HRP20140002B1 - Himerni infektivni dnk klonovi, himerni cirkovirusi svinja i njihova uporaba - Google Patents

Abstract

Ovaj se izum odnosi na infektivne DNK klonove, infektivne himerne DNK klonove cirkovirusa svinja (SCV), cjepiva i načine zaštite svinja od viralne infekcije ili “postweaning multisystemic wasting” sindrom (PMWS) koji je uzrokovan od strane SCV2. Novi himerni infektivni DNK klon i njegov izveden avirulentni himerni virus konstruirani su od nepatogenog SCV1 u kojem imunogeni ORF gen iz patogenog SCV2 zamjenjuje gen iz nepatogenog SCV1, poželjno na istoj poziciji. Himerni virus pogodno zadržava nepatogeni fenotip od SCV1 ali izaziva specifične imune odgovore protiv patogenog SCV2. Ovaj izum dalje obuhvaća imunogene polipeptidne ekspresijske proizvode.This invention relates to infectious DNA clones, infectious chimeric DNA clones of porcine circovirus (PCV), vaccines and means of protecting pigs against a viral infection or "postweaning multisystemic wasting" syndrome (PMWS) caused by PCV2. The new chimeric infectious DNA clone and its derivative, avirulent chimeric virus are constructed from the nonpathogenic PCV1 in which the immunogenic ORF gene of the pathogenic PCV2 replaces the gene of the nonpathogenic PCV1, preferably in the same position. The chimeric virus advantageously retains the nonpathogenic phenotype of PCV1 but causes specific immune responses against the pathogenic PCV2. This invention further includes immunogenic polypeptide expression products.

Description

Područje izuma

Ovaj se izum odnosi na infektivne svinjske DNK klonove cirkovirusa tipa-1 (SCV1) i tipa-2 (SCV2), himerne SCV1-2 infektivne DNK klonove i žive himerne viruse koji su dobiveni od himernih DNK klonova, koji se mogu koristiti kao cjepiva.

Opis srodnoga područja

Svi patenti i publikacije koji se citiraju u ovoj specifikaciji u cijelosti su pokriveni referencama u ovoj prijavi.

Svinjski cirkovirus (SC) prvobitno je izoliran kao kontaminant stanične kulture svinjske bubrežne stanične linije PK-15 (I. Tischer et al., “A very small porcine virus with circular single-stranded DNA”, Nature 295:64-66 (1982); I. Tischer et al., “Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines”, Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2):153-167 (1974)). SCV je mali ikozahedralni virus bez omotača koji sadržava jednolančani cirkularni DNK genom od oko 1.76 kb. Scv je klasificiran u porodicu Circoviridae, koja se sastoji od tri životinjska cirkovirusa ((virus anemije pileta (chicken anemia virus-CAV), psittacine virus bolesti kljuna i perja, (psittacine beak and feather disease virus-PBFDV), i nedavno pronađen cirkovirus golubova, columbid circovirus (CoCV) kod golubova)) i tri biljna cirkovirusa (banana bunchy top virus, coconut foliar decay virus i subterranean clover stunt virus) (M. R. Bassami et al., “Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circovirus and chicken anemia virus”, Virology 249:453-459 (1998); J. Mankertz et al., “Transcription analysis of porcine circovirus (PCV)”, Virus Genes 16:267-276 (1998); A. Mankertz et al., “Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons”, Arch Virol. 145:2469-2479 (2000); B. M. Meehan et al., “ Sequencing of porcine circovirus DNA:affinities with plant circoviruses” J. Gen. Virol. 78:221-227 (1997); B. M. Meehan et al., “Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs” J. gen. Virol. 79:2171-2179 (1998); D. Todd et al., “Comparasion of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes”, Arch. Virol. 117:129-135 (1991)). Članovi tri ranije priznata životinjska cirkovirusa (SCV, CAV, i PBFDV) međusobno ne dijele homologiju nukleotidnih sekvenci niti antigene determinante (M. R. Bassami et al., 1998, supra; D. Todd et al., 1991, supra). Genom novo identificiranog CoCV pokazuje oko 40% identičnosti u nukleotidnoj sekvenci sa sekvencom SCV (A. Menkertz et al., “Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons”, Arch. Vuirol. 145:2469-2479 (2000)). Nedavno je identificiran novi humani cirkovirus sa cirkularnim genomom, koji je nazvan virus prenosiv transfuzijom (transfusion transmitted virus ili TT virus (TTV)), koji je izoliran iz individua koje su imale post-transfuzijski hepatitis (H. Miyata et al., “Identification of novel GC-rich 113- nucleotide region to complete the circular, single stranded DNA genome of the TT virus, the first human circovirus” J. Virol. 73:3582-3586 (1999); T. Nischizawa et al., “ A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241:92-97 (1997)). Dodatno, identificiran je humani TTV-u sličan mini virus (human TTV-lije mini virus (TLMV)) koji je izoliran iz krvi normalnih davatelja krvi (P. Biagini et al., “Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus -like mini virus human isolates” J. Gen. Virol. 82:379-383 (2001); K. Takahashi te la., “Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus” Arch. Virol. 145:979-93 (2000)) i treći novi humani cirkovirus, poznat kao SEN virus (SENV) isto je tako otkriven kod ljudi s post transfuzijskim hepatitisom (T. Umemura et al., “SEN virus infection and its relationship to transfusion associated hepatitis”, Hepathology 33:1303-1311 (2001)). Organizacija genoma i humanog TTV i TMLV slična je organizaciji genoma CAV (P. Biagini et al., 2001, supra; H. Miyata te al., 1999, supra; K. Takahashi et al.,2000, supra). Iako su antitijela na SCV pronađena kod različitih životinjskih vrsta uključujući ljude, miševe, stoku i svinje (G. M. Allan et al., “Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus” Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994); G. C. Dulac and A. Afshar, “Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCCCCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs”, Can. J. Vet. Res. 53:431-433 (1989); S. Edwards and J. J. Sands, “Evidence of circular infection in British pigs”, Vet. Rec. 134:680-1 (1994); J. C. Harding and E. G. Clark, “Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)”, Swine Health and Production 5:201-203 (1997); R. K. Hines and P. D. Lukert, “Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States,” Swine Health and Production 3:71-73 (1995); G. P. Nayar et al., “Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses”, Can. Vet. J. 40:277-278 (1999; I. Tischer te al., “Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms”, Arch. Virol. 140:737-743 (1995); I Tischer et al., “Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle” Arch. Virol. 140:1427-1439 (1995)) jako malo se zna o patogenezi SCV u ovim životinjskim vrstama. Eksperimentalno inficiranje svinja sa SCV dobivenim iz PK-15 stanica nije dovelo do nastanka kliničke slike bolesti i tako se ovaj virus ne svrstava u patogene za svinje (G. M. Allan et al., “Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examinatiom of pig foetal material”, Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995); I. Tischer et al., “Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus,” Arch. Virol.91:271-276 (1986)). Nepatogeni SCV koji je dobiven iz kontaminirane PK-15 stanične linije označen je kao svinjski cirkovirus tipa 1 ili SCV1.

“Postweaning multisystemic wasting” sindrom (PMWS), prvi put opisan 1991 (j. C. Harding i E. G. Clark, 1997, supra), složena je bolest praščića koji ne sisaju- odbijeni od sise (weaning), koje se ubrzano širi. Budući da prijeti ozbiljnim ekonomskim utjecajem na industriju svinja, postala je hitna potreba da se razvije cjepivo protiv SCV2, primarni uzročni agens PMWS. PMWS uglavnom djeluje na praščiće starosti 5-18 tjedana. Klinički znakovi PMSW uključuju progresivni gubitak težine, dispneu, tahipneu, anemiju, dijareju i žuticu. Stopa mortaliteta može varirati od 1% do 2% i do 40% u nekim kompliciranim slučajevima u Velikoj Britaniji (M. Muirhead, “Source of information on PMWS/PDNS,” VET. REC. 150:456 (2002)). Mikroskopske lezije koje su karakteristične za PMSW uključuju granulomatoznu intersticijalnu upalu pluća limfadenopatiju, hepatitis, i nefritis (G. M. Allan i J. A. Ellis, “porcine circoviruses: a review” J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000); J. C. Harding and E. G. Clark, 1997, supra). PMWS sada je priznat kod svinja u Kanadi, Sjedinjenim Američkim Državama (G: M. Allan et al., “Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes,” Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan et al., “Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe”, J. Vet. Diag. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. Ellis et al., “Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome” Can. Vet. J 39:44-51; A. L. Hamel et al., Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs” J. Virol. 72:5262-5267 (1998); M. Kiupei et al., “Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana, “ Vet. Pathol. 35:303-307 (1998); R. Larochelle et al., “Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebea as determined by PCR,” Vet.Rec. 145:140-142 (1999); B. M. meehan et al., 1998, supra; I Morozov et al., “Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome” J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)), većini europskih zemalja (G. M Allan et al., “Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe” J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998), G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; S. Kennedy et al., “Porcine circovirus infection in Northern Ireland,” Vet. Rec. 142:495-496 (1998); A. Mankertz et al., “Characterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France” Virus Res. 66:65-77 (2000); C. Rosell et al., “Identification of porcine circovirus in tissue of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome” Vet. Rec. 146:40-43 (2000); P Spillane et al., “Porcine circovirus infection in Republic of Ireland” vet. Rec. 143:511-512 (1998); G. J. Wellenberg et al., “Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post- postweaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands”, Vet. Quart. 22:167-72 (2000) i u nekim zemljama u Aziji (C. Choi et al., “Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polinerase chain reaction” J. Vet. Diagn. Invest. 12:151-153 (2000); A. Onuki et al., “Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan,” J. Vet.Med. Sci. 61:1119-1123 (1999)). PMWS potencijalno ima ozbiljan ekonomski utjecaj na industriju svinja u čitavom svijetu.

Primarni uzročni agens PMWS patogena je vrsta SCV koja je određena kao svinjski cirkovirus tipa 2 ili SCV (G. M. Allan et al., “Novel porcine circovirus from pigs with wasting disease syndrome” Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan et al., “Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with wasting disease syndrome in the USA and Europe” J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan et al., “Isolation and characterization of porcine circovirus from pigs with postweaning wasting syndrome in Spain, Denmark and Northern Ireland” Vet. Microbiol. 66:115-23 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. A. Ellis et al., 1998, supra; A. L. Hamel et al., 1998, supra; B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., 1998, supra). Kompletna genomska sekvenca PMSWS-povezanog SCV2 je određena (M. Fenaux et al., “Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geografic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polimorphism assay to detect and differentiate between infections with 3PCV-1 and PCV-2” J. Clin. Microbiol. 38:2494-503 (2000): A. L. Hamel et al., 1998, supra; J. Mankertz et al., 1998, supra; B. M. Meehan et al., 1997, supra; B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., 1998, supra).

SCV1 je sveprisutan kod svinja ali ne predstavlja patogen za njih. Za razliku od njega, genski je srodan SCV2 patogen i izaziva PMWS kod svinja. Analiza sekvenci otkrila je da PMWS-povezan SCV2 dijeli samo oko 75% identičnosti u nukleotidnoj sekvenci s nepatogenim SCV1. ORF2 gen oba nepatogena SCV1 i patogenog SCV2 kodiraju za glavni inmunogeni viralni protein kapsida (P. Nawagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002); P. Nawagitgul et al. , "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)).

Inicijalni pokušaji da se reproduciraju klinički PMWS u konvencionalnim svinjama pomoću inokulacije nisu dali rezultate (M. Balasch et al., "Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome," J. Comp. Pathol. 121:139-148 (1999); M. Fenaux et al., "Cloned Genomic DNA of Type 2 Porcine Circovirus (PCV-2) Is Infectious When Injected Directly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinical Disease, Virus Distribution, and Pathologic Lesions," J. Virol. 76:541-551 (2002)). Eksperimentalna reprodukcija kliničkog PMWS kod gnotobiotskih svinja i konvencionalnih svinja s tkivnim homogenatima iz svinja kod kojih se prirodno javlja PMSW i sa staničnom kulturom propagiranom sa SCV2 davali su miješane rezultate. Klinički PMWS reproduciran je kod gnotobiotskih (SBP) svinja uskraćenih za kolostrum i svinja dobivenih carskim rezom koje su koinficirane sa SCV2 i svinjskim parvovirusom (SPV) (G. M. Allan et al. , "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus," Vet. Pathol. 37:254-263 (2000)), and in PCV2-inoculated gnotobiotic pigs when their immune system was activated by keyhole hemocyanin in incomplete Freund parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); S. Krakowka et al., "Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome's adjuvant (S. Krakowka et al., "Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2)," Vet. Pathol. 38:31-42 (2001)).

Klinički PMWS isto je tako reproduciran kod dobivenih carskim rezom /uskraćenih za kolostrum svinja (CD/CD) koje su inokulirane samo sa SCV2 (P. A. Harms et al., "Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus," Vet. Pathol. 38:528-539 (2001)) i kod konvencionalnih svinja koje su koinficirane sa SCV2 i s ili svinjskim parvovirusom (SPV) ili svinjskim reproduktivnim i respiratornim sindrom vitusom (SRRSV) (A. Rivora et al., "Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2," J. Virol. 76: 3232-3239 (2002)). U slučajevima SRRSV/SCV2 koinfekcija, karakteristični patološki znaci vezani za PMWS kao što je limfoidno raspadanje, granulomatozna upala i nekrotični hepatitis inducirani su SCV2-om a ne SRRSV (P. A. Harms et al ., 2001, supra ). Međutim, klinički PMWS reproduciran je kod gnotobiotskih svinja koje su inficirane samo sa SCV2 (G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); M. Balasch et al. , 1999, supra ; J. Ellis et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets," J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); S. Kennedy et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus" J. Comp. Pathol. 122:9-24 (2000); S. Krakowka et al. , 2001, supra; S. Krakowka et al., 2000, supra; R. M. Pogranichnyy et al., "Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection," Viral. Immunol. 13:143-153 (2000)). Inokulumi virusa koji su upotrebljavani u ovim studijama bili su ili homogenati tkiva iz svinja kod kojih se prirodno može javiti PMWS, ili virusi propagirani u PK-15 staničnim kulturama (G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); M. Balasch et al., 1999, supra; J. Ellis et al., 1999, supra; S. Kennedy et al., 2000, supra; S. Krakowka et al., 2001, supra; S. Krakowka et al., 2000, supra; R. M. Pogranichnyy et al., 2000, supra). Kako ovi tkivni homogenati mogu sadržavati druge rasprostranjene svinjske agense kao PPV (SPV) i svinjski reproduktivni i respiratorni sindrom virus (SRRSV) G. M. Allan et al. , "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al. , "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); G.M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra ; J. A. Ellis et al. , "Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Vet. Diagn. Invest. 12:21-27 (2000); C. Rosell et al. , 2000, supra ), i kako je ATCC PK-15 stanična linija koja se koristi za propagiranje SCV2 perzistentno inficirana sa SCV1 (G. C. Dulac and A. Afshar, 1989, supra), klinička bolest i patološke lezije reproducirane u ovim studijama ne moraju biti uzrokovane samo SCV2 infekcijom (G. M. Allan et al. , "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al. , "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al. , "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra ; J. A. Ellis et al. , 2000, supra ).

Klinički PMWS isto je tako reproduciran kod CDCD svinja inokuliranih sa SCV2 kada su cijepljene s Mycoplasma hyopneumoniae (G. M. Allan et al ., "Immunostimulation, PCV-2 and PMWS," Vet. Rec. 147:171-172 (2000)). U dvije skorašnje studije od strane G. M Allan et al., "Neonatal vaccination for Mycoplasma hyopneumoniae and postweaning multisystemic wasting syndrome: a field trial," Pig J. 48:34-41 (2001), and S. C. Kyriakis et al., "The effects of immuno-modulation on the clinical and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Comp. Pathol. 126:38-46 (2002), testiran je efekt imuno-modulacije cjepiva Mycoplasma hyopneumoniae na razvoj PMWS kod endemičnih krda, i pokazan je značajan pad u broju PMWS slučajeva kod necijepljene grupe kada su uspoređene sa cijepljenim životinjama. Međutim, u još jednoj skorašnjoj studiji u kojoj su korišteni konvencionalni SBP praščići u kontroliranim laboratorijskim uvjetima nije bilo moguće reproducirati ovakav efekt, što je ukazalo na to da cjepivo s Mycoplasma hyopneumoniae može potencijalno utjecati na razvoj kliničkog PMWS ali jasno je da ima sekundarnu ulogu pored SCV2 infekcije. Bazirano na ovoj i drugim studijama, SCV2 se nedvosmisleno smatra primarnim ali ne i ekskluzivnim uzročnim agensom PMWS.

Nedostatak stoka infektivnog virusa biološki čiste forme SCV2 otežao je razumijevanje SCV2 patogeneze i etiološke uloge SCV2 u PMWS. Cjepivo protiv PPV i vjerojatno SRRSV nisu pokazale da uvijek sprečavaju nastanak PMWS kod svinja inficiranih sa SCV2. Kao posljedica toga jako je otežano pronalaženje s jedne strane sigurnog, a s druge stranog potentnog cjepiva koje specifično cilja PMWS. Postoji definitivna potreba za proizvodnjom efikasnog, sigurnog cjepiva protiv SCV2 infekcija i PMWS prepoznata u veterini.

U.S. Patent broj 6,287,856 (Poet et al.) i WO 99/459 odnose se na nukleinske kiseline iz ptičjeg virusa bolesti kljuna i pera- psittacine beak and feather disease virus (BFDV), cirkovirusa koji inficira ptičje vrste, i iz svinjskog virkovirusa (SCV). Patent predlaže kompozicije cjepiva koja sadržavaju golu DNK ili IRNK i otkriva nukleokiselinski vektor za tranzijentnu ekspresiju SCV u eukariotskoj stanici koja obuhvaća cis djelujuće transkripcijske ili translacijske regulatorne sekvence dobivene iz humanog citomegalovirusnog trenutnog ili ranogenskog enhensera (pojačivač) ili promotora funkcijski povezanog za nukleinsku kiselinu te sekvence. Međutim, kako je SCV DNK dobivena samo od PK-15 stanične linije, normalno je da se obuhvati i nepatogeni SCV1 koji je otkriven skoro prije 30 godina od strane I. Tischer et al ., 1974, supra , i samim tim nije vjerojatno efikasan u izazivanju imune reakcije na SCV2 ili infekciju izazvanu sa SCV2. Subjedinična (subunit) cjepiva rekombinantnih proteina napravljena suod vektora koji obuhvaćaju otvorene okvire čitanja isto se tako predlažu u patentu ali otvoreni okviri čitanja iz SCV nisu dobro okarakterizirani niti se međusobno mogu razlikovati. Kako su izvor SCV DNK PK-15 stanice, proteini proizvedeni iz tih vektora koji obuhvaćaju otvorene okvire čitanja SCV1 ne bi imale pouzdane imunogene osobine, ako bi ih uopće imale, protiv SCV2.

U.S. Patent No. 6,217,883 (Allan et al.) and francuski Patent No. 2,781,159B odnose se na izolaciju pet SCV vrsta iz plućnih ili ganglijskih uzoraka uzetih iz svinja koje su inficirane s PMWS u Kanadi, Kaliforniji i Francuskoj (Brittany), i njihovu uporabu u imunogenoj kompoziciji u kombinaciji s makar jednim svinjskim parvovirusnim antigenom. Proteini koje kodiraju otvoreni okviri čitanja (open reading frame-ORF) koji se sastoji od ORF1 i ORF3 detaljno su opisani u patentu međutim ne postoji tumačenje niti jednog specifičnog proteina koji pokazuje imunogene osobine. Patent dalje otkriva vektore koji se sastoje od DNK plazmida, linearnih DNK molekula i rekombinantnih virusa koji sadržavaju i eksprimiraju in vivo molekulu nukleinske kiseline koja kodira SCV antigen. Nekoliko drugih referenci, na primjer U.S. Patent No. 6,391,314 B1; U.S. Patent No. 6,368,601 B1; francuski Patent No. 2,769,321; francuski Patent No. 2,769,322; WO 01/96377 A2; WO 00/01409; WO 99/18214; WO 00/77216 A2; WO 01/16330 A2; WO 99/29871; itd., isto tako opisuju dostavljanje SCV1 ili SCV2 polipeptida ili nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide različitih vrsta.

