PT1487483E - Clones de adn infeccioso quimérico de circovírus porcino e sua utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"CLONES DE ADN INFECCIOSO QUIMÉRICO DE CIRCOVÍRUS PORCINO E SUA UTILIZAÇÃO"

Campo da Invenção A presente invenção insere-se no campo dos clones de ADN infeccioso de circovírus porcino de tipo 1 (PCVl) e de tipo 2 (PCV2) e diz respeito aos clones de ADN infeccioso quimérico PCVl-2 e aos vírus quiméricos vivos derivados dos clones de ADN quimérico, úteis como vacinas.

Descrição da Técnica Correlacionada 0 circovírus porcino (PCV) foi isolado originalmente como um contaminante de cultura celular da linhagem de células do rim de porcinos, designada por PK-15 (I. Tischer et ai., "A very small porcine virus with circular single-stranded DNA," Nature 295:64-66 (1982); I. Tischer et al.r "Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines," Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2): 153-167 (1974)). 0 PCV é um vírus pequeno icosaédrico sem invólucro que contém um genoma de ADN circular de cadeia singular com cerca de 1,76 kb. 0 PCV está classificado como pertencente à família de Circoviridae, que é constituída por mais três circovírus de animais (o vírus da anemia dos galináceos (CAV), o vírus da doença do bico e das penas das psitacíneas (PBFDV) e o recentemente descoberto circovírus das columbídeas (CoCV), observado nos pombos) e três circovírus de plantas (o vírus do cacho da bananeira, o vírus do apodrecimento foliar do 2 coqueiro e o vírus do atrofiamento das raízes do trevo) (M. R. Bassami et al., "Psittacine beak and feather disease vírus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and chicken anemia vírus," Virology 249: 453-459 (1998); J. Mankertz et al., "Transcription analysis of porcine circovirus (PCV) ," Virus Genes 16: 267-276 (1998); A. Mankertz et al., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons, " Arch. Virol. 145:24 69-247 9 (2000); B. M. Meehan et al., "Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses," J. Gen. Virol. 78: 221-227 (1997); B. M. Meehan et al., "Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs," J. Gen. Virol. 79: 2171-2179 (1998); D. Todd et al., "Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes," Arch. Virol. 117: 129-135 (1991)). Os membros deste conjunto de três circovirus de animais, anteriormente identificados (PCV, CAV e PBFDV) não partilham entre si nenhuma homologia de sequências de nucleótidos nem determinantes antigénicos (M. R. Bassami et al., 1998, supra·, D. Todd et al., 1991, supra). O genoma do CoCV recentemente identificado, partilha com o PCV cerca de 40% de identidade entre sequências de nucleótidos (A. Mankertz et al., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons," Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000)). Recentemente foi identificado um novo circovirus humano com um genoma circular, designado por vírus transmitido por transfusão ou vírus TT (TTV), a partir de indivíduos em que se observou hepatite pós-transfusão (H. Miyata et al., "Identification of a novel GC rich 113-nucleotide region to complete the circular, 3 single-stranded DNA genome of TT vírus, the first human circovirus," J. Virol. 73:3582-3586 (1999); T. Nishizawa et al., "A novel DNA vírus (TTV) associated with elevated transaminase leveis in posttransfusion hepatitis of unknown etiology, " Biochem. Biophys. Res. Commun. 241:92-97 (1997)) . Além disso, identificou-se um minivírus humano de tipo TTV (TLMV) a partir de dadores normais de sangue (P. Biagini et al., "Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates," J. Gen. Virol. 82: 379-383 (2001); K. Takahashi et al., "Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV), intermediariamente conotado com o vírus TT e com o vírus da anemia dos galináceos, "Arch. Virol. 145:979-93 (2000)), tendo sido também encontrado um terceiro circovirus humano novo, designado por vírus SEN (SENV), em seres humanos com hepatite pós-transfusão (T. Umemura et al., "SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis," Hepathology 33:1303-1311 (2001)) . A organização genómica, tanto do TTV como do TLMV humanos, é semelhante à do CAV (P. Biagini et al., 2001, supra·, H. Miyata et al., 1999, supra·, K. Takahashi et al., 2000, supra) . Embora tenham sido encontrados anticorpos contra o PCV em diversas espécies animais, incluindo seres humanos, murganhos, bovinos e suínos (G. M. Allan et al., "production preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus," Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994); G. C. Dulac e A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) e provas da existência de anticorpos contra os circovirus em suínos canadianos, "Can. J. Vet. Res. 53:431-433 (1989); S. Edwards e J. J. Sands, "Evidence of 4 circovirus infection in British pigs," Vet. Rec. 134:680-1 (1994); J. C. Harding e E.G. Clark, "Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)," Swine Health and Production 5:201-203 (1997); R. K. Hines e P. D. Lukert, "Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States," Swine Health and Production 3:71-73 (1995); G. P. Nayar et al., "Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses," Can. Vet. J. 40:277-278 (1999); I. Tischer et al., "Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms," Arch. Virol. 140:737-743 (1995); I. Tischer et al., "Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle," Arch. Virol. 140:1427-1439 (1995)), pouco se sabe sobre a patogenese do PCV nestas espécies animais. A infecção experimental de suínos com PCV provenientes de células PK-15 não produziu nenhuma patologia clinica e consequentemente considera-se que este vírus não é patogénico para os suínos (G. M. Allan et al., "Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material," Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995); I. Tischer et al., "Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus," Arch. Virol. 91:271-276 (1986)). O PCV não patogénico derivado da linhagem de células PK-15 contaminadas recebeu a designação de circovirus porcino de tipo 1 ou PCVl. A síndrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS), descrita pela primeira vez em 1991 (J. C. Harding e E.G. Clark, 1997, supra), é uma doença complexa dos leitões em fase de desmame, que se está a tornar cada vez mais 5 disseminada. Perante a ameaça potencial de um impacto económico grave no dominio da suinicultura, passou a ser urgente desenvolver uma vacina contra o PCV2, que é o agente primário causador da PMWS. A PMWS afecta principalmente os leitões com idades entre 5-18 semanas. Os sinais clínicos da PMWS são uma progressiva perda de peso, dispneia, taquipneia, anemia, diarreia e icterícia. A taxa de mortalidade pode variar entre 1 e 2% e pode mesmo ir até 40% em alguns casos complicados no Reino Unido (M. Muirhead, "Sources of Information on PMWS/PDNS," Vet. Rec. 150:456 (2002)). As lesões microscópicas características da PMWS compreendem a pneumonia intersticial granulomatosa, linfadenopatia, hepatite e nefrite (G. M. Allan e J. A. Ellis, "Porcine circoviruses: a review," J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000); J. C. Harding e E.G. Clark, 1997, supra) . A PMWS foi agora identificada em suínos no Canadá, nos Estados Unidos da América do Norte (G. M. Allan et al.r "Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes," Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan e J. A. Ellis, 2000, supra; J. Ellis et al., "Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome, " Can. Vet. J. 39:44-51 (1998); A. L. Hamel et al., "Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs," J. Virol. 72:5262-5267 (1998); M. Kiupel et al., "Circovirus-like virai associated disease in weaned pigs in Indiana," Vet. Pathol. 35:303-307 (1998); R. Larochelle et al., "Identification and incidence of porcine circovirus in 6 routine field cases in Quebec as determined by PCR," Vet. Rec. 145:140-142 (1999); B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)), na maior parte dos países europeus (G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan e J. A. Ellis, 2000, supra; S. Edwards e J. J. Sands, 1994, supra; S. Kennedy et al., "Porcine circovirus infection in Northern Ireland," Vet. Rec. 142:495-496 (1998); A. Mankertz et al., "Characterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France," Virus Res. 66:65-77 (2000); C. Roseli et al., "Identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome. Vet. Rec. 146:40-43 (2000); P. Spillane et al., "Porcine circovirus infection in the Republic of Ireland," Vet. Rec. 143:511-512 (1998); G. J. Wellenberg et al., "isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-weaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands," Vet. Quart. 22:167-72 (2000)) e em alguns países asiáticos (C. Choi et al., "Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polymerase chain reaction," J. Vet. Diagn. Invest. 12:151-153 (2000); A. Onuki et al., "Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan," J. Vet. Med. Sei. 61:1119-1123 (1999)). A PMWS tem potencial para provocar um impacto económico grave no domínio da suinicultura em todo o mundo. 7 0 agente primário causador de PMWS é uma estirpe patogénica de PCV conhecida pelo nome de circovírus porcino de tipo 2 ou PCV2 (G. M. Allan et al., "Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes," Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan et al., "Isolation and characterisation of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland," Vet. Microbiol. 66:115-23 (1999); G. M. Allan e J. A. Ellis, 2000, supra; J. Ellis et al., 1998, supra, A. L. Hamel et al., 1998, supra; B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., 1998, supra). Foi já determinada a sequência genómica completa do PCV2 associado à PMWS (M. Fenaux et al., "Genetic characterization of type 2 porcine circovírus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2," J. Clin. Microbiol. 38:2494-503 (2000); A. L. Hamel et al., 1998, supra; J. Mankertz et al., 1998, supra; B. M. Meehan et al., 1997, supra; B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., 1998, supra). O PCVl é universal nos suínos, mas não é patogénico para os suínos. Pelo contrário, o PCV2 geneticamente conotado, é patogénico e provoca a PMWS nos suínos. As análises de sequências revelam que o PCV2 associado à PMWS partilha apenas cerca de 75% da identidade da sequência de nucleótidos com o PCVl não patogénico. O gene ORF2 do PCVl não patogénico e do PCV2 patogénico codifica a proteína principal da cápside virai imunogénica (P. Nawagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Iitimunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002); P. Nawagitgul et al., "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)).

As tentativas iniciais para se reproduzir a PMWS clínica em suínos vulgares por inoculação de PCV2, não tiveram êxito (M. Balasch et al., "Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome," J. Comp. Pathol. 121:139-148 (1999); M. Fenaux et al., "Cloned Genomic DNA of Type 2 Porcine Circovirus (PCV-2) Is Infectious When Injected Directly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinicai Disease, Vírus Distribution, and Pathologic Lesions," J. Virol. 76:541-551 (2002)). A reprodução experimental da PMWS clínica em suínos gnotobióticos e em suínos vulgares com homogenados teciduais obtidos a partir dos suínos com PMWS que ocorre naturalmente e com PCV2 propagado em culturas de células produziu resultados mistos. A PMWS clínica foi reproduzida em suínos gnotobióticos (SPF) e em suínos privados de colostro e paridos por cesariana, co-infectados com PCV2 e com parvovírus porcino (PPV) (G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovírus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); S. Krakowka et al., "Virai wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome 9 in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus," Vet. Pathol. 37:254-263 (2000)), e em suínos gnotobióticos inoculados com PCV2, quando os seus sistemas imunitários foram activados por hemocianina de moluscos gastrópodes em adjuvante de Freund (S. Krakowka et al., "Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2)," Vet. Pathol. 38:31-42 (2001)) .

Arch. A PMWS clínica foi também reproduzida em suínos paridos por cesariana/privados de colostro (CD/CD) inoculados apenas com o PCV2 (P. A. Harms et al., "Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus," Vet. Pathol. 38:528-539 (2001)) e em suínos vulgares co-infectados com o PCV2 e, em alternativa, com o parvovirus porcino (PPV) ou com o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos porcinos (PRRSV) (A. Rivora et al., "Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2," J. Virol. 76: 3232-3239 (2002)). No caso da co-infecção com PRRSV/PCV2, os sinais patológicos característicos da PMWS, tais como depleção linfóide, inflamação granulomatosa e hepatite necrotizante, são induzidos pelo PCV2 e não pelo PRRSV (P. A. Harms et al., 2001, supra). No entanto, a PMWS clínica não foi reproduzida em suínos gnotobióticos infectados apenas com o PCV2 (G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 10 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); M. Balasch et al., 1999, supra·, J. Ellis et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets," J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); S. Kennedy et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus" J. Comp. Pathol. 122:9-24 (2000); S. Krakowka et al., 2001, supra; S. Krakowka et al., 2000, supra; R. M. Pogranichnyy et al., "Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection," Virai. Immunol. 13:143-153 (2000)). Os inóculos virais utilizados nestes estudos foram homogenados de tecidos obtidos a partir de suínos em que ocorre naturalmente a PMWS, ou vírus propagados em culturas de células PK-15 (G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of 11 pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); M. Balasch et al., 1999, supra; J. Ellis et al., 1999, supra; S. Kennedy et al., 2000, supra·, S. Krakowka et al., 2001, supra; S. Krakowka et al., 2000, supra; R. M. Pogranichnyy et al., 2000, supra). Uma vez que os homogenados de tecidos podem conter outros agentes vulgares nos suínos, tais como o PPV e o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos porcinos (PRRSV) (G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999) ; G. M. Allan and J. A Ellis, 2000, supra; J. A. Ellis et al., "Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Vet. Diagn. Invest. 12:21-27 (2000); C. Roseli et al., 2000, supra), e uma vez que a linhagem de células ATCC PK-15, utilizada para a propagação dos PCV2, foi persistentemente infectada com os PCVl (G. C. Dulac e A. Afshar, 1989, supra), a patologia clínica e as lesões patológicas reproduzidas em tais estudos podem não ser apenas atribuíveis à infecção com os PCV2 (G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and 12 porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra·, J. A. Ellis et al., 2000, supra) .

Também foi reproduzido a PMWS clinica em suínos CDCD inoculados com PCV2 depois de vacinados com Mycoplasma hyopneumoniae (G. M. Allan et al., "Immunostimulation, PCV-2 and PMWS," Vet. Rec. 147:171-172 (2000)). Dois estudos recentes em ambiente natural, feitos por G. M. Allan et al., "Neonatal vaccination for Mycoplasma hyopneumoniae and postweaning multisystemic wasting syndrome: a field trial, " Pig J. 48:34-41 (2001), and S. C. Kyriakis et al., "The effects of immuno-modulation on the clinicai and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Comp. Pathol. 126:38-46 (2002), permitiram testar o efeito da imunomodulação pela vacina de Mycoplasma hyopneumoniae sobre o desenvolvimento da PMWS em varas de porcos endémicas e revelaram uma diminuição significativa em casos de PMWS em grupos não vacinados, comparativamente com animais vacinados. No entanto, num outro estudo recente, utilizando leitões SPF vulgares, em condições laboratoriais controladas, não foi possível reproduzir tal efeito, sugerindo isso que as vacinações com M. hyopneumoniae podem influenciar, potencialmente, o desenvolvimento da PMWS clínica, mas que isso é claramente um papel secundário para uma infecção com PCV2. Com base nestes e noutros estudos, o PCV2 é, não obstante, 13 considerado como sendo exclusivo, da PMWS. o agente causador primário, mas não A inexistência de um lote virai infeccioso de uma forma biologicamente pura de PCV2 tem impedido a compreensão da patogénese do PCV2 e a função etiológica do PCV2 na PMWS. Ainda não se demonstrou, de forma consistente, que as vacinações contra o PPV e possivelmente contra o PRRSV impeçam o surto de PMWS em suínos infectados com PCV2. Em consequência, tem sido difícil encontrar uma vacina segura e potente para combater, especificamente, a PMWS. Há uma necessidade técnica, bem definida no domínio da medicina veterinária, para a produção de uma vacina eficaz e segura contra infecções de PCV2 e contra a PMWS. A patente de invenção norte-americana n° 6 287 856 (Poet et al.) e o documento WO 99/45956 dizem respeito a ácidos nucleicos provenientes do vírus do bico e da doença das penas das psitacíneas (BFDV), que é um circovírus que infecta espécies de aves, e provenientes também de circovírus porcino (PCV). A patente de invenção propõe composições vacinais constituídas por ADN ou ARNm desguarnecido e descreve um vector de ácido nucleico para a expressão transitória de PCV numa célula eucariótica, compreendendo uma sequência reguladora da transcrição ou da tradução com actuação cis, derivada do intensificador ou promotor do gene de acção imediata ou precoce do citomegalovírus humano, funcionalmente ligado a um ácido nucleico da sequência. No entanto, uma vez que o ADN do PCV deriva exclusivamente da linhagem de células PK-15, é provável que compreenda o PCVl não patogénico descoberto à quase 30 anos por I. Tischer et al., 1974, supra, e consequentemente é improvável que seja eficaz para suscitar 14 uma reacção imunitária contra o PCV2 ou contra infecções causadas pelo PCV2. A patente sugere também vacinas de subunidades de proteínas recombinantes feitas a partir de vectores que compreendem grelhas de leitura aberta, mas as grelhas de leitura aberta do PCV não estão bem caracterizadas e nem diferenciadas entre si. Uma vez que a fonte de adn do PCV é constituída pelas células pk-15, as proteínas feitas a partir dos vectores que compreendem grelhas de leitura aberta do PCVl não iriam ter propriedades imunogénicas fiáveis, se tivessem algumas, contra o PCV2.

A patente de invenção norte-americana n° 6 217 883 (Allan et al.) e a patente de invenção francesa n° 2 781 159B descrevem o isolamento de cinco estirpes de PCV a partir de amostras pulmonares ou gangliónicas retiradas de suínos infectados com PMWS no Canadá, Califórnia e França (Bretanha) e a sua utilização combinadamente, pelo menos com um antigénio de parvovirus de porcinos, em composições imunogénicas. As proteínas codificadas pelas grelhas de leitura aberta (ORF) de PCV2, abrangendo desde a ORFl até à 0RF13, estão profusamente descritas nas referidas patentes de invenção, mas não há nenhuma exemplificação de qualquer proteína específica que exiba propriedades imunogénicas. As referidas patentes de invenção descrevem também vectores constituídos por plasmídeos de ADN, moléculas de ADN linear e vírus recombinantes que contêm e expressam in vivo uma molécula de ácido nucleico que codifica o antigénio PCV. Há várias outras referências, por exemplo, a patente de invenção norte-americana n° 6 391 314 Bl; a patente de invenção norte-americana n° 6 368 601 Bl; a patente de invenção francesa n° 2 769 321; a patente de invenção francesa n° 2 769 322; e os documentos WO 01/96377 A2; WO 15 00/01409; WO 99/18214; WO 00/77216 A2; WO 01/16330 A2; WO 99/29871; etc., que descrevem também a administração de polipeptidos de PCV1 ou PCV2 ou os ácidos nucleicos que codificam os polipeptidos de diversas estirpes. Em particular, os documentos WO 99/29871 e WO 00/77188 dizem respeito a suinos protegidos contra um ataque de PCV patogénico, após imunização de ADN.

No entanto, o PCVl não patogénico não irá ser útil contra infecções de PCV2 e é provável que as estirpes de PCV2 patogénicas descritas na especialidade, ainda que atenuadas, tenham um valor limitado, devido à tendência habitual de um vírus vivo regressar ao seu estado virulento. Assim sendo, continua a existir na especialidade, uma necessidade continuada de se dispor de um antigénio não patogénico, infeccioso e vivo para a inoculação de suínos contra qualquer infecção grave ou PMWS provocadas pelo PCV2, que seja eficaz e seja segura em vacinas de veterinária. Estes objectivos são satisfeitos mediante a construção de novos circovírus porcinos quiméricos vivos aqui descritos, os quais se baseiam na estrutura genómica do PCVl não patogénico isolado por I. Tischer et al. há quase 30 anos. O novo circovírus porcino quimérico da presente invenção tem aptidão para satisfazer essa necessidade duradoura, graças ao facto de suster exclusiva e vantajosamente o fenótipo não patogénico do PCVl e simultaneamente induzir uma resposta imunitária específica contra o PCV2 patogénico.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico quimérico infeccioso de circovírus porcino 16 (PCV1-2), caracterizada pelo facto de possuir uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCVl infeccioso e não patogénico que contém um gene imunogénico de grelha de leitura aberta 2 (0RF2) de um PCV2 patogénico, em vez de um gene de 0RF2 da molécula de ácido nucleico do PCVl. De acordo com uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico quimérico possui uma sequência de nucleótidos que está explicitada na figura 9, a sua cadeia complementar ou uma sequência de nucleótidos que possui pelo menos uma homologia de 95% com a sequência de nucleótidos da figura 9. A presente invenção também diz respeito a um vector plasmídico ou virai biologicamente funcional que contém a molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a invenção, e a uma célula hospedeira conveniente transfectada por um vector caracterizado pelo facto de compreender a molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a invenção. A presente invenção também diz respeito a um circovirus porcino quimérico infeccioso e avirulento que pode ser obtido por células que contêm a molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a invenção A presente invenção também diz respeito a um processo para a produção de um produto polipeptídico imunogénico, sendo o referido processo caracterizado pelos passos seguintes: desenvolver, em condições nutrientes adequadas, células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas transfectadas com uma molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a invenção, de uma maneira que permita a expressão do referido produto polipeptídico, e isolar o desejado produto polipeptídico da expressão da referida molécula de ácido nucleico. 17 A presente invenção também diz respeito a uma vacina que protege um suino contra uma infecção virai ou contra a sindrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS) provocada pelo PCV2, a qual compreende um veiculo não tóxico, fisiologicamente aceitável, e uma quantidade imunogénica de um componente seleccionado entre o conjunto constituído por: (a) uma molécula de ácido nucleico quimérico que possua uma sequência de nucleótidos explicitada na figura 9, a sua cadeia complementar ou uma sequência dos nucleótidos que manifeste uma homologia pelo menos igual a 95% com a sequência de nucleótidos da figura 9; (b) um vector plasmidico ou virai biologicamente funcional que contenha a molécula de ácido nucleico quimérico, a cadeia complementar ou sequência de nucleótidos que apresente pelo menos uma homologia de 95% com a sequência de nucleótidos da figura 9; e (c) um circovírus porcino quimérico infeccioso e avirulento produzido a partir de uma molécula de ácido nucleico quimérico de PCV1-2 em que o gene da cápside de 0RF2 do PCV1 é substituído pelo gene da cápside de 0RF2 do PCV2 . A presente invenção também diz respeito à vacina virai de acordo com a invenção para utilização na protecção de um suíno contra uma infecção virai ou contra a sindrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS) causada por PVC2, e à utilização da vacina de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para proteger um suíno contra a infecção virai ou contra a sindrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS) provocada pelo PVC2. 18 A presente invenção também diz respeito a um processo para a preparação de uma molécula de ácido nucleico quimérico infeccioso de PCVl-2 de acordo com a invenção, o qual consiste em remover um gene da grelha de leitura aberto 2 (0RF2) de uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCVl não patogénico e infeccioso; substituir a posição do gene de 0RF2 do PCVl por um gene de 0RF2 imunogénico proveniente de um PCV2 patogénico; e recuperar a molécula de ácido nucleico quimérico. A presente invenção também diz respeito a uma molécula de ácido nucleico quimérico recíproco infeccioso de PCV2-1 que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCV2 patogénico e infeccioso que possui um gene de 0RF2 imunogénico proveniente de um PCVl não patogénico em vez de um gene de 0RF2 da molécula de ácido nucleico do PCV2.

