TWI278517B - Methods and compositions for the differentiation of human preadipocytes into adipocytes - Google Patents

Description

1278517 五、發明說明α) 本發明屬於脂肪細胞生物學的領域，提供了促使人 前脂肪細胞分化為脂肪細胞方法與組成物。 在美國，每年有四到五百萬人民因非胰島素（nid⑽ )依賴型糖尿病而受苦。非胰島素依賴型糖尿病大多 以胰島素，但因胰島素必須每曰注射二到四次，且須妥盖 保存以免其活性喪失，令人感到使用上的不便。而其它& 用來處置非胰島素依賴型糖尿病的藥物尚包括

Troglitaz〇ne〈RezulinTM〉，一種過氧化體再育活化受器 伽瑪（PPARr)反應刺激物質，Gluc〇phageTM以及硫酿尿 素。但不幸地’有關這些藥物使用都有安全上的疑慮。因 此找出食全、有效、並能以口服方式作用的藥物來處置非 胰島素依賴型糖尿病，將可大幅提高為此一疾病所苦者之 生活口口貝自缺乏可複製的人類試管内細 礙了有關找尋這類物質的研究進展。 貝奴尔凡丨且 同時，大約有百分之二十到二十五的美國X民有肥 ^困擾，因而提高了非胰島素依賴型糖尿病、高血壓、心 $血管疾病產生的風險。-般說來，非胰島素依賴型糖尿 ^肥胖的形成時常和脂肪組織的缺陷及問題有所關聯， 並如内分泌細胞般地影響Ϊ是：；= 寅；定性的角色， 來說，專司製造-種脂肪細胞’戶=8::…18〉。舉例 蛋白iepUn，之。b基因即是分泌因子，減肥 人，自然，⑴⑷372:425^；2成〉衫響因的^源之—〈贊等 4以〉。因為減肥蛋01eptin

1278517 五、發明說明（2) 已被證實可降低肥胖及糖尿病老鼠的體重及血糖〈百利蒙 特等人，科學，（ 1 99 5 ) 269:540-543〉。 另外，一些脂肪細胞所獨有的酵素及受器被認為是滅 肥及降血糖藥物的重要研究目標。例如被發現主要分布在 人類脂肪組織的/3 3腎上腺受器之反應刺激物質〈阿諾等 人，新英格蘭醫學雜誌，（1995) 333:382-383〉，在老鼠

就有減肥及降血糖的特性，目前在人體實驗也進入二/三 期階段。這類包括troglitazone及ciglitazone之雙酮噻 唾類化合物（雙S同噻唑）已被證實可改善老鼠及人類的胰島 素感受度’進一步降低咼血糖和高血脂症狀（沙提爾等人， 糖尿病（ 1 996 ) 45; 166卜1 6 6 9;瑟南等人，美國生理雜諸 (1996)271:E742-E747;諾蘭等人，新英格蘭醫學雜士士 (1 994)331:1 1 88-1 1 93 )。在美國及日本，tr〇g^a:ne 〈ReZUlln”已獲准上市。包括⑽ ciglitazone之許多雙酮噻唑藥物都是一種轉錄因子核内 受器家族過氧化體再育活化受器珈瑪有效的活化劑〈湯多 諾滋等人，細胞（1 994)79;1 1 47-1 1 56;拉曼等人生物化 學雜諸，（ 1 995 ) 270:1 2953- 1 2955〉。過氧化體再育活化

受器珈瑪是脂肪細胞的主要的分化調控因子，以脂肪组 含量最為豐富。 、、 動物脂肪細胞的研究因3T3-L1鼠纖維母細胞支這類可 無限繁衍〈格林等人，細胞，（ 1 974) 1:1 ^ 16〉，且經適 當處理可分化成脂肪細胞的前脂肪細胞而加速。這些^胞 和分離出來的原生脂肪細胞有許多相同特點。但最&發表

1278517 五、發明說明（3) 的研究論文指出，關於影響胰島素於^ τ机性之因子的麥規，為 人類脂肪組織及脂肪細胞和老鼠細貽+ J ^ ^ + ^ 呢有明顯的不同。舉例 來說，腫瘤壞死因子-阿爾發在人_ π a如肪細胞和去鼠脂肪 細胞表現出不同的調控方式〈荷他半把 ^ ^ ^ ^ 究雜誌（ 1 995 ) 95:2409-241 5〉。因，士 5 ^ ^ ^ 此’對於人類脂肪細胞 和脂肪代謝之研究因缺乏可重複且4| 1 W政率地將前脂肪細胞 誘導分化為脂肪細胞之培養技術而辱& 2< , 又判延滯0 目前將分離出的人類前脂肪細胎八儿Μ ^ ^ ^ 呢分化的各種方法有百 分之五到八十不等的頻度。纟這些系統中，可以經由膠原 蛋白酶的處理’將人類前脂肪細胞的細胞組成由脂肪組織 (即所謂的血管基質小片’或SVF)分離出來〈羅德貝爾，生 物化學雜諸（ 1 967)242:5744-5750;羅德貝爾，酵素學方法 雜諸（1 974) 3 1 : 103-114〉°分離出的人類前脂肪細胞便可 經由各種化學處理驅使其分化為脂肪細胞。舉例來說，豪 納（Hauner，s)實驗室便曾指出，在含有〇· 2ηΜ三碘曱狀腺 素、0.5//Μ胰島素、0.1/ζΜ類皮質糖（可體頌、迪皮質 醇、盤固酮）的無血清培養基中，可引導人類前脂肪細胞 的分化。在這些情況下，五到七十個百分比的前脂肪細胞 可達到分化的目的。而細胞分化的百分比和所取得細胞之 來源的年齡有關。這些研究人員申請專利範圍經由各式生 化標記的定量，他們能夠達成在任何地方在二十天以内使 百分之五到七十的前脂肪細胞完全分化。與其類似發現的 還有歐羅西利（〇, Rahi 1 ly，s)實驗室所顯示（迪格拜等人， 糖尿病（ 1 998 ) 5:1 38-1 41 )，當前述無血清培養基加上像是

1278517 五、發明說明（4) BRL49653的TZA屬藥物在網膜前脂肪細胞可達成百分之二 十，而皮下及腎週前脂肪細胞則可達成百分之五十到八十 的分化比例。 “ ：:!更有效率地能在較短時間内將人類前脂肪細胞分 匕j月曰：細胞’並能擁有較高之一慣性的方法將對肥胖及 T尿病的研究有所助益。本發明提供了方法及組成物，可 在不論是二度空間培養基或二度空 一.hh $ ^ L f督丞a 一度工間生物適性基質，達成 仆 刀之九十到九十五之前脂肪細胞到脂肪細胞之分 化0 本發明提供了方法及組成物使由护 的前p肪& μ + #孙 風物便由月曰肪組織所分離出來 的别月曰肪細胞達成一貫且定量的分化為脂肪 肪細胞具有的生化、遺傳、生理特性都和所分 ^ 脂肪細胞中所觀察到的相類似。這項發明所方ς 有，培養分離出的人類前脂肪細胞、以最少二方八^ 一 萬五千個細胞的濃度塗佈於含有葡萄糖、異丁其二# 色精或forskolin之類的環狀單磷酸鳥糞嗓、土土、κ化 皮質糖或類皮質糖之類似物、胰島素或胰7 V 、、類 過氧化體再育活化受器孙7瑪反應刺激物或〕員々物 反應刺激物之培養基。行之以有或益二@生素A酸X受器 質培養基。這項發明的組成物= 生物適性基 化之人類脂肪細胞以及轉殖脂肪細胞。*明的方法所分 同時所提之發明亦提供測定化合物影趣 、， 胞分化為脂肪細胞能力的方法，測定化合^ ^類前脂肪細 氧化體再育活化受器珈瑪拮抗物、類皮^紙是否具有像過 貝糖、類皮質糖類