Međutim, nepatogeni SCV1 neće biti od koristi protiv SCV infekcije i patogeni SCV2 vrste koji su opisani u znanosti, čak i atenuirani, vrlo će vjerojatno biti ograničene vrijednosti zbog tendencije živog virusa da se vraća u svoje virulentno stanje. Zato, i dalje u ovom području znanosti postoji dugoročna potreba za živim infektivnim, nepatogenim antigenom za inokulaciju svinja protiv ozbiljne infekcije ili PMWS koje izaziva SCV2, i koji je efikasan i ostaje siguran u veterinarskim cjepivima. Ovi ciljevi zadovoljeni su konstrukcijom živog himernog svinjskog cirkovirusa koji je ovdje opisan, i koji se bazira na genomskoj osnovi nepatogenog SCV1 kojeg je izolirao I. Tischer et al., skoro prije 30 godina.

Novi himerni svinjski cirkovirus iz ovoga izuma sposoban je zadovoljiti dugoročnu potrebu tako što jedinstveno i s prednošću zadržava nepatogeni fenotip SCV1 ali izaziva specifični imuni odgovor protiv patogenog SCV2.

Kratak sadržaj izuma

Ovaj izum tiče se infektivnih himernih DNK klonova svinjskog cirkovirusa (SCV) i živih himernih virusa dobivenih iz DNK klonova koji se mogu koristiti kao cjepiva.

Novi živi himerni, genetski avirulentni virusi rade se od nepatogene SCV genomske strukture u kojem gen za imunogenost patogene SCV2 vrste zamjenjuje gen iz SCV1, tipično na istoj odgovarajućoj poziciji. Izum obuhvaća biološki funkcionalne plazmide, virusne vektore i slične koji sadržavaju nove rekombinantne molekule nukleinskih kiselina koji su ovdje opisani, pogodne stanice domaćine transfektirane vektorima koji sadržavaju DNK i ekspresijske proizvode, imunogene polipeptide. Isto tako u okviru polja koje obuhvaća ova prijava nov je postupak za zaštitu svinja od viralne infekcije ili “postweaning multisystemic wasting” sindrom (PMWS) kojeg izaziva SCV2 i koji obuhvaća dostavljanje svinji, kojoj je potrebna takva zaštita, imunološki efikasne količine cjepiva koje obuhvaća na primjer himernu DNK kloniranu u plazmid, himerni virus dobiven iz klona s himernom DNK, polipeptidne proizvode koji se eksprimiraju s DNK koja je ovdje opisana, itd. Ovaj izum dalje osigurava novu infektivnu SCV2 molekularnu DNK i recipročne SCV klonove s himernom DNK koji su našli upotrebu kao pokusni modeli za dobivanje ili karakterizaciju novih avirulentnih viralnih cjepiva.

Kratak opis slika

Povijest izuma i njegovo udaljavanje od znanosti dalje će biti opisana u tekstu koji slijedi s referencama koje su priložene uz slike naznačeno time da:

Slika 1 predstavlja konstrukciju molekularnog DNK klona infektivnog SCV2.Relativne pozicije para prajmera koji su upotrijebljeni za umnožavanje kompletnog SCV2 genoma označeni s strelicama (reverzni prajmer PCVSAC2, forward prajmer PCVSAC2). SCV2 genomska DNK koja je umnožena PCR-om (lančana reakcija polimeraze) izrezana je sa SacII restrikcijskim enzimom, i zatim pročišćena. Pročišćena i izrezana sa SacII genomska DNK ligirana je da bi formirala konkatemere (concatemers). Ligirani konkatemeri razdvajaju se elektroforezom na gelu, tandem genomski dimer SCV2 se pročišćava i klonira u pSK vektor koji je već izrezan sa SacII enzimom u cilju dobivanja molekularnog SCV2 DNK klona.

Slike 2A i 2B pokazuju da je klonirana SCV2 plazmidna DNK infektivna kada se transfektira in vitro u PK-15 stanice. Slika 2A prikazuje detekciju SCV2 antigena pomoću eseja imunoflorescencije (IFE) u PK-15 stanicama koje su transfektirane s kloniranom SCV2 plazmidnom DNK.Intenzivno imuno bojanje SCV2 antigena vidi se u jedru, i nešto manje u citoplazmi transfektiranih stanica.Slika 2B pokazuje lažno-transfektirane PK-15 stanice.

Slika 3A prikazuje pluća svinje koja je inokulirana intralimfoidnim putem sa SCV2 DNK pri 21 DPI. Pluća su poput gume, ne mogu kolabirati (collapse) i išarana su smeđe-crveno.Traheobronhijalni limfni čvorovi vidno su uvećani i smeđi (strelice).

Slika 3B predstavlja mikroskopski preparat (isječak) normalnog plućnog krila iz kontrolne svinje (25X).

Slika 3C predstavlja mikroskopski isječak pluća iz svinje sa slike 3A. Obratiti pažnju na peribronhionalnu limfohistiocističnu upalu i blago nekrotični bronhiolitis (25X).

Slika 3D ilustracija je imunohistokemijskog bojenja pluća sa slike 3A. Obratiti pažnju na SCV2 antigen u makrofazima (strelice) i fibroblastima sličnim stanicama (samo glave strelica) u dišnim putovima (64X).

Slika 4A prikazuje normalni limfni čvor iz kontrolne svinje. Obratiti pažnju na dobro definirane limfoidne folikule (strelice) (25X).

Slika 4B predstavlja mikroskopski presjek traheobranhijalnog limfnog čvora svinje sa slike 3A koja je inokulirana 21 dan ranije intralimfoidnim putem s kloniranom SVC2 genomskom DNK. Limfoidni folikuli slabo su definirani, postoji blago do umjereno limfno raspadanje (depletion), i blaga multifokalna granulomatozna upala (25X).

Slika 4C predstavlja mikroskopski isječak limfnog čvora sa slike 4B na većem povećanju i fokusiran je na jedan folikul. Zapaziti slabo definirane folikule s makrofazima i gigantskim stanicama (strelice) koje zamjenjuju folikularne limfocite (64X).

Slika 4D prikazuje imunohistokemijsku detekciju SCV2 antigena u istom limfnom čvoru kao što je ona na slici 4B u makrofazima (strelice) i gigantskim stanicama (male strelice), i dendričnim stanicama slične stanice (velike glave strelica) u folikulima (64X).

Slika 5 prikazuje konstruiranje himernog SCV1-2 (SCV1/SCV2) DNK klona s nepatogenim SCV1 genomom koji nosi imunogeni ORF2 gen kapsida patogenog SCV2. Dimerizirani DNK klon upotrebljava se za in vitro transfekciju PK-15 stanica da bi se proizveo živi himerni virus koji eksprimira ORF2 protein iz SCV2, i za in vivo životinjske pokuse da bi se potvrdila aktivnost.

Slika 6 predstavlja konstrukciju i organizaciju infektivnih SCV1, SCV2, himernih SCV1-2 i recipročno himernih SCV2-1 molekularnih DNK klonova. SCV DNK klon konstruiran je ligiranjem dva kompletna linearna SCV2 genoma u tandemu u Bluescript SK vektor (pSK) pomoć u opće poznatih postupaka ranije već opisanih (M. Fenaux et al., 2002, supra). SCV1 DNK klon konstruiran je ligiranjem dva kompletna linearna SCV1 genoma u tandemu u pSK vektor.Himerni SCV1-2 DNK kolon konstruiran je zamjenom ORF2 kapsidnog gena iz SCV1 s istim iz SCV2 u nepatogenoj SCV1 genomskoj osovini (backbone) u pSK vektor.Recipročni SCV2-1 DNK klon konstruiran je zamjenom ORF2 kapsidnog gena patogenog SCV2 s onim iz nepatogenog SCV1 u patogenoj SCV2 genomskoj osovini (backbone) u pSK vektoru.Oba himerna klona dimeri su u pSK vektoru.Strelice predstavljaju relativne pozicije PCR prajmera za detekciju SCV1, SCV2, SCV1-2 i SCV2-1 viremija u inokuliranim životinjama.

Slike 7A-7J pokazuju da su SCV1, SCV2, himerni SCV1-2 i recipročno himerni SCV2-1 DNK kolonovi infektivni i eksprimiraju odgovarajuće viralne antigene kada se transtektiraju in vitro u PK-15 stanice.Lijevi panel (7A, 7C, 7E, 7G i 7I) obojen je s monoklonalnim antitijelima protiv SCV1 ORF2.Desni panel (7B, 7D, 7F, 7H i 7J) obojen je s antitijelima protiv SCV2.Paneli 7A i 7B lažno su transfektirane PK-15 stanice. Paneli 7C i 7D PK-15 stanice su transfektirane sa SCV1 DNK klonom. Paneli 7E i 7F su PK-15 stanice transfektirane sa SCV2 DNK klonom. Paneli 7G i 7H su PK-15 stanice transfektirane s himernim SCV1-2 DNK klonom.Paneli 7I i 7J PK-15 stanice su transfektirane s recipročnim SCV2-1 DNK klonom.

Slika 8 predstavlja cjelokupnu DNK sekvencu klonirane SCV2 molekularne DNK (koja odgovara SEQ ID NO:1).

Slika 9 predstavlja cjelokupnu DNK sekvencu klonirane himerne SCV1-2 DNK (koja odgovara SEQ ID NO:2).

Slika 10 predstavlja DNK sekvencu imunogenog ORF2 kapsidnog gena klonirane himerne SCV1-2 DNK (koja odgovara SEQ ID NO:3).

Slika 11 predstavlja pretpostavljenu amino kiselinsku transleciju imunogenog ORF2 kapsidnog gena himerne SCV1-2 DNK (koja odgovara SEQ ID NO:4).

Detaljan opis izuma

U skladu s ovim izumom, osigurane su infektivne molekulske i himerne molekule nukleinskih kiselina svinjskog cirkovirusa (SCV), živi himerni virusi koji su proizvedeni od himerne molekule nukleinske kiseline i veterinarskih cjepiva u cilju zaštite svinja od viralne infekcije ili postweaning multisystemic wasting syndroma (PMWS) koji izaziva SCV2. Ovaj izum dalje osigurava imunogene polipeptidne ekspresijske produkte koji se mogu iskoristiti kao cjepiva.

Nova avirulentna infektivna himerna DNK molekula SCV (SCV1-2) obuhvaća molekulu nukleinske kiseline koja kodira infektivni nepatogeni SCV1 koji sadržava imunogeni otvoren okvir čitanja (open reading frame-ORF) gena patogenog SCV2 na mjestu ORF gena u SCV1 genomu. Infektivni himerni SCV1-2 DNK klon poželjno sadržava imunogeni kapsidni gen (ORF2) od SCV2 DNK kloniranog u genomsku kralješnicu (backbone) infektivnog, nepatogenog SCV1 DNK klona.

Nova avirulentna infektivna himerna DNK molekula SCV (SCV1-2) obuhvaća molekulu nukleinske kiseline koja kodira infektivni, nepatogeni SCV1 koji sadržava imunogeni otvoreni okvir čitanja (ORF) gen patogenog SCV2 umjesto ORF gena u SCV1 genomu. Poželjno je da infektivni himerni SCV1-2 klon sadržava imunogeni gen kapsida (ORF2) iz SCV2 DNK kloniran u genomsku osovinu (backbone) infektivnog nepatogenog SCV1 DNK klona. Generalno, kapsidni gen iz SCV2 DNK zamjenjuje ORF gen SCV1 DNK u nepatogenoj SCV1 genomskoj strukturi ali se razmišlja i o činjenici da se putem genetičkog inženjerstva mogu konstruirati različite pozicijske permutacije i tako dobiti avirulentni ili atenuirani himerni DNK klonovi. Recipročni himerni infektivni SCV1-2 DNK klon između SCV1 i SCV2 stavljen je kao kontrola da bi se analizirao himerni SCV1-2 klon iz ovoga izuma i konstruiran je tako što je zamijenjen kapsidni gen iz SCV2 s istim iz SCV1 u osovini patogenog SCV2 infektivnog DNK klona. Pored toga što se koristi kao eksperimentalni model, recipročni himerni infektivni SCV2-1DNK klon može naći primjenu u specifično skrojenim cjepivima.

Za kloniranu genomsku DNK SCV2 koja je ovdje opisana pokazano je da su i in vitro i in vivo infektvni kada se transtektiraju u PK-15 stanice i kada se daju svinjama.Infektivni SCV2 DNK klon proizvodi patološke lezije koje su karakteristične za PMWS kod svinja i tako omogućava poboljšanu karakterizaciju kliničke bolesti i razumijevanju distribucije virusa u stanicama tkiva. Ovaj novi pripravni reproduktivni patogeni agens pruža mogućnost za razvoj pogodnog programa cjepiva u cilju prevencije PMWS kod svinja.

Novi himerni SCV1-2 DNK klon isto je tako infektivan i u in vitro transfekciji PK-15 stanica i u in vivo dostavljanju svinjama. U transfektiranim PK-15 stanicama himerni SCV1-2 DNK eksprimira SCV2 kapsidni antigen (imunogeni kapsidni protein iz SCV2) dok recipročni himerni SCV2-1 DNK klon eksprimira SCV1 kapsidni antigen, koji je demonstriran putem eseja imunofluorescencije (IFE) pomoću antitijela specifičnih za SCV1 ili SCV2 kapsidni antigen. Serokonverzija u SCV2-specifično antitijelo detektirana je kod svinja koje su inokulirane s infektivnim SCV2 kolonom kao i s himernim SCV1-2 klonom. Detektiranje serokonverzije u SCV2-specifično antitijelo pokazuje da himerni SCV1-2 DNK klon indicira SCV2-specifično antitijelo kod inficiranih svinja i kao posljedica toga ima ulogu u zaštiti svinja od infekcije sa SCV2.

Primjeri koji slijede detaljnije opisuju procjenu imunogenosti i patogenosti himernih DNK klonova kod inokuliranih svinja. U osnovi, serokonverzija u antitijela protiv SCV2 ORF2 antigena detektirana su kod svinja koje su inokulirane sa SCV2 DNK klonom (grupa 3), i himernim SCV1-2 DNK klonom (grupa 4). Sve svinje inokulirane sa SCV1 klonom i recipročnim himernim SCV2-1 DNK klonom (grupe 2 i 5) podliježu serokonverziji u SCV1 antitijelo. Virusi koji su izvađeni iz selektiranih svinja u svakoj grupi djelomice su sekvencirani i potvrđeno je da su autentični odgovarajući infektivni DNK klonovi koji su korišteni u inokulaciji. Krupne i mikroskopske lezije u različitim tkivima životinja koje su inokulirane sa SCV2 DNK klonom značajno su teže i ozbiljnije nego one pronađene kod svinja inokuliranih sa SCV1, himernim SCV1-2 i recipročnim himernim SCV2-1 DNK klonovima.

Iznenađujuće i korisno, himerni SCV2-1 DNK klon koji ima imunogeni kapsidni gen (ORF2) patogenog SCV2 kloniranog u nepatogenu SCV1 genomsku kralješnicu (backbone) inducira specifični odgovor antitijelima na patogeni SCV2 kapsidni antigen, dok isključivo zadržava nepatogenu prirodu SCV1 kod svinja. Životinje inokulirane s himernim SCV2-1 DNK klonom razvijaju umjerenu infekciju koja podsjeća na onu koja se javlja kod životinja koje su inokulirane sa SCV1 dok podliježu serokonverziji u antitijela protiv ORF2 kapsidnog proteina patogenog SCV2. Prosječna dužina viremije primijećene kod životinja inokuliranih sa SCV1 i himernim SCV1-2 kraća je, 0.625 tjedana i 1 tjedan, u odnosu na životinje inokulirane s patogenim SCV2 kod kojih je oko 2.12 tjedana. Odsustvo detektibilne himerne SCV1-2 viremije kod nekih inokuliranih životinja nema utjecaja na serokonverziju u antitijela protiv SCV2 ORF2 kapsidnog proteina kod svinja inokuliranih sa SCV1-2 (grupa 4). Ovi rezultati ukazuju na to da iako je viremija s himernim SCV1-2 kratka ili nedetektabilna kod nekih inolkuliranih životinja, himerni SCV1-2 virus sposoban je inducirati odgovor antitijelima protiv SCV2 ORF2 kapsidnog proteina. Posebna sposobnost himernog SCV1-2 infektivnog DNK klona da inducira imuni odgovor koji je specifičan na patogeni SCV2 imunogeni ORF kapsidni protein a pri tome ostaje nepatogen za svinje čini himerni SCV1-2 klon povoljnim u smislu genetski napravljenog živog-atenuiranog cjepiva i za druge tipove cjepiva.

Nove, pročišćene i izolirane molekule nukleinskih kiselina iz ovoga izuma obuhvaćaju cjelokupnu DNK sekvencu klonirane DNK himernog SCV1-2 prikazanu u SEQ ID NO:2, prikazana na slici 9, i deponiranu u American Type Culture Collection pod određenim patentnim brojem za deponiranje (Patent Deposit Designation) PTA-3912; njen komplementarni lanac (i.e., reverzni i naspramni bazni parovi) ili nukleotidne sekvence koje su najmanje 95% homologe s himernom nukleotidnom sekvencom (i. e., značajno aktivan dio čitavoga gena). Konvencionalne metode koje su u znanosti poznate mogu se koristiti za izradu komplementarnog lanca ili nukleotidne sekvence koje imaju visoku homologiju, na primjer, pomoću poznatih metoda hibridizacije (standardna ili “high stringency”). Pročišćena i izolirana molekula nukleinske kiseline koja sadržava DNK sekvencu imunogenog kapsidnog gena klonirane himerne SCV1-2 DNK isto je tako prikazana u SEQ ID NO:3 i slici 10.

Pogodne stanice koje sadržavaju himernu molekulu nukleinske kiseline jedinstveno proizvode žive, infektivne himerne svinjske cirkoviruse. Živi, infektivni himerni virus dobiven je iz himernog DNK klona putem transfekcije PK-15 stanica in vivo i in vitro transfekcijama na način koji je ovdje ilustriran. Poželjan primjer klonirane DNK himernog SCV1-2 nukleotidna je sekvenca koja je prikazana u SEQ ID NO:2 i slici 9. Ovaj izum dalje predviđa to da je himerni virus dobiven od komplementarnog lanca ili nukleotidne sekvence koja ima visoku homologiju, najmanje 95% je homologa s himernom nukleotidnom sekvencom.

Isto su tako u okviru ovoga izuma uključeni biološki funkcionalni plazmidi, viralni vektori i slični koji sadržavaju nove rekombinantne molekule nukleinskih kiselina koje su ovdje opisane, pogodne stanice domaćina koje su transfektirane vektorima koji obuhvaćaju himerne i molekularne DNK klonove i proizvode koji eksprimiraju imunogene polipeptide. Posebno poželjan imunogeni protein ima amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:4 i na slici 11. Njegove biološki aktivne varijante dalje su obuhvaćene ovim pacijentom. Obična bi osoba iz ovoga područja znanosti znala bez napora modificirati, zamijeniti, deletirati ... amino kislein(e) iz polipeptidne sekvence i proizvesti biološki aktivne varijante koje zadržavaju istu, ili u biti istu aktivnost kao i roditeljska sekvenca.