Assim, a presente invenção diz respeito a clones de ADN quimérico infeccioso de circovírus porcino (PCV) e a vírus quiméricos vivos derivados dos clones de ADN, que são úteis como vacinas.

Os novos virus quiméricos vivos, geneticamente avirulentos, são produzidos a partir da estrutura genómica não patogénica do PCVl, em que o gene imunogénico de uma estirpe patogénica de PCV2 substitui um gene do PCVl, na mesma posição correspondente. A invenção compreende plasmídeos biologicamente funcionais, vectores virais e construções semelhantes que contenham as novas moléculas de ácido nucleico recombinante aqui descritas, células hospedeiras adequadas transfectadas pelos vectores que compreendam o ADN e um processo para a produção de produtos polipeptídicos imunogénicos. Também está contida no âmbito da presente invenção uma vacina virai e a sua utilização 19 para a protecção de suínos contra infecções virais ou contra a síndrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS) causadas pelo PCV2. A invenção proporciona também clones de PCV quiméricos de ADN recíproco, utilizáveis em modelos experimentais para se obter ou caracterizar as novas vacinas virais avirulentas.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS

Os antecedentes da invenção e o seu ponto de partida, relativamente à técnica anterior serão melhor descritos adiante, tomando como referência os desenhos anexos em que: a figura 1 representa a construção de um clone de ADN molecular de PCV2 infeccioso. As posições relativas do par iniciador utilizado para amplificar o genoma completo do PCV2 estão indicadas pelas setas (iniciador inverso R-PCVSAC2, iniciador directo F-PCVSAC2). 0 ADN genómico do PCV2, amplificado por PCR, é digerido com a enzima de restrição Sacll e purificado. 0 ADN genómico digerido com Sacll e purificado é ligado para formar concatemeros. Os concatemeros ligados são separados por electroforese em gel, purifica-se o dímero genómico encadeado (tandem) do PCV2 e faz-se a sua clonagem no vector pSK que é pré-digerido com a enzima Sacll para produzir um clone de ADN molecular de PCV2.

As figuras 2A e 2B mostram que o ADN plasmídico do PCV2 clonado é infeccioso quando transfectado in vitro em células PK-15. A figura 2A ilustra a detecção do antigénio PCV2 por meio de um ensaio de imunofluorescência (IFA) em células PK-15 transfectadas com o ADN plasmídico do PCV2 clonado. Observa-se no núcleo uma intensa imunomarcação do antigénio PCV2 e, em 20 menor grau, no citoplasma das células transfectadas. A figura 2B mostra células pk-15 pseudotransfectadas. A figura 3A mostra os pulmões de um suíno inoculado, por via intralinfóide, com ADN de PCV2 ao 21° DPI. Os pulmões apresentam-se com aspecto de borracha, não chegam a deformar-se e estão sarapintados de castanho avermelhado. Os nodos linfáticos traqueobronquiais estão nitidamente dilatados e acastanhados (setas). A figura 3B representa uma secção microscópica de um pulmão normal retirado de um suino de contraprova (25X) . A figura 3C representa uma secção microscópica do pulmão retirado do suíno correspondente à figura 3A. Chama-se a atenção para a inflamação linfoistocítica peribronquiolar e para a ligeira bronquiolite necrotizante (2 5 X). A figura 3D ilustra a coloração imunocitoquímica do pulmão da figura 3A. Chama-se a atenção para o antigénio PCV2 em macrófagos (setas) e em células semelhantes a fibroblastos (cabeças das setas) em torno das vias aéreas (64X). A figura 4A ilustra um nodo linfático normal de um suíno de contraprova. Chama-se a atenção para os folículos linfóides perfeitamente definidos (setas) (25X). A figura 4B representa uma secção microscópica do nodo linfático traqueobronquial proveniente do suíno correspondente à figura 3A inoculado 21 dias antes por via intralinfóide com o ADN genómico do PCV2 clonado. Os folículos linfóides apresentam-se mediocramente definidos, existe uma depleção linfóide entre ligeira e moderada e há uma inflamação granulomatosa multifocal ligeira (25X). A figura 4C representa uma secção microscópica do nodo linfático da figura 4B com uma amplificação maior incidente sobre um folículo. Chama-se a atenção para o foliculo mediocramente 21 definido com macrófagos e células gigantes (seta) a substituírem os linfócitos foliculares (64X). A figura 4D ilustra a detecção imunocitoquímica do antigénio PCV2 no mesmo nodo linfático representado na figura 4B em macrófagos (setas) e em células gigantes (cabeças de setas pequenas) e células de tipo dendrítico (cabeças de setas grandes) nos folículos (64X). A figura 5 ilustra a construção de um clone de ADN de PCVl-2 quimérico (PCV1/PCV2) com o genoma não patogénico de PCVl transportando o gene imunogénico da cápside de 0RF2 do PCV2 patogénico. 0 clone de ADN dimerizado é utilizado para transfectar in vitro células PK-15 para se produzir o vírus quimérico em que tem lugar a expressão da proteína ORF2 do PCV2 e para experiências in vivo em animais, para se confirmar a actividade. A figura 6 representa a construção e a organização de PCVl, PCV2 e PCVl-2 quimérico, infecciosos, e de clones de ADN molecular recíproco de PCV2-1 quimérico. 0 clone de ADN de PCV2 é construído fazendo a ligação de dois genomas, em tandem, de PCV2 linear de comprimento completo, no vector Bluescript SK (pSK), recorrendo aos processos gerais já anteriormente descritos (M. Fenaux et al., 2002, supra). O clone de ADN de PCVl é construído fazendo a ligação, em tandem, de dois genomas de PCVl linear de comprimento completo, no vector pSK. O ADN quimérico de PCVl-2 é construído fazendo a substituição do gene da cápside de ORF2 do PCVl pelo do PCV2 na estrutura genómica não patogénica de PCVl no vector pSK. O clone de ADN recíproco quimérico de PCV2-1 é construído fazendo a substituição do gene da cápside de ORF2 do PCV2 patogénico pelo do PCVl não patogénico na estrutura genómica do PCV2 patogénico no 22 vector pSK. Ambos os clones quiméricos são dímeros no vector pSK. As setas representam as localizações relativas dos iniciadores de PCR para a detecção de viremia de PCV1, PCV2, PCV1-2 e PCV2-1 nos animais inoculados.

As figuras 7A-7J demonstram que os clones de ADN de PCVl, PCV2, PCVl-2 quimérico e PCV2-1 quimérico reciproco são infecciosos e expressam os respectivos antigénios virais quando transfectados in vitro em células PK-15. 0 painel da esquerda (7A, 7C, 7E, 7G e 71) está colorado com o anticorpo monoclonal contra o 0RF2 de PCVl. 0 painel da direita (7B, 7D, 7F, 7H e 7J) está colorado com o anticorpo contra o PCV2. Os painéis 7A e 7B correspondem a células PK-15 pseudotransfectadas. Os painéis 70 e 7D correspondem a células PK-15 transfectadas com o clone de ADN de PCVl. Os painéis 7E e 7F correspondem a células PK-15 transfectadas com o clone de ADN de PCV2. Os painéis 7G e 7H correspondem a células PK-15 transfectadas com o clone de ADN quimérico de PCVl-2. Os painéis 71 e 7J correspondem a células PK-15 transfectadas com o clone de ADN quimérico reciproco de PCV2-1. A figura 8 representa a sequência de ADN de comprimento completo do ADN molecular de PCV2 clonado (que corresponde à SEQ id N0:1). A figura 9 representa a sequência de ADN de comprimento completo do ADN quimérico clonado de PCVl-2 (que corresponde à SEQ ID NO:2). A figura 10 representa a sequência de ADN do gene da cápside de ORF2 imunogénico do ADN quimérico clonado de PCVl-2 (que corresponde à SEQ ID NO:3). 23 A figura 11 representa a tradução dos aminoácidos putativos do gene da cápside de 0RF2 imunogénico do ADN quimérico de PCV1-2 (que corresponde à SEQ ID NO:4).

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, esta proporciona moléculas infecciosas de ácido nucleico molecular e quimérico de circovirus porcino (PCV), vírus quiméricos vivos produzidos a partir das moléculas de ácido nucleico quimérico e vacinas para aplicação veterinária para a protecção de suínos contra infecções virais ou contra a síndrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS), causadas pelo PCV2. A invenção também diz respeito a um processo para a produção de produtos de expressão de polipeptidos imunogénicos que podem ser utilizados como vacinas. A nova molécula de ADN quimérico infeccioso de PCV avirulento (PCVl-2) compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCVl não patogénico e infeccioso que contém um gene imunogénico da grelha de leitura aberta 2 (0RF2) de um PCV2 patogénico, em vez de um gene de 0RF2 no genoma do PCVl. Assim, o clone de ADN de PCVl-2 quimérico infeccioso contém o gene de cápside imunogénico (0RF2) do ADN de PCV2 clonado na estrutura genómica do clone de ADN de PCVl não patogénico infeccioso. 0 gene de cápside do ADN de PCV2 substitui o gene de 0RF2 do ADN de PCVl na estrutura genómica do PCVl não patogénico, e descreve-se um conjunto de permutações posicionais construídas por meio de técnicas da engenharia genética para se obter outros clones de ADN quiméricos avirulentos 24 ou atenuados. Descreve-se e explicita-se o clone de ADN de PCV2-1 infeccioso, quimérico e reciproco, entre o PCVl e o PCV2, como referência de contraprova para analisar o clone de PCVl-2 quimérico da invenção, sendo construído mediante a substituição do gene da cápside do PCV2 pelo de PCVl na estrutura do clone de ADN infeccioso do PCV2 patogénico. Para além de ser um modelo experimental, o clone de ADN de PCV2-1 quimérico e recíproco pode vir a ser utilizado para a preparação de vacinas especialmente adaptadas.

Comprovou-se que o ADN genómico clonado do PCV2 aqui descrito é infeccioso in vitro e in vivo quando transfectado em células PK-15 e administrado aos suínos. 0 clone de ADN de PCV2 infeccioso produz lesões patológicas características da PMWS em suínos, permitindo uma melhor caracterização da patologia clínica e uma compreensão da distribuição virai nas células dos tecidos. Este novo agente patogénico, facilmente reproduzível, serve perfeitamente para o desenvolvimento de um programa de vacinação conveniente para evitar a pmws em suínos. 0 novo clone de ADN quimérico de PCVl-2 também é infeccioso tanto por transfecção in vitro de células PK-15 como por administração in vivo aos suínos. Nas células PK-15 transfectadas, o clone de ADN quimérico de PCVl-2 expressa o antigénio da cápside do PCV2 (a proteína da cápside imunogénica do PCV2), ao passo que o clone de ADN quimérico recíproco de PCV2-1 expressa o antigénio da cápside do PCVl, o que é demonstrado por meio de um ensaio de imunofluorescência (IFA) utilizando anticorpos específicos para o antigénio da cápside do PCVl ou do PCV2. A seroconversão em anticorpos específicos de PCV2 é detectada nos suínos inoculados com o clone infeccioso de PCV2 e também com o clone quimérico de 25 PCVl-2. A detecção da seroconversão em anticorpos específicos de PCV2 determina que o clone de ADN quimérico de PCVl-2 induz anticorpos específicos de PCV2 em suínos infectados e consequentemente actua no sentido de proteger os suínos inoculados contra infecções com PCV2.

Os exemplos subsequentes descrevem, de forma mais minuciosa, a avaliação da imunogenicidade e da patogenicidade dos clones de ADN quimérico em suínos inoculados. Basicamente, são detectadas as seroconversões em anticorpos contra o antigénio de 0RF2 do PCV2 em suínos inoculados com o clone de ADN de PCV2 (grupo 3) e com o clone de ADN quimérico de PCVl-2 (grupo 4). Em todos os suínos inoculados com o clone de PCV1 e com o clone de ADN quimérico recíproco de PCV2-1 (respectivamente grupos 2 e 5), tem lugar a seroconversão em anticorpos contra o PCVl. Os vírus recuperados a partir de suínos seleccionados em cada grupo são parcialmente sequenciados, tendo sido confirmado que são os respectivos e autênticos clones de ADN infeccioso utilizados na inoculação. As lesões macroscópicas e microscópicas em diversos tecidos de animais inoculados com o clone de ADN de PCV2 são significativamente mais graves do que as verificadas em suínos inoculados com clones de ADN de PCVl, de PCVl-2 quimérico e de PCV2-1 quimérico e recíproco.

De forma surpreendente e vantajosa, o clone de ADN infeccioso de PCVl-2 quimérico que possui o gene da cápside imunogénico (0RF2) do PCV2 patogénico clonado na estrutura genómica do PCVl não patogénico induz uma resposta de anticorpos específica contra o antigénio da cápside do PCV2 patogénico, ao mesmo tempo que conserva, exclusivamente, a natureza não patogénica do PCVl nos suínos. Os animais inoculados com o clone de ADN infeccioso de PCVl-2 26 quimérico desenvolvem uma infecção ligeira que se assemelha à dos animais inoculados com o PCVl, ao mesmo tempo que fazem a seroconversão em anticorpos contra a proteina da cápside do 0RF2 do PCV2 patogénico. A duração média da viremia observada nos animais inoculados com PCVl e com o PCVl-2 quimérico é mais curta, respectivamente 0,625 semana e 1 semana, do que a dos animais inoculados com o PCV2 patogénico que é de cerca de 2,12 semanas. A inexistência de viremia de PCVl-2 quimérico detectável, em alguns dos animais inoculados, não afecta a seroconversão em anticorpos contra a proteina da cápside do ORF2 do PCV2 nos suinos inoculados com PCVl-2 (grupo 4). Os resultados indicam que o virus PCVl-2 quimérico, apesar da viremia de PCVl-2 quimérico ser curta ou indetectável em alguns animais inoculados, é capaz de induzir uma resposta de anticorpos contra a proteina da cápside do ORF2 de PCV2. Se bem que a aptidão especial do clone de ADN infeccioso do PCVl-2 quimérico para induzir a resposta imunitária especifica contra a proteina da cápside do ORF2 imunogénico do PCV2 patogénico se mantenha não patogénica para os suinos, faz com que o clone de PCVl-2 quimérico seja particularmente útil como vacina viva atenuada, geneticamente manipulada, e outros tipos de vacinas.

As novas moléculas de ácido nucleico purificadas e isoladas da presente invenção compreendem uma sequência de ADN de comprimento completo do ADN do PCVl-2 quimérico clonado, designada por SEQ ID NO:2, ilustrada na figura 9 e depositada na Colecção Americana de Culturas Tipo com a designação de depósito de patentes PTA-3912; e a sua cadeia complementar (isto é, os pares de bases inversos e opostos) ou as sequências de nucleótidos que possuem uma homologia 27 pelo menos igual a 95% com a sequência de nucleótidos quimérica (isto é, uma parte activa e significativa do gene inteiro). É possível utilizar todos os processos convencionais, perfeitamente conhecidos na especialidade, para a preparação das cadeias complementares ou das sequências de nucleótidos que possuam uma homologia elevada, por exemplo, todas as técnicas de hibridação consagradas na especialidade ou de rigor elevado. A molécula de ácido nucleico purificada e isolada, que compreende a sequência de ADN do gene da cápside imunogénico do ADN do PCVl-2 quimérico clonado, está também explicitada na SEQ ID NO:3 e na figura 10.

As células adequadas que contêm a molécula de ácido nucleico quimérica, produzem exclusivamente o circovírus porcino quimérico, infeccioso e vivo. O vírus quimérico infeccioso e vivo é obtido a partir do clone de ADN quimérico por transfecção de células PK-15 por meio de transfecções in vitro e in vivo, conforme aqui ilustrado. Um exemplo preferencial do ADN do PCVl-2 quimérico clonado é o da sequência de nucleótidos designada por SEQ ID NO:2 e o da figura 9. A presente invenção prevê também que o vírus quimérico seja preparado a partir da cadeia complementar ou das sequências de nucleótidos que possuam uma homologia elevada, pelo menos uma homologia igual a 95%, com a sequência de nucleótidos quimérica.

Também estão abrangidos no âmbito da presente invenção os vectores virais ou plasmídicos biologicamente funcionais, e outros que tais, que contenham as novas moléculas de ácido nucleico recombinante aqui descritas, as células hospedeiras convenientes transfectadas pelos vectores que compreendam os clones de ADN quimérico e molecular e um processo para a produção de produtos de 28 expressão de polipeptidos imunogénicos, tais como a proteína imunogénica que possui a sequência de aminoácidos designada por SEQ ID NO: 4 e explicitada na figura 11. Também podem ser produzidas as suas variantes biologicamente activas. Um vulgar especialista na matéria saberia como modificar, substituir, eliminar, etc., aminoácidos da sequência de polipeptidos e como produzir variantes biologicamente activas que conservem a mesma, ou praticamente a mesma, actividade existente na sequência original, sem nenhum esforço desnecessário.

Para a produção dos produtos polipeptídicos imunogénicos, conforme descrito, o processo pode compreender os passos seguintes: desenvolver, em condições nutrientes adequadas, células hospedeiras procarióticas e eucarióticas transfectadas com as novas moléculas de ácido nucleico recombinante aqui descritas, de uma maneira que permita a expressão dos referidos produtos polipeptídicos, e isolar os desejados produtos polipeptídicos da expressão das referidas moléculas de ácido nucleico por processos convencionais conhecidos na especialidade. Também está previsto que as proteínas imunogénicas possam ser preparadas por meio de outras técnicas tais como, por exemplo, a síntese bioquímica e não só.

As vacinas de clones de adn molecular e virai quimérico e as suas utilizações também estão compreendidas no âmbito da presente invenção. Os suínos inoculados ficam protegidos contra infecções virais graves e contra a PMWS provocadas pelo PCV2. A sua utilização protege os suínos, que necessitem de protecção, contra a infecção virai ou contra a PMWS, administrando aos suínos uma quantidade imunologicamente eficaz de uma vacina de acordo com a invenção tal como, por exemplo, uma vacina que compreenda 29 uma quantidade imunogénica do ADN quimérico de PCVl-2, do virus quimérico clonado, de um vector plasmídico ou virai que contenha o ADN do PCVl-2, etc.. É possivel administrar simultaneamente aos suinos outros antigénios tais como PRRSV, PPV ou outros agentes infecciosos dos suínos e estimuladores do sistema imunitário, para lhes conferir um espectro amplo de protecção contra infecções virais.

As vacinas compreendem, por exemplo, o ADN de PCVl-2 quimérico infeccioso, o ADN genómico quimérico de PCV clonado em vectores ou plasmideos adequados tais como, por exemplo, o vector pSK, um vírus quimérico, vivo e avirulento, um vírus quimérico inactivado, etc., em combinação com um veículo não tóxico fisiologicamente aceitável e, facultativamente, um ou vários adjuvantes. São preferíveis o ADN do PCVl-2 quimérico infeccioso, o ADN plasmídico que contenha o genoma virai quimérico infeccioso e o vírus quimérico vivo, sendo a máxima preferência para o vírus quimérico vivo. A vacina virai viva avirulenta da presente invenção tem uma vantagem relativamente às vacinas virais tradicionais em que são utilizados vírus vivos atenuados em que há o risco de regressarem ao estado virulento ou de a cultura de células mortas propagar os vírus inteiros, com a possibilidade de não induzirem uma resposta imunitária com anticorpos suficientes para protecção contra a doença virai. 0 adjuvante, que pode ser administrado em conjunto com a vacina da presente invenção, é uma substância que faz aumentar a resposta imunitária de um suíno à vacina. 0 adjuvante pode ser administrado ao mesmo tempo e no mesmo local da vacina, ou em momento diferente, por exemplo, como estímulo de reforço. Os adjuvantes também podem ser vantajosamente administrados ao suíno de uma maneira ou num 30 local diferentes da maneira ou do local em que a vacina é administrada. Os adjuvantes adequados compreendem, mas sem nenhuma limitação, os seleccionados entre hidróxido de alumínio (alum), complexos imunoestimuladores (ISCOMS), polímeros ou copolímeros de blocos não iónicos, citoquinas (tais como IL-1, il-2, IL-7, iFN-a, iFN-β, iFN-γ, etc.), saponinas, lípido A monofosforílico (MLA), dipeptidos muramílicos (MDP) e não só. Outros adjuvantes convenientes compreendem, por exemplo, sulfato de alumínio e potássio, enterotoxina termicamente estável ou instável, isolada a partir de Escherichia coli, toxina da cólera ou a sua subunidade B, toxina da difteria, toxina do tétano, toxina da tosse convulsa, adjuvante completo ou incompleto de Freund, etc.. Os adjuvantes à base de toxinas, tais como a toxina da difteria, a toxina do tétano e a toxina da tosse convulsa podem ser inactivados antes da sua utilização, por exemplo, por tratamento com formaldeído.

As vacinas também podem conter antigénios suplementares que favoreçam a actividade imunológica dos clones de ADN do PCV quimérico infeccioso tais como, por exemplo, vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos porcinos (PRRSV), parvovirus de porcinos (PPV), outros agentes infecciosos dos suínos e estimuladores do sistema imunitário.