第9頁 1278517 五、發明說明（7) _ b將前述細胞於攝氏三十七 到細胞達百分之九十五到一百融^ ·σ養四到四十八小時直 c將前述前脂肪細胞培養基 萄糠、百分之1到15胎牛血清、—由含有1到4.5g/l葡 物、^⑽到丨胰島素或等量—^狀鳥糞嗓吟誘導 1 // Μ之類皮質糖及可有效表 素類似物、1 6ηΜ到

濃度的過氧化體再育活細胞分化之-定 酸X受器&應刺激物細胞谇養馬反應弟I"敫物或維生素A …述分化養二到四天； 養基含有：1到4. 5g/l葡葙楂 θ肪細胞培養基，此培 胰島素或等量之胰胎牛血清、1到 吟誘導物，亦不包含；以效量之環狀鳥糞嗓 定濃度的過氧化體再育激：二“旨肪細胞分化之-Α酸X受器反應刺激Ξ化…瑪反應刺激物或維生素 f將前述細胞在攝 少三到四天以前述脂肪 其中$亥如月曰肪細胞 肪細胞培養基和前述細 酸驗值。

氏二十七培養一到二週，並每隔最 細胞培養基再银養一次此細胞； 培養基、該細胞分化培養基、該脂 胞之接觸必須保持PH7到7· 6左右的 J所=二^肪細胞是指可由所備之脂肪組織的血管基質 :片分並具分化為脂肪細胞之潛力者而言。但在 此項發明中所使用的前脂肪細胞，卻可能以本領域以熟知

第12頁 j 1278517 _______________ 五、發明說明（8) -- 何技術分離而來。但由所備之脂肪組織的血管基質小 刀離出前脂肪細胞是較被偏好的一種方式。 ，領域熟知的各種細胞培養基在本發明的方法中被使 牛例來况，這類培養基〈全部都不含血清或已將血清 舌掉〉包括最低需求依格氏培養基Minimum Essential u^/UmEagle，ADC一1αΡΜ(不含牛血清蛋白），F10(漢姆 ，F12(漢姆HAM)，DDCCM2, RPMI 1 64 0，BGJ 培養基（包 舌有或/又有經費頓—捷克遜Fitt〇n—Jacks〇n修飾），基礎依 格氏培養基Basal Medium Eagle(BME-上另加入厄爾氏 Ear 1 s鹽基），多貝科氏修飾依格氏培養基⑶，s Modified Eagle (DMEM-不含血清），Yamane，IMEM-2〇， 格拉斯哥氏修飾依格氏培養基Glasg〇w M〇dificati〇n

Eagle (GMEM)，利玻維滋Leib〇vitz L -15培養基，賣高氏

MaCoy’s 5A培養基，培養基鼢99(培養基M199E 一加入厄爾 氏Earl’ s鹽基），培養基M199(培養基M199H—加入漢克氏 Hank s鹽基），最低需求依格氏培養基（培養基MEM —E_加入 厄爾氏Earl’ s鹽基），最低需求依格氏培養基（培養基 MEM-H-加入漢克氏Hank’s鹽基）及最低需求依格氏培養基 (培養基MEM-NAA加入非必須氨基酸），尚有一些其它的培養 基，包括培養基199，CMRL 1415，CMRL 1 969， CMRL 1066， NCTC 135， MB 75261， MAB8713， CM145，

Williams G,紐曼及泰特Neuman &Tytel，黑骨雞 Higuchi， MCDB301， MCDB202， MCDB501， MCDB401，MCDB41 1，MDBC 153·其中多貝科氏修飾依格氏培

第13頁 1278517 五、發明說明（9) 養基/漢姆氏F-10營養拉

u ^ ,1ΠβΟΛ呂臀培養液（1:1 v/v)(見漢姆，實驗細 胞研究，（1963)29.Ric；TO /1 c on 1 λ · 15;墨頓Morton·試管内 In Vitro, ( 1 9 70 ) 6:89- 1 08;多目# μ … 貝科，專人，病毒學Virology

( 1 9 59 ) 8:39 6;史密斯 /毋子, 〇gY 斗、r添成边A甘, 4人，病毒學，（I 960 ) 1 2: 1 85 ) 或厄爾氏支口養基（厄爾l .、丄广 _harle，1 943 JNCI 4:1 6 5- 1 69 )是比 較被偏好的。廷4b盥复，π ^ W 4 6一 一具匕可利用的無血清營養培養基以分 別衍生自吳國紐約格縫I Γ τ ^ a a从广士、甘、ώ 1島GIBC0公司及以色列BetHaEmek 祝八η斬菸轩祕主 上有關這些培養基的資訊在學院出 r , 、— 干之方法期刊（Methods of

Enzymology)弟五十八卹锋 v °丨4弟六十二到七十二頁，適廢B 傑可貝及愛拉H·帕斯畀邮祕 J卞貝風廉β· 埼丹所編之、、細胞培養〃被摘要出 來0 另外還有一些福人私 H Μ :。物有旎被包括或加入培養基。舉 a义0 士、士 4 鏈儻支素等抗生素及f u n g i ζ ο n e在 此發明中被加入培養其θ δ 螯基疋有所助益的。另外，在培養基中 加入約0 · 5到1 0 0 “ μ哇舲I ， 你口臀签τ $)IRn u Φ ^ . 物素，如果生物素的濃度能在約10 到6 0 // Μ更好，但生物去沾、、曲 、，QQ μ丄仏主曲 素的/辰度能在約30到35 //Μ最好，而 以3 3 // Μ生物素濃度最佳。焱 _ , , i： ^11 π取佳為對促進細胞生長有所助益， 須加入約0 · 5到1 〇 〇 “ μ迻酿 μ苗從加乂純U乏馱如果泛酸的濃度能在約5到5 0 μ ^ ^ ^ ^ ^ /辰度此在約1 5到25 // Μ最好，而以1 7 // Μ泛酸濃度最佳。 ^ 培養基使用時透過4@ i如 灰丄--儿n人生物緩衝劑的加入或調節培養箱九 氣中"一氧化石反的含量使酸給碎欲v从从丄 ^ , ,, ^ Η 便自夂鹼度務必維持在大約7到7· 6。所 明生物緩衝劑疋一種适人、明紗i ϋ # 裡吧口弱§文及其共價鹼之液體。當微量

