK載體以生產PCV2分子 DNA選殖株（第1圖）。PCV2分子DNA選殖株之感染力以PK-1 5細胞之活體外轉染決定。以PCV2-專一性抗體確認之 IFA，其分子DN A選殖株在活體外爲感染性且約10-15 %之 PK-15細胞被轉染，PCV2專一性抗原以IFA在核內爲可見的，且在轉染細胞之細胞質中爲較少程度（第2圖），以空的 pSK載體模擬轉染之細胞保持對PCV2抗原爲陰性的。實例3 以PCV2分子DNA選殖株在活體外轉染及生產生物學上純及同源的PCV2感染性病毒種源爲了測試分子DN A選殖株在活體外之感染力，將無PC VI 污染之PK-15細胞生長在8孔之LabTek腔室玻片中，當PK-15 細胞達到約8 5 %之群集時，依據製造商所提供之操作手冊， 1314580 以使用 Lipofectamine Plus試劑（Life Technologies, Inc)之分子DNA選殖株轉染細胞，包括以空的pSK載體模擬轉染細胞作爲對照組。轉染後3天，以含有8 0 %丙酮及2 0 %甲醇之溶液在4°C下固定細胞20分鐘，並執行使用PCV2專一性兔多株抗血淸之免疫螢光試驗來決定在活體外分子DN A選殖株之感染性（見下述）。爲了產生作動物接種實驗之生物學上純及同源的PC V2 感染性病毒種源，將無PCV1污染之PK-15細胞在T-25培養瓶中培育並以PCV2分子DNA選殖株轉染，PK-15細胞在T-25 瓶中生長至約85%群集時，在轉染之前以無菌PBS緩衝液淸洗細胞一次，在T-25瓶之每一轉染反應中，將12μβ之PCV2 質體與16μ1之Plus試劑在0.35毫升之MEM培養基中混合，包括以空的pSK載體模擬轉染細胞之瓶作爲對照組。在室溫下培育15分鐘後，將50μ1之被稀釋在0.35毫升之MEM培養基之Lipofectamine試劑加入此混合物中並在室溫下另培育15分鐘，然後將此轉染混合物加至含有2.5毫升新鮮 MEM之PK-15細胞T-25瓶，在37°C下培育3小時後，以新鮮含有2%FBS及IX抗生素之MEM替換培養基，在轉染後3天收成此經轉染的細胞並儲存於-80 °C直到被使用。病毒種源之感染性力價以IFA決定（見下述）。基本上，生物學上純及同源的PCV2感染性病毒種源係以 PCV2分子DNA選殖株轉染PK-15細胞而產生，由於經轉染之細胞碎片可成功用於感染PK-15細胞，故在活體外轉染所生產的PCV2病毒顆粒是有感染性，因此，當在活體外轉染 1314580 時，PCV2分子DNA選殖株能夠產生感染性PCV2病毒顆粒。由轉染細胞製備之同源PCV2病毒種源之感染性力價被決定爲lxl 0 4 5 TCID5()/ml，在第2組中使用此病毒來接種豬隻，以空pSK載體模擬轉染之細胞之碎片不能感染PK-15細胞。實例4 以免疫螢光試驗（IFA)定量病毒爲了決定同源PCV2病毒種源之感染性力價，在8孔 LabTek有凹槽玻片上培養 PK-15細胞，連續10倍在MEM中稀釋此病毒種源，且每一稀釋被分別培育於生長在10孔 LabTek有凹槽玻片之單層PK-15細胞中，包括未接種細胞之孔作爲對照組。接種後3天，以含有80%丙酮及20%甲醇之溶液在4°C下固定被感染的細胞20分鐘，以PBS緩衝液淸洗細胞後，將此經感染的細胞與經稀釋之PCV2-專一性兔多株抗血淸一·起在37 °C培育1小時（S_ D. Sorden ei α/·， "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue，1’ J. Vet, Diagn. Invest. 11:528-530 (1999))，然後以 PBS緩衝液淸洗細胞3次，並與二次性經FITC標定山羊抗兔 IgG —起在 37 °C 培育 45 分鐘（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc，Gaithersburg, MD)，以 PBS緩衝液淸洗玻片3次後，將氟襯紙G(flu〇r〇m〇unt-G)固定於載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片並在螢光顯微鏡下檢查，計算每毫升之50% 1314580 組織培養感染性劑量（TCID5(1/ml)。初期以含有PCV2基因體單一複製之質體建構轉染細胞，但由單一基因體建構之感染性PCV2力價甚低於含有成對基因體之力價，因此含有 PCV2基因體之二聚物形式之質體建構在活體外及活體轉染實驗中被使用。實例5 以PCV2分子DNA選殖株在豬活體中轉染及以同源PCV2感染性病毒種源實驗接種豬隻將40隻4週齡之無特定病原（SPF)豬隨機分成每間10隻動物至4間房間中，在接種前，測試SPF豬之PCV、PRRSV、 PPV及豬E型肝炎病毒之抗體。第1組豬未被接種並作爲對照組。第2組每一豬隻，以約1.9x 105TCID5。之衍生自PCV2分子DNA選殖株之PCV2感染性病毒種源作鼻內接種。第3組豬隻直接由肝內注射接受PC V2分子選殖株之重組質體DN A，透過超音波導向技術，每一豬隻注射總共20〇Rg之重組質體 DNA(經選殖的PCV2質體DNA)至肝臟的6個不同位置中。第 4組豬每一隻直接注射總共200pg之重組PCV2質體DNA表面腸骨淋巴結中，且每一淋巴結接受兩次分離的注射。每曰監控疾病之臨床症狀，在接種後第〇、7、14、21、28及35 天（DPI)收集每一動物之血淸樣品，在21DPI時，隨機自每一組中選出5隻豬並進行屍解，每一組剩下的5隻動物在35 DPI時屍解，在屍解時收集各種組織及器官並進行組織學檢查及免疫組織學染色（見下述）。 -52- 1314580 此結果顯示在下表1中，第2、3及4組之所有被接種豬在 0 DPI對PCV2抗體爲陰性的，在第1組之未接種對照組中，有兩頭豬在〇 DPI時具有可偵測的PCV2母體抗體，在此兩頭仔豬之母體抗體在7 DPI時會減弱，在對照組10頭未接種之任一豬中未偵測到PCV2抗體之血淸轉換。在第2組以鼻內接種PCV2感染性病毒之豬中，在21 DPI時有1頭仔豬血淸轉換成PCV2抗體，在35 DPI之前，第2組剩下的5頭豬中有4頭豬已血淸轉換。由第3及4組之轉染動物中的血淸轉換首先出現在28 DPI時，在35 DPI之前，第3組剩下5頭豬之5頭豬及第4組剩下5頭豬之3頭豬已血淸轉換成PCV2抗體。在3及21 DPI時測試所有豬之PPV抗體，以及在35 DPI時測試剩下豬隻之抗體，對於普遍存在的豬傳染物PPV之母體抗體在SPF仔豬中偵測到，在所有仔豬中PPV HI抗體力價中只有1隻自3 DPI時顯著降低（平均力價爲1:2,665 )，說明了在此等仔豬中所偵測到的抗體爲被動獲得的。1隻仔豬有輕微增加的PPV HI力價，爲在3 DPI之1:32至21 DPI之1:64，其很可能是由於試驗變量造成。在〇、21及35 DPI時自所有豬收集的血淸樣品進一步以公開的PCR分析測試PPV DN A (J. M. Soucie et al·, "Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate: C porcine factor VIII concentrate," Transfusion 40:708-711 (200 0))，在任一 DPI之豬中未偵測到PPV毒血症’此進一步說明了豬隻未受PPV感染。 1314580 表1.在接種PCV2活病毒或直接注射經選殖的PCV2質體 DNA之豬中血淸轉變成PCV2專一性抗體_ 接種後之天數耑接種物接種途徑 0 7 14 21 28 35 1無 2/10a 0/10 0/10 0/10 0/5 0/5 2 PCV2活病毒b 鼻內 0/10 0/10 0/10 1/10 1/5 4/5 3 PCV2DNAe 肝臟內 0/10 0/10 0/10 0/10 1/5 5/5 4 PCV2DNAC 淋巴結內 0/10 0/10 0/10 0/10 1/5 3/5 aPCV2抗體以ELISA測量，陽性數目/測數數目。 b產自以PCV2分子DNA選殖株轉染之PK-1 5細胞之生物學

上純及同源的PCV2病毒種源。 £在？3反質體中之經選殖的PCV2基因體DNA。實例6 PCR-RFLP 分析爲了測量以PCV2分子DNA選殖株轉染之豬以及以pCV2 感染性病毒種源感染豬隻的PC V2毒血症，在不同DPIs收集血淸樣品以先前描述之PCR-RFLP分析的一般方法來測試 P C V 2 D N A 之存在（Μ · F e n a u X e ί <3 / ·，2 0 0 0，W p r α)。使用 DNAzol®試劑，依據製造商（Molecular Res earch Center, Cincinnati，OH)所提供之操作手冊，自5〇μ1之每一血淸樣品提取病毒的DNA，將提取之DNA再次懸浮於無DNA分解 -54- 1314580 酶、RNA分解酶及蛋白質分解酶的水中並以PCR-RFLP (id.) 測試PCV2 DNA。定序自所選擇的動物中得到的PCR產物以分類感染豬隻之病毒起源。自所有對照組及接種動物，在〇、7、丨4、21、28及35DPIS 時收集血淸樣品並以PCV2 DNA (id)之偵測來試驗PCV2毒血症，此結果顯示在下表2中。在第1組未接種豬中之任一 DPI並未偵測到PCV2 DNA。第2組10隻豬中在14 DPI時有7 隻偵測到毒血症以及35 DPI時10隻豬中有8隻偵測.到毒血症，毒血症只持續數週，因爲在28 DPI及35 DPI時，在第2 組剩下的所有5隻豬中皆未偵測到PCV2 DNA。在第3組以肝臟內注射PCV2分子DNA選殖株之豬隻中，8/10豬在14 DPI 有毒血症且在35 DPI前9/10已可偵測到病毒血症。第4組以 PCV2分子DN A選殖株注射至淋巴結之豬隻中，10隻豬中有2 隻於14 DPI時及10隻豬中有8隻於21 DPI時有毒血症。當直接注射至SPF豬之肝臟及表面腸骨梁巴結時，此結果顯示 PC V2分子DN A選殖株爲感染性的。由所選擇動物放大.的 PCR產物被定序，由所選擇動物放大的pCR產物與PCV2分子DN A選殖株之相對應區域之序列一致。表2.在接種及對照組豬隻血淸之毒血症（PCV2 DNA)偵測接種後之天數組別接種物接㈣徑 0 7 14 21 28 35 總數 1 Μ 0/1 oa 0/10 0/10 0/10 0/5 0/5 0/10 2 PCV2活病毒b 鼻內 0/10 0/10 7/10 5/10 0/5 0/5 8/10 1314580 3 PCV2 DNAC 肝臟內 0/10 0/10 8/10 6/10 3/5 3/5 9/10 4 PCV2 DNAC 淋巴結內 0/10 0/10 2/10 8/10 2/5 0/5 8/10 a每一組1 0隻豬，陽性數目/測數數目。 b產自以PCV2分子DNA選殖株轉染之PK-15細胞之生物學上純及同源的P C V 2病毒種源。 e在pSK質體中之經選殖的PCV2基因體DNA。實例7 臨床評估在0 DPI及屍解時稱量隻豬體重，由〇至35 DPI中每隔一天即紀錄直腸溫度及範圍由0至6(0 =正常的，6 =嚴重的）之臨床呼吸疾病 g平分（P. G. Halbur ei 〇/.，"Comparison of the pathogenicity of two U. S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the