As novas vacinas da presente invenção não ficam limitadas a nenhum tipo ou processo particular de preparação. As vacinas virais clonadas compreendem, mas sem nenhuma limitação, as vacinas de ADN infeccioso (isto é, utilização de plasmídeos, vectores ou outros veículos convencionais para injectar directamente ADN nos suínos), vacinas vivas, vacinas vivas modificadas, vacinas 31 inactivadas, vacinas atenuadas, vacinas geneticamente modificadas, etc.. Estas vacinas são preparadas por processos conhecidos na especialidade. A vacina virai viva é, geralmente, a vacina mais desejável, na medida em que todas as possíveis respostas imunitárias são activadas no receptor da vacina, incluindo as respostas imunitárias sistémicas, locais, humorais e mediadas por células. Por outro lado, uma vacina morta, consegue induzir apenas uma resposta imunitária humoral. No entanto, apesar de ser a mais desejável, uma vacina virai viva tem diversos inconvenientes, tais como o risco potencial de contaminação com agentes virais secundários ou o risco de que o vírus possa regressar ao seu estado virulento no meio em que está inserido. De uma forma notável, o ADN quimérico exclusivo do PCVl-2 da presente invenção vem resolver estes inconvenientes. Utilizando apenas os genes imunogénicos do PCV2 patogénico, o ADN quimérico constrói um vírus quimérico vivo e replicativo que é não patogénico e permite suscitar a resposta imunitária completa e benéfica das vacinas virais vivas contra o vírus PCV2 patogénico. As vacinas de vírus vivos, baseadas no vírus quimérico, irão ter uma probabilidade diminuta, se houver alguma, para regressarem a um fenótipo patogénico. Deste modo, o novo vírus quimérico, que tem por base a estrutura do PCVl não patogénico, possui uma enorme vantagem sobre todos os vírus de ADN recombinante do PCV2, sobre todas a vacinas vivas e atenuadas de PCV2 ou sobre todos os outros tipos de vacinas em que esteja envolvido exclusivamente o PCV2, para conferir imunidade contra infecções provocadas por PCV2. 32

Embora a vacina virai viva seja a mais preferencial, é possivel utilizar outros tipos de vacinas para inocular suínos com o novo vírus quimérico e com outros antigénios aqui descritos. Para a preparação de vacinas de vírus inactivados, por exemplo, a propagação de vírus a partir do clone de ADN infeccioso é feita por processos conhecidos na especialidade ou aqui descritos. A inactivação sequencial dos vírus é então optimizada por protocolos genericamente conhecidos pelos vulgares especialistas na matéria.

As vacinas de vírus inactivados podem ser preparadas tratando os vírus quiméricos, obtidos a partir de ADN do PCV clonado, com agentes inactivadores tais como a formalina ou os solventes hidrofóbicos, ácidos, etc., por irradiação com luz ultravioleta ou raios X, por métodos térmicos, etc.. A inactivação é realizada de uma maneira conhecida na especialidade. Por exemplo, na inactivação química, trata-se uma amostra virai adequada ou uma amostra de soro que contenha o vírus durante um intervalo de tempo suficiente com uma quantidade ou com uma concentração suficientes de um agente inactivador a valores de temperatura ou pH suficientemente elevados (ou diminutos, consoante o agente inactivador) para inactivar o vírus. A inactivação térmica é efectuada a uma temperatura e durante um intervalo de tempo suficientes para inactivar o vírus. A inactivação por irradiação é efectuada recorrendo a uma fonte luminosa com um determinado comprimento de onda, ou a outra fonte energética, durante um intervalo de tempo suficiente para inactivar o vírus. Considera-se que o vírus está inactivado se for incapaz de infectar uma célula sensível à infecção. 33

Para a preparação de vacinas atenuadas a partir de clones patogénicos, atenua-se em primeiro lugar o PCV2 patogénico, vivo e adaptado da cultura tecidual (que passou a ser não patogénico ou inofensivo) por processos conhecidos na especialidade, tipicamente por passagem sequencial através de culturas de células. A atenuação de clones patogénicos pode ser feita por deleções de genes ou por mutações de genes de produção virai. Depois, os virus PCV2 podem ser atenuados para a construção de virus quiméricos suplementares PCVl-2 que conservam o fenótipo não patogénico do PCVl, mas que conseguem variar a intensidade das peculiaridades imunogénicas seleccionadas a partir do genoma do PCV2, por meio de tecnologias recombinantes. A vacina mais preferencial utiliza o clone de ADN de vírus quimérico que contém os genes imunogénicos do PCV2 clonado na estrutura do PCVl não patogénico, conforme definido nas reivindicações. De uma forma vantajosa, o vírus quimérico vivo, que é naturalmente avirulento quando construído por técnicas de manipulação genética, não necessita da prática de procedimentos de atenuação morosos. 0 vírus serve exclusivamente como vírus vivo, replicativo e não patogénico, que produz proteínas imunogénicas contra o PCV2 durante a replicação virai, podendo então suscitar um conjunto completo de respostas imunitárias contra o PCV2 patogénico.

Como benefício suplementar, o vírus quimérico vivo preferencial da presente invenção proporciona uma vacina geneticamente estável que é mais fácil de preparar, guardar e administrar do que outros tipos de vacinas atenuadas. As vacinas avirulentas ou atenuadas que se baseiam em vírus quiméricos são consideradas geralmente tão seguras, ou 34 mesmo mais seguras, como as vacinas vivas tradicionalmente modificadas (J. Arroyo et al., "Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE), " J. Virol. 75(2):934-942 (2001); F. Guirakhoo et al., "Recombinant chimeric yellow fever-dengue type 2 virus is immunogenic and protective in nonhuman primates," J. Virol. 74(12):5477-5485 (2000); S. Tang et al., "Toward a poliovirus-based simian immunodeficiency virus vaccine: correlation between genetic stability and immunogenicity," J. Virol. 71(10):7841-7850 (1997)). Por exemplo, demonstrou-se que a vacina ChimeriVax-JE contra o virus da encefalite japonesa (JEV), que é um derivado geneticamente manipulado da vacina contra o virus da febre amarela YFV17D, em que os genes que codificam as proteínas estruturais prM e E do YFV17D são substituídos pelos genes correspondentes da estirpe JEV SA14-14-2 atenuada, é geneticamente estável após passagens prolongadas tanto in vitro como in vivo (J. Arroyo et al., 2001, supra). Também se concluiu que é geneticamente estável uma outra vacina de vírus quimérico, a ChimeriVax-D2 contra o vírus de tipo 2 do dengue, que é um vírus quimérico atenuado de tipo 2 do dengue (dengue 2)-febre amarela (YF); confirmou-se que as suas sequências ficam inalteradas após 18 passagens em células Vero (F. Guirakhoo et al., 2000, supra).

Uma outra vacina preferencial da presente invenção utiliza plasmídeos adequados para administrar aos suínos o clone de ADN quimérico não patogénico. Contrariamente à vacina tradicional, que utiliza o vírus inteiro propagado em culturas de células vivas ou mortas, a invenção proporciona a inoculação directa de suínos com o ADN plasmidico que contém um genoma virai quimérico infeccioso. 35 Há outras vacinas geneticamente manipuladas, desejáveis na presente invenção, que são produzidas por técnicas conhecidas na especialidade. Tais técnicas implicam, mas sem nenhuma limitação, a manipulação suplementar de ADN recombinante, a modificação ou as substituições de sequências de aminoácidos das proteínas recombinantes e não só.

As vacinas geneticamente manipuladas, que se baseiam na tecnologia do ADN recombinante, são preparadas, por exemplo, identificando partes alternativas das proteínas que codificam o gene virai responsável pela indução de uma resposta imunitária ou protectora mais forte nos suínos (v.g., proteínas derivadas de 0RF3, 0RF4, etc.). Tais genes identificados ou fragmentos imunodominantes podem ser clonados em vectores de expressão de proteínas convencionais, tais como o vector de baculovírus, e utilizados para infectar células hospedeiras convenientes (ver, por exemplo, OReilly et al., "Baculovírus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co., 1992). As células hospedeiras são criadas em cultura para assim expressarem as proteínas de vacina desejadas que podem ser purificadas com o grau desejado e formuladas num produto de vacina conveniente.

Se os clones conservarem todas as aptidões naturais indesejáveis para provocarem doença, também é possível definir com exactidão as sequências de nucleótidos no genoma virai, responsáveis pela virulência, e manipular geneticamente o vírus para ficar avirulento, por exemplo, por mutagenese dirigida ao local. A mutagenese dirigida ao local permite acrescentar, eliminar ou modificar um ou vários nucleótidos (ver, por exemplo, Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984). Sintetiza-se um oligonucleótido contendo 36 a mutação desejada e recombina-se com uma parcela de ADN virai de cadeia singular. A molécula híbrida, que resulta de tal procedimento, é utilizada para transformar bactérias. Depois utiliza-se o ADN de cadeia dupla, que é isolado de modo a conter a mutação adequada, para produzir ADN de comprimento completo por ligação com um seu fragmento de restrição, sendo subsequentemente transfectado numa cultura celular adequada. A ligação do genoma no vector conveniente, para transferência, pode ser efectuada por meio de qualquer técnica convencional conhecida pelos vulgares especialistas na matéria. A transfecção do vector nas células hospedeiras para a produção de progenia virai pode ser efectuada recorrendo a todos os métodos convencionais, tais como os seleccionados entre transfecção mediada por fosfato de cálcio ou por DEAE-dextrano, electroporação, fusão de protoplastos e outras técnicas perfeitamente conhecidas (v.g., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . 0 vírus clonado exibe então a mutação desejada. Em alternativa, é possível sintetizar dois oligonucleótidos que contêm a mutação adequada. Estes podem ser recombinados para formarem ADN de cadeia dupla que pode ser inserido no ADN virai para a produção de ADN de comprimento completo.

As proteínas geneticamente manipuladas, úteis como vacinas, podem ser expressas, por exemplo, em células de insectos, células de leveduras ou células de mamíferos. As proteínas geneticamente manipuladas, que podem ser purificadas ou isoladas por processos convencionais, podem ser inoculadas directamente nos suínos para lhes conferirem protecção contra infecções virais ou contra a síndrome 37 debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS), provocadas pelo PCV2. É possível transformar uma linha de células de insectos (tal como a HI-FIVE) com um vector de transferência que contenha moléculas de ácido nucleico obtidas a partir do vírus ou copiadas a partir do genoma virai que codifica uma ou várias das proteínas imunodominantes do vírus. 0 vector de transferência compreende, por exemplo, ADN de baculovírus linearizado e um plasmídeo que contém os polinucleótidos desejados. A linhagem de células hospedeiras pode ser co-transfectada com o ADN de baculovírus linearizado e com uma plasmídeo para se obter um baculovírus recombinante.

Em alternativa, o ADN proveniente de um suíno que padeça de PMWS, que codifica um ou várias das proteínas da cápside, o clone de ADN molecular do PCV2 infeccioso ou o genoma do ADN quimérico do PCV clonado podem ser inseridos em vectores vivos, tais como um poxvirus ou um adenovírus e utilizados como vacinas.

Administra-se uma quantidade imunologicamente eficaz das vacinas da presente invenção a um suíno que necessite de protecção contra uma infecção virai ou contra a PMWS. A quantidade imunologicamente eficaz ou a quantidade imunogénica para inocular o suíno pode ser determinada facilmente ou titulada rapidamente por meio de ensaios de rotina. Uma quantidade eficaz é aquela em que se consegue obter uma resposta imunitária suficiente à vacina para proteger o suino exposto ao virus que causa a PMWS. De preferência, o suíno fica protegido com uma intensidade tal que um ou todos os sintomas ou efeitos fisiológicos adversos da doença virai são significativamente reduzidos, melhorados ou totalmente evitados. 38 A vacina pode ser administrada numa dose única ou em doses repetidas. A dosagem pode variar, por exemplo, entre 1 e 1 000 microgramas de ADN plasmidico contendo o genoma do ADN quimérico infeccioso (dependendo isso da concentração do componente imunoactivo da vacina), mas não deve conter nenhuma quantidade de antigénio, à base de virus, suficiente para originar uma reacção adversa ou sintomas fisiológicos adversos de infecção virai. São conhecidos na especialidade processos para a determinação ou titulação de doses adequadas de agente antigénico activo, com base na massa corporal do suino, na concentração do antigénio e outros factores típicos. De preferência, o clone de ADN virai quimérico infeccioso é utilizado como vacina, ou então é possível gerar um vírus quimérico infeccioso vivo in vitro e utilizar depois o vírus quimérico vivo como vacina. Nesse caso, é possível administrar a um suíno entre 100 a 2 00 microgramas de ADN de PCV quimérico clonado ou cerca de 10 000 unidades de vírus quimérico em cultura tecidual em dose infecciosa a 50% (CTDI50) .

De uma forma desejável, administra-se a vacina a um suíno que ainda não tenha estado exposto ao vírus PCV. A vacina que contém o clone de ADN quimérico infeccioso de PCVl-2, ou outras suas formas antigénicas, pode ser administrada convenientemente pelas vias intranasal, transdérmica (isto é, aplicada sobre a superfície ou na superfície da pele para absorção sistémica), parentérica, etc.. A via parentérica de administração compreende, mas sem nenhuma limitação, as vias intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica (isto é, por injecção ou por colocação, por qualquer outro processo, sob a pele) e não 39 só. Uma vez que as vias de inoculação intramuscular e intradérmica tiveram êxito noutros estudos, utilizando clones de ADN infeccioso virai (E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); L. Willems et al., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)), são estas vias as de maior preferência, para além da via prática intranasal de administração. Embora menos conveniente, também está previsto que a vacina seja administrada ao suino pela via intralinfóide de inoculação. Um processo exclusivo, altamente preferencial de administração, consiste em injectar directamente o ADN plasmídico que contém a quimera PCVl-2 num suino pelas vias intramuscular, intradérmica, intralinfóide, etc..

Quando administrada no estado liquido, a vacina da presente invenção pode ser preparada sob a forma de uma solução aquosa, xarope, elixir, tintura e não só. Tais formulações são conhecidas na especialidade e são preparadas, tipicamente, por dissolução do antigénio e de outros aditivos típicos em sistemas solventes ou veiculares apropriados. Os veículos ou solventes adequados compreendem, mas sem nenhuma limitação, água, soluto salino, etanol, etileno-glicol, glicerol, etc.. Os aditivos típicos são, por exemplo, corantes, aromas, edulcorantes e conservantes antimicrobianos certificados, tais como timerosal (etil-mercúrio-tiossalicilato de sódio). Tais soluções podem ser estabilizadas, por exemplo, por adição de gelatina parcialmente hidrolisada, sorbitol ou um meio de cultura celular, e podem ser tamponados por processos convencionais, utilizando reagentes conhecidos na especialidade, tais como 40 hidrogeno-fosfato de sódio, di-hidrogeno-fosfato de sódio, hidrogeno-fosfato de potássio, di-hidrogeno-fosfato de potássio, uma sua mistura e não só.

As formulações no estado líquido também podem compreender suspensões e emulsões que contenham agentes de suspensão ou de emulsão em combinação com outros co-formulantes convencionais. Estes tipos de formulações liquidas podem ser preparados por processos convencionais. Por exemplo, é possível preparar as suspensões recorrendo a um moinho coloidal. As emulsões podem ser preparadas, por exemplo, utilizando um homogeneizador.

As formulações parentéricas, concebidas para injecção nos sistemas de fluidos corporais, necessitam de uma isotonicidade adequada e de um tamponamento de pH para os níveis correspondentes aos dos fluidos corporais dos porcinos. A isotonicidade pode ser ajustada convenientemente com cloreto de sódio e com outros sais, conforme necessário. É possível utilizar solventes adequados, tais como o etanol ou o propileno-glicol, para aumentar a solubilidade dos ingredientes na formulação e a estabilidade da preparação líquida. Entre outros aditivos que é possível utilizar na vacina da presente invenção refere-se, mas sem nenhuma limitação, os seleccionados entre dextrose, antioxidantes convencionais e agentes quelantes, tais como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). As formas de dosagem parentérica também devem ser esterilizadas antes da sua utilização.

Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um novo método para a preparação de uma molécula de ácido nucleico quimérico não patogénico e infeccioso de PCVl-2, o qual consiste em remover um gene de uma grelha de 41 leitura aberta 2 (0RF2) de uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCVl não patogénico e infeccioso, substituir a mesma posição por um gene de 0RF2 imunogénico de uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCV2 patogénico infeccioso e recuperar a molécula de ácido nucleico quimérico. A molécula de ácido nucleico é, tipicamente, ADN. Assim, o processo substitui o gene de 0RF2 do ADN de PCVl não patogénico pelo gene da cápside de 0RF2 imunogénico do ADN molecular patogénico infeccioso do PCV2 aqui descrito. É possível permutar outras posições de ORF, ou seus fragmentos imunogénicos, entre o ADN do PCVl e do PCV2 para se construir os clones de ADN quimérico infeccioso atenuado, de acordo com os processos aqui descritos. A molécula de ácido nucleico recombinante é depois utilizada para a construção de vírus quiméricos replicantes, infecciosos e vivos da presente invenção que conservam, vantajosamente, a natureza não patogénica do PCVl ao mesmo tempo que expressam ainda a proteína 0RF2 imunogénica do PCV2 patogénico e induzem uma resposta imunitária completa contra o PCV2 patogénico. De uma forma desejável, o clone de ADN do PCV1-2 serve como vacina viva avirulenta, geneticamente manipulada, contra uma infecção provocada por PCV2 e contra a PMWS em suínos.

Constrói-se um clone de ADN infeccioso de PCV2, conforme aqui descrito, de modo a que seja gerado um lote de vírus infecciosos biologicamente puros e homogéneos para estudos de patogénese e para o desenvolvimento de vacinas quiméricas não patogénicas. A evolução da patologia clínica, da distribuição virai e das lesões patológicas associadas à infecção de PCV2 são mais definitivamente 42 caracterizadas mediante a utilização deste clone de ADN molecular e de um lote de vírus de PCV2 infeccioso biologicamente puro e homogéneo, obtido a partir do clone de ADN molecular, do que aquilo que se observou no passado, o que os torna propícios para o desenvolvimento dos desejados produtos vacinais da presente invenção. 0 clone molecular de PCV2 é gerado ligando em tandem duas cópias do genoma completo do PCV2 no vector pSK. Em contraste acentuado com o genoma de cópia singular descrito na especialidade, o clone de ADN infeccioso de PCV2 obtido pelos métodos aqui descritos contém duas cópias completas do genoma do PCV2 ligadas conjuntamente numa repetição em tandem. A ligação de duas cópias do genoma em tandem proporciona um genoma circular semelhante que simula o genoma circular habitual do PCV2. A vantagem de ter duas cópias do genoma em tandem no clone de ADN de PCV2 infeccioso consiste em tornar possível a maximização da replicação quando o clone de ADN infeccioso é transfectado in vitro e in vivo. Deste modo, o clone funciona mais eficiente e eficazmente do que o genoma de cópia singular da técnica anterior. A infecção de animais com o clone virai molecular é extremamente útil para se estudar os determinantes genéticos da replicação virai e a virulência no hospedeiro. 0 circovírus porcino de tipo 2 (PCV2) é considerado como sendo o agente causador da síndrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS). A PMWS é uma síndrome patológica complexa nos suínos e há múltiplos factores implicados na exposição clínica da PMWS. No entanto, a dificuldade na produção de uma forma biologicamente pura do PCV2, devido à presença de outros agentes vulgares nos 43 suínos, nos homogenados teciduais de suínos infectados, tem impedido uma caracterização definitiva da patologia clínica e das lesões patológicas atribuíveis exclusivamente à infecção com o PCV2. É esta a primeira vez em que se constrói um clone de ADN molecular infeccioso de PCV2 e que se utiliza para caracterizar a patologia e as lesões patológicas associadas a uma infecção com PCV2, por transfecção directa in vivo de suínos com o clone molecular.

Comprovou-se que o lote de vírus vivos PCV2 homogéneos, derivado do clone molecular, é infeccioso in vitro quando transfectados em células PK-15. 0 ADN genómico do PCV2 clonado também é infeccioso quando injectado directamente nos fígados e nos nodos linfáticos ilíacos superficiais de suínos isentos de patogénios específicos (SPF). Os animais injectados com ADN plasmídico de PCV2 clonado desenvolveram uma infecção e uma patologia semelhantes às induzidas por inoculação intranasal com um lote homogéneo de vírus vivos PCV2 infecciosos. Foi detectada a seroconversão em anticorpos específicos de PCV2 na maior parte dos suínos provenientes dos grupos inoculados decorridos 35 dias pós-inoculação (DPI). 0 começo e a duração da viremia nos suínos inoculados com o clone de ADN de PCVl-2 quimérico são semelhantes aos dos suínos inoculados com o clone de ADN de PCVl não patogénico, ao passo que a viremia nos suínos inoculados com o clone de PCV2 aparece mais cedo e tem uma duração superior. Começando ao 14° DPI e durando cerca de 2-4 semanas, detectou-se a viremia na maior parte dos animais inoculados com PCV2. De igual modo, na maior parte dos suínos inoculados e autopsiados ao 35° DPI houve seroconvesão em anticorpos de 44 PCV2. Detectou-se o antigénio PCV2 em diversos tecidos e órgãos de suínos inoculados. As lesões macroscópicas estão limitadas aos pulmões e nodos linfáticos e caracterizam-se por nodos linfáticos com um volume sistematicamente maior com uma cor acastanhada, pulmões que não chegaram a deformar-se e focos de consolidação multifocal ligeira de cor acastanhada. As lesões macroscópicas que afectam os nodos linfáticos nos dois grupos de suínos inoculados com PCVl não patogénico e com PCVl-2 quimérico são ligeiras e limitadas apenas a alguns animais, ao passo que todos os suínos inoculados com o PCV2 patogénico apresentaram inchaços entre moderados e graves e descoloração dos tecidos linfóides (quadro 9, infra) . A análise estatística revela que a classificação das lesões macroscópicas nos nodos linfáticos dos animais inoculados com PCVl-2 quimérico são semelhantes às observadas nos suínos inoculados com PCVl não patogénico. Ao 21° DPI, os suínos inoculados com PCV2 apresentavam lesões macroscópicas que são estatisticamente mais graves do que as dos suínos inoculados com PCVl e com PCVl-2 quimérico. Foram detectadas lesões histopatológicas e antigénios específicos do PCV2 em numerosos tecidos e órgãos, incluindo cérebro, pulmões, coração, rins, amígdalas, nodos linfáticos, baço, ílio e fígado dos suínos inoculados (infectados). As lesões histopatológicas em vários tecidos e órgãos, semelhantes às da PMWS, foram reproduzidas com o clone de ADN molecular do PCV2 e também com os vírus infecciosos preparados in vitro a partir do clone de ADN molecular. Em termos microscópicos, quer ao 21° DPI quer ao 49° DPI, os animais inoculados com PCVl-2 quimérico apresentavam, estatisticamente, menos lesões microscópicas do que os animais inoculados com o PCV2. As classificações das lesões microscópicas nos nodos linfáticos 45 dos suínos inoculados com o PCV1-2 quimérico são semelhantes às dos animais inoculados com o PCVl não patogénico, com o PCV2-1 quimérico e recíproco e às dos animais de contraprova não inoculados. Foram encontradas lesões microscópicas entre moderadas e graves em diversos tecidos de animais inoculados com o PCV2 patogénico, incluindo pulmões, fígado, tecidos linfóides, baço, cérebro, coração, rins e amígdalas. No entanto, nos animais inoculados com o PCVl-2 quimérico, as lesões microscópicas entre ligeiras e moderadas estavam limitadas apenas aos tecidos do figado, nodos linfáticos e rins (ver o quadro 1, infra) . Não há nenhuns sinais clínicos notáveis de PMWS nos suínos de contraprova ou em qualquer dos suínos inoculados. Embora os sintomas clínicos característicos da PMWS não sejam observados com o ADN plasmídico do PCV2 clonado (o clone de ADN de PCV2 infeccioso) ou com um lote de vírus PCV2 infecciosos biologicamente puros, o PCV2 é claramente responsável pelas lesões histopatológicas de tipo PMWS reproduzidas nos exemplos ilustrativos seguintes. De um modo geral, admite-se que o PCV2 é o agente patogénico primário, mas não exclusivo, responsável pelo início da PMWS clínica. A presente invenção permite uma caracterização mais definitiva da evolução clínica e das lesões patológicas atribuíveis exclusivamente à infecção com PCV2. Os dados apresentados nos exemplos ilustrativos subsequentes indicam que o ADN genómico do PCV2 clonado, facilmente reproduzido, está disponível para substituir o vírus infeccioso para estudos de imunização e patogénese do PCV2. Embora se demonstre que o PCV2 é essencial para o desenvolvimento da PMWS, há outros factores ou agentes, tais como PRRSV, PPV, 46 etc. que podem ser, eventualmente, necessários para induzir o espectro total de lesões e sinais clínicos associados a casos avançados de PMWS. No entanto, sabendo-se que o PCV2 é um factor essencial, é possível modificar ainda mais o novo clone virai replicativo e infeccioso ou manipulá-lo qeneticamente para se consequir o desejado efeito imunoqénico óptimo, por meio de processos conhecidos por um vulqar especialista em imunologia e genética molecular. A disponibilidade do clone de ADN infeccioso PCV2 aqui descrito permite desenvolver a vacina atenuada geneticamente manipulada para evitar uma infecção com PCV2 e a PMWS nos suínos. Sabe-se que o PCV2 se replica nos nodos linfáticos, nos pulmões e no fígado durante a infecção natural e um dos efeitos patogénicos importantes é a debilitação do sistema imunitário por degradação das estruturas linfóides (S. Krakowka et al., 2001, supra; G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; S. Kennedy et al., 2000, supra; G. J. Wellenberg et al., 2000, supra; G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); J. Ellis et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets," J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, supra). Utilizando este novo clone de ADN molecular do PCV2 infeccioso faz com que seja possível caracterizar mais definitivamente a patologia clínica, as lesões patológicas e a distribuição virai atribuíveis exclusivamente à infecção com o PCV2.