1278517 _________—------ 五、發明說明（1〇) 酸或鹼的加入時，可抵抗酸鹼度的變化。典型的生物緩衝 劑包括，但不侷限於，磷酸和碳酸緩衝劑系統。培養基的 酸鹼度最好能維持在pH7. 2到7· 5之間。如果能在7· 3到7. 5之間更好，最好能維持在P Η 7 · 4左右。另外，培養基的酸 鹼度以大約1 5mM碳酸氫鈉及大約1 5mM HEPES緩衝在ρΗ7. 3 到7. 5之間，最好能將ΡΗ值控制在7· 4左右。 所偏好使用的胚胎血清屬於哺乳類動物胚胎血清，又 以胎牛血清為最佳。胎牛血清（FBS)可以大約1%到15%的濃 度加入細胞培養基，！ ％到丨〇 %更好，但以3 %到丨〇 %最佳。最 〆3 /。胎牛血π的濃度對確保細胞牢固的於 上是必須的。 〜口贷孤 可提票呤誘！物？是指在有效濃度下 度最少2%，如果At R曰細胞内缞狀單磷酸鳥糞嘌呤的濃 2 0%為最佳。測」b °更好，最少1 0%為優，如果能達到 已為本領域所熟里知田。I内裱狀單磷酸鳥糞嘌呤含量的方法 物包括異丁基甲、，較偏好的環狀單磷酸鳥糞嘌呤誘導 糞嗓呤誘導物的$二=色精及F〇rskolin。環狀單填酸鳥 花色精，異丁基=龙，使用〇· 2到0. 5mM異丁基甲基黃 胰島素是指利^ 色精如果能在〇· 5到〇· 5mM更好。 之哺乳類胰島ί明的方法以及培養基自然發生合 胰島素為優。等量以人類自然發生合成或重组之 胞同等級之胰島素刺激人類血Λ上二達到和ΐ()()ηΜ到1 這類胰島物類似物不一定在

固定量化合物官.基.負細胞分化成脂肪細 第15頁 1278517 五、發明說明（U) 、σ構上和姨島素有關聯， 者。較偏好之Μ I I ^，且可能為自然發生合成或重組 島素生長因3 似物為類胰島素生長因子I錢 利用各種本領域已為脂肪細胞的 為佳（袼林，supraf。 技術來定量。其中以Oil Red 0 脂肪細：：：：：f，以本發明之培養基與方法誘導前 關功能性衍生合物:相

合生理濃度= = =: 為大約咖到1…大約10_到1^更 好”大約1 為最佳之類皮質糖濃度。 旦可二f"化，再月活化叉裔珈瑪反應刺激物是指相對於背 :口 /匕過氧化體再育活化受器珈瑪最少百分之十的化合 物。過氧化體再育活化受器伽瑪活化程度定量可依拉曼 L^hmanri/，人所描述的方法來定量。較偏好的過氧化體再 月活化冗裔珈瑪反應刺激物為雙酮噻唑的衍生物或相關之 類似物。而BRL 49653，pi〇giitiZQne， tr〇gli1;azQne，

darglitazone， ciglitazone, AD 5075， AD 5080， AD 4742，AD 4743為更佳之過氧化體再育活化受器珈瑪反應 刺激物。最受喜雯的過氧化體再育活化受器珈瑪反應刺激 物是 BRL 49653 或 troglitazone。使用 BRL 49653 或 troglitazone 的濃度是大約〇· 5 到1 。BRL 49653 或 troglitazone的濃度大約〇·8到1 更好，最被喜愛的濃 度則是1 // Μ。

第16頁 1278517

五、發明說明（12) 維生素A酸X受器反應刺激物是指相對於背景可活化維 生素A酸X受器最少百分之十的化合物。維生素a酸X受哭 的活化可以海曼等人（ 1 992 Cell 6 8:397-40 6 )所描述之m方 法來決定。所偏好使用的維生素A酸X受器反應刺激物是 LG1 069或順位-維生素a酸。LG1 06 9或順位-維生素a酸較佳 的使用濃度是1 0 0nM到1 0 // Μ，最佳的使用濃度則是大約1 // Μ 〇

a有效刺激人類前脂肪細胞分化〃是指最少具有如同 本發明方法的一般之效應能促進人類前脂肪細胞分化為脂 肪細胞’就像0.5到1 //Μ之BRL 49 6 53。人類前脂肪細胞^ 化為脂肪細胞之百分比可以本領域所熟知的各種方法來定 量。有一種較好的方法是經由〇i 1 Red 〇染色來定量。 各種來源的人類脂肪組織須經處理以生產可製造脂肪 細胞的前脂肪細胞。脂肪組織可由皮下及腎週取得，但以 皮下脂肪組織較優。抽脂手術及P e n n i C U 1 e c t 〇 m y可提供皮 下脂肪組織。

前脂肪細胞可經由本領域已知的各種方法分離而來。 以羅德貝爾Rodbell(1974)， supra由血管基質小片分離前 脂肪細胞的方法為佳。 當初步將前脂肪細胞塗佈在前脂肪細胞培養基（步驟 a )，其細胞密度必須在每平方公分二萬五千到四萬個之 譜。若能使細胞密度在每平方公分二萬五千到三萬個更 好。低密度刖脂肪細胞塗佈會使得細胞分化的比率下降。 冨母平方公分一萬五千個前脂肪細胞被塗佈，隔一晚的培

第17頁 1278517 ------—-----------— —_____ 五、發明説明（13) 養即 < 長之融合。但如果在此時間點並未長之融合，可在 更換為分化培養基之前再培養二十四小時。培養時間長於 此，即導致較低分化百分比。 一旦暴露於分化培養基（步驟c )，它們便很容易 在培養基完全移除或快速地加入時由培養孤剝落。當更換 分化培養基或脂肪細胞培養基時，必須小心保持一層培養 基覆蓋於細胞上（以9 6袼培養皿來說，大約每格3 〇到5 〇 m j )

加入分化培養基之後大約四天，脂肪細胞的特點油滴 即會開始形成。但根據病患間的差異性及前脂肪細胞的分 離來源會有一些差異。一般說來，根據前述狀況，最少百 分之九十，典型是百分之九十到九十五的細胞會開始分 化0

本發明之另一 提升前脂肪細胞分 肪細胞分化為脂肪 處置上佔有重要的 糖、過氧化體再育 葡萄糖的移除及支 素及RezulinTM (過 在美國已獲准用來 化或脂肪合成作用 助益。這些化合物 激物、維生素A酸X 更長运的目 化為脂肪細 細胞的化合 地位。舉例 活化受器珈 配前脂肪細 氧化體再育 處置糖尿病 的化合物也 包括過氧化 受器反應刺 胞的方 物，已 來說， 瑪活化 胞到脂 活化受 。而可 許對處 體再育 激物和 法。許 被證明 像是胰 劑這類 肪細月包 為孙7瑪 影響人 置糖尿 活化受 騰島素 多可提升前脂 在對糖尿病的 島素、類皮質 化合物能影響 的分化。胰島 活化劑）目前 類脂肪細胞分 病及肥胖有所 器珈瑪反應刺 類似物。

1278517 五、發明說明（14) 於是，-個用以決定化合物影響前脂肪細胞 肪細胞能力的方法包括： π %為$曰 ，將分離出來的人類前脂肪細胞，以大約每 八八 ，萬五千到二萬個的濃度，塗佈在包含或外加工到：刀 葡萄糖及0一到15%胚胎血清的細胞培養基之前脂肪典養美. b將則述細胞以攝氏三十七度培養四到四：二’ 直到細胞呈百分之九十五到一百之融人. 守’ c將前述前脂肪細胞培養基換成【含或 4.5g/i葡萄糖、HU5%胚胎血清、一種環狀 丨 吟誘導物、ΙΟΟηΜ到1 “月夷島素或等量之鳥糞。示 蘭到类貝皮質糖、達可有效刺激人類 頁 A酸X受器反應刺激物及具適當載體之前述化》、口 ： 體的分化培養基； A /、有載 d將前述細胞以攝氏三十七度培養二到四天； e將前述分化培養基取代以包含或外加丨到夂’ 萄糖、0到1 5%胚胎血清、丨〇〇nM到j # M胰島素戈等旦^ 島素類似物、16nM到1/zM類皮質糖之脂肪細胞培|基夷 在此，所謂脂肪細胞培養基既不包含有效劑量之 =糞”誘導物，亦不包含可有效刺激人類前脂肪細胞* 刀化的過氧化體再育活化受器珈瑪反應刺激物或 酸X受器反應刺激物； 、 一 f將前述細胞於約37 °C下培養一到二週，並最少 二到四天以前述脂肪培養基重新餵養一次； 第19頁 1278517

