BRPI0214919B1 - molécula de ácido nucléico quimérico infecciosa de circovírus suíno (pcv-12), vetor viral ou plasmídeo contendo a dita molécula, célula hospedeira adequada, circovírus suíno quimérico infeccioso avirulento, processo para produção de produto polipeptídico imunogênico, produto assim obtido, vacina viral, processo para preparação da dita molécula, clone de dna molecular do pcv2 infeccioso, plasmídeo ou vetor viral biologicamente funcional contendo o dito clone, molécula de ácido nucléico quimérica recíproca infecciosa do pcv2-1, bem como uso dos ditos clones - Google Patents

molécula de ácido nucléico quimérico infecciosa de circovírus suíno (pcv-12), vetor viral ou plasmídeo contendo a dita molécula, célula hospedeira adequada, circovírus suíno quimérico infeccioso avirulento, processo para produção de produto polipeptídico imunogênico, produto assim obtido, vacina viral, processo para preparação da dita molécula, clone de dna molecular do pcv2 infeccioso, plasmídeo ou vetor viral biologicamente funcional contendo o dito clone, molécula de ácido nucléico quimérica recíproca infecciosa do pcv2-1, bem como uso dos ditos clones Download PDF

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BRPI0214919B1 BRPI0214919A BR0214919A BRPI0214919B1 BR PI0214919 B1 BRPI0214919 B1 BR PI0214919B1 BR PI0214919 A BRPI0214919 A BR PI0214919A BR 0214919 A BR0214919 A BR 0214919A BR PI0214919 B1 BRPI0214919 B1 BR PI0214919B1
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Abstract

"clones de dna infecciosos quiméricos, circovírus suíno quiméricos e usos dos mesmos". a presente invenção refere-se a clones de dna infecciosos, a clones de dna quimérico do circovírus suíno (pcv), a vacinas e meios de proteção de porcos contra a infecção viral ou a síndrome de desgaste multisistêmico pós-desmame (pmws) causada pelo pcv2. o novo clone de dna infeccioso quimérico e seu derivado, um vírus quimérico virulento são construídos partindo do pcv1 não patogênico em que o gene orf imunogênico do pcv2 patogênico substitui um gene do pcv1 não patogênico, preferencialmente na mesma posição. o vírus quimérico mantém vantajosamente o fenótipo não patogênico do pcv1 mas ativa respostas imunológicas específicas contra o pcv2 patogênico. a invenção abrange ainda os produtos da expressão de polipeptídeos imunogênicos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO QUIMÉRICO INFECCIOSA DE CIRCOVÍRUS SUÍ- NO (PCV-12), VETOR VIRAL OU PLASMÍDEO CONTENDO A DITA MO- LÉCULA, CÉLULA HOSPEDEIRA ADEQUADA, CIRCOVÍRUS SUÍNO QUIMÉRICO INFECCIOSO AVIRULENTO, PROCESSO PARA PRODU- ÇÃO DE PRODUTO POLIPEPTÍDICO IMUNOGÊNICO, PRODUTO ASSIM
OBTIDO, VACINA VIRAL, PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DA DITA MOLÉCULA, CLONE DE DNA MOLECULAR DO PCV2 INFECCIOSO, PLASMÍDEO OU VETOR VIRAL BIOLOGICAMENTE FUNCIONAL CON- TENDO O DITO CLONE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO QUIMÉRICA
RECÍPROCA INFECCIOSA DO PCV2-1, BEM COMO USO DOS DITOS CLONES”.
Referências Cruzadas aos Pedidos de Patente U.S. Relacionados Este pedido de patente não provisório reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/424.840, de- positado em 8 de novembro de 2002, que reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/340.775, depo- sitado em 12 de dezembro de 2001. Os dois pedidos de patente anteriores são incorporados aqui como referência em sua totalidade.
Relatório em Relação á Pesquisa Patrocinada pelo Governo Referência a uma "Listagem de Seqüência" O material em um único disco compacto contendo um arquivo de Listagem de Seqüência fornecido neste pedido de patente é incorporado como referência. A data de criação é__de 2003 e o tamanho é de apro- ximadamente __________________________.
Fundamento da Invenção Campo da Invenção A presente invenção refere-se aos clones de DNA do circovírus suíno infeccioso do tipo-1 (PCV1) e do tipo-2, aos clones de DNA infecciosos PCV1-2 e aos vírus quiméricos vivos derivados dos clones de DNA quiméri- cos, úteis como vacinas.
Descrição da técnica Relacionada Todas as patentes e publicações citadas neste relatório descriti- vo são incorporadas aqui como referência à sua totalidade. O circovírus suíno (PCV) foi originalmente isolado como um contaminante de cultura de células de uma linhagens de células renais suí- nas PK-15 (I. Tischer e outros, "A very small porcine virus with circular sin- gle-strande DNA", Nature 295:64-66 (1982); I. Tischer e outros, "Characteri- zation of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines", Zantralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2):153-167 (1974)). O PCV é um vírus não envelopado icosaédrico que contém um genoma de DNA cir- cular de filamento único de aproximadamente 1,76 kb. O PCV é classificado na família Circoviridae, que consiste de três outros circovírus animais (vírus da anemia da galinha (CAV), vírus da doença de bico e de penas de psitasí- deo (PBFDV) e o circovírus de columbiformes recentemente descoberto de pombos (CoCV)) e três circovírus vegetais (vírus de topo do cacho de bana- na, vírus da queda foliar do coco e vírus de definhamento de trevo (clover stunt) subterrâneo) (M. R. Bassami e outros, "Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and chicken anemia virus", Virology 249:453- 459 (1998); J. Mankertz e outros, "Transcription analysis of porcine circovirus (PCV)", Virus Genes 16:267-276 (1998); A. Mankertz e outros, "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons", Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000); B. M. Meehan e outros, "Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plante circoviruses", J. Gen. Virol. 78:221-227 (1997); B. M. Meehan e outros, "Characterization of novel circo- virus DNAs associated with wasting syndromes in pigs", J. Gen. Virol. 79:2171-2179 (1998); D. Todd e outros, "Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes", Arch. Virol. 117:129-135 (1991)). Os membros dos três circovírus animais reconhecidos anterior- mente (PCV, CAV e PBFDV) não compartilham homologia de seqüências de nucleotídeos ou determinantes antigênicos um com os outros (M. R. Bassa- mi e outros, 1998, supra; D. Todd e outros, 1991, supra). O genoma do CoCV recentemente identificado compartilhava aproximadamente 40% de identidade de seqüências de nucleotídeos com o do PCV (A. Mankertz e ou- tros, "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovi- rus from pigeons", Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000)). Recentemente, um novo circovirus humano com um genoma circular, denominado como um vírus transmitido por transfusão ou vírus TT (TTV), foi identificado de indiví- duos associados com a hepatite pós-transfusão (H. Miyata e outros, "Identi- fication of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus", J. Virol. 73:3582-3586 (1999); T. Nishizawa e outros, "A novel DNA virus (TTV) as- sociated with elevated transaminase leveis in posttransfusion hepatitis of unknown etiology", Biochem. Biophys. Res. Commun. 241:92-97 (1997)).
Adicionalmente, um minivírus similar ao TTV humano (TLMV) foi identificado partindo de doadores de sangue normais (P. Biagini e outros, "Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates", J. Gen. Virol. 82: 379-383 (2001); K. Takahashi e outros, "Identification of a nem human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus", Arch. Virol. 145:979-93 (2000)) e um terceiro circovirus humano novo, conhecido como o vírus SEN (SENV), foi também descoberto partindo de humanos com hepa- tite pós-transfusão (T. Umemura e outros, "SEN virus infection and its relati- onship to transfusion-associated hepatites", Hepathology 33:1303-1311 (2001)). A organização genômica tanto do TTV quanto do TLMV humanos é similar à do CAV (P. Biagini e outros, 2001, supra; H. Miyata e outros, 1999, supra; K. Takahashi e outros, 2000, supra). Embora os anticorpos para o PCV tenham sido encontrados em várias espécies de animais incluindo se- res humanos, camundongos, gado e porcos (G. M. Allan e outros, "Producti- on, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus", Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994); G. C.
Dulac e A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evídence of antibodies to circovirus in Canadian pigs", Can. J.
Vet. Res. 53:431-433 (1989); S. Edwards e J. J. Sands, "Evidence of cirovi- rus infection in British pigs", Vet. Rec. 134:680-1 (1994); J. C. Harding e E. G. Clark, "Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)", Swine Health and Produtcion 5:201-203 (1997); R. K.
Hines e P. D. Lukert, "Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States", Swine Health and Production 3:71-73 (1995); G. P. Nayar e outros, "Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses", Can. Vet. J. 40:277-278 (1999); I. Tischer e outros, "Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of diffe- rent breeding farms", Arch. Virol. 140:737-743 (1995); I. Tischer e outros, "Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle", Arch. Virol. 140:1427-1439 (1995)), sabe-se pouco em re- lação à patogênese do PCV nestas espécies de animais. A infecção experi- mental de porcos com o PCV derivado de células PK-15 não produziu doen- ça clínica e assim, este vírus não considerado patogênico aos porcos (G. M.
Allan e outros, "Pathogenesis of porcine circovirus, experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material", Vet. Mi- crobiol. 44:49-64 (1995); I. Tischer e outros, "Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus", Arch. Virol. 91:271-276 (1986)). O PCV não patogênico derivado da linhagem de células PK-15 foi denominado de circovirus suíno do tipo 1 ou PCV1. A síndrome de desgaste multissistêmico pós-desmame (PMWS), foi descrita primeiro em 1991 (J. C. Harding e E. G. Clark, 1997, supra), é uma doença complexa dos leitões desmamados que está se tornando de forma crescente mais espalhada. Com a ameaça de um impacto econômico sério potencial sobre a indústria suína, se tomou urgente o desenvolvimento de uma vacina contra o PCV2, o agente causador primário da PMWS. A PMWS afeta principalmente os leitões entre 5-18 semanas de idade. Os si- nais clínicos da PMWS incluem a perda de peso progressiva, a dispnéia, a taquipnéia, a anemia, a diarréia e a icterícia. A taxa de mortalidade pode va- riar de 1% até 2% e até 40% em alguns casos complicados no Reino Unido (M. Muirhead, "Sources of Information on PMWS/PDNS", Vet. Rec. 150:456 (2002)). As lesões microscópicas características da PMWS incluem a pneu- monia intersticial granulomatosa, a linfadenopatia, a hepatite e a nefrite (G. M. Allan e J. A. Ellis, "Porcine circoviruses: a review", J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000); J. C. Harding e E. G. Clark, 1997, supra). A PMWS foi agora reconhecida em porcos no Canadá, nos Estados Unidos (G. M. Allan e ou- tros, "Novel porcine circovirus from pigs with wasting disease syndromes", Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan e outros, "Isolation of porcine cir- covirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Euro- pe", J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan e J. A. Ellis, 2000, su- pra; J. Ellis e outros, "Isolations of circovirus from lesions of pigs with pos- tweaning multisystemic wasting syndrome", Can. Vet. J. 39:44-51 (1998); A. L. Hamel e outros, "Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs", J. Virol. 72:5262- 5267 (1998); M. Kiupel e outros, "Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana, "Vet. Pathol. 35:303-307 (1998); R. Larochelle e ou- tros, "Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR", Vet. Rec. 145:140-142 (1999); B. M. Me- ehan e outros, 1998, supra: I. Morozov e outros, "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndro- me", J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)), na maior parte dos países da Europa (G. M. Allan e outros, "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe", J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan e J. A. Ellis 2000, supra; S. Edwards e J. J.
Sands, 1994, supra; S. Kennedy e outros, "Porcine circovirus infection in Northern Ireland", Vet. Rec. 142:495-496 (1998); A. Mankertz e outros, "Cha- racterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France", Virus Res. 66:65-77 (2000); C. Roseli e outros, "Identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropaty syndrome." Vet. Rec. 146:40-43 (2000); P. Spillane e outros, "Porcine circovirus infection in the Republic of Ireland", Vet. Rec. 143:511-512 (1998); G. J. Wellenberg e ou- tros, "Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-weaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands", Vet. Quart. 22:167-72 (2000)) e em alguns países da Ásia (C.
Choi e outros, "Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Ko- rean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polimerase chain reaction", J. Vet. Diagn. Invest. 12:151-153 (2000); A.
Onuki e outros, "Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan", J. Vet. Med. Sei. 61:1119-1123 (1999)). A PMWS possui potencial mente um impacto econômico grave sobre a indústria suína por todo o mundo. O agente causador primário da PMWS é uma cepa patogênica de PCV denominado de circovirus suíno do tipo 2 ou PCV2 (G. M. Allan e outros, "Novel porcine circoviruses form pigs with wasting disease syndro- mes", Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan e outros, "Isolation of porci- ne circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe", J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan e outros, "Isolation and characterization of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Nothern Ireland", Vet. Microbiol. 66:115-23 (1999); G. M. Allan e J. A. Ellis, 2000, supra; J. Ellis e outros, 1998, supra-, A. L. Hamel e outros, 1998, supra; B. M. Meehan e outros, 1998, supra; I. Morozov e ou- tros, 1998, supra). A seqüência genômica completa do PCV2 associado à PMWS foi determinada (M. Fenaux e outros, "Genetic characterization of type 2 porcine circoviruses (PCV-2) from pigs with postweaning multisyste- mic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differencial PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2", J. Clin. Microbiol. 38:2494-503 (2000); A. L. Hamel e outros, 1998, supra; J.
Mankertz e outros, 1998, supra-, B. M. Meehan e outros, 1997, supra; B. M.
Meehan e outros, 1998, supra; I. Morozov e outros, 1998, supra). O PCV1 é ubíquo em porcos, mas não é patogênico aos porcos.
Em contraste, o PCV2 relacionado geneticamente é patogênico e causa PMWS em porcos. A análise de seqüência revela que o PVC2 relacionado com a PMWS compartilha apenas aproximadamente 75% da identidade de seqüência de nucleotídeos com o PCV1 não patogênico. O gene ORF2 de ambos o PCV1 não patogênico e do PCV2 patogênico codifica a proteína de capsídeo viral imunogênica principal (P. Nawagitgul e outros, "Modified indi- rect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF-2)-based Elisa for the detection of antibodies to PCV", Immunol. Clin.
Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002); P. Nawagitgul e outros, "Open reading fram 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein", J. Gen.
Virol. 81:2281-2287 (2000)).
As tentativas iniciais de reproduzir a PMWS clínica em porcos convencionais através da inoculação do PCV2 não foram bem-sucedidas (M.
Balasch e outros, "Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome", J. Comp. Pathol. 121:139-148 (1999); M. Fenaux e outros, "Cloned Genomic DNA of Type 2 Porcine Circovirus (PCV-2) Is Infectious When Injected Direc- tly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinicai Diseases, Virus Distribution, and Pathologic Lesions", J. Virol. 76:541-551 (2002)). A reprodução experimental da PMWS clínica em porcos gnotobióti- cos e em porcos convencionais com homogenados de tecidos provenientes de porcos com a PMWS que ocorre naturalmente e com o PCV2 propagado através de culturas de células produziu resultados mistos. A PMWS clínica foi reproduzida em porcos gnotobióticos (SPF) e privados de colostro e por- cos derivados de cesariana co-infectados com o PCV 2 e o parvovírus suíno (PPV) (G. M. Allan e outros, "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovi- rus", J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); S. Krakowka e outros, "Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus", Vet. Pathol. 37:254-263 (2000)) e em porcos gnotobióticos inoculados com o PCV-2 quando seu sistema imunológico foi ativado através da hemocianina do buraco da fechadura em adjuvante de Freund incompleto (S. Krakowka e outros, "Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2)", Vet. Pathol. 38:31-42 (2001)). A PMWS clínica foi também reproduzida em porcos derivados de cesariana/privados do colostro (CD/CD) inoculados apenas com o PCV2 (P.
A. Harms e outros, "Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus", Vet. Pathol. 38:528-539 (2001)) e em porcos convencionais co-infectados com o PCV2 e o parvovírus suíno (PPV) ou o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV) (A. Rivora e ou- tros, "Experimental inpculation of conventional pigs with procine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2", J. Virol. 76: 3232- 3239 (2002)). Nos casos da co-infecção com PRRSV/PCV2, os sinais pato- lógicos característicos da PMWS tais como a eliminação linfóide, a inflama- ção granulomatosa e a hepatite necrosante são induzidos pelo PCV2 e não pelo PRRSV (P. A. Harms e outros, 2001, supra). Entretanto, a PMWS clíni- ca não foi reproduzida em porcos gnotobióticos infectados apenas com a PCV2 (G. M. Allan e outros, "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respi- ratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication", Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan e outros, "A sequential study of experi- mental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: im- munostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan e outros, "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); M. Balasch e outros, 1999, supra; J. Ellis e outros, "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets", J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); S.
Kennedy e outros, "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus" J. Comp. Pathol. 122:9-24 (2000); S. Krakowka e outros, 2001, supra; S. Krakowka e outros, 2000, supra; R. M. Pogranichnyy e outros, "Characterization of immune res- ponse of young pigs to porcine circovirus type 2 infections", Viral Immunol. 13:143-153 (2000). Os inóculos virais utilizados nestes estudos eram homo- genados de tecidos provenientes de porcos com PMWS naturalmente ocor- rente ou vírus propagado em culturas de células PK-15 (G. M. Allan e outros, "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication", Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan e outros, "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostainig of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan e outros, "Experi- mental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus", J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); M. Balasch e outros, 1999, supra; J. Ellis e outros, 1999, supra\ S. Kennedy e outros, 2000, supra; S. Krakowka e outros, 2001, supra\ S. Krakowka e outros, 2000, supra; R. M. Pogranichnyy e outros, 2000, supra). Uma vez que os homogenados de tecidos podem conter outros agentes suínos co- muns tais como o PPV e o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV) (G. M. Allan e outros, "Experimental infection of colostrums depri- ved piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication", Arch.
Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan e outros, "Experimental reproducti- on of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus", J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); G. M. Allan e J. A. Ellis, 2000, supra; J. A. Ellis e outros, "Coinfection by porcine circovirus and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisys- temic wasting syndrome", J. Vet. Diagn. Invest. 12:21-27 (2000); C. Roseli e outros, 2000, supra) e uma vez que a linhagem de células PK-15 da ATCC utilizada para a propagação do PCV2 foi persistentemente infectada com o PCV1 (G. C. Dulac e A. Afshar, 1989, supra), a doença clínica e as lesões patológicas reproduzidas nestes estudos podem não ser atribuídas exclusi- vamente à infecção por PCV2 (G. M. Allan e outros, "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 re- plication", Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan e outros, "A se- quential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation", J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan e outros, "Experimental reproducti- on of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus", J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); G. M. Allan e J. A. Ellis, 2000, supra; J. A. Ellis e outros, 2000, supra). A PMWS clínica também foi reproduzida em porcos CDCD ino- culados com PCV2 quando vacinados com Mycoplasma hyopneumoniae (G. M. Allan e outros, "Immunostimulation, PCV-2 and PMWS", Vet. Rec. 147:171-172 (2000)). Dois estudos de campo recentes por G. M. Allan e ou- tros, "Neonatal vaccination for Mycoplasma hyopneumoniae and postwea- ning multisystemic wasting syndrome: a field trial", Pig J. 48:34-41 (2001) e S. C. Kyriakís e outros, "The effects of immuno-modulation on the clinicai and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome", J.