As relações estruturais e funcionais dos genes dos PCV são melhores compreendidas devido à disponibilidade dos clones de ADN infeccioso de PCV2, PCVl, PCVl-2 quimérico e 47 PCV2-1 quimérico reciproco, aqui descritos. Will et al., "Cloned HBV dna causes hepatitis in chimpanzees," Nature 299:740-742 (1982), demonstraram pela primeira vez a praticabilidade de se utilizar um ADN do virus clonado da hepatite B para infectar chimpanzés por injecção directa in vivo. Esta metodologia tem sido utilizada desde então para se estudar a replicação virai e a patogénese de diversos outros virus (T. W. Dubensky et al., "Direct transfection of virai and plasmid DNA into the liver or spleen of mice," Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:7529-7533 (1984); R Girones et al., "Complete nucleotide sequence of a molecular clone of woodchuck hepatitis virus that is infectious in the natural host," Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1846-1849 (1989); N. L. Letvin et al., "Risks of handling HIV," Nature 349:573 (1991); C. Seeger et al., "The cloned genome of ground squirrel hepatitis virus is infectious in the animal. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 81:5849-5852 (1984); E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); R Sprengel et al., "Homologous recombination between hepadnaviral genomes following in vivo DNA transfection: implications for studies of virai infectivity," Virology 159:454-456 (1987); H. Will et al., 1982, supra; L. Willems et al., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)). A construção de um clone de ADN molecular de PCV2 infeccioso e a demonstração de infecção por injecção directa do ADN molecular plasmidico do PCV2 clonado no figado e nos nodos linfáticos de suinos são vantajosas para estudos de PCV2. Este sistema de transfecção in vivo irá melhorar o 48 estudo da relação estrutural e funcional dos genes de PCV2, utilizando plasmideos recombinantes construídos in vitro para testar diferentes regiões ou genes de PCV2 para pesquisar as funções que desempenham na replicação e na patogénese virai no hospedeiro. A replicação e a patogénese do PCV2 podem ser estudadas in vivo sem que seja necessário produzir lotes de virus infecciosos, por propagação do PCV2 em culturas de células. Isto é vantajoso na medida em que as diversas passagens de culturas celulares sequenciais podem originar a selecção de variantes virais. Uma outra vantagem da utilização de ADN genómico de PCV2 clonado, em vez do virus vivo, para estudos em animais, é a facilidade relativa de quantificação da dose de inoculação. A quantidade de ADN de PCV2 clonado, utilizada para a inoculação de um animal, pode ser determinada facilmente por meio de um espectofotómetro, ao passo que a dose de virus PCV2 vivos implica a titulação da infecciosidade em culturas celulares e a confirmação de infecção por meio de um protocolo IFA. A injecção directa de animais com ADN plasmídico de PCV2 clonado elimina os problemas associados à presença de outros agentes, normalmente existentes nos suinos, que possam estar presentes nos inóculos de homogenados teciduais nos estudos com animais.

Na presente invenção o gene da cápside de 0RF2 imunogénico é trocado entre o PCV2 patogénico e o PCVl não patogénico para se produzir uma estrutura exclusiva do clone de ADN infeccioso de PCVl-2 quimérico. De uma forma surpreendente e vantajosa, o clone infeccioso de PCVl-2 quimérico replicou-se, expressou o antigénio da cápside de 0RF2 imunogénico in vitro e in vivo e induziu uma resposta de anticorpos específicos contra o 0RF2 do PCV2, mas conservou a natureza não patogénica do PCVl. 0 clone de ADN 49 infeccioso do PCVl-2 quimérico tem a aptidão para induzir uma forte resposta imunitária contra o PCV2, ao mesmo tempo que induz apenas uma infecção limitada com lesões patológicas ligeiras semelhantes às originadas pelo PCV1 não patogénico. Para o desenvolvimento de uma vacina, a facilidade relativa de armazenagem e a estabilidade do ADN clonado e a economia em termos de produção em grande escala de ADN plasmidico de PCV2 recombinante e do clone de ADN de PCVl-2 quimérico constituem um meio atractivo para administrar aos suínos uma vacina viva de ADN virai infeccioso ou vacinas virais atenuadas geneticamente manipuladas. Posto isto, o clone de ADN infeccioso de PCVl-2 quimérico, objecto da presente invenção, constitui uma vacina útil que pode ser utilizada contra uma infecção de PCV2 e contra a PMWS.

Faz-se observar que todos os termos científicos e tecnológicos aqui utilizados têm as mesmas significações vulgarmente utilizadas pelos especialistas na matéria. Para os objectivos da presente invenção, o termo "infeccioso" significa que o vírus se replica nos suínos, independentemente de o vírus causar ou não alguma doença. A abreviatura "SPF" diz respeito a suínos isentos de patogénicos específicos. 0 termo "suínos gnotobióticos" designa suínos isentos de microrganismos invulgares neles. Os termos "ADN plasmidico de PCV2", "ADN genómico de PCV2 " e "ADN molecular de PCV2 " são aqui utilizados indiferentemente para designar a mesma sequência nucleotídica clonada. 0 clone de ADN quimérico infeccioso de PCV1/PCV2 (estirpe designada por "quimera PCVl-2"), o clone de ADN molecular infeccioso de PCV2 (estirpe designada por "clone PCV2") e o lote de PCV2 biologicamente puro e homogéneo, 50 obtidos a partir de uma amostra de PCV2 recolhida no Iowa, a qual foi isolada a partir de um suino com PMWS grave e identificada como sendo o isolado n° 40895 (estirpe com a designação "PCV2 #40895") estão depositados, ao abrigo do estipulado no n° 37 C.F.R. § 1.808 e em conformidade com o tratado de Budapeste, na Colecção Americana de Culturas Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, E.U.A. As sequências de ADN aqui descritas estão contidas nos plasmídeos de 6490 pb clonados no vector pBluescript SK(+) ou (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) e são transformadas em células competentes DH5a de Escherichia coli. Os plasmídeos que contêm o clone de ADN de PCVl-2 (identificado pela designação de "clone de ADN infeccioso de circovírus porcino quimérico de tipo 1 (PCVl) e de tipo 2 (PCV2)") e o clone de ADN molecular de PCV2 infeccioso (identificado pela designação de "clone de ADN infeccioso de circovírus porcino de tipo 2 (PCV2)") foram depositados na ATCC a 7 de Dezembro de 2001, tendo-lhes sido atribuídos respectivamente as designações PTA-3912 e PTA-3913 de depósito de patentes na ATCC. Faz-se observar que é possível construir facilmente outros plasmídeos, recorrendo a técnicas de mutagenese dirigida ao local e a técnicas aqui descritas. A amostra de PCV2 biologicamente pura e homogénea do isolado número 40895 (identificado pela designação de "circovírus porcino de tipo 2 (PCV2)") também foi depositada na ATCC a 7 de Dezembro de 2 001 e foi-lhe atribuída a designação PTA-3914 de depósito de patentes na ATCC. A sequência genómica (nucleotídica) do isolado de PCV2 número 40895 foi depositada no banco de dados Genbank e está disponível ao público desde 23 de Julho de 2000 com o número AF264042 de registo. 51

Os exemplos seguintes demonstram determinados aspectos da presente invenção. No entanto, faz-se observar que estes exemplos têm apenas fins ilustrativos e não são integralmente definitivos nos termos e no âmbito da presente invenção. Faz-se observar que ao serem apresentadas condições de reacção típicas (v.g., temperatura, tempo de reacção, etc.), podem ser utilizados parâmetros acima e abaixo dos intervalos especificados, embora isso seja geralmente menos conveniente. Os exemplos são realizados à temperatura ambiente, entre cerca de 23°C e cerca de 28°C, e à pressão atmosférica. Todas as partes e percentagens aqui indicadas são calculadas relativamente ao peso e todas as temperaturas estão expressas em graus Celsius, salvo quando especificado de outro modo.

Os exemplos a seguir descritos, não limitativos, proporcionam uma melhor compreensão da presente invenção. EXEMPLO 1 (apenas com fins ilustrativos)

Geração de uma linhagem de células PK-15 sem contaminação com PCV1 A fonte do isolado de PCV2 foi uma amostra de tecido do baço de um suíno em que ocorreu naturalmente a PMWS (PCV2 com o número de série de identificação 40895, designado por "isolado 40895") (M. Fenaux et al., 2000, supra) . A coloração imunocitoquímica (IHC) com anticorpos específicos do PCV2 confirmou a presença do antigénio PCV2 no tecido. Os tecidos do baço foram guardados a -80°C até serem utilizados. 52 A linhagem de células PK-15, adquirida à Colecção Americana de Culturas Tipo (número CCL-33 de registo na ATCC), foi persistentemente infectada com PCVl (G. C. Dulac e A. Afshar, 1989, supra). Uma vez que apenas uma subpopulação de células PK-15 foi persistentemente infectada (id.), gerou-se uma linhagem de células PK-15 isenta de contaminação com PCVl por diluição de ponto critico. 0 protocolo executado foi o seguinte: manteve-se em desenvolvimento células PK-15 em MEM com sais de Earle e L-glutamina (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) enriquecido com 10% soro fetal de bovino (FBS) e antibiótico IX (Life Technologies, Inc.). Efectuou-se a tripsinização de monocamadas de células confluentes, realizou-se depois uma contagem das células e fez-se a sua diluição sequencial até um ponto critico com uma célula por cada 0,2 mL. A diluição de ponto critico foi aplicada em placas de 96 cavidades e permitiu-se o seu desenvolvimento de modo a obter-se uma monocamada, começando com uma única célula. As células de cada cavidade foram analisadas para se pesquisar o adn de PCVl, utilizando um ensaio de PCR-RFLP capaz de detectar e diferenciar o PCVl do PCV2 (M. Fenaux et al., 2000, supra). As células PK-15 das cavidades que proporcionaram um resultado negativo na análise de pesquisa do PCVl pelo ensaio de PCR-RFLP foram subsequentemente expandidas. Produziu-se uma subcultura da linhagem de células PK-15 isentas de PCVl, executando cinco passagens suplementares, tendo-se encontrado um resultado negativo na pesquisa de ADN do PCVl por PCR em cada passagem.

Foram produzidas quatro linhagens de células, que revelaram um resultado negativo de contaminação com PCVl, por diluição de ponto critico das células PK-15, 53 persistentemente infectadas, obtidas na ATCC. As linhagens de células continuaram a apresentar um resultado negativo em termos de PCV1 por PCR após mais cinco passagens. Uma das linhagens de células foi depois expandida e demonstrou-se que era capaz de suportar a replicação do PCV2, quando as células foram transfectadas com o clone de ADN molecular do PCV2 (Fig. 2) e infectadas com o vírus PCV2. As células clonadas foram ainda utilizadas para a transfecção in vitro do clone de ADN molecular do PCV2 para se gerar um lote de virus infeccioso PCV2 biologicamente puro, para experiências de inoculação em animais. EXEMPLO 2 (apenas com fins ilustrativos)

Construção do clone de ADN infeccioso do PCV2

Para se construir o clone de ADN molecular do PCV2 engendrou-se um par de iniciadores de PCR de acordo com a sequência publicada do isolado 40895 do PCV2 (M. Fenaux et al., 2000, supra): iniciador directo F-PCVSAC2 (5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3' ) , explicitado na SEQ ID NO:5, e iniciador inverso R-PCVSAC2 (5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3' ) , explicitado na SEQ ID NO:6. Este par de iniciadores amplifica o genoma completo do PCV2 com uma região de sobreposição que contém um local exclusivo da enzima de restrição SacII (Fig. 1) . Extraiu-se o ADN utilizando o estojo miniaturizado 'QIAamp DNA Minikit' (Qiagen, Inc., Valência, CA) a partir de uma amostra de tecido de baço de um suíno em que ocorre naturalmente a PMWS (isolado n° 40895) (M. Fenaux et al., 2000, supra) . O ADN extraído foi amplificado por PCR com a 54 polimerase 'AmpliTaq Gold' (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) . A reacção de PCR consistiu num passo inicial de activação da enzima a 95°C durante 9 minutos, seguindo-se 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 minuto, recombinação a 4 8°C durante 1 minuto, extensão a 72°C durante 3 minutos e uma extensão final a 72°C durante 7 minutos. Efectuou-se a separação do produto de PCR com o tamanho esperado, por electroforese em gel, e purificou-se pelo protocolo de purificação sobre sílica com um estojo 'Geneclean' (Bio 101, Inc., La Jolla, CA).

Para a construção do clone de ADN molecular que contém um dímero em tandem do genoma de PCV2, ligou-se primeiro o produto de PCR que contém o genoma do PCV2 completo ao vector plasmídico 'advanTAge' (Clontech, Paio Alto, CA). Foram transformadas células competentes DH5a de E. Coli. Efectuou-se a verificação dos plasmídeos recombinantes por digestão com enzimas de restrição. O ADN genómico de PCV2 de comprimento completo foi excisado a partir do vector 'advanTAge' por digestão com a enzima de restrição Sacll. O ADN genómico de PCV2 digerido foi ligado com ligase de ADN de T4 a 37°C durante 10 minutos apenas, o que favorece a produção de dímeros em tandem. Os dímeros em tandem foram depois clonados no vector pBluescript SK(+) (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) (Fig. 1). Os plasmídeos recombinantes, contendo os dímeros em tandem do genoma do PCV2 (aqui designado por clone de ADN molecular do PCV2), foram confirmados por PCR, por digestão com enzimas de restrição e por sequenciação do ADN. Determinou-se por espectrofotometria a concentração do ADN dos plasmídeos recombinantes.

Concretamente, amplificou-se o genoma completo do PCV2 (isolado 40895) por PCR para se construir o clone de ADN 55 molecular do PCV2 infeccioso. Foram ligadas em tandem duas cópias do genoma do PCV2 completo ao vector pSK para se produzir o clone de ADN molecular do PCV2 (Fig. 1). Determinou-se a infecciosidade do clone de ADN molecular do PCV2 por transfecção in vitro das células PK-15. O protocolo de IFA com anticorpos específicos do PCV2 confirmou que o clone de ADN molecular é infeccioso in vitro, tendo sido transfectadas cerca de 10-15% das células PK-15. Visualizou-se o antigénio específico de PCV2 pelo protocolo de IFA no núcleo e, em menor grau, no citoplasma das células transfectadas (Fig. 2) . As células pseudotransfectadas com o vector pSK vazio permaneceram negativas ao antigénio PCV2. EXEMPLO 3 (Apenas com fins ilustrativos)

Transfecção in vitro com o clone de ADN molecular do PCV2 e geração de um lote virai homogéneo e infeccioso de PCV2 biologicamente puro

Para se testar a infecciosidade do clone de ADN molecular in vitro, deixou-se desenvolver células PK-15, isentas de contaminação com PCV1, em lamelas de câmara 'LabTek' de 8 cavidades. Quando as células PK-15 atingiram uma confluência de cerca de 85%, efectuou-se a transfecção das células com o clone de ADN molecular, utilizando os reagentes 'Lipofectamine Plus' em conformidade com o protocolo fornecido pelo fabricante (Life Technologies, Inc). As células pseudotransfectadas com o vector pSK vazio foram incluídas como contraprovas. Decorridos três dias após a transfecção as células foram fixadas com uma solução que continha 80% de acetona e 20% de metanol a 4°C durante 20 minutos e executou-se um ensaio de 56 imunofluorescência, utilizando um anti- -soro policlonal de coelho específico do PCV2, para se determinar a infecciosidade in vitro do clone de ADN molecular (ver infra).

Para se gerar um lote virai homogéneo e infeccioso de PCV2 biologicamente puro para a experiência de inoculação de animais, fez-se uma cultura de células PK-15 isentas de contaminação com PCV1, em balões de cultura T-25, tendo sido depois transfectadas com o clone de ADN molecular do PCV2. As células PK-15 cresceram até cerca de 85% da confluência em balões T-25. Efectuou-se a lavagem das células uma vez com tampão PBS estéril, antes da transfecção. Para cada reacção de transfecção num balão T-25, misturou-se 12 pg do ADN plasmidico do PCV2 com 16 pL de reagente 'Plus' em 0,35 mL de meios mem. incluiu-se como contraprova negativa um balão de células pseudotransfectadas com o vector pSK vazio. Após incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos, acrescentou-se à mistura 50 pL de reagente 'Lipofectamine' diluído em 0,35 mL de meios MEM e manteve-se tudo a incubar à temperatura ambiente durante mais 15 minutos. A seguir acrescentou-se a mistura de transfecção a um balão T-25 com células PK-15 que continha 2,5 mL de meio MEM recente. Após a incubação a 37°C durante 3 horas, os meios foram substituídos por meios MEM recentes contendo 2 % de PBS e antibióticos IX. As células transfectadas foram colhidas ao 3o dia após a transfecção e foram guardadas a -80°C até virem a ser utilizadas. Determinou-se pelo protocolo IFA (ver infra) a titulação infecciosa do lote virai.

Basicamente, o lote virai infeccioso de PCV2, biologicamente puro e homogéneo, foi gerado por transfecção de células PK-15 com o clone de ADN molecular do PCV2. Os 57 viriões do PCV2 produzidos por transfecção in vitro eram infecciosos, uma vez que os lisados de células transfectadas foram utilizados com êxito para infectar células PK-15. Deste modo, o clone de ADN molecular do PCV2 é capaz de produzir viriões infecciosos de PCV2 quando transfectado in vitro. Determinou-se a titulação infecciosa do lote virai homogéneo de PCV2 a partir das células transfectadas, tendo-se obtido o valor de 1 x 104'5 CTDI50/mL. Utilizou-se o lote virai para inocular suínos do grupo 2. Os lisados das células pseudotransfectadas com o vector pSK vazio não conseguiram infectar as células PK-15. EXEMPLO 4 (apenas com fins ilustrativos)

Titulação virai pelo protocolo de ensaio de imunofluorescência (IFA)

Development of a polyclonal-

Para se determinar a titulação infecciosa do lote virai homogéneo de PCV2, produziu-se uma cultura de células PK-15 em lamelas de câmara 'LabTek' de 8 cavidades. 0 lote virai foi diluído sequencialmente 10 vezes em meio MEM e com cada diluição inoculou-se 10 cavidades das monocamadas de células PK-15 que estavam a desenvolver-se nas lamelas de câmara 'LabTek'. As cavidades que continham células não inoculadas foram incluídas como contraprovas. As células infectadas foram fixadas ao 3o dia pós-inoculação com uma solução que continha 80% de acetona e 20% de metanol a 4°C durante 20 minutos. Após a lavagem das células com tampão PBS, manteve-se as células infectadas a incubar com o anticorpo policlonal específico do PCV2 na diluição de 1:1 000 (S. D. Sorden et al.r 58 antibodybased immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue," J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999)) a 37°C durante 1 hora. As células foram depois lavadas 3 vezes com tampão PBS e ficaram a incubar com anti-IgG secundária de coelho conjugada na cabra e marcada com FITC (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) a 37°C durante 45 minutos. Após a lavagem das lamelas 3 vezes com tampão PBS, as referidas lamelas foram tratadas com o composto 'Fluoromount-G', tapadas com lamelas de cobertura e examinadas ao microscópio de fluorescência. Calculou-se a dose de cultura de tecidos infecciosa a 50%, por cada mL (CTDI50/mL). Inicialmente, as células foram transfectadas com uma construção plasmídica que continha uma única cópia do genoma de PCV2, mas a titulação de PCV2 infeccioso a partir da construção única do genoma é muito menor do que aquela que contém o genoma em tandem. Assim sendo, a construção plasmídica que contém a forma dimérica do genoma do PCV2 foi utilizada para as experiências de transfecção in vitro e in vivo. EXEMPLO 5 (apenas com fins ilustrativos)

Transfecção in vivo de suínos com o clone de ADN molecular do PCV2 e inoculação experimental de suínos com o lote virai homogéneo de PCV2 infeccioso

Colocou-se quarenta suínos isentos de patogéneos específicos (SPF), com idades de 4 semanas, aleatoriamente em 4 compartimentos de 10 animais cada um. Antes da inoculação, os suínos SPF foram pesquisados para análise de 59 anticorpos contra os vírus PCV, PRRSV, PPV e da hepatite E dos suínos. Os suínos do grupo 1 eram não inoculados e serviram como contraprovas negativas. Os suínos do grupo 2 foram inoculados intranasalmente com cerca de 1,9 x 105 CTDI5o do lote virai infeccioso do PCV2 obtido a partir do clone de ADN molecular do PCV2. Os suínos do grupo 3 receberam uma injecção directa intra-hepática de ADN plasmídico recombinante do clone molecular de PCV2. Cada suíno foi injectado comum total de 200 pg de ADN plasmídico recombinante (o ADN plasmídico do PCV2 clonado), por meio de uma técnica comandada por ultra-sons, em 6 locais diferentes do fígado. Cada um dos suínos do grupo 4 foi injectado com um total de 200 pg de ADN plasmídico do PCV2 recombinante nos nodos linfáticos ilíacos superficiais e cada nodo linfático recebeu duas injecções separadas. Os animais foram monitorizados diariamente para pesquisa de sinais clínicos de patologia. Foram recolhidas amostras de soro de cada animal nos dias pós-inoculação (DPI) 0, 7, 14, 21, 28 e 35. Ao 21° DPI, os suínos foram seleccionados aleatoriamente em cada grupo e foram sacrificados para autópsia. Os cinco animais restantes de cada grupo foram sacrificados para autópsia ao 35° DPI. Durante a autópsia foram recolhidos diversos tecidos e órgãos que foram preparados para exame histológico e para coloração imunocitoquímica (ver infra) .