g決定步驟f在步驟C中 培養基而得之已分化細胞的 h決定步驟f在步驟c中 養基而得之已分化細胞的數 I比較步驟g及步驟h中 其中该兩脂肪細胞培養 胞培養基和前述細胞之接觸 度0 ’飯以含有前述化合物的分化 數目或百分比； ’银以只含該載體的該分化培 目或百分比；以及 已分化細胞數目或百分比； 基、該分化培養基、該脂肪細 ’皆須維持在PH7到7· 6之酸檢 的旦二：化：：都可被测試對前脂肪細胞分化為脂肪細皰 又态珈瑪及/或維生素Α酸)（受器 比方說，雙酮噻唑。、香^ # μ 為之反應刺激物， ^ ^ ρ ί Γ !適虽載體可被當作這類受測試化合物 _ Phan„ 在眷明頓製藥科學 到。適當載體的例子包：:a;=Ces最近之出版中找 溶液及各種的水性緩衝液，但；限；於：甲基咲喃或酒精 率。這類$:6^知的方法可被用來決定細胞分化的比 千坆頰方法的例子包括一此蟀彳士目士 特性’像是油脂沉殿及脂肪：胞之特上的 核酸。較偏好的方式是d異質及轉錄核糖 染色。 休固疋細胞後以Oi 1 Red 〇 在其它實施例方面 成為過氧化體再育 ’本發明提供決定 具有 所以 、、’本，，提供決定一種化合物是否 活化文器珈瑪拮抗劑能力的方法。 種化σ物是否具有成為過氧化體 1278517 五、發明說明（16) 再育活化受器枷瑪拮抗劑能力的方法。包括· a將分離出來的人類前脂肪細胞，以大約公分 、 辰度塗佈在包含或外加1到4 5g/ 1 fe萄糖及0到1 5%胚胎血清的細胞 b將前述細胞以攝氏：十：声m脂肪语養公 辦氏一卞七度培養四到四十八小時， 直到細胞呈百分之九十五到一百之融人· C將前述前脂肪細胞培養基換含或外加丨到 .5g/ 1葡萄糖、1到1 5%胚胎血清、一種環狀單磷酸鳥糞嘌 呤誘導物、ΙΟΟηΜ到1 胰島素或等量之胰島素類似物、

到類皮質糖、達最大可有效刺激人類前脂肪細 胞分化濃度一半的過氧化體再育活化受器珈瑪反應刺激物 及具適當載體之前述化合物或只有載體的分化培養基； d將前述細胞以攝氏三十七度培養二到四天；

e將剞述为化培養基取代以包含或外加1到* 5 g / 1葡 萄糖、0到15%胚胎血清、l〇〇nSM,u 胰島素或等量之胰 島素類似物、1 6nM到1 // Μ類皮質糖之脂肪細胞培養基， 在此，所明月曰肪細胞培養基既不包含有效劑量之環狀單構 ，鳥糞嘌呤誘導物，亦不包含可有效刺激人類前脂肪細胞 刀化的過氧化體再育活化受器珈瑪反應刺激物或維生素A 酉变x受器反應刺激物； μ

f將如述細胞於約3 7 C下培養大約一週，並最少以步 驟6中供應的培養基重新餵養一次； V 、g決定步驟f在步驟C中，餵以含有前述化合物的分化 培養基而得之已分化細胞的數目或百分比；

第21頁 1278517 五、發明說明（Π) h Α定在步驟c中，餵以只含該載體的分化培養 基而得之已为化細胞的數目或百分比；以及 I比較步驟及步驟h中已分化細胞數目或百分比； 在此所述之前脂肪細胞培養基、該分化培 肪細胞培養基和前述細胞之接觸，皆須維持在抑广到7 :: 駿驗度。 · 還有-些不同的過氧化體再育活化受 物可被使用，但較偏好的過氧化體再言：夂應刺 刺激物是雙酮噻唑群筚物。6 1文态珈瑪反應 τ永初。季父偏好的過氣介驶古、◊ 器珈瑪反應刺激物是i到⑽㈣飢49653 '二叉 是10到ΙΟΟηΜ，最好是大約在5〇nM。 車又適虽的派度 本發明尚提供-些實施例，來 類皮質糖或類皮質糖類似物的能力。包括：物疋否具有如 a將分離出來的人類前脂肪大 二萬五千到四萬個的遭度 =約母平方公分 葡萄糖的已知成分細胞培養基·匕3或外加1到4. 5g/l b將前述細胞以攝氏三$七 直到細胞呈百分之九十五四到二十四小時’ 4.5g/l葡萄糖、一種 基換成包含或外加1到 到1 "M胰島素或等量之胰:糞嘌呤誘導物、1〇〇nM 前脂肪細胞分化濃度的過化、二，、達可有效刺激人頰 激物或維生素AW受器，活化受器珈瑪反應刺 合物或只有載體的條件培^基激物及具適當載體之前述化 1278517 五、發明說明（18) ^ d將前述細胞以攝氏三十七度培養二到四天； e將前述分化培養基取代以胃包含或外力nl到4.5g/l葡 萄糖、1 Ο Ο nM到1 # Μ胰島素或專虽之胰島素類似物及具適 當載體之前述化合物或只有載體之脂肪細皰培養基； f將前述細胞於約37 °C下培養一到二週，並最少每隔 三到四天以前述脂肪培養基重新餵養—次； g決定步驟f在步驟c中，餵以含有前述化合物的分化 培養基而得之已分化細胞的數目或百分比； h決定步驟f在步驟c中，餵以只含前述該載體的該分 化培養基而得之已分化細胞的數目或百分比；以及 I比較步驟g及步驟h中已分化細胞數目或百分比； 在此所述之前脂肪細胞培養基、該分化培養基、該脂 肪細胞培養基和前述細胞之接觸，皆須維持在PH7到7· 6之 酸驗度。 本發明另外還提供一項實施例’用以決定一個化合物 是否具有如同胰島素類似物般的功能。包括： a將分離出來的人類前脂肪細胞，β大約每平方公分 二萬五千到三萬個的濃度’塗佈在包含或外加1到4. Sg/f 葡萄糖及0到1 5%胚胎血清的細胞培養基之前脂肪培養基· b將前述細胞以攝氏三十七度培養四到=十八小日^ 直到細胞呈百分之九十五到一百之融合； c將前述前脂肪細胞培養基換成包含咬外加1到 心^/丨葡萄糖、1到15%胚胎血清、一種環;^單^酸鳥 吟誘導物、16nM到类員皮質糖、達可有效刺激人‘

1278517 五、發明說明（19) ί ί化濃度的過氧化體再育活化受器珈瑪反應刺激 ，、 ’、A IX文器反應刺激物及具適當裁體之前述化合 物或只有載體的分化培養基； d將^述細胞以攝氏三十七度培養二到四天； e將础述分化培養基取代以包含或外加1到4. 5 g / 1葡 萄糖、0一到15%胚胎血清、16nM到1 類皮質糖及呈適當 載體之前述化合物或只有載體的之脂肪細胞培養基，在 此，所謂脂肪細胞培養基尤☆人古崎如〇 _ ^ ^ ^ ^ ^ 。箐丞既不包含有效劑ΐ之環狀單磷酸