Leiystad virus，" Vet. Pathol· 32:648-660 (1995))。臨床觀察包括中樞神經系統疾病、肝病（黃疸）、肌肉骨骼疾病之證據，以及身體狀況的改變亦每日被紀錄。爲了評估巨觀的病理學及組織學，在21及35 DPI時隨機自每一組選出5頭豬來屍解，在屍解時，屍解組員對豬隻之感染狀態是不知道的，在所有豬上進行完全的屍解。以先前描述的評分系統（id.)爲基礎，紀錄每一隻豬所估算的肺臟之巨觀可見的肺炎百分比’此評分系統以構成完整肺臟之每一肺葉之大約體積爲基礎：右前葉、右中葉、左前葉 -56- 1314580

之前部及左前葉之後部，其每一個貢獻約1 0%總肺臟體積，附屬葉貢獻5%，以及右及左後葉每一個貢獻27.5%，其它傷害如淋巴結加被分開注意的。取鼻甲骨、肺臟（七個切片） (id.)、心臟、腦、淋巴結（氣管支氣管、腸骨、腸繫膜、舌下）、扁桃腺、胸腺、肝臟、膽囊、脾臟、關節、小腸、結腸、胰臓及腎臟作組織學切片檢查，樣品以肓目方式標號來做組織學檢查並給予主觀上評分肺臓、淋巴結及肝臟傷害之嚴重性。肺臟計分範圍由約0(正常）至3 (嚴重的淋巴組織球性間質性肺炎），肝臟評分範圍由0(正常）至3 (嚴重的淋巴組織球性肝炎），由濾泡之淋巴樣消耗估計量，淋巴結評分範圍由〇(正常至淋巴樣消耗）至3 (濾泡之嚴重淋巴樣消耗及組織球取代）。

血淸學步驟涉及到達1 1至1 2日齡以及所有豬於0、7、 14、21、28 及 35DPIS 之收集血液，使用 HerdCheckPRRSV ELISA(IDEXX Laboratories, Westbrook. ΜΑ)分析對 PRRSV 之血淸抗體，以血球凝集抑制（HI)試驗偵測抗PPV之血淸抗體（H. S. J ο o e t al., " A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1 976))，以基於重組PCV2之ORF2蛋白質所作之經修飾間接ELISA來偵測PCV2之血淸抗體（P. N awagitgul e t al., "Modified indirect porcine circovirus (P C V) type 2-based and recombinant capsid protein (0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to P C V," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 -57- 1314580

(2002))。部分純化的PCV2抗原由以含有PCV2之主要衣殻 ORF2蛋白質之重組桿狀病毒所感染之Hi Five細胞 (Invitrogen，Carlsbad, CA)製備而來（P .Nawagitgul e t al.， "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000))。感染野生型桿狀病毒之Hi Five細胞之細胞碎片以相似幫法製備並作爲陰性對照組抗原。在4 °C下將I mm u 1 ο η 2 ΗΒ聚苯乙稀微定量盤（Dynex Technologies Inc, Chantilly, VA)塗覆適當濃度之陽性及陰性抗原36小時，將ΙΟΟμΙ之以 1:100在 5 %牛奶稀釋劑（Kirkegaard & Perry Laboratories， Inc.)中稀釋之每一血淸樣品加至每一孔中，將血淸樣品作四次測試：2孔用作對照組抗原及2個平行孔用來作PCV2抗原，每一盤中包括陽性對照組及陰性對照組血淸，此血淸被培育在37°C 30分鐘，然後以含有0.1% Tween-20之0.1 Μ PBS緩衝液淸洗5次，以過氧化酶標定之二次抗豬IgG(Sigma Co, St. Louis, MO)在37°C下培育30分鐘，再次淸洗此盤，並在37°C下以2,2’-次偶氮基-二- (3-乙基苯并苯并噻唑啉-6-磺酸鹽）（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc)培育 15 分鐘使其呈色。在4 0 5 nm讀取光學密度値（OD)。每一測試及對照組血淸減去含有PCV2抗原的平行孔之陰性抗原之孔之平均OD値計算出校正的〇D値。分成被測試血淸樣品（S)之校正OD値及陽性對照組血淸（P)將資料正規化，並被報告爲 S/P比率，樣品具有各〇.12、0.12至0_2及>0.2之S/P比率，分別被認爲是陰性、模稜兩可的及陽性的。， -58- 1314580 由臨床評估之結果，無對照組及經接種豬隻顯示出相似於臨床P M W S之明顯疾病症狀，在此四組之任一組間，其在增重或平均直腸溫度間無差異，第1組之對照組在整個實驗期間內維持正常，在轉染PCV2 DNA及感染PCV2病毒的組於8至14DPI時在大部分豬中觀察到輕微短暫的呼吸疾病，其在個別豬中具有1·至2天期間以及整組豬爲5 - 6天的輕微呼吸困難（臨床呼吸評分爲1至2)之特徵。屍解時在對照組豬中無觀察到巨觀病變，經接種之3組豬中具有限制於肺臟及淋巴結中（見下表3 )，此傷害相似於轉染PCV2質體DNA及感染PCV2病毒組的豬，在21 DPI 時，肺臟無法塌陷並涉及0-2%之肺臟具有隨機、多處、中度之黃褐色至紫色界限淸楚的區域聯合（第3圖），以及在35 DPI時有0-13%之肺臟。在第21及35 DPI之大部分3組接種 PCV2豬之淋巴結全身性加大爲正常大小之2至5倍，爲結實及黃褐色的（第3圖）。在對照組之任一組織中除了肝臟外，顯微檢查無顯示出傷害，對照組1 〇隻中之8隻豬具有非常輕微之多處淋巴漿細胞性發炎佔優勢地在肝臟圓柱形區域中，此在正常豬隻中常常會觀察到並被認爲是正常背景（P. G. Halbur etal.， 2001， supra)。由2組轉染PC V2質體DNA (肝內及淋巴結內）及感染 PCV2病毒（鼻內）之豬在腦、肺臟、心臟、腎臟、淋巴組織（扁桃腺、淋巴結、脾臟）、迴.腸及肝臓（見下表4)具 -59- 1314580 有相似的傷害，在3組接種組之30隻中有23隻觀察到腦傷害，且具有輕至中度多處淋巴漿細胞性腦膜炎之血管周圍束口及膠樣變性之特徵，在接種PCV2之30蒦豬中有28隻觀察到肺臟傷害，且具有輕至中度支氣管周圍淋巴-漿細胞性及組織球支氣管間質性肺炎（第3C圖）。在21 DPI由感染 PCV2病毒第2組之一隻豬屍解時，以及在35 DPI各至由2個轉染PCV2質體DN A之組之一頭豬中屍解時在支氣管之基質膜及支氣管周圍區域具有纖維素增生及肉芽腫性炎症之潰瘍及增生性支氣管炎，在18/30之經接種PCV2豬中亦觀察到輕微多處淋巴漿細胞性心肌炎，在14/30之接種PCV2豬隻中，觀察到輕至中度多處淋巴漿細胞性間質性腎炎，在胸線中未觀察到傷害，有輕至中度淋巴消耗（第4B圖），且在 2 8/3 0之接種PCV豬之扁桃腺、7/30之脾臟以及26/30淋巴結中觀察到濾泡之組織球取代。在21 DPI時3組以鼻內接種 PC V2病毒的豬中觀察到具有巨大細胞之中度肉芽種淋巴腺炎（第4C圖），在經轉染PCV2質體DNA組之每一組中有1隻在 35 DPI時觀察到。在35 DPI時，於感染PCV2病毒組中3/5豬隻、肝內轉染PCV2質體DNA組中3/5豬隻，以及淋巴結內轉染PCV2質體DNA組中1/5豬隻觀察到輕微淋巴漿細胞性及組織球性小腸結腸炎。轉染PCV2質體DNA組之每一組的1 頭豬中具有組織球性取代之輕微淋巴消耗及在帕氏結中少量巨大細胞。在接種PC V2豬之29/3 0中觀察到輕微至中度淋巴漿細胞性肝炎，在21 DPI時，每一轉染PCV2質體DNA組之1頭豬中觀察到低量廣泛散佈之個別壞死性肝細胞所圍 -60- 1314580 繞之淋巴組織球發炎，其它組織中的慯害是不明顯的。依據已公開的評分系統來評分在肺臟、肝臓及淋巴結中之顯微傷害（下表 4)(P. G. Halbur ei α/., 2001，P_ G. Halbur et al., 1995, supra) >其它組織及器官中無可接受的評分系統。3組接種之PCV2組之豬中，肺臓及淋巴結的平均評分與在第1組之對照組具有統計學上差異，3組接種PCV2 組之豬中’肝臟傷害之平均評分與對照組則無統計學上差異。表3對照組及接種PCV2的豬中肺臟及淋巴結之巨觀傷害組別接種物 21 DPI 35 DPI 接種途徑淋巴結肺臟淋巴結肺臟 1 ίΕ / » Ν\ 0/5a 0/5 0/5 0/5 2 PCV2活病毒b 鼻內 5/5 1/5(0-1)° 5/5 4/5(0-5) 3 PCV2 DNAd 肝臓內 2/5 2/5(0-2) 5/5 2/5(0-13) 4 PCV2 DNAd 淋巴結內 4/5 5/5(0-1) 3/5 1/5(0-9) a每一組5隻豬在21 DPI時屍解，剩下5隻於35 DPI時屍解，陽性數目/測數數目。 b產自以PCV2分子DNA選殖株轉染之PK-15細胞之生物學上純及同源的PCV2病毒種源。 1昜害數目/測試數目（肺臟受影響之巨觀可見的肺炎傷害之估計百分比範圍，0-100%) <1在？3尺質體中之經選殖的PCV2基因體DNA。 1314580 布分之害傷學織組中隻豬之組 2 V C Ρ 種接及組照對 4 表 DPf 接種途徑接種物組別扁桃腺腎臓、：b臟 /°二甾月迴昜脾臟 LN」肝臟。市藏σ- 1 無 21 0/5(0.0) 4/5(0.8) 0/5(0.0) 35 0/5(0.0) 4/5(0.8) 0/5(0.0) 2 PCV2 鼻內 21 5/5(1.6) 5/5(1.2)3/5(1.2) 病毒 35 3/5(0.6) 4/5(1.0) 4/5(0.8) 3 PCV2 肝內 21 5/5(1.0^ 5/5(1.0) 5/5(1.0) DNA 35 5/5(1.2) 5/5(1.0) 4/5(1.0) 4 PCV2 淋巴 21 5/5(1.2) 5/5(1.0)5/5(0.8) DNA內 35 5/5(1.0) 5/5(1.2) 5/5(1.4) // ^ // ο ο ο 5 5 5 // / // ο ο 1 5 5 5 1/ // ---/ 0 0 3 5 5 5 // / 1/ 0 0 4 5 5 5 1/ ---., // ο ο ο 5 5 5 / ,---.- / ο ο ο 5 5 5 / / / ο ο 1 3/0/ /5/5 11 11 5 5 0/4/ 5 5 4/5/ 5 5 3/0/ 5 5 0/0/ /5/5 3 1 3/4/ 5 5 3/0/ 5 5 0/0/ 5 5 2/0/ /5/5 4/4/ 3/0/ 5/5 5 3 2/: /5 3 5 3/ /5 3 /5 11 5 0/ 5 0/