Os resultados estão apresentados no quadro 1 subsequente. Todos os suínos inoculados dos grupos 2, 3 e 4 revelaram ser negativos aos anticorpos de PCV2 no DPI 0. Dois suínos do grupo de contraprova, não inoculados, revelaram um anticorpo materno detectável contra o PCV2 no DPI 0. O anticorpo maternal nestes dois leitões enfraqueceu 60 ao 1° DPI. Não foi detectada nenhuma seroconversão em anticorpos de PCV2 em nenhum dos 10 suínos de contraprova inoculados. No grupo 2 de suínos inoculados intranasalmente com vírus infecciosos PCV2, 1 leitão fez a seroconversão em anticorpos de PCV2 ao 21° DPI. Por volta do 35° DPI, tinha havido seroconversão em 4 dos 5 suínos restantes do grupo 2. A seroconversão em animais transfectados dos grupos 3 e 4 apareceu primeiro ao 28° DPI. Por volta do 35° DPI, em 5 dos 5 suínos restantes do grupo 3 e em 3 dos 5 suínos restantes do grupo 4 tinha ocorrido a seroconversão em anticorpos contra o PCV2.

Efectuou-se a análise de anticorpos contra PPV ao 3o e 21° DPI em todos os suínos e ao 35° DPI nos suínos restantes. Os anticorpos maternais contra o agente PPV ubíquo nos suínos foi detectado nos leitões SPF. O anticorpo PPV Hl concentrou-se em todos os leitões, mas diminuiu significativamente num deles desde o 3o DPI (uma concentração média de 1:2 665) até ao 21° DPI (uma concentração média igual a 1:246), indicando isso que o anticorpo detectado nestes leitões foi obtido passivamente. Num leitão observou-se um aumento ligeiro da concentração de PPV Hl, desde 1:32 ao 3o DPI até 1:64 ao 21° DPI, o que é devido, provavelmente, a variações do método de análise. As amostras de soro retiradas de todos os suínos nos DPI 0, 21 e 35 foram ainda submetidas a testes de análise para pesquisa do ADN de PPV, com um protocolo de ensaio de PCR conhecido (J. M. Soucie et al., "Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate: C porcine factor VIII concentrate," Transfusion 40:708-711 (2000)) . Não foi detectada nenhuma viremia de PPV em nenhum 61 dos suínos em nenhum dos DPI, indicando isso que os suínos não foram infectados pelos PPV.

Quadro 1. Seroconversão em anticorpos específicos do PCV2 em suínos inoculados com vírus vivos PCV2 ou injectados directamente com ADN plasmídico de PCV2 clonado

Via de Dias pós-inoculação

Grupo Inóculos inoculação 0 7 14 21 28 35 1 Nenhum 2/10a 0/10 0/10 0/10 0/5 0/5 2 Vírus PCV2 intranasal 0/10 0/10 0/10 1/10 1/5 4/5 vivob 3 ADN de intra- 0/10 0/10 0/10 0/10 1/5 5/5 PCV2c hepático 4 ADN de intralinfóide 0/10 0/10 0/10 0/10 1/5 3/5 PCV2c a Mediu-se a concentração do anticorpo PCV2 por meio de um protocolo ELISA; número de positivos/número de analisados. b Lote virai de PCV2 biologicamente puro e homogéneo gerado por transfecção de células PK-15 com o clone de ADN molecular de PCV2. c ADN genómico de PCV2 clonado no plasmídeo pSK.

EXEMPLO 6 (apenas com fins ilustrativos) Análises de PCR-RFLP

Para se medir a viremia de PCV2 em suínos transfectados com o clone de ADN molecular de PCV2 e em suínos infectados com o lote virai de PCV2 infeccioso foram testadas amostras de soro, recolhidas em diferentes DPI para se pesquisar a presença de ADN dos PCV2 pelos processos gerais de um ensaio de PCR-RFLP já anteriormente descrito (M. Fenaux et al., 2000, supra) . Extraiu-se o ADN virai a partir de 50 pL de 62 cada amostra de soro, utilizando para tal o reagente 'DNAzol®', em conformidade com o protocolo fornecido pelo fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) . Com o ADN extraido preparou-se nova suspensão em água isenta de DNase, Rnase e proteinase e analisou-se para se pesquisar o ADN de PCV2 pelo protocolo de PCR-RFLP (id.). Os produtos de PCR provenientes de animais seleccionados foram sequenciados para se verificar a origem do vírus que infecta os suínos.

Foram recolhidas amostras de soro de todos os animais de contraprova e inoculados nos DPI 0, 7, 14, 21, 28 e 35 e foram analisadas para pesquisa da viremia de PCV2 por detecção de ADN do PCV2 (id.). Os resultados estão indicados no quadro 2, infra. Não foi detectado ADN de PCV2 no grupo 1 de suínos de contraprova não inoculados, em nenhum dos dpi. Foi detectada viremia em 7/10 suínos do grupo 2 ao 14° DPI e em 8/10 leitões por volta do 35° DPI. A viremia durou apenas algumas semanas, uma vez que não houve ADN de PCV2 detectável ao 28° DPI e 35° DPI em todos os 5 suínos restantes do grupo 2. Nos suínos do grupo 3 que foram injectados infra-hepaticamente com o clone de ADN molecular do PCV2, 8/10 suínos revelaram ser virémicos ao 14° DPI e 9/10 suínos tinham viremia detectável por volta do 35° DPI. O grupo 4 de suínos foi injectado com o clone de ADN molecular do PCV2 nos nodos linfáticos. Verificou-se que 2 de 10 suínos se apresentavam virémicos ao 14° DPI e 8 de 10 suínos ao 21° DPI, pertencentes ao grupo 4. Os resultados mostram que o clone de ADN molecular de PCV2 é infeccioso quando injectado directamente no fígado e nos nodos linfáticos ilíacos superficiais de suínos SPF. Efectuou-se a sequenciação dos produtos de PCR amplificados, a partir de animais seleccionados. A sequência dos produtos 63 de PCR amplificados, a partir de animais seleccionados, foi idêntica à região correspondente ao clone de adn molecular do PCV2.

Quadro 2. Detecção de viremia (ADN de PCV2) por PCR em soros de suínos inoculados e de contraprova

Via de Dias pós-inoculaçao

Grupo Inóculos inoculação 0 7 14 21 28 35 Total 1 Nenhum 0/10a 0/10 0/10 0/10 0/5 0/5 0/10 2 Vírus PCV2 vivob intranasal 0/10 0/10 7/10 5/10 0/5 0/5 8/10 3 ADN de PCV2c intra- hepático 0/10 0/10 8/10 6/10 3/5 3/5 9/10 4 ADN de intralinfóide 0/10 0/10 2/10 8/10 2/5 0/5 8/10 PCV2c a 10 suínos em cada grupo; número de positivos/número de analisados. b Lote virai de PCV2 biologicamente puro e homogéneo gerado por transfecção de células PK-15 com o clone de ADN molecular de PCV2. c ADN genómico de PCV2 clonado no plasmídeo pSK. EXEMPLO 7 (apenas com fins ilustrativos) Avaliação clínica

Os suínos foram pesados no DPI 0 e no momento da necropsia. Efectuou-se o registo das temperaturas rectais e da patologia clínica respiratória, variando entre 0 e 6 (0 = normal, 6 = grave) (P. G. Halbur et al., "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus," Vet. Pathol. 32:648-660 (1995)), dia sim 64 dia não, desde o DPI 0 até ao 35°. Também se efectuou o registo diário de observações clinicas, incluindo provas de patologia do sistema nervoso central, patologia hepática (icterícia) , patologia musculoesquelética e alterações do estado corporal.

Para se fazer uma avaliação da patologia macroscópica e da histopatologia foram seleccionados aleatoriamente 5 suínos de cada grupo para realização de necropsias ao 21° e ao 35° DPI. A equipa técnica que efectuou a necropsia ignorava, em teste cego, o estado de infecção dos suinos no momento da necropsia. Foram efectuadas necropsias completas a todos os suínos. Registou-se para cada suíno uma percentagem estimada do pulmão com pneumonia visível macroscopicamente, com base num sistema de classificação já anteriormente descrito (id.). 0 sistema de classificação baseia-se no volume aproximado com que cada lobo pulmonar contribui para o volume total do pulmão: o lobo cranial direito, o lobo médio direito, a parte cranial do lobo cranial esquerdo e a parte caudal do lobo cranial esquerdo contribuem individualmente com 10% do volume total do pulmão, o lobo acessório contribui com 5% e cada um dos lobos caudal direito e esquerdo contribui com 27,5%. Outras lesões, tais como a dilatação dos nodos linfáticos, foram registadas separadamente. Foram feitas secções para exame histopatológico a partir do turbinado nasal, pulmões (sete secções (id.), coração, cérebro, nodos linfáticos (traqueobronquial, ilíaco, mesentérico e subinguinal), amígdalas, timo, fígado, vesícula biliar, baço, articulações, intestino delgado, cólon, pâncreas e rins. Os tecidos foram examinados segundo um protocolo de teste cego que permitiu obter uma classificação subjectiva da gravidade das lesões do pulmão, dos nodos linfáticos e do fígado. A classificação das 65 lesões pulmonares variou entre 0 (normal) e 3 (pneumonia intersticial linfoistiocitica grave). A classificação das lesões hepáticas variou entre 0 (normal) e 3 (hepatite linfoistiocitica grave). As classificações das lesões dos nodos linfáticos consistiram numa quantidade estimada de depleção linfóide de folículos, variando entre 0 (normal ou nenhuma depleção linfóide) e 3 (depleção linfóide grave e substituição histiocitica de folículos). 0 protocolo serológico consistiu em fazer a colheita de sangue à chegada dos leitões com 11 a 12 dias de idade e em todos os suínos nos DPI 0, 7, 14, 21, 28 e 35. Foram analisados os anticorpos séricos contra o PRRSV utilizando o protocolo ELISA 'Herd Check PRRSV' (Laboratórios IDEXX, Westbrook, MA). Foram detectados anticorpos séricos contra o PPV por meio de um ensaio de inibição da hemaglutinação (Hl) (H. S. Joo et al., "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)). Foram detectados anticorpos séricos contra o PCV2 por meio de um protocolo ELISA indirecto modificado, com base na proteína ORF2 recombinante do PCV2 (P. Nawagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)). Preparou-se um antigénio de PCV2, parcialmente purificado, a partir de células Hi Five (Invitrogen, Carlsbad, CA) infectadas com baculovírus recombinante que continha a proteína ORF2 da cápside principal do PCV2 (P. Nawagitgul et al., "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)). Foram 66 preparados semelhantemente lisados celulares de células Hi Five infectadas com baculovírus de tipo característico natural, que serviram como antigénio de contraprova negativo. Efectuou-se o revestimento de placas de microtitulação, feitas de polistireno 'Immulon 2 HB' (Dynex Technologies Inc, Chantilly, VA), com concentrações óptimas de antigénios positivos e negativos a 4°C durante 36 horas. Acrescentou-se a cada cavidade 100 pL de cada amostra de soro diluida à razão de 1:100 em diluente de leite a 5% (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). As amostras de soro foram analisadas em quadruplicado: 2 cavidades para o antigénio de contraprova negativa e 2 cavidades paralelas para o antigénio PCV2. Em cada placa foram incluídos os soros de contraprova positiva e de contraprova negativa. Os soros foram inoculados a 37°C durante 30 minutos e depois foram lavados 5 vezes com tampão PBS 0,1 M contendo 0,1% de Tween-20. Manteve-se a incubar anti-IgG secundária de suíno marcada com peroxidase (Sigma Co, St. Louis, MO) a 37°C durante 30 minutos. Efectuou-se novamente a lavagem das placas e manteve-se tudo a incubar com 2,2'-azino-di-(3-etil-benzotiazolina-6-sulfonato) (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc) a 37°C durante 15 minutos para revelação de cor. Efectuou-se a leitura da densidade óptica (DO) a 405 nm. Calculou-se o valor corrigido de DO de cada soro, analisado e de contraprova, por subtracção do valor médio de DO das cavidades que continham o antigénio negativo ao valor lido nas cavidades paralelas que continha o antigénio PCV2. Efectuou-se a normalização dos dados dividindo o valor de DO corrigido de uma amostra de soro analisada (S) pelo valor lido para o soro de contraprova positiva (P), tendo sido agrupados em termos de quocientes S/P. As amostras com 67 índices S/P < 0,12, 0,12 a 0,2 e > 0,2 foram consideradas, respectivamente, negativas, equivocas e positivas. A partir dos resultados da avaliação clínica, nenhum dos suínos de contraprova e inoculados apresentou sinais óbvios de patologia semelhantes aos da PMWS clínica. Não foram observadas nenhumas diferenças de ganhos de peso ou de temperaturas rectais médias entre a totalidade dos quatro grupos. Os suínos de contraprova do grupo 1 mantiveram-se normais ao longo de toda a experiência. Observou-se uma patologia respiratória transitória ligeira na maior parte dos suínos dos grupos transfectados com ADN de PCV2 e infectados com o vírus PCV2, entre o 8o e o 14° DPI. Esta patologia caracterizou-se por uma dispneia ligeira (classificação respiratória clinica entre 1 e 2) com uma duração de 1 a 2 dias em alguns suínos particulares e de 5-6 dias para o grupo.

Na autópsia não foram observadas lesões macroscópicas nos suínos de contraprova. Nos três grupos inoculados os suínos apresentaram lesões macroscópicas limitadas aos pulmões e aos nodos linfáticos (ver o quadro 3, infra) . As lesões foram semelhantes em todos os suínos dos grupos transfectados com ADN plasmídico de PCV2 e nos grupos infectados com vírus PCV2. Os pulmões não chegaram a deformar-se e apresentaram áreas moderadamente bem demarcadas, aleatórias e multifocais de consolidação, entre castanho e púrpura, abrangendo 0-2% do pulmão (Fig. 3) ao 21° DPI e entre 0-13% no pulmão ao 35° DPI. Os nodos linfáticos aumentaram de volume sistemicamente 2 a 5 vezes relativamente ao tamanho normal, tendo sido observada rigidez e uma cor acastanhada (Fig. 3) tanto ao 21° como ao 68 35° DPI na maior parte dos suínos dos três grupos inoculados com PCV2. 0 exame microscópico revelou a inexistência de lesões em todos os tecidos dos suínos de contraprova, com excepção dos fígados. Observou-se uma inflamação linfoplasmacítica multifocal muito ligeira em 8 dos 10 suínos de contraprova, predominantemente nas regiões periportais do fígado, conforme se observa vulgarmente em suínos normais, o que é considerado uma formação espontânea normal (P. G. Halbur et al., 2001, supra) .

Os suínos dos dois grupos transfectados com ADN plasmídico de PCV2 (pelas vias intra-hepática e intralinfóide) e do grupo infectado com o vírus (por via intranasal) revelaram lesões semelhantes no cérebro, pulmões, coração, rins, tecidos linfóides (amígdalas, nodos linfáticos e baço), ílio e fígado (ver o quadro 4, infra). Foram observadas lesões no cérebro em 23/30 suínos dos três grupos inoculados, tendo sido caracterizadas como meningoencefalite linfoplasmacítica multifocal entre ligeira e moderada com acumulação linfocítica perivascular e gliose. Foram observadas lesões pulmonares em 28/30 suínos inoculados com PCV2, tendo sido caracterizadas como pneumonia broncointestinal histiocítica e linfoplasmacítica peribronquiolar entre ligeira e moderada (Fig. 3C) . Um suíno do grupo 2 infectado com o vírus PCV2, autopsiado ao 21° DPI, e um suíno de cada um dos dois grupos transfectados com ADN plasmídico de PCV2, autopsiados ao 35° DPI, revelaram bronquiolite ulcerativa e proliferativa com fibroplasia e inflamação granulomatosa na lâmina própria e nas regiões peribronquiolares dos brônquios. Também foi observada miocardite linfoplasmacítica 69 multifocal ligeira em 18/30 suínos inoculados com PCV2. Em 14/30 suínos inoculados com PCV2 observou-se nefrite intersticial linfoplasmacítica multifocal entre ligeira e moderada. Não foram observadas nenhumas lesões nos timos. Observou-se depleção linfóide (Fig. 4B) e substituição histiocítica de folículos nas amígdalas de 8/30, no baço de 7/30 e nos nodos linfáticos de 26/30 suínos inoculados com PCV2. Observou-se linfadenite granulomatosa moderada com células gigantes (Fig. 4C) ao 21° DPI em três suínos inoculados intranasalmente com vírus PCV2 e num suíno ao 35° DPI em cada um dos grupos transfectados com ADN plasmídico de PCV2. Observou-se enterocolite linfoplasmacítica e histiocítica ligeira em 3/5 suínos no grupo infectado com vírus PCV2, em 3/5 suínos do grupo transfectado intra-hepaticamente com ADN plasmídico de PCV2 e em 1/5 suínos no grupo transfectado intralinfoidemente com ADN plasmídico de PCV2 ao 35° DPI. Um suíno em cada um dos grupos transfectados com ADN plasmídico de PCV2 revelou depleção linfóide ligeira com substituição histiocítica e números diminutos de células gigantes nas superfícies de Peyer. Observou-se hepatite linfoplasmacítica entre ligeira e moderada em 29/30 dos suínos dos três grupos inoculados com PCV2. Foram observados números diminutos de hepatócitos necróticos individualizados e profusamente dispersos, rodeados por inflamação linfoistiocítica em um suíno de cada um dos grupos transfectados com ADN plasmídico de PCV2 ao 21° DPI. As lesões noutros tecidos foram irrelevantes.

As lesões microscópicas nos pulmões, fígados e nodos linfáticos foram classificadas em conformidade com sistemas de classificação consagrados (quadro 4, infra) (P. G. Halbur et al., 2001, supra; P. G. Halbur et al., 1995, 70 supra). Não há sistemas de classificação aceitáveis para outros tecidos e órgãos. Os valores médios de classificação das lesões nos pulmões e nos nodos linfáticos em suinos dos três grupos inoculados com PCV2 foram estatisticamente diferentes dos valores observados com suinos de contraprova do grupo 1. Os valores médios da classificação das lesões hepáticas em suínos dos três grupos inoculados com PCV2 não são estatisticamente diferentes dos valores observados com os suínos de contraprova.

Quadro 3. Lesões macroscópicas dos pulmões e dos nodos linfáticos de suínos de contraprova e de suínos inoculados com PCV2 Grupo Inóculos Via de inoculação 21° 1 DPI 35° DPI Nodos linfáticos Pulmão Nodos linfáticos Pulmão 1 Nenhum 0 /5a 0/5 0/5 0/5 2 Vírus Intranasal 5/5 1/5(0-1)° 5/5 4/5 (0-5) PCV2 vivob 3 ADN de intra- 2/5 2/5(0-2) 5/5 2/5 (0-13) PCV2d hepática 4 ADN de intralin- 4/5 5/5 (0-1) 3/5 1/5 (0-9) PCV2d f óide a Foram autopsiados cinco suinos de cada grupo ao 21° DPI e os restantes 5 suínos foram autopsiados ao 35° DPI; número de positivos / número de analisados gerou-se um lote de vírus PCV2 biologicamente puro e homogéneo, por transfecção de células PK-15 com o clone de ADN molecular de PCV2.

c Número com lesões / número de analisados (intervalo de variação da percentagem estimada de pulmões afectados por lesões pneumónicas visíveis mascroscopicamente, 0-100%). d ADN genómico de PCV2 clonado no plasmídeo pSK 71

Quadro 4. Distribuição de lesões histopatológicas em suínos de contraprova e em suínos inoculados com PCV2

Grupo Inóculos Via de inoculaçã' 10 H (i Q £ 0 »td g rH 2 Oa 0 V Π3 Ή &-i V 2 id Baço Timo í lio Cérebro Coração Rim Amígdala 1 Ne- 21 0/5(0,0) 4/5(0,8) 0/5(0,0) 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 nhum 35 0/5(0,0) 4/5(0,8) 0/5(0,0) 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2 Víru intra 21 5/5(1,6) 5/5(1,2) 3/5(1,2) 1/5 0/5 0/5 4/5 3/5 1/5 0/5 s nasal 35 3/5(0,6) 4/5(1,0) 4/5(0,8) 3/5 0/5 3/5 4/5 0/5 1/5 3/5 PCV2 3 ÃDN intra- 21 5/5(1,0) 5/5(1,0) 5/5(1,0) 1/5 0/5 0/5 5/5 4/5 1/5 0/5 de hepá- 35 5/5(1,2) 5/5(1,0) 4/5(1,0) 2/5 0/5 3/5 3/2 4/5 5/5 3/5 PCV2 tica 4 ADN intra- 21 5/5(1,2) 5/5(1,0) 5/5(0,8) 0/5 0/5 0/5 4/5 4/5 3/5 0/5 de lin- 35 5/5(1,0) 5/5(1,2) 5/5(1,4) 0/5 0/5 1/5 3/5 3/5 3/5 2/5 PCV2 fóide

Dias pós-inoculação (DPI): foram autopsiados 5 animais de cada grupo ao 21° DPI e os restantes 5 animais de cada grupo foram autopsiados ao 35° DPI. b Número de positivos / número de analisados (valor médio da classificação histológica pulmonar: 0 = normal, 1 = pneumonia intersticial ligeira, 2 = moderada, 3 = grave). c Número de positivos / número de analisados (valor médio da classificação histológica hepática: 0 = normal, 1 = hepatite ligeira, 2 = moderada, 3 = grave). d Número de positivos / número de analisados (valor médio da classificação da depleção histológica linfóide (LN): 0 normal, 1 = ligeira, 2 = moderada, 3 = grave). EXEMPLO 8 (apenas com fins ilustrativos)

Imunocitoquímica (IHC) do recolhidos

Efectuou-se a detecção imunocitoquímica antigénio específico de PCV2 em todos os tecidos durante as autopsias aos 21° e 35° DPI. Utilizou-se um 72 anti-soro policlonal de coelho específico do PCV2 para a IHC, tendo sido praticados os processos já anteriormente descritos (S. D. Sorden et ai., 1999, supra).