Comp. Pathol. 126:38-46 (2002), testaram o efeito da modulação imunológi- ca através da vacina com Mycoplasma hyopneumoiae sobre o desenvolvi- mento da PMWS em rebanhos endêmicos e exibiram um decréscimo signifi- cativo nos casos de PMWS em grupos não vacinados comparados com os animais vacinados. Entretanto, um outro estudo recente utilizando leitões SPF convencionais sob condições de laboratório controladas não pode re- produzir tal efeito, sugerindo que as vacinações com M. hyopneumoiae po- deríam influenciar potencialmente no desenvolvimento da PMWS clínica, mas é evidentemente uma função secundária a uma infecção por PCV2.
Com base nestes e em outros estudos, o PCV2 é todavia considerado como sendo o agente causador primário, mas não o exclusivo da PMWS. A falta de um estoque de vírus infeccioso de uma forma biologi- camente pura do PCV2 impediu o entendimento da patogênese do PCV2 e a função etiológica do PCV2 na PMWS. Não foi mostrado de forma coerente que as vacinações contra o PPV e possivelmente o PRRSV previnem o iní- cio da PMWS em porcos infectados com PCV2. Conseqüentemente, a des- coberta de uma vacina potente e ainda segura que se direciona especifica- mente à PMWS foi difícil. Há uma necessidade definida reconhecida na téc- nica no campo da veterinária de produzir uma vacina segura eficiente contra as infecções do PCV2 e a PMWS. A Patente U.S. N° 6.287.856 (Poet e outros) eoWO 99/45956 referem-se aos ácidos nucléicos do vírus da doença de bico e de penas psi- tacídio (BFDV), um circovírus que infecta espécies de aves e do circovírus suíno (PCV). A patente propõe composições vacinais que compreende o DNA ou o mRNA nu e divulga um vetor de ácido nucléico para a expressão transitória do PCV em uma célula eucariótica que compreende uma seqüên- cia reguladora da transcrição ou da tradução que atua em cis derivada do promotor ou do intensificador de genes intermediários ou iniciais do citome- galovírus humano ligado funcionalmente a um ácido nucléico da seqüência.
Entretanto, uma vez que o DNA do PCV é derivado exclusivamente da li- nhagem de células PK-15, é provável que compreende o PCV1 não patogê- nico descoberto a aproximadamente 30 anos atrás por I. Tischer e outros, 1974, supra e, portanto, não é provável que seja eficiente na ativação de uma reação imunológica ao PCV2 ou a infecções causadas pelo PCV2. As vacinas de subunidades de proteínas recombinantes constituídas de vetores que compreendem quadros abertos de leitura são também sugeridas na pa- tente, mas os quadros abertos de leitura do PCV não são bem caracteriza- dos ou distinguidos um dos outros. Uma vez que a fonte do DNA do PCV é as células PK-15, as proteínas constituídas destes vetores que compreende os quadros abertos de leitura do PCV1 não possuiríam propriedades imuno- gênicas confiáveis, se alguma, contra o PCV2. A Patente U.S. N° 6.217.883 (Allan e outros) e a Patente Fran- cesa N° 2.781.159B referem-se ao isolamento de cinco cepas do PCV pro- venientes de amostras pulmonares ou ganglionares tiradas de porcos infec- tados com a PMWS no Canadá, na Califórnia e na França (Brittany) e ao seu uso em combinação com pelo menos um antígeno de parvovírus suíno em composições imunogênicas. As proteínas codificadas pelos quadros abertos de leitura (ORF) do PCV2 que consistem do ORF1 e do ORF13 são ampla- mente descritas na patente, mas não há exemplos de qualquer proteína es- pecífica que exiba as propriedades imunogênicas. A patente descreve ainda vetores que consistem de plasmídeos de DNA, de moléculas de DNA linea- res e de vírus recombinantes que contêm e expressam in vivo uma molécula de ácido nucléico que codifica o antígeno do PCV. Várias outras referências, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.391.314 B1; a Patente U.S. N° 6.368.601 B1; a Patente Francesa N° 2.769.321; a Patente Francesa N° 2.769.322; WO 01/96377 A2; WO 00/01409; WO 99/18214; WO 00/77216 A2; WO 01/16330 A2; WO 99/29871; etc., também descrevem a administração de polipeptí- deos do PCV1 ou do. PCV2 ou os ácidos nucléicos que codificam os poli- peptídeos de várias cepas.
Entretanto, o PCV1 não patogênico não será útil contra as infec- ções por PCV2 e provavelmente as cepas de PCV2 patogênicas descritas na técnica, mesmo se atenuadas, têm valor limitado por causa da tendência usual de um vírus vivo se reverter em seu estado virulento. Portanto, há ain- da uma necessidade antiga na técnica de um antígeno não patogênico in- feccioso vivo para a inoculação de porcos contra uma infecção grave ou a PMWS causada pelo PCV2 que seja eficiente e permaneça seguro nas vaci- nas veterinárias. Estas metas são satisfeitas através da construção do novo circovírus suíno quimérico vivo descrito aqui, que é baseada na estrutura fundamental genômica do PCV1 não patogênico isolado por I. Tischer e ou- tros a quase 30 anos atrás. O novo circovírus suíno quimérico da presente invenção é capaz de satisfazer a necessidade antiga por manter exclusiva e vantajosamente o fenótipo não patogênico do PCV1, mas ativar uma res- posta imunológica específica contra o PCV2 patogênico.
Breve Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a clones de DNA quiméricos in- fecciosos do circovírus suíno (PCV) e a vírus quiméricos derivados dos clo- nes de DNA que são úteis como vacinas. Os novos vírus geneticamente avi- rulentos quiméricos vivos são produzidos partindo da estrutura genômica do PCV1 em que um gene imunogênico de uma cepa de PCV2 patogênica substitui um gene do PCV1, tipicamente na mesma posição correspondente. A invenção abrange os plasmídeos biologicamente funcionais, os vetores virais e similares que contêm as novas moléculas de ácidos nucléicos re- combinantes descritas aqui, células hospedeiras adequadas transfectadas pelos vetores que compreendem o DNA e os produtos da expressão de poli- peptídeos imunogênicos. Ainda está incluído dentro do âmbito da presente invenção um novo método de proteção de porcos contra a infecção viral ou a síndrome de desgaste multisisstêmica pós-desmame (PMWS) causada pelo PCV2 que compreende a administração a um porco que necessita de tal proteção de uma quantidade imunologicamente eficiente de uma vacina que compreende, por exemplo, o DNA quimérico clonado em um plasmídeo, um vírus quimérico derivado do clone de DNA quimérico, os produtos polipeptí- dicos expressos do DNA descrito aqui etc. A invenção fornece ainda um novo DNA molecular de PCV2 infeccioso e clones de DNA quiméricos recí- procos do PCV que encontram uso como modelos experimentais na obten- ção ou na caracterização de novas vacinas virais avirulentas.
Breve Descrição dos Desenhos O fundamento da invenção e seu desvio da técnica serão adici- onalmente descritos aqui abaixo com referência aos desenhos em anexo, em que: A figura 1 representa a construção de um clone de DNA mole- cular do PCV2 infeccioso. As posições relativas do par de iniciadores utiliza- do para amplificar o genoma completo do PCV2 são indicados através das setas (iniciador inverso PCVSAC2, iniciador para frente PCVSAC2). O DNA genômico do PCV2 amplificado através da PCR é digerido com a enzima de restrição Sacll e é purificado. O DNA genômico purificado e digerido com Sacll é ligado para formar concatâmeros. Os concatâmeros ligados são se- parados através de eletroforese em gel, o dímero genômico em série do PCV2 é purificado e clonado no vetor pSK que é pré-digerido com a enzima Sacll para produzir um clone de DNA de PCV2 molecular.
As figuras 2A e 2B ilustram que o DNA do plasmídeo PCV2 clo- nado é infeccioso quando transfectado in vitro em células PK-15. A figura 2A mostra a detecção do antígeno de PCV2 através do ensaio de imunofluores- cência (IFA) em células PK-15 transfectadas com o DNA plasmideal do PCV2 clonado. A marcação imunológica intensa do antígeno do PCV2 é vi- sualizada no núcleo e até um menor grau, no citoplasma das células trans- fectadas. A figura 2B mostra células PK-15 com transfecção falsa. A figura 3A mostra os pulmões de um porco inoculado através da rota intralinfóide com o DNA do PCV2 a 21 DPI. Os pulmões são flexí- veis, falharam até o colapso e são castanhos avermelhados manchados. Os nodos linfáticos traqueobronquiais estão notavelmente alargados e casta- nhos (setas). A figura 3B representa uma secção microscópica de um pul- mão normal de um porco de controle (25X). A figura 3C representa uma sec- ção microscópica do pulmão do porco da figura 3A. Observar a inflamação linfo-histiocítica peribronquiolar e a bronquilote necrosante suave (25X). A figura 3D ilustra a coloração imuno-histoquímica do pulmão da figura 3A.
Observar o antígeno do PCV2 nos macrófagos (setas) e nas células simila- res a fibroblastos (pontas de setas) ao redor das vias aéreas (64X). A figura 4A mostra um nodo linfático normal de um porco de controle. Observar os folículos linfóides bem definidos (setas) (25X). A figura 4B representa uma secção microscópica do nodo linfático traqueobronquial do porco da figura 3A inoculado 21 dias antes através da rota intralinfóide com o DNA genômico do PCV2 clonado. Os folículos linfóides são fraca- mente definidos, há uma deleção linfóide de suave a moderada e uma infla- mação granulomatosa multifocal suave (25X). A figura 4C representa uma secção microscópica do nodo linfático da figura 4B em um aumento maior focalizando um dos folículos. Observar o folículo fracamente definido com macrófagos e células gigantes (seta) substituindo os linfócitos foliculares (64X). A figura 4D ilustra a detecção imuno-histoquímica do antígeno do PCV2 no mesmo nodo linfático que o da figura 4B em macrófagos (setas) e células gigantes (pontas de setas pequenas) e células similares aos dendri- tos (pontas de setas grandes) nos folículos (64X). A figura 5 ilustra a construção de um clone de DNA quimérico PCV1-2 (PCV1/PCV2) com o genoma do PCV1 não patogênico carregando o gene de capsídeo ORF2 imunogênico do PCV2 patogênico. O clone de DNA dimerisado é utilizado para a transfecção in vitro das células PK-15 para produzir vírus quimérico vivo expressando a proteína ORF2 do PCV2 e para experimentos animais in vivo para confirmar a atividade. A figura 6 representa a construção e a organização do PCV1, do PCV2 infecciosos, do PCV1-2 quimérico e dos clones de DNA moleculares PCV2-1 quiméricos recíprocos. O clone de DNA do PCV2 é construído atra- vés da ligação de dois genomas do PCV2 lineares de comprimento completo em série no vetor Bluescript SK (pSK) através dos métodos gerais descritos anteriormente (M. Fenaux e outros, 2002, supra). O clone de DNA do PCV1 é construído através da ligação de dois genomas do PCV1 lineares de com- primento completo em série no vetor pSK. O clone de DNA PCV1-2 quiméri- co é construído substituindo o gene de capsídeo ORF2 do PCV1 pelo do PCV2 na estrutura genômica do PCV1 não patogênico. O clone de DNA PCV2-1 quimérico recíproco é construído substituindo o gene de capsídeo ORF2 do PCV2 patogênico pelo do PCV1 não patogênico na estrutura ge- nômica do PCV2 patogênico no vetor pSK. Ambos os clones quiméricos são dímeros no vetor pSK. As setas representam as localizações relativas dos iniciadores da PCR para a detecção da viremia do PCV1, do PCV2, do PCV1-2 e do PCV2-1 em animais inoculados.
As figuras 7A-7J demonstram que os clones de DNA do PCV1, do PCV2, do PCV1-2 quimérico e do PCV2-1 quimérico recíproco são infec- ciosos e expressam antígenos virais respectivos quando transfectados in vitro nas células PK-15. Os painéis à esquerda (7A, 7C, 7E, 7G e 7I) estão corados com o anticorpo monoclonal contra o ORF2 do PCV1. Os painéis à direita (7B, 7D, 7F, 7H e 7J) estão corados com o anticorpo contra o PCV2.
Os painéis 7A e 7B são células PK-15 transfectadas de forma falsa. Os pai- néis 7C e 7D são células PK-15 transfectadas com o clone de DNA do PCV1. Os painéis 7E e 7F são células PK-15 transfectadas com o clone de DNA do PCV2. Os painéis 7G e 7H são células PK-15 transfectadas com o clone de DNA do PCV1-2 quimérico. Os painéis 7I e 7K são células PK-15 transfectadas com o clone de DNA do PCV2-1 quimérico recíproco. A figura 8 representa a seqüência de DNA de comprimento completo do DNA molecular do PCV2 clonado (que corresponde à SEQ ID N°: 1). A figura 9 representa a seqüência de DNA de comprimento completo do DNA do PCV1-2 quimérico clonado (que corresponde à SEQ ID Ν°: 2). A figura 10 representa a seqüência de DNA do gene de capsí- deo ORF2 imunogênico do DNA do PCV1-2 quimérico clonado (que corres- ponde à SEQ ID N°: 3). A figura 11 representa a suposta tradução de aminoácidos do gene de capsídeo ORF2 imunogênico do DNA do PCV1-2 quimérico (que corresponde à SEQ ID N°: 4).
Descrição Detalhada da Invenção De acordo com a presente invenção, são fornecidas moléculas de ácidos nucléicos moleculares e quiméricos infecciosos de circovírus suíno (PCV), vírus quiméricos vivos produzidos partindo da molécula de ácido nu- cléico quimérico e vacinas veterinárias para proteger porcos da infecção viral ou da síndrome de desgaste multissistêmico pós-desmame (PMWS) causa- da pelo PCV2. A invenção fornece ainda produtos da expressão de poli- peptídeos imunogênicos que podem ser utilizados como vacinas.
A nova molécula de DNA quimérica infecciosa avirulente do PCV (PCV1-2) compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um PCV1 não patogênico infeccioso que contém um gene de quadro aberto de leitura (ORF) imunogênico de um PCV2 patogênico no lugar de um gene de ORF no genoma do PCV1. O clone de DNA de PCV1-2 quimérico infeccioso contém preferencialmente o gene de capsídeo imunogênico (ORF2) do DNA do PCV2 clonado na estrutura genômica do clone de DNA de PCV1 não patogênico infeccioso. Geralmente, o gene de capsídeo do DNA do PCV2 substitui o gene ORF2 do DNA do PCV1 na estrutura genômica do PCV1 não patogênico, mas é considerado que tal variedade de permutações de posição pode ser construída através da engenharia genética para a obten- ção de outros clones de DNA quiméricos avirulentos ou atenuados. O clone de DNA do PCV2-1 infeccioso quimérico recíproco entre PCV1 e PCV2 é divulgado como um controle para analisar o clone de PCV1-2 quimérico da invenção e é construído através da substituição do gene de capsídeo do PCV2 pelo do PCV1 na estrutura do clone de DNA infeccioso do PCV2 pa- togênico. Além de ser um modelo experimental, o clone de DNA de PCV2-1 quimérico recíproco pode encontrar uso na produção de vacinas especial- mente projetadas. É mostrado que o DNA genômico clonado do PCV2 descrito aqui é infeccioso in vitro e in vivo quando transfectado em células PK-15 e forne- cido aos porcos. O clone de DNA do PCV2 infeccioso produz lesões patoló- gicas características da PMWS em porcos permitindo uma melhor caracteri- zação da doença clínica e um entendimento da distribuição viral nas células do tecido. Este novo agente patogênico que pode ser facilmente reproduzido presta-se ao desenvolvimento de um programa de vacinação adequado para prevenir a PMWS em porcos. O novo clone de DNA do PCV1-2 quimérico é também infeccioso tanto através da transfecção in vitro de células PK-15 quanto da administra- ção in vivo aos porcos. Nas células PK-15 transfectadas, o clone de DNA do PCV1-2 quimérico expressa o antígeno de capsídeo do PCV2 (a proteína de capsídeo imunogênica do PCV2), enquanto que o clone de DNA do PCV2-1 quimérico recíproco expressa o antígeno de capsídeo do PCV1, que é de- monstrado através do ensaio de imunofluorescência (IFA) utilizando anticor- pos específicos ao antígeno de capsídeo do PCV1 ou do PCV2. A sorocon- versão ao anticorpo específico ao PCV2 é detectada em porcos inoculados com o clone do PCV2 infeccioso assim como com o clone de PCV1-2 quimé- rico. A detecção da soroconversão ao anticorpo específico ao PCV2 esta- belece que o clone de DNA do PCV1-2 quimérico induz o anticorpo específi- co ao PCV2 em porcos infectados e, conseqüentemente, atua para proteger os porcos inoculados da infecção com o PCV2.
Os exemplos abaixo descrevem a avaliação da imunogenicidade e da patogenicidade dos clones de DNA quiméricos em porcos inoculados em maiores detalhes. Basicamente, as soroconversões para os anticorpos contra o antígeno de ORF2 do PCV2 são detectadas em porcos inoculados com o clone de DNA do PCV2 (Grupo 3) e com o clone de DNA do PCV2-1 quimérico recíproco (Grupos 2 e 5, respectivamente) sofrem soro conversão para o anticorpo do PCV1. Os vírus recuperados dos porcos selecionados em cada grupo são parcialmente seqüenciados e confirmados como sendo os clones de DNA infecciosos respectivos autênticos na inoculação. As le- sões grandes e microscópicas em vários tecidos de animais inoculados com o clone de DNA do PCV2 são significativamente mais graves que as encon- tradas em porcos inoculados com os clones de DNA do PCV1, do PCV1-2 quimérico e do PCV2-1 quimérico recíproco.
Surpreendente e vantajosamente, o clone de DNA infeccioso do PCV1-2 quimérico que possui o gene de capsídeo imunogênico (ORF2) do PCV2 patogênico clonado na estrutura genômica do PCV1 não patogênico induz uma resposta de anticorpos específicos para o antígeno de capsídeo do PCV2 patogênico, enquanto mantém a natureza não patogênica do PCV1 em porcos. Os animais inoculados com o clone de DNA infeccioso do PCV1- 2 quimérico desenvolvem uma infecção suave semelhante à dos animais inoculados com o PCV1, enquanto que sofrem soroconversão para o anti- corpo contra a proteína de capsídeo ORF2 do PCV2 patogênico. O período médio de viremia observada em animais inoculados com o PCV1 e com o PCV1-2 quimérico é mais curto, 0,625 semana e 1 semana respectivamente, do que o observado em animais inoculados com o PCV2 patogênico que é de aproximadamente 2,12 semanas. A falta de viremia detectável para o PCV1-2 quimérico em alguns animais inoculados não afeta a soroconversão para o anticorpo contra a proteína de capsídeo ORF2 do PCV2 nos porcos inoculados com o PCV1-2 (Grupo 4). Os resultados indicam que, muito em- bora a viremia para o PCV1-2 quimérico seja curta ou indetectável em al- guns animais inoculados, o vírus PCV1-2 quimérico é capaz de induzir uma resposta de anticorpo contra a proteína de capsídeo ORF2 do PCV2. A ca- pacidade especial do o clone de DNA infeccioso do PCV1-2 quimérico de induzir a resposta imunológica específica para a proteína de capsídeo ORF2 imunogênica do PCV2 patogênico permanece ainda não patogênica para os porcos torna o clone de PCV1-2 quimérico particularmente útil como uma vacina atenuada viva engenheirada geneticamente e outros tipos de vacinas.