U cilju proizvodnje imunogenih polipeptidnih proizvoda iz ovoga izuma, postupak može obuhvatiti slijedeće korake: uzgajanje, u odgovarajućim nutritivnim uvjetima, prokariotskih ili eukariotskih domaćinskih stanica koje su transfektirane s novim rekombinantnim molekulama nukleinske kiseline koje su ovdje opisane na način koji omogućuje ekspresiju spomenutih polipeptidnih proizvoda, i izolaciju željenih polipeptidnih proizvoda koji su produkti ekspresije spomenutih molekula nukleinskih kiselina standardnim postupcima koje se koriste u znanosti. Špekulira se da se imunogeni proteini mogu pripremiti drugim tehnikama kao na primjer, biokemijska sinteza i slične.

Cjepiva himernih i molekularnih DNK klonova, i metode za njihovo korištenje isto su tako uključene u područje ovoga izuma. Inokulirane svinje zaštićene su od ozbiljne viralne infekcije i PMWS kojeg izaziva SCV2. Novi postupak štiti svinje koje zahtijevaju zaštitu od viralne infekcije ili PMWS putem dostavljanja svinji imunološki efektivne količine cjepiva na osnovi ovoga izuma, kao na primjer, cjepiva koje obuhvaća imunogenu količinu himerne SCV1-2 DNK, klonirani himerni virus, plazmid ili viralni vektor koji sadržava himernu DNK iz SCV1-2, polipeptidni ekspresijski proizvod, rekombinantnu SCV2 DNK itd. Drugi antigeni kao PRRSV, PPV, drugi svinjski infektivni agensi i imuno stimulanti mogu se davati istovremeno svinji da bi se osigurao široki spektar protekcije od viralnih infekcija.

Cjepiva obuhvaćaju na primjer, infektivnu himernu SCV1-2 DNK, kloniranu SCV himernu genomsku DNK u pogodnom plazmidu ili vektoru kao što je na primjer, pSk vektor, avirulentni, živi himerni virus, inaktivirani himerni virus, itd., u kombinaciji s netoksičnim, fiziološki prihvatljivim nosačem i opcijski, jednim ili više adjuvanata. Cjepivo isto tako može obuhvaćati infektivni SCV2 molekularni DNK klon koji je ovdje opisan.Infektivna himerna SCV1-2 DNK, plazmidna DNK koja sadržava infektivni himerni viralni genom i živi himerni virus poželjni su dok je najpoželjniji živi himerni virus. Avirulentno, živo viralno cjepivo iz ovoga izuma osigurava prednost u odnosu na tradicionalna viralna cjepiva u kojima se koriste ili atenuirani živi virusi kod kojih postoji opasnost da revertiraju u virulentni oblik, ili ubijene kulture stanica propagirane sa cijelim virusom koji ne mora inducirati dovoljan imuni odgovor s antitijelima za zaštitu od viralne bolesti.

Adjuvant, koji se može dostavljati u konjunkciji sa cjepivom iz ovoga izuma, supstanca je koja povećava imunološki odgovor svinje na cjepivo. Adjuvant se može ostavljati u isto vrijeme i na isto mjesto kao cjepivo ili u različito vrijeme na primjer kao “booster”. Adjuvanti se isto tako mogu dostavljati svinji s prednošću na način ili na mjesto koje je različito od načina i mjesta na koje se dostavlja cjepivo. Pogodni adjuvati uključuju, ali nisu limitirani samo na njih, aluminij hidroksid (alum), imunostimulirajući kompleks (ISKOMS), ne-ionski blok polimeri ili kopolimeri, citokini (kao IL-1, IL-, IL-7, IFN-α , IFN-bb, IFN-γ , itd), saponini, monofosforil lipid A (MLA), miramil dipeptiddi (MDP) i slični. Drugi pogodni adjuvanti uključuju na primjer, aluminij kalij sulfat, toplinski labilni ili toplinski stabilni enterotoksin izoliran iz Escherichia coli, kolera toksin ili njegova B subjedinica, toksin difterije, teteanus toksin, pertusi (veliki kašalj) toksin, Freund-ov nekompletni ili kompletni adjuvant, itd. Adjuvanti bazirani na toksinu, kao toksin difterije, teetnusa i pertusis toksin mogu se inaktivirati prije uporabe na primjer tretmanom s formaldehidom.

Cjepiva dalje mogu sadržavati dodatne antigene da bi potpomogle imunološku aktivnost infektivnih himernih SCV DNK klonova kao na primjer, virus svinjskog reprodukcijskog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (SPV), drugi svinjski agensi i imunostimulanti.

Nova cjepiva iz ovoga izuma ne moraju se pripremati samo na neki poseban način. Klonirana viralna cjepiva uključuju ali nisu njima limitirana infektivna DNK cjepiva (na primjer uporabom plazmida, vektora ili drugih konvencionalnih nosača da se direktno injektira DNK u svinje), živa cjepiva, modificirana živa cjepiva, inaktivirana cjepiva, subjedinična cjepiva, atenuirana cjepiva, genetski konstruirana cjepiva, itd. Ova se cjepiva pripremaju standardnim postupcima poznatim u znanosti.

Živo viralno cjepivo generalno je najpoželjnije cjepivo u smislu da se svi kompletni imuni odgovori aktiviraju u recipientu koji dobije cjepivo, uključujući sustavni, lokalni, humoralni i stanični posredovani imuni odgovori.Ubijeno cjepivo, s druge strane može inducirati humoralni imuni odgovor. Iako najpoželjnija međutim živa viralna cjepiva imaju nekoliko nedostataka, kao potencijalni rizik od kontaminacije sa živim slučajnim viralnim agensoma ili rizik da virus može revertirati u virulentni oblik na terenu. Ono što je zanimljivo, jedinstvena SCV1-2 himerna SCV DNK iz ovoga izuma prelazi okvire ovih problema. Uporabom samo imunogenih gena patogenog SCV2, himerna DNK konstruktirana je od živog, replikativnog himernog virusa koji je nepatogen ali izaziva kompletne povoljne imune odgovore od živog viralnog cjepiva protiv patogenog SCV2 virusa. Živo viralno cjepivo bazirano na himernom virusu imat će male šanse, ako ih uopće bude imalo, za reverziju u patogeni fenotip. Zato, novi himerni virus baziran na strukturi nepatogenog SCV1 ima veliku prednost u odnosu na bilo koji rekombinanatni SCV DNK virus, bilo koje živo, atenuirano SCV2 cjepivo ili bilo koji drugi tip cjepiva zasnovanog samo na SCV2 za imunitet protiv SCV2 infekcija.

Iako je živo viralno cjepivo najpoželjnije, drugi se tipovi cjepiva mogu iskoristiti za inokulaciju svinja s novim himernim virusom i drugim antigenima koji su ovdje opisani. Da bi se pripremila inaktivirana virusna cjepiva, na primjer, propagacija virusa iz infektivnog DNK klona izvodi se postupcima poznatim u znanosti ili pomoću onih koje su opisane ovdje u izumu. Serijska se inaktivacija virusa zatim optimizira protokolima koji su generalno poznati onima koji se bave ovim dijelom znanosti.

Inaktivirana virusna cjepiva mogu se pripremati tretiranjem himernih virusa dobivenih od klonirane SCV DNK s agensima za inaktivaciju kao što su formalin ili hidrofobna otapala, kiseline itd., zračenjem s ultraljubičastom svjetlošću ili X zracima, zagrijavanjem itd. Inaktivacija se izvodi na način koji razumiju osobe koje se bave ovim područjem. Na primjer, u kemijskoj inaktivaciji, pogodan uzorak virusa ili uzorak seruma koji sadržava virus tretira se dovoljno dugo s dovoljnom količinom ili koncentracijom inaktivirajućeg agensa pri dovoljno visokoj (ili niskoj, ovisno o inaktivirajućem agensu) temperaturi ili pH da bi se inaktivirao virus. Inaktivacija zračenjem izvodi se pomoću valne dužine svjetlosti ili drugog izvora energije u vremenskom intervalu dovoljno dugom da se inaktivira virus. Virus se smatra inaktiviranim ako nije u stanju inficirati stanicu podložnu infekciji.

Priprema subjediničnih cjepiva tipično se razlikuje od pripreme modificiranog živog cjepiva ili inaktiviranog cjepiva. Prije pripreme subjediničnoga cjepiva, protektivne ili antigene komponente uključuju određene amino kiselinske segmente ili fragmente viralnog kapsidnog proteina koji izazivaju osobito jak protektivan ili imunološki odgovor u svinja; same pojedinačne ili višestruke kapsidne proteine koji formiraju virusne substrukture ili određene dijelove ili jedinice ovakve substrukture; oligoglikozide, glikolipide ili glikoproteine koji su prisutni na ili blizu površine virusa ili u viralnim substrukturama kao što su lipoproteini ili lipidne grupe povezane s virusom itd. Poželjno je da se kapsidni portein, kao onaj koji kodira ORF2 gen, upotrijebi kao antigen komponenta subjediničnoga cjepiva. Drugi proteini koje kodira infektivni DNK klon mogu se isto tako koristiti. Ove imunogene komponente već su identificirane postupcima koja su poznata u ovome području. Jednom identificirani protektivni ili antigeni dijelovi virusa (i.e. “subjedinica”) dalje se pročišćavaju i/ili kloniraju već poznatim procedurama. Subjedinično cjepivo osigurava prednost nad drugim cjepivima koja su bazirana na živom virusu jer je subjedinica, kao i visoko pročišćene subjedinice virusa, manje toksična nego cijeli virus.

Ako se subjedinično cjepivo proizvede pomoć u tehnika rekombinanatne genetike, ekspresija klonirane subjedinice, kao ORF2 (kapsid) gen, na primjer, može se optimizirati postupcima koji su poznati onima koji se bave znanošću (vidjeti na primjer Maniatis et al., “Molecular cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MA., 1989). Ako subjedinica koja se koristi predstavlja intaktnu strukturnu osobinu virusa, kao cijeli kapsidni protein, procedura za njenu izolaciju iz virusa mora se optimizirati.U svakom slučaju, nakon optimizacije protokola za inaktivaciju, protokol za pročišćavanje subjedinice može se optimizirati prije proizvodnje.

Da bi se cjepiva iz patogenih klonova pripremila atenuirana, živi patogeni klonovi adaptirani na kulturu tkiva prvo se atenuiraju (pretvaraju se u nepatogeni ili bezopasan oblik) postupcima koji su poznati u znanosti, tipično se rade serijski pasaži kroz stanične kulture. Atenuacija patogenih klonova može se isto tako izvesti putem delecije gena ili mutacijama gena proizvedenim u virusu. Zatim se atenuirani SCV2 virusi mogu koristiti za konstruiranje dodatnih himernih SCV1-2 virusa koji zadržavaju nepatogeni fenotip SCV1 ali se mogu razlikovati u jakosti imunogenih osobina koje su izabrane iz genoma SCV2 pomoć u tehnologije rekombinantne DNK.

Najpoželjnije cjepivo sadržava živi himerni virusni DNK klon, detaljnije, klon koji sadržava imunogene gene SCV2 klonirane u kralješnicu (backbone) nepatogenog SCV1. Korisno je to što živi himerni virus, koji je prirodno avirulentan kada se konstruira pomoću genetičkog inženjerstva, ne zahtijeva vremenski duge procedure za atenuaciju. Virus isključivo služi kao živi ali nepatogeni replicirajući virus koji proizvodi imunogene proteine protiv SCV2 tijekom replikacije virusa, koji zatim mogu izazvati čitav dijapazon imunih odgovora na patogeni SCV2.

Kao buduća korist, poželjni živi himerni virus iz ovoga izuma osigurava genetski stabilno cjepivo koje se lakše proizvodi, čuva i dostavlja u odnosu na druge tipove atenuiranih cjepiva. Avirulentna ili atenuirana cjepiva koja se baziraju na himernim virusima smatraju se sigurnim kao, ako ne i sigurnijim od, tradicionalno modificiranih živih cjepiva (J. Arroyo et al. , "Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE)," J. Virol. 75(2):934-942 (2001); F. Guirakhoo et al., "Recombinant chimeric yellow fever-dengue type 2 virus is immunogenic and protective in nonhuman primates," J. Virol. 74(12):5477-5485 (2000); S. Tang et al., "Toward a poliovirus-based simian immunodeficiency virus vaccine: correlation between genetic stability and immunogenicity," J. Virol. 71(10):7841-7850 (1997)). Na primjer, ChimeriVax-JE cjepivo protiv Japanskog encefalitis virusa (JEV), koji je konstruiran genetskim inženjerstvom i predstavlja derivat virusa žute groznice YFV17D u kojem su geni koji kodiraju strukturne proteine prM i E iz YFV17D zamijenjeni s odgovarajućim genima iz atenuirane vrste JEV SA14-14-2, pokazano je da je getetski stabilno nakon produženih prolaza kao in vitro tako i in vivo (J. Arroyo et al ., 2001, supra ). Za još jedno cjepivo s himernim virusom ChimeriVax-D2 protiv Dengue virusa tipa 2, koji predstavlja atenuirani himerni virus žute groznice (YF)-dengue tip 2, isto je tako pokazano da je genetski stabilno; pokazano je da se njegova sekvenca ne mijenja nakon 18 prolaza u Vero stanicama (F. Guirakhoo et al., 2000, supra).

Još jedno poželjno cjepivo iz ovoga izuma koristi pogodne plazmide za dostavljanje nepatogenog himernog DNK klona svinjama. Za razliku od tradicionalnoga cjepiva koje koristi žive ili ubijene stanične kulture propagirane cijelim virusom, ovaj izum osigurava direktnu inokulaciju svinja s plazmidnom DNK koja sadržava infektivni himerni viralni genom.

Dodatna genetski konstruirana cjepiva, koje su poželjna u ovome izumu, proizvode se tehnikama poznatim u ovom području znanosti. Ovakve tehnike obuhvaćaju ali nisu limitirane samo na njih, dalje manipulacije s rekombinanatnom DNK, modifikaciju ili zamjenu u amino kiselinske sekvence rekombinanatnih proteina i slične.

Genetski konstruirana cjepiva bazirana na tehnologiji rekombinantne DNK rade se na primjer, identifikacijom alternativnih dijelova viralnog gena koji kodiraju proteine odgovorne za indukciju jačeg imunog ili protektivnog odgovora u svinja (npr. proteini izvedeni iz ORF3, ORF4 itd). Ovakvi identificirani geni ili imuno-dominantni fragmenti mogu se klonirati u standardne vektore za ekspresiju proteina, kao bakulovirusni vektor, i upotrijebiti za inficiranje odgovarajućih domaćinskih stanica (vidjeti na primjer O'Reilly et al ., "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co., 1992). Domaćinske stanice se kultiviraju, i tako eksprimiraju željene proteine cjepiva, koji se mogu pročistiti do željenog nivoa i dalje se mogu formulirati u pogodno finalno cjepivo.Ako u klonovima ostane neka nepoželjna prirodna osobina koja izaziva bolest, isto je tako moguće da se promijene nukleotidne sekvence u viralnom genomu koje su odgovorne za virulentnost, i genetski konstruirati avirulentni virus putem na primjer “site directed” mutageneze. Pomoć u “site directed” mutageneze moguće je dodati, deletirati ili promijeniti jedan ili više nukleotida (vidjeti na primjer Zoller et al ., DNA 3:479-488, 1984). Sintetiziran je oligonukleotid koji sadržava željenu mutaciju i vezan je (annealing) za dio jednolančane viralne DNK.Hibridna molekula, koja nastaje u proceduri, koristi se za transformaciju bakterija.Dvolančana DNK, koja je izolirana i sadržava odgovarajuću mutaciju, koristi se za dobivanje DNK kompletne dužine putem ligacije s restrikcijskim fragmentom gore spomenutog viursa koji se zatim transfektira u pogodnu staničnu kulturu. Ligacija genoma u pogodan vektor za transfer može se postići pomoću standardne tehnike poznate osobama koje se bave ovim područjem znanosti. Transfekcija vektora u stanice domaćine da bi proizvela potomstvo virusa može se izvesti pomoću bilo kojeg od konvencionalnih postupaka kao što je kalcij fosfatna ili posredovana DEAE-dekstranom transfekcija, elektroporacija, fuzija protoplasta i druge već poznate tehnike (e.g., Sambrook et al ., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Klonirani virus tada pokazuje željenu mutaciju.Alternativno, mogu se sintetizirati dva oligonukleotida koji sadržavaju odgovarajuću mutaciju. Oni se mogu vezati za dvolančanu DNK koja se može ubaciti u viralnu DNK da bi se dobila DNK kompletne dužine.

Proteini konstruirani tehnikama genetičkog inženjerstva, koji su korisni za cjepiva, na primjer, mogu biti eksprimirani u stanicama insekata, stanicama kvasca ili stanicama sisavaca. Proteini konstruirani tehnikama genetičkog inžinjerstva, koji mogu biti pročišćeni ili izolirani konvencionalnim postupcima, mogu biti direktno inokulirani u svinje da bi se potvrdila zaštita od viralne infekcije ili "postweaning wasting" sindrom (PMWS) kojeg izaziva SCV2.

Stanična linija insekta (kao HI-FIVE) može se transfromirati s transfer vektorom koji sadržava molekule nukleinske kiseline dobivene iz virusa ili kopirane iz viralnog genoma koji kodiraju jedan ili više imuno-dominantnih proteina iz virusa. Transfer vektor uključuje, na primjer, lineariziranu DNK bakulovirusa i plazmid koji sadržava željene polinukleotide. Domaćinska stanična linija može biti ko-transfektirana s lineariziranom DNK bakulovirusa i plazmidom koji sadržava željene polinukleotide.

Alternativno, DNK iz svinje koja pati od PMWS, koja kodira jedan ili više kapsidnih proteina, infektivni SCV2 molekularni DNK klon ili kloniran SCV himerni DNK genom mogu se ubaciti u žive vektore, kao poxvirus ili adenovirus i tako upotrijebiti kao cjepivo.

Imunološki efikasna količina cjepiva iz ovoga izuma dostavlja se svinji koja ima potrebu za zaštitom od viralne infekcije ili PMWS. Imunološki efikasna količina ili imonogena količina kojom se inokulira svinja može se lako odrediti ili lako titirirati rutinskim testiranjem. Efikasna je količina ona u kojoj se postigne dovoljan imunološki odgovor na cjepivo u cilju zaštite svinje koja je izložena virusu koji izaziva PMWS. Poželjno je da se svinja zaštiti do nivoa gdje su značajno reducirani, poboljšani ili potpuno spriječeni jedan ili svi nepoželjni štetni fiziološki simptomi ili efekti viralne bolesti.

Cjepivo se može dostaviti kao pojedinačna doza ili u ponovljenim dozama. Doziranja mogu varirati na primjer u opsegu od 1 do 1000 mikrograma plazmidne DNK koja sadržava infektivni himerni DNK genom (u ovisnosti o koncentraciji imunoaktivne komponente, ali ne bi trebalo sadržavati količinu antigena koji je izazvan virusom koja može dovesti do nastanka štetnih reakcijskih ili fizioloških simptoma viralne infekcije. U znanosti su poznati postupci za determinaciju ili titriranje pogodnih doza aktivnog antigenog agensa koji se baziraju na težini svinje, koncentraciji antigena i drugim tipičnim faktorima. Poželjno je da se infektivni himerni DNK klon koristi kao cjepivo, ili se živi infektivni himerni virus može dobiti in vitro i zatim se tada živi himerni virus koristi kao cjepivo. U tom slučaju, svinji se može dati 100-200 miligrama klonirane himerne SCV DNK ili oko 10,000 50% infektivne doze kulture tkiva (IDKT50 ) živog himernog virusa.