化的過氧化體再育活化受；W脂肪細胞分 平 巧1G又為珈瑪反應刺激物或維生辛A酸X 受器反應刺激物； \ μ i系Λ f將前=胞於約37t下培養一到二週，並最少每隔 三到四天以刖述脂肪培養基重新餵養一次； g ”步：f八在步驟C中，餵以含有前述化合物的分化 培養基而付之已为化細胞的數目或百分比· h決定=在步驟C中，餵以只含前述載體的分化培 養基而得之已刀化細胞的數目或百分比；以及 I比較步驟g及步驟h中已分化細胞數目或百八比. 在此ϊΐίίΞΓΓ包培養基、該分化培養i及該脂 肪細胞培養基和别述細胞之接觸，皆須維持在pH7到76之 酸驗度。 一些研究已提出建議，某些化合物 的脂肪分解作[並可利用來處方肥：誘：：：細胞内 依本發明之方法为化而來的脂肪細胞鮮正腎上腺素、、異丙

第24頁 1278517 五、發明說明（20) 腎上腺素（一種貝他-腎細胞受器之反應刺激物）這類溶脂 劑有反應。當以這類溶脂化合物刺激時，脂肪細胞内的三 甘油脂即轉變為甘油及脂肪酸。而甘油即接著由細胞内被 釋放到培養基中。測量條件培養基中之甘油含量，可視為 脂肪細胞對溶脂劑反應的指標。因此，本發明中的成熟已 分化脂肪細胞可用來辨認及研究可影響脂肪分解作用的化 s物。而化合物可刺激人類脂肪細胞内脂肪分解作用的能 力也可藉由本系統來研究。當脂肪細胞已完整分化，化合 物可被加入此細胞系統，經由甘油之生成以測試其刺激脂 肪刀解^作用的能力。而甘油的濃度可以標準方法加以測得 (巴漢等人，分析家Analyst，（ 1 972 ) 97:1 42 )。 t有將外生的去氧核糖核酸送入所培養脂肪細胞之能 出月匕肪f :究人貝得以分析脂肪細胞内蛋白質的生產、找 心現：：If選基因之啟動子區域的特性，並辨識出可影 系統前，無法獲得豐富的大化二物。在尚未發明此快速 胞族群阻礙了以分析基“(現大於百:之九十)的已分化細 轉殖。不同比例之舒炉^ f為目的之外生去氧核糖核酸 種細胞型態同時存：：田胞與脂肪細胞的混☆，使得兩 純化之脂肪細胞族群的：礙：f因調控的分析。但相對 此，還有另：測現變得可行 分化而來的脂肪細胞的方 x月提供轉殖由前脂肪細胞 域中所熟知的藥劑，# B ^ 各種轉殖的方法便使用此領 像疋磷酸約（威袼勒等人，細胞，

1278517 五、發明說明（21) (1977) 11:223-231) 、lipofectin(弗格納等人，美國國 家科學院Proc Natl Acad Sci USA，（ 1 987 ) 87:7413 - 7417)或Effectene。另一方面，像是腺病毒這類 可感染前脂肪細胞的病毒顆粒便可用類似之前已被發表的 方法（貝克等人，細胞生物方法，（1994) 43:161-189;木 尼爾-得蒙特等人，歐洲生化雜誌，（1 996 ) 237:66〇一667 ) 將去氧核糖核酸導入基質細胞。然後如同前面範例一所陳 述些細胞便經由處理使它們分化為脂肪細胞。加入抗 4選標記可增加具有導入遺傳物質的細胞，所得到具 ^入遺傳物質之脂肪細胞便可用於研究上面所說之基因 調控。 糊胞具 減肥蛋 月旨肪細 它的例 鼠蛋白 分別對 之影響 辨識這 一實施 分泌的 前脂肪 〜方面 由脂肪 份是經由 幾乎只由 平衡。其 長因子刺 月太全部都 能有顯著 得系統性 因此還有 肪細胞所 法分餾由 在另 組織站之 有内分泌腺體的功能已被証實，其中一部 白leptin的發現。減肥蛋白leptin是一種 胞分泌的蛋白質，能調節哺乳類動物能量 子還有脂肪細胞具有分泌血管内皮細胞生 質及血管緊張素之能力。這些蛋白質/胜 傷口癒合、血管生成、肥胖、心臟血管功 。發明簡便之人類脂肪細胞培養系統，使 些細胞所分泌的蛋白質/胜肽得以進行。 例便是，本發明提供了辨識培養之人類脂 蛋白質/胜肽的方法，包含以本發明的方 細胞分化而成的脂肪細胞的條件培養基。 ，本赉明^^供方法以準備含有可生產脂肪 組織付到的基質細胞的三度空間生物材料

1278517 五、發明說明（22) 以提供植入受植者。包括： a將分離出來的人類前脂肪細胞， 二萬五千到三萬個的濃度，塗佈 =、力母千方公分 葡萄糖及〇到15%胚胎血清的細胞培養基之二二1至2.^/1 b將前述細胞以約攝氏三十七 ：：；二 時，直到細胞呈百分之九十五到—百之融/四十八小 C將前述前脂肪細胞培養基換成包含i外 4.5g/l葡萄糖、1到15%胚胎血清、一到 呤誘導物、ΙΟΟηΜ到1 //M胰島素或等量^早%酸鳥翼嗓 16nM到1 "类員皮質糖及達可有效刺激人類前月:Π : 化濃度的過氧化體再育活化受器伽瑪 曰或田。刀 Α酸X受器反應刺激物； 〇 4、、赛生素 d將前述細胞以約攝氏三十七度培養二到四天； e將步驟d之細胞導入三度空間具有空隙的生物適性 基質，f此所指之脂肪細胞培養基為包含或外加i到 4. 5g/l葡萄糖、〇到15%胚胎血清、1〇〇nM到j # M胰 等量之胰島素類似物、16nMa1/zM類皮質糖的細胞培^ 基，在此’所謂脂肪細胞培養基既不包含有效劑量σ产贴 單碌酸鳥翼嗓吟誘導物’亦不包含可有效刺激人類前S 細胞分化的過氧化體再育活化受器珈瑪反應刺激 ^ 素Α酸X受器反應刺激物； 4、唯生 f將前述細胞於約37。(：培養一到二週，並最少 到四天以前述脂肪培養基重新餵養—次； ㈣一 在此所述之前脂肪細胞培養基、該分化培養基、及該 第27頁 1278517 五、發明說明（23) 培養基和前述細胞之接觸，皆須維持在PH?到7.6 I駿驗度。 本發明所使用的生物基質特別適用於脂肪组織移植， 常Π?;圭肪組織在人類及其它哺乳動物的正 吊發月及生理上扮演重要及監督的角色。 的脂肪存在。最常見的是分布於皮下(皮下有脂夕不；2 (網膜脂肪）、及生殖器官周圍彳生& & ^ 組織。還有較少見於成人在二；：:，的白色脂肪 ^ ^ 在头' 兄日可期扮演重要產熱角色 勺铩色脂肪組織。這類脂肪分布在肩胛骨 (interscapular)、重要血管及心臟附近 及腎臟上方(suprarenal) 二= 热，她們所製造乳腺脂肪組織的量會增加^ 二乳時期為提供能量的來源。的•，生育能== =個體内的脂肪組織有密切的關聯。女人和男 期與-種衍生自脂肪組織的荷爾蒙減肥蛋白男 及釋放還有體脂肪的組成有宓 p 1 η的生產 則在體内扮演架構性的功能：舉‘ ：★兒而：二::脂肪組織 脂肪塾即提供了抵抗走路時撞擊的能；。失1 =機械性 將導致漸肌肉骨路傷害及移動能力=肪塾 肥胖疋目别影響美國及一此 卡 之生活型態的國家之所有年齡層卡=及久 有為數不少的人們因缺乏脂肪組織的情況或 ，，也 肪代謝障礙，不管是局部或全身# h ::苦。脂 命的嚴重例子。這種疾病在+疋有可此威脅到生 展病在女人比較常見，其特徵是皮下 第28頁 1278517 五、發明說明（24) 脂肪組織之喪失。它的結果是無以銘狀的。對此種疾病的 性質仍少有了解。在某些家族因體染色體特徵之證據，可 發現其具有強烈的遺傳成分（彼得斯JM，巴恩斯R，班奈 特L，吉得墨WM，破可am，卡格A國家遺傳學 1 8:292-295，1 998;捷克森SN，濱科奈j，巴吉歐塔A，薇 兒CD，、毫利特TA，麥可納利pG，可羅R，強森A，川 貝RC美國人類遺傳學雜誌63:53 4一54〇， 1 9 98;卡格a， 威=森R，巴恩斯R，阿李歐格魯E，贊第Z，格拉肯F， 可蓋克N，歐羅西利S，泰勒SI，派得爾SB，柏可j，美 國内分泌代謝臨床雜誌84: 339〇_3 394, 1 999 )。一些病例 是自體免疫疾病，因為病患表現出全身性一的免疫