As novas moléculas de ácido nucléico purificadas e isoladas desta invenção compreendem a seqüência de DNA de comprimento com- pleto do DNA do PCV1-2 quimérico clonado apresentada na SEQ ID N°: 2, exibida na figura 9 e depositada na American Type Culture Collection sob a Patent Deposit Designation PTA-3912; seu filamento complementar (isto é, os pares de bases inversos ou opostos) ou as seqüências de nucleotídeos que possuem pelo menos 95% de homologia à sequência de nucleotídeos quimérica (isto é, uma parte ativa significativa do gene inteiro). Os métodos convencionais que são bem conhecidos na técnica podem ser utilizados para produzir os filamentos complementares ou as seqüências de nucleotí- deos que possuem homologia alta, por exemplo, através de técnicas de hi- bridização com rigidez padronizada ou alta reconhecidas na técnica. A molé- cula de ácido nucléico purificada e isolada que compreende a seqüência de DNA do gene de capsídeo imunogênico do DNA do PCV1-2 quimérico clo- nado é também apresentada na SEQ ID N°: 3 e na figura 10.
As células adequadas que contêm a molécula de ácido nucléico quimérica produzem exclusiva mente circovírus suínos quiméricos infeccio- sos vivos. O vírus quimérico infeccioso vivo é derivado do clone de DNA quimérico através da transfecção de células PK-15 por transfecções in vitro ou in vivo como é ilustrado aqui. Um exemplo preferido do DNA do PCV1-2 quimérico clonado é a seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID N°: 2 e na figura 9. A invenção prevê ainda que o vírus quimérico é derivado do filamento complementar ou das seqüências de nucleotídeos que possu- em uma alta homologia, pelo menos 95% de homologia, à seqüência de nu- cleotídeos quimérica. São ainda incluídos dentro do âmbito da presente invenção os plasmídeos, os vetores virais biologicamente funcionais e similares que contêm as novas moléculas de ácido nucléico recombinantes descritas aqui, as células hospedeiras adequadas transfectadas pelos vetores que compre- endem os clones de DNA quiméricos e moleculares e os produtos da ex- pressão de polipeptídeos imunogênicos. Uma proteína imunogênica particu- larmente preferida possui a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 4 e na figura 11. As variações biologicamente ativas da mesma são também abrangidas pela invenção. Um perito comum na técnica saberia como modificar, substituir, deletar etc., o(s) aminoácido(s) da seqüência po- lipeptídica e produzir variações biologicamente ativas que mantêm a mesma ou substancialmente a mesma atividade que a da seqüência original sem esforço desnecessário.
Para produzir os produtos polipeptídicos imunogênicos desta invenção, o processo pode incluir as etapas a seguir: cultivo, sob condições nutricionais adequadas, das células hospedeiras procarióticas ou eucarióti- cas transfectadas com as novas moléculas de ácido nucléico recombinantes descritas aqui de uma forma que permita a expressão dos ditos produtos polipeptídicos e isolamento dos produtos polipeptídicos desejados da ex- pressão das ditas moléculas de ácido nucléico através de métodos padroni- zados conhecidos na técnica. É considerado que as proteínas imunogênicas podem ser preparadas através de outras técnicas tais como, por exemplo, a síntese bioquímica e similares.
As vacinas dos clones de DNA viral e molecular quimérico e os métodos de utilização dos mesmos estão também incluídos dentro do âmbito da presente invenção. Os porcos inoculados são protegidos da infecção viral grave e da PMWS causadas pelo PCV2. O novo método protege os porcos que necessitam da proteção contra a infecção viral ou a PMWS através da administração ao porco de uma quantidade imunologicamente eficiente de uma vacina de acordo com a invenção, tal como, por exemplo, uma vacina que compreende uma quantidade imunogênica do DNA do PCV1-2 quiméri- co, o vírus quimérico clonado, um vetor plasmideal ou viral contendo o DNA quimérico do PCV1-2, os produtos da expressão de polipeptídeos, o DNA do PCV2 recombinante etc. Outros antígenos tais como o PRRSV, o PPV, ou- tros agentes suínos infecciosos e estimulantes imunológicos podem ser for- necidos concorrentemente ao porco para fornecer um espectro amplo de proteção contra as infecções virais.
As vacinas compreendem, por exemplo, o DNA do PCV1-2 qui- mérico infeccioso, o genoma de DNA quimérico do PCV clonado em plasmí- deos adequados ou vetores tais como, por exemplo, o vetor pSK, um vírus quimérico vivo avirulento, um vírus quimérico inativado etc. em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável não-tóxico e, opcionalmente, um ou mais adjuvantes. A vacina pode compreender ainda o clone de DNA molecular do PCV2 infeccioso descrito aqui. O DNA do PCV1-2 quimérico infeccioso, o DNA plasmideal contendo o genoma viral quimérico infeccioso e o vírus quimérico vivo são preferidos com o vírus são preferidos com o ví- rus quimérico vivo sendo mais preferido. A vacina viral viva avirulenta da presente invenção fornece uma vantagem sobre as vacinas virais tradicio- nais que utilizam vírus vivos atenuados que correm o risco de se reverteram de volta para o estado viruleno ou vírus inteiros propagados em culturas de células mortas que podem não induzir uma resposta imunológica de anticor- pos suficiente para a proteção contra a doença viral. O adjuvante, que pode ser administrado em associação com a vacina da presente invenção, é uma substância que aumenta a resposta imunológica do porco para a vacina. O adjuvante pode ser administrado ao mesmo tempo e no mesmo local que a vacina ou em um momento diferente, por exemplo, como um reforço. Os adjuvantes também podem ser vantajo- samente administrados ao porco de uma maneira ou em um local diferente da maneira ou do local em que a vacina é administrada. Os adjuvantes ade- quados incluem, mas não estão limitados ao hidróxido de alumínio (alúmen), aos complexos imunoestimulanteS (ISCOMS), aos polímeros em blocos não iônicos ou aos co-polímeros, às citocinas (como IL-1, IL-2, IL-7, IFN-α, IFN- β, IFN^y etc.), às saponinas, ao lipídeo de monofosforila A (MLA), aos di- peptídeos de muramila (MDP) e similares. Outros adjuvantes adequados incluem, por exemplo, sulfato de alumínio e potássio, enterotixina termolábil ou termoestável isolada de Escherichia coli, toxina do cólera ou a subunida- de B da mesma, toxina diftérica, toxina tetânica, toxina pertussis, adjuvante incompleto ou completo de Freund etc. Os adjuvantes com base em toxinas, tal como a toxina diftérica, a toxina tetânica e a toxina pertussis podem ser inativados antes do uso, por exemplo, através do tratamento com formaldeí- do.
As vacinas podem conter ainda antígenos adicionais para pro- mover a atividade imunológica dos clones de DNA do PCV quiméricos infec- ciosos tais como, o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), o parvovírus suíno (PPV), outros agentes suínos infecciosos e estimulantes imunológicos.
As novas vacinas desta invenção não estão restritas a qualquer tipo particular ou método de preparação. As vacinas virais clonadas incluem, mas não estão limitadas às vacinas de DNA infeccioso (isto é, utilizando plasmídeos, vetores ou outros veículos convencionais para injetar direta- mente o DNA em porcos), às vacinas vivas, às vacinas vivas modificadas, às vacinas inativadas, às vacinas de subunidades, às vacinas atenuadas, às vacinas engenheiradas geneticamente etc. Estas vacinas são preparadas através de métodos padronizados conhecidos na técnica. A vacina viral viva é geralmente a vacina mais desejável pelo fato de que todas as respostas imunológicas possíveis são ativadas no re- ceptor da vacina, incluindo as respostas imunológicas sistêmicas, locais, humorais e mediadas por células. Uma vacina morta, por outro lado, pode somente induzir uma resposta imunológica humoral. Embora sejam mais desejáveis, entretanto, as vacinas virais vivas possuem várias desvanta- gens, tal como o risco potencial de contaminação com os agentes virais ad- ventícios vivos ou o risco de que o vírus pode reverter a virulência no campo.
Notavelmente, o DNA quimérico do PCV1-2 exclusivo da presente invenção supera estas desvantagens. Utilizando somente os genes imunogênicos do PCV2 patogênico, o DNA quimérico constrói um vírus quimérico replicante vivo que é não patogênico e ainda ativa as respostas imunológicas benéficas completas das vacinas virais vivas contra o vírus PCV2 patogênico. A vacina de vírus vivo no vírus quimérico possuirá pouca chance, se alguma, de re- versão para um fenótipo patogênico. Assim, o novo vírus quimérico baseado na estrutura do PCV1 não patogênico possui uma enorme vantagem sobre qualquer vírus de DNA do PCV2 recombinante, qualquer vacina do PCV2 atenuada viva ou qualquer outro tipo de vacina atribuída exclusivamente ao PCV2 para a imunidade contra as infecções pelo PCV2.
Embora a vacina viral viva seja mais preferida, outros tipos de vacinas podem ser utilizados para inocular porcos com o novo vírus quiméri- co e outros antígenos descritos aqui. Para preparar vacinas virais inativadas, por exemplo, a propagação do vírus partindo do clone de DNA infeccioso é feita através de métodos conhecidos na técnica ou descritos aqui. A inativa- ção viral em série é então otimizada através de protocolos geralmente co- nhecidos pelos peritos comuns na técnica.
As vacinas virais inativadas podem ser preparadas através do tratamento do vírus quimérico derivado do DNA do PCV clonado com agen- tes de inativação tal como a formalina ou solventes hidrofóbicos, ácidos etc., através da irradiação com luz ultravioleta ou raios X, através do aquecimento etc. A inativação é realizada de uma maneira entendida na técnica. Por exemplo, na inativação química, uma amostra viral adequada ou uma amos- tra de soro contendo o vírus é tratada durante um período suficiente de tem- po com uma quantidade ou concentração suficiente de agente de inativação a uma temperatura suficientemente alta (ou baixa, dependendo do agente de inativação) ou pH para inativar o vírus. A inativação através do aquecimento é realizada a uma temperatura e durante um período de tempo suficiente para inativar o vírus. A inativação através da irradiação é conduzida utilizan- do um comprimento de luz ou outra fonte de energia durante um período de tempo suficiente para inativar o vírus. O vírus é considerado inativado se este for incapaz de infectar uma célula suscetível à infecção. A preparação de vacinas de subunidades difere tipicamente da preparação de uma vacina viva modificada ou de uma vacina inativada. An- tes da preparação de uma vacina de subunidade, os componentes proteto- res ou antigênicos da vacina precisam ser identificados. Tais componentes protetores ou antigênicos incluem certos segmentos de aminoácidos ou fragmentos das proteínas de capsídeo viral que produzem uma resposta protetora ou imunogênica particularmente forte em porcos; as próprias pro- teínas de capsídeo viral isoladas ou múltiplas, oligômeros das mesmas e associações de maior ordem das proteínas de capsídeo viral que formam as subestruturas virais ou partes identificáveis ou unidades de tais subestrutu- ras; oligoglicosídeos, glicolipídeos ou glicoproteínas presentes na ou próxi- mas à superfície do vírus ou nas subestruturas virais tais como as lipoproteí- nas ou grupos lipídicos associados ao vírus etc. Preferencialmente, uma proteína de capsídeo, tal como a proteína codificada pelo gene ORF2, é em- pregada como o agente antigênico da vacina de subunidades. Outras proteí- nas codificadas pelo clone de DNA infeccioso também podem ser utilizadas.
Estes componentes imunogênicos são rapidamente identificados através dos métodos conhecidos na técnica. Uma vez identificados, as partes protetoras ou antigênicas do vírus (isto é, a "subunidade") são subseqüentemente puri- ficadas e/ou clonadas através dos procedimentos conhecidos na técnica. A vacina de subunidades fornece uma vantagem sobre as outras vacinas com base no vírus vivo uma vez que a subunidade, tal como as subunidades al- tamente purificadas do vírus, é menos tóxica do que o vírus inteiro.
Se a vacina de subunidades for produzida através de técnicas genéticas recombinantes, a expressão da subunidade clonada tal como o gene ORF2 (capsídeo), por exemplo, pode ser otimizada através de méto- dos conhecidos pelos peritos na técnica (ver, por exemplo, Maniatis e outros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MA, 1989). Se a subunidade que está sendo empregada representar uma característica estrutural intacta do vírus, tal como uma pro- teína de capsídeo inteira, o procedimento para seu isolamento do vírus tem que ser então otimizado. Em qualquer um dos casos, após a otimização do protocolo de inativação, o protocolo de purificação da subunidade pode ser otimizado antes da produção.
Para preparar vacinas atenuadas partindo de clones patogêni- cos, o PCV2 patogênico vivo adaptado à cultura de tecidos é primeiro atenu- ado (tomado não patogênico ou inofensivo) através de métodos conhecidos na técnica, o que é tipicamente executado através de passagens em séria através de culturas de células. A atenuação de clones patogênicos também pode ser feita através da deleção de genes ou de mutações de genes de produção viral. Então, os vírus PCV2 atenuados podem ser utilizados para construir vírus PCV1-2 quiméricos adicionais que mantêm o fenótipo não patogênico do PCV1, mas podem variar na força das características de imunogenicidade selecionadas do genoma do PCV2 através da tecnologia recombinante. A vacina mais preferida emprega o clone de DNA de vírus qui- mérico vivo, em particular, o clone que contém os genes imunogênicos do PCV2 clonado na estrutura do PCV1 não patogênico. Vantajosamente, o vírus quimérico vivo, que é naturalmente avirulento quando construído atra- vés da engenharia genética, não requer procedimentos de atenuação demo- rados. O vírus serve exclusivamente como um vírus replicante, mas não pa- togênico que produz proteínas imunogênicas contra o PCV2 durante a repli- cação viral, que podem então ativar uma faixa completa de respostas imunológicas contra o PCV2 patogênico.
Como uma vantagem adicional, o vírus quimérico vivo preferido da presente invenção fornece uma vacina geneticamente estável que é mais fácil de produzir, de armazenar e de fornecer do que outros tipos de vacinas atenuadas. As vacinas avirulentas ou atenuadas com base nos vírus quimé- ricos são geralmente consideradas tão seguras quanto, se não mais seguras que, as vacinas vivas modificadas tradicionalmente (J. Arroyo e outros, "Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Vi- rus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE)", J. Virol. 75(2):934-942 (2001); F. Guirakhoo e outros, "Recombinant chimeric yellow fever-dengue type 2 virus is immunogenic and protective in nonhuman pri- mates", J. Virol. 74(12):5477-5485 (2000); S. Tang e outros, "Toward a poli- ovirus-based simian immunodeficiency virus vaccine: correlation between genetic stability and immunogenicity", J. Virol. 71(10):7841-7850 (1997)). Por exemplo, foi mostrado que a vacina ChimeriVax-JE contra o vírus da encefa- lite japonesa (JEV), que é um derivado engenheirado geneticamente da va- cina para o vírus da febre amarela YFV17D na qual os genes que codificam as proteínas estruturais prM e E da YFV17D são substituídos pelos genes correspondentes da cepa JEV SA14-14-2 atenuada, é geneticamente está- vel após passagens prolongadas tanto in vitro quanto in vivo (J. Arroyo e outros, 2001, supra). Também foi descoberto que uma outra vacina viral quimérica ChimeriVas-D2 contra o vírus da Dengue do tipo 2, que é um vírus quimérico atenuado febre amarela (YF) - dengue do tipo 2, é geneticamente estável; é relatado que suas seqüências ficam inalteradas após 18 passa- gens em células Vero (F. Guirakhoo e outros, 2000, supra).
Uma outra vacina preferida da presente invenção utiliza plasmí- deos adequados para a distribuição do clone de DNA quimérico não patogê- nico para porcos. Em contraste à vacina tradicional que utiliza vírus inteiro propagado em culturas de células mortas, esta invenção fornece a inocula- ção direta em porcos.com o DNA plasmideal contendo o genoma viral qui- mérico infeccioso.
As vacinas engenheiradas geneticamente adicionais, que são desejáveis na presente invenção, são produzidas através das técnicas co- nhecidas na técnica. Tais técnicas envolvem, mas não estão limitadas à ma- nipulação adicional do DNA recombinante, à modificação ou as substituições nas seqüências de aminoácidos das proteínas recombinantes e similares.
As vacinas engenheiradas geneticamente com base na tecnolo- gia do DNA recombinante são produzidas, por exemplo, através da identifi- cação de partes alternativas do gene viral que codifica proteínas responsá- veis pela indução de uma resposta imunológica ou protetora mais forte em porcos (por exemplo, proteínas derivadas do ORF3, ORF4 etc.). Tais genes identificados ou fragmentos imunodominantes podem ser clonados em veto- res de expressão de proteínas padronizados, tal como o vetor de baculovírus e utilizados para infectar células hospedeiras apropriadas (ver, por exemplo, 0’Reilly e outros, "Baculovírus Expression Vectors: A Lab Manual", Freeman & Co., 1992). As células hospedeiras são cultivadas, expressando assim as proteínas vacinais desejadas, que podem ser purificadas até a extensão de- sejada e formuladas em um produto vacinai adequado.
Se os clones mantiverem quaisquer habilidades naturais inde- sejáveis de causar doenças, é também possível escolher as seqüências de nucleotídeos no genoma viral responsáveis pela virulência e engenheirar geneticamente o vírus avirulento através, por exemplo, da mutagênese dire- cionada ao sítio. A mutagênese direcionada ao sítio é capaz de adicionar, deletar ou alterar um ou mais nucleotídeos (ver, por exemplo, Zoller e outros, DNA 3:479-488, 1984). É sintetizado um oligonucleotídeo que contém a mutação desejada e anelada a uma parte do DNA viral de filamento simples. A molécula híbrida, que resulta deste procedimento, é empregada para transformar bactérias. Então o DNA de filamento duplo, que é isolado con- tendo a mutação apropriada, é utilizado para produzir o DNA de compri- mento completo através da ligação com um fragmento de restrição do último que é subseqüentemente transfectado em uma cultura de células adequa- das. A ligação do genoma no vetor adequado para transferência pode ser realizada através de qualquer técnica padronizada conhecida pelos peritos comuns na técnica. A transfecção do vetor nas células hospedeiras para a produção da progênie viral pode ser feita utilizando qualquer um dos méto- dos convencionais tais como a transfecção mediada pelo fosfato de cálcio ou pelo DEAE-dextrano, a fusão de protoplastos e outras técnicas bem conhe- cidas (por exemplo, Sambrook e outros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). O vírus clonado exibe então a mutação desejada. Alternativamente, podem ser sintetizados dois oligonucleotídeos que contêm a mutação apropriada. Estes podem ser ane- lados para formar o DNA de filamento duplo que pode ser inserido no DNA viral para produzir o DNA de comprimento completo.
As proteínas engenheiradas geneticamente, úteis em vacinas, por exemplo, podem ser expressas em células de insetos, células de levedu- ras ou células de mamíferos. As proteínas engenheiradas geneticamente, que podem ser purificadas ou isoladas através de métodos convencionais, podem ser diretamente inoculadas em porcos para conferir proteção contra a infecção viral ou a síndrome de desgaste multissistêmico pós-desmame (PMWS) causada pelo PCV2.
Uma linhagem de células de inseto (como HI-FIVE) pode ser transformada com um vetor de transferência que contém moléculas de ácido nucléico obtidas do vírus ou copiadas do genoma viral que codifica uma ou mais das proteínas imunodominantes do vírus. O vetor de transferência in- clui, por exemplo, o DNA de baculovírus linearizado e um plasmídeo conten- do os polinucleotídeos desejados. A linhagem de células hospedeiras pode ser co-transfectada com o DNA de baculovírus linearizado e um plasmídeo com a finalidade de produzir um baculovírus recombinante.
Alternativamente, o DNA de um porco que está sofrendo de PMWS, que codifica uma ou mais proteínas de capsídeo, o clone molecular do PCV2 infeccioso ou o genoma de DNA quimérico do PCV clonado pode ser inserido em vetores vivos, tal como um poxvírus ou um adenovírus e uti- lizado como uma vacina.