a接種後天數（DPI):每一組5隻在21DPI時屍解並於35DPI 時屍解每一組剩下的5隻豬。 •^陽性數目/測試數目（平均組織學肺臟評分：〇=正常、卜輕度間質性肺炎、2 =中度、3 =嚴重） °陽性數目/測試數目（平均組織學肝臟評分：0 =正常、1 = 輕度間質性肝炎、2=中度、3 =嚴重） £1陽性數目/測試數目（平均組織學淋巴結（LN )消耗評分·· 0 =正常、1=輕度、2 =中度、3 =嚴重）實例8 免疫組織化學在DPIs 21及35時屍解所收集的所有組織上實行PCV2專 —性抗原之免疫組織化學（IHC)偵測，在IHC中使用兔多株 PCV2專一性抗血淸，其一般步驟先前已被描述（S. D. Sorden etal., 1 999，supra) ° -62- 1314580 爲了 PCV2抗原之偵測及組織分布上，在21及35 DPI屍解之所有豬隻之腦、肺臟、鼻甲骨、心臓、腎臓、扁桃腺、淋巴結、脾臟、胸腺、迴腸、肝臟、膽囊及胰臓上執行PCV2 抗原之IHC染色，對照組之所有組織之PCV2抗原是陰性的，在3組接種PCV2組中PCV2抗原組織分布是相似的（見下表5)。在腦中，發現PC V2抗原在腦膜及脈絡叢之單核細胞、類纖維母細胞及內皮細胞中是佔優勢的，而在大腦及小腦中之內皮細胞及血管周圍單核細胞則較不常見。在肺臟中，PC V2抗原在肺泡及中隔巨噬細胞間以及呼吸道基質膜之類纖維母細胞中被偵測到（第3D圖）。在心臟，PCV2抗原在廣泛散佈性巨噬細胞及內皮細胞中被偵測到。在腎臟中’於組織間隙之管內上皮及單核細胞間偵測到PC V2抗原。在淋巴組織中（淋巴結、脾臓、扁桃腺及皮氏斑（Peyer’s patches) ) ，PCV2抗原主要在巨噬細胞及類樹突狀細胞以及濾泡間巨大細胞被偵測到（第4D圖）。PCV2抗原亦在小腸之基質膜中的巨噬細胞間偵測到。在肝臟中，PCV2抗原在單核細胞及庫佛氏（Kupffer )細胞間偵測到。在鼻甲骨、胸腺或膽囊中未偵測到PCV2抗原。表5以免疫組織化學在對照組及接種PCV2的豬隻中PCv2 專一性抗原之偵測及分布扁桃腺腎臟心臓腦週曰资 /'Pcnrr5 胸腺脾臟 LN 肝臓肺臓 Dpf 接種途徑接種物組別 1 m 21 0/5b 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 35 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2 PCV2 鼻內21 4/5 5/5 5/5 3/5 0/5 3/5 3/5 1/5 1/5 2/5 1314580 病毒 35 1/5 2/5 3/5 2/5 0/5 0/5 2/5 0/5 0/5 0/5 PCV2 DNA 肝內 21 5/5 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 5/5 1/5 0/5 2/5 35 4/5 4/5 3/5 4/5 0/5 3/5 4/5 2/5 2/5 3/5 PCV2 淋巴 21 4/5 4/5 5/5 4/5 0/5 3/5 3/5 0/5 0/5 3/5 DNA 內 35 V5 4/5 5/5 4/5 0/5 2/5 3/5 1/5 0/5 4/5 a接種後天數（DPI):每—組5隻在21DPI時屍解並於35DPI 時屍解每一組剩下的5隻豬° b陽性數目/測試數目實例9 無病原性P c V 1感染性DN A選殖株之建構用來建構PCV1感染性DNA選殖株之步驟基本上與在此所述之PCV2相同，一對PCR引子’呈現於SEQ ID NO:7之 KPNPCV1.U 及 SEQ ID NO:8 之 KPNPCV1.L (見下表 6)，基於PCV1已公開序列來設計，此對引子增幅具有含獨特限制酶切割位重複區之PCV1完全基因體。pCVl病毒之DNA 自被污染之獲自 American Type Culture Collection(ATCC accessionnumberCCL-33)的 ATCCPK-15細胞株中提取，使用QIAmp DNA套組自持續感染PCV1之ATCC PK-15細胞提取 PCV1 DNA(Qiagen, Inc_，Valencia，CA.)。經提取之 DNA 以具 AmpliTaq Gold 聚合酶（Perkin-Elmer, Norwalk, CT)之 PCR放大，PCR循環由95°C之起始步驟作用10分鐘，隨後以在94°C1分鐘之變性、48°C 1分鐘之退火結合及在72°C 2分鐘之延展之35次循環，以及7分鐘之最終展延所組成。預期大小之PCR產物以膠體電泳分開並以使用Geneclean套組 1314580 (Bio 1 01，Inc.，La JolU，CA)之玻璃乳（glassmilk )步驟純化，首先將含有完全PCV1基因體之經純化之PCR產物連結至 advanTAge質體載體中（ciontech，Palo Alto, CA)，大腸桿菌DH5 a勝任細胞被用來轉形，重組質體以限制酶消化來確認’由advanTAge載體以oh限制酶消化而切割出全長度 PCV1基因體DNA，在37 °C將經消化之PCV1基因體以T4 DNA連接酶連結至 pBluescript SK ( + )(pSK)載體（Stratagene

Inc·，La Jolla，CA)中隔夜，含有PCV1基因體之全長PCV1 基因體之重組質體以Qiagen質體mini kit (Qiagen，Valencia, CA)分離並以限制酶消化及DNA定序確認。全長PCV1基因體DNA以消化自PSK載體切出，並形成二聚物以製作 PCV1感染性DNA選殖株如在實例2之PCV2感染性選殖株中所述。由於發現二聚物化前後縱排的DNA選殖株有利於有效的轉染細胞及產生感染性病毒顆粒，因而製作此前後縱排的二聚物，爲了製作p C V 1 D N A之前後縱排二聚物，在3 7 °C以T4 DNA連結酶將經消化的PCV1基因體DNA連結僅10 分鐘，其會偏向前後縱排二聚物的產生，此前後縱排二聚物隨後被選殖至 pBluescript SK( + ) (pSK)載體（Stratagene,

LaJolla, CA)。含有PCV1基因體（載此係指"PCVl DNA選殖株”）之前後縱排二聚物之重組質體以P CR、限制酶消化及 DNA定序確認，重組質體之DNA濃度以分光光度計決定。表6在此發明中所使用之寡核苷酸引子_ 引子方向弓丨子序列應用 — 建構引子： KPNPCV1.U. a 5'-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-'3 PCVI DNA選殖株建構 >3 (相當於 SEQIDNO:7) KPNPCV1 丄. < 5，-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-’3 PCV1 DNA 選殖株建構 -65- 1314580 湘當於 SEQIDNO:8) Hpa 1-2 < 5'- GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAAC CATTACG-3 (相當於SEQ ID NO:9) PCVl-2 DNA選殖株建構 Nar 1-3 > 5'- GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCA 丁 CCTATAAA AGTG-，3 (相當於 SEQIDNO:10) PCVl-2 DNA選殖株建構 Psi 1-5 > 5'-AGGTTATAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-'3 (相當於 SEQroNO: 11) PCVl-2 DNA選殖株建構 Acl 1-6 < 5,-GGAAACGTTACCGCAGAAGAAGACACC-<3 (相當於 SEQIDNO:12) PCV1-2 DNA選殖株建構 BgMI-ORP2 5’· ACTATAGATCTTTATTCATTTAGAGGGTCTTTCA PCV2-1 DNA選殖株建構 > G-*3 (相當於 SEQIDNO:13) SpH-I-ORF2 < 5，-TACGGGCATGCATGACGTGGCCAAGGAGG-*3 (相當於 SEQIDNO:14) PCV2-1 DNA選殖株建構 Bgl-II-PCV2 < 5'- AGACGAGATCTATGAATAATAAAAACCATTAC GAAG-3 (相當於 SEQIDNO:15) PCV2-1 DNA選殖株建構 SpH-I-PCY2 偵測引子： > 5-- CGTAAGCATGCAGCTGAAAACGAAAGAAGTG- '3 (相當於 SEQIDNO: 16) PCV2-1 DNA選殖雛構 MCV1 > 5'-GCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGG-'3 (相當於 SEQIDNO:17) PCV1及PCV2偵測 MCV2 < 5VTCACACAGTCTCAGTAGATCATCCCA-，3 (相當於 SEQIDNO: 18) PCV1及PCV2偵測 Orf.PCVl < 5’-CCAACTTTGTAACCCCCTCCA-，3 (相當於 SEQIDNO:19) PCV1 及 PCV2-1 偵測 Gen.PCVl > 5，-GTGGACCCACCCTGTGCC-，3 (相當於 SEQIDNO:2〇) ?(^1及?(^1-2偵測巢套 Orf.PCVl < 5，-CCAGCTGTGGCTCCATTTAA-，3 (相當於 SEQIDNO:21) PCVl5：PCV2-lf#IIJ 巢套 Gen.PCVl > 5，-TTCCCATATAAAATAAATTACTGAGTCTT」3 (相當於 SEQIDNO:22) PCVl 及PCVl-2 偵測 Orf.PCV2 < S'-CAGTCAGAACGCCCTCCTG-'S (相當於 SEQIDNO:23) 卩(：¥2及?”1-2偵測 Gen.PCV2 > S'-CCTAGAAACAAGTGGTGGGATG-'S (相當於 SEQIDNO:24) PCV2SPCV2-1{#I 巢套 Orf.PCV2 < 5'-TTGTAACAAAGGCCACAGC-'3 (相當於 SEQIDN025) PC V2 及 PC VI-2 偵測巢套 Gen.PCV2 > 5，-GTGTGATCGATATCCATTGACTG-’3 (相當於 SEQIDNO:26) PCV^PCV2-1 偵測