Para a detecção e distribuição tecidual do antigénio PCV2, efectuou-se a coloração IHC do antigénio PCV2 no cérebro, pulmões, turbinado, coração, rins, amígdalas, nodos linfáticos, baço, timo, ílio, fígado, vesícula biliar e pâncreas de todos os suínos autopsiados ao 21° e ao 35° DPI. Todos os tecidos dos suínos de contraprova revelaram ser negativos em termos de antigénio PCV2. A distribuição tecidual do antigénio PCV2 nos três grupos inoculados com PCV2 foi semelhante (ver o quadro 5, infra) . No cérebro, o antigénio PCV2 foi encontrado, predominantemente, em células mononucleares, células fibroblastóides e células endoteliais nas meninges e no plexo coróide e, menos frequentemente, em células endoteliais e células mononucleares perivasculares no cérebro e no cerebelo. Nos pulmões, o antigénio PCV2 foi detectado dentro de macrófagos alveolares e septais e em células fibroblastóides na lâmina própria das vias aéreas (Fig. 3D) . No coração, o antigénio PCV2 foi detectado em macrófagos profusamente dispersos e em células endoteliais. Nos rins, o antigénio PCV2 foi detectado dentro de células epiteliais tubulares e em células mononucleares no interstício. Nos tecidos linfóides (nodos linfáticos, baço, amígdalas e superfícies de Peyer), o antigénio PCV2 foi detectado, essencialmente, no interior de macrófagos e em células de tipo dendrítico e em células gigantes no interior de folículos (Fig. 4D). 0 antigénio PCV2 também foi detectado no interior de macrófagos na lâmina própria do intestino delgado. No fígado, o antigénio PCV2 foi detectado no interior de células mononucleares e nas células de Kupffer. 0 73 antigénio PCV2 não foi detectado nem no turbinado, nem no timo nem na vesícula biliar.

Quadro 5. Detecção e distribuição do antigénio específico de PCV2 por imunocitoquímica em suínos de contraprova e em suínos inoculados com PCV2

Grupo Inóculos Via de inoculação Λ3 M d Ω n 0 «d £ 1—1 3 d 0 T5 (d Ή Pm Ό 2 d Baço Timo í lio Cérebro Coração Rim Amígdala 1 Nenhum 21 0/5" 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 35 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2 Vírus intranasal 21 4/5 5/5 5/5 3/5 0/5 3/5 3/5 1/5 1/5 2/5 PCV2 35 1/5 2/5 3/5 2/5 0/5 0/5 2/2 0/5 0/5 0/5 3 ADN de intra- 21 5/5 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 5/5 1/5 0/5 2/5 PCV2 hepática 35 4/5 4/5 3/5 4/5 0/5 3/5 4/5 2/5 2/5 3/5 4 ADN de intra- 21 4/5 4/5 5/5 4/5 0/5 3/5 3/5 0/5 0/5 3/5 PCV2 linfóide 35 3/5 4/5 5/5 4/5 0/5 2/5 3/5 1/5 0/5 4/5 a Dias pós-inoculação (DPI): foram autopsiados 5 animais de cada grupo ao 21° DPI e os restantes 5 animais de cada grupo foram autopsiados ao 35° DPI. Número de positivos / número de analisados EXEMPLO 9 (apenas com fins ilustrativos)

Construção do clone de ADN infeccioso de PCVl não patogénico 0 processo utilizado para a construção de um clone de ADN infeccioso de PCVl é essencialmente idêntico ao aqui descrito para o PCV2. Concebeu-se um par de iniciadores de PCR, kpnpcvI.u, correspondente à SEQ ID NO:7, e kpnpcvI.L, correspondente à SEQ ID NO:8 (ver o quadro 6, infra), com base na sequência publicada do PCVl. Este par de iniciadores amplifica o genoma completo do PCVl com uma região de sobreposição que contém o local exclusivo da enzima de 74 restrição ΚρηΙ. Extraiu-se o ADN do vírus PCVl a partir da linhagem de células contaminadas ATCC pk-15, provenientes da Colecção Americana de Culturas Tipo (número de registo CCL-33 na ATCC) . Extraiu-se o ADN de PCVl a partir das células ATCC PK-15 persistentemente infectadas com PCVl, utilizando o miniestojo 'QlAmp DNA' (Qiagen, Inc., Valência, CA.)· 0 ADN extraído foi amplificado por PCR com polimerase 'AmpliTaq Gold' (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). 0 procedimento de PCR consistiu num passo inicial a 95°C durante 10 minutos a que se seguiram 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 minuto, recombinação a 48°C durante 1 minuto, extensão a 72°C durante 2 minutos e mais uma extensão final a 72°C durante 7 minutos. 0 produto de PCR com o tamanho esperado foi separado por electroforese em gel e purificado pelo processo da sílica, tendo sido utilizado para tal o estojo 'Geneclean' (Bio 101, Inc., La Jolla, CA). O produto de PCR purificado que continha o genoma completo do PCVl, foi ligado primeiramente ao vector plasmídico 'advanTAge' (Clontech, Paio Alto, CA). Para a transformação foram utilizadas as células competentes DH5a de Escherichia coli. Fez-se a verificação dos plasmídeos recombinantes por digestão com enzimas de restrição. O ADN genómico de comprimento completo do PCVl foi excisado a partir do vector 'advanTAge' por digestão com a enzima de restrição Kpnl. Ligou-se o ADN genómico de comprimento completo de PCVl ao vector pBluescript SK(+) (pSK) (Stratagene, La Jolla, CA) com ligase de ADN de T4 a 37°C, de um dia para o outro. Os plasmídeos recombinantes, que continham o genoma de comprimento completo do PCVl, foram isolados com o miniestojo 'Qiagen' para plasmídeos (Qiagen, Valência, CA) e foram verificados por digestão com enzimas de restrição e por sequenciação do ADN. Excisou-se o ADN genómico de comprimento 75 completo do PCV1 a partir do vector pSK por digestão com Kpríl e dimerizou-se para se obter o clone de adn infeccioso de PCVl, conforme descrito anteriormente no Exemplo 2 a propósito do clone infeccioso de PCV2. Estes dímeros em tandem foram preparados porque se concluiu que os clones de ADN dimerizados em tandem são vantajosamente mais eficientes para transfectar células e para produzir viriões infecciosos. Para se obter o dimero de ADN em tandem de PCV1 ligou-se o ADN genómico do PCV1 com ligase de ADN de T4 a 37°C durante apenas 10 minutos, o que favorece a produção de dímeros em tandem. Os dímeros em tandem foram depois clonados no vector pBluescript SK(+) (pSK) (Stratagene, La Jolla, CA) . Os plasmídeos recombinantes que contêm os dímeros em tandem do genoma do PCVl (aqui designado por "clone de ADN do PCVl ") foram confirmados por PCR, digestão com enzimas de restrição e sequenciação do adn. Determinou-se por via espectrofotométrica a concentração do ADN dos plasmídeos recombinantes.

Quadro 6. Iniciadores oligonucleotídicos utilizados na presente invenção

Iniciador Direcção Sequência do Iniciador Aplicação Iniciadores da construção: KPNPCV1.U. >a 5'-TTTGGTACCCGAAGGCCGATT-'3 construção do (corresponde à SEQ ID NO:7) clone de ADN de PCVl KPNPCV1.L. < 5'-ATTGGTACCTCCGTGGATTGTTCT-' 3 construção do (corresponde à SEQ ID NO:8) clone de ADN de PCVl Hpa 1-2 < 5' - construção do GAAGTTAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCATTACG-' 3 clone de ADN (corresponde à SEQ ID NO:9) de PCV1-2 Nar 1-3 > 5' -GGTGGCGCCTCCTTGGATACGTCATCCTATAAAAGTG- construção do '3 (corresponde à SEQ ID NO:10) clone de ADN de PCV1-2 76

Iniciador Direcção Sequência do Iniciador Aplicação Psi 1-5 > 5'-AGGTTATAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-'3 (corresponde à SEQ ID NO:11) construção do clone de ADN de PCV1-2 Acl 1-6 < 5'-GGAAACGIIACCGCAGAAGAAGACACC-' 3 (corresponde à SEQ ID NO:12) construção do clone de ADN de PCV1-2 Bgl-II-ORF2 > 5' - ACTATAGATCT1TAT1CAT1TAGAGGGTCT11CAG-'3 (corresponde à SEQ ID NO:13) construção do clone de ADN de PCV2-1 SpH-I-ORF2 < 5'-TACGGGCAIGCAIGACGIGGCCAAGGAGG-'3 (corresponde à SEQ ID NO:14) construção do clone de ADN de PCV2-1 Bgl-II-PCV2 < 5'-AGACGAGAICIAIGAATAATAAAAACCATIACGAAG-'3 (corresponde à SEQ ID NO:15) construção do clone de ADN de PCV2-1 SpH-I-PCV2 Iniciadores > de detecção 5'-CGTAAGCATGCAGCTGAAAACGAAAGAAGTG-'3 (corresponde à SEQ ID NO:16) construção do clone de ADN de PCV2-1 MC VI > 5'-GCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGG-' 3 (corresponde à SEQ ID NO:17) detecção de PCV1 e PCV2 MCV2 < 5'-TCACACAGTCTCAGTAGATCATCCCA-'3 (corresponde ào SEQ ID NO:18) detecção de PCV1 e PCV2 Orf.PCV1 < 5'-CCAACTTTGTAACCCCCTCCA-'3 (corresponde à SEQ ID NO:19) detecção de PCV1 e PCV2-1 Gen.PCVl > 5'-GTGGACCCACCCTGTGCC-'3 (corresponde à SEQ ID NO:20) detecção de PCV1 e PCV1-2 Orf.PCV1 encaixado < 5'-CCAGCTGTGGCTCCATTTAA-'3 (corresponde à SEQ ID NO:21) detecção de PCV1 e PCV2-1 Gen.PCVl encaixado > 5'-TTCCCATATAAAATAAATTACTGAGTCTT-'3 (corresponde à SEQ ID NO:22) detecção de PCV1 e PCV1-2 Orf.PCV2 < 5'-CAGTCAGAACGCCCTCCTG-'3 (corresponde à SEQ ID NO:23) detecção de PCV2 e PCV1-2 Gen.PCV2 > 5'-CCTAGAAACAAGTGGTGGGATG-'3 (corresponde à SEQ ID NO:24) detecção de PCV2 e PCV2-1 Orf.PCV2 de precisão < 5'-TTGTAACAAAGGCCACAGC-' 3 (corresponde à SEQ ID NO:25) detecção de PCV2 e PCV1-2 Gen.PCV2 de precisão > 5' -GTGTGATCGATATCCATTGACTG-'3 (corresponde à SEQ ID NO:26) detecção de PCV2 e PCV2-1 a Direcção do iniciador 77 EXEMPLO 10 (apenas com fins ilustrativos)

Avaliação da infecciosidade do clone de ADN de PCVl quando transfectado no interior de células PK-15 isentas de contaminação virai

Determinou-se a infecciosidade do clone de ADN molecular do PCVl por transfecção in vitro de células PK-15. Um protocolo de IFA com anticorpos monoclonais específicos do PCVl (uma oferta do Dr. Gordon Allan, Belfast, U.K.) confirmou que o clone de ADN molecular do PCVl é infeccioso em células PK-15. Visualizou-se o antigénio específico de PCVl pelo protocolo de IFA no núcleo e, em menor grau, no citoplasma das células transfectadas. As células pseudotransfectadas com o vector pSK vazio permanecerem negativas ao antigénio PCVl. EXEMPLO 11

Construção do clone de ADN virai quimérico de PCV1-2

Construiu-se um vírus quimérico entre PCVl não patogénico e PCV2 associado à PMWS, utilizando clones de ADN infeccioso de PCVl e PCV2. Para se construir um clone de ADN quimérico de PCVl-2, removeu-se o gene da cápside de ORF2 do PCVl não patogénico a partir do clone de ADN infeccioso de PCVl e substitui-se pelo gene da cápside de ORF2 imunogénico do PCV2 patogénico na estrutura do genoma do PCVl (ver as Figs. 5 e 6). Foram produzidos artificialmente dois pares de iniciadores de PCR. O primeiro par de iniciadores para ORF2 do PCV2 é Psi 1-5, 78 explicitado na SEQ ID NO:11, e Acl 1-6, explicitado na SEQ ID NO:12, tendo estes iniciadores sido concebidos com mutações pontuais nas extremidades 5' para a criação de locais Acll e Psil para as enzimas de restrição para amplificação do gene 0RF2 do PCV2 e para introdução, por mutação pontual, dos locais de flanqueamento Psil e Acll das enzimas de restrição. 0 procedimento de PCR para a amplificação do 0RF2 do PCV2 consistiu num passo inicial a 95°C durante 9 minutos, seguindo-se 38 ciclos de desnaturação a 95°C durante 1 minuto, recombinação a 48°C durante 1 minuto, extensão a 72°C durante 1 minuto e mais uma extensão final a 72°C durante 7 minutos.

Concebeu-se um segundo par de iniciadores de PCR, Hpa 1-2, explicitado na SEQ ID NO:9, e Nar 1-3, explicitado na SEQ ID NO: 10, para a amplificação do vector pSK+ e da sua inserção do genoma do PCVl. Foram introduzidas mutações pontuais nas extremidades 5' dos iniciadores de PCR para se criar os locais Narl e Hpal de f lanqueamento para as enzimas de restrição. Este par de iniciadores amplificou o vector pSK+ e a sua inserção de ADN genómico do PCVl à qual lhe falta o gene da cápside de ORF2, isto é, o genoma do PCVl menos o ORF2 do PCVl (pSK-PCVl AORF2), utilizando como matriz de PCR o clone de adn infeccioso do PCVl. O procedimento de PCR consistiu num passo inicial a 95°C durante 9 minutos a que se seguiram 38 ciclos de desnaturação a 95°C durante 1 minuto, recombinação a 50°C durante 1 minuto, extensão a 72°C durante 3,5 minutos e ainda uma extensão final a 72°C durante 7 minutos. Fez-se digerir o produto de PCR de ORF2 do PCV2 com as enzimas Acll e Psil para se remover as mutações pontuais introduzidas. Fez-se digerir o produto pSK-PCVl AORF2 (o 79 produto de PCR sobre o vector pSK-genoma do PCVl, ao qual lhe falta o gene 0RF2 do PCVl) com as enzimas Narl e Hpal para se remover as mutações pontuais introduzidas por PCR. Esta última digestão produziu uma extremidade aderente e uma extremidade cortada a condizer, complementar do produto de PCR sobre 0RF2 do PCV2 digerido com as enzimas de restrição AcII e Psil. 0 produto de 0RF2 do PCV2 e o produto de pSK-PCVl com deleção de 0RF2 foi ligado com ligase de ADN de T4 para se obter o clone de ADN genómico quimérico de PCVl-2, em que o gene ORF2 do PCVl é substituído pelo gene 0RF2 do PCV2. Depois de os dois produtos de PCR terem sido digeridos e novamente ligados, todas as mutações pontuais introduzidas por PCR, utilizadas para facilitar a clonagem, foram removidas no clone quimérico resultante. Procedeu-se à transformação de células competentes DH5a de Escherichia coli. Os plasmídeos recombinantes que continha mo clone de ADN quimérico foram isolados e confirmados por PCR, digestão com enzimas de restrição e sequenciação parcial do ADN. O genoma quimérico de comprimento completo do PCVl-2 foi excisado a partir do vector pSK+ (o plasmídeo recombinante) por digestão com Kpríl. Depois disso, o genoma do ADN quimérico foi dimerizado por meio de uma reacção de ligação curta de 10 minutos com ligase de ADN de T4 que favorece a formação de dímeros lineares para se obter o clone de ADN quimérico infeccioso de PCVl-2 (Fig. 6) . Os plasmídeos recombinantes que contêm duas cópias do genoma virai quimérico foram confirmados por PCR, digestão com enzimas de restrição e sequenciação do ADN. 80 EXEMPLO 12

Avaliação da infecciosidade in vitro do clone de ADN quimérico do PCV1-2

Experimentou-se e analisou-se em células PK-15 a viabilidade do clone de ADN quimérico do PCV (PCVl não patogénico com o gene da cápside imunogénico do PCV2).

Quando as células PK-15 foram transfectadas com o clone de ADN quimérico virai, detectou-se o antigénio virai

especifico para a cápside do ORF2 do PCV2 pelo protocolo de IFA, decorridos cerca de 2 dias após a transfecção. O antigénio da cápside do PCVl não foi detectado em células transfectadas. Esta experiência permitiu concluir que o clone de ADN quimérico é infeccioso in vitro, replica-se em células PK-15 e produz a proteína da cápside imunogénica do PCV2 . EXEMPLO 13

Construção de um clone de ADN quimérico recíproco de PCV2-1

Para se construir um clone de ADN quimérico recíproco de PCV2-1, substitui-se o gene da cápside de ORF2 do PCV2 pelo do PCVl não patogénico na estrutura do genoma do PCV2 patogénico (Fig. 6) . Foram concebidos artificialmente dois pares de iniciadores de PCR: o par constituído por, Bgl-Il-ORF2, explicitado na SEQ ID NO:13, e por SpH-I-ORF2, explicitado na SEQ ID NO: 14, que amplifica o gene ORF2 do PCVl e introduz por mutação pontual locais de flanqueamento das enzimas de restrição BglII e SpHl. O segundo par de 81 iniciadores de PCR, constituído por Bgl-II-PCV2 explicitado na SEQ ID NO: 15, e por SpH-i-PCV2, explicitado na SEQ id NO: 16, amplifica o vector pSK e os genoma do PCV2 menos o gene ORF2 (pSK-PCV2 AORF2), mediante a utilização do clone de ADN infeccioso de PCV2 como matriz de PCR, e introduz por mutação pontual os locais de flanqueamento das enzimas de restrição Bglll e SpHl. 0 produto pSK-PCV2 A0RF2 e o produto de PCR de 0RF2 do PCVl foram digeridos com as enzimas de restrição Bglll e SpHI para assim se produzir extremidades complementares, aderentes e cortadas a condizer, ligadas entre si. Após a transformação em células de E. coli efectuou-se o isolamento dos plasmídeos recombinantes autênticos e fez-se a confirmação por digestão enzimática e sequenciação parcial do ADN. 0 genoma quimérico recíproco de comprimento completo do PCV2-1 foi excisado a partir do plasmídeo recombinante por digestão com ScrcII e dimerizou-se, conforme aqui descrito, para se produzir o clone quimérico recíproco infeccioso de PCV2-1. EXEMPLO 14

Transfecção in vitro de células PK-15 com os clones de ADN de PCVl, PCV2, PCVl-2 e PCV2-1

Demonstrou-se a infecciosidade do clone de PCV2 in vitro e in vivo nos exemplos 3-5 anteriores. Para se experimentar e analisar a infecciosidade do PCVl e dos dois clones quiméricos in vitro procedeu-se à preparação de células PK-15 isentas de contaminação com PCVl, pelo processo do exemplo 1, tendo essas células sido desenvolvidas em lamelas de câmara de 8 cavidades 'LabTek' (Nalge Nunc Int., Denmark). Quando as 82 células PK-15 atingiram uma confluência de cerca de 80%, efectuou-se a transfecção dessas células com clones de ADN de PCV1, PCV2, PCV1-2 e PCV2-1, utilizando o reagente 'Lipofectamine Plus', em conformidade com os protocolos fornecidos pelo fabricante (Life Technologies, Inc.). Como contraprova foram incluídas células pseudotransfectadas com o vector pSK vazio. Decorridos três dias após a transfecção, as células foram fixadas com uma solução que continha 80% de acetona e 20% de metanol, a 4°C durante 20 minutos. As provas de infecciosidade e de replicação virai em células transfectadas com os clones de ADN de PCVl e PCV2-1 foram confirmadas pelo protocolo de ensaio de imunofluorescência indirecta (IFA), utilizando o anticorpo monoclonal contra o gene da cápside de ORF2 do PCVl, amavelmente fornecido pelo Dr. G. M. Allan (G. M. Allan et al., "Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus," Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994)). As células fixadas foram lavadas com soluto salino tamponado em fosfato (PBS) e ficaram a incubar com anticorpos monoclonais de PCVl, para uma diluição de 1:20, a 37°C durante 1 hora. As células foram então lavadas três vezes com tampão de PBS e ficaram a incubar com anti-imunoglobulina G de murganho conjugada na cabra e marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.) a 37°C durante 45 minutos. Após a lavagem três vezes com tampão de PBS, efectuou-se a montagem das lamelas com 'Fluoromount-G', tendo sido cobertas com tampa própria e examinadas ao microscópio de fluorescência. A infecciosidade das células transfectadas com os clones de ADN de PCV2 e de ADN quimérico de PCVl-2 foi confirmada pelo 83 protocolo de IFA, utilizando anticorpos específicos para o PCV2, conforme anteriormente descrito no exemplo 4.