Uma quantidade imunologicamente eficiente das vacinas da pre- sente invenção é administrada a um porco que necessita de proteção contra uma infecção viral ou a PMWS. A quantidade imunologicamente eficiente ou a quantidade imunogênica que inocula o porco pode ser facilmente determi- nada ou rapidamente titulado através de testes de rotina. Uma quantidade eficiente é uma em que é conseguida uma resposta imunológica suficiente à vacina para proteger o porco exposto ao vírus que causa a PMWS. Prefe- rencialmente, o porco é protegido até uma extensão em que um ou todos os sintomas ou efeitos fisiológicos adversos da doença viral são significativa- mente reduzidos, melhorados ou totalmente prevenidos. A vacina pode ser administrada em uma dose única ou em do- ses repetidas. As dosagens podem variar, por exemplo, de 1 até 1.000 mi- crogramas do DNA plasmideal contendo o genoma de DNA quimérico infec- cioso (dependente da concentração do componente imunoativo da vacina), mas não devem conter uma quantidade de antígeno de base viral suficiente para resultar em uma reação adversa ou sintomas fisiológicos da infecção viral. São conhecidos na técnica métodos para a determinação ou a titulação de dosagens adequadas de agente antigênico ativo com base no peso do porco, na concentração do antígeno e outros fatores típicos. Preferencial- mente, o clone de DNA viral quimérico infeccioso é utilizado como uma vaci- na ou um vírus quimérico infeccioso vivo pode ser gerado in vitro e então o vírus quimérico vivo é utilizado como uma vacina. Neste caso, 100 até 200 microgramas de DNA do PCV quimérico clonado ou aproximadamente 10.000 50% da dose infecciosa da cultura de tecido (TCID50) de vírus quimé- rico podem ser fornecidos a um porco.
Desejavelmente, a vacina é administrada a um porco que ainda não foi exposto ao vírus do PCV. A vacina contendo o clone de DNA infecci- oso do PCV1-2 quimérico ou outras formas antigênicas do mesmo pode ser administrada de forma intranasal, transdermal (isto é, aplicada sobre ou na superfície da pele para absorção sistêmica), parenteral etc. A rota parenteral de administração inclui, mas não está limitada às rotas intramuscular, intra- venosa, intraperítoneal, intradermal (isto é, injetada ou colocada de outra forma sob a pele) e similares. Uma vez que as rotas intramuscular e intra- dermal de inoculação foram bem-sucedidas em outros estudos utilizando clones de DNA infecciosos virais (E. E. Sparger e outros, "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone", Vi- rology 238:157-160 (1997); L. Willlems e outros, "In vivo transfection of bovi- ne leukemia provirus into sheep", Virology 189:775-777 (1992)), estas rotas são mais preferidas, em adição à rota intranasal prática de administração.
Embora seja menos conveniente, é também considerado que a vacina é for- necida ao porco através da rota intralinfóide de inoculação. Um método al- tamente preferido exclusivo de administração envolve a injeção direta do DNA plasmideal contendo a quimera do PCV1-2 no porco de forma intra- muscular, intradermal, intralinfóide etc.
Quando administrada na forma de um líquido, a presente vacina pode ser preparada na forma de uma solução aquosa, xarope, um elixir, uma tintura e similares. Tais formulações são conhecidas na técnica e são tipica- mente preparadas através da dissolução do antígeno e outros aditivos típi- cos no carreador ou em sistemas de solvente apropriados. Os carreadores ou os solventes adequados incluem, mas não estão limitados à água, à so- lução salina, ao etanol, ao etileno glicol, ao glicerol etc. Os aditivos típicos são, por exemplo, corantes certificados, aromatizantes, adoçantes e preser- vantes antimicrobianos tal como o thimerosal (etilmercuritiossalicilato de só- dio). Tais soluções podem ser estabilizadas, por exemplo, através da adição de gelatina parcialmente hidrolisada, de sorbitol ou de meio de cultura e po- dem ser tamponadas através de métodos convencionais utilizando reagen- tes conhecidos na técnica, tais como o hidrogênio fosfato de sódio, o bifos- fato de sódio, o hidrogênio fosfato de potássio, o bifosfato de potássio, uma mistura dos mesmos e similares.
As formulações líquidas também podem incluir suspensões e emulsões que contêm agentes de suspensão ou emulsificantes em combi- nação com outros co-formulantes adicionais. Estes tipos de formulações lí- quidas podem ser preparados através de métodos convencionais. As sus- pensões, por exemplo, podem ser preparadas utilizando um moinho coloidal.
As emulsões, por exemplo, podem ser preparadas utilizando um homoge- neizador.
As formulações parenterais, projetadas para injeção nos siste- mas fluidos do corpo, requerem uma isotonicidade apropriada e pH tampo- nante aos níveis correspondentes de fluidos corporais suínos. A isotonicida- de pode ser apropriadamente ajustada com cloreto de sódio e outros sais quando necessários. Os solventes adequados, tal como o etanol ou o propi- leno glicol, podem ser utilizados para aumentar a solubilidade dos ingredi- entes na formulação e a estabilidade da preparação líquida. Os aditivos adi- cionais que podem ser empregados na presente vacina incluem, mas não estão limitados à dextrose, aos antioxidantes convencionais e aos agentes quelantes convencionais tais como o ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA). As formas de dosagem parenteral devem ser ainda esterilizadas antes do uso.
Uma outra modalidade da presente invenção envolve um novo método de preparação de uma molécula de ácido nucléico quimérica não patogênica infecciosa do PCV1-2, que compreende a remoção de um gene do quadro aberto de leitura (ORF) de uma molécula de ácido nucléico que codifica um PCV1 não patogênico infeccioso, substituindo a mesma posição por um gene ORF imunogênico de uma molécula de ácido nucléico que co- difica um PCV2 patogênico infeccioso e recuperando a molécula de ácido nucléico quimérica. A molécula de ácido nucléico é tipicamente DNA. Um método preferido substitui o gene ORF2 do DNA de PCV1 não patogênico pelo gene de capsídeo ORF2 imunogênico do DNA molecular patogênico infeccioso do PCV2 descrito aqui. É considerado que outras posições de ORF ou fragmentos imunogênicos dos mesmos podem ser trocados entre o DNA do PCV1 e do PCV2 para a construção de clones de DNA quiméricos infecciosos atenuados de acordo com os métodos descritos aqui. A molécula de ácido nucléico recombinante é então utilizada para construir o vírus quimérico replicante infeccioso vivo da presente inven- ção que vantajosamente mantém a natureza não patogênica do PCV1 ex- pressando ainda a proteína ORF2 imunogênica do PCV2 patogênico e ativa uma resposta imunológica completa contra o PCV2 patogênico. Desejavel- mente, o DNA do PCV1-2 serve como uma vacina viva avirulenta engenhei- rada geneticamente contra a infecção pelo PCV2 e a PMWS em porcos.
Um clone de DNA infeccioso do PCV2 é construído, como des- crito aqui, de forma que um estoque viral infeccioso homogêneo e biologi- camente possa ser gerado para os estudos da patogênese e para o desen- volvimento de vacinas de quimeras não patogênicas. O curso da doença clínica, a distribuição viral e as lesões patológicas associadas com a infec- ção do PCV2 são mais definitivamente caracterizados utilizando este clone de DNA molecular e um estoque de vírus PCV2 infeccioso homogêneo e biologicamente puro derivado do clone de DNA molecular do que foi obser- vado no passado, que se presta ao desenvolvimento dos produtos vacinais desejados da presente invenção. O clone molecular do PCV2 é gerado através da ligação de duas cópias do genoma do PCV2 completo em série no vetor pSK. Em forte con- traste ao genoma de cópia única divulgado na técnica, o clone do PCV2 de DNA infeccioso produzido através dos métodos descritos aqui contém duas cópias completas do genoma do PCV2 ligadas uma à outra em repetição em série. A ligação de duas cópias do genoma em série fornece um ge- noma circular similar que imita o genoma circular normal do PCV2. A vanta- gem de ter duas cópias do genoma em série no clone de PCV de DNA infec- cioso é a capacidade de maximizar a replicação quando o clone de DNA in- feccioso é transfectado in vitro ou in vivo. Assim, o clone da invenção opera mais eficientemente e efetivamente do que o genoma de cópia única anteri- or. A infecção de animais com o clone viral molecular é extrema- mente útil para o estudo dos determinantes genéticos da replicação viral e da virulência no hospedeiro. O circovírus suíno do tipo-2 (PCV2) foi incrimi- nado como o agente causador da síndrome de desgaste multissistêmico pós-desmame (PMWS). A PMWS é uma síndrome de doença complexa nos suínos e vários fatores podem estar envolvidos na apresentação clínica da PMWS. Entretanto, a dificuldade de produzir uma forma biologicamente pura do PCV2 por causa da presença de outros agentes suínos comuns nos ho- mogenados de tecidos de porcos doentes impediu uma caracterização defi- nitiva da doença clínica e das lesões patológicas que podem ser exclusiva- mente atribuídas à infecção pelo PCV2. Esta é a primeira vez que um clone de DNA molecular infeccioso do PCV2 foi construído e utilizado para carac- terizar a doença e as lesões patológicas associadas com a infecção pelo PCV2 através da transfecção direta in vivo de porcos com o clone molecular. É mostrado que o estoque de vírus vivo de PCV2 homogêneo derivado do clone molecular é infeccioso in vitro quando transfectado em células PK-15. O DNA genômico do PCV2 clonado é também infeccioso quando é injetado diretamente nos fígados e nos nodos linfáticos ilíacos su- perficiais de porcos livres de agentes patogênicos específicos (SPF). Os animais injetados com o DNA do plasmídeo do PCV2 clonado desenvolvem uma infecção e uma doença que se assemelha à induzida através da inocu- lação intranasal com um estoque de vírus vivo do PCV2 infeccioso homogê- neo. A soroconversão para o anticorpo específico ao PCV2 é detectada na maior parte dos porcos dos grupos inoculados no 35Q dia após a inoculação (DPI). O início e a duração da viremia nos porcos inoculados com o clone de DNA do PCV1-2 quimérico são similares aos dos porcos inoculados com o clone de DNA do PCV1 não patogênico, enquanto que a viremia nos porcos inoculados com o clone do PCV2 aparece mais cedo e dura mais.
Começando em 14 DPI e durando aproximadamente 2-4 semanas, a viremia é detectada na maior parte dos animais inoculados com o PCV2. Similar- mente, a maior parte de porcos inoculados com necrópsia no 35- DPI sofreu soroconversão para os anticorpos para o PCV2. O antígeno do PCV2 é de- tectado em vários tecidos e órgãos em porcos inoculados. As lesões gran- des são limitadas aos pulmões e aos nodos linfáticos e são caracterizadas pelos nodos linfáticos corados de castanho sistematicamente aumentados, pelos pulmões que falharam até o colapso e pelos focos de consolidação corados de marrom multifocais. As lesões grandes que afetam os nodos lin- fáticos tanto nos porcos inoculados com PCV1 não patogênico quanto com PCV1-2 quimérico são brandas e limitadas apenas a alguns animais, en- quanto que nos porcos inoculados com o PCV2 patogênico todos possuem inchaço de moderado até grave e descoloração dos tecidos linfóides (Tabela 9, abaixo). A análise estatística revela que os valores das lesões grandes nos nodos linfáticos dos animais inoculados com o PCV1-2 quimérico são similares aos dos porcos inoculados com o PCV1 não patogênico. No 21- DPI, os porcos inoculados com o PCV2 possuem lesões grandes que são estatisticamente mais graves que as dos porcos inoculados com o PCV1 ou com o PCV1-2 quimérico. As lesões histopatológicas e o antígeno específico ao PCV2 são detectados em vários tecidos e órgãos incluindo o cérebro, os pulmões, o coração, os rins, as tonsilas, os nodos linfáticos, o baço, o íleo e o fígado dos porcos inoculados (infectados). As lesões histopatológicas em vários tecidos e órgãos similares às da PMWS são reproduzidas com o clone de DNA molecular do PCV2 assim como com o vírus infeccioso preparado in vitro partindo do clone de DNA molecular. Microscopicamente, tanto no 213 quanto no 493 DPIs, os animais inoculados com o PCV1-2 quimérico possu- em estatisticamente menos lesões microscópicas do que os animais inocu- lados com o PCV2. Os valores das lesões microscópicas nos nodos linfáti- cos dos porcos inoculados com o PCV1-2 quimérico são similares às com o PCV1 não patogênico, às com o PCV2-1 quimérico recíproco e às em ani- mais de controle não inoculados. As lesões microscópicas moderadas até graves são encontradas em vários tecidos de animais inoculados com o PCV2 patogênico incluindo os tecidos pulmonares, do fígado, linfóides, do baço, do cérebro, do coração, dos rins e das tonsilas. Entretanto, nos ani- mais inoculados com o PCV1-2 quimérico, as lesões microscópicas suaves até moderadas são limitadas apenas aos tecidos do fígado, dos nodos linfá- ticos e dos rins (ver a Tabela 10, abaixo). Não há sinais clínicos notáveis da PMWS nos porcos de controle ou em qualquer dos inoculados. Embora os sintomas clínicos característicos da PMWS não sejam observados com o DNA plasmídeal do PCV2 clonado (o clone de DNA de PCV2 infeccioso) ou com os estoques virais infecciosos de PCV2 biologicamente puros, o PCV2 é claramente responsável pelas le- sões histopatológicas similares às da PMWS reproduzidas nos exemplos ilustrativos abaixo. Acredita-se que geralmente o PCV2 é o agente primário, mas não o único agente patogênico responsável pelo início da PMWS clíni- ca.
Esta invenção caracteriza mais definitivamente o curso clínico e as lesões patológicas que podem ser exclusivamente atribuídas à infecção pelo PCV2. Os presentes dados nos exemplos ilustrativos abaixo indicam que o DNA genômico do PCV2 clonado facilmente reproduzido está disponí- vel para substituir o vírus infeccioso para os estudos de patogênese e de imunização do PCV2. Embora seja mostrado que o PCV2 é essencial para o desenvolvimento da PMWS, outros fatores ou agentes tais como o PRRSV, o PPV etc. podem ser necessários para induzir o espectro completo de si- nais e lesões clínicos associados com os casos avançados da PMWS. En- tretanto, com o conhecimento de que o PCV2 é um fator fundamental, o novo clone viral replicante infeccioso da presente invenção pode ser adicio- nalmente modificado ou engenheirado geneticamente para atingir o efeito imunogênico ótimo desejado através de métodos conhecidos pelos peritos comuns na imunologia e na genética molecular. A disponibilidade do clone de DNA infeccioso do PCV2 descrito aqui torna factível o desenvolvimento da vacina atenuada engenheirada ge- neticamente para a prevenção da infecção pelo PCV2 e da PMWS em por- cos. Sabe-se que o PCV2 se replica nos nodos linfáticos, nos pulmões e no fígado durante a infecção natural e um dos efeitos patogênicos principais é a debilitação do sistema imunológico através da degradação das estruturas linfóides (S. Krakowka e outros, 2001, supra; G. M. Allan e J. A. Ellis, 2000, supra; S. Kennedy e outros, 2000, supra; G. J. Wellenberg e outros, 2000, supra; G. M. Allan e outros, "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovi- rus", J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); J. Ellis e outros, "Reproduction of lesions of postweaning mulisystemic wasting syndrome in gnotobiotic pi- glets", J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); J. C. Harding e E. G. Clark, 1997, supra). Utilizando este novo clone de DNA molecular do PCV2 infecci- oso, a doença clínica, as lesões patológicas e a distribuição viral que podem ser atribuídas exclusivamente à infecção pelo PCV2 são mais caracterizadas de forma mais definida.
As relações estruturais e funcionais dos genes do PCV são mais bem entendidas por causa da disponibilidade dos clones de DNA infecciosos do PCV2, do PCV1, do PCV1-2 quimérico e do PCV2-1 quimérico recíproco descritos aqui. Will e outros, "Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpan- zees", Nature 299:740-742 (1982), demostraram primeiro a praticabilidade de utilizar um DNA do vírus da hepatite B clonado para infectar chimpanzés através da injeção in vivo direta. Esta abordagem foi desde então utilizada para estudar a replicação e a patogênese viral de vários outros vírus (T. W.
Dubensky e outros, "Direct transfection of viral and plasmid DNA into the li- ver ou spleen of mice", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:7529-7533 (1984); R.
Girones e outros, "Complete nucleotide sequence of a molecular clone of woodchuck hepatitis virus that is infectious in the natural host", Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 86:1846-1849 (1989); N. L. Letvin e outros, "Risks of han- dling HIV", Nature 349:573 (1991); C. Seeger e outros, "The cloned genome of ground squirrel hepatitis virus is infectious in the animal", Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 81:5849-5852 (1984); E. E. Sparger e outros, "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone", Virolo- gy 238:157-160 (1997); R. Sprengel e outros, "Homologous recombination between hepadnaviral genomes folowing in vivo DNA transfection: implicati- ons for studies of viral infectivity", Virology 159:454-456 (1987); H. Will e ou- tros, 1982, supra; L. Willems e outros, "In vivo transfection of bovine leuke- mia provirus into sheep", Virology 189:775-777 (1992)). A construção de um clone de DNA molecular do PCV2 infeccio- so e a demonstração da infecção através da injeção direta do DNA plasmi- deal do PCV2 clonado no fígado e nos nodos linfáticos dos porcos no con- texto da presente invenção são vantajosas para os estudos sobre o PCV2.
Este sistema de transfecção in vivo melhorará o estudo da relação estrutural e funcional dos genes do PCV2 utilizando plasmídeos recombinantes cons- truídos in vitro para testar regiões ou genes diferentes do PCV2 em relação às suas funções na replicação e na patogênese viral no hospedeiro. A repli- cação e a patogênese do PCV2 podem ser estudadas in vivo sem ter que produzir estoques virais infecciosos através da propagação do PCV2 em culturas de células. Isto é vantajoso uma vez que as passagens em série em culturas de células podem selecionar variações virais. Uma outra vantagem de utilizar o DNA genômico do PCV2 clonado, ao invés do vírus vivo, para estudos em animais é a sua facilidade relativa para a quantificação da dose inoculada. A quantidade do DNA do PCV2 clonado utilizada para a inocula- ção em animais pode ser facilmente determinada através de um espectrofo- tômetro, enquanto que a dose de vírus PCV2 vivo requer a titulação da in- fectividade em culturas de células e a confirmação da infecção por IFA. A injeção direta de animais com o DNA plasmideal do PCV2 clonado elimina os problemas associados com a presença de outros agentes suínos nativos nos inóculos de homogenados de tecidos em estudos com animais.