引子方向實例10 當經轉染至無病毒污染之PK-15細胞時，PCVl DNA選殖株 -66- 1314580 之感染性評估 P c V 1分子D N A選殖株之感染性以活體外P K -1 5細胞之轉染來決定，以PCV1專一性單株抗體（由Dr. Gordon Allan, Belfast, U.K.贈送）之IFA確認PCV1分子DNA選殖株在PK-15細胞爲感染性的，以IF Α在經轉染細胞之核中可見PCV1 專一性抗原，而在細胞質則有較少程度的抗原，以空的pSK 載體所模擬轉染的細胞對PCV 1抗原爲陰性的。實例1 1 嵌合型PCV1-2病毒DNA選殖株之建構藉由使用PCV1及PCV2之感染性DNA選殖株建構無病原性PCV1與和PMWS有關之PCV2嵌合型病毒之間的嵌合型 PCV1-2DNA選殖株。爲了建構嵌合型PC\H-2 DNA選殖株，以PCV1基因體之骨架，自PCV1感染性DNA選殖株移除無病原性PCV1之ORF2衣殼基因，並以病原性PCV2之免疫生成性0RF2衣殼基因取代（見第5及6圖）-設計兩對PCR引子，用來作PCV2 ORF2之第一對引子，Psi 1-5陳列在SEQ ID N0:11以及Acl 1-6陳列在SEQ ID NO:12，被設計爲具有在引子5'端之點突變而創造出h/I及ΡίΠ限制酶切割位以增幅 PCV2之ORF2基因，並以點突變導入兩端的及限制酶切割位。PCV2 ORF2增幅之PCR反應由在95°C 9分鐘之起始步驟，隨後以在9 5 °C 1分鐘之變性、在4 8 °C 1分鐘之退火結合及72°C 1分鐘之延展的38次循環，以及72 °C 7分鐘之最終延展所組成。 -67- 1314580 第二對 PCR 弓I 子，Hpa 1-2 陳歹!J 在 SEQ ID NO:9 以及 Nar 1-3 陳列在SEQ IDNO:10，被設計用來增幅PSK +載體及其PCV1 基因體插入片段，PCR引子之5'端被導入點突變以創造出 iVarl及Hpal限制酶切割位，此引子增幅PSK +載體及其插入片段缺乏ORF2衣殼基因之PCV1基因體，即藉由使用PCV1 感染性DNA選殖株作爲PCR模板之PCV1基因體減去PCV1 ORF2 (pSK-PCVl AORFS)。PCR 反應由在 95°C9分鐘之起始步驟，隨後以在9 5 °C 1分鐘之變性、在5 0 °C 1分鐘之退火結合及72°C3.5分鐘之延展的38次循環，以及72°C7分鐘之最終延展所組成。以及Hpal消化PCV2 ORF2 PCR產物以移除導入的點突變，以Marl及Hpal消化pSK-PCVl 產物（缺乏PCV1之ORF2基因之pSK載體- PCV1基因體PCR產物）以移除PCR所導入的點突變，後者消化產生互補於以 m及Phi限制酶消化之PCV2 0RF2 PCR產物之突出端及頓端。經消化的P C V 2 Ο R F 2產物及經刪除〇 R F 2的p S K - P C V1 產物以T4 DNA連接酶連結以形成嵌合型PCV1-2基因體 DNA選殖株，其中PCV1之ORF2基因以PCV2之ORF2基因取代，一旦兩個PCR產物被消化及再次連結，所有PCR所導入用來促進選殖之點突變會被移除以造成嵌合型選殖株。轉形大腸桿菌DH5a勝任細胞，將含有嵌合型DN A選殖株之重組質體分離並以PCR、限制酶消化及部分DnA定序確認。以尺消化將全長嵌合型PCV1-2基因體自PSK +載體（重組質體）切除，然後嵌合型DNA基因體以短暫1〇分鐘之以T4 DNA連接酶之連結反應偏向線狀二聚物之形成以產生 1314580 PCV1-2嵌合型感染性DNA選殖株（第6圖），含有兩個複製之嵌合型病毒基因體之重組質體以PCR、限制酶消化及DN A 定序確認。實例12 PCVI-2嵌合型DNA選殖株在活體外感染力之評估嵌合型PCV DNA選殖株（具PCV2之免疫生成性衣殻基因之無病原性PCV1)之存活力在PK-15細胞中測試，當PK-15 細胞被轉染嵌合型病毒DN A選殖株時，在轉染後2天，以IF A 偵測病毒抗原專一性對PCV2 ORF2衣殼。在經轉染細胞中未偵測到PC VI衣殼抗原，此實驗指出嵌合型DN A選殖株在活體外爲感染性，在PK-15細胞中可複製並產生PC V2之免疫生成性衣殻蛋白質。實例1 3 相互嵌合型PCV2-1 DNA選殖株之建構爲了建構相互PCV2-1嵌合型DNA選殖株，在病原性PCV2 基因體之骨架上以無病原性PCV1之ORF2衣殼基因取代 PCV2之ORF2衣殼基因（第6圖），設計兩個PCR引子對： Bgl-II-〇RF2陳列在 SEQ ID NO:13及 SpH-I-ORF2陳列在 SEQ ID NO:14爲一對，增幅PCV1 ORF2基因並以點突變導入在兩端的及限制酶切割位；第二對PCR引子對， Bgl-II-PCV2陳列在 SEQ ID NO:15及 SpH-I-PCV2陳列在 SEQ ID NO: 1 6，藉由使用PCV2感染性DNA選殖株作爲PCR模板 1314580 增幅pSK載體及減去〇RF2基因之PCV2基因體（pSK-PCV2 △ ORF2)，並以點突變導入兩端5茗m及限制酶切割位。 pSK-PCV2 A〇RF2 產物及 PCV 1 ORF2 PCR產物以 5g/II及 ⑪限制酶消化以生產被連接在一起之互補的突出端及頓端’在轉形至大腸桿菌細胞後，分離可靠的重組質體並以酵素消化及部分DNA定序確認。以SacII消化將全長相互嵌合型PC V2-1基因體自重組質體中切出，如在此所述二聚物化以生產相互嵌合型P C V 2 -1感染性選殖株。實例14 具 PCV1、PCV2、PCV1-2 及 PCV2-1 DNA 選殖株之 PK-15 細胞在活體外轉染 PC V2選殖株在活體外及活體中之感染力已展現於上述實例3-5中，爲了測試PCV1及兩個嵌合型選殖株在活體外之感染力，依實例1之方法製備生長在8孔LabTek有凹槽玻片 (Nalge Nunc Int., Denmark)之無 PCV1污染的 PK-15細胞，當 P K -1 5細胞到達約8 0 %群集時，分別以P C V 1、P C V 2、P C V 1 -2及PCV2-1 DNA選殖株轉染細胞，使用Lipofectamine Plus Reagent依據製造商所提供之手冊（Life Technologies, Inc.)，包括以空的PSK載體模擬轉染的細胞作爲對照組。轉染後3天，將細胞以含有80%丙酮及20%甲醇的溶液在4°C下固定20分鐘，以使用抗PCV1 ORF2衣殻基因之單株抗體的間接免疫螢光試驗（IFA)確認感染力及在以PCV1及PCV2-1 DNA選殖株所轉染的細胞中病毒複製，單株抗體由Dr. G. Μ. Allan好意提供（G. M. Allan ei a/·, "Production, preliminary -70- 1314580 characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus," Vet. Immunol. Immunopathol. 43:3 5 7-3 7 1 ( 1 9 94))。以磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)淸洗經固定的細胞並與1:20稀釋的PCVI單株抗體一起在37°C培育1小時，然後將細胞以PBS淸洗3次並與螢光素異硫氰酸鹽（FITC) 標定的山羊抗鼠免疫球蛋白G(Kirkegaai_d & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.)在 37。C —起培育 45 分鐘，以PBS緩衝液淸洗3次後，以氟襯紙G ( fluoromount-G ) 覆蓋玻片，蓋上蓋玻片，在螢光顯微鏡下檢查。以PC V2及嵌合型PCV1_2 DNA選殖株轉染細胞之感染力以使用對 PC V2專一性抗體之IF A確認，如在實例4中所述。 PCV1、嵌合型PCV1-2DNA及相互嵌合型PCV2-1 DNA選殖株之感染力以PK· 1 5細胞之活體外轉染來證實，將完全 PCV1基因體之兩個一致的複製以前後縱列連接至PSK載體以生產PCV1 DNA選殖株（第6圖），嵌合型PCV1-2DNA選殖株爲以無病原性PCV1基因體爲骨架，將PCV1之ORF2衣殼基因以病原性P C V 2之彼等基因取代，相互嵌合型P C V 2 -1 DNA選殖株爲以病原性PCV2基因體爲骨架，將PCV2之 ORF 2衣殼基因以無病原性PCV1之彼等基因取代。若在活體外爲感染性的，在經轉染的PK-15細胞中，嵌合型PCV1-2 DNA選殖株將產生PCV2之ORF2衣殻抗原且相互嵌合型 PCV2-1 DNA選殖株將表現PCV1 ORF2衣殼抗原。此結果顯示當經轉染至PK-15細胞時，PCV1、嵌合型PCV1-2及相互嵌合型PCV2-l DNA選殖株全都令人驚訝地顯示具感染 -71- 1314580 性，且表現各自的病毒衣殼抗原蛋白質如使用對PCV1或 PC V2專一性抗體之IFA所展現者。使用單株抗體抗PC VI ORF2及抗PCV2抗體之IFA確認PCV 1 D N A及P C V卜2 D N A選殖株爲感染性的。使用P C V 1 Ο R F 2專一性抗體之I F A顯示 PC VI-2嵌合型DN A選殖株亦爲感染性的，約10-20%之經轉染PK-15細胞對PCV1衣殼抗原及PCV2抗原爲陽性，並在經轉染係拋之核中表現PCV1 ORF2抗原（第7圖）。實例1 5 豬隻以PCV1、PCV2、嵌合型PCV卜2及相互嵌合型PCV2-1 DNA選殖株之實驗接種爲了評估嵌合型DNA選殖株之免疫生成性及病原性，將 40隻4-6週齡之無特定病原豬（SPF)隨機分派至5間房中，每間8隻。接種前，動物被測試對PCV、PRRSV、PPV及豬肝炎E病毒之抗體，此外，接種前血淸樣品以PCR測試PC VI 及PCV2核酸以確認豬並未自然感染此等病毒。PCV 1、 PCV2、PCV1-2及PCV2-1 DNA選殖株皆被直接注射經選殖的質體DNA至豬的表淺腸骨淋巴結來接種。第1組之豬接受磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS緩衝液）並作爲陰性對照組，將 2〇〇μ1之感染性PCV1 DNA選殖株注射至第2組每一隻豬之表淺腸骨淋巴結中，將200μ1之感染性PCV2 DNA選殖株注射至第3組豬隻中，第4組豬隻接受200 μΐ之感染性嵌合型 PCV1-2DNA選殖株，第5組每一隻豬接受200 μ1之感染性相互嵌合型PCV2-1 DNΑ選殖株，每日監測所有動物之疾病臨 -72- 1314580 床症狀。在接種後（DPI)-2、7、14、21、28、35、42 及 49 天自每一動物收集血淸樣品。在2 1 D PI時，將自每一組隨機選出的4隻動物屍解，每組剩下之4隻動物在4 9 D P I時屍解，如先前在實例7中所述，在屍解期間收及各種組織及器官，並進行組織學檢查。在豬隻中檢查PCV1、PCV2及嵌合型感染性DNA選殖株之免疫生成性，將在-2(0)、7、14、21、28、35、42 及 49 DPIs 自所有對照組及接種組動物所收集之血淸樣品，以P C R偵測經選殖之特定DNA序列、以IFA偵測抗PCV1抗體及以ELISA 偵測抗PCV2 ORF2抗體來分析PCV1、PCV2、PCV1-2及 PCV2-1毒血症。在接種前2天（-2 DPI)，所有5組之動物以PCR測試，PCV1及PCV2 DNA爲陰性的。陰性對照組動物在整個硏究期間對P C V 1及P C V 2毒血症爲陰性的（見下表7 )，在-2 D P I時，未接種之對照組5隻豬中具有可偵測的PCV2母體抗體，且在7 DPI時，2隻豬具有可偵測的P C V 1母體抗體（見下表8 )，在此等仔豬中對P C V 1及 PCV2兩者之母體抗體在21 DPI時會消退，在整個硏究期間’ 8隻未接種對照組豬中無血淸轉變成p c V 1或P C V 2被偵測到。在接種P cv 1之組中，在接種豬隻之7 D P I時首先偵測到病毒血症（下表7) ’且最後在35 DPI被偵測到。8隻接種PCVI 感染性DNA選殖株中之5隻動物爲PCV1毒血症陽性的，連續 PCV1毒血症之平均期間爲0.625週，在21 DPI前，在接種 -73- 1314580 P C V 1組之所有動物已血淸轉變成p c V 1且維持對p C V 1抗體爲陽性的直到在49 DPI之硏究結束時。在此所示之PCV2 DN A選殖株在豬隻中爲感染性的，在接種PCV2 DNA選殖株之組中，PCV2毒血症首先在7 DPI時被偵測到（下表7 )’在2 1 D P I前’所有接種p c V 2之第3組動物對卩(：¥2毒血症爲陽性的，？(：乂2毒血症之平均長度爲2.12 週。在7 DPI時’接種PC V2組之兩隻豬中有可偵測量之母體 PCV2抗體（下表8)，且在此等仔豬中母體抗體在14 DPI前會消退’血淸轉變成PC V2，以PC V2專一性ELIS A分析，，首先在35 DPI時偵測到，在42 DPI前，所有接種PCV2感染性DNA 選殖株之豬隻已血淸轉變成PCV2。在第4組接種PCV 1-2嵌合型感染性DNA選殖株之豬中，對嵌合型病毒專一性毒血症在14 DPI時首先被偵測到（下表 7)，7隻接種動物中之4隻在14 DPI至42 DPI間變成PCV1-2 之毒血症，嵌合型PCV1-2毒血症之平均長度爲1週，一隻豬在7及14 DPI時具有可偵測量之母體PCV2抗體，但母體在21 DPI前會消退（下表8)。血淸轉成PCV2 ORF2專一性抗體首先發生在28 DPI，在49 DPI前，所有接種嵌合型PCV1-2 DNA 選殖株之豬隻已血淸轉變成PC V2 ORF 2專一性抗體。在接種相互嵌合型PCV2-l選殖株豬隻中，在血淸樣品中未偵測到專一性對PCV2-1嵌合型病毒之病毒DNA(下表 7)，然而’在21 DPI前，第5組所有動物血淸轉變成PCV1 抗體，增幅自每一組選出的豬之PC R產物被定序，且每一組 -74- 1314580 在接種中所使用者被確認爲可靠的個別感染性選殖株。表7 .以重疊PCR在經接種組及對照組豬隻中毒血症之偵測組別接種物 DPI 總數 -2 7 14 21 28 35 42 49 1 PBSa 0/8b 0/8 0/8 0/8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/8 2 PCV1 DNAC 0/8 1/8 1/8 2/8 0/4 .2/4 0/4 0/4 5/8 3 PCV2 DNAC 0/8 3/8 6/8 7/8 1/4 2/4 2/4 0/4 8/8 4 PCV1-2DNA0 0/7 0/7 1/7 2/7 2/4 2/4 2/4 0/4 4/7 5 PCV2-1 DNAC 0/8 0/8 0/8 0/8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/8 a使用磷酸鹽緩衝食鹽水作爲陰性對照組。 b每一組8隻豬；陽性數目/測數數目。質體中之經選殖的基因體PCV或牽合型DNA。表8 在接種PCV2或嵌合型PCV1-2DNA選殖株之豬中血淸轉變成抗PCV2之抗體及在接種PCV1或嵌合型PCV2-1DNA. 選殖株之豬中血淸轉變成抗PCV1之抗體