As infecciosidades dos clones de PCVl, de ADN quimérico de PCV1-2 e de ADN quimérico recíproco de PCV2-1 foram demonstradas pela transfecção de células PK-15 in vitro. Ligou-se em tandem duas cópias idênticas do genoma completo do PCVl no vector pSK para se produzir o clone de ADN de PCVl (Fig. 6) . O clone de ADN quimérico de PCVl-2 tinha o gene da cápside de 0RF2 do PCVl substituído pelo do PCV2 patogénico na estrutura do genoma do PCVl não patogénico. O clone de ADN quimérico recíproco de PCV2-1 tinha o gene da cápside de 0RF2 do PCV2 substituído pelo do PCVl não patogénico na estrutura do genoma do PCV2 patogénico. Se for infeccioso in vitro, o clone de ADN quimérico do PCVl-2 irá produzir o antigénio da cápside de 0RF2 do PCV2 e o clone de ADN quimérico recíproco de PCV2-1 irá expressar o antigénio da cápside de 0RF2 do PCVl em células PK-15 transfectadas. Os resultados comprovaram que os clones de ADN de PCVl, de PCVl-2 quimérico e de PCV2-1 quimérico recíproco foram todos eles, surpreendentemente, infecciosos quando transfectados em células PK-15 e expressaram as correspondentes proteínas antigénicas da cápside virai, conforme demonstrado pelo protocolo de IFA, utilizando anticorpos específicos para o PCVl ou para o PCV2. 0 protocolo de IFA, utilizando anticorpos monoclonais contra o 0RF2 do PCVl e anticorpos contra o PCV2, confirmou que os clones de ADN de PCVl e de ADN de PCVl-2 eram infecciosos. 0 protocolo de IFA, utilizando anticorpos monoclonais específicos do 0RF2 do PCVl, demonstrou que o clone de ADN quimérico de PCVl-2 também era infeccioso. Cerca de 10-20% das células PK-15 transfectadas foram 84 positivas em termos de antigénio da cápside do PCV1 e do antigénio de PCV2 e expressaram o antigénio de 0RF2 de PCVl no interior do núcleo das células transfectadas (Fig. 7). EXEMPLO 15

Inoculação experimental de suínos com os clones de ADN de PCVl, PCV2, PCV1-2 quimérico e PCV2-1 quimérico recíproco

Para se avaliar a imunogenicidade e a patogenicidade dos clones de ADN quimérico, foram utilizados quarenta suínos isentos de agentes patogénicos específicos (SPF) com idades entre 4-6 semanas, os quais foram distribuídos aleatoriamente por cinco compartimentos com 8 animais cada um. Antes da inoculação, os animais foram analisados para se pesquisar a existência de anticorpos contra PCV, PRRSV, PPV, e vírus E da hepatite dos suínos. Além disso, foram analisadas amostras de soro obtidas pré-inoculação para se pesquisar por PCR os ácidos nucleicos do PCVl e do PCV2, para se confirmar se os suínos não estariam naturalmente infectados por qualquer desses vírus. Os clones de ADN de PCVl, PCV2, PCVl-2 e PCV2-1 foram todos eles inoculados por injecção directa, do ADN plasmídico clonado, nos nodos linfáticos ilíacos superficiais dos suínos. Os suínos do grupo 1 receberam soluto salino tamponado com fosfato (tampão PBS) e serviram de contraprova negativa. Aos suínos do grupo 2 injectou-se, individualmente, nos nodos linfáticos ilíacos superficiais 200 pg de clone de ADN de PCVl. Cada um dos suínos do grupo 3 recebeu uma injecção de 200 pg de clone de ADN de PCV2 infeccioso. Cada um dos suínos do grupo 4 recebeu uma injecção de 200 pg de clone 85 de ADN quimérico infeccioso de PCVl-2. Cada suino do grupo 5 recebeu 200 pg de clone de adn quimérico reciproco de PCV2-1 infeccioso. Os animais foram monitorizados diariamente para observação de sinais clínicos de patologia. Foram colhidas amostras de soro em cada animal nos dias pós-inoculação (DPI)-2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 e 49. Ao 21° DPI, foram sacrificados e autopsiados quatro animais seleccionados aleatoriamente em cada grupo. Os restantes quatro animais de cada grupo foram sacrificados e autopsiados ao 49° DPI. Efectuou-se a colheita de diversos tecidos e órgãos durante a autópsia, conforme anteriormente descrito no Exemplo 7, tendo sido depois preparados para exame histológico.

Examinou-se nos suínos a imunogenicidades dos clones de adn infeccioso de PCVl, de PCV2 e quimérico. As amostras de soro colhidas a partir de todos os animais de contraprova e dos animais inoculados nos DPI -2 (0), 7, 14, 21, 28, 35, 42 e 49 foram analisadas para se pesquisar a viremia com PCVl, PCV2, pcvI-2 e PCV2-1, por detecção das sequências de adn específicas dos clones, feita pelo protocolo de PCR, para se pesquisar anticorpos anti-PCVl pelo protocolo de IFA e para se pesquisar anticorpos anti-ORF2 do PCV2 pelo protocolo ELISA. Antes da inoculação no DPI -2, os animais da totalidade dos cinco grupos analisados revelaram ser negativos, pelo protocolo de PCR, ao ADN do PCVl e do PCV2.

Os animais de contraprova negativos revelaram resultados negativos de viremia, tanto para o PCVl como para o PCV2, ao longo de todo o estudo (ver o quadro 7, infra) . Cinco suínos não inoculados do grupo de contraprova apresentaram anticorpos maternais detectáveis de PCV2 ao DPI -2 e dois suínos apresentaram anticorpos maternais 86 detectáveis de PCV1 ao 7o DPI (ver o quadro 8, infra) . Os anticorpos maternais, tanto contra o PCVl como contra o PCV2, desapareceram nestes leitões praticamente ao 21° DPI. Não foi detectada nenhuma seroconversão em PCVl ou PCV2 em nenhum dos 8 suínos de contraprova não inoculados, ao longo de todo o estudo.

No grupo inoculado com PCVl, a viremia foi detectada, em primeiro lugar, num suíno inoculado, ao 7o DPI (quadro 7, infra) e foi detectada, em último lugar, ao 35° DPI. Houve 5 de 8 animais inoculados com o clone de ADN infeccioso de PCVl que revelaram ser positivos à viremia de PCVl. A duração média da viremia contínua de PCVl foi de 0,625 semana. Por volta do 21° DPI, em todos os animais do grupo inoculado de PCVl tinha ocorrido seroconversão para PCVl e mantiveram-se positivos aos anticorpos de PCVl até ao final do estudo no 49° DPI.

Demonstra-se aqui que o clone de ADN de PCV2 é infeccioso nos suínos. No grupo inoculado com o clone de ADN de PCV2, detectou-se a viremia de PCV2, pela primeira vez, ao 7o DPI (quadro 7, infra) . Por volta do 21° DPI, todos os animais do grupo 3 inoculado com PCV2 revelaram ser positivos à viremia de PCV2. A duração média da viremia de PCV2 foi de 2,12 semanas. Houve dois suínos do grupo inoculado com PCV2 que revelaram níveis detectáveis de anticorpos de PCV2 maternais ao 7o DPI (quadro 8, infra), tendo os anticorpos maternais desaparecido nestes leitões praticamente por volta do 14° DPI. A seroconversão em PCV2, analisada pelo protocolo ELISA, específico para PCV2, foi detectada pela primeira vez ao 35° DPI. Por volta do 42° DPI, em todos os suínos inoculados com o clone de ADN infeccioso de PCV2 tinha havido seroconversão para PCV2. 87

Nos suínos do grupo 4 inoculados com o clone de ADN infeccioso quimérico de PCVl-2, a viremia específica para o vírus quimérico foi detectada pela primeira vez ao 14° DPI (quadro 7, infra) . Houve quatro de 7 animais inoculados que ficaram virémicos ao PCVl-2 entre o 14° DPI e o 42° DPI. A duração média da viremia quimérica de PCVl-2 foi de 1 semana. Houve um suíno que apresentou níveis detectáveis de anticorpos maternais contra o PCV2 ao 1° e ao 14° DPI, mas os anticorpos maternais desapareceram praticamente ao 21° DPI (quadro 8, infra). A seroconversão em anticorpos específicos de 0RF2 do PCV2 ocorreu pela primeira vez ao 28° DPI. Por volta do 49° DPI, em todos os suínos inoculados com o clone de ADN quimérico de PCVl-2 tinha ocorrido a seroconversão em anticorpos específicos de 0RF2 do PCV2.

Nos suínos inoculados com o clone quimérico recíproco de PCV2-1, não foi detectado, nas amostras de soro, ADN virai específico para o vírus quimérico PCV2-1 (quadro 7, infra) . No entanto, por volta do 21° DPI tinha ocorrido em todos os animais do grupo 5 a seroconversão em anticorpos contra o PCVl. Os produtos de PCR, amplificados a partir de suínos seleccionados em cada grupo, foram sequenciados, tendo-se confirmado que eram os correspondentes clones infecciosos autênticos utilizados na inoculação de cada grupo.

Quadro 7. Detecção de viremia por PCR de precisão (nested PCR) em soros de suinos inoculados e de contraprova

DPI

Grupo Inóculos -2 7 14 21 28 35 42 49 Total 1 PBSa 0/8b 0/8 0/8 0/8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/8 2 ADN de 0/8 1/8 1/8 2/8 0/4 2/4 0/4 0/4 5/8 88 PCVc

DPI

Grupo Inóculos -2 7 14 21 28 35 42 49 Total 3 ADN de 0/8 3/8 6/8 7/8 1/4 2/4 2/4 0/4 8/8 PCV2c 4 ADN de 0/7 0/7 1/7 2/7 2/4 2/4 2/4 0/4 4/7 PCVl-2c 5 ADN de 0/8 0/8 0/8 0/8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/8 PCV2-lc â utilizou-se soluto salino tamponado com [ fosfato (PBS) como contraprova negativa. b oito suínos em cada grupo; número de positivos/número de analisados c ADN genómico de PCV ou adn quimérico de PCV, clonados no plasmídeo pSK.

Quadro 8. Seroconversão em anticorpos contra o PCV2 em suínos inoculados com clones de ADN de PCV2 ou de PCV1-2 quimérico e seroconversão em anticorpos contra o PCV1 emsuínos inoculados com clones de ADN de PCV1 ou de PCV2-1 Anticorpo DPIC analisado

Grupo Inóculos contrab -2 7 14 21 28 35 42 49 1 PBS PCV1 NA 2/8 2/8 1/8 0/4 0/4 0/4 0/4 PCV2 5/8 5/8 2/8 0/8 0/4 0/4 0/4 0/4 2 ADN de ORF2 de PCV1 NA 3/8 2/8 8/8 4/4 4/4 4/4 4/4 PCV1 3 ADN de virus de 3/8 2/8 0/8 0/8 0/4 3/4 4/4 4/4 PCV2 PCV2 4 ADN de completo virus de 2/8 1/8 1/8 0/8 1/4 1/4 3/4 4/4 PCV1-2 PCV2 5 ADN de completo ORF2 de PCV1 NA 3/8 3/8 8/8 3/4 3/4 4/4 4/4 PCV2-1

â utilizou-se soluto salino tamponado com fosfato (PBS) como contraprova negativa. Os inóculos foram ADN genómico de PCV e ADN 89

quimérico de PCV, clonados no plasmideo pSK b mediu-se os anticorpo contra 0RF2 do PCV1 por meio de um ensaio de imunofluorescência indirecta, especifico para o antigénio PCV1. Mediu-se o anticorpo contra PCV2 por meio de um ensaio de imunossorção ligado a enzimas c dias pós-inoculação; número de positivos/número de analisados. EXEMPLO 16

Avaliaçao clínica

Efectuou-se a pesagem dos suínos no DPI 0 e no momento da autópsia. Efectuou-se o registo das temperaturas rectais e das classificações respiratórias clínicas, variando entre 0 e 6 (0 = normal; 6 = grave) (P. G. Halbur et al., "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus," Vet. Pathol. 32:648-660 (1995)), de dois em dois dias, entre o DPI 0 e o 49° DPI. Também se efectuou o registo diário de observações clínicas, incluindo os sinais de patologia do sistema nervoso central, patologia hepática (icterícia), patologia musculoesquelética e alterações do estado corporal. Todas as avaliações clínicas foram feitas por uma equipa de duas pessoas.

Nenhum dos animais de contraprova ou inoculados revelou sinais evidentes de PMWS clínica de espectro total. Não houve diferenças de aumento de peso ou de valores das temperaturas médias rectais entre os animais de qualquer dos grupos. Um dos suínos do grupo 3, inoculado com PCVl-2, morreu um dia a seguir à inoculação. Após a autópsia e análises clínicas, não foi detectado nenhum agente 90 patogénico e considerou-se que a morte não estava associada ao processo de inoculação ou ao vírus quimérico PCVl-2. EXEMPLO 17

Patologia e histopatoloqia macroscópicas

Foram sacrificados e autopsiados 4 suínos de cada grupo ao 21° e ao 49° DPI. A equipa que efectuou as autópsias ignorava totalmente, em teste cego, o estado de infecção dos suínos no momento da autópsia. Foram efectuadas autópsias completas a todos os suínos. Com base num sistema de classificação já anteriormente descrito, anotou-se para cada suíno uma percentagem estimada de pulmão com pneumonia visível macroscopicamente (P. G. Halbur et al., 1995, supra) . Efectuou-se o registo separado de outras lesões, tais como a dilatação dos nodos linfáticos. Foram feitas secções para exame histopatológico do turbinado nasal, pulmões (sete secções) (id.), coração, cérebro, nodos linfáticos (traqueobronquiais, ilíacos, mesentéricos, subinguinais), amígdalas, timo, fígado, vesícula biliar, baço, articulações, intestino delgado, cólon, pâncreas e rim. Os tecidos foram examinados em protocolo de teste cego e foi-lhes atribuída uma classificação subjectiva para quantificar a gravidade das lesões pulmonares, dos nodos linfáticos e hepáticas, conforme descrito no exemplo 7. Os valores de classificação para os pulmões variaram entre 0 (normal) e 3 (pneumonia intersticial linfoistiocítica grave). Os valores de classificação para as lesões hepáticas variaram entre 0 (normal) e 3 (hepatite linfoistiocítica grave). Os valores de classificação para as lesões dos nodos 91 linfáticos foram atribuídos para uma quantidade estimada de depleção linfóide de folículos, variando entre 0 (normal ou inexistência de depleção linfóide) e 3 (depleção linfóide grave e substituição histiocítica dos folículos).

Para se determinar a patogenicidade dos clones de ADN infeccioso de PCVl, PCV2, PCVl-2 quimérico e PCV2-1 quimérico recíproco nos suínos examinou-se, em primeiro lugar, as lesões macroscópicas. Os resultados estão agrupados no quadro 9, infra. Os nodos linfáticos dos animais do grupo 1 de contraprova, não inoculados, apresentaram-se normais, quer ao 21° quer ao 49° DPI. Os suínos dos quatro grupos inoculados apresentaram graus variáveis de lesões macroscópicas limitadas aos nodos linfáticos. Nos suínos do grupo 2, inoculados com PCVl, os nodos linfáticos apresentaram-se macroscopicamente normais ao 21° DPI; no entanto, foi detectado um aumento de volume, entre ligeiro e moderado, e uma descoloração dos nodos linfáticos ao 49° DPI. Todos os suínos do grupo 3 inoculado com PCV2 apresentaram nodos linfáticos com um volume maior, correspondente a duas a cinco vezes o seu tamanho normal, sendo rígidos e corados de castanho, quer ao 21° quer ao 49° DPI. Os nodos linfáticos dos animais inoculados com PCVl-2 quimérico apresentaram um aumento de volume, entre ligeiro e moderado, e uma descoloração, quer ao 21° quer ao 49° DPI, em 5 dos 7 suínos. Nos suínos do grupo 5, inoculados com o clone de PCV2-1, 1 dos 8 animais apresentou um aumento de volume ligeiro e uma descoloração dos nodos linfáticos ao 21° DPI. Os valores médios de classificação das lesões macroscópicas dos nodos linfáticos nos suínos inoculados com o clone quimérico de PCVl-2 não foram estatisticamente diferentes dos valores observados 92 nos grupos 1, 2 e 5, mas foram estatisticamente diferentes dos valores observados nos suinos do grupo 3 inoculados com o PCV2 patogénico, quer ao 21° quer ao 49° DPI. Os valores médios de classificação das lesões linfóides macroscópicas ao 4 9° DPI, observados nos animais inoculados com PCVl, PCV2 e PCVl-2, não foram estatisticamente diferentes uns dos outros, mas foram todos estatisticamente diferentes dos valores médios de classificação das lesões macroscópicas observados nos grupos 1 e 5.

Seguidamente foram analisadas as lesões microscópicas. Os resultados estão apresentados no quadro 10 subsequente. Não foram detectadas nenhumas lesões microscópicas nos suinos do grupo 1 de contraprova não inoculados nem nos suinos do grupo 2 inoculados com PCVl, em nenhum dos DPI. Foram observadas lesões pulmonares microscópicas, caracterizadas como pneumonia ligeira peribronquiolar linfoplasmacitica e histiocitica broncointersticial em 1 dos 8 suinos inoculados com PCV2. Nos animais inoculados com PCVl-2 e PCV2-1 não foram observadas nenhumas lesões microscópicas nos pulmões. Não foram observadas lesões nos timos de nenhum dos suinos inoculados. Foi observada miocardite linfoplasmacitica multifocal ligeira em 2 dos 8 suinos do grupo inoculado com PCV2. Os tecidos dos corações dos animais inoculados com PCVl-2 e PCV2-1 apresentaram-se sem lesões microscópicas. Foi observada nefrite intersticial linfoplasmacitica multifocal ligeira em 4 dos 8 suinos do grupo inoculado com PCV2, em 2 dos 7 suínos inoculados com PCVl-2 e em 1 dos 8 suinos inoculados com PCV2-1. Observou-se depleção linfóide e substituição histiocitica dos foliculos, entre ligeira e moderada, nas amígdalas de 5 dos 8 suínos, no baço de 3 de 8 suínos e nos nodos linfáticos de 8 dos 8 suínos do grupo 93 inoculado com PCV2. Nos animais inoculados com PCVl-2 quimérico observou-se depleção linfóide e substituição histiocítica ligeira dos folículos nos nodos linfáticos de 2 dos 7 suínos, mas isso não foi detectado nem no baço nem nas amígdalas. Não foi observada nenhuma depleção linfóide nem substituição histiocítica dos folículos nos nodos linfáticos, baço ou amígdalas nos animais inoculados com PCV2-1 quimérico recíproco. Observou-se hepatite linfoplasmacítica, entre ligeira e moderada, em 7 dos 8 suínos inoculados com PCV2. Observou-se hepatite linfoplasmacítica ligeira em 2 dos 7 suínos inoculados com PCVl-2 quimérico. Não foi observada nenhuma hepatite linfoplasmacítica nos suínos inoculados com PCV2-1 quimérico recíproco. As lesões noutros tecidos foram irrelevantes.

As lesões microscópicas nos pulmões, fígados e nodos linfáticos foram classificadas em conformidade com um sistema de classificação consagrado (P. G. Halbur et al.r 1995, supra) . Os resultados estão agrupados no quadro 10 subsequente. Os valores médios de classificação das lesões nos nodos linfáticos dos suínos do grupo 4, inoculado com PCVl-2 quimérico, foram semelhantes aos observados nos grupos 1, 2 e 5, mas foram estatisticamente diferentes dos valores observados nos suínos do grupo 3, inoculados com PCV2 patogénico, quer ao 21° quer ao 49° DPI. Os valores médios de classificação das lesões hepáticas microscópicas nos animais do grupo inoculado com PCVl-2 quimérico ao 21° DPI foram estatisticamente diferentes dos valores observados nos animais do grupo 3 inoculados com PCV2, mas foram semelhantes aos valores observados nos suínos dos grupos 1, 2 e 5 ao 21° DPI. Ao 49° DPI, os valores médios das classificações das lesões hepáticas microscópicas dos 94 animais do grupo 4, inoculados com PCV1-2 quimérico, não foram estatisticamente diferentes dos valores observados com os suinos dos grupos 1, 2, 3 e 5. Não há nenhum sistema de classificação aceitável para outros tecidos ou órgãos.