Poželjno je da se cjepivo dostavlja svinji koja nije još izložena SCV virusu. Cjepivo koje sadržava himerni SCV1-2 infektivni DNK klon ili druge njegove antigene forme može se jednostavno dostaviti intranazalno, transdermalno (na primjer nanešeno na kožu ili na površinu kože za sustavsku apsorpciju), parenteralno …itd. Parenteralni put dostavljanja uključuje ali nije samo na njih limitiran, intramuskularne, intravenske, intraperitonealne, intradermalne (i.e., injektiranje ili na neki drugi način nanešeno na kožu) putove i slično. Kako su intramuskularni i intradermalni putovi inokulacije bili uspješno izvedeni u drugim studijama koji se bave viralnim infektivnim DNK klonovima E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); L. Willems et al., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992) ovi putovi su i najpoželjniji, pored praktičnog intranazalnog puta dostavljanja. Iako je manje zgodno razmatra se isto tako da se cjepivo daje svinji putem intralimfoidnog puta inokulacije. Jedinstven i izuzetno poželjan postupak dostavljanja uključuje direktno injeciranje plasmidne DNK koja sadržava SCV1-2 himeru u svinju intramuskularno, intradermalno, intralimfoidno itd..

Kada se dostavlja u tekućem obliku, cjepivo iz ovoga izuma može se pripremiti u formi vodene otopine, sirupa, eliksira i sličnih. Ovakve formulacije već su poznate u znanosti i tipično se pripremaju otapanjem antigena i drugih tipičnih aditiva u odgovarajućem nosaču ili sustavu za otapanje. Pogodni nosači ili otapala uključuju, ali nisu limitirani samo na njih, vodu, fiziološku otopinu, etanol, etilen glikol, glicerol itd. Tipični aditivi su na primjer, certificirane boje, dodaci za okus, zaslađivači i antimikrobijalni prezervativi kao timerosal (natrij etilmerkuritiosalicilat). Ovakve otopine mogu biti stabilizirane na primjer, dodavanjem djelomice hidrizirane želatine, sorbitola ili medija za staničnu kulturu, i mogu biti puferirani konvencionalnim postupcima pomoću reagenasa koji su već poznati u znanosti, kao što je natrij hidrogen fosfat, natrij dihidrogen fosfat, kalij hidrogen fosfat, njihova mješavina, i slični.

Tekuće formulacije isto tako mogu uključiti suspenzije i emulzije koje sadržavaju agense za otapanje ili emulzifikaciju u kombinaciji s drugim standardnim ko-formulantima. Ovi tipovi tekućih formulacija mogu se pripremiti konvencionalnim postupcima. Suspenzije se na primjer, mogu pripremiti upotrebom koloidne vodenice (mill). Emulzije se, na primjer mogu pripremiti pomoću homogenizatora.

Parenteralne formulacije, koje su dizajnirane za injeciranje u sustav tjelesnih tekućina, zahtijevaju da tjelesne tekućine svinje imaju odgovarajuću izotoničnost i da budu pH puferirane do odgovarajućih nivoa. Izotoničnost se može podestiti na odgovarajući način s natrij kloridom i drugim solima ovisno o potrebi. Pogodna otapala, kao što je etanol ili propilen glikol, mogu se upotrijebiti za povećanje topivosti sastojaka u formulaciji i za stabilnost tekućeg pripremljenog preparata. Dodatni aditivi koji se mogu koristiti u cjepivu iz ovoga izuma uključuju ali nisu limitirani samo na njih, dekstrozu, konvencionalne antioksidante i konvencionalne reducirajuće (chelating) agense kao etilendiamin tetraostena kiselina (EDTA). Parenteralne forme doziranja moraju se isto tako sterilizirati prije uporabe.

Još jedno ostvarenje ovoga izuma uključuje novi postupak za pripremu infektivne, nepatogene himerne molekule nukleinske kiseline SCV1-2, koja obuhvaća uklanjanje otvorenog okvira čitanja (ORF, open reading frame) gena molekule nukleinske kiseline koja kodira infektivno nepatogeni SCV1, zamjenjujući istu poziciju s imunogenim ORF genom nukleinske kiseline koji kodira infektivni patogeni SCV2 i oporavak himerne molekule nukleinske kiseline. Molekula nukleinske kiseline tipično je DNK.Poželjan postupak zamjenjuje ORF2 kapsidni gen nepatogenog SCV1 DNA s inunogenim ORF kapsidni genom infektivnog patogenog molekularnog DNK SCV2 koji je ovdje opisan. Smatra se da se druge pozicije ORF ili njihovih imunogenih fragmenata mogu razmijeniti između SCV1 i SCV” DNK da bi se konstruirali atenuirani infehtivni himerni DNK klonovi na osnovu postupaka koji su ovdje opisani.

Rekombinantna molekula nukleinske kiseline zatim se koristi za konstruiranje živog, infektivnog, replicirajućeg virusa iz ovoga izuma koji korisno zadržava nepatogenu prirodu SCV1 ali i eksprimira imunogeni ORF protein patogenog SCV2 i izaziva kompletan imuni odgovor na patogeni SCV2. Poželjno je da SCV1-2 klon služi kao genetski konstruirano avirulentno, živo cjepivo protiv SCV2 infekcije i PMWS kod svinja.

Konstruiran je infektivni DNK klon SCV2, kao što je ovdje opisano, tako da se može dobiti biološki čist i homogeni infektivni stok virusa za studije patogeneze i razvoj nepatogenih himernih cjepiva. Razvoj bolesti, distribucija virusa i patološke lezije koje su povezane sa SCV2 infekcijom mnogo su bolje okarakterizirane upotrebom DNK klona i biološki čistog i homogenog infektivnog stoka SCV2 virusa koji je dobiven iz molekualrnog DNK klona koji je primijećen u prošlosti, koji sam po sebi dovodi do razvoja željenog proizvoda cjepiva iz ovoga izuma.

SCV2 molekularni klon je generiran ligacijom dvije kopije kompletnog SCV2 genoma u tandemu u pSK vektor.Nasuprot jednoj kopiji genoma koja je objavljena u ovom području, infektivni DNK SCV2 klon napravljen pomoću postupaka koji su ovdje opisani sadržava dvije kompletne kopije SCV2 genoma koji su ligirani kao tandemski ponavljači. Ligacija dvije kopije genoma u tandemu osigurava sličan cirkularni genom koji podražava uobičajeni cirkularni genom SCV2. Prednost posjedovanja dvije kopije genoma u tandemu u infektivnom DNK SCV2 klonu je u tome što se povećava do maksimuma replikacija kada se infektivni DNK klon transfektira in vitro i in vivo. Zato, klon iz ovoga izuma funkcionira mnogo efikasnije nego prethodni genom koji je zastupljen u jednoj kopiji.

Inficiranje životinja s molekulskim viralnim klonom izuzetno je korisno za proučavanje genetskih determinanti viralne replikacije i virulentnosti u domaćinu.Cirkovirus tipa 2 kod svinje (SCV2) determiniran je kao agens koji izaziva “postweaning multisystemic wasting” sindrom (PMWS).PMWS je kompleksan sindrom tj.bolest kod svinja i različiti faktori mogu biti uključeni u kliničkom ispoljavanju PMWS. Međutim, teškoća proizvodnje biološki čiste forme SCV2 uslijed prisutnosti drugih agenasa koji se nalaze kod svinja u homogenatu tkiva zaraženih svinja otežala je definitivnu karakterizaciju kliničke slike bolesti i patoloških lezija za koje je odgovorna samo SCV2 infekcija. Ovo je prvi put da je infektivni molekularni DNK klon SCV2 konstruiran i upotrebljen za karakterizaciju bolesti i patoloških lezija koje su povezane sa SCV2 putem infekcije direktnom in vivo transfekcijom svinja s molekulskim klonom.

Za homogeni SCV2 stok živih virusa dobivenih iz molekualrnog klona pokazano je da je infektivan in vitro kada se transfektira u PK-15 stanice. Klonirana SCV2 genomska DNK isto je tako infektivna kada se direktno injecira u jetru i superficijalne limfne čvorove na butini specifičnih-bez patogena- (SBP) svinja. Životinje koje su injecirane s kloniranom SCV2 plazmidnom DNK razvijaju infekciju i bolest koja podsjeća na onu koja je inducirana intranazalnom inokulacijom s homogenim infektivnim virusnim stokom SCV2. Serokonverzija u SCV2-specifična antitijela detektirana je kod većine svinja iz inokuliranih grupa 35 dana poslije inokulacije (DPI).

Početak i trajanje viremije u svinja koje su inokulirane s himernoim SCV1-2 DNK klonom slični su onima koji se javljaju kod svinja koje su inokulirane s nepatogenim SCV1 DNK klonom, dok viremija kod svinja koje su inokulirane sa SCVs klonom izgleda da duže traje. Kod većine SCV2 inokuliranih životinja početak viremije detektira se 14 DPI i traje oko 2-4 tjedna.Slično, većina inokuliranih svinja kojima je napravljena nekropsija 35 DPI podlegla je serokonverziji u SCV2 antitijela.SCV2 antigen je detektiran u različitim tkivima i organima kod inokuliranih svinja. Krupne lezije su limitirane na pluća i limfne čvorove, i karakteriziraju ih sustavski generirani smeđe obojeni limfni čvorovi, pluća koja ne uspijevaju kolabirati (collapse), i blago multifokalni smeđe obojeni foci konsolidacije. Krupne lezije koje napadaju limfne čvorove i kod svinja inokuliranih s nepatogenim SCV1 i svinja inokuliranih s himernim SCV1-2 blage su i ograničene samo na nekoliko životinja, dok svinje inokulirane s patogenim SCV2 imaju umjerenu do tešku “welling” i diskoloraciju limfnog tkiva (tablica 9). Statistička analiza otkriva da su vrijednosti gross lezija u limfnim čvorovima svinja inokuliranih s himernim SCV1-2 slične onima zabilježenim kod svinja inokuliranim s nepatogenim SCV1. 21 DPI, svinje inokulirane sa SCV2 imaju gross lezije koje su statistički mnogo ozbiljnije nego one kod svinja inokuliranih s SCV1 i himernim SCV1-2. Histopatološke lezije i SCV2-specifični antigen detektirane su u mnogobrojnima tkivima i organima uključujuć i mozak, pluća, srce, bubreg, mandule, limfne čvorove, slezenu, ileum i jetru kod inokuliranih (inficiranih) svinja. Histopatološke lezije kod mnogobrojnih tkiva i organa slične onima koje se javljaju kod PMWS dobivene su sa SCV2 molekulskim DNK klonom kao i s infektivnim virusom pripremljenima in vitro iz molekularnog DNK klona. Mikroskopski i 21 i 49 DPI životinje inokulirane s himernim SCV1-2 imaju statistički manje mikroskopske lezije nego životinje inokulirane sa SCV2. Vrijednosti mikroskopskih lezija u limfnim čvorovima svinja inokuliranih s himernim SCV1-2 slične su onima dobivenim s nepatogenim SCV1, recipročnim SCV2-1 i neinokuliranim kontrolnim životinjama. Umjerene do teške mikroskopske lezije pronađene su u više tkiva kod životinja inokuliranim s patogenim SCV2 uključujući tkiva pluća, jetre, limfnog tkiva, slezene, mozga, srca, bubrega i mandula. Međutim, kod životinja inokuliranih himernim SCV1-2, blage do umjerene mikroskopske lezije ograničene su samo na tkivo jetre, limfnih čvorova i bubrega (vidjeti tablicu 10).

Kod kontrolnih i bilo kojih drugih inokuliranih svinja ne postoje značajni klinički znakovi PMWS. Iako nisu primijećeni karakteristični klinički simptomi PMWS s kloniranom SCV2 plazmidnom DNK (infektivni SCV2 klon) niti s biološki čistim živim stokom virusa infektivnih SCV2, SCV2 očigledno je odgovoran za PMWS-u slične histopatološke lezije koje su dobivene u primjerima koji slijede, koji su ilustrativni. Generalno, vjeruje se da je SCV2 primaran ali ne i jedini patogeni agens koji je odgovoran za početak kliničke slike PMWS.

Ovaj izum definitivnije karakterizira da su klinički tijek i patološke lezije uzrokovane SCV2 infekcijom. Sadašnji podaci u ilustrativnim primjerima koji slijede ukazuju na to da je spremna reproducirana klonirana SCV2 genomska DNK dostupna da zamijeni infektivni virus za SCV2 patogenezu i studije imunizacije. Dok se SCV2 pokazao kao esencijalan za razvoj PMWS, možda su drugi faktori ili agensi kao PRRSV, PPV, itd.potrebni da bi se inducirao kompletan spektar kliničkih znakova i lezija koje su povezane sa slučajevima već uznapredovalog PMWS. Međutim, sa spoznajom da je SCV2 ključan faktor, nov, infektivan, replicirajući klon iz ovoga izuma može se dalje modificirati ili genetski konstruirati da bi se postigao željeni optimalan imunogeni efekt pomoću postupaka koji su poznati onima koji se bave imunologijom i molekularnom genetikom.

Dostupnost infektivnog DNK klona SCV2 koji je opisan u ovome izumu omogućuje da se razvije genetski konstruirano atenuirano cjepivo za sprječavanje SCV2 infekcije i PMWS kod svinja. Poznato je da SCV2 replicira u limfnim čvorovima, plućima i jetri tijekom prirodne infekcije, i jedan od glavnih patogenih efekata nefunkcioniranje je imunog sustava uslijed degradacije limfnih struktura (S. Krakowka et al. , 2001, supra ; G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra ; S. Kennedy et al. , 2000, supra ; G. J. Wellenberg et al. , 2000, supra ; G. M. Allan et al. , "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); J. Ellis et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets," J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, supra ). Uporabom ovog novog infektivnog SCV2 molekularnog DNK klona, klinička bolest, patološke lezije i distribucija virusa bili su isključivo posljedica SCV2 infekcije i mnogo bolje okarakterizirani.

Strukturni i funkcionalni odnosi SCV2 gena bolje se razumiju ako se sagledava dostupnost SCV2, SCV1 i himernih SCV1-2, i recipročnih himernih SCV2-1 infektivnih DNK klonova koji su ovdje opisani. Will et al ., "Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees," Nature 299:740-742 (1982), prvi su demonstrirali mogućnost uporabe klonirane hepatitis B virusne DNK za inficiranje čimpanzi direktnom in vivo injekcijom. Ovaj pristup se od tada primjenjuje za proučavanje viralne replikacije i patogeneze nekoliko drugih virusa (T. W. Dubensky et al. , "Direct transfection of viral and plasmid DNA into the liver or spleen of mice," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7529-7533 (1984); R. Girones et al. , "Complete nucleotide sequence of a molecular clone of woodchuck hepatitis virus that is infectious in the natural host," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1846-1849 (1989); N. L. Letvin et al ., "Risks of handling HIV," Nature 349:573 (1991); C. Seeger et al. , "The cloned genome of ground squirrel hepatitis virus is infectious in the animal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:5849-5852 (1984); E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); R. Sprengel et al. , "Homologous recombination between hepadnaviral genomes following in vivo DNA transfection: implications for studies of viral infectivity," Virology 159:454-456 (1987); H. Will et al. , 1982, supra ; L. Willems et al. , "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)).

Konstruiranje infektivnog SCV2 molekularnog DNK klona, i demonstriranje infekcije direktnim injeciranjem klonirane SCV2 plazmidne DNK u jetru i limfne čvorove svinja u kontekstu ovoga izuma korisni su za SCV2 studije. Ovaj in vivo sustav transfekcije pojačat će studiju strukturnog i funkcionalnog odnosa SCV2 gena uporabom rekombinantnih plazmida konstruiranih in vitro za testiranje različitih regija ili gena SCV2 i njihovih uloga u replikaciji virusa i patogenezi domaćina. Replikacija i patogeneza SCV2 može se proučavati in vivo bez potrebe za proizvodnjom stokova infektivnih virusa putem propagacije SCV2 u staničnim kulturama.Ovo je poželjno kako se serijski prolazi mogu odabrati za viralne varijante. Još jedna prednost uporabe klonirane SCV2 genomske DNK, umjesto živog virusa, za životinjske studije relativno je lako određivanje količine inokulacijske doze.Količina klonirane SCV2 DNK koja se koristi za inokulaciju životinja može se lako odrediti spektrofotometrom, gdje doza živog SCV2 virusa zahtijeva infektivnu titraciju u staničnim kulturama i potvrdu infekcije s IFE.Direktno injeciranje životinja s kloniranom SCV2 plazmidnom DNK eliminira probleme koji su povezani s prisustvom drugih prirodnih svinjskih agenasa u inokulumu homogenata tkiva u životinjskim studijama.

U ovome izumu, imunogeni ORF2 kapsidni gen zamjenjuje se između patogenog SCV2 i nepatogenog SCV1 da bi se proizvela jedinstvena struktura himernog SCV1-2 infektivnog DNK klona. Iznenađujuće i korisno, himerni SCV1-2 infektivni klon je replicirao, eksprimirao imunogeni ORF2 kapsidni antigen in vitro i in vivo, i inducirao je specifičan odgovor antitijelima protiv SCV2 ORF2 ali je zadržao nepatogenu prirodu SCV1. Himerni SCV1-2 infektivni DNK klon ima sposobnost da inducira jak imuni odgovor protiv SCV2 dok inducira samo ograničenu infekciju s blagim patološkim lezijama sličnima onim koje izaziva nepatogeni SCV1. Za razvoj cjepiva, relativno lako čuvanje i stabilnost klonirane DNK i ekonomičnost proizvodnje na velikoj skali rekombinantne SCV2 plazmidne DNK kao i himernog SCV1-2 DNK klona osigurava atraktivne načine dostavljanja svinjama živa, infektivna, viralna DNK cjepiva ili genetski konstruirana, atenuirana viralna cjepiva. Zato, himerni SCV1-2 infektivni DNK klon koji se opisuje u ovome izumu predstavlja korisnog kandidata za cjepivo protiv SCV2 infekcije i PMWS.

Treba shvatiti da svi znanstveni i tehnološki izrazi koji se ovdje koriste imaju ista značenja kao i izrazi koji se normalno koriste u ovom području znanosti od strane ljudi koji se bave ovom problematikom. Za potrebe ovoga izuma izraz “infektivni” znači da virus replicira kod svinja bez obzira da li ili ne izaziva virus bilo koju bolest. “SBP” se odnosi na Specifične-bez-patogena (SBP) svinje. “Gnotobiotske” svinje znače svinje bez mikroba. Izrazi “SCV2 plazmidna DNK”, “SCV2 genomska DNK” i “SCV2 molekularna DNK” koriste se izmjenjivo da bi se odnosili na istu kloniranu nukleotidnu sekvencu.

Infektivni SCV1/SCV2 himerni DNK klon (vrsta označena kao “SCV1-2 himera), infektivni SCV2 molekularni DNK klon (vrsta označena kao “SCV klon”) i biološki čist i homogen stok SCV2 dobiven iz Iowa uzorka SCV2 koji je izoliran iz svinje s teškim PMWS i identificiran kao izolat broj 40895 (dodaje broj vrsti “SCV2#40895”) deponirani su pod uvjetima koji su dobili mandat od strane 37 C.F.R. § 1.808 i ostaju u suglasnosti sa Sporazumom iz Budimpešte u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A. Sekvence DNK koje su ovdje opisane sadržavaju u okviru 6,490 bp plazmida klonirani u pBluescriptSK(+) vektor (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) i transformirane su u Ecsherichia coli DH5α kompetentne stanice. Plazmidi koji sadržavaju infektivni himerni SCV1-2 DNK klon (identificiran kao “himerni svinjski cirkovirus tipa 1 (SCV1) i tipa 2 (SCV2) infektivni DNK klon) i infektivni SCV2 molekularni DNK klon (identificiran kao “infektivni DNK klon tipa 2 svinjskog cirkovirusa (SCV2)”) deponirani su u ATCC 7.prosinca, 2001. i dodijeljen im je ATCC broj za deponiranje patenta (ATCC Patent Deposit Designation) PTA-3912 i PTA-3913. Potrebno je shvatiti da su drugi plazmidi koji se mogu lako konstruirati pomoću “site directed” mutageneze i tehnika koje su ovdje opisane, isto tako obuhvaćeni poljem ovoga izuma. Biološki čist i homogen SCV2 uzorak izolata broj 40895 (identificiran kao “tip 2 svinjski cirkovirus (SCV2)”) isto je tako deponiran u ATCC, 7.prosinca 2001 i dodijeljen mu je broj za deponiranje patenta PTA-3914. genomska (nukleotidna) sekvenca SCV2 izolata broj 40895 deponirana je u Genbank banci podataka i dostupna je javnosti od 23. srpnja 2000. pod brojem za pristup (acession number) AF264042.