_DPT 組別接種物3 所測試之抗體b -2 7 14 21 28 35 42 49 1 PBS PCV1 N/A 2/8 2/8 1/8 0/4 0/4 0/4 0/4 PCV2 5/8 5/8 2/8 0/8 0/4 0/4 0/4 0/4 2 PCV1 DNA PCVI ORF2 N/A 3/8 2/8 8/8 4/4 4/4 4/4 4/4 3 PCV2 DNA PCV2完全病毒 3/8 2/8 0/8 0/8 0/4 3/4 4/4 4/4 4 PCV1-2DNA PCV2完全病毒 2/8 1/8 1/8 0/8 1/4 1/4 3/4 4/4 -75 1314580 5 PCV2-1 DNA PCVI ORF2 N/A 3/8 3/8 8/8 3/4 3/4 4/4 4/4 a使用磷酸鹽緩衝食鹽水作爲陰性對照組，接種物爲在PSK 載體中之經選殖基因體PCV及PCV嵌合型DNA。 b以間接免疫螢光試驗測量專一性抗PCV 1抗原之PCV 1之 ORF2抗體，以酵素連結免疫吸附試驗測量pCV2抗體。 e接種後天數，陽性數目/測試數目。實例16

將豬於〇 DPI及屍解時稱重，自〇至49 DPI間每隔一天紀錄直腸溫度及臨床呼吸評分，範圍由0至6(0 =正常；6 =嚴重） (P. G. H alb ur et al., "Comparison of the pathogenicity of two U. S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Leiystad virus," Vet. Pathol. 32 :64 8 -6 60 ( 1 9 9 5))。包括中樞神經系統疾病、肝病（黃疸）、肌肉骨骼疾病及身體情況的改變之臨床觀察證據亦每曰紀錄，兩人一組執行所有的臨床評估。對照組或接種組豬隻皆無顯示臨床全部範圍PMWS之明顯症狀，在任一組間，於增重或平均直腸溫度間無差異’ 接種PCVI-2之第3組之一隻豬於接種後一天死亡，屍解及臨床分析後，未偵測到病原且死亡與接種步驟或嵌合型 PCV1-2無關。實例1 7 -76- 1314580 巨觀病理學及組織學每—組之4隻豬分別於21及49 DPI時屍解，於屍解時，以胃§ &配豬隻感染狀態於屍解組，在所有豬隻上執行完全屍解’基於先前所述評分系統（P. G. Halbur ei α/·，1 995, ’紀錄每一豬隻之具巨觀可見肺炎之肺臟估計百分比’其它傷害如淋巴結增大被分別摘錄。組織病理學檢查切片取自鼻甲骨 '肺臟（7個切片）（id·)、心臟、腦、淋巴結（氣管支氣管、腸骨、腸系膜、舌下）、扁桃腺、胸腺、肝臟、膽囊、脾臟、關節、小腸、結腸、胰臟及腎臟。此等組織以盲目形式分配並如實例7所述之肺臟、淋巴結及肝臟傷害嚴重性給予主觀評分，肺臟評分範圍由〇(正常）至3 (嚴重淋巴組織球性間質性肺炎），肝臟評分範圍由0(正常）至3 (嚴重淋巴組織球性肝炎），淋巴結評分由濾泡之淋巴消耗估計量範圍由〇(正常或無淋巴消耗）至3 (嚴重淋巴消耗及組織球性取代之濾泡）。爲了決定在豬隻中PCV1、PCV2、嵌合型PCV1-2及相互嵌合型PCV2-1感染性DNA選殖株之病原性，首先檢查巨觀傷害’此結果顯示在下表9中。第1組未接種對照組動物之淋巴結在21及49 DPIs時爲正常的，在4組接種組豬隻，具有限制於淋巴結之巨觀傷害的可見程度。在接種P CV 1第2