Quadro 9. Lesões macroscópicas dos nodos linfáticos em suinos de contraprova e em suinos inoculados DPIb

Grupo Inoculo3 21 49 1 PBS 0/4 (0,0) 0/4 (0,0) 2 ADN de PCVI 0/4 (0,0) 4/4 (1,5) 3 ADN de PCV2 4/4 (2,5) 4/4 (2,25) 4 ADN de PCV1-2 2/3 (0,66) 3/4 (1,25) 5 ADN de PCV2-1 1/4 (0,25) 0/4 (0,0) a utilizou-se soluto salino tamponado com fosfato (PBS) como contraprova negativa. Os inóculos foram ADN de PCV genómico ou de PCV quimérico clonado no plasmídeo pSK. b foram autopsiados quatro suínos de cada grupo ao 21° DPI e os suínos restantes foram autopsiados ao 49° DPI; número de positivos / número de analisados. Número com lesões / número de analisados (intervalo de gravidade estimada de aumento de volume dos nodos linfáticos)

Quadro 10. Distribuição das lesões histopatológicas em diferentes tecidos / órgãos dos suínos de contraprova e dos suínos inoculados % V w O 0 0 (ti Grupo 0 H P u '0 X! H d Ω O !fd £ 1—1 P 0 V rti tP Ή Lodos u •H -P vti U-l Baço Timo f lio d A Q) d 'CD icfl O (ti d O Rim iti tP -d d H CU d d -H O O £ <

1 PBS 21 0/4(0,0) 49 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 95

Grupo V 0 i—1 3 U Ό C H Δ H 1¾ Ω 0 !É= i—1 3 P-i O T) rd Ct SH ti Lodos Linfáticos' Baço Timo f lio Cérebro Co raçao Rim Amígdala 2 ADN de 21 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 PCV1 49 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3 ADN de 21 0/4(0,0) 4/4(1,5) 4/4(1,75) 3/4 0/4 0/4 1/4 1/4 2/4 3/4 PCV2 49 1/4(0,25) 3/4(0,75) 4/4(1,0) 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 2/4 2/4 4 ADN de 21 0/3(0,0) 1/3(0,33) 1/3(0,33) 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 PCV1-2 49 0/4(0,0) 1/4(0,25) 1/4(0,25) 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 4 ÍON de 21 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4(0,0) 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 PCV2-1 49 0/4(0,0) 0/4(0,0) 1/4(0,25) 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 a utilizou-se soluto salino tamponado com fosfato (PBS) como contraprova negativa. Os inóculos foram ADN de PCV genómico ou de PCV quimérico clonado no plasmídeo pSK. b foram autopsiados quatro suinos de cada grupo ao 21° DPI e os suinos restantes foram autopsiados ao 49° DPI. c número de positivos / número de analisados (valores médios de classificação histológica pulmonar: 0, normal; 1, pneumonia intersticial ligeira; 2, moderada; 3, grave) d número de positivos / número de analisados (valores médios de classificação histológica do fígado: 0, normal; 1, hepatite ligeira; 2, moderada; 3, grave) e número de positivos / número de analisados (valores médios de depleção histológica linfóide (nodos linfáticos): 0, normal; 1, ligeira; 2, moderada; 3, grave) EXEMPLO 18

Serologia

Recolheu-se sangue de todos os suínos nos DPI -2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 e 49. Os anticorpos séricos contra PRRSV foram analisados utilizando o protocolo ELISA 'Herd Check PRRSV' (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Foram detectados anticorpos séricos contra PPV por meio de um 96 ensaio de inibição da hemaglutinação (Hl) (H. S. Joo et ai., "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)). Foram detectados anticorpos séricos contra PCV2 por meio de um protocolo ELISA indirecto modificado com base na proteína da cápside de ORF2 recombinante do PCV2, conforme aqui anteriormente descrito (ver também P. Nawagitgul et ai., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)). Foram detectados anticorpos séricos contra PCV por meio de um ensaio de imunofluorescência indirecta (IFA). Manteve-se a desenvolver células PK-15, infectadas com PCVl, em lamelas de câmaras 'LabTek' de 8 cavidades. Quando as células PK-15 infectadas atingiram uma confluência de cerca de 95-100%, efectuou-se a fixação das células infectadas com uma solução que continha 80% de acetona e 20% de metanol, a 4°C durante 20 minutos. As células fixadas foram lavadas uma vez com tampão PBS, acrescentou-se às câmaras 100 pL de uma amostra de soro de suíno diluída à razão de 1:10 em PBS e manteve-se tudo a incubar durante 1 hora a 37 °C. Seguidamente efectuou-se a lavagem das células três vezes com PBS e manteve-se tudo a incubar durante 45 minutos a 37°C com um anti-anticorpo secundário de suíno conjugado na cabra e marcado com FITC. Seguidamente, efectuou-se a lavagem das lamelas três vezes com PBS, tendo sido montadas com 'Fluoromount-G', cobertas com tampa própria e examinadas ao microscópio de fluorescência. Para a contraprova positiva, manteve-se células infectadas com PCVl a incubar com um anticorpo monoclonal diluído, 97 específico de PCV1 (oferta do Dr. G. M. Allan), seguindo-se uma incubação com anti-lgG de murganho conjugado na cabra e marcado com FITC (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.). Para a contraprova negativa, manteve-se células infectadas com PCVl a incubar com soro de suíno, diluído à razão de 1:10, isento de anticorpos contra PCVl e anticorpos contra PCV2, seguindo-se uma incubação com anti-lgG de suíno conjugado na cabra e marcado com FITC (Kirkegaard& Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.).

EXEMPLO 19 Detecção por PCR

Para se detectar viremia de PCVl, PCV2, PCVl-2 quimérico e PCV2-1 quimérico recíproco nos soros de suínos inoculados, efectuou-se a colheita de amostras de soro em diferentes DPI, tendo sido analisadas por PCR. Extraiu-se o adn virai de 100 pL de cada uma das amostras de soro, utilizando-se para tal o reagente DNAzol, em conformidade com o protocolo do fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Com o ADN extraído preparou-se nova suspensão em DNase, RNase e água isenta de proteinases. Para se amplificar as sequências genómicas, específicas dos clones de PCVl, PCV2, PCVl-2 quimérico e PCV2-1 quimérico recíproco, foram concebidos dois conjuntos de pares de iniciadores de precisão (nested) de PCR (nested PCR) (quadro 6, supra) . O primeiro conjunto de iniciadores de precisão foi concebido com base em sequências já publicadas de PCVl. Os iniciadores Gen.PCVl, explicitado na SEQ ID NO:20, e Orf.PCVl explicitado na SEQ ID NO:19, amplificaram 98 um fragmento de 400 pb na presença do genoma de PCV1. Os iniciadores de precisão, 'nested.Gen.PCVl', explicitado na SEQ ID NO:22, e 'nested.Orf.PCVl', explicitado na SEQ ID NO:21, amplificaram um fragmento de 220 pb.

Para se detectar viremia de PCV2, o par iniciador de PCV2, designado por Gen.PCV2, explicitado na SEQ ID NO:24, e o iniciador designado por Orf.PCV2, explicitado na SEQ ID NO:23, amplificaram um fragmento de 900 pb na presença do PCV2 no primeiro ciclo de PCR. Os iniciadores 'nested.Gen.PCV2', explicitado na SEQ ID NO:26, e 'nested.0rf.PCV2', explicitado na SEQ ID NO:25, amplificaram um fragmento de 600 pb na PCR de precisão.

Para se detectar viremia de PCVl-2 quimérico, utilizou-se no primeiro ciclo do protocolo de PCR o iniciador Gen.PCVl especifico de PCVl, explicitado na SEQ ID NO:20, e o iniciador 0rf.PCV2 especifico de ORF2 de PCV2, explicitado na SEQ ID NO:23 para amplificar um fragmento de 580 pb. Para a PCR de precisão, utilizou-se o iniciador 'nested.Gen.PCVl', especifico de PCVl, explicitado na SEQ ID NO:22, e o iniciador 'nested.Orf.PCV2' especifico de ORF2 de PCV2, explicitado na SEQ ID NO:25, para amplificar um fragmento quimérico de 370 pb.

Para a detecção de viremia de PCV2-1 quimérico reciproco, utilizou-se no primeiro ciclo de PCR o iniciador Gen.PCV2 especifico de PCV2, explicitado na SEQ ID NO:24, e o iniciador Orf.PCVl, especifico de ORF2 de PCVl, explicitado na SEQ ID NO:19, para amplificar um fragmento quimérico de 700 pb. Para a PCR de precisão, utilizou-se o iniciador especifico de PCV2, designado por 'nested.Gen.PCV2', explicitado na SEQ ID NO:26, e o iniciador especifico de ORF2 de PCVl, designado por 'nested.Orf.PCVl', explicitado na SEQ 99 ID NO :21, para amplificar um fragmento quimérico de 460 pb. Todos os parâmetros de PCR foram essencialmente idênticos, consistindo em 38 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 minuto, recombinação a 45°C durante 1 minuto e extensão a 72°C durante 1,5 minutos. As amostras de soro, retiradas dos suinos de controlo negativo, foram analisadas por meio de um ensaio de diagnóstico 'PCR-RFLP' que permite detectar e diferenciar PCV1 e PCV2, conforme já anteriormente descrito (M. Fenaux et al., "Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCRrestriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2,"J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503 (2000)). Os produtos de PCR de animais seleccionados em cada grupo, foram sequenciados para se verificar a origem dos virus que infectam os suinos. EXEMPLO 20

Imunocitoquímica (IHC)

Efectuou-se a detecção do antigénio especifico de PCV2 por IHC nos tecidos dos nodos linfáticos colhidos a partir de todos os suinos autopsiados ao 21° e ao 49° DPI. Utilizou-se um anti-soro policlonal de coelho contra o PCV2 para a detecção por IHC, em conformidade com os processos gerais já anteriormente descritos (S. D. Sorden et al., "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, 100 paraffin-embedded tissue," J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999)) .

Com base na coloração do antigénio específico de PCV2 na IHC, os tecidos linfóides provenientes dos suínos de contraprova não inoculados e dos suínos inoculados com PCV1 e PCV2-1 revelaram ser negativos ao antigénio PCV2. Detectou-se o antigénio PCV2 nos tecidos linfóides de 7 dos 8 animais do grupo inoculado com PCV2. O antigénio PCV2 também foi detectado no tecido linfóide de 1 dos 7 suínos do grupo inoculado com o PCVl-2 quimérico. 101

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição us 6287856 B, Poet [0010] wo 9945956 A [0010] us 6217883 B, Allan [0011] FR 2781159 B [0011] US 6391314 BI [0011] US 6368601 BI [0011] FR 2769321 [0011] FR 2769322 [0011] WO 0196377 A2 [0011] WO 0001409 A [0011] WO 9918214 A [0011] WO 0077216 A2 [0011] WO 0116330 A2 [0011] WO 9929871 A [0011] WO 0077188 A [0011]

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Claims (20)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico quimérico infeccioso de circovirus porcino (PCVl-2), caracterizada pelo facto de ter uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCVl não patogénico infeccioso que contém um gene imunogénico de grelha de leitura aberta 2 (0RF2) de um PCV2 patogénico no sitio de um gene 0RF2 da molécula de ácido nucleico do PCVl.

2. Molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a molécula de ácido nucleico quimérico ter uma sequência nucleotidica explicitada na figura 9, a sua cadeia complementar ou uma sequência nucleotidica que tenha uma homologia pelo menos igual a 5% com a sequência nucleotidica da figura 9.

3. Vector plasmidico ou virai biologicamente funcional, caracterizado pelo facto de conter uma molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a reivindicação 2.

4. Plasmideo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de possuir a designação de depósito de patente ATCC PTA-3912.

5. Célula hospedeira adequada, transfectada por um vector, caracterizada pelo facto de compreender uma molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a reivindicação 2. 2

6. Circovírus porcino quimérico infeccioso e avirulento, caracterizado pelo facto de ser produzido por células que contêm a molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a reivindicação 2.

7. Circovirus porcino quimérico infeccioso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de as referidas células conterem o plasmídeo que possui a designação de depósito de patente ATCC PTA-3912.

8. Processo para a produção de um produto polipeptídico imunogénico, caracterizado pelo facto de compreender os passos seguintes: desenvolvimento, em condições nutrientes adequadas, de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas transfectadas com uma molécula de ácido nucleico quimérico de acordo com a reivindicação 2, de uma maneira que permita a expressão do referido produto polipeptídico, e isolamento do produto polipeptídico desejado resultante da expressão da referida molécula de ácido nucleico.

9. Vacina virai que protege um suíno contra uma infecção virai ou contra a síndrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS) provocada por PCV2, caracterizada pelo facto de compreender um veículo não tóxico e fisiologicamente aceitável e uma quantidade imunogénica de um componente seleccionado entre o conjunto constituído por: (a) uma molécula de ácido nucleico quimérico que tenha uma sequência nucleotídica tal como a explicitada na figura 9, a sua cadeia complementar ou uma sequência nucleotídica 3 que tenha uma homologia pelo menos igual a 95% com a sequência nucleotídica da figura 9; (b) um vector plasmídico ou virai biologicamente funcional que contenha uma molécula de ácido nucleico quimérico, a cadeia complementar ou uma sequência nucleotídica que tenha uma homologia pelo menos igual a 95% com a sequência nucleotídica da figura 9; e (c) um circovírus porcino quimérico infeccioso e avirulento, obtido a partir de uma molécula de ácido nucleico quimérico de PCVl-2, em que o gene da cápside 0RF2 do PCV1 é substituído pelo gene da cápside 0RF2 do PCV2.

10. Vacina virai de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de conter um circovírus porcino quimérico vivo.

11. Vacina virai de acordo com uma das reivindicações 9 ou 10, a qual compreende também uma quantidade imunogénica, pelo menos, de um antigénio porcino adicional.

12. Vacina virai de acordo com a reivindicação 11, em que pelo menos um antigénio porcino adicional é seleccionado entre o conjunto constituído pelo vírus porcino da síndrome reprodutiva e respiratória (PRRSV) e pelo parvovírus porcino (PPV).

13. Vacina virai de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 12, para utilização na protecção de um suíno contra uma infecção virai ou contra a síndrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS) provocada pelo PVC2. 4

14. Utilização da vacina de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 12, para a preparação de um medicamento para protecção de um suino contra uma infecção virai ou contra a sindrome debilitante multissistémica pós-desmame (PMWS) provocada pelo PVC2.

15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de se administrar a vacina ao suino.

16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo facto de se administrar a vacina ao suino pelas vias parentérica, intranasal, intradérmica ou transdérmica.

17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo facto de se administrar a vacina ao suino pelas vias intralinfóide ou intramuscular.

18. Processo para a preparação de uma molécula de ácido nucleico quimérico infeccioso de PCV1-2 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se remover um gene da grelha de leitura aberta (0RF2) de uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCVl não patogénico infeccioso; substituir a posição do gene 0RF2 do PCVl por um gene 0RF2 imunogénico proveniente de um PCV2 patogénico; e recuperar a molécula de ácido nucleico quimérico.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o referido gene 0RF2 do PCV2 5 ser obtido a partir da molécula de ácido nucleico molecular do PCV2 contida num vector de expressão que possui a designação de depósito de patente ATCC PTA-3913.

20. Molécula de ácido nucleico quimérico reciproco e infeccioso de PCV2-1, caracterizada pelo facto de compreender uma molécula de ácido nucleico que codifica um PCV2 patogénico infeccioso que possui um gene ORF2 imunogénico proveniente de um PCVl não patogénico, em vez de um gene ORF2 da molécula de ácido nucleico do PCV2. 1/11 Fig. 1

Dímero em tandem do genoma do PCV2 Ligação ao plasmídeo pSK

2/11 2Â ϊ?. JU' FÍ&2Â

Fig. 2Β 3/11

4/11 FigS, 4A -4D

5/11 Fig. 5 PCV2

Ml -h PCR PCW 0RF2 1 Digestão com Acl e Psi I

NaM Hpat OBf2 PCR

6/11 Fíg.6 ΚραΣ OitPCVl* N^.Orf^CVW KpflJ OIIF2

ffTCUÍWewvm-* V> **«eo.P€Vl Kpnl V clone de ADN molecular do PCV1 pSK_

r KpuI <MKM* PCV2 ORF2! Kíml I •4Nestód.Gen,PCVl «GíaJCVi l cloue de ADN molecular do PCV1-2 _gSK_;_) S&eil Orf.PCVi* I Nesied.Orf.PCVl* Saell PCVÍ «Kl>2 PCV2 PCV1 Oitt'2 «Nc^GeaPCV* -4GolPÇV2 SaelI FCV2|~--v V clone de ADN molecular do PCV2-1 pSK 7/11 7Â-7J ÍTAcom li Λ n»m ;mtí-OILF2 de PCV1 íiiirt P( V2

8/11 Fig.8 AAATTTCTGACAAACGraACAGGG^CTGCT<^CAACGGTCACCAGAC?CCCGCTCTCC AACAAGGTACTCACAGCAGTAGACASGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCGAGGAGCTCCA CATTCAATAAGTAAGTTGCCTTCTTTACTGCAATATTCrrTATTCTGCTGATCAGTTCCT ttggct^tctcgatatggcagcgggcacçcaaataccacttcactttattaaaagtttgc TTCTTGACAAAATTAGCGAACCCCTGGAGGTGAGGTGTTCGTCCTTCCTCATTACCCTCC TCGCCAACAATAAAATAATCÂAATAGGGAGATTGGGAGCTCCCGTATTTTCTTGCGCTCG TCTTCGGAAGGATTATTCAGCGTGAACACCCACCTTTTATG^GGTTGGGGTCCGCTTCPT CCATOÍCTTCTTGCTGGGCATGTTGCTGCTGAGGTGCfGCCGAfíGTGCTGCCGCTGCCGAA GTGCGCTGGTAATACTTACAGCGCACTTCmCGTTTTCAGCTATGACGTATCCAAGGAG GCGTTACCGCAGAA6AAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCG CCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAA cacccgcctctcccgcaccttcggatatactgtcaaggctaccacagícagaacgccctc CTGGGCGGTGGACATGATGAGATTTAATATTGACGACTTTGTTCecCCGGGAGGGGGGAC CMCAAAATCTCTATACCCTTTGAATACTACAGÂATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTG GCCCTGCTCCCCCATCACCCAGGGTGATAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGA TGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTAACCTATGACCCATATGTAAACTACTCCTC GCGCCATACAATCCCCCAACCCTTCTCCTACCACTCCCGTTACTTCACACCGAAACGTGT TCTTGACTCCACCATTGATTACTTCCAACCAAATAACAAAAGGAATCAGCTTTGGATGAG GCTACAAACCTCTAGAAATGTGGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTAT ATACGACCAGGACTACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAAI^TrAATCT TAAAGACCCCCCACTTAAACCCTAAATGAATAATAAAAACCATTACGAAGTGATAAAAAA GACTCAGTAAITÍATTÍCATATGGAAAÍTCAGGGCATGGGGGGGAAAGGGTGACGAACIÍG GCCCCCTTCCTCCGTGGATTGTTCTGTAGCATTCTTCCAAAATACCAAGAAAGTAATCCT CCGATAGAGAGCTTCTACAGCTGGGACAGCAGTTGAGGAGTACCATTCCAACGGGGTCTG attgctggtaatcagaatactgcgggccaaaaaaggtacagitccacctttagtctctac AGTCAATGGATATCGATCACACAGTCTCAGTAGATCATCCCACGGCAGCCAGCCATAAAA GTCATGAATAACAACCACTrCTTCACCATGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGG TTTCCAGTATGTGGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCAlKtfGCinifACCACACCC AGGTGGCCCCACAATGACGTGTACAlTGGTCTTCCAATCACGCTfC^GCATnTCCCGCT CACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCGG 9/11 Fig, 9 aGTACCTCCGTGGATTGTTCTCCAGCàGTCTTCCMAATTGCAAAGTAGTAATCCTCCGA tagagagcttctacagctgggacagcagttgaggagtaccattcctggggggcctgattg CTGGTAATCAAAAIACTGCGGGCCAAAAAAGGMCAGTACCCCCTTTAGTCTCTACAGTC mtggataccggtcacacagtctcagtagatcatcccaaggtaaccagccataaaaatca TCCAAAACAACAACTTCTTCTGCATGATA^CCATCCCACCACTTATTTCTACTAGGCTTC CAGTAGGTGTCCCTAGGCTCAGCAAAATTACGGGCCCACTGGeTCTTCCCACAACCGGGC GGGCCCACTATGACGTGTACAGCTGTCTTCCAATCACGCTGCTCCATCTTCCCGC^CACT TTCAAAAGTrCAGCCAGCCCGCGGAAATTTCXCACATACGTTACAGOAAACTGCPCGGCT ACAGTCACCAAAGACCCCGTCTCCAAAAGGGTACTCACAGCAGTAGACAGGTCGCTGCGC TTCCCCTGGTTCCGCGGAGCTCCACACTCGATAAGTATGTGGCCTTCTTfACTGCAGTAT TCTTTATTCTGCTGGTCGGTTCCTTTCGCrTTCTCGATGTGGCAGCGGGCACCAAAATAC CACTTCACCTTGTTAAAAGTCTGCTTCT^AGCAftAATTCGCAAACCCCTGGAGGTGAGGA GTTCTACCCTCTTTCCAAACCTTCCTCGCCACAAACAAAATAATCAAAAAGGGAGATTGGA AGCTCCCGTATTTTGTTT^TCTCCTCCTCGGAAGGATTÂTTAAGGGTGAACACCCACCTC TTATGGGGTTGCGGGCCGCTTTTCTTGCTTGGCATTTTCACTGACGCTGCCGAGGTGCTG ccgctgccgaagtgcgctggtaatactacagcagcgcacttctttcacttttataggatg ACGmTCCAAGGAGGCGTTACCGCAGAAGAAGACACCGCCCCCGÇAGCCATCTTGGCCAG ATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAA AATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGGCTACCACA GTCAGAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTTAATATTGACGACTTTGTTCCC CCGGGAGGGGGGA<^MCAAAATCTCTATACCCTTTGASTACTACAGAATàAGAAAGGTT AAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCCATCACCCAGGGTGATAGGGGAGTGGGCTCCACT GCTGTTATyCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACSGCCCTKKCCTATGACCCATAT GTAAAGTACTCCTCCCGCCATACAATCCCCCAACCCTTCTCCTACCACTCCCGTTACTTC ACàCCCAAACCTGTTCTTGACTCCACCATTGATTACTTCCAACCAAATAACAAAAGGAAT CAGCTTTGGATGAGGCTACAAACCÍCrAGAAAÍGTGGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCG TTCGAAAACAGTATATACGACCAGGACTACAA^ATCCGTGTAACCATGTATGÍACAAtTC AGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAAACCCTAAATGAATAAAAATAAAAACCAT TACGATGTGATAACAAAAAAGACTCAGTAATTTATTTTATATGGGAAAAGGGCACAGGG^ GGGTCCACTGCTTCAAATCGGCCTTCGGGTàCC 10/11 Fíg. 10 ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGCAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGC ÇAGATCCXCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCÇACÇCCCGCCAÇCGCTACCGTTGGAGAAGG AAAAATGGCATCXTCAACACCCGCCTCrCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGGCTACC ACAGfCAGAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGAXGAGATXTAAXATTGACGACTTTGTT CCCCCGGGAGGGGGGACCMCAAAATCTCTATACCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAG GTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCCATCACCCAGGGTGATAGGGGAGTGGGCTCC ÃCTGCTGTTATXCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCrAACCTAXGACCCA TATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACAATCCCCCAACCCTTCTCCTACCACTCCCGTTAC TTCACACCCAAÂCCÍGTXCXXG&CTCCAcCATXGAXXACPTCCAAGCAAAXAÀCAAAAGG AAXCAGCTTTGGATGAGGCTACAAACCTCTAGAAATGTGGACCACGTAGGCCTCGGCACT GCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGACTACAAXATCCGTGTAACCATGXATGTACAA TXCAGAGAATTXAATdTAAAGACCCCCCACTTAAACCCXAA 11/11 Fig. Π HTYPRHRYRfíRRHRPRSHLGQILRRR^WLVííPRHRYRííRRKNGIFMTRLSRTFGYrVKAT TVRTPSWAVDKMRFWIDDFVPPCGGTNKISIPFEYYRIHKVKVEFWPCSPITQeDRGVÔS TAVlLDDNFVtKATAIiTYDPYVHYSSRHTXPQPFSYKSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKíí KQLWMRLQTSRNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRV^n^YVQFREFNLKDPPLKP* * codão de terminação da tradução