Primjeri koji slijede demonstriraju određene aspekte ovoga izuma. Međutim, treba razumjeti da su ovi primjeri samo za ilustraciju i nemaju za cilj da budu isključivo i u potpunosti definitivni kao uvjeti i područje ovoga izuma. Treba razumjeti da kada su dani tipični uvjeti reakcija (e.g. temperatura, vrijeme reakcije, itd), uvjeti iznad i ispod specifičnog opsega isto se tako mogu koristiti, iako su generalno manje pogodni. Primjeri su izvođeni na sobnoj temperaturi (oko 23°C do oko 28°C) i pri atmosferskom tlaku. Svi dijelovi i postotci na koje se ovdje odnosi na bazi su težine i sve temperature su izražene u stupnjevima ukoliko nije drugačije specificirano.

Dalje razumijevanje ovoga izuma može se postići pomoću nelimitirajućih primjera koji slijede dalje u tekstu.

PRIMJER 1

Dobivanje PK-15 stanične linije koja nema SCV1 kontaminaciju

Izvor SCV2 izolata bio je uzorak tkiva slezene svinje kod koje se prirodno javlja PMWS (SCV2 serijski identifikacijski broj 40895, koji se koristi kao “izolat 40895” (M. Fenaux et al., 2000, supra). Imunohistokemijsko bojanje (IHH) sa SCV2 specifičnim antitijelom potvrdilo je prisutnost SCV2 antigena u tkivu. Tkiva slezene čuvana su na -80ºC do uporabe.

PK-15 stanična linija kupljena od Americane Type Culture Collection (ATCC broj za pristup CCL-33) perzistentno je inficirana sa SCV1 G. C. Dulac and A. Afshar, 1989, supra ). Kako je samo subpopulacija PK-15 stanica perzistentno inficirana (id.), PK-15 stanična je linija bila bez SCV1 kontaminacije kada je napravljeno krajnje razblaženje.

PK-15 stanična linija kupljena od American type Culture Collection (ATCC broj pristupa CCL-33) perzistentno je inficirana sa SCV1 (G. C. Dulac and A. Afshar, 1989, supra ). Kako je samo subpopulacija PK-15 stanica perzistentno inficirana, generična je dilucijama do kraja (end-point dilution) PK-15 stanična linija koja nema SCV1 kontaminaciju. Protokol je izvršen na slijedeći način: PK-15 stanice su uzgajane u MEM s Earle solima i L-glutaminom Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) s dodatkom 10% fetalnog seruma goveda (FBS, foetal bovine serum) i 1X antibiotikom (Life Technologies Inc.) Konfluentni pojedinačni slojevi stanica su tripsinizirani i zatim su stanice izbrojane i napravljene su serijske dilucije do kraja od jedne stanice na 0.2 ml. Krajnje razrijeđenje je bilo naneseno na ploču s 96 bunarčića i dozvoljeno im je da rastu i monoslojevi iz pojedinačne stanice. Stanice iz svakog bunarčića testirane su za SCV1 DNK pomoću PCR-RFLP eseja koji može detektirati i razlikovati SCV1 i SCV2 (M. Fenaux et al. , 2000, supra ). PK-15 stanice iz bunarčića koje su bile negativne za SCV1 dalje su proširene. PK-15 stanična linija koja nema SCV1 bila je subkultivirana kroz pet dodatnih prolaza i opet je bila negativna sa SCV1 DNK u PCR-u koji je napravljen za svaki prolaz.

Četiri stanične linije koje su bile negativne za SCV1 kontaminaciju proizvedene su pomoću dilucija do kraja perzistentno inficiranih PK-15 stanica iz ATCC. Stanične su linije ostale negativne za SCV1 u PCR-u nakon pet dodatnih prolaza. Jedna od staničnih linija bila je dodatno proširena i pokazala je da može podržati replikaciju SCV2 kada su stanice transfektirane sa SCV2 molekulskim DNK klonom (Sl.2) i inficirane sa SCV2 virusom. Klonirane su stanice dalje upotrebljene za in vitro transfekciju SCV2 molekularnog DNK klona da bi se dobile biološki čisti SCV2 infektivni virusni stok za pokuse inokuliranja životinja.

PRIMJER 2

Konstruiranje SCV2 infektivnog DNK klona

Da bi se kontruirao SCV2 molekularni klon, dizajniran je par prajmera za PCR na osnovi objavljene sekvence SCV2 izolata 40895 (M. Fenaux et al. , 2000, supra ): “forward” prajmer F-PCVSAC2 (5’-GAACCGCGGGCTGGCT GAACTTTTGAAAGT-3’), prikazan u SEQ ID NO:5, i reverzni prajmer R-PCVSAC2 (5’-GCACCGCGGAAATTTCT GACAAACGTTACA-3’), prikazan u SEQ ID NO:6. Ovaj par prajmera amplificira kompletan genom SCV2 s preklapajućom regijom koja sadržava jedinstveno SacII restrikcijsko mjesto (Sl.1). DNK je izolirana pomoć u QIAamp DNA Minikit (Qiagen, Inc., Valencia, CA) iz uzorka tkiva slezene svinje kod koje se prirodno javlja PMWS (izolat 40895) (M. Fenaux et al. , 2000, supra ). Izolirana je DNK umnožena u PCR reakciji s AmpliTaq Gold polimeraze (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). PCR reakcija inicijalno se sastojala od koraka inicijacije enzima na 95ºC tijekom 9 minuta, zatim je slijedilo 35 ciklusa denaturacije na 94ºC tijekom 1 minute, vezanje prajmera za matricu (annealing) na 48ºC 1 minutu i ekstenzije na 72ºC tijekom 3 minute, i finalne ekstenzije na 72ºC tijekom 7 minuta. PCR proizvod očekivane duljine odvojen je elektroforezom na gelu i pročišćen pomoću “glassmilk” procedure s Geneclean kitom (Bio 101, Inc., La Jolla, CA).

Da bi se konstruirao molekularni DNK klon koji sadržava tandem dimere SCV2 genoma, PCR proizvod koji sadržava kompletan SCV2 genom prvo je ligiran u advanTAge plazmidni vektor (Clontech, Palo Alto, CA). E. Coli DH5α kompetentne stanice su transformirane. Rekombinantni plazmidi potvrđeni su rezanjem pomoću restrikcijskog enzima. SCV2 genomska DNK kompletne dužine izvađena je iz advanTAge vektora disegtijom sa SacII restrikcijskim enzimom. Izrezana SCV2 genomska DNK ligirana je s T4 DNK ligazom na 37ºC tijekom samo 10 minuta, što je favoriziralo proizvodnju tandemskih dimera. Tandemski dimeri na kraju su klonirani u pBluescript SK(+) vektor (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) (Sl. 1). Rekombinantni plazmidi koji sadržavaju tandem dimere SCV2 genoma (ovdje označeni kao SCV2 molekularni DNK klon) potvrđeni su PCR reakcijom, rezanjem s restrikcijskim enzimom, i sekvenciranje u DNK.Koncentracija DNK rekombinantnih plazmida određena je spektrofotometrom.

Specifično, kompletan genom SCV2 (izolat 40895) umnožen je PCR reakcijom da bi se kontruirao infektivni SCV2 molekularni DNK klon.Dvije kolije kompletnog SCV2 genoma ligirane su u tandemu u pSK vektor da bi se proizveoSCV2 molekularni DNK klon (Sl. 1).Infektivnost SCV2 molekularnog DNK klona određena je in vitro transfekcijom PK-15 stanica. IFE sa SCV2- specifičnim antitijelom potvrdila je da je molekularni DNK klon infektivan in vitro i da je oko 10-15% PK-15 stanica bilo transfektirano. SCV2-specifični antigen je vizualiziran pomoću IFE u jedru, i u nešto manjoj mjerici u citoplazmi transfektiranih stanica (Sl.2). Stanice lažno-transfektirane s praznim pSK vektorom ostale su negativne za SCV2 antigen.

PRIMJER 3

In vitro transfekcija sa SCV2 molekulskim DNK klonom i stvaranje biološki čistog i homogenog stoka virusa infektivnog SCV2

Da bi se testirala infektivnost molekularnog DNK klona in vitro, PK-15 stanice bez kontaminacije uzgajane su u LabTek komorama s osam bunarčića. Kada su PK-15 stanice dostigle oko 85% konfluentnosti, stanice su transfektirane s molekulskim DNK klonom uporabom Lipofectamine Plus reagensima na osnovu protokola koji je preporučio proizvođač (Life Technologies, Inc). Lažno-transfektirane stanice s praznim pSK vektorom uključene su kao kontrole. Tri dana nakon transfekcije, stanice su fiksirane s otopinom koja sadržava 80% aceton i 20% metanol na 4ºC tijekom 20 minuta. I izveden je esej imunofluorescencije uporabom SCV2-specifičnog zečijeg poliklonalnog antiseruma da bi se odredila in vitro infektivnost molekularnog DNK klona (vidjeti dalje u tekstu).

Da bi se dobio biološki čist i homogen stok virusa infektivnog SCV2 za pokus inokulacije životinja, PK-15 stanice bez kontaminacije uzgajane su u T-25 flaskovima i transfektirane sa SCV2 molekulskim DNK klonom. PK-15 stanice su uzgajane do oko 85% konfluentnosti u T-25 flaskovima. Prije transfekcije stanice su jednaput isprane sa sterilnim PBS puferom. Za svaku reakciju transfekcije u T-25 flasku, 12 μg SCV2 plazmidne DNK pomiješano je sa 16 μl Plus reagensa u 0.35 ml MEM mediju. Flask s lažno-transfektiranim stanicama s praznim pSK vektorom uključen je kao negativna kontrola. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tijekom 15 minuta, 50 μl Lipofectamine reagensa koji je razrijeđen u 0.35 ml MEM medija dodan je u mješavinu i sve je inkubirano na sobnoj temperaturi tijekom još 15 minuta. Mješavina za transfekciju zatim je dodana u T-25 flask s PKć 15 stanicama koje sadržavaju 2.5 ml svježeg MEM. Poslije inkubacije na 37ºC tijekom 3 sata, medij je zamijenjen sa svježim MEM medijem koji sadržava 2% FBS i 1X antibiotike. Transfektirane stanice pokupljene su nakon 3 dana poslije transfekcije i čuvane na –80ºC do uporabe. Infektivni titar virusnog stoka određen je s IFE (vidjeti dalje u tekstu).

U osnovi, biološki čist i homogen stok virusa infektivnog SCV2 dobiven je transfekcijom PK-15 stanica sa SCV2 molekulskim DNK klonom. SCv2 viorioni koji su dobiveni in vitro transfekcijom bili su infektivni jer su transfektirani stanični lizati uspješno iskorišteni za inficiranje PK-15 stanica.Zato je SCV2 molekularni DNK klon sposoban proizvesti infektivne SCV2 virione kada se in vitro transfektira. Infektivni titar homogenog SCV2 virusnog stoka koji je pripremljen iz transfektiranih stanica određen je da je 1x104.5 TCID50 /ml. Ovaj stok virusa uporabljen je za inokulaciju svinja u grupi 2. Lizati stanica lažno transfektiranih s praznim pSK vektorom nisu bile u stanju inficirati PK-15 stanice.

PRIMJER 4

Titracija virusa pomoću eseja imunofluorescencije (IFE)

Da bi se odredio infektivni titar homogenog SCV2 virusnog stoka, PK-25 stanice su uzgajane u LAB-Tek komorama s osam bunarčića. Stok virusa je serijski diluioran 10 puta u MEM, i svaka dilucija je inokulirana u 10 bunarčića s jednim slojem PK-15 stanica koje su uzgajane na LabTek komorama (Chamber slides). Bunarčići s neinokuliranim stanicama uključeni su kao negativna kontrola. Inficirane stanice fiksirane su 3 dana nakon inokulacije s otopinom koja sadržava 80% aceton i 20% metanol na 4ºC tijekom 20 minuta. Poslije ispiranja stanica s PBS puferom, inficirane stanice inkubirane su s 1:1,000 diluiranim SCV2-specifičnim zečijim poliklonalnim antitijelima S. D. Sorden et al. , "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, " J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999)) na 37ºC tijekom 1 sata.. Stanice su zatim tri puta oprane s PBS puferom, i inkubirane sa sekundarnim FITC-obilježenim kozjim anti-zečijim IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) na 37ºC tijekom 45 minuta. Poslije ispiranja slajdova tri puta s PBS puferom, slajdovi su napunjeni s flormont-G, stavljena su pokrovna stakla i preparat je pregledan pod fluorescentnim mikroskopom.Izračunata je 50% infektivna doza kulture tkiva po ml (IDKT50 /ml). Inicijalno, stanice su transfektirane s plazmidnim konstruktom koji sadržava jednu kopiju SCV2 genoma ali je infektivni SCV2 titar iz pojedinačnog genomskog konstrukta bio mnogo niži nego onaj kod onoga što sadržava tandem genoma. Zato je za in vitro i in vivo pokuse transfekcije korišten plazmidni konstrukt koji sadržava dimernu formu SCV2 genoma.

PRIMJER 5

In vivo transfekcija svinja sa SCV2 molekulskim DNK klonom i eksperimentalna inokulacija svinja s homogenim SCV2 infektivnim stokom virusa

Četrdeset specifičnih svinja bez patogena (SBP) starih 4 tjedna nasumce su smještene u 4 prostorije s po deset svinja u svakoj. Prije inokulacije, SPB svinje testirane su za antitijela na SCV, SRRSV, SPV i svinjski hepatitis E virus. Svinje iz grupe 1 nisu inokulirane i služile su kao negativne kontrole. Svinje iz grupe 2 svaka su posebno inokulirane intranazalno s oko 1.9x105 IDKT50 SCV2 infektivnim stokom virusa koji je dobiven od VCV2 molekularnog DNK klona. Svinje iz grupe 3 primile su direktnu intrehepatitičnu inekciju rekombinantne plazmidne DNK (klonirana SCV2 molekularnog klona). Svaka svinja cijepljena je s ukupno 200 mg rekombinantne plazmidne DNK, kroz tehnike usmjeravanja pomoć u ultrazvuka, u 6 različitih mjesta u područje jetre.

Svinje iz grupe 4 svaka je posebno cijepljena s ukupno 200 μg rekombinantne CSV2 plazmidne DNK direktno u superficijalne limfne čvorove na butu, svaki limfni čvor primio je dvije odvojene injekcije. Životinje su promatrane na dnevnoj bazi za kliničke znakove bolesti. Uzorci seruma prikupljani su iz svake životinje 0, 7, 14, 21, 28 i 35 dana poslije inokuliranja (DPI). 21 DPI, pet svinja je nasumce izabrano iz svake grupe i napravljena im je nekropsija. Ostalim pet životinjama iz svake grupe nekropsija je napravljena 35 DPI. Prikupljena su različita tkiva i organi tijekom nekropsije i procesirani su za histološke preglede i imunohistokemijsko bojanje (vidjeti dalje u tekstu).

Rezultati su prikazani u tablici 1 dalje u tekstu.Sve inokulirane svinje iz grupa 2, 3, i 4 bile su negativne za SCV2 antitijela 0 DPI.Dvije svinje u neinokuliranoj kontrolnoj grupi 1 imale su detektibilna SCV2 majčinska antitijela 0. DPI. Majčinsko je antitijelo u ova dva praščića iščezlo do 7. DPI. Nikakva serokonverzija u SCV2 nije detektirana niti u jednoj od 10 neinokuliranih kontrolnih svinja. U grupi 2 svinja intranazalno inokuliranih sa SCV2 infektivnim virusom, 1 je praščić imao serokonverziju u SCV2 antitijelo 21. DPI. Do 35.DPI, 4 od 5 svinja koje su ostale iz grupe 2 imale su serokonverziju. Serokonverzija u transfektiranim životinjama iz grupa 3 i 4 prvi se put pojavila 28. DPI. Do 35. DPI 5 od 5 svinja koje su ostale u grupi 3 i 3 od 5 preostalih u grupi 4 imale su serokonverziju u SCV2 antitijelo SPV antitijela testirana su 3. i 21. DPI za sve svinje, i 35.DPI za ostatak svinja. Majčinska antitijela na raznovrsni SPV agense kod svinja detektirana su u SBP praščićima. Titri SPV HI antitijela u svim praščićima osim kod jednog opadala su značajno od 3. DPI (prosječan titar 1.2,665) do 21. DPI (prosječan titar 1:246), što je ukazivalo na to da su antitijela koja su detektirana kod ovih praščića bila pasivno dobivena. Jedan je praščić imao malo povećanje SPV HI titra od 1:32 do 1:64 21. DPI i 35 DPI testirano je za SPV DNK pomoću već objavljenog PCR eseja (J. M. Soucie et al., "Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate: C porcine factor VIII concentrate," Transfusion 40:708-711 (2000)). Nikakova SPV viremija nije detektirana kod svinja bilo kojeg DPI, što je dalje ukazivalo na to da svinje nisu bile inficirane sa SPV.

Tablica 1.Serokonverzija u specifična antitijela za SCV2 u svinja inokuliranim sa SCV2 živim virusom ili direktnim cjepljenjem s kloniranom SCV2 plazidnom DNK

[image]

PRIMJER 6

PCR-RFLP analize

Da bi se izmjerila SCV2 viremija u svinja koje su transfektirane sa SCV2 molekulskim DNK klonom i u svinja inficiranim sa SCV2 infektivnim stokom virusa, uzorci seruma prikupljeni pri različitim DPI testirani su na prisustvo SCV2 DNK opće poznatim postupcima PCR-RFLP eseja koji je ranije već opisan (M. Fenaux et al., 2000, supra). Napravljena je ekstrakcija viralne DNK iz 50 μ l svakoga uzorka seruma uz pomoć DNAzol® reagensa na osnovi protokola koji preporučuje proizvođač (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Izolirana DNK resuspendirana je u vodi bez DN-aze, RN-aze i proteinaze i testirana na SCV2 DNK putem PCR-RFPL (id.). Produkti PCR-a iz izabranih životinja sekvencirani su da bi se potvrdilo podrijetlo virusa u inficiranim svinjama.

Uzorci seruma prikupljeni su iz svih kontrolnih i inokuliranih životinja pri 0, 7, 14, 21, 28 i 35 DPI i napravljeni su eseji za SCV2 viremiju detekcijom SCV2 DNK (id.) rezultati su prikazani u tablici 2. SCV2 DNK nije detektirana u grupi 1 inokuliranih kontrolnih svinja ni u jednom DPI. Detektirana je viremija u 7/10 svinja iz grupe 2, 14 DPI i 8/10, 35 DPI.Viremija je trajala samo nekoliko tjedana kako SCV2 DNK nije detektirana 28 DPI i 35 DPI kod svih 5 preostalih svinja iz grupe 2. U grupi 3 svinja koje su cijepljene intrahepatično sa SCV2 molekulskim DNK klonom, 8/10 svinja imale su viremiju 14 DPI i 9/10 svinja imalo je detektibilnu viremiju 35 DPI. Grupa 4 svinja inokulirana je sa SCV2 molekulskim DNK klonom direktno u limfne čvorove. Dvije od 10 svinja 14 DPI i 8 od 10 svinja 21 DPI iz grupe 4 imale su viremiju. Rezultati pokazuju da je SCV2 molekularni DNK klon infektivan kada se injecira direktno u jetru i površinske iliačne limfne čvorove SPF svinja.PCR proizvodi koji su umnoženi iz selektiranih životinja sekvencirani su.Sekvenca PCR proizvoda koji su umnoženi iz odabranih životinja bila je identična s odgovarajućom regijom SCV2 molekularnog DNK klona.