另外還有一些例子則是醫療的結果。接受HUM ,qQnx Μ J，庫柏 DA Lancet 351 ·· 1 881 -1 883 。脂肪代謝障礙不只是愛美的缺陷。為此疾 3’ 的病心、逷表現出複雜的代謝失控，、 血中胰島素含量、及對胰島辛有尸低血脂症、低 人，果國人類遺傳學雜誌63:534_54〇 19 f克4 患對胰島素的反應不良，它們 尿因為造類病 無法以傳統療法控制 &病及口有的併發症並 酮噻唑，提供τ、厶 ’幵5出的口服抗糖尿病藥物雙 土'&供了治療上的一個選擇，但 ：初雙 ❶2近日被提出的脂肪代謝障 盔八它處 病的處方指引出一個方向。产一動物只驗杈式為這類疾 1278517

二=基因轉殖老鼠已被創造出來（席夢尤拉〗，輪黑 $林J A，依克謨多§，巴西馬可夫γ，格得史丁 =朗MS基因發展^:”“一^“^“丨墨依德拉】，，本 ，奥利福M，克拉勒夫D，佳罘利勒發〇，馬可氏〜、、、/木 $依爾B，費金寶l，李E，歐亞麻T，愛克號 ，曼 M1，文森 C 1 2:3 1 68-3 1 8 1 1 998 )。這兩種實驗，= F伴Ik有糖尿病、胰島素上升大於五十倍以上、以及血、、主 中三甘油脂及脂肪酸的含量亦上升。這類動物證明缺二 肪將導致糖尿病的症狀。初步的研究已指出，這類老曰 經由相容的異體脂肪組織移植而成功地治療。暗示了受^Γ 似於此情況所苦的人類病患亦可受益於類似的處置。又目 另外人類還有一些缺乏或失去脂肪組織但不影響生A 的情形。但這些失常的影響是不可小看的，為其所ς的I 們在生活品質上將受到顯著的衝擊。‘比方說，青春期臉部 粉刺會造成皮下脂肪溶失，而使得外貌嚴重損傷。類似的 軟組織症痕化及缺陷亦發生在以放射治療為輔助的癌症病 患。而這些問題可經由將病患自體脂肪移植於患部來獲得

治療（比林斯Ε，May整形重建手術83 ·· 368-38 1，1 989 ; JW 柏可Μ，諾伐克B整形手術季刊1 8 : 3 2 7 - 3 2 9， 1 9 8 7 ;艾倫 柏金R整形手術季刊1 6: 1 79- 1 94, 1 986 )。但這類修補手 術的成功大多是短暫的，因為移植的細胞會漸漸地被鄰近 組織所吸收（爾西克R Α整形重建手術 8 7 : 2 1 9 - 2 2 7，1 9 9 1)。一些改善此情況的方法包括結合吸收 聚合葡萄糖小球的基礎纖維母細胞生長因子（安普利B l

第30頁 1278517 五、發明說明（26) 辛得RA，普拉蒂斯JM，薩得福am整形重建手術 90:1 0 22- 1 030，1 992 )。導因於外傷及手術的疤痕也有相似 的後遺症。最極端的例子是導因於治療威脅生命安危的乳 房癌，而導致的局部病灶切除術或乳房切除術。一些患者 會，了美觀選擇手術植入義乳。但許多人則寧可選擇經由 大範圍的手術移植下腹脂肪組織及肌肉組 外觀：而乳房切除術發生時，則一定要實施‘^ flap手術，且無法重複。而成功的機率也不一定。如果 應移植組織將導致手術失敗，❿移植的脂肪組 纖將被吸收。 於此空間脂肪基質的其它用途還有，但不限 原、生ί/二：選化合物的影響力及細胞毒性、過敏 ’、生長/凋栓因子、製藥化合物等等，還有解M 病的機轉，研究犖#^ ， 逖百％釋一些疾 &鉬g I 物和/或生長因子的作用機制，吟鼯b 監視”的癌Γ正’基因治療及生產生物活性二，斷及 或不；ί空間生物適性基質是指任何具生物適性可再哄 ;方S且二t吸收的化合物。它可在活體内或活體外支拉L收 ;、、且2的前脂肪細胞基質細胞附著、生長、分2持：脂 ΐ 11生長及以三度空間模式進入軟組織及脂肪έ 1 U偏好的基質包括：肪:且織 :聚合物、藻朊酸聚合物、matrigel、第？丄聚乙醇 ::τ生物、第四型膠原蛋白及其衍生⑯ 盆二蛋白及 蛋白及其衍生物以及以上種類之組合。L、匕型膠原 以實施例來說，使用的基質是百分之五十到九十五多

第31頁 1278517

五、發明說明（27) 孔性的聚乳酸-乙醇酸聚合物片，但較偏好多孔性百分之 九十左右者。其厚度最好在一到二十五公釐之間，二％五 到十二點五公厘之間較優。而孔徑最好能維持在五十到一 千微米之間’若能在二百到六百微米之間更佳。 其它基質的材料還有，但不侷限於，尼龍（多元醯 胺）、達克龍（聚酯）、聚笨乙烯、聚丙烯、聚壓克力、聚 乙稀化合物（聚氯乙烯）、聚碳酸（pvc)、聚四服乙烯 (PTFE，特氟龍）、thermanox(TPX)、硝酸纖維、棉纖 維、聚乙醇酸（PGA)、膠原蛋白（須呈海綿、總帶、組合 線狀等形式）、貓腸線、纖維素、明膠及其它自然生成之 可分解材質或人工合成之材料，舉例來說有 … P^lyhydroxyalkanoates。以上所提之任何材料皆可經組 合而成網狀組織，例如像三度空間框架或骨架。有些材質 1象尼邊或聚苯乙烯等為細胞附著性較差之受質。當使用之 ，材料為三度空間框架時，建議在接種基質細胞^先加= ，理’以增加基質細胞對此基質的附著力。舉例來說，尼 減基質必須在接種基質細胞之前以0 · 1Μ醋酸處理，並在聚 =胺酸、PBS及/或膠原蛋白中培養以包覆尼龍。聚苯乙^ '、可經硫酸加以類似的處理。 當培養基必須被保留一段很長的時間或低溫保存，不 ^分解性的材質像是尼龍、達克龍、聚苯乙烯、聚壓克 車*、、聚乙烯、特氟龍、棉纖維等等較為適合。根據本發明 二ί =是一種尼龍網狀組織Nitex。它是一種尼龍攄 叫狀組織，平均的孔徑為21 Omu. m，平均的尼龍纖維直