Na presente invenção, o gene de capsídeo ORF2 imunogênico é trocado entre o PCV2 patogênico e o PCV1 não patogênico para produzir a estrutura exclusiva do clone de DNA infeccioso do PCV1-2 quimérico. Sur- preendente e vantajosamente, o clone infeccioso do PCV1-2 quimérico repli- cado, expressava o antígeno de capsídeo ORF2 imunogênico in vitro e in vivo e induzia uma resposta de anticorpos específica contra o ORF2 do PCV2, mas mantinha a natureza não patogênica do PCV1. O clone de DNA infeccioso do PCV1-2 quimérico possui a capacidade de induzir uma res- posta imunológica forte contra o PCV2, enquanto induz somente uma infec- ção limitada com lesões patológicas brandas similares às do PCV1 não pa- togênico. Para o desenvolvimento de vacina, o armazenamento relativa- mente fácil e a estabilidade do DNA clonado e a economia do DNA plasmi- deal do PCV2 recombinante e do clone de DNA do PCV1-2 quimérico em larga escala fornecem meios atraentes de distribuição de uma vacina de DNA viral infeccioso vivo ou de vacinas virais atenuadas engenheiradas ge- neticamente para porcos. Portanto, o clone de DNA infeccioso do PCV1-2 quimérico ensinado nesta invenção é um candidato útil de vacina contra a infecção pelo PCV2 e a PMWS. Deve ser considerado que todos os termos científicos e tecnológicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que o comumente entendido pelos peritos comuns na técnica. Para as finalidades desta invenção, o termo "infeccioso" significa que o vírus se replica em por- cos, independentemente do fato do vírus causar ou não qualquer doença. "SPF” refere-se aos porcos livres de agentes patogênicos específicos. Os porcos "gnotobióticos" significam porcos isentos de germes. Os termos "DNA plasmideal do PCV2", "DNA genômico do PCV2" e "DNA molecular do PCV2" estão sendo utilizados de forma intercambiável para se referir à mesma seqüência de nucleotídeos clonada. O clone de DNA quimérico do PCV1/PCV2 infeccioso (denomi- nação de cepa "quimera do PCV1-2"), o clone de DNA molecular infeccioso (denominação de cepa "clone do PCV2") e o estoque de PCV2 biologica- mente puro e homogêneo derivado de uma amostra de lowa do PCV2 que foi isolada de um porco com PMWS grave e identificada como o número de isolado 40895 (denominação de cepa "PCV2 #40895") são depositados sob as condições ordenadas por 37 C.F.R. § 1.808 e mantidos conforme ao Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, U.S.A. As seqüências de DNA descritas aqui estão contidas dentro de plasmídeos de 6.490 pb clo- nados no vetor pBluescript SK(+) (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) e transformadas em células competentes de Escherichia coli DH5a. Os plas- mídeos contendo o clone de DNA do PCV1-2 quimérico infeccioso (identifi- cado como "clone de DNA infeccioso do circovírus suíno do Tipo 1 (PCV1) e do Tipo 2 (PCV2) quimérico") e o clone de DNA molecular do PCV2 infeccio- so (identificado como "clone de DNA infeccioso do circovírus suíno do Tipo 2 (PCV2)") foram depositados na ATCC em 7 de dezembro de 2001 e recebe- ram as Designações de Depósito de Patente ATCC PTA-3912 e PTA-3913, respectivamente. Deve ser considerado que outros plasmídeos, que podem ser facilmente construídos utilizando a mutagênese direcionada ao sítio e as técnicas descritas aqui, são também abrangidos dentro do âmbito da pre- sente invenção. A amostra do PCV2 biologicamente pura e homogênea do isolado de número 40895 (identificado como "circovírus suíno do Tipo 2 (PCV2)") foi também depositada na ATCC em 7 de dezembro de 2001 e re- cebeu a Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-3914. A seqüência genômica (de nucleotídeos) do isolado de número 40895 do PCV2 foi depo- sitada no banco de dados Genbank e está publicamente disponível desde 23 de julho de 2000 sob o número de acesso AF264042.
Os exemplos a seguir demonstram certos aspectos da presente invenção. Entretanto, deve ser entendido que estes exemplos são somente para ilustração e não devem ser expressos como a definição completa das condições e do âmbito desta invenção. Deve ser considerado que, quando as condições de reação típicas (por exemplo, temperatura, tempos de rea- ção etc.) forem fornecidas, as condições tanto acima quanto abaixo das fai- xas especificadas podem ser também utilizadas, embora geralmente de for- ma menos conveniente. Os exemplos são realizados à temperatura ambi- ente (aproximadamente 23°C até aproximadamente 28°C) e à pressão at- mosférica. Todas as partes e porcentagens referidas aqui estão em uma base em peso e todas as temperaturas são expressas em graus centígrados a não ser que seja especificado de outra forma.
Um entendimento adicional da invenção pode ser obtido partindo dos exemplos não limitantes que seguem abaixo.
Exemplo 1 Produção de uma Linhagem de Células PK-15 isenta de Conta- minação pelo PCV1 A fonte do isolado do PCV2 era de uma amostra de tecido do baço de um porco com PMWS naturalmente ocorrente (número de identifi- cação de série do PCV2 40895, referido como "isolado 40895") (M. Fenaux e outros, 2000, supra). A coloração imuno-histoquímica (IHC) com o anticorpo específico ao PCV2 confirmou a presença do antígeno PCV2 no tecido. Os tecidos do baço foram armazenados a -80°C até o uso. A linhagem de células PK-15 fornecida pela American Type Culture Collection (ATCC número de acesso CCL-33) foi persistentemente infectada com o PCV1 (G. C. Dulac e A. Afshar, 1989, supra). Uma vez que somente uma subpopulação das células PK-15 foi persistentemente infecta- da (id.), foi gerada uma linhagem de células PK-15 que é isenta de contami- nação pelo PCV1 na diluição de ponto final. O protocolo prosseguiu como a seguir: as células PK-15 foram cultivadas em MEM com sais de Earle e L-glu- tamina (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) suplementados com soro bovino fetal a 10% (FBS) e antibiótico 1X (Life Technologies, Inc.). As mono- camadas de células confluentes foram tratadas com tripsina e as células fo- ram então contadas e diluídas em séria até um ponto final com uma célula por 0,2 mL. A diluição de ponto final foi plaqueada em placas de 96 cavida- des e foi permitido que crescesse em uma monocamada partindo de uma única célula. As células de cada cavidade foram testadas em relação ao DNA do PCV1 utilizando um ensaio de PCR-RFLP capaz de detectar e dife- renciar o PCV1 e o PCV2 (M. Fenaux e outros, 2000, supra). As células PK- 15 das cavidades que eram negativas para o teste para o PCV1 através do ensaio de PCR-RFLP foram subseqüentemente expandidas. A linhagem de células PK-15 isentas de PCV1 foi subcultivada por cinco passagens adicio- nais e foram detectadas como sendo negativas para o DNA do PCV1 atra- vés da PCR a cada passagem.
Quatro linhagens de células que eram negativas em relação à contaminação pelo PCV1 foram produzidas através da diluição até o ponto final das células PK-15 persistentemente infectadas da ATCC. As linhagens de células permaneceram negativas em relação ao PCV1 através da PCR após as cinco passagens adicionais. Uma das linhagens de células foi sub- seqüentemente expandida e foi mostrado que eram capazes de sustentar a replicação do PCV2 quando as células foram transfectadas com o clone de DNA molecular do PCV2 (Fig. 2) e infectadas com o vírus PCV2. As células clonadas foram ainda utilizadas para a transfecção in vivo do clone de DNA molecular do PCV2 para gerar um estoque de vírus infeccioso do PCV2 bio- logicamente puro para o experimento de inoculação em animais.
Exemplo 2 Construção do Clone de DNA Infeccioso do PCV2 Para o constructo de um clone de DNA molecular do PCV2, um par de iniciadores para PCR foi projetado de acordo com a seqüência publi- cada do isolado 40895 do PCV2 (M. Fenaux e outros, 2000, supra): iniciador para frente F-PCVSAC2 (5'-GAACCGCGGGTCGGCTGAACTTTTGAAAGT- 3'), apresentado na SEQ ID N°: 5 e iniciador inverso R-PCVSAC2 (5- GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3'), apresentado na SEQ ID N°: 6. Este par de iniciadores amplifica o genoma completo do PCV2 com uma região sobreposta contendo o sítio único da enzima de restrição Sacll (Fig. 1). O DNA foi extraído utilizando o QIAmp DNA Minikit (Qiagen, Inc., Valencia, CA) de uma amostra de baço de um porco com PMWS natural- mente ocorrente (isolado 40895) (M. Fenaux e outros, 2000, supra). O DNA extraído foi amplificado através da PCR com a polimerase AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). A reação da PCR consistia de uma etapa de ativação enzimática inicial a 95°C durante 9 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min, pela recozimento a 48°C durante 1 min, pela extensão a 72°C durante 3 min e uma extensão final a 72°C durante 7 min. O produto da PCR do tamanho esperado foi separado através da ele- troforese em gel e purificado com o procedimento de "glassmilk" com um Geneclean Kit (Bio 101, Inc., La Jolla, CA).
Para construir um clone de DNA molecular contendo um dímero em série do genoma do PCV2, o produto da PCR contendo o genoma do PCV2 completo foi primeiro ligado no vetor plasmideal advanTAge (Clon- tech, Paio Alto, CA). As células competentes de Escherichia coli DH5a foram transformadas. Os plasmídeos recombinantes foram verificados através da digestão com a enzima de restrição. O DNA genômico do PCV2 de compri- mento completo foi cortado do vetor advanTAge através da digestão com a enzima de restrição Sacll. O DNA genômico do PCV2 digerido foi ligado com a T4 DNA ligase a 37°C durante apenas 10 min, que favorece a produção de dímeros em série. Os dímeros em série foram subseqüentemente clonados no vetor pBluescript SK(+) (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) (Fig. 1). Os plasmídeos recombinantes contendo dímeros em série do genoma do PCV2 (referido aqui como o clone de DNA molecular do PCV2) foram confirmados através da PCR, da digestão com enzima de restrição e do seqüenciamento do DNA. A concentração de DNA dos plasmídeos recombinantes foi deter- minada por espectrofotometria.
Especificamente, o genoma completo do PCV2 (isolado 40895) foi amplificado através da PCR para construir o clone de DNA molecular do PCV2 infeccioso. Duas cópias do genoma completo do PCV2 foram ligadas em série no vetor pSK para produzir o clone de DNA molecular do PCV2 (Fig. 1). A capacidade de infecção do clone de DNA molecular do PCV2 foi determinada através da transfecção in vitro das células PK-15. O IFA com o anticorpo específico ao PCV2 confirmou que o clone de DNA molecular é infeccioso in vitro e que aproximadamente 10-15% das células PK-15 tinham sido transformadas. O antígeno específico ao PCV2 foi visualizado através de IFA no núcleo e em um grau menor, no citoplasma das células transfec- tadas (Fig. 2). As células com infecção falsa com o vetor pSK vazio perma- neceram negativas em relação ao antígeno do PCV2.
Exemplo 3 Transfecção In Vitro com o Clone de DNA Molecular do PCV2 e Produção de um Estoque Viral Infeccioso do PCV2 Biologicamente Puro e Homogêneo Para testar a capacidade de infecção do clone de DNA molecu- lar in vitro, as células PK-15 isentas de contaminação pelo PCV1 foram culti- vadas em lâminas em câmaras LabTek de 8 cavidades. Quando as células PK-15 atingiram aproximadamente 85% de confluência, as células foram transfectadas com o clone de DNA molecular utilizando os Lipofectamine Plus Reagents de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante (Life Te- chnologies, Inc.). As células que sofreram transfecção falsa com o vetor pSK vazio foram incluídas como os controles. Três dias após a transfecção, as células foram fixadas com uma solução contendo 80% de acetona e 20% de metanol a 4°C durante 20 min e o ensaio de imunofluorescência utilizando um antisoro policlonal de coelho específico ao PCV2 foi realizada para de- terminar a capacidade de infecção in vitro do clone de DNA molecular (ver abaixo).
Para gerar um estoque de vírus infeccioso do PCV2 biologica- mente puro e homogêneo para o experimento de inoculação em animais, as células PK-15 isentas de contaminação pelo PCV1 foram cultivadas em fras- cos de cultura T-25 e transfectadas com o clone de DNA molecular do PCV2. As células PK-15 foram cultivadas até aproximadamente 85% de confluência em frascos T-25. As células foram lavadas uma vez com tampão PBS esterilizado antes da transfecção. Para cada reação de transfecção em um frasco T-25, 12 pg do DNA plasmideal do PCV2 foram misturados com 16 pL do Plus Reagent em 0,35 mL de meio MEM. Um frasco de células com transfecção falsa com o vetor pSK vazio foi incluído como o controle negativo. Após incubar à temperatura ambiente durante 15 min, 50 μΙ_ de Lipofectamine Reagent diluídos em 0,35 mL de meio MEM foram adiciona- dos à mistura e incubados à temperatura ambiente durante mais 15 min. A mistura de transfecção foi então adicionada a um frasco T-25 de células PK- 15 contendo 2,5 mL de meio fresco. Após incubar a 37°C durante 3 h, o meio foi substituído por meio MEM fresco contendo FBS 2% e antibióticos 1X. As células transfectadas foram coletadas 3 dias após a transfecção e armazenadas a -80°C até o uso. O título infeccioso do estoque de vírus foi determinado por IFA (ver abaixo).
Basicamente, o estoque de vírus infeccioso do PCV2 biologica- mente puro e homogêneo foi gerado através da transfecção das células PK- 15 com o clone de DNA molecular do PCV2. Os vírions do PCV2 produzidos através da transfecção in vitro eram infecciosos uma vez que os lisados de células transfectadas foram utilizados de forma bem-sucedida para infectar células PK-15. Assim, o clone de DNA molecular do PCV2 é capaz de pro- duzir vírions do PCV2 infecciosos quando transfectados in vitro. O título in- feccioso do estoque de vírus do PCV2 homogêneo preparado partindo de células transfectadas foi determinado como sendo de 1 x 104,5 TCID5o/mL.
Este estoque de vírus foi utilizado para inocular porcos no Grupo 2. Os lisa- dos de células com transfecção falsa com o vetor pSK vazio eram incapazes de infectar as células PK-15.
Exemplo 4 Titulação do Vírus pelo Ensaio de Imunofluorescência (IFA) Para determinar o título infeccioso do estoque de vírus do PCV2 homogêneo, as células PK-15 foram cultivadas em lâminas em câmaras de 8 cavidades da LabTek. O estoque de vírus foi diluído em série 10 vezes em MEM e cada diluição foi inoculada em 10 cavidades das monocamadas das células PK-15 cultivadas nas lâminas em câmaras da LabTek. As cavidades de células não inoculadas foram incluídos como controles. As células infec- tadas foram fixadas 3 dias após a inoculação com uma solução contendo 80% de acetona e 20% de metanol a 4°C durante 20 min. Após lavar as cé- lulas com o tampão PBS, as células infectadas foram incubadas com um anticorpo policlonal de coelho específico ao PCV2 diluído 1:1.000 (S. D.
Sorden e outros, "Development of a polyclonal-antibody-based immunohisto- chemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin- fixed, paraffin-embedded tissue", J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999)) a 37°C durante 1 h. As células foram então lavadas três vezes com o tampão PBS e incubadas com uma IgG secundária anticoelho de cabra marcada com FITC (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) a 37°C
durante 45 min. Após a lavagem das lâminas três vezes com o tampão PBS as lâminas foram montadas com fluoromount-G, cobertos com lamínula e examinadas sob um microscópio de fluorescência. A dose infecciosa de 50% da cultura de tecido por mL (TCID50/mL) foi calculada. Inicialmente, as célu- las foram transfectadas com um constructo plasmideal contendo uma única cópia do genoma do PCV2 mas o título do PCV2 infeccioso partindo de um constructo com um único genoma é muito menor que o de um contendo o genoma em série. Portanto, o constructo plasmideal contendo a forma dimé- rica do genoma do PCV2 foi utilizado para os experimentos de transfecção in vitro e in vivo.
Exemplo 5 Transfecção In Vivo de Porcos com o Clone de DNA Molecular do PCV2 e Inoculação Experimental de Porcos com o Estoque de Vírus In- feccioso do PCV2 Homogêneo Quarenta porcos isentos de agentes patogênicx>s específicos (SPF) de 4 semanas de idade foram distribuídos aleatoriamente em 4 câma- ras de 10 animais cada. Antes da inoculação, os porcos SPF foram testados em relação a anticorpos para PCV, PRRSV, PPV e vírus da hepatite E suí- na. Os porcos no Grupo 1 não foram inoculados e serviram como controles negativos. Os porcos no Grupo 2 foram, cada um, inoculados de forma intra- nasal com aproximadamente 1,9 x 105 TCID5o do estoque de vírus infeccioso do PCV2 derivado do clone de DNA molecular do PCV2. Os porcos no Gru- po 3 receberam uma injeção intra-hepática direta do DNA plasmideal recom- binante do clone molecular do PCV2. Cada porco recebeu uma injeção com um total de 200 pg de DNA plasmideal recombinante (DNA plasmideal do PCV2 clonado), através de uma técnica guiada por ultra-som, em 6 locais diferentes do fígado. Os porcos no Grupo 4 receberam cada um injeções com um total de 200 pg do DNA plasmideal do PCV2 recombinante direta- mente nos nodos linfáticos ilíacos superficiais e cada nodo linfático recebeu duas injeções separadas. Os animais foram monitorados diariamente em relação a sinais clínicos da doença. Foram coletadas amostras de soro co- letadas de cada animal em 0, 7, 14, 21, 28, 35 dias após a inoculação (DPI).
No 21- DPI, cinco porcos foram aleatoriamente selecionados de cada grupo e submetidos à necrópsia. Os cinco animais restantes de cada grupo sofre- ram necrópsia no 35- DPI. Vários tecidos e órgãos foram coletados durante a necrópsia e processados para exame histológico e coloração imuno-histo- química (ver abaixo).
Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo. Todos os por- cos inoculados dos Grupos 2, 3 e 4 eram negativos em relação aos anticor- pos para o PCV2 no 0 DPI. Os dois porcos no Grupo 1 de controle não ino- culados possuíam anticorpos maternos para o PCV2 detectáveis no 0 DPI. O anticorpo materno nestes dois leitões diminuiu no 7° DPI. Não foi observada qualquer soroconversão para o anticorpo para o PCV2 em qualquer um dos 10 porcos controles não inoculados. Nos porcos do Grupo 2 inoculados de forma intranasal com o vírus infeccioso do PCV2, 1 leitão sofreu soroconver- são para o anticorpo para o PCV2 no 21e DPI. No 35s DPI, 4 dos 5 porcos restantes do Grupo 2 sofreram soroconversão. A soroconversão em animais transfectados dos Grupos 3 e 4 apareceu primeiro no 28- DPI. No 35s DPI, 5 dos 5 porcos restantes do Grupo 3 e 3 dos 5 porcos restantes do Grupo 4 sofreram soroconversão para o anticorpo para o PCV2.
Os anticorpos para o PPV foram testados nos 3a e 21a DPI em todos os porcos e no 35a DPI nos porcos restantes. Os anticorpos matemos para o agente PPV suíno ubíquo foram detectados nos leitões SPF. Os títu- los dos anticorpos Hl para o PPV em todos os leitões menos em um diminuí- ram significativamente do 3a DPI (um título médio de 1:2.665) até o 21a DPI (um título médio de 1:246), indicando que o anticorpo detectado nestes lei- tões foi derivado passivamente. Um leitão possuía um título de Hl para PPV ligeiramente maior de 1:32 no 3a DPI até 1:64 no 21a DPI, que é provavel- mente causado pela variação do teste. As amostras de soro coletadas de todos os porcos no 0, 21a e 35a DPI foram adicionalmente testadas em rela- ção ao DNA do PPV com um ensaio da PCR publicado (J. M. Soucie e ou- tros, "Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia re- ceiving Hyato: C porcine factor VIII concentrate", Transfusion 40:708-711 (2000)). Não foi detectada viremia do PPV em qualquer um dos porcos em qualquer DPI, indicando adicionalmente que os porfcos não foram infectados pelo PPV. a O anticorpo para o PCV2 foi medido com um ELISA, número de positi- vos/número testado. b Um estoque de vírus do PCV2 biologicamente puro e homogêneo gerado através da transfecção de células PK-15 com o clone de DNA molecular do PCV2. c DNA genômico do PCV2 clonado no plasmídeo pSK.