Tablica 2. Detekcija viremije (SCV2 DNK) pomoć u PCR u serumu inokuliranih i kontrolnih svinja

[image]

PRIMJER 7

Klinička procjena

Svinje su izmjerene 0 DPI i u vrijeme nekropsije. Vrijednosti rektalnih temperatura i vrijednosti kliničke respiratorne bolesti, bili su u opsegu 0 do 6 (0=normalno, 6=ozbiljna) (P. G. Halbur et al., "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus," Vet. Pathol. 32:648-660 (1995)), bilježene su svakoga dana od 0 do 35 DPI. Klinička zapažanja uključujući dokaz bolesti centralnog živčanog sustava, bolest jetre (ikterus), muskuloskeletna bolest i promjene stanja organizma isto su tako bilježene na dnevnoj bazi.

Da bi se procijenila krupna patologija i histopatologija, pet svinja iz svake grupe nasumce je odabrano za nekropsiju 21 i 35 DPI.Tim za nekropsiju nije bio obaviješten o statusu infekcije svinja kod kojih je rađena nekropsija. Kompletna nekropsija izvedena je na svim svinjama. Procijenjeni postotak pluća s jasno vidljivom upalom pluća zabilježen je za svaku svinju i bazirao se na ranije opisanom sustavu za vrednovanje (id.) Sustav vrednovanja se bazira na približnom volumenu koje svaki plućni režanj doprinosi cijelim plućima: desni kranijalni režanj, desni središnji režanj, kranijalni dio lijevog kranijalnog režnja, i repni (kaudalni) dio lijevog kranijalnog režnja, svaki posebno doprinosi sa 10% u ukupnom volumenu pluća, pomoćni režanj doprinosi s 5% i desni i lijevi kaudalni režnjevi doprinose 27.5%. Druge lezije kao što je uvećanje limfnih čvorova odvojeno je praćeno. Isječci za histopatološki pregled uzimani su iz nosne školjke, pluća sedam isječaka (id.), srca, mozga, limfnih čvorova (traheobranhijalnih, butnih, mezenteričnih, sublingvalnih) mandula, timusa, jetre, mokraćnog mjehura, slezene, zglobova, tankog crijeva, debelog crijeva, pankreasa i bubrega. Tkiva su pregledana bez prethodnih informacija o njima, i ocijenjeni su subjektivnim vrijednostima za težinu stanja lezija pluća, limfnih čvorova, i lezija jetre. Vrijednost za pluća bile su u opsegu od 0 (normalna) do 3 (teška limfohistiocitična intresticijalna upala pluća). Vrijednosti za jetru bile su u opsegu od 0 (normalna) do 3 (težak limfohistiocitični hepatitis). Vrijednosti za limfne čvorove bile su za procjenjenu količinu limfoidnog raspadanja folikula i bili su u opsegu od 0 (normalno nema limfoidnog raspadanja) do 3 (teško limfoidno raspadanje i histocitična zamjena folikula).

Serološki protokol uključuje sakupljanje krvi kada pristigne od 11 do 12 dana starih subjekata, i iz svih svinja 0, 7, 14, 21 i 35. DPI. Napravljeni su eseji za antitijela na PRRSV pomoću Herd Check PRRSV ELISA (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Antitijela na PPV u serumu detektirana su esejem inhibicije hemaglutinacije (HI) esej(H. S. Joo et al. , "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)). Antitijela na SCV2 u serumu detektirana su modificiranim indirektnim ELISA testom koji se bazira na rekombinantnom ORF proteinu SCV2 (P. Nawagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)). Djelomice pročišćen SCV2 antigen pripremljen je iz Hi Five stanica (Invitrogen, Carlsbad, CA) koje su inficirane s rekombinantnim bakulovirusom koji sadržava glavni kapsidni ORF2 protein SCV2 (P. Nawagitgul et al.,"Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)). Stanični lizati Hi Five stanica koje su inficirane s divljim tipom bakulovirusa pripremljene su na sličan način i služile su kao negativni kontrolni antigen. Immulon 2 HB polisterinske mikrotitar ploče Dynex Technologies Inc, Chantilly, VA) obložene su s optimalnim koncentracijama pozitivnih i negativnih antigena na 4ºC tijekom 36 sati. Stotinu ml svakoga uzorka seruma diluiranog 1:100 u 5% mliječnom diluentu (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) bilo je dodano u svaki bunarčić. Uzorci seruma testirani su u kvadruplikatu: 2 bunarčića za negativni kontrolni antigen i dva paralelna bunarčića za SCV2 antigen. Pozitivni i negativni kontrolni serumi uključeni su u svakoj ploči. Serumi su inkubirani na 37ºC tijekom 30 minuta i zatim oprani 5 puta s 0.1 M PBS puferom koji sadržava 0.1% Tween-20. Sekundarni Anti-svinjski IgG obilježen s peroksidazom (Sigma Co, St. Louis, MO) inkubiran je na 37ºC tijekom 30 minuta. Ploče su ponovo isprane i inkubirane s 2,2’-azino-di-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonatom (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc) na 37ºC tijekom 15 minuta za razvoj boje. Optička gustoća (optic density-OD) čitana je na 405 nm. Izračunat je korigiran OD za svaki testirani i kontrolni serum oduzimanjem srednje vrijednosti bunarčića koji sadržava negativni antigen od onog u paralelnom bunarčiću koji sadržava SCV2 antigen. Podaci su normalizirani dijeljenjem korigirane vrijednosti OD testiranog uzorka seruma (S) s onom od pozitivnog kontrolnog seruma (P) i prikazan je kao odnosi S/P. Uzorci sa S/P odnosima </=0.12, 1.12 do 0.2, i >0.2 uzeti su kao negativni, dvosmisleni (ekvivokalni) i pozitivni.

U rezultatima dobivenim iz kliničke procjene, nijedna od kontrola i inokuliranih svinja nije pokazivala očite znakove bolesti koji su podsjećali na one od kliničkog PMWS. Nije bilo razlike u dobivanju na težini ili u srednjim rektalnim temperaturama između bilo kojih od četiri grupe. Kontrolne svinje iz grupe 1 ostale su normalne tijekom pokusa. Postojala je blaga tranzijentna respiratorna bolest koja je detektirana kod većine svinja u grupi transfektiranoj sa SCV2 DNK i grupi inficiranoj s virusom SCV2 od 8. do 14. DPI. Ovo stanje karakterizirala je blaga dispnea (kliničke respiratorne vrijednosti 1 do 2) koja je trajala jedan do dva dana u pojedinačnim svinjama i 5-6 dana za grupu.

Nije bilo krupnih lezija u kontrolnim svinjama kad im je rađena nekropsija. Svinje u tri inokulirane grupe imale su krupne lezije koje su bile limitirane na pluća i limfne čvorove (vidjeti tablicu 3). Lezije su bile slične izmeđ u svinja u grupi transfektriranoj sa SCV2 DNK i grupi inficiranoj s virusom SCV2. Pluća nisu uspjela kolabirati (colapse) i imala su nasumične, multifokalne, umjerene, jasno ograničene površine smeđe do purpurne konsolidacije (consolidation) koje pokrivaju 0-2% pluća (slika 3) 21.DPI i 1-13% pluća 35. DPI. Limfni su čvorovi bili sistematično uvećani 2 do 5 puta u odnosu na normalnu veličinu, čvrsti, i smeđi (slika 3) i 21. i 35 DPI kod većine svinja iz sve tri grupe koje su inokulirane sa SCV2.

Mikroskopskim pregledom nisu otkrivene lezije u bilo kojem tkivu kod kontrolnih svinja osim u tkivu jetre. Osam od deset kontrolnih svinja imalo je blagu multifokalnu limfoplazmatičnu inflaminaciju predomianantno u periportalnim regijama jetre što se često javlja kod normalnih svinja i uzima se kao normalna pozadina (background) (P. G. Halbur et al. , 2001, supra).

Svinje iz dvije grupe koje su transfektirane sa SCV2 plazmidnom DNK (intrahepatična i intralimfna grupa) i grupa inficirana sa SCV2 (intranazalna) imale su slične lezije u mozgu, plućima, srcu, bubregu, limfnom tkivu (mandula, limfni čvorovi, slezena), ileum, i jetra (vidjeti tablicu 4). Lezije na mozgu opažene su u 23/30 svinja iz tri inokulirane grupe i okarakterizirane su kao blage do umjerene multifokalne limfoplazmacitične meningoencefalitične s perivaskularni “cuffing” i “gliosis”. Plućne lezije opažene su u 23/30 svinja iz tri inokulirane grupe i okarakterizirane su kao blage do umjerene peribronhiolarne limfo-plazmacitične i histiocitične bronhointersticijalne upale pluća (sl.3C). Jedna svinja iz grupe 2 inficiranih sa SCV2 virusom kojoj je nekropsija napravljena 21. DPI, i po jedna svinja iz dvije grupe koje su transfektirane sa SCV22 plazmidnom DNK kojima je napravljena nekropsija 35. DPI imale su ulcerativni (kao čir) i proliferativni bronhiolitis s fibriplazijom i granulomatoznu inflaminaciju (upalu) u lamnia propria i peribronhijalnim regijama bronhija. Blagi limfoplazmacitični miokarditis isto je tako primjećen kod 18/30 svinja inokuliranih sa SCV2. Kod 14/30 svinja inokuliranih sa SCV2, primjećen je blag do umjeren multifokalni limfoplazmicitični intersticijalni nefritis. U timusima nisu registrirane nikakve lezije. Blago do umjereno limfoidno raspadanje (slika 4B) i histiocitična zamjena folikula registrirane su u manduli 8/38, u slezeni 7/30 i limfnim čvorovima 26/30 svinja inokuliranih sa SCV2. Umjereni granulomatozni limfadenitis u gigantskim stanicama (sl. 4C) uočen je 21. DPI kod tri svinje inokulirane intranazalno sa SCV2 virusom, i kod jedne svinje 35. DPI u svakoj grupi koja je transfektirana sa SCV2 plazmidnom DNK. Blagi limfoplazmacitični i histocitični enterokolitis primjećen je kod 3/5 svinja u grupi inokuliranoj sa SCV2 virusom, kod 3/5 svinja u grupi intrahepatitično transfektriranoj sa SCV2 plazmidnom DNK, i 1/5 svinja u grupi intralimfoidno transfektriranoj sa SCV2 plazmidnom DNK 35. DPI. Jedna svinja u svakoj od grupa transfektriranoj sa SCV2 plazmidnom DNK imala je blago limfoidno raspadanje s histocitičnom zamjenom i niskim brojem gigantskih stanica u “Peyer’s patches”. Blagi do umjereni limfoplazmacitični hepatitis uočen je kod 29/30 od tri svinje inokulirane sa SCV2. Uočen je nizak broj široko razbacanih individualnih hepacitocita koje su okružene inflaminacijom kod jedne svinje u svakoj grupi transfektriranoj sa SCV2 plazmidnom DNK 21. DPI. Lezije u drugim tkivima nisu bile vidljive.

Mikroskopske lezije u plućima, jetri i limfnim čvorovima vrednovane su na osnovi objavljenih vrijednosnih sustava (tablica 4) (P. G. Halbur et al. , 2001, supra ; P. G. Halbur et al. , 1995, supra). Za druga tkiva i organe nije postojao odgovarajući sustav za vrednovanje (ocjenjivanja). Prosječni rezultati za lezije u plućima i limfnim čvorovima kod svinja iz tri grupe koje su inokulirane sa SCV2 statistički su se razlikovale od onih iz kontrolnih svinja grupe 1. Prosječne vrijednosti za lezije jetre kod svinja iz tri grupe koje su inokulirane sa SCV2 nisu statistički bile različite od onih kod kontrolnih svinja.

Tablica 3. Krupne lezije pluća i limfnih čvorova kod kontrolnih i SCV2- inokuliranih svinja

[image]

Tablica 4. Distribucija histopatoloških lezija kod kontrolnih i SCV2-inokuliranih svinja

[image]

PRIMJER 8

Imunohistokemija

Detekcija imunohistokemijom (IHH) SCV2-specifičnog antigena izvedena je na tkivima prikupljenim tijekom nekropsije DPI 21 i 35. Zečiji poliklonalni SCV2 specifični antiserum upotrebljen je za IHH, i opće procedure već su ranije objavljene (S. D. Sorden et al. , 1999, supra ).

Za detekciju i distribuciju u tkivu SCV2 antigena, IHH bojanje SCV2 antigena izvedeno je na mozgu, plućima, ušnoj školjci, srcu, manduli, limfnim čvorovima, slezeni, timusu, ileumu, jetri, mokraćnom mjehuru i pankreasu kod svih svinja koje su podvrgnute nekropciji 21 i 35 DPI. Sva su tkiva iz kontrolnih svinja bila negativna za SCV2 antigen.Distribucija u tkivu SCV2 antigena u tri SCV2-inokulirane grupe bila je slična (vidjeti tablicu 5).U mozgu je, SCV2 antigen predominantno pronađen u mononuklearnim stanicama, stanicama sličnim fibroblastima, i endotelijalnim stanicama meninge (moždane opne-membrane) i horoidnog pleksusa i rjeđe u endotelijalnim stanicama i perivaskularnim mononuklearnim stanicama velikog i malog mozga.U plućima, SCV2 antigen je detektiran u alveolarnim i septalnim makrofazima i stanicama sličnim fibroblastu u lamina propria dišnih puteva (sl.3D).U srcu, SCV2 antigen pronađen je u široko rasutim makrofazima i endotelijalnim stanicama.U bubrezima je SCV2 antigendetektiran u okviru tubularnih epitelijalnih stanica i mononuklearnih stanica u intersticiju. U limfnom tkivu (limfni čvorovi, slezena, mandula, “Peyer’s patches” ) SCV2 antigen primarno je detektiran u makrofazima i stanicama sličnim denričnim stanicama i gigantskim stanicama u folikulima (sl.4D). SCV2 antigen isto je tako detektiran u makrofazima lamina propria tankoga crijeva.U jetri je SCV2 antigen pronađen u mononuklearnim stanicama i Kupferovim stanicama.SCV2 nije detektiran u školjci, timusu niti mokraćnom mjehuru.

Tablica 5. Detekcija i distribucija SCV2-specifičnog antigena pomoću imunohistokemije u kontrolnim i SCV2-inokuliranim svinjama

[image]

PRIMJER 9

Konstruiranje nepatogenog infektivnog SCV2 DNK klona

Procedura koja je korištena za konstruiranje SCV1 infektivnog DNK klona u biti je ista kao ona opisana ovdje u izumu za SCV2.Par prajmera za PCR, KPNPCV1. U prikazan u SEQ ID NO:7 i KPNPCV1.L prikazan u SEQ ID NO:8 (vidjeti tablicu 6), dizajniran je na osnovi objavljene sekvence SCV1. Ovaj par prajmera umnožava kompletan genom SCV1 s preklapajućom regijom koja ima jedinstveno KpnI restrikcijsko mjesto. DNK od SCV1 virusa izolirana je iz kontaminirane stanične linije ATCC PK-15 nabavljene od American Type Culture Collection (ATCC broj pristupa CCL-33). SCV1 DNK izolirana je iz ATCC PK-15 stanica koje su perzistentno inficirane sa SCV1, pomoću QIAmp DNA minikit (Qiagen, Inc.,Valencia, CA.). Izolirana DNK umnožena je u PCR reakciji s AmpliTaq Gold polimerazom (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). PCR ciklusi sastojali su se od inicijalnog koraka na 95ºC tijekom 10 minuta, zatim je slijedilo 35 ciklusa denaturacije na 94ºC tijekom 1 minute, vezivanje prajmera za matricu (annealing) na 48ºC 1 minuta i ekstenzije na 72ºC tijekom 2 minute, i finalne ekstenzije na 72ºC tijekom 7 minuta. PCR proizvod očekivane dužine odvojen je elektroforezom na gelu i pročišćen pomoću “glassmilk” procedure s Geneclean kitom (Bio 101, Inc., La Jolla, CA). Pročišćeni PCR proizvod koji sadržava kompletni SCV1 genom prvo je ligiran u advanTAge plazmidni vektor (Clontech, Palo Alto, CA). E. Coli DH5α kompetentne stanice korištene su za transformaciju.

Rekombinanatni plazmidi potvrđeni su digestijom s restrikcijskim enzimima.SCV1 geomska DNK kompletne dužine izrezana je iz advanTAge vektora rezanjem s KpnI restrikcijskim enzimom. SCV1 geomska DNK kompletne dužine ligirana je u pBluescriptSK(+) vektor (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) s T4 ligazom na 37ºC preko noć i. Rekombinanatni plazmidi koji sadržavaju SCV1 geomska DNK kompletne dužine izolirane su s Qiagen kitom za mini prep (izoliranje plazmida na maloj skali) (Qiagen, Valencia, CA) i potvrđeni su rezanjem s restrikcijskim enzimima i sekvenciranjem DNK. SCV1 geomska DNK kompletne dužine izrezana je iz pSK vektora s KpnI restriktivnim enzimom, i dimerizirana da bi se napravio infektivni DNK klon kao što je opisano u primjeru 2 za SCV2 infektivni klon.Ovi tandem dimeri napravljeni su jer je za dimerizirane tandem DNK klonove pokazano da su efikasniji u transfekciji stanica i proizvodnji infektivnih viriona. Da bi se napravio tandemski dimer SCV1 DNK, izrezana SCV1 genomska DNK ligirana je s T4 DNK ligazom na 37C samo 10 min., što favorizira stvaranje tandem dimera. Tandem dimeri zatim su klonirani u pBluescriptSK(+) vektor (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA).

Rekombinanatni plazmidi koji sadržavaju tandemske dimere SCV1 genoma (ovdje su označeni kao “SCV1 DNK klon”) potvrđeni su pomoću PCR postupka, digestije restrikcijskim enzimima i sekvenciranjem DNK. Koncentracija DNK rekombinanatnih plazmida određena je na spektrofotometru.

Tablica 6. Oligonukleotidni prajmeri koji su se koristili u ovome izumu

[image]

a smjer prajmera

PRIMJER 10

Procjena infektivnosti SCV1 DNK klona kada se transfektira u PK-15 stanice bez kontaminacije virusom

Infektivnost SCV1 molekularnog DNK klona određena je in vitro transfekcijom PK-15 stanica. IFE sa SCv1 specifičnim monoklonalnim antitijelima (poklon od Dr. Gordon Allan, Belfast, U. K.) potvrdila su da je CSV1 molekularni DNK klon infektivan u PK-15 stanicama. SCV1-specifični antigen vizualiziran je pomoću IFE u jedru, i u manjem obujmu u citoplazmi transfektiranih stanica.Stanice koje su lažno transfektirane s praznim pSK vektorom ostale su negativne za SCV1 antigen.

PRIMJER 11

Konstruiranje himernog SCV1-2 viralnog SCV1-2 klona

Himerni virus konstruiran je između nepatogenog SCV1 i SCV2 koji je povezan s PMWS uporabom infektivnog DNK klona SCV1 i SCV2.Da bi se konstruirao himerni SCV1-2 DNK klon, ORF2 kapsidni gen nepatogenog SCV1 uklonjen je iz SCV1 infektivnog DNK klona, i zamijenjen s imunogenim ORF2 kapsidnim genom iz patogenog SCV2 ukralješnici genoma SCV1 (vidjeti slike 5 i 6).Dizajnirana su dva para prajmera za PCR. Prvi prajmerski par za SCV2 ORF2, Psi I-5 prikazan u SEQ ID NO:11 i Acl I-6 prikazan u SEQ ID NO:12, dizajnirani su s točkastim mutacijama na 5’ krajevima prajmera da bi se napravila restrikcijska mjesta AvlI i PstI u cilju umnažanja ORF2 gena iz SCV2 i da bi se unijela restrikcijska mjesta koja ga obrubljuju pomoću točkaste mutacije. PCR reakcija za umnažanje ORF2 sastojala se od inicijalnog koraka 95ºC tijekom 9 minuta, zatim je slijedilo 38 ciklusa denaturacije na 95ºC tijekom 1 minute, vezanje prajmera za jednolančanu matricu na 48ºC tijekom 1 minute, ekstenzija prajmera na 72ºC tijekom 1 minute i finalna ekstenzija na 72ºC tijekom 7 minuta.