第32頁 1278517 五、發明說明（28) 徑為 90mu.m(#3-210/36 Tetko， Inc·，Ν·Υ·)。而如果必 須將此三度空間培養物植入活體，生物可分解性的基質則 較佳。像是聚乙醇酸、貓腸線材料、膠原蛋白或明膠。如 果要將所培養的細胞移植或種入活體，最好選用患者自身 組織得來的基質細胞。細胞在此三度空間支撐物上的生長 可經由將框架加上或包覆以蛋白質（膠原纖維、彈性纖 $、網狀纖維）、糖蛋白、氨基葡聚糖（硫酸肝燐脂、軟 1素-4-硫酸鹽，軟骨素—6—硫酸鹽，心㈣討⑽硫酸鹽，硫 酉欠角素）、細胞基質及/或其它材質。 爲⑽細胞最好能以每立方公分丨〇 〇到丨〇 〇 〇 〇 〇個的密度加入 $貝、’，仿效在細胞培養時的狀況。此數值被重複地提 以證明三度空間組織已被建立的事實。此數值只表示 達ϋ ^區間，最終的濃度仍須以本領域的方法來決定，以 建移植物之最大脂肪分化率。 月曰肪細胞培養基可進 括一種或多種10-9到 :monobutyrin 、類皮質糖 每毫升1到lOOOng由以下 血管内皮細胞生長因子、 四號骨質型態發生蛋白 、胰島素、第一號類胰島 長因子、減肥蛋白lept in

1〇、3Μ由以下族群選出的化合物ι 長鏈脂肪酸。另外一種或多種 =群選出的化合物亦可被加入： ，維母細胞生長因子（貝它）、第 ^、第七號骨質型態發生蛋白質 爲生長因子、第二號類胰島 及生長激素。 人類和脂肪組織有關之各 發。例如所發展出來的系

這些方法與組成物已被用在 U況的化合物及蛋白質藥物研 1278517 五、發明說明（29)~" '^ --*- 統具有以人類脂肪細胞在動物為基礎模型下篩選候選藥物 的潛力。t發展出人類由脂肪組織來的基質細胞移植能成 功的在小氣或大鼠中行脂肪細胞分化，篩選它們對候選藥 物的反應即可行。這項進展將容許藥物脂肪細胞代謝的生 理評估，並提供可能的優勢予現代方法學測試培養中的分 離人類脂肪細月包。不像細胞培養系統，此法容許脂肪細胞 與其它器官系統以交互調控、正向及負向回饋控制環的方 式交互作用。 以下例子是以例證的方式而非限制的方式提出。 範例一 人類前脂肪細胞至脂肪細胞的分化 人類前脂肪細胞經由羅德貝爾及輪特描述的抽脂手術 (羅德貝爾（ 1 967)and( 1 974 );翰特，supra)得到的脂肪 組織分離出。將由血管基質小片得到的前脂肪細胞再懸浮 在刖脂肪細胞培養基（D Μ E -漢姆氏F - 1 〇，1 : 1 (v / v )， 1 〇 % 胎牛血清及盤尼西林—鏈黴素-fungiz〇ne)並每格二萬五千 個細胞塗佈在九十六格培養皿中（丨5 〇 #丨/格）。然後將細 胞放在含百分之五二氧化碳的攝氏三十七度培養箱一晚以 便其安定。隔天便將全部的培養基換成丨5 〇 # 1分化培養基 (多貝科氏修飾依格氏培養基/漢姆氏F —1〇營養培養液（1: 1，v/v)，15mM HEPES 緩衝液，ρΗ7·4，33//M 生物素，17 //Μ泛酸，〇· 2mM異丁基甲基黃花色精，ι〇〇ηΜ胰島素，；[ //Μ迪皮質醇，1//M BRL49653(由一百倍二曱基亞風儲備 溶液稀釋入培養基），1 0 % (v / v)胎牛血清，6 0 U / 1鏈黴素，

1278517

6 0U/1盤尼西林，2 5 //g/l fungizone)。細胞將維持 化培養基中三天。必要時將再添加分化培養基、分 的體積。 、、隹持適當 移去1 2 0 // 1培養基並小心地留下3 〇 # 1蓋住細胞 層，以免，移除全部液體造成之表面張力使得細胞^由^ 皿表面剝落。然後再將細胞餵以丨2 〇 # 1脂肪細胞培養^養 (多貝科氏修飾依格氏培養基/漢姆氏F_10營養培養液土 (l:l，v/v)，15mM HEPES，pH 7.4，3% 胎牛血清， 物素，1Y//M泛酸，ι00ηΜ胰島素，1/zM迪皮質醇，6〇/ ^ 尼西林，60U/1鏈黴素，25//g/lfungizone)，並以攝氏^ 十七度培養。細胞將每三到四天再以脂肪細胞培養基館: 一次，持續十四天。每次的餵養皆將丨〇 〇 #丨舊培養^ = 除，再加入100//1新培養基。 土 油滴將在分化培養基加入後的四天出現。每三到四天 將脂肪細胞培養基更換一次，脂肪細胞可維持一週到一個 月。第一圖以Oi 1 Red 〇染色的前脂肪細胞與脂肪細胞 示出正常及意料中的形態。 ^ 以下過程用以決定脂肪細胞中的脂肪累積量。將九十 六格培養皿每格移去丨20 # 1培養基。小心預防培養基乾 掉。每格加入100 # 1固定劑（内含7%福馬林之pBS)，並以 室溫培養最少二小時。將四毫升蒸餾水加入六毫升〇 i i Red 0儲存液（異戊醇中加入1% 〇u Red 〇)以製備〇u 0工作溶液。將此工作溶液以室溫培養二十分鐘後，以 Nal gene 0· 8微米之濾紙過濾。全部之固定劑將以吸引方

1278517 五、發明說明（31) — - 式移除，直到培養皿完全乾燥。 、然後將細胞加入每袼40 //1的0il Red 〇工作溶液在室 溫下培養十到十五分鐘。小心不要碰到培養皿之格壁，以 =染料殘留在壁上而使背景雜訊過高。為避免蒸發，培 養4須將培養皿加蓋。培養完之後m㈣u Red 〇溶 液移去，並以每格200 // 1的蒸餾水清洗細胞四次。清洗過 的水以插入吸管或定量吸管由上方移除，以除去漂浮在液 面的1 Red 0沉澱。全部的殘留清洗液都要移除。 母格加入100 //1異戊醇，並將培養皿在室溫下培養十 分鐘。將異戊醇上下抽吸數次以確保全部0i i Red 0都溶 入溶液中。以50 0nm波長測試其光學濃度。比較已分化脂 肪細胞及前脂肪細胞可得染色的五倍增加（第二圖）。染色 的脂肪細胞讀數平均為〇· 383 ± 〇. 〇2〇〇D5⑽而染色的前脂肪 細胞讀數平均為一致〇·〇82± 〇.〇14〇D5G◦。一致的細胞分化 可在各培養m中觀察到。 範例二 辨識提昇前脂肪細胞分化為脂肪細胞的化合物