Exemplo 6 Análises de PCR-RFLP
Para medir a viremia do PCV2 em porcos transfectados com o clone de DNA molecular do PCV2 e em porcos infectados com o estoque de vírus infeccioso do PCV2, as amostras de soro coletadas em DPIs diferentes foram testadas em relação à presença do DNA do PCV2 através dos méto- dos gerais de um ensaio de PCR-RFLP descrito anteriormente (M. Fenaux e outros, 2000, supra). O DNA viral foi extraído de 50 μ\- de cada amostra de soro utilizando o reagente DNAzol® de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). O DNA extraí- do foi ressuspenso em água isenta de DNase, RNase e proteinase e testado em relação ao DNA do PCV2 através de PCR-RFLP (id.). Os produtos da PCR de animais selecionados foram seqüenciados para verificar a origem do vírus infectando os porcos.
As amostras de soro foram coletadas partindo de todos os ani- mais de controle e inoculados em 0, 7, 14, 21,28 e 35 DPIs e analisadas em relação à viremia do PCV2 através da detecção do DNA do PCV2 (id.). Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo. O DNA do PCV2 não foi de- tectado nos porcos de controle não inoculados do Grupo 1 em qualquer DPI. A viremia foi detectada em 7/10 porcos do Grupo 2 no 142 DPI e em 8/10 no 35- DPI. A viremia durou apenas algumas semanas uma vez que o DNA do PCV2 não era mais detectável no 28Q DPI e no 35s DPI em todos os 5 por- cos restantes do Grupo 2. Nos porcos do Grupo 3 que receberam injeções intra-hepaticamente com o clone de DNA molecular do PCV2, 8/10 porcos eram virêmicos no 14- DPI e 9/10 porcos possuíam viremia detectável no 35e DPI. Os porcos do Grupo 4 receberam injeções com o clone de DNA molecular do PCV2 nos nodos linfáticos. Dois de 10 porcos no 14s DPI e 8 de 10 porcos no 21- DPI do Grupo 4 eram virêmicos. Os resultados mostram que o clone de DNA molecular do PCV2 é infeccioso quando injetado dire- tamente no fígado e nos nodos linfáticos ilíacos superficiais de porcos SPF.
Os produtos da PCR amplificados partindo dos animais selecionados foram seqüenciados. A seqüência dos produtos da PCR amplificados partindo dos animais selecionados era idêntica à da região correspondente do clone de DNA molecular do PCV2. a 10 porcos em cada grupo, número de positivos/número testado. b Um estoque de vírus do PCV2 biologicamente puro e homogêneo gerado através da transfecção de células PK-15 com o clone de DNA molecular do PCV2. c DNA genômico do PCV2 clonado no plasmídeo pSK.
Exemplo 7 Avaliação Clínica Os porcos foram pesados no 0 DPI e no momento da necrópsia.
As temperaturas retais e os valores da doença respiratória clínica, variando de 0 até 6 (0 = normal, 6 = grave) (P. G. Halbur e outros, "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome ví- rus isolates with that of the Lelystad virus", Vet. Pathol. 32:648-660 (1995)), foram registrados em dias alternados desde o 0 até o 35 DPI. As observa- ções clínicas incluindo a evidência de doença no sistema nervoso central, de doença no fígado (icterícia), de doença musculoesquelética e alterações no estado de saúde do corpo, foram também registradas diariamente.
Para avaliar a patologia e a histopatologia grosseiras, cinco por- cos de cada grupo foram selecionados aleatoriamente para as necrópsias no 21a e 35a DPI. O grupo da necrópsia não conhecia o estado de infecção dos porcos na necrópsia. Necrópsias completas foram realizadas em todos os porcos. Uma porcentagem estimada dos pulmões com pneumonia enorme- mente visível foi registrada para cada porco com base em um sistema de classificação descrito anteriormente {id.). O sistema de classificação se ba- seia no volume aproximado que cada lobo pulmonar contribui para o pulmão inteiro: lobo cranial esquerdo, lobo mediano direito, parte craniana do lobo cranial esquerdo e parte caudal do lobo craniano esquerdo contribuem cada com 10% do volume pulmonar total, o lobo acessório contribui com 5% e os lobos caudais direito e esquerdo contribuem cada com 27,5%. Outras lesões tal como o aumento dos nodos linfáticos foram observadas separadamente.
As seções para o exame histopatológico foram tiradas da concha nasal, dos pulmões (sete secções) {id.), do coração, do cérebro, dos nodos linfáticos (traqueobronquial, ilíaco, mesentérico, subinguinal), da tonsila, do timo, do fígado, da vesícula biliar, do baço, das articulações, do intestino delgado, do cólon, do pâncreas e dos rins. Os tecidos foram examinados de forma cega e receberam uma classificação subjetiva em relação a gravidade das lesões nos pulmões, nos nodos linfáticos e no fígado. Os valores para os pulmões variavam de 0 (normal) até 3 (pneumonia intersticial linfo-histiocítica grave).
Os valores para o fígado variavam de 0 (normal) até 3 (hepatite linfo- histiocítica grave). Os valores para os nodos linfáticos eram para uma quan- tidade estimada de eliminação linfóide de folículos variando de 0 (normal ou nenhuma eliminação linfóide) até 3 (eliminação linfóide grave e substituição histiocítica de folículos). O protocolo de sorologia envolvia a coleta de sangue na chega- da no 11a até o 12a dia de idade e de todos os porcos no 0, 7, 14, 21, 28 e 35 DPIs. Os anticorpos do soro para o PRRSV foram analisados utilizando Herd Check PRRSV ELISA (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Os anti- corpos do soro para o PPV foram detectados através de um ensaio de inibi- ção da hemaglutinação (Hl) (H. S. Joo e outros, "A Standardized haemag- glutination inhibition teste for porcine parvovirus antibody", Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)). Os anticorpos do soro para o PCV2 foram detectados através de um ELISA indireto modificado com base na proteína ORF2 re- combinante do PCV2 (P. Nawagitgul e outros, "Modified indirect porcine cir- covirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV", Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)). Um antígeno do PCV2 parcialmente purificado foi preparado partindo de células Hi Five (Invitrogen, Carlsbad, CA) infectadas com o baculovírus recombinante contendo a proteína principal de capsídeo ORF2 do PCV2 (P. Nawagitgul e outros, "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein", J. Gen. Virol. 81:2281- 2287 (2000)). Os lisados de células das células Hi Five infectadas com o baculovírus do tipo selvagem foram preparados similarmente e serviram como o antígeno para controle negativo. As placas para microtitulação de poliestireno Immulon 2 HB (Dynex Technologies Inc., Chantilly, VA) foram revestidas com concentrações ótimas de antígenos positivos e negativos a 4°C durante 36 h. Cem pL de cada amostra de soro diluída 1:100 em dilu- ente com 5% de leite (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) foram adiciona- dos em cada cavidade. As amostras de soro foram testadas em quadrupli- cata: 2 cavidades para o antígeno de controle negativo e 2 cavidades para- lelas para o antígeno do PCV2. Os soros de controle positivo e de controle negativo foram incluídos em cada placa. Os soros foram inoculados a 37°C durante 30 min e então lavados 5 vezes com tampão PBS 0,1 M contendo 0,1% de Tween-20. Uma IgG anti-suíno secundária marcada com peroxida- se (Sigma Co, St. Louis, MO) foi incubada a 37°C durante 30 min. As placas foram lavadas novamente e inoculadas com 2,2’-azino-di-(3-etilbenzotiazo- lina-6-sulfonato) (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) a 37°C durante 15 min para o desenvolvimento de cor. A densidade óptica (DO) foi lida em 405 nm. A DO corrigida de cada soro de teste e de controle foi calculada através da subtração do valor médio da DO das cavidades contendo antígeno negativo daquele das cavidades paralelas contendo o antígeno PCV2. Os dados fo- ram normalizados através da divisão do valor corrigido da DO de uma amostra de soro testada (S) com o do soro de controle positivo (P) e relata- dos na forma de razões S/P. As amostras com razões S/P <0,12, 0,12 até 0,2 e >0,2 foram consideradas como negativas, ambíguas e positivas, res- pectivamente.
Dos resultados da avaliação clínica, nenhum dos porcos de con- trole e inoculados exibiu sinais óbvios de doença que se assemelhasse aos da PMWS clínica. Não havia diferença no ganho de peso ou nas temperatu- ras retais médias entre qualquer um dos quatro grupos. Os porcos de con- trole do Grupo 1 permaneceram normais ao longo de todo o experimento.
Foi observada uma doença respiratória transitória branda na maior parte dos porcos nos grupos transfectados com o DNA do PCV2 e infectados com o vírus PCV2 do 8° até o 14s DPI. Esta era caracterizada por uma dispnéia suave (valores respiratórios clínicos de 1 até 2) de um a dois dias de dura- ção em porcos individuais e 5-6 dias de duração para o grupo.
Nenhuma lesão grande foi observada nos porcos de controle na necrópsia. Os porcos nos três grupos inoculados possuíam lesões grandes limitadas aos pulmões e aos nodos linfáticos (ver a Tabela 3, abaixo). As lesões eram similares entre os porcos nos grupos transfectados com o DNA plasmideal do PCV2 e infectados com o vírus do PCV2. Os pulmões falha- ram até o colapso e tinham áreas moderadamente bem demarcadas multifo- cais aleatórias de consolidação do castanho até o roxo envolvendo 0-2% do pulmão (Fig. 3) no 21Q DPI e 0-13% do pulmão no 35e DPI. Os nodos linfáti- cos estavam sistemicamente aumentados 2 até 5 vezes o tamanho normal, firmes e castanhos (Fig. 3) tanto no 21Q DPI quanto no 35s DPI na maior parte dos porcos de todos os três grupos inoculados com o PCV2. O exame microscópico não revelou lesões em qualquer um dos tecidos dos porcos de controle exceto pelos fígados. Oito de dez porcos de controle possuíam uma inflamação linfoplasmática multifocal muito suave predominantemente nas regiões periportais do fígado que é comumente ob- servada nos porcos normais e considerada residual normal (P. G. Halbur e outros, 2001, supra).
Os porcos dos dois grupos transfectados com o DNA plasmideal do PCV2 (intra-hepático e intralinfóide) do grupo infectado com o vírus PCV2 (intranasal) possuíam lesões similares no cérebro, nos pulmões, no coração, nos rins, nos tecidos linfóides (tonsila, nodos linfáticos, baço), no íleo e no fígado (ver a Tabela 4, abaixo). As lesões no cérebro foram observadas em 23/30 dos porcos dos três grupos inoculados e foram caracterizadas como meningoencefalite linfoplasmacítica multifocal de suave a moderada com bainha de linfócitos e gliose. As lesões nos pulmões foram observadas em 28/30 porcos inoculados com o PCV2 e caracterizadas como pneumonia bronquiointersticial linfoplasmática e histiocítica peribronquiolar de suave a moderada (Figura 3C). Um porco do Grupo 2 infectado com o vírus PCV2 submetido à necrópsia no 21- DPI e um porco de cada um dos dois grupos transfectados com o DNA plasmideal do PCV2 submetido à necrópsia no 35° DPI possuíam bronquiolite ulcerativa e proliferativa com fibroplasia e infla- mação granulomatosa na lamina própria e nas regiões peribronquiolares dos brônquios. Também foi observada a miocardiite linfoplasmacítica multifocal suave em 18/30 porcos inoculados com o PCV2. Em 14/30 dos porcos ino- culados com o PCV2, foi observada a nefrite intersticial linfoplasmacítica multifocal de suave até moderada. Não foram observadas lesões nos timos.
Foram observadas a eliminação linfóide e a substituição histiocítica dos folí- culos de suaves a moderadas na tonsila de 8/30, no baço de 7/30 e nos no- dos linfáticos de 26/30 dos porcos inoculados com o PCV2. Foi observada a linfadenite granulomatosa moderada com células gigantes (Fig. 4C) no 21Q DPI em três porcos inoculados de forma intranasal com o vírus PCV2 e em um porco no 35° DPI em cada um dos grupos transfectados com o DNA plasmideal do PCV2. Foram observadas as enterocolites linfoplasmacítica e histiocítica suaves em 3/5 porcos no grupo infectado com o vírus PCV2, em 3/5 porcos no grupo transfectado de forma intra-hepática com o DNA plas- mideal do PCV2 e em 1/5 porcos no grupo transfectado de forma intralinfói- de com o DNA plasmideal do PCV2 no 35Q DPI. Um porco em cada um dos grupos transfectados com o DNA plasmideal do PCV2 possuía eliminação linfóide suave com substituição histiocítica e baixos números de células gi- gantes nas placas de Peyer. Foi observada a hepatite linfoplasmacítica sua- ve até moderada em 29/30 dos três porcos inoculados com o PCV2. Foram observados números baixos de hepatócitos individualmente espalhados de forma ampla rodeados de inflamação linfo-histiocítica em um porco em cada um dos grupos transfectados com o DNA plasmideal do PCV2 no 21s DPI.
As lesões em outros tecidos não eram notáveis.
As lesões microscópicas nos pulmões, no fígado e nos nodos linfáticos foram classificadas de acordo com os sistemas de classificação publicados (Tabela 4, abaixo) (P. G. Halbur e outros, 2001, supra; P. G. Hal- bur e outros, 1995, supra). Não havia sistemas de classificação aceitáveis para os outros tecidos e órgãos. Os valores médios das lesões nos pulmões e nos nodos linfáticos em porcos dos três grupos inoculados com PCV2 eram estatisticamente diferentes daqueles nos porcos de controle do Grupo 1. Os valores médios das lesões no fígado nos porcos dos três grupos ino- culados com o PCV2 não são estatisticamente diferentes daqueles dos por- cos de controle. a Cinco porcos de cada grupo foram submetidos à necrópsia no 21- DPI e os 5 porcos restantes foram submetidos à necrópsia no 35Q DPI. Número de positivos/número testado. b Um estoque de vírus do PCV2 biologicamente puro e homogêneo gerado através da transfecção de células PK-15 com o clone de DNA molecular do PCV2. c Número de lesões/número testado (faixa do percentual estimado dos pul- mões afetados por lesões de pneumonia grosseiramente visíveis, 0-100%) d DNA genômico do PCV2 clonado no plasmídeo pSK.
Exemplo 8 Imuno-histoquímica A detecção imunohistoquímica (IHC) do antígeno específico ao PCV2 foi realizada em todos os tecidos coletados durante as necrópsias no 21s e no 35a DPIs. Um anti-soro específico ao PCV2 policlonal de coelho foi utilizado para a ICH e os procedimentos gerais foram descritos anterior- mente (S. D. Sorden e outros, 1999, supra).
Para a detecção e a distribuição do antígeno do PCV2, a colora- ção por IHC do antígeno do PCV2 foi feita no cérebro, nos pulmões, na con- cha nasal, no coração, nos rins, na tonsila, nos nodos linfáticos, no baço, no timo, no íleo, na vesícula biliar e no pâncreas de todos os porcos submetidos à necrópsia no 21a e no 35a DPI. Todos os tecidos dos porcos de controle eram negativos em relação ao antígeno do PCV2. A distribuição do antígeno do PCV2 nos três grupos inoculados com o PCV2 era similar (ver a Tabela 5, abaixo). No cérebro, o antígeno do PCV2 foi encontrado predominante- mente nas células mononucleares, nas células similares aos fibroblastos e nas células endoteliais nas meninges e no plexo coróide e menos freqüen- temente nas células endoteliais e nas células mononucleares perivasculares no cérebro e no cerebelo. Nos pulmões, o anticorpo do PCV2 foi detectado dentro dos macrófagos alveolares e septais e nas células similares aos fi- broblastos na lamina própria das vias aéreas (Figura 3D). No coração, o an- tígeno do PCV2 foi detectado em macrófagos amplamente espalhados e nas células epiteliais. Nos rins, o antígeno do PCV2 foi detectado dentro das cé- lulas epiteliais tubulares e nas células mononucleares no interstício. Nos te- cidos linfóides (nodos linfáticos, baço, tonsila e placas de Peyer), o antígeno do PCV2 foi detectado primariamente dentro dos macrófagos e nas células similares às dendríticas e nas células gigantes dentro dos folículos (Fig. 4D). O antígeno do PCV2 também foi detectado dentro dos macrófagos na lamina própria do intestino delgado. No fígado, o antígeno do PCV2 foi detectado dentro de células mononucleares e nas células de Kupffer. O antígeno do PCV2 não foi detectado na concha nasal, no timo ou na vesícula biliar.
Exemplo 9 Construção do Clone de DNA Infeccioso do PCV1 Não Patogê- nico O procedimento utilizado para o constructo de um clone de DNA infeccioso do PCV1 é essencialmente o mesmo que o descrito aqui para o PCV2. Um par de iniciadores para a PCR, KPNPCV1.U apresentado na SEQ ID N°: 7 e o KPNPCV1.L apresentado na SEQ ID Ns: 8 (ver a Tabela 6, abaixo), foi planejado com base na seqüência publicada do PCV1. Este par de iniciadores amplifica o genoma completo do PCV1 com uma região de sobreposição contendo o sítio único da enzima de restrição Kpnl. O DNA do vírus PCV1 foi extraído da linhagem de células PK-15 da ATCC que foi obti- da na American Type Culture Collection (número de acesso na ATCC CCL- 33). O DNA do PCV1 foi extraído das células PK-15 da ATCC infectadas de forma persistente com o PCV1, utilizando o minikit QIAmp DNA (Qiagen, Inc., Valencia, CA). O DNA extraído foi amplificado pela PCR com a Ampli- Taq Gold Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). Os ciclos da PCR con- sistiam de uma etapa inicial de 95°C durante 10 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min, de recozimento a 48°C durante 1 min, de extensão a 72°C durante 2 min e de uma extensão final a 72°C du- rante 7 min. O produto da PCR de tamanho esperado foi separado através de eletroforese em gel e purificado através do procedimento de "glassmilk" utilizando um Kit Geneclean (Bio 101, Inc., La Jolla, CA). O produto da PCR purificado contendo o genoma do PCV1 completo foi primeiro ligado no vetor plasmideal advanTAge (Clontech, Paio Alto, CA). As células competentes de Escherichia coli DH5a foram utilizadas para a transformação. Os plasmídeos recombinantes foram verificados através da digestão com a enzima de res- trição. O DNA genômico do PCV1 de comprimento completo foi cortado do vetor advanTAge através da digestão com a enzima de restrição Kpnl. O DNA genômico do PCV1 de comprimento completo foi ligado no vetor pBluescript SK(+) (pSK) (Stratagene, La Jolla, CA) com a T4 DNA ligase a 37°C durante a noite. Os plasmídeos recombinantes contendo o genoma do PCV1 de comprimento completo foram isolados com um mini kit Qiagen plasmid (Qiagen, Valencia, CA) e foram verificados através da digestão com a enzima de restrição e o seqüenciamento do DNA. O DNA genômico do PCV1 de comprimento completo foi cortado do vetor pSK através da diges- tão com Kpn\ e dimerizado para produzir o clone de DNA infeccioso do PCV1 como é descrito anteriormente no Exemplo 2 para o clone infeccioso do PCV2. Estes dímeros em série foram produzidos porque foi descoberto que os clones de DNA em série dimerizados são vantajosamente mais efici- entes para transfectar células e produzir vírions infecciosos. Para produzir o dímero em série do DNA do PCV1, o DNA genômico do PCV1 digerido foi ligado com a T4 DNA ligase a 37°C durante somente 10 min, o que favorece a produção de dímeros em série. Os dímeros em série foram subseqüente- mente clonados no vetor pBluescript SK(+) (pSK) (Stratagene, La Jolla, CA).
Os plasmídeos recombinantes contendo os dímeros em série do genoma do PCV1 (referidos aqui como "clone do DNA do PCV1") foram confirmados através da PCR, da digestão com enzima de restrição e do seqüenciamento do DNA. A concentração de DNA dos plasmídeos recombinantes foi deter- minada através de espectrofotometria.