組豬中’在21 DPI淋巴結巨觀上爲正常的，然而，在49DPI 偵測到輕微至中等腫脹及退色’在2 1及4 9 D PI s時，所有接種PCV2之第3組豬有較正常大小變大2至5倍的淋巴結，其爲結實並爲黃褐色。在21及49 DPIs時，7隻中有5隻接種嵌合 -77- 1314580 型PCV1-2動物之淋巴結爲輕微至中等腫脹並退色。在第5 組接種PCV2-1選殖株之豬中，於21 DPI時，8隻動物有1隻之淋巴結有輕微腫脹及退色，接種嵌合型PCV1-2選殖株之豬之淋巴結巨觀傷害平均評分爲與彼等在第】、2及5組無統計學上差異的，但與彼等接種PCV2第3組豬，在21及49 DPIs 時’有統計學上差異。由接種PCV1、PCV2及PCV1-2的動物在49 DPI之平均淋巴巨觀傷害評分彼此間無統計學上差

異’但其皆與第4及5組之平均巨觀傷害評分有統計學上差異。

之後檢查顯微傷害，其結果顯示在下表10中，在未接種之第1組或接種PCV1之第2組豬，於任何DPI時皆無偵測到顯微傷害’顯微肺臟傷害特徵爲輕微支氣管周圍淋巴組織球性及組織球性及組織球性支氣管間質性肺炎，在接種 PCV2之8頭豬中有1頭觀察到此結果。在接種pcvi-2及 PCV2-1的動物中，在肺臟未觀察到顯微傷害，在任—接種豬隻胸腺中未觀察到傷害，在接種PC V2組之8頭豬中有2隻觀察到輕微多處淋巴組織球性心肌炎，接種PCV 1 -2及 PCV2-1之心臟組織無顯微傷害，淋巴組織球性間質性腎炎在接種PCV2組8頭豬之4頭豬、接種PCVI-2的7頭豬之2頭豬及接種PCV2-1的8頭豬之1頭豬被觀察到。在接種pCV2的豬隻中，8頭中有5頭豬在扁桃腺、8頭中有3頭豬在脾臟以及8 頭中有8頭豬在淋巴結觀察到輕微至中度淋巴消耗及濾泡之組織球性取代。在接種嵌合型PCVI-2的動物中，7頭中有 2頭觀察到淋巴結有輕微淋巴消耗及濾泡之組織球性消 -78- 1314580 耗，但在脾臟及扁桃腺中未觀察到。在接種相互嵌合型 PCV2-1的動物之淋巴結、脾臟或扁桃腺中觀察到淋巴消耗及濾泡之組織球取代。在接種P c v 2之8隻豬中有7隻觀察到輕微至中度淋巴漿細胞性肝炎，接種嵌合型P C V 1 - 2的7隻豬中有2隻被觀察到有輕微淋巴漿細胞性肝炎’在接種相互嵌合型P C V 2 - 1的豬之中未觀察到淋巴漿細胞性肝炎，在其它組織之傷害則爲不明顯的。依據已公開的評分系統將肺臟、肝臟及淋巴結之顯微傷害評分（P. G· Halbur ei α/·，1 995, apra)，此結果顯示在下表10中，在第4組之接種嵌合型PCV1-2之豬中，其淋巴結傷害之平均評分相似於第1、2及5組，但與第3組接種病原性 PCV2之豬在21及49DPIS時則具有統計學上差異。接種嵌合型PC V1-2的組在21 DPI時，其平均顯微肝臟傷害與接種 PCV2之第3組動物有統計學上差異，但在21 DPI時相似於彼等第1、2及5組豬。在49 DPI時，接·種嵌合型pcvi-2之第4 組豬之平均顯微肝臟評分與第1、2、3及5組豬隻無統計學上差異。在其它組織或器官中無可接受的評分系統。表9.在對照組及接種組豬隻中淋巴結之巨觀傷害 DPIb 組別接種物a 21 49 1 PBS 0/4 (0.0) 0/4 (0.0) 2 PCV1 DNA 0/4 (0.0) 4/4 (1.5) 3 PCV2 DNA 4/4 (2.5) -79- 4/4 (2.25) 1314580

4 PCV1-2 DNA 2/3 (0.66)

PCY2-1 DNA 1/4 (0.25) 3/4 (1.25) 0/4 (0.0) 3使用磷酸鹽緩衝貪鹽水（PBS )作爲陰性對照組’接種物爲在pSK質體中之經選殖基因體PCV或嵌合型PCV DNA» 6在21 DPI時自每一組屍解4隻豬，並在49DPI時屍解剩下的豬隻；陽性數目/測試數目，具傷害的數目/測試數目（淋S 結加大之估計嚴重性之範圍）表1 〇由對照組及接種組之不同組織/器官中組織學傷害之分布 __ 扁桃腺腎臟心臟腦迴腸胸腺脾臟 LNe 肝臟d 肺臟c DPf 接種物a 組別

1 PBS 2 PCV1 DNA 3 PCY2 DNA 4

PCV1-2 DNA PCV2-1 DNA 21 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4 49 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4 21 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4 49 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4 21 0/4(0.0) 4/4(1.5) 4/4(1.75) 3/4 49 1/4(0.25) 3/4(0.75) 4/4(1.0) 0/4 21 0/3(0.0) 1/3(0.33) 1/3(0.33) 0/4 49 0/4(0.0) 1/4(0.25) 1/4(0.25) 0/4 21 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4(0.0) 0/4 49 0/4(0.0) 0/4(0.0) 1/4(0.25) 0/4 0/40/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/41/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 3/4 2/4 2/4 0/4 0/4 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3使用磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS )作爲陰性對照組，接種物爲在pSK質體中之經選殖基因體PCV或嵌合型PCV DNA。 1)在2 1 DPI時自每一組屍解4隻豬，並在49 DPI時屍解剩下的豬隻。 °陽性數目/測試數目，（平均組織學肺臓評分：〇爲正常·，1 爲輕度間質性肺炎；2爲中度的；3爲嚴重的） -80- 1314580 "陽性數目/測試數目，（平均組織學肝臟評分：0爲正常；1 爲輕度肝炎；2爲中度的；3爲嚴重的） e陽性數目/測試數目，（平均組織學淋巴結消耗評分：〇爲正常；1爲輕度；2爲中度的；3爲嚴重的）實例18 血淸學

在-2、7、14、21、28、35、42 及 49 DPIs 自所有豬隻收集血液’使用 Herd Check PRRS V ELIS A(IDEXX Laboratories，Westbrook，MA)試驗抗 PRRSV之血淸抗體。以血球凝集抑制（HI)試驗偵測抗PPV之血淸抗體（H. S. Joo e t a l., " A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Au s t. Vet. J. 52:422-424 (1976))。以如上述之PCV2重組ORF2衣殼蛋白質爲基礎之經修飾間接ELISA來偵測抗PCV2血淸抗體（亦見P. Nawagitgul e t al., "Modified indirect porcine circo virus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. D i a gn. Lab Immunol. 1:33-40 (200 2))。以間接免疫螢光試驗（IFA)偵測抗PCV1之血淸抗體。將感染PCV1之PK-15細胞生長在8孔LabTek有凹槽玻片上，當被感染的PK-15細胞達到約95 - 1 00%群集時，以含有80%丙酮及20%甲醇之溶液在4°C下將經感染細胞固定20 分鐘，以P B S緩衝液淸洗經固定的細胞，將1 0 0 μ 1之以1 : 1 〇 -81 - 1314580

羊抗豬二次抗體培育45分鐘，隨後此玻片以PBS淸洗3次，覆蓋氟襯紙G，蓋上蓋玻片並在螢光顯微鏡下檢查。在陽性對照組上，將經PCV 1感染的細胞與經稀釋的PCV 1專一性單株抗體一起培育（Dr. G. M. Allan的禮物），隨後與經 FITC標定的山羊抗鼠IgG—起培育（Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，Md.)。於陰性對照組中，經PCV1感染的細胞與以1:10稀釋的無PCV1及PCV2抗體之豬血淸一起培育，隨後與經FITC標定的山羊抗豬IgG—起培育（Kirkegaard& Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.)。實例19 PCR偵測爲了自接種豬之血淸中偵測 PCV1、PCV2、嵌合型 PCV1-2及相互嵌合型PCV2-1毒血症，以PCR測試在不同DPIs時收集之血淸樣品。

依據製造冏手冊（Molecular Research Center，Cincinnati， OH)使用DNAzol試劑由100 # 1之每一血淸樣品提取病毒 DNA，將經提取之DNA再懸浮在無Dnase、RNase及蛋白酶之水中，爲了增幅PCV1、PCV2、嵌合型PCV1-2及嵌合型相互PCV2-1之選殖株特定性基因體序列，設計兩組巢套PCR 引子對（上表6)。第1組巢套引子基於已公開的pcVI序列來設計，引子Gen.PCVl陳列在SEQ ID NO:20及Orf.PCVl陳列 -82 - 1314580 在SEQ ID NO:19，在PCV1基因體存在下增幅一個400 bp的片段’巣狀引子Gen.PCVl陳列在SEQ ID NO:22及巢套 Orf.PCVl陳列在SEQ ID NO:21，增幅一個220 bp的片段。

爲了偵測PCV2毒血症，PCV2引子對Gen.PCV2陳列在 SEQ ID NO:24及〇rf_PCV2陳列在 SEQ ID NO:23，在第一回合PCR中PCV2存在時增幅一個900 bp片段，引子巢套 Gen.PCV2 陳列在 SEQ ID NO:26 及巢套〇rf.PCV2 陳列在 SEQ ID NO:25 在巢套PCR中增幅一個600bp片段。爲了偵測嵌合型PCV1-2毒血症，第一回合PCR反應所使用之PCV1特定引子Gen.PCVl陳列於SEQ ID NO:20及特定 PCV2 0RF2 引子〇rf.PCV2陳列於 SEQ ID NO:23以增幅 580 bp之嵌合型片段。於巢套PCR，特定PCV1引子巢套Gen.PCVl 陳列於SEQ ID NO:22且特定PCV2 0RF2引子巢套0rf.PCV2 陳列於SEQ ID NO :25被使用來增幅3 70 bp之嵌合型片段。