Drugi par PCR primjera, Hpa I-2 prikazan u SEQ ID NO:9 i Nar I-3 prikazan u SEQ ID NO:10, dizajniran je za umnožavanje pSK+ vektora i njegovog SCV1 genomskog inserta. Točkaste mutacije unesene su na 5’ krajevima PCR prajmera da bi se napravila restrikcijska mjesta NarI i HpaI koja obrubljuju umnoženi fragment. Ovaj par prajmera umnožavao je pSK+ vektor i njegov insert SCV1 genomsku DNK kojoj nedostaje ORF2 kapsidni gen, to jest, SCV1 genom minus SCV1 ORF2 (pSK-SCV1 _ORF2) uporabom SCV1 infektivnog DNK klona kao matrice za PCR. PCR reakcija sastojala se od inicijalnog koraka 95ºC tijekom 9 minuta, zatim je slijedilo 38 ciklusa denaturacije na 95ºC tijekom 1 minute, vezanje prajmera za jednolančanu matricu na 50ºC tijekom 1 minute, ekstenzija prajmera na 72ºC tijekom 3.5 minute i finalna ekstenzija na 72ºC tijekom 7 minuta. SCV2 ORF produkt iz PCR reakcije rezan je s AclI i PstI da bi se uklonile unešene točkaste mutacije.pSK-SCV1 DORF2 proizvod (pSK vektor-SCV1 genom proizvod kojem nedostaje ORF2 gen zi SCV1) rezan s NarI i HpaI da bi se uklonile PCR-om unesene točkaste mutacije. Posljednja digestija proizvela je ljepljivi kraj i “blunt”-ravni kraj koji su komplementarni sa SCV2 ORF2 PCr proizvodom koji je rezan s AclI i PstI restrikcijskim enzimima. Izrezani SCV2 ORF2 proizvod i proizvod PSK-SCV1 s deletiranim ORF2 ligirani su s T4 DNK ligazom da bi formirali himerni SCV1-2 genomski DNK klon, u kojem je ORF2 gen iz SCV1 zamijenjen s ORF2 genom iz SCV2. Kada su dva proizvoda iz PCR-a izrezana i religirana, PCR-om unesene točkaste mutacije koje su korištene za olakšavanje kloniranja uklonjene su u dobivenom himernom klonu. Escherichia coli DH5α kompetentne su stanice transformirane. Rekombinantni plazmidi koji sadržavaju himerni DNK klon izolirani su i potvrđeni PCR-om, restrikcijskim enzimima i djelomičnim sekvenciranjem DNK.Himerni SCV1.2 genom kompletne dužine izrezan je iz pSK+ vektora (rekombinantni plazmid) s KpnI digestijom.Himerni DNK genom dimeriziran je kratkom reakcijom ligacije s T4 DNK ligazom koja favorizira formiranje linearnih dimera da bi se proizveo SCV1-2 himerni infektivni DNK klon (slika 6).Rekombinantni plazmidi koji sadržavaju dvije kopije himernog viralnog genoma potvrđeni su PCR-om, restrikcijskim enzimima i sekvenciranjem DNK.

PRIMJER 12

Procjena in vitro infektivnosti SCV1-2 himernog DNK

Vijabilnost himernog SCV DNK klona (nepatogeni SCV1 s imunogenim kapsidnim genom iz SCV2) testirana je u PK-15 stanicama. Kad su PK-15 stanice transfektirane s himernim viralnim DNK klonom, viralni antigen specifičan za SCV2 ORF2 kapsidni gen detektiran je pomoću IFE oko 2 dana poslije infekcije. SCV1 kapsidni antigen nije detektiran u transfektiranim stanicama. Pokus ukazuje na to da je himerni DNK klon infektivan in vitro, da replicira u PK-15 stanicama i proizvodi imunogeni kapsidni portein iz SCV2.

PRIMJER 13

Konstruiranje recipročnog himernog SCV2-1 DNK klona

Da bi se konstruirao recipročan SCV2-1 himerni DNK klon, ORF kapsidni gen iz SCV2 zamijenjen je s onim iz nepatogenog SCV1 u kičmi genoma patogenog SCV2 (Slika 6). Dizajnirana su dva prajmerska para za PCRF: par, Bgl-II-ORF2 prikazan u SEQ ID NO:13 i SpH-I-ORF2 prikazan u SEQ ID NO:14, koji umnožavaju SCV1 ORF2 gen i s točkastim mutacijama unose na krajevima restrikcijska mjesta Bgl II and SpH I. Drugi par prajmera za PCR Bgl-II-PCV2 prikazan u SEQ ID NO:15 i SpH-I-PCV2 prikazan u SEQ ID NO:16, umnožavali su pSK vektor i SCV2 genom minus ORF2 gen (pSK-SCV2 DORF) uporabom SCV2 infektivnog DNK klona kao matrice za PCR, i unošenjem pomoć u točkastih mutacija restrikcijskih mjesta za BglI i SphI na krajevima. pSK-SCV2 DORF produkt i SCV1 ORF2 PCR produkt rezani su s BglI i SphI restrikcijskim enzimima da bi proizveli komplementarne ljepljive i ravne “blunt” krajeve koji zajedno ligiraju. Nakon transformacije u E.coli stanice, izolirani su autentični rekombinantni plazmidi i potvrđeni rezanjem s enzimima i sekvenciranjem DNK. Recipročni himerni SCV2-1 genom kompletne dužine izrezan je iz rekombinantnog plazmida sa SacI restrikcijskim enzimom, i dimeriziran kao što je ovdje opisano da bi se dobio recipročni himerni SCV2-1 infektivni klon.

PRIMJER 14

In vitro transfekcija PK-15 stanica sa SCV1, SCV2, SCV1-2 i SCV2-1 DNK klonovima

Infektivnost SCV2 klona in vitro i in vivo demonstrirana je u primjerima 3-5, koji su gore u tekstu opisani. Da bi se infektivnost SCV1 i dva himerna klona testirala, PK-15 stanice bez SCV1 kontaminacije pripremljene na osnovi metode iz primjera 1 uzgajane su u LabTek komorama (LabTek chamber slides) (Nalge Nunc Int., Denmark). Kada su PK-15 stanice dostigle oko 80% konfluentnosti stanice su transfektirane sa SCV1, SCV2, SCV1-2 i SCV2-1 DNK klonovima uporabom Lipofectamine Plus reagensa na osnovi protokola koji je preporučio proizvođač (Life Technologies, Inc). Lažno-transfektirane stanice s praznim pSK vektorom uključene su kao kontrole. Tri dana nakon transfekcije, stanice su fiksirane s otopinom koja sadržava 80% aceton i 20% metanol na 4ºC tijekom 20 minuta. Dokaz o infektivnosti i virusnoj replikaciji u stanicama transfektiranim sa SCV1 i SCV2-1 DNK klonovima potvrđena je indirektnim imunofluorescentnim esejem (IFE) pomoć u monoklonalnog antitijela protiv SCV1 ORF2 kapsidnog gena, koji smo dobili zahvaljujući ljubaznosti Dr. G. M. Allan (G. M. Allan et al., "Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus," Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994)). Fiksirane stanice oprane su s fosfatnim puferom u fiziološkoj otopini (PBS puferom), i inkubirane sa SCV1 monoklonalnim antitijelom na 37ºC tijekom 45 minuta. Stanice su zatim tri puta oprane s PBS puferom, i inkubirane s fluorscein izotiocijanat (FITC) obilježenim kozjim anti-mišijim inunoglobulinom G (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) na 37ºC tijekom 45 minuta.

Stanice su zatim tri puta oprane s PBS puferom, i inkubirane sa sekundarnim FITC-obilježenim kozjim anti-zečijim IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) na 37ºC tijekom 45 minuta. Poslije ispiranja slajdova tri puta s PBS puferom, slajdovi su napunjeni s flormont-G, stavljena su pokrovna stakla i preparat je pregledan pod fluorescentnim mikroskopom.Izračunata je 50% infektivna doza kulture tkiva po ml (IDKT50 /ml). Inicijalno, stanice su transfektirane s plazmidnim konstruktom koji sadržava jednu kopiju SCV2 genoma ali je infektivni SCV2 titar iz pojedinačnog genomskog konstrukta bio mnogo niži nego onaj kod onoga što sadržava tandem genoma. Zato je za in vitro i in vivo eksperimente transfekcije korišten plazmidni konstrukt koji sadržava dimernu formu SCV2 genoma. Nakon ispiranja tri puta s PBS puferom, pločice su napunjene s fluormount-G, stavljene su im pokrovne pločice, i pregledane su na fluorescentnom mikroskopu. Infektivnost stanica transfektiranih sa SCV2 i himernim SCV1-2 DNK klonovima potvrđena je s IFE pomoć u antitijela specifičnih za SCV2, kao što je ranije opisano u primjeru 4.

Infektivnost SCV1, himernog SCV1-2 i recipročnog himernog SCV2-1 klona potvrđena je u in vitro transfekciji PK-15 stanica.Dvije identične kopije kompletnog SCV1 genoma ligirane su u tandemu u pSk vektor da bi se dobio SCV1 DNK klon (sl.6).Himerni SCV1-2 DNK klon posjedovao je ORF2 kapsidni gen iz SCV1 zamijenjen s patogenim SCV2 u kralješnici nepatogenog SCV1 genoma. Recipročni himerni SCV2-1 klon imao je ORF kapsidni gen iz SCV2 zamijenjen s istim iz nepatogenog SCV1 u kralješnici patogenog SCV2 genoma. Ako je in vitro infektivan, himerni SCV1-2 klon će proizvoditi ORF2 kapsidni antigen od SCV2 a recipročni SCV2-1 klon će eksorimirati SCV1 ORF kapsidni antigen u transfektiranim PK-15 stanicama. Rezultati su pokazali da su SCV1, himerni SCV1-2 i recipročni himerni SCV2-1 klonovi na iznenađenje bili infektivni kada se transtektiraju u PK-15 stanice i eksprimirali su odgovarajuće viralne kapsidne antigenske proteine kao što je demonstrirano pomoć u IFE uporabom antitijela specifičnih za SCV1 ili SCV2. IFE u kojem su upotrebljena monoklonalna antitijela protiv SCV1 ORF2 i antitijela protiv SCV2 potvrdila su da su SCV1 DNK i SCV1-2 DNK klonovi infektivni.IFE u kojem je upotrebljeno SCV1 ORF2-specifično monoklonalno antitijelo pokazao je da je SCV1-2 himerni DNK klon isto tako infektivan.Oko 10-20% transfektiranih PK-15 stanica bile su pozitivne za SCV1 kapsidni i SCV2 antigen, i eksprimirale su SCV1 ORF antigen, u okviru jedra transfektiranih stanica (sl.7).

PRIMJER 15

Eksperimentalno inokuliranje svinja sa SCV1, SCV2, himernim SCV1-2 i recipročnim himernim SCV2-1 klonovima

Da bi se procijenila imunogenost i patogenost himernih DNK klonova, četrdeset specifičnih svinja bez patogena (SBP) starih 4-6 tjedana nasumce je upućeno u pet soba u kojima je bilo po 8 životinja. Prije inokulacije, životinje su testirane na antitijela za SCv, PRRSV, PPV i za hepatitis E virus svinja. Dodatno, pre-inokulacijski uzorci seruma testirani su PCR-om za SCV1 i SCV2 nukleinske kiseline da bi se potvrdilo da svinje nisu prirodno inficirane s bilo kojim od ova dva virusa. SCV1, SCV2, SCv1-2 i SCV2-1 DNK klonovi inokulirani su direktnim injeciranjem klonirane plazmidne DNK u superficijalne butne limfne čvorove svinja.Svinje iz grupe 1 primile su PBS pufer (fiziološku otopinu puferiranu fosfatom) i služili su kao negativna kontrola.Svinje iz grupe 2 bile su cijepljene u butne limfne čvorove s 200 ml infektivnog SCV1 DNK klona.Svinje iz grupe 3 bile su cijepljene u butne limfne čvorove s 200 μl infektivnog SCV2 DNK klona.Svinje iz grupe 4 bile su cijepljene u butne limfne čvorove s 200 μl infektivnog SCV1-2 DNK klona.Svinje iz grupe 5 bile su cijepljene u butne limfne čvorove s 200 μl infektivnog SCV2-1 DNK klona. Sve životinje su na dnevnoj bazi pregledane na kliničke znakove bolesti. Uzorci seruma prikupljani su iz svake životinje – 2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 dana poslije inokulacije (DPI). 21. DPI za nasumce izabrane životinje iz svake grupe napravljena je nekropsija. Za ostale četiri životinje iz svake grupe nekropsija je napravljena 49. DPI. Tijekom nekropsije prikupljena su različita tkiva i organi kao što je već ranije opisano u primjeru 7, i procesirani su za histološki pregled.

Imunogenost SCV1, SCV2 i himernog infektivnog SCV1-2 klona pregledani su kod svinja.Uzorci seruma prikupljeni su iz svih kontrolnih i inokuliranih životinja-2 (0), 7, 14, 21, 28, 35, 42 and 49 DPI i napravljeni su eseji za SCV1, SCV2, SCV1-2 i SCV2-1 viremiju pomoć u PCR reakcije klon specifičnih DNK sekvenci, za anti-SCV1 antitijela pomoć u IFE i za anti- SCV2 ORF2 antitijela pomoću ELISA testa. Prije inokulacije -2 DPI, životinje iz svih pet grupa bile su negativne u PCR testu za oba SCV1 i SC2.

Životinje koje su bile negativna kontrola za SCV1 i SCV2 viremije u studiji (vidjeti tablicu 7 dalje u tekstu).Pet svinja u neinokuliranoj kontrolnoj grupi imale su detektibilna SCV2 majčinska antitijela – 2 DPI i dvije su svinje imale detektabilna SCV1 majčinska antitijela 7 DPI (vidjeti tablicu 8 dalje u tekstu). Majčinska antitijela i SCV1 i SCV2 u ovim praščićima nestala su do 21 DPI. Tijekom ove studije nije bila detektirana nikakva serokonverzija niti u SCV1 niti u SCV2 ni u jednom od osam kontrolnih neinokuliranih svinja.

U grupi inokuliranoj sa SCV1, viremija je prvi put detektirana kod inokulirane svinje 7 DPI (tablica 7 dalje u tekstu), i posljednji put je detektirana 35 DPI. Pet od osam životinja koje su inokulirane sa SCV1 infektivnim DNK klonom bile su pozitivne za SCV1 viremiju. Prosječna dužina trajanja kontinuirane SCV1 viremije bio je 0.625 tjedana. Do 21. SCV1, sve životinje u grupi koje su inokulirane sa SCV1 podlegle su serokonverziji u SCV1 i ostale su pozitivne na SCV1 antitijela do kraja studije tj 49 DPI.

Za SCV2 DNK klon ovdje je pokazano da je infektivan kod svinja. U grupi inokuliranoj sa SCV2 DNK, SCV2 viremija je prvi put detektirana 7 DPI (tablica 7 dalje u tekstu). Do 21 DPI, sve životinje iz grupe 3 koje su inokulirane sa SCV2 bile su pozitivne za SCV2 viremiju. Prosječna dužina trajanja SCV2 viremije bila je 2.12 tjedna. Dvije svinje iz grupe koje su inokulirane sa SCV2 imale su detektibilne nivoe majčinskih SCV2 antitijela 7DPI (tablica 8 dalje u tekstu) i u ovim praščićima majčinska antitijela su nestala do 14. DPI. Serokonverzija u SCV2, koja je utvrđena ELISA testom sa specifičnima SCV2 antitijelima, prvi je put detektirana 35 DPI. Do 42 DPI sve svinje koje su inokulirane sa SCV2 infektivnim DNK klonom podlegle su serokonverziji u SCV2.

U grupi 4 svinja koje su inokulirane sa SCV1-2 himernom infektivnim DNK klonom, viremija specifična za himerni virus prvi je put detektirana 14 DPI (tablica 7 dalje u tekstu).Četiri od 7 inokuliranih životinja dobilo je viremiju sa SCV1-2 izmeđ u 14 i 42 DPI. Prosječna dužina himerne SCV1-2 viremije bila je 1 tjedan. Jedna svinja imala je detektabilne nivoe majčinskih SCV2 antitijela 7 i 14 DPI, ali majčinska su antitijela nestala do 21 DPI (tablica 8 dalje u tekstu). Serokonverzija u SCV2 ORF-specifično antitijelo dogodila se prvi put 28 DPI. Do 49 DPI, sve svinje inokulirane s himernim SCV1-2 DNK klonom podlegle su serokonverziji u SCV2 specifično antitijelo.

Kod svinja koje su inokulirane s recipročnim himernim SCV2-1 klonom, viralna DNK specifična za SCV2-1 himerni virus nije bila detektirana u uzorcima seruma (tablica 7 dalje u tekstu).Međutim, do 21 DPI sve životinje iz grupe 5 podlegle su serokonverziji u SCV1 antitijelo.PCR proizvodi koji su dobiveni umnožavanjem iz selektiranih svinja u svakoj grupi sekvencirani su i potvrđeno je da su autentični odgovarajući infektivni klonovi koji su korišteni u inokulaciji u svakoj grupi.

Tablica 7. Detekcija viremije pomoću “nested” PCR-a u serumu inokuliranih i kontrolnih svinja

[image]

Tablica 8. Serokonverzija u antitijela protiv SCV2 kod svinja koje su inokulirane sa SCV2 ili himernim SCV1-2 DNK klonovima ili serokonverzija u antitijela protiv SCV1 kod svinja sa SCV1 ili SCV1-2 DNK klonovima

[image]

[image]

PRIMJER 16

Klinička procjena

Svinje su izmjerene 0 DPI i u vrijeme nekropsije. Rektalne temperature i kliničke respiratorne vrijednosti, koje su bile u opsegu od 0 do 6 (0=normalno; 6= teško) (P. G. Halbur et al. , "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus," Vet. Pathol. 32:648-660 (1995)), bilježene su svaki drugi dan počevši od 0 do 49 DPI. Klinička zapažanja, uključujući dokaze bolesti centralnog živčanog sustava, bolesti jetre (ikterus), muskoskeltna bolest i promjene stanja organizma, isto su tako bilježena na dnevnoj bazi. Tim od dva čovjeka izveo je sve kliničke procjene.

Nijedna od kontrolnih kao ni inokuliranih svinja nije pokazivala očite znakove kompletne kliničke slike PMWS. Nisu postojale razlike u dobivanju na tjelesnoj težini ili u srednjim tjelesnim temperaturama između bilo koje grupe. Jedna od svinja iz grupe 3 koja je inokulirana sa SCV1-2 uginula je jedan dan nakon inokulacije. Poslije izvedene nekropsije i kliničkih analiza, nije detektiran patogeni agens i smrt nije bila povezana s inokulacijskom procedurom ili himernim SCV1-2 virusom.