Exemplo 10 Avaliação da Capacidade de Infecção do Clone de DNA do PCV1 Quando Transfectado em Células PK-15 Isentas de Contaminação Viral A capacidade de infecção do clone de DNA molecular do PCV1 foi determinada através da transfecção in vitro das células PK-15. O IFA com o anticorpo monoclonal específico ao PCV1 (uma doação do Dr. Gordon Allan, Belfast, Reino Unido) confirmou que o clone de DNA molecular do PCV1 é infeccioso nas células PK-15. O antígeno específico ao PCV1 foi visualizado pelo IFA no núcleo e em um menor grau no citoplasma das cé- lulas transfectadas. As células com transfecção falsa com o vetor pSK vazio permaneceram negativas em relação ao antígeno do PCV1.
Exemplo 11 Construção de um Clone de DNA Viral PCV1 -2 Quimérico Foi construído um vírus quimérico entre o PCV1 não patogênico e o PCV2 associado a PMWS utilizando os clones de DNA infecciosos do PCV1 e do PCV2. Para construir um clone de DNA PCV1-2 quimérico, o ge- ne de capsídeo ORF2 do PCV1 não patogênico foi removido do clone de DNA infeccioso do PCV1 e substituído pelo gene de capsídeo ORF2 imuno- gênico do PCV2 patogênico na estrutura genômica do PCV1 (ver as Figuras 5 e 6). Foram projetados dois pares de iniciadores da PCR. O primeiro par de iniciadores para ORF2 do PCV2, Psi I-5 apresentado na SEQ ID N-: 11 e Acl 1-6 apresentado na SEQ ID N°: 12, foi projetado com mutações pontuais nas extremidades a 5’ dos iniciadores para criar os sítios das enzimas de restrição Ac/I e Psi\ para a amplificação do gene ORF2 do PCV2 e introduzir os sítios das enzimas de restrição Ps/Ί e Acl\ flanqueadores através da mu- tação pontual. A reação da PCR para a amplificação do ORF2 do PCV2 consistia em uma etapa inicial a 95°C durante 9 min, seguida por 38 ciclos de desnaturação a 95°C durante 1 min, de recozimento a 48°C durante 1 min, de extensão a 72°C durante 1 min e de uma extensão final a 72°C du- rante 7 min.
Um segundo par de iniciadores da PCR, Hpa I-2 apresentado na SEQ ID N°: 9 e Nar 1-3 apresentado na SEQ ID N°: 10, foi projetado para a amplificação do vetor pSK+ e seu inserto do genoma do PCV1. Foram intro- duzidas mutações pontuais nas extremidades a 5’ dos iniciadores da PCR para criar sítios das enzimas de restrição Λ/ad e Hpa\ flanqueadores. Este par de iniciadores amplificou o vetor pSK+ e seu inserto do DNA genômico do PCV1 faltando o gene de capsídeo ORF2, ou seja, o genoma do PCV1 menos a ORF2 do PCV1 (pSK-PCV1 AORF2) através da utilização do clone de DNA infeccioso do PCV1 como o molde da PCR. A reação da PCR con- sistia em uma etapa inicial a 95°C durante 9 min, seguida por 38 ciclos de desnaturação a 95°C durante 1 min, de recozimento a 50°C durante 1 min, da extensão a 72°C durante 3,5 min e de uma extensão final a 72°C durante 7 min. O produto da PCR do ORF2 do PCV2 foi digerido com Acl\ e Ps/I para remover as mutações pontuais introduzidas. O produto pSK-PCV1 AORF2 (produto da PCR do vetor pSK - genoma do PCV1 faltando o gene ORF2 do PCV1) foi digerido com Narí e Hpa\ para remover as mutações pontuais in- troduzidas. A última digestão produziu uma extremidade coesiva e uma ex- tremidade cega complementares ao produto da PCR do ORF2 do PCV2 di- gerido pelas enzimas de restrição Acl\ e Ps/I. O produto da ORF2 do PCV2 digerido e o produto do pSK-PCV1 com o ORF2 deletado foram ligados com a T4 DNA ligase para formar o clone de DNA genômico PCV1-2 quimérico, no qual o gene ORF2 do PCV1 é substituído pelo gene ORF2 do PCV2.
Uma vez que os dois produtos da PCR foram digeridos e religados, todas as mutações pontuais introduzidas pela PCR utilizadas para facilitar a clonagem foram removidas no clone quimérico resultante. Células competentes de Es- cherichia coli DH5a foram transformadas. Os plasmídeos recombinantes contendo o clone de DNA quimérico foram isolados e confirmados através da PCR, da digestão com enzimas de restrição e do seqüenciamento parcial do DNA. O genoma do PCV1-2 quimérico de comprimento completo foi cor- tado do vetor pSK+ (o plasmídeo recombinante) com a digestão com Kpn\. O genoma do DNA quimérico foi então dimerizado através de uma reação de ligação curta de 10 minutos com a T4 DNA ligase que favorece a formação de dímeros lineares para produzir o clone de DNA infeccioso quimérico PCV1-2 (figura 6). Os plasmídeos recombinantes contendo duas cópias do genoma viral quimérico foram confirmados através da PCR, da digestão com enzimas de restrição e do seqüenciamento do DNA.
Exemplo 12 Avaliação da Capacidade de Infecção In Vitro do Clone de DNA
Quimérico PCV1-2 A viabilidade do clone de DNA do PCV quimérico (PCV1 não patogênico com o gene de capsídeo imunogênico do PCV2) foi testada em células PK-15. Quando as células PK-15 foram transfectadas com o clone de DNA viral quimérico, o antígeno viral específico para o capsídeo ORF2 do PCV2 foi detectado através de IFA aproximadamente 2 dias após a transfec- ção. O antígeno do capsídeo do PCV1 não foi detectado nas células trans- fectadas. Este experimento indicou que o clone de DNA quimérico é infecci- oso in vitro, é capaz de se replicar nas células PK-15 e produzir a proteína do capsídeo imunogênico do PCV2.
Exemplo 13 Construção de um Clone de DNA do PCV2-1 Quimérico Recí- proco Para construir um clone de DNA quimérico PCV2-1 recíproco, o gene de capsídeo ORF2 do PCV2 é substituído pelo do PCV1 não patogêni- co na estrutura genômica do PCV2 patogênico (Fig. 6). Foram projetados dois pares de iniciadores para PCR: o par, Bgl-ll-ORF2 apresentado na SEQ ID N°: 13 e SpH-l-ORF2 apresentado na SEQ ID N°: 14, amplifica o gene ORF2 do PCV1 e introduz os sítios das enzimas de restrição Bgl\\ e SpH\ flanqueadores através de mutação pontual. O segundo par de iniciadores para a PCR, Bgl-ll-PCV2 apresentado na SEQ ID N°: 15 e SpH-l-PCV2 apresentado na SEQ ID N°: 16, amplificou o vetor pSK e o genoma do PCV2 menos o gene ORF2 (pSK-PCV2 AORF2) utilizando o clone de DNA infecci- oso do PCV2 como o molde da PCR e introduziu sítios de enzimas de restri- ção BglW e SpH\ flanqueadores através de mutação pontual. O produto pSK- PCV2 AORF2 e o produto da PCR do ORF2 do PCV1 foram digeridos pelas enzimas de restrição Sg/ll e SpH\ para produzir extremidades coesivas e cegas complementares unidas. Após a transformação em células de E. coli, os plasmídeos recombinantes autênticos foram isolados e confirmados atra- vés da digestão com as enzimas e do seqüenciamento parcial do DNA. O genoma do PCV2-1 quimérico recíproco de comprimento completo foi corta- do do plasmídeo recombinante através da digestão com Sacll e dimerizado como é descrito aqui para a produção do clone infeccioso PCV2-1 quimérico recíproco.
Exemplo 14 Transfecção In Vitro de Células PK-15 com os Clones de DNA do PCV1. do PCV2. do PCV1-2 e do PCV2-1 A capacidade de infecção do clone do PCV2 in vitro e in vivo foi demonstrada nos Exemplos 3-5 anteriores. Para testar a capacidade de in- fecção dos clones do PCV1 e dos dois quiméricos in vitro, células PK-15 isentas de contaminação pelo PCV1 preparadas pelo método do Exemplo 1 foram cultivadas em lâminas em câmaras de 8 cavidades da LabTek (Nalge Nunc Int., Dinamarca). Quando as células PK-15 atingiram aproximada- mente 80% de confluência, as células foram transfectadas com os clones de DNA do PCV1, do PCV2, do PCV1-2 e do PCV2-1 respectivamente, utilizan- do o Reagente Lipofectamine Plus de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante (Life Technologies, Inc.). As células que sofreram transfor- mação falsa com o vetor pSK vazio foram incluídas como controles. Três dias após a transfecção, as células foram fixadas com uma solução conten- do 80% de acetona e 20% de metano a 4°C durante 20 min. A evidência de infectividade e de replicação viral nas células transfectadas com os clones de DNA do PCV1 e do PCV2-1 foi confirmada através do ensaio de imuno- fluorescência indireta (IFA) utilizando o anticorpo monoclonal contra o gene de capsídeo ORF2 do PCV1, gentilmente fornecido pelo Dr. G. M. Allan (G. M. Allan e outros, "Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus", Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994)). As células fixadas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas com o anticorpo monoclonal para PCV1 diluído 1:20 a 37°C durante 1 hora. As células foram então lavadas três vezes com o tampão PBS e inoculadas com a imunoglobulina G antica- mundongo de cabra marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Kir- kegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.) a 37°C durante 45 min.
Após lavar três vezes com tampão PBS, as lâminas foram montadas com fluoromount-G, cobertas com lamínula e examinadas sob um microscópio de fluorescência. A capacidade de infecção das células transfectadas com os clones de DNA do PCV2 e do PCV1-2 quimérico foi confirmada através do IFA utilizando um anticorpo específico para o PCV-2, como descrito anteri- ormente no Exemplo 4. A capacidade de infecção dos clones de DNA do PCV1, do PCV1-2 quimérico e do PCV2-1 quimérico recíproco foi comprovada através da transfecção in vitro das células PK-15. Duas cópias idênticas do genoma do PCV1 completo foram ligadas em série no vetor pSK para produzir o clo- ne de DNA do PCV1 (Fig. 6). O clone de DNA do PCV1-2 quimérico possuía o gene de capsídeo ORF2 do PCV1 substituído pelo do PCV2 patogênico na estrutura do genoma do PCV1 não patogênico. O clone de DNA do PCV2-1 quimérico recíproco possuía o gene de capsídeo ORF2 do PCV2 substituído pelo do PCV1 não patogênico na estrutura do genoma do PCV2 patogênico.
Se forem infecciosos in vitro, o clone de DNA do PCV1-2 quimérico produzi- rá o antígeno de capsídeo ORF2 do PCV2 e o clone de DNA do PCV2-1 quimérico recíproco expressará o antígeno de capsídeo ORF2 do PCV1 nas células PK-15 transfectadas. Os resultados mostraram que os clones de DNA do PCV1, do PCV1-2 quimérico e do PCV2-1 quimérico recíproco eram todos surpreendentemente infecciosos quando transfectados nas células PK-15 e expressavam as respectivas proteínas do antígeno do capsídeo viral que é mostrado através do IFA utilizando anticorpos específicos para o PCV1 ou para o PCV2. O IFA utilizando anticorpos monoclonais contra o ORF2 do PCV1 e anticorpos contra o PCV2 confirmou que os clones de DNA do PCV1 e de DNA do PCV2 eram infecciosos. O IFA utilizando o anti- corpo monoclonal específico ao ORF2 do PCV1 mostrou que o clone de DNA quimérico do PCV1-2 também era infeccioso. Aproximadamente 10- 20% das células PK-15 transfectadas eram positivas em relação ao antígeno de capsídeo do PCV1 e ao antígeno do PCV2 e expressavam o antígeno ORF2 do PCV1, dentro do núcleo das células transfectadas (figura 7).
Exemplo 15 Inoculacão Experimental de Porcos com Clones de DNA do PCV1, do PCV2. do PCV1-2 Quimérico e do PCV2-1 Quimérico Recíproco Para avaliar a imunogenicidade e a patogenicidade dos clones de DNA quiméricos, quarenta porcos isentos de agentes patogênicos espe- cíficos (SPF) de 4-6 semanas de idade foram distribuídos aleatoriamente em cinco câmaras de 8 animais cada. Antes da inoculação, os animais foram testados em relação aos anticorpos para o PCV, para o PRRSV, para o PPV e para o vírus da hepatite E suína. Em adição, as amostras de soro pré- inoculação foram testadas através da PCR em relação ao ácido nucléico do PCV1 e do PCV2 para confirmar que os porcos não são naturalmente infec- tados por qualquer um destes vírus. Os clones de DNA do PCV1, do PCV2, do PCV1-2 e do PCV2-1 foram todos inoculados através da injeção direta do DNA plasmideal clonado nos nodos linfáticos ilíacos superficiais dos porcos.
Os porcos no Grupo 1 receberam solução salina tamponada com fosfato (tampão PBS) e serviram como o controle negativo. Os porcos do Grupo 2 foram cada injetados nos nodos linfáticos ilíacos superficiais com 200 pg do clone de DNA do PCV1 infeccioso. Os porcos do Grupo 3 foram cada injeta- dos com 200 pg do clone de DNA do PCV2 infeccioso. Os porcos do Grupo 4 receberam cada injeções de 200 pg do clone de DNA do PCV1-2 quiméri- co infeccioso. Os porcos do Grupo 5 receberam cada 200 pg do clone de DNA do PCV2-1 quimérico recíproco infeccioso. Todos os animais foram monitorados diariamente em relação aos sinais clínicos da doença. Foram coletadas amostras de soro de cada animal em -2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 e 49 dias após a inoculação (DPI). No 21° DPI, quatro animais selecionados ale- atoriamente de cada grupo sofreram necrópsia. Os quatro animais restantes em cada grupo foram submetidos à necrópsia no 49° DPI. Vários tecidos e órgãos foram coletados durante a necrópsia como descrito anteriormente no Exemplo 7 e processados para o exame histológico. A imunogenicidade dos clones de DNA infecciosos do PCV1, do PCV2 e quiméricos foi examinada nos porcos. As amostras de soro coleta- das de todos os animais de controle e inoculados em -2(0), 7, 14, 21, 28, 35, 42 e 49 DPIs foram analisadas em relação à viremia do PCV1, do PCV2, do PCV1-2 e do PCV2-1 através da detecção pela PCR de seqüências de DNA específicas ao clone, em relação ao anticorpo anti-PCV1 por IFA e em rela- ção ao anticorpo anti-ORF2 do PCV2 por ELISA. Antes da inoculação no -2° DPI, os animais de todos os cinco grupos tiveram teste negativo pela PCR tanto para o DNA do PCV1 quanto o do PCV2.
Os animais de controle negativo eram negativos para a viremia tanto pelo PCV1 quanto pelo PCV2 ao longo de todo o estudo (ver Tabela 7, abaixo). Cinco porcos no grupo de controle não inoculado tinham anticorpo materno para o PCV2 detectável no -2e DPI e 2 porcos possuíam anticorpos maternos para o PCV1 detectável no 7Q DPI (ver Tabela 8, abaixo). Os anti- corpos maternos tanto para PCV1 quanto para PCV2 nestes leitões diminuí- ram no 21g DPI. Não foi detectada a soroconversão para PCV1 ou para PCV2 em qualquer um dos 8 porcos de controle não inoculados ao longo de todo o estudo.
No grupo inoculado com o PCV1, a viremia foi detectada primei- ro em um porco inoculado no 7S DPI (Tabela 7, abaixo) e foi detectada por último no 35- DPI. Cinco de 8 animais inoculados com o clone de DNA infec- cioso do PCV1 eram positivos em relação à viremia pelo PCV1. O período médio de viremia contínua pelo PCV1 era de 0,625 semana. No 213 DPI, todos os animais no grupo inoculado com o PCV1 tinha sofrido soroconver- são para o PCV1 e permaneceram positivos para os anticorpos para o PCV1 até o final do estudo no 49- DPI. É mostrado aqui que o clone de DNA do PCV2 é infeccioso em porcos. No grupo inoculado com o clone de DNA do PCV2, a viremia pelo PCV2 foi primeiro detectada no 7Õ DPI (Tabela 7, abaixo). No 21- DPI, todos os animais do Grupo 3 inoculados com o PCV2 eram positivos para a vire- mia pelo PCV2. O período médio de viremia pelo PCV2 era de 2,12 sema- nas. Dois porcos no grupo inoculado com o PCV2 possuíam níveis detectá- veis de anticorpos maternos para o PCV2 no 7- DPI (Tabela 8, abaixo) e os anticorpos matemos nestes leitões diminuíram no 14- DPI. A soroconversão para o PCV2, analisada pelo ELISA específico ao PCV2, foi primeiro detec- tada no 35s DPI. No 42° DPI, todos os porcos inoculados com o clone de DNA infeccioso do PCV2 sofreram soroconversão para o PCV2.
Nos porcos do Grupo 4 inoculados com o clone de DNA infeccio- so quimérico do PCV1-2, a viremia específica ao vírus quimérico foi primeiro detectada no 14° DPI (Tabela 7, abaixo). Quatro de 7 animais inoculados se tornaram virêmicos ao PCV1-2 entre o 14° DPI e o 42° DPI. O período médio da viremia pelo PCV1-2 era de 1 semana. Um porco tinha níveis detectáveis de anticorpos matemos para o PCV2 no 7 e no 14s DPIs, mas o anticorpo materno diminuiu no 21° DPI (Tabela 8, abaixo). A soroconversão para o anticorpo específico ao ORF2 do PCV2 ocorreu primeiro no 28° DPI. No 49° DPI, todos os porcos inoculados com o clone de DNA do PCV1-2 quimérico sofreram soroconversão para o anticorpo específico ao ORF2 do PCV2.
Nos porcos inoculados com o clone do PCV2-1 quimérico recí- proco, o DNA viral específico para o vírus quimérico PCV2-1 não foi detecta- do nas amostras de soro (Tabela 7, abaixo). Entretanto, no 21° DPI todos os animais no Grupo 5 sofreram soroconversão para o anticorpo para o PCV1.
Os produtos da PCR amplificados partindo de porcos selecionados em cada grupo foram seqüenciados e foi confirmado que eram os clones infecciosos respectivos autênticos utilizados em cada grupo. a Solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizada como o controle negativo b Oito porcos em cada grupo; número de positivos/número testado c DNA do PCV genômico e do PCV quimérico clonado no plasmídeo pSK
Exemplo 16 Avaliação Clínica Os porcos foram pesados no 0 DPI e no momento da necrópsia.
As temperaturas retais e os valores respiratórios clínicos, variando de 0 até 6 (0 = normal; 6 = grave) (P. G. Halbur e outros, "Comparison of the pathoge- nicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isola- tes with that of the Lelystad virus", Vet. Pathol. 32:648-660 (1995)), foram registrados em dias alternados desde 0 até 49 DPI. As observações clínicas, incluindo a evidência de doença no sistema nervoso central, de doença no fígado (icterícia), de doença musculoesquelética e de alterações no estado de saúde do corpo, também foram registradas diariamente. Uma equipe de duas pessoas realizou todas as avaliações clínicas.
Nenhum dos porcos de controle ou inoculados exibia sinais ób- vios da PMWS clínica de espectro completo. Não havia diferenças de ganho de peso ou das temperaturas retais médias entre qualquer um dos grupos.
Um dos porcos do Grupo 3 inoculado com o PCV1-2 morreu um dia após a inoculação. Após a necrópsia e a análise clínica, não foi detectado qualquer agente patogênico e a morte não foi associada ao procedimento de inocula- ção ou ao vírus PCV1-2 quimérico.