爲了偵測相互嵌合型PCV2-1毒血症，第一回合PCR使用特定的PCV2弓|子Gen.PCV2P東歹IJ於SEQ ID NO:24及特定的 PCV 1 ORF2 弓I 子 Orf.PCVl 陳歹 IJ 於 SEQ ID NO:19 以增幅 700 bp之嵌合型片段。於巢套PCR，使用PCV2專一性引子巢套 Gen.PCV2 陳歹 1J 於 SEQ ID NO:26 及 PCV1 ORF2 專一性引子巢套Orf.PCVl陳列於SEQ ID NO:21增幅一個4 6 0 bp之嵌合型片段，所有PCR參數基本上是相同的，由94°C 1分鐘之變性、45°C1分鐘之退火結合及72°C1.5分鐘之延展結合之38 次循環所組成，如先前所述（M. Fenaux ei a /，"Genetic -83- 1314580 characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PC V-1 and PCV-2," J. Clin. Microbiol. 3 8: 2494- 5 0 3 (20 00))，由陰性對照組得到的血淸樣品以PCR-RFLP診斷試驗測試，其可偵測並區分PCV1 及PCV2兩者。定序由每一組所選動物的PCR產物以確認感染豬隻病毒來源。實例20 免疫組織化學（IHC) 於21及49D Pis時屍解之所有豬隻所收集的淋巴結組織上執行PCV2特定性抗原之IHC偵測，於IHC中使用抗PCV2 之兔多株抗血淸，依據先前所述一般步驟（S· D. Sorden et a/., "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue," J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999))° 基於PCV2專一性抗原之IHC染色，由未接種對照組、接種PCV1及PCV2-1豬隻之淋巴組織對PCV2抗原爲陰性的，在接種PCV2組之8隻動物中有7隻在淋巴組織偵測到PCV2抗原，亦在接種嵌合型PCV 1-2組7隻豬中有1隻之淋巴組之偵 -84- 1314580 消J至|J P C V 2抗原。在前文中’已提供本發明之特殊具體例之詳細說明，其用來作爲說明之目的而未限制本發明於此，應了解由於此揭示，所有其他修飾、衍生物及同等物對於此項技藝中熟習此藝者是顯而易知的’而有意被包括在如本發明範疇之申請專利範圍中。 (五）圖式簡單說明本發明之背景及其與此項技藝之變化將進一步以參考文獻並伴隨圖示而描述於下列中，其中：第1圖代表感染性PCV2分子DNA選殖之建構，所使用來增幅完全的PCV2基因體之引子對之相關位置以箭頭指示 (反轉引子PCVSAC2，順向引子PCVSAV2 )。以連環限制酶消化經PCR增幅之PCV2基因體DNA，並純化此片段，將經純化及經SmII消化之基因體DNA連接以形成連環，連結之連環以膠體電泳而分離，純化PCV2之隨機二聚物並選殖入預先以SflcII酵素消化之pSK載體中以生產分子PCV2 DNA選殖株。第2A及2B圖說明在試管中之PK-15細胞中被轉染時，經選殖之PCV2質體DNA是有感染性的，第2A圖顯示在轉染選殖之PCV2質體DNA之PK-15細胞中，以免疫螢光試驗（IFA) 作PCV2抗原之偵測，強烈的PC V2抗原免疫標定在核中是可見的，且轉染細胞之細胞質中有較少程度的免疫標定。第 -85- 1314580 2B圖顯示模擬轉染之ΡΚ-15細胞。第3Α圖顯示在21 DPI，自以淋巴結內途徑接種PCV2 DN A之豬隻中所取出肺臟，此肺臟爲有彈性的、不會塌陷的且呈黃褐色-紅色之斑駁狀。氣管支氣管淋巴結顯著增大並爲黃褐色（箭頭處）。第3B圖表示對照組豬隻之正常肺臟之顯微切片（25X)。第3C圖表示取自第3A圖之豬隻肺臟的顯微切片，注意支氣管周圍之淋巴組織性炎症及輕度壞死性支氣管炎（2 5 X)。第3 D圖說明第3 A圖肺臟之免疫組織染色，注意在呼吸道周圍之巨噬細胞及纖維母細胞樣細胞中之PCV2抗原（箭頭處）（64X)。第4 A圖顯示對照組豬隻之正常淋巴結，注意界定淸楚之淋巴濾泡（箭頭處）（25X)。第4B圖代表由第3A圖之以淋巴結內途徑接種經選殖的PC V2基因體DN A之豬隻於接種後21 天取其氣管支氣管淋巴結之顯微切片，淋巴樣泡界陷不淸楚，有輕微至中度淋巴樣耗損，及輕度多處肉牙腫性炎症 (25 X)。第4C圖表示在第4B圖中淋巴結之焦距在一個濾泡之較大放大倍率之顯微切片，注意界限不淸楚之濾泡中巨噬細胞及巨大細胞（箭頭處）取代濾泡淋巴細胞（6 4 X)。第4 D 圖說明PCV2抗原在如第4B圖中相同淋巴結中之巨噬細胞 (箭頭處）及巨大細胞（小箭頭）以及濾泡中之樹突樣細胞（大箭頭）之免疫組織偵測（64X)。第5圖說明無病原性PCV1基因體之嵌合型PCV1-2 (PCV1/PCV2) DNA選殖株之建構，其帶有病原性PCV2之免疫生成性ORF2衣殻基因，在試管中轉染PK-15使用二聚物 1314580 化DNA選殖株以生產表現PCV2之ORF2蛋白質之活的嵌合病毒，並在活體動物實驗中確認活性。第6圖代表感染性PCV1、PCV2、嵌合型PCV1-2及互相嵌合的PCV2-1分子DNA選殖株之建構及組成。經由連結PCV2 兩段全長線狀基因體建構PCV2 DNA選殖株。經由先前所描述之一般方法隨機置入Blue script SK載體（pSK) (M. Fenaux e ί α /., 2 0 0 2 , s u p r a)，將經由連結兩段全長線狀的P C V 1基因體隨機置入pSK載體中建構PCV1 DNA選殖株。在pSK載體中之無病原性PCV1基因體骨架中，藉由PCV2之ORF2衣殼基因取代PCV1此基因來建構嵌合的PCV1-2 DNA選殖株。在病原性PCV2基因體骨架之PSK載體中，以無病原性PCV1之 ORF2衣殻基因取代PC V2之該段基因而建構相互嵌合的 PCV2_1 DNA選殖株，箭頭代表在接種動物中用來偵測 PCV：!、PCV2、PCV1-2及PCV2-1毒血症之PCR弓|子之相對位置。第7A-7J圖展現了當被轉染至PK-15細胞時，PCV1、 PCV2、嵌合型PCV1-2及互相嵌合型PCV2-1分子DNA選殖株爲感染的並表現各自的病毒抗原，左列圖（7八、7〇7£、70 及71)爲以對抗PCV1 ORF2之單株抗體所作之染色，右列圖 (7B、7D、7F、7H及7J)爲以對抗PCV2之抗體所作之染色。 7A及7B圖爲模擬轉染之PK-15細胞，7C及7D圖爲以PCV1

DNA選殖株所轉染之ρκ-15細胞，7E及7F圖爲以PCV2 DNA 選殖株所轉染之PK-I5細胞，7G及7H圖爲以嵌合型PCV1-2 DNA選殖株所轉染之PK-15細胞，71及7J圖爲以相互嵌合的 -87- 1314580 PCV2-1 DNA殖株所轉染之PK_15細胞° 第8圖代表經選殖的PCV2分子DNA之全長DNA序列（相當於 SEQ ID NO : 1 )。第9圖代表經選殖的嵌合型PCV1-2 DNA之全長DNA序列 (相當於 SEQ id NO: 2)。第10圖代表經選殖的嵌合型PCV1-2 DNA之免疫生成性 ORF2衣殼基因之〇ΝΑ序列（相當於SEQ ID NO: 3)。

第11圖代表經選殖的嵌合型PCV1-2 DNA之免疫生成性 ORF2衣殻基因之推定的胺基酸轉譯（相當於SEQ ID NO: 4)。

-88- 1314580 序列表 <ll〇> Meng, Xiang-Jin Fenaux, Martijn Halbur, Patrick G. <120>嵌合型感染性DNA選殖株、嵌合型猪環狀病毒及其運用 <130> ΑΜ10087Θ <140> US 10/314,512 <141> 2002-12*09 <160> 26 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 176Θ

<212> DNA <213〉豬環狀病毒： <400> 1 aaatttctga caaacgttac agggtgctgc tctgcaacgg tcaccagact cccgctctcc 60 aacaaggtac tcacagcagt agacaggtca ctccgttgtc cttgagatcg aggagctcca 120 cattcaataa gtaagttgcc ttctttactg caatattctt tattctgctg atcagttcct 180 ttggctttct cgatatggca gcgggcaccc aaataccact tcactttatt aaaagtttgc 240 ttcttcacaa aattagcgaa cccctggagg tgaggtgttc gtccttcctc attaccctcc 300 tcgccaacaa taaaataatc aaatagggag attgggagct cccgtatttt cttgcgctcg 360 -1- 1314580 tcttcggaag gattattcag cgtgaacacc caccttttat gtggttgggg tccgcttctt 420 ccattcttct tgctgggcat gttgctgctg aggtgctgcc gaggtgctgc cgctgccgaa 480 gtgcgctggt aatacttaca gcgcacttct ttcgttttca gctatgacgt atccaaggag 540 gcgttaccgc agaagaagac accgcccccg cagccatctt ggccagatcc tccgccgccg 600 cccctggctc gtccaccccc gccaccgcta ccgttggaga aggaaaaatg gcatcttcaa 660 cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtcaaggct accacagtca gaacgccctc 720 ctgggcggtg gacatgatga gatttaatat tgacgacttt gttcccccgg gaggggggac 780 caacaaaatc tctataccct ttgaatacta cagaataaga aaggttaagg ttgaattctg Θ40 gccctgctcc cccatcaccc agggtgatag gggagtgggc tccactgctg ttattctaga 900 tgataacttt gtaacaaagg ccacagccct aacctatgac ccatatgtaa actactcctc 960 ccgccataca atcccccaac ccttctccta ccactcccgt tacttcacac ccaaacctgt 1020 tcttgactcc accattgatt acttccaacc aaataacaaa aggaatcagc tttggatgag 1080 gctacaaacc tctagaaatg tggaccacgt aggcctcggc actgcgttcg aaaacagtat 1140 atacgaccag gactacaata tccgtgtaac catgtatgta caattcagag aatttaatct 1200 taaagacccc ccacttaaac cctaaatgaa taataaaaac cattacgaag tgataaaaaa 1260 gactcagtaa tttatttcat atggaaattc agggcatggg ggggaaaggg tgacgaactg 1320 gcccccttcc tccgtggatt gttctgtagc attcttccaa aataccaaga aagtaatcct 1380 ccgatagaga gcttctacag ctgggacagc agttgaggag taccattcca acggggtctg 1440 attgctggta atcagaatac tgcgggccaa aaaaggtaca gttccacctt tagtctctac 1500 agtcaatgga tatcgatcac acagtctcag tagatcatcc cacggcagcc agccataaaa 1560 gtcatcaata acaaccactt cttcaccatg gtaaccatcc caccacttgt ttctaggtgg 1620 tttccagtat gtggtttccg ggtctgcaaa attagcagcc catttgcttt taccacaccc 1680 aggtggcccc acaatgacgt gtacattggt cttccaatca cgcttctgca ttttcccgct 1740 cactttcaaa agttcagcca gcccgcgg 1768