PRIMJER 17

Krupna patologija i histopatologija

Za četiri svinje iz svake grupe napravljena je nekropsija 21 i 49 DPI.Tim za nekropsiju nije imao informacije o infektivnom statusu svinja u trenutku nekropsije.Na svim svinjama napravljena je kompletna nekropsija. Procijenjen postotak pluća s krupnom vidljivom upalom pluća zabilježen je za svaku svinju i baziran je na prethodno opisanom sustavu za vrednovanje (P. G. Halbur et al., 1995, supra). Druge lezije kao uvećanje limfnih čvorova odvojeno je notirano. Isječci za histopatološki pregled uzeti su iz nosne školjke, pluća (sedam isječaka) (id.), srca, mozga, limfnih čvorova (traheobranhijalnih, butni, mezenteričnih, sublingvalnih), mandula, timusa, jetre, mokraćnog mjehura, slezene, zglobova, tankog crijeva, debelog crijeva, pankreasa i bubrega. Tkiva su pregledana bez prethodnih informacija o njima, i ocijenjeni su subjektivnim vrijednostima za težinu stanja lezija pluća, limfnih čvorova, i lezija jetre kao što je opisano u primjeru 7. Vrijednosti za pluća bile su u opsegu od 0 (normalna) do 3 (teška limfohistiocitična intresticijalna upala pluća). Vrijednosti za jetru bile su u opsegu od 0 (normalna) do 3 (težak limfohistiocitični hepatitis). Vrijednosti za limfne čvorove bile su za procjenjenu količinu limfoidnog raspadanja folikula i bili su u opsegu od 0 (normalno nema limfnog raspadanja) do 3 (teško limfno raspadanje i histocitična zamjena folikula).

Da bi se odredila patogenost SCV1, SCV2, himernog SCV1-2 i SCV2-1 infektivnih DNK klonova u svinja, prvo su pregledane krupne lezije.Rezultati su prikazani u tablici 9 dalje u tekstu.Limfni čvorovi životinja koje su bile u kontrolnoj grupi 1 koja nije inokulirana bili su normalni i 21 i 49 DPI. Svinje u četiri grupe koje su inokulirane imale su različite stupnjeve krupnih lezija koje su bili ograničene na limfnim čvorovima. U grupi 2 svinja koje su inokulirane sa SCV1, limfni čvorovi bili su krupni normalni 21 DPI, međutim, blago do umjereno oticanje i diskoloracija limfnih čvorova detektirana je 49 DPI. Sve svinje iz grupe 3 koje su inokulirane sa SCV2 imale su uvećane limfne čvorove dva do pet puta u odnosu na normalnu veličinu, koji su bili čvrsti i smeđe obojeni i 21 i 49 DPI. Limfni čvorovi iz životinja koje su inokulirane s himernim SCV2-1 klonom bili su blago do umjereno otečeni i bezbojni i 21 i 49 DPI kod 5 od sedam svinja. U grupi 5 svinja koje su inokulirane sa SCV2-1 klonom, 1 od 8 životinja imala je blago otečene i bezbojne limfne čvorove 21 DPI. Prosječne vrijednosti krupnih lezija limfnih čvorova kod svinja inokuliranim s himernim SCV1-2 klonom nisu bile statistički različite od onih u grupama 1, 2 i 5, ali su se statistički razlikovale od onih u grupi 3 koje su inokulirane s patogenim SCV2 i to i 21 i 49 DPI. Prosječne vrijednosti limfnih lezija na 49 DPI iz životinja koje su inokulirane sa SCV1, SCV2, SCV1-2 nisu međusobno bile statistički različite ali su se statistički razlikovale od prosječnih vrijednosti za gross lezije grupa 1 i 5.

Zatim su pregledane mikroskopske lezije.Rezultati su prikazani u tablici 10. Nikakve mikrolezije bilo kojeg DPI nisu bile detektirane niti u okviru kontrolne grupe 1 svinja niti u okviru svinja iz grupe 2 koje su inokulirane sa SCV1. Mikroskopske plućne lezije koje su okarakterizirane kao blaga peribronhijalna limfoplazmacitična i histocitična branhointersticijalna upala pluća, zapažene su kod 1 od osam svinja iz grupe inokuliranih sa SCV2. Kod životinja inokuliranih sa SCV1-2 i SCV2-1, u plućima nisu primjećene nikakve mikroskopske lezije. U timusima inokuliranih svinja nisu primjećene nikakve lezije. Blagi multifokalni limfoplazmacitični miokarditis zabilježen je kod 2 od 8 svinja u grupi koja je inokulirana sa SCV2. Tkivo srca iz životinja inokuliranih sa SCV1-2 i SCV2-1 nisu imala nikakve mikroskopske lezije. Blagi multifokalni limfoplazmacitični intersticijalni nefritis primjećen je kod 4 od 8 svinja iz grupe koja je inokulirana sa SCV2, i kod 2 od 7 svinja inokuliranih sa SCV1-2 i kod 1 od 8 svinja inokuliranih sa SCV2-1. Blago do umjereno limfoidno raspadanje i histocitična zamjena folikula primjećena je na mandulama kod 5 od 8 svinja, u slezeni 3 od 8 svinja i u limfnim čvorovima 8 od 8 svinja iz grupe koja je inokulirana sa SCV2. Kod životinja koje suinokulirane s himernim SCV1-2, primjećeno je blago limfoidno raspadanje i histocitična zamjena folikula u limfnim čvorovima kod 2 od 7 svinja ali isto nije bilo primjećeno niti u slezeni niti u mandulama. Nikakvo limfoidno raspadanje i histocitična zamjena folikula nisu primjećeni u limfnim čvorovima, slezeni ili mandulama životinja inokuliranih s recipročnim himernim SCV2-1. Blag limfoplazmacitični hepatitis primjećen je kod 7 od 8 svinja inokuliranih sa SCV2-1. Lezije u drugim tkivima bile su neprimjetne.

Mikroskopske lezije u plućima, jetri i limfnim čvorovima vrednovane su na osnovi objavljenog sustava za vrednovanje (P. G. Halbur et al., 1995, supra). Rezultati su prikazani u tablici 10 dalje u tekstu. Prosječne vrijednosti za lezije u limfnim čvorovima kod svinja iz grupe 4 koje su inokulirane s himernim SCV1-2 bile su slične onima iz grupa 1, 2 i 5 ali su se statistički razlikovale od onih iz grupe 3 koja je inokulirana s patogenim SCV2 i 21 i 49 DPI. Prosječne vrijednosti za mikroskopske lezije jetre iz grupe koja je inokulirana s himernim SCV1-2, 21 DPI statistički su se razlikovale od onih iz grupe 3 koja je inokulirana sa SCV2 ali su bile slične onima iz grupa 1, 2 i 5, 21 DPI. 49 DPI prosječne vrijednosti za mikroskopske lezije jetre životinja iz grupe 4 koje su inokulirane s himernim SCV1-2 statistički su se razlikovale od onih iz grupa svinja 1, 2, 3 i 5. Za druga tkiva i organe nije bilo prihvatljivog sustava za vrednovanje.

Tablica 9. Krupne lezije limfnih čvorova u kontrolnim i inokuliranim svinjama

[image]

Tablica 10. Distribucija histopatoloških lezija u različitim tkivima/organima iz kontrolnih i inokuliranih svinja

[image]

PRIMJER 18

Serologija

Krv je prikupljena iz svih svinja na -2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 DPI. Serumska antitijela na PRRSV korištena su u eseju pomoću Herd Check PRRSV ELISA (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Serumska antitijela na SPV detektirana su esejem inhibicije hemaglutinacije (HI) (H. S. Joo et al., "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)). Serumska antitijela na SCV2 detektirana su modificiranim indirektnim ELISA testom koji se bazira na rekombinantnom ORF2 kapsidnom proteinu iz SCV2 koji je opisan ovdje u tekstu (vidjeti isto tako P. Nawagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)).Serumska antitijela za SCV1 detektirana su esejem indirektne imunofluorescencije (IFE). PK-15 stanice inficirane sa SCV1 uzgajane su u LabTek komorama s osam bunarčića. Kada su PK-15 stanicedostigle oko 95-100% konfluentnosti, inficirane su stanice fiksirane s otopinom koja sadržava 80% aceton i 20% metanol na 4ºC tijekom 20 minuta. Fiksirane stanice oprane su jedanput s PBS. Sto mikrolitara uzorka seruma svinje koji je razrijeđen u PBS 1:10 dodano je u komore, i inkubirano tijekom 1 minute na 37ºC. Ove su stanice zatim tri puta isprane s PBS i inkubirane 45 minuta na 37ºC s kozjim anti-svinjskim sekundarnim antitijelima obilježenim s FITC. Slajdovi (komore) su zatim isprani tri puta s PBS, napunjeni s fluormont-G, stavljena su pokrovna stakla i pregledani su fluorescentnim mikroskopom za pozitivnu kontrolu. Stanice inficirane sa SCV1 inkubirane su s diluiranim SCV1 specifičnim monoklonalnim antitijelom (pokolon od Dr. G. M. Allan), i zatim inkubirane s kozjim anti-mišjim IgG obilježenim s FITC(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.). Za negativnu kontrolu, stanice inficirane sa SCV1 inkubirane su sa svinjskim serumom bez SCV1 i SCV2 antitijela, razrjeđenje je bilo 1:10, a zatim su inkubirane s kozjim anti-svinjskim IgG obilježenim s FITC (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.).

PRIMJER 19

DETEKCIJA PCR-OM

Da bi se u serumu inokuliranih svinja detektirali SCV1, SCV2, himerni SCV1-2 i recipročni himerni SCV2-1, uzorci seruma koji su prikupljeni u različitim DPI testirani su PCR-om. Viralna DNK izolirana je iz 100 μl svakoga uzorka seruma pomoću DNAzol reagensa na osnovu uputa proizvođača (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Izolirana DNK resuspendirana je u vodi bez DNaze, RNaze i proteinaze. Da bi se umnožili klon specifične genomske sekvence SCV1, SCV2, himernog SCV1-2 i recipročno himernog SCV2-1, dizajnirana su dva seta PCR prajmera za “nested” PCR (tablica 6 u tekstu iznad). Prvi set “nested” prajmera dizajniran je na osnovu objavljene SCV1 sekvence. Prajmeri Gen.PCV1 prikazan u SEQ ID NO:20 i Orf.PCV1 prikazan u SEQ ID NO:19 umnožavaju fragment od 400 baznih parova u prisutnosti SCV1 genoma. “Nested” prajmeri nested.Gen.PCV1 prikazan u SEQ ID NO:22 i nested.Orf.PCV1 prikazan u SEQ ID NO:21, umnožavaju fragment od 220 bp.

Da bi se detektirala SCV2 viremija, SCV2 par prajmera Gen.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:24 i Orf.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:23 umnožavaju fragment od 900 baznih parova u prisutnosti SCV2 genoma u prvoj rundi PCR-a. Prajmeri nested.Gen.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:26 i nested.Orf.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:25, umnožavaju fragment od 600 bp u “nested” pCR-u.

Da bi se detektirala himerna SCV1-2 viremija, prva runda PCR-a upotrebljavala se za SCV1 specifičan par prajmera Gen.PCV1 prikazan u SEQ ID NO:20 i SCV2-ORF2 specifični prajmer Orf.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:23 radi umnažanja himernog fragmenta od 580 baznih parova Za “nested” PCR, SCV1 specifični prajmer nested.Gen.PCV1 prikazan u SEQ ID NO:22 i SCV2-ORF2 specifičan prajmer nested.Orf.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:25, korišten je radi umnažanja himernog fragmenta od 370.

Da bi se detektirala recipročna himerna SCV2-1 viremija, prva runda PCR-a upotrebljavala se za SCV2 specifičan prajmer Gen.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:24 i SCV1-ORF2 specifični prajmer Orf.PCV1 prikazan u SEQ ID NO:19 radi umnažanja himernog fragmenta od 700 baznih parova Za “nested” PCR, SCV2 specifični prajmer nested.Gen.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:26 i SCV1-ORF2 specifičan prajmer nested.Orf.PCV1 prikazan u SEQ ID NO:21, korišten je radi umnažanja himernog fragmenta od 460. Svi parametri PCR reakcije bili su bitno isti, sastojali su se od 38 ciklusa denaturacije na 94ºC tijekom 1 minute, vezanje prajmera na 45ºC tijekom 1 minute, i ekstenzije na 72ºC tijekom 1.5 minute. Uzorci seruma iz svinja koje su bile negativna kontrola testirani su PCR-RFLP esejem za dijagnozu, koji može detektirati i razlikovati i SCV1 i SCV2 kao što je ranije opisano (M. Fenaux et al. , "Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2," J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503 (2000)).PCR proizvodi iz izabranih životinja u svakoj grupi bili su sekvencirani da bi se potvrdilo podrijetlo virusa kojim su inficirane svinje.

PRIMJER 20

Imunohistokemija (IHH )

IHH detekcija SCV2-specifičnog antigena izvedena je na tkivima limfnih čvorova koji su prikupljeni iz svih svinja kojima je napravljena nekropsija 21 i 49 DPI. Zečji poliklonalni antiserum protiv SCV2 uporabljen je za IHC, na osnovi općih procedura koje su opisane ranije (S. D. Sorden et al., "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue," J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999)).

Bazirano na IHH bojanju SCV2-specifičnog antigena, limfna tkiva iz kontrole koja nije inokulirana, svinje inokulirane sa SCV1 i SCV2 bile su negativne za SCV2 antigen. SCV2 antigen detektiran je u limfoidnim tkivima kod 7 od 8 životinja iz grupe inokulirane sa SCV2. SCV2 antigen isto je tako detektiran u limfnom tkivu kojeg 1 od 7 svinja iz grupe inokulirane sa SCV1-2.

U prethodnom tekstu, osiguran je detaljan opis određenih rezultata ovoga izuma u cilju ilustracije a ne ograničavanja. Treba shvatiti da je namjera bila da se u okviru ovoga izuma koji se patentira uključe i druge modifikacije, razgraničenja i ekvivalenti koji su bliski i očiti onima koji se bave znanošću i baziraju se na ovome izumu.

Claims (20)

1. Virusno cjepivo za zaštitu svinje od viralne infekcije ili postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) kojeg izaziva SCV2, naznačeno time što sadrži netoksični fizološki prihvatljiv nosač, jedan ili više adjuvanata i imunogenu količinu sastojka izabranog iz skupine koju čine (a) himerna molekula nukleinske kiseline svinjskog cirkovirusa (SCV1-2) koja posjeduje molekulu nukleinske kiseline koja kodira nepatogeni SCV1 koji ima imunogeni otvoreni okvir čitanja 2 (ORF2) gena patogenog SCV2 na mjestu ORF2 gena molekula nukleinske kiseline SCV1; (b) himerna molekula nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidnu sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO:2, njezin komplementarni lanac ili nukleotidnu sekvencu koja je barem 95% homologna sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 2; (c) plazmid ili viralni vektor koji sadrži himernu molekulu nukleinske kiseline svinjskog cirkovirusa (SCV1-2), komplementarni lanac ili nukleotidnu sekvencu koja je barem 95% homologna sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:2; i (d) himerni svinjski cirkovirus koji je napravljen od himerne molekule nukleinske kiseline prema (a). opcijski, imunogene količine barem jednog dodatnog svinjskog antigena.

2. Virusno cjepivo prema zahtjevu 1, naznačeno time što je cjepivo DNK cjepivo, živo cjepivo, modificirano živo cjepivo, inaktivirano cjepivo ili atenuirano cjepivo.

3. Virusno cjepivo prema zahtjevu 1, naznačeno time što je opcijski dodatni svinjski antigen virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (PPV) ili oba.

4. Virusno cjepivo prema zahtjevu 1, naznačeno time što je adjuvant aluminij hidroksid, imunostimulirajući kompleksi, ne-ionski blok polimer ili kopolimer, citokin, saponin, monofosforil lipid A, muramil dipeptid, aluminij kalij sulfat, toplotno labilni ili toplotno stabilni enterotoksin izoliran iz Escherichia coli, kolera toksin ili njegova B podjedinica, toksin difterije, toksin tetanusa, pertrusis toksin, Freundov nekompletni ili kompletni adjuvant ili njihova kombinacija.

5. Virusno cjepivo prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-4, naznačeno time što obuhvaća primjenu spomenutog virusnog cjepiva u zaštiti svinje protiv viralne infekcije ili postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) izazvanog sa SCV2.

6. Upotreba imunološki efikasne količine cjepiva prema patentnim zahtjevima 1-5 naznačena time što obuhvaća primjenu u postupku pripremanja preparata za zaštitu svinje protiv viralne infekcije ili postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) izazvanog sa SCV2.

7. Upotreba prema zahtjevu 6, naznačena time što se cjepivo daje u jednoj dozi.

8. Upotreba prema zahtjevu 6, naznačena time što se cjepivo daje parenteralno, intranazalno, intradermalno ili transdermalno.

9. Cjepivo, naznačeno time što sadrži imunogenu količinu ORF2 kapsidnog gena ili proteina kodiranog s SCV1-2 koji sadrži molekulu nukleinske kiseline koji kodira nepatogeni SCV1 koji sadrži imunogeni ORF2 gen patogenog SCV2 na mjestu ORF gena molekula nukleinske kiseline SCV1 za primjenu u zaštiti prasadi koja imaju SCV2 antitijela majke protiv SCV2 ili postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) izazvanog sa SCV2.

10. Upotreba cjepiva, naznačena time što sadrži imunogenu količinu ORF2 kapsidnog gena ili proteina kodiranog s SCV1-2 koji sadrži molekulu nukleinske kiseline koji kodira nepatogeni SCV1 koji sadrži imunogeni ORF2 gen patogenog SCV2 na mjestu ORF gena molekula nukleinske kiseline SCV1 u postupku pripremanja preparata za zaštitu prasadi koja imaju SCV2 antitijela majke protiv SCV2 ili postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) izazvanog sa SCV2.

11. Upotreba prema zahtjevu 10, naznačena time što cjepivo obuhvaća sastojak koji je izabran iz skupine koju čine: (a) himerna molekula nukleinske kiseline svinjskog cirkovirusa (SCV1-2) koja obuhvaća nukleinsku kiselinu koja kodira nepatogeni SCV1 koji sadrži imunogeni otvoreni okvir čitanja 2 (ORF2) gena patogenog SCV2 na mjestu ORF gena molekula nukleinske kiseline SCV1; (b) plazmid ili viralni vektor koji sadrži himernu molekulu nukleinske kiseline prema (a); (c) avirulentni, himerni cirkovirus tipa 1 koji kodira imunogeni SCV2 ORF2 protein (SCV1-2), gdje je ORF2 kapsidnog gena nepatogenog SCV1 zamijenjen s ORF2 kapsidnim genom patogenog SCV2;i (d) imunogeni SCV2 ORF2 protein kodiran sa himernom molekulom nukleinske kiseline pod (a).

12. Upotreba prema zahtjevu 10, naznačena time što cjepivo sadrži avirulentni himerni svinjski cirkovirus tipa 1 koji kodira imunogeni SCV2 ORF2 protein.

13. Upotreba prema zahtjevu 10, naznačena time što se cjepivo daje zajedno sa adjuvantom.

14. Upotreba prema zahtjevu 10, naznačena time što se cjepivo daje u jednoj dozi.

15. Upotreba prema zahtjevu 10, naznačena time sto se cjepivo daje parenteralno, intranazalno, intradermalno ili transdermalno.

16. Upotreba prema zahtjevu 11, naznačena time da je viralni vektor pod (b) bakulovirus koji eksprimira SCV2 ORF2 protein.

17. Upotreba prema zahtjevu 10, naznačena time što dalje obuhvaća davanje barem jednog dodatnog svinjskog antigena.

18. Upotreba prema zahtjevu 17, naznačen time što je barem jedan dodatni svinjski antigen infektivni svinjski agens.

19. Upotreba prema zahtjevu 17, naznačen time što je dodatni svinjski antigen svinjski virus reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (PPV) ili oba.

20. Upotreba prema zahtjevu 10, naznačena time sto je cjepivo DNK cjepivo, živo cjepivo, modificirano živo cjepivo, inaktivirano cjepivo ili atenuirano cjepivo.