Exemplo 17 Patologia e Histopatoloqia Grosseiras Quatro porcos de cada grupo foram submetidos à necrópsia no 21e e no 49^0?!, respectivamente. A equipe de necrópsia não conhecia o estado de infecção dos porcos na necrópsia. Foram realizadas necrópsias completas em todos os porcos. Uma porcentagem estimada do pulmão com pneumonia grosseiramente visível foi registrada para cada porco com base um sistema de classificação descrito anteriormente (P. G. Halbur e outros, 1995, supra). Outras lesões tal como o aumento dos nodos linfáticos foram observadas separadamente. As secções para o exame histopatológico foram tiradas da concha nasal, dos pulmões (sete secções) (/d.), do coração, do cérebro, dos nodos linfáticos (traqueobronquial, ilíaco, mesentérico, subin- guinal), da tonsila, do timo, do fígado, da vesícula biliar, do baço, das articu- lações, do intestino delgado, do cólon, do pâncreas e dos rins. Os tecidos foram examinados de forma cega e receberam uma classificação subjetiva para a gravidade das lesões nos pulmões, nos nodos linfáticos e no fígado como é descrito no Exemplo 7. Os valores para os pulmões variavam de 0 (normal) até 3 (pneumonia intersticial linfo-histiocítica grave). Os valores para o fígado variavam de 0 (normal) até 3 (hepatite linfo-histiocítica grave).
Os valores para os nodos linfáticos eram para uma quantidade estimada de eliminação linfóide dos folículos variando de 0 (normal ou nenhuma elimina- ção linfóide) até 3 (eliminação linfóide e substituição histiocítica dos folícu- los).
Para determinar a patogenicidade dos clones de DNA infeccio- sos do PCV1, do PCV2, do PCV1-2 quimérico e do PCV2-1 quimérico recí- proco, foram primeiro determinadas as lesões grosseiras. Os resultados são mostrados na Tabela 9 abaixo. Os nodos linfáticos de animais do Grupo 1 de controle não inoculado eram normais tanto no 21 quanto no 49-DPIs. Os porcos nos quatro grupos inoculados possuíam graus variáveis de lesões grosseiras limitadas aos nodos linfáticos. Nos porcos do Grupo 2 inoculado com PCV1, os nodos linfáticos estavam de forma grosseira normais no 21-DPI, entretanto, foram detectados inchaço de suave até moderado e des- coloração dos nodos linfáticos no 49-DPI. Todos os porcos do Grupo 3 ino- culado com o PCV2 possuíam nodos linfáticos aumentados duas até cinco vezes o tamanho normal, que eram firmes e corados de castanho tanto no 21 quanto no 49QDPIs. Os nodos linfáticos dos animais inoculados com o PCV1-2 quimérico estavam suavemente a moderadamente inchados e des- corados tanto no 21 quanto no 492DPIs em 5 de 7 porcos. Nos porcos do Grupo 5, inoculados com o clone do PCV2-1, 1 de 8 animais possuíam in- chaço e descoloração suaves dos nodos linfáticos no 21SDPI. Os valores médios das lesões grosseiras dos nodos linfáticos em porcos inoculados com o clone do PCV1 -2 quimérico não eram estatisticamente diferentes da- queles nos Grupos 1, 2 e 5, mas eram estatisticamente diferentes daqueles dos porcos do Grupo 3 inoculado com o PCV2 patogênico tanto no 21 quanto no 49sDPIs. Os valores médios para as lesões linfóides grosseiras no 49^0ΡΙ dos animais inoculados com o PCV1, com o PCV2 e com o PCV1-2 não eram estatisticamente diferentes uns dos outros, mas eram todos esta- tisticamente diferentes dos valores médios de lesões grosseiras nos Grupos 1 e 5.
Depois, foram examinadas as lesões microscópicas. Os resulta- dos são mostrados na Tabela 10 abaixo. Nenhuma lesão microscópica foi detectada nos porcos do Grupo 1 de controle não inoculado ou nos porcos do Grupo 2 inoculado com o PCV1 em qualquer DPI. As lesões pulmonares microscópicas caracterizadas como pneumonia linfoplasmacítica peribron- quiolar e bronquiointersticial histiocítiica suave, foram observadas em 1 de 8 dos porcos inoculados com o PCV2. Nos animais inoculados com o PCV1-2 e com o PCV2-1, não foram observadas lesões microscópicas nos pulmões.
Nenhuma lesão foi observada nos timos de qualquer um dos porcos inocula- dos. A miocardite linfoplasmacítiica multifocal suave foi observada em 2 de 8 porcos no grupo inoculado com o PCV2. Os tecidos do coração dos animais inoculados com o PCV1-2 e com o PCV2-1 estavam livres de lesões micros- cópicas. A nefrite intersticial linfoplasmacítica multifocal suave foi observada em 4 de 8 porcos no grupo inoculado com o PCV2, em 2 de 7 porcos inocu- lados com o PCV1-2 e em 1 de 8 porcos inoculados com o PCV2-1. A elimi- nação linfóide suave até moderada e a substituição histiocítica dos folículos foram observadas na tonsila em 5 de 8 porcos, no baço de 3 de 8 porcos e nos nodos linfáticos de 8 de 8 porcos do grupo inoculado com o PCV2. Nos animais inoculados com o PCV1-2 quimérico, a eliminação linfóide e a subs- tituição histiocítica dos folículos foram observadas nos nodos linfáticos de 2 de 7 porcos mas não foram detectadas no baço ou nas tonsilas. Não foram observadas a eliminação linfóide e a substituição histiocítica dos folículos nos nodos linfáticos, no baço ou nas tonsilas dos animais inoculados com o PCV2-1 quimérico recíproco. A hepatite linfoplasmacítica suave a moderada foi observada em 7 dos 8 porcos inoculados com o PCV2. A hepatite linfo- plasmacítica suave foi observada em 2 dos 7 porcos inoculados com o PCV1-2 quimérico. Não foi observada a hepatite lifoplasmacítica nos porcos inoculados com o PCV2-1 quimérico recíproco. As lesões em outros tecidos não eram notáveis.
As lesões microscópicas nos pulmões, no fígado e nos nodos linfáticos foram registradas de acordo com um sistema de classificação pu- blicado (P. G. Halbur e outros, 1995, supra). Os resultados são mostrados na Tabela 10 abaixo. Os valores médios das lesões nos nodos linfáticos nos porcos do Grupo 4 inoculado com o PCV1-2 quimérico eram similares aos dos Grupos 1, 2 e 5 mas eram estatisticamente diferentes daqueles dos por- cos do Grupo 3 inoculado com o PCV2 patogênico, tanto no 21 quanto no 49eDPIs. Os valores médios das lesões microscópicas no fígado do grupo inoculado com o PCV1-2 quimérico no 21-DPI eram estatisticamente dife- rentes daqueles dos animais do Grupo 3 inoculado com o PCV2 mas eram similares aos dos porcos dos Grupos 1, 2 e 5 no 21fiDPI. No 49SDPI, os valo- res médios microscópicos do fígado dos porcos do Grupo 4 inoculados com o PCV1-2 não eram estatisticamente diferentes aos dos porcos dos Grupos 1, 2, 3 e 5. Não havia sistemas de classificação aceitáveis para os outros tecidos ou órgãos. a Solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizada como o controle ne- gativo. Os inóculos eram o DNA do PCV genômico ou do PCV quimérico clonado no plasmídeo pSK. b Quatro porcos de cada grupo foram submetidos à necrópsia no 21SDPI e os porcos restantes foram submetidos à necrópsia no 49-DPI; número de positivos/número testado. Número com lesões/número testado (faixa de gra- vidade estimada do alargamento dos nodos linfáticos) Exemplo 18 Soroloqia O sangue foi coletado de todos os porcos em -2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 e 49 DPIs. Os anticorpos do soro para o PRRSV foram analisados utilizando o Herd Check PRRSV ELISA (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Os anticorpos do soro para o PPV foram detectados através de um en- saio de inibição da hemaglutinação (Hl) (H. S. Joo e outros, "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody", Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)). Os anticorpos do soro para o PCV2 foram detectados através de um ELISA indireto modificado baseado na proteína de capsídeo ORF2 recombinante do PCV2 como é descrito anteriormente aqui (ver tam- bém P. Nawagitgul e outros, "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant caspid protein (ORF2)-based ELISA for the detec- tion of antibodies to PCV", Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)). Os anticorpos para o PCV1 foram detectados através de um ensaio de imunofluorescência indireto (IFA). As células PK-15 infectadas com o PCV1 foram cultivadas em lâminas em câmaras de oito cavidades da LabTek. Quando as células PK-15 infectadas atingiram aproximadamente 95-100% de confluência, as células infectadas foram fixadas com uma solu- ção contendo 80% de acetona e 20% de metano a 4°C durante 20 min. As células fixadas foram lavadas uma vez com o tampão PBS. Cem microlitros de amostra do soro de porco diluída 1:10 em PBS foram adicionados às câ- maras e incubados durante 1 hora a 37°C. As células foram então lavadas três vezes com PBS e incubadas durante 45 min a 37°C com o anticorpo secundário anti-suíno de cabra marcado com FITC. As lâminas foram sub- seqüentemente lavadas com PBS, montadas com fluoromount-G, cobertas com lamínula e examinadas sob um microscópio fluorescente. Para o con- trole positivo, as células infectadas com o PCV1 foram incubadas com um anticorpo monoclonal específico ao PCV1 diluído (doação do Dr. G. M.
Allan), seguida por uma incubação com a IgG anticamundongo de cabra marcada com FITC (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.). Para o controle negativo, as células infectadas com o PCV1 foram in- cubadas com o soro suíno diluído 1:10 isento dos anticorpos para PCV1 e para PCV2, seguida pela IgG anti-suíno de cabra marcada com FITC (Kirke- gaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.).
Exemplo 19 Detecção pela PCR
Para detectar a viremia pelo PCV1, pelo PCV2, pelo PCV1-2 quimérico e pelo PCV2-1 quimérico recíproco no soro de porcos inoculados, as amostras de soro coletadas em DPIs diferentes foram testadas através da PCR. O DNA viral foi extraído de 100 μί de cada amostra de soro utilizando o reagente DNAzol de acordo com o protocolo do fabricante (Molecular Re- search Center, Cincinnati, OH). O DNA extraído foi ressuspenso em água isenta de DNase, RNase e proteinase. Para a amplificação de seqüências genômicas específicas ao clone do PCV1, do PCV2, do PCV1-2 quimérico e do PCV2-1 quimérico recíproco, foram projetados dois conjuntos de pares de iniciadores para PCR contida (Tabela 6, acima). O primeiro conjunto de inici- adores contidos foi projetado com base nas seqüências do PCV1 publica- das. Os iniciadores Gen.PCVI apresentado na SEQ ID Ne: 20 e Orf.PCVI apresentado na SEQ ID N-: 19 amplificaram um fragmento de 400 pb na presença do genoma do PCV1. Os iniciadores contidos, Gen.PCVI contido apresentado na SEQ ID N°: 22 e Orf.PCVI contido apresentado na SEQ ID N°: 21, amplificaram um fragmento de 220 pb.
Para detectar a viremia pelo PCV2, o par de iniciadores do PCV2 Gen.PCV2 apresentado na SEQ ID N°: 24 e Orf.PCV2 apresentado na SEQ ID N°: 23 amplificaram um fragmento de 900 pb na presença do PCV2 na primeira rodada da PCR. Os iniciadores Gen.PCV2 contido apresentado na SEQ ID N°: 26 e Orf.PCV2 contido apresentado na SEQ ID N°: 25 ampli- ficaram um fragmento de 600 pb na PCR contida.
Para detectara viremia pelo PCV1-2 quimérico, a primeira roda- da da reação de PCR empregava o iniciador específico ao PCV1 Gen.PCVI apresentado na SEQ ID N°: 20 e o iniciador específico ao ORF2 do PCV2 Orf.PCV2 apresentado na SEQ ID N°: 23 para a amplificação de um frag- mento quimérico de 580 pb. Para a PCR contida o iniciador específico ao PCV1 Gen.PCVI contido apresentado na SEQ ID N°: 22 e o iniciador espe- cífico ao ORF2 do PCV2 Orf.PCV2 contido apresentado na SEQ ID N°: 25 foram utilizados para a amplificação de um fragmento quimérico de 370 pb.
Para detectar a viremia pelo PCV2-1 quimérico recíproco, a pri- meira rodada da PCR empregava o iniciador específico ao PCV2 Gen.PCV2 apresentado na SEQ ID N°: 24 e o iniciador específico ao ORF2 do PCV2 Orf.PCV2 apresentado na SEQ ID N°: 19 para a amplificação de um frag- mento quimérico de 700 pb. Para a PCR contida, o iniciador específico ao PCV2 Gen.PCV2 contido apresentado na SEQ ID N°: 26 e o iniciador espe- cífico ao ORF2 do PCV1 Orf.PCVI contido apresentado na SEQ ID N°: 21 foram utilizados para a amplificação de um fragmento quimérico de 460 pb.
Todos os parâmetros eram essencialmente os mesmos, consistindo em 38 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min, de recozimento a 45°C du- rante 1 min e de extensão a 72°C durante 1,5 min. As amostras de soro pro- venientes de porcos de controle negativo foram testadas através do ensaio de diagnóstico de PCR-RFLP, que pode detectar e diferenciar tanto o PCV1 quanto o PCV2 como é descrito anteriormente (M. Fenaux e outros, "Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postwea- ning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infectious with PCV- 1 and PCV-2", J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503 (2000)). Os produtos da PCR dos animais selecionados em cada grupo foram seqüenciados para verificar a origem do vírus que infecta os porcos.
Exemplo 20 Imuno-histoguímica (IHC) A detecção IHC do antígeno específico ao PCV2 foi realizada nos tecidos de nodos linfáticos coletados de todos os porcos submetidos à necrópsia no 21 e no 49QDPI. Foi utilizando um anti-soro policlonal de coelho contra o PCV2 para a IHC, de acordo com os procedimentos gerais descritos anteriormente (S. D. Sorden e outros, "Development of a polyclonal- antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 por- cine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue", J. Vet. Diagn.
Invest. 11:528-530(1999)).
Com base na coloração IHC do antígeno específico ao PCV2, os tecidos linfóide dos porcos de controle não inoculados, inoculados com o PCV1 e com o PCV2-1 eram negativos em relação ao antígeno do PCV2. O antígeno do PCV2 foi detectado nos tecidos linfóides de 7 de 8 animais no grupo inoculado com o PCV2. O antígeno do PCV2 foi também detectado no tecido linfóide de 1 de 7 porcos do grupo inoculado com o PCV1-2 quiméri- co.

Claims (19)

1. Molécula de ácido nucléico quimérico infecciosa de circovírus suíno (PCV1-2), caracterizada pelo fato de que apresenta uma molécula de ácido nucléico que codifica um PCV1 não patogênico infeccioso que contém um gene de quadro aberto de leitura 2 (ORF2) imunogênico de um PCV2 patogênico no lugar de um gene ORF2 da molécula de ácido nucléico do PCV1.
2. Molécula de ácido nucléico quimérico de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico qui- mérico possui uma seqüêncía de nucleotídeos apresentada na SEQ ID N°; 2, seu filamento ou uma seqüêncía de nucleotídeos complementar que possui pelo menos 95% de homología com a seqüêncía de nucleotídeos da SEQ ID N°: 2.
3. Vetor viral ou plasmídeo biologicamente funcional, caracteri- zado pelo fato de que contém a molécula de ácido nucléico quimérico como definida na reivindicação 2.
4. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pe- lo fato de que possui a Designação de Depósito de Patente ATGG PTA- 3912.
5. Célula hospedeira proca ri ótica isolada, caracterizada pelo fato de ser transfectada por um vetor que compreende a molécula de ácido nu- cléico quimérico como definida na reivindicação 2.
6. Circovírus suíno quimérico infeccioso avirulento, caracterizado pelo fato de que é produzido por células contendo a molécula de ácido nu- cléico como definida na reivindicação 2.
7. Circovírus suíno quimérico infeccioso de acordo com a reivin- dicação 6, caracterizado pelo fato de que as ditas células que contêm a mo- lécula de ácido nucléico quimérico estão contidas ou derivam de um plasmí- deo que possuí a Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-3912.
8. Processo para a produção de um produto polipeptídico imu- nogênico, o dito processo sendo caracterizado pelo fato de que compreende; o cultivo, sob condições nutricionais adequadas, de células procarióticas ou eucarióticas transfectadas com uma molécula de ácido nucléico como defini- da na reivindicação 2 de uma forma que permite a expressão do dito produto polipeptídico e o isolamento do produto polipeptidico desejado da expressão da dita molécula de ácido nucléico.
9. Vacina viral que protege um porco contra a infecção viral ou a síodrome de desgaste multissistêmico pós-desmame (PMWS) causada pelo PCV2, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo fisiologica- mente aceitável não tóxico e uma quantidade imunogênica de um membro selecionado do grupo que consiste em: (a) uma molécula de ácido nucléico quimérico que possui uma seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID N°: 2, seu filamento complementar ou uma seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 95% de homologia com a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N°: 2; (b) um plasmídeo ou um vetor viral biologicamente funcional que contém a molécula de ácido nucléico quimérico, o filamento complementar ou a seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos 95% de homologia com a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N°: 2; e (c) um circovírus suíno quimérico infeccioso avirulento feíto a partir de uma molécula de ácido nucléico quimérico de PCV1-2, em que o gene de capsídeo ORF2 de PCV1 ê substituído com gene de capsídeo ORF2 de PCV2.
10. Vacina viral de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a dita vacina contém o circovírus suíno quimérico vivo.
11. Uso da vacina como definida nas reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para pro- teção de um porco contra a infecção viral ou a síndrome de desgaste multis- sistêmico pós-desmame (PMWS) causado por PCV2.
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a vacina a um porco.
13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a vacina de forma parenteral, intranasal, intradermal ou transdermal ao porco.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a vacina de forma intralinfoide ou intra- muscular ao porco.
15. Processo para preparação da molécula de ácido nucléíco quimérico infecciosa do PCV1-2 como definida na reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que compreende a remoção de um gene de quadro aberto de leitura 2 (ORF2) de uma molécula de ácido nucléíco que codifica um PCV1 não patogênico infeccioso; a substituição da posição do gene ORF2 do PCV1 por um gene ORF2 imunogênico de um PCV2 patogênico; e a re- cuperação da molécula de ácido nucléíco quimérico.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito gene ORF2 do PCV2 é obtido da molécula de ácido nucléíco molecular do PCV2 contida em um vetor de expressão que possui a Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-3913,
17. Molécula de ácido nucléíco quimérica recíproca infecciosa do PCV2-1, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléíco que codifica um PCV2 patogênico infeccioso que possui um gene ORF2 imunogênico de um PCV1 não patogênico no lugar de um gene ORF2 da molécula de ácido nucléíco do PCV2.
18. Uso de uma quantidade imunogênica eficaz de um membro selecionado do grupo que consiste em: (a) uma molécula de ácido nucléíco quimérico que possui uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID N°: 2, seu filamento complementar ou uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 95% de homologia com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID N°: 2; (b) um plasmídeo ou um vetor viral biologicamente funcional que contém a molécula de ácido nucléíco quimérico, o filamento complementar ou a sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 95% de homologia com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID N°: 2; (c) um circo vírus suíno quimérico infeccioso avirulento; caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma vacina vira! utilizável para proteção de um porco contra a infecção viral ou a sín- drome de desgaste multissistêmico pós-desmame (PMWS) causada pelo PCV2,
19. Uso de acordo coro a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende o uso de circovírus suíno quiméríco vivo.
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