<210> 2 <211> 1773

<212> DNA <213>豬環狀病毒， -2- 1314580 <400> 2 ggtacctccg tggattgttc tccagcagtc ttccaaaatt gcaaagtagt aatcctccga 60 tagagagctt ctacagctgg gacagcagtt gaggagtacc attcctgggg ggcctgattg 120 ctggtaatca aaatactgcg ggccaaaaaa ggaacagtac cccctttagt ctctacagtc 180 aatggatacc ggtcacacag tctcagtaga tcatcccaag gtaaccagcc ataaaaatca 240 tccaaaacaa caacttcttc tccatgatat ccatcccacc acttatttct actaggcttc 300 cagtaggtgt ccctaggctc agcaaaatta cgggcccact ggctcttccc acaaccgggc 360 gggcccacta tgacgtgtac agctgtcttc caatcacgct gctgcatctt cccgctcact 420 ttcaaaagtt cagccagccc gcggaaattt ctcacatacg ttacaggaaa ctgctcggct 480 acagtcacca aagaccccgt ctccaaaagg gtactcacag cagtagacag gtcgctgcgc 540 ttcccctggt tccgcggagc tccacactcg ataagtatgt ggccttcttt actgcagtat 600 tctttattct gctggtcggt tcctttcgct ttctcgatgt ggcagcgggc accaaaatac 660 cacttcacct tgttaaaagt ctgcttctta gcaaaattcg caaacccctg gaggtgagga 720 gttctaccct cttccaaacc ttcctcgcca caaacaaaat aatcaaaaag ggagattgga 780 agctcccgta ttttgttttt ctcctcctcg gaaggattat taagggtgaa cacccacctc 840 ttatggggtt gcgggccgct tttcttgctt ggcattttca ctgacgctgc cgaggtgctg 900 ccgctgccga agtgcgctgg taatactaca gcagcgcact tctttcactt ttataggatg 960 acgtatccaa ggaggcgtta ccgcagaaga agacaccgcc cccgcagcca tcttggccag 1020 atcctccgcc gccgcccctg gctcgtccac ccccgccacc gctaccgttg gagaaggaaa 1080 aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accttcggat atactgtcaa ggctaccaca 1140 gtcagaacgc cctcctgggc ggtggacatg atgagattta atattgacga ctttgttccc 1200 ccgggagggg ggaccaacaa aatctctata ccctttgaat actacagaat aagaaaggtt 1260 aaggttgaat tctggccctg ctcccccatc acccagggtg ataggggagt gggctccact 1320 gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca aaggccacag ccctaaccta tgacccatat 1380 gtaaactact cctcccgcca tacaatcccc caacccttct cctaccactc ccgttacttc 1440 acacccaaac ctgttcttga ctccaccatt gattacttcc aaccaaataa caaaaggaat 1500 cagctttgga tgaggctaca aacctctaga aatgtggacc acgtaggcct cggcactgcg 1560 ttcgaaaaca gtatatacga ccaggactac aatatccgtg taaccatgta tgtacaattc 1620 agagaattta atcttaaaga ccccccactt aaaccctaaa tgaataaaaa taaaaaccat 1680

-3- 1314580 tacgatgtga taacaaaaaa gactcagtaa tttattttat atgggaaaag ggcacagggt 1740 gggtccactg cttcaaatcg gccttcgggt acc 1773 <210> 3 <211> 702

<212> DNA <213〉豬環狀病毒 <400> 3 atgacgtatc caaggaggcg ttaccgcaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgctaccg ttggagaagg 120 aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caaggctacc 180 acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaatattga cgactttgtt 240 cccccgggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 300 gttaaggttg aattctggcc ctgctccccc atcacccagg gtgatagggg agtgggctcc 360 actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctaac ctatgaccca 420 tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc ccccaaccct tctcctacca ctcccgttac 460 ttcacaccca aacctgttct tgactccacc attgattact tccaaccaaa taacaaaagg 540 aatcagcttt ggatgaggct acaaacctct agaaatgtgg accacgtagg cctcggcact 600 gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660 ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa 702

<210> 4 <211> 233

<212> PRT <213>豬環狀病毒 <400> 4

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15

Ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro -4- 1314580 20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr 50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95

Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr 100 105 110

Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp Asp Asn 115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140

Ser Ser Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Met Arg Leu Gin Thr Ser Arg Asn 1Θ0 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser lie Tyr Asp 195 200 205

Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 <210> 5 <211> 30 -5- 1314580 <212> DNA<213〉豬環狀病毒 <400> 5 gaaccgcggg ctggctgaac ttttgaaagt <210> 6 <211> 30 <212> DNA<213>豬環狀病毒 30 <400> 6 gcaccgcgga aatttctgac aaacgttaca <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213〉豬環狀病毒 <400> 7 tttggtaccc gaaggccgat t <210> 8 <211> 24 <212> DNA<213>豬環狀病毒 <400> Θ attggtacct ccgtggattg ttct 30 21

<210> 9 <211> 39 <212> DNA -6- 24 39 1314580 <213>豬環狀病毒

<400> 9 gaagttaacc <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213〉豬環狀病毒 <400> 10 37 ggtggcgcct ccttggatac gtcatcctat aaaagtg <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 11 aggttataag tggggggtct <210> 12 <211> 27 <212> DNA < 213>豬環狀病毒 <400> 12 ggaaacgtta ccgcagaaga <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213〉豬環狀病毒 30 27 -7- 1314580 <400> 13 actatagatc tttattcatt tagagggtct ttcag 35 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213〉猪環狀病毒 <400> 14 tacgggcatg catgacgtgg ccaaggagg 29 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 15 agacgagatc tatgaataat aaaaaccatt acgaag 36 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 16 cgtaagcatg cagctgaaaa cgaaagaagt g 31 <210> 17 <211> 24

<212> DNA <213>豬環狀病毒 -8- 241314580 <400> 17 gctgaacttt tgaaagtgag cggg <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213：>豬環狀病毒 <400> 18 tcacacagtc tcagtagatc atccca <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213〉豬環狀病毒 <400> 19 ccaactttgt aaccccctcc a <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213〉豬環狀病毒 <400> 20 gtggacccac cctgtgcc <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213〉豬環狀病毒 <400> 21 26

21 1Θ

-9- 1314580 ccagctgtgg ctccatttaa <210> 22 <211> 29

<212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 22 ttcccatata aaataaatta ctgagtctt <210> 23 <211> 19

<212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 23 cagtcagaac gccctcctg <210> 24

<211> 22 <212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 24 cctagaaaca agtggtggga tg <210> 25 <211> 19

<212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 25 ttgtaacaaa ggccacagc 1314580 <210> 26 <211> 23

<212> DNA <213>豬環狀病毒 <400> 26 gtgtgatcga tatccattga ctg

Claims

1314580 lp4- ^.；rS ：0， i 第91135955號「嵌合型感染性DNA選殖株，嵌合型豬環病毒（porcine circoviruses)及其用途」專利案 (2009年4月修正）拾、申請專利範圍 1. 一種豬環狀病毒感染性之嵌合型核酸分子（PCV 1-2)，其係具有陳列於S E Q ID N 0 : 2之核苷酸序列、其互補股或具有對於S E Q ID N 0 : 2核苷酸序列至少9 5 %同源性之核苷酸序列，其係由具有編碼含病原性PCV2的免疫生成性開放讀碼區2 ( ORF2 )衣殼基因取代PCV1核酸分子的0RF基13之感染性、無病原性PCV1之核酸分子所。組成。 2. —種生物學功能性質體，其含有如申請專利範圍第1項之嵌合型核酸分子。 3 .如申請專利範圍第2項之生物學功能性質體，其具有 ATCC專利寄存標示號PTA-3912以及財團法人食品工業發展硏究所寄存編號BCRC 940424。 4. 一種經生物學功能性質體轉染之適宜的宿主細胞，其含有如申請專利範圍第2項之嵌合型核酸分子。 5. —種無毒的、感染性嵌合型豬環狀病毒，其係由含有如申請專利範圍第1項之嵌合型核酸分子之細胞所生產。 6 ·如申請專利範圍第5項之感染性嵌合型豬環狀病毒，其中該細胞含有之嵌合型核酸分子是含於或衍生自具有 ATCC專利寄存標示號PTA-39 1 2及BCRC 940424之質體。 7.—種生產免疫生成性多胜肽產物之方法，其中該方法包 1314580 含：以如申請專利範圍第1項之核酸分子轉染之原核或真核宿主細胞生長在適當營養條件下使其能夠表現該多胜肽產物，並分離該核酸分子所表現之所欲得到之多胜肽產物。 8. —種如申請專利範圍第7項之方法所表現之免疫生成性多胜肽產物，其具有陳列於SEQ ID NO:4之胺基酸序列。 9. —種免疫生成性多胜肽，其特徵爲具有陳列於SEQ ID NO:4之胺基酸序列。 10. —種保護豬隻對抗由PCV2所引起之病毒感染或斷奶後多系統消耗症候群（PMWS )之病毒疫苗，其包含無毒性的生理學上可接受載劑，以及由下列所組成之群中選出之免疫生成量的成分： (a) 一種如申請專利範圍第1項之豬環狀病毒感染性之嵌合型核酸分子（PCV1-2); (b ) —種如申請專利範圍第2項之生物學上功能性質體； (c ) 一種如申請專利範圍第5項之無毒的、感染性嵌合型豬環狀病毒以及 (d) —種免疫生成性多胜肽，具有陳列於SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列。 11. 如申請專利範圍第10項之病毒疫苗，其中該疫苗含有活的嵌合型豬環狀病毒（PCV1-2)。 12_—種製備如申請專利範圍第丨項之感染性嵌合型核酸分子（PCVI-2)之方法，其包含移除編碼感染性、無病原性 -2- 1314580 PCV1之核酸分子之開放讀碼區原性PCV2之免疫生成性ORF基E 基因；以及回收該嵌合型核酸分 13.如申請專利範圍第12項之方法q ORF基因取代PCV1核酸分子之相 1 4 ·如申請專利範圍第1 3項之方法，基因爲ORF2。 C ORF )，以由來自病 3來取代PCV1之該ORF 子。 [中該免疫生成性PCV2 同ORF基因位置。其中該免疫生成性ORF 1314580 .薩、(一)、本案指萣代表圖場:第__圖 (二）、本代表圖之元件代表符號簡單說明：柒、本素若宥花孳_寺，護湯筆最能顯示發明特徵的化學式··