為測试化合物刺激前脂肪細胞分化為脂肪細胞的能 力，範例一中的步驟將接續以下變化。BRL49653將在分化 培養基中被省略掉’代以待測化合物或只有載體作為負面 對照。而BRL496 53則被用為正面對照。細胞在各種濃度的 BRL49 6 53包含於3%胎牛血清、ΙΟΟηΜ胰島素、1//M迪皮質 醇及0· 2mM異丁基甲基黃花色精的DMEM/F-10培養基中培 養三天。然後換成不含BRL49653的脂肪細胞培養基。九天

第36頁 1278517 五、發明說明（32) 之後以前述方法沖洗細胞、固定然後以〇 i 1 Red 〇染色。 最後將Oil Red 0淬取掉，測量吸光質，將BRL496 53濃度 對光學密度（OD)做成簡圖。第三圖說明以〇i i Red 〇染色 之後’顯示出人類前脂肪細胞受不同劑量BRL49653影響分 化的反應。 範例三 辨識類皮質糖及類皮質糖類似物

為測試化合物是否具有類皮質糖及/或類皮質糖類似 物般的作用力，範例一中的步驟將接續以下變化。人類前 脂肪細胞備分離出來並培養在含3%胎牛血清、i〇〇nM胰島 素、0· 2mM異丁基甲基黃花色精及漸升濃度之迪皮質醇的 DMEM/F-1 0培養基中如本文所述之條件培養三天。然後再 將培養基換成含有3%胎牛金清、1 〇 〇 胰島素及漸升濃度 之迪皮質醇的DMEM/F-10(1 : 1)培養基，並每三天更換一次 培養基直到十二天。然後如前所述沖洗細胞、固定然後以 0 i 1 R e d 0染色。第四圖經測量脂肪的累積說明迪皮質醇 以依據劑量多少的模式刺激細胞分裂。 範例四

辨識過氧化體再育活化受器珈瑪拮抗物

為測試化合物拮抗過氧化體再育活化受器珈瑪的能 力’範例一中的步驟將接續以下變化。將在含有5〇nM BRL49653的分化培養基中，加入待測化合物或只有載體作 為負面對照以容許最大分化刺激之半量。細胞將被分離並 培養在包含於3%胎牛血清、1〇〇]；^胰島素、5〇nM

第37頁 1278517 五、發明說明（33) BRL49653、1//M迪皮質醇、0·2πιΜ異丁基甲基黃花色精 及1 // Μ新的化合物的DMEM/F-1 〇培養基中培養三天。將細 胞以標準脂肪細胞培養基再培養十天。然後沖洗細胞、固 定然後以Oi 1 Red 0染色如前所述。

第五圖說明以單一劑量之各種新的物質加以篩選，來 決定其抑制分化的能力。此為光學密度對各種化合物之作 圖。接近0· 2 OD的水平線是1 //M BRL49653時所觀察到的 Oi 1 Red 0吸光質，可作為百分之百分化的指標。當5〇nM BRL49653產生接近〇· 2 OD的值時（水平線），有一些化合物 以Oi 1 Red 0染色測量時，顯示對最大分化刺激之半量有 所抑制。 辨識可引導已分化脂 分別由五個患者 分化。如範例一之方 肪細胞。塗佈二十一 (Krebs - Ringer 緩衝 腺素處理。正負對照 上腺素及只有KRB)分 三十七度培養四小時 當脂肪分解物質 甘油及脂肪酸。脂肪 放到培養基的甘油來 基（100 // 1)移到新的 肪細胞脂肪合成作用的化合物 分離來的前脂肪細胞以本文所述之法 法準備一個九十六個培養皿的分化脂 天之後，將細胞以格林溶液 液）沖洗，並以漸增濃度之異丙腎上 組(、依序為KRB中含有〇· 5 //M異丙腎 %被加人=纟°然I將培#皿在攝氏 分二油脂會被轉變成 ”速率在本範例中將 決定。培養έ士击„士， 彳里饥砰 > I m Φ 、、°束蚪個格中的條件培養 培養皿中。甘、、上4 ，由& 準組（ImM， 〇. 5mM，

1278517

0.25mM，O.lmM，0·05πιΜ，〇.〇25mM, OmM)也包括在其中。 將甘油分析溶液（1 0 0 // 1 ; S i g m a甘油分析組合）加到 各格之中。將溶液充分混合並於室溫培養十五分鐘，並測 量個格的540nm光學密度度。540nm吸光度*的上升和樣本中 甘油濃度呈直接的正比。第六圖說明已知脂肪分解劑，異 丙腎上腺素，以和劑量有關的方式，刺激由不同五位患者 分離而來的已分化脂肪細胞的脂肪分解作用。 五、發明說明（34) 範例六 引導去氧核糖核酸入脂肪細胞

根據範例一所述的方法將前脂肪細胞分化為脂肪細 胞·。將〇· 1到2 M pCMV- 々gal加入150 # 1 EC緩衝液 jlagenEf^ectene 組合，商品編號30 1 425，Qiagen，瓦 ^。亞，加拿大）然後去氧核糖核酸將在微離心管被容許濃 萨、、η ^8、“ 1提昇劑（Qiagen Ef f ectene組合）到去氧核糠核 鐘Γ二液三震動混合一秒，並將之在室溫下培養二到五分 上古去氧核糖核酸混合液大概地離心一下，移除離心管 +去丨、 ’。以後加入1 〇 // 1之E f f ec t ene試劑，震動混合

舊培養美(/殿下培養五到十分鐘。由細胞處移去120 # 1 細胞培^美必須留30 # 1在格中），然後加入70 #1新鮮脂肪 加入^氧土五到十分鐘培養後，一毫升的新鮮培養基被 中。脸4亥糖核酸混合液’並將此混合液2 5 // 1加到各格 在細胞上 二香五小時。不過Ef f ectene無毒’可將之留 膝細2，$論時間長短。然後以80 # 1脂肪細胞培養基洗 、’於感染七十二小時之後分析貝它—乳糖分解膽

第39頁 1278517

的活性。第七圖顯示經由測量貝它〜a ♦ 以Effectene轉殖的效率對去氧核糖===解梅的活性， 及培養時間的長短的影響。 ^久/辰度有劑量依賴 範例七 由培養之人類脂肪細胞及前脂肪細胞辨 以下過程可由根據範例一的方法製;’斤的蛋白質 出新的蛋白質。衍生自同患者的前^之脂肪細胞辨識 u q〜月丨j乃曰肪細胎 細胞依範例一所述培養，然後以不含 已分化脂肪

培養基培養二小時。然後在培#基加人脂肪細= 胺酸，並將細胞培養於此混合液中— [S]甲石瓜 換成含1 // Μ非放射性甲硫胺酸之脂肪細胞培養美。’ σ " 未決定所分泌蛋白質的模型，將細胞“ $升條件培 養基移去，並在攝氏四度以四公升冷KRB透析四小時去除 放射性蛋白質上未結合的35[S]甲硫胺酸。將每份樣本取 50, OOOcpm與二倍濃度之稀釋緩衝液（16%NP_4〇，2% amphol ines，8M尿素· 7· 5% /3 -乙醇氫硫及〇· 1%溴酚藍）

以1 : 1 v / v混合，測量蛋白質濃度及輻射總量並馬上裝填 於12· 5公分長的3%聚壓克力電泳膠管。電泳膠含8M尿 素、10% NP-40 、5.5% ampholines。加三到四力尿素結 晶至樣本中，並搖動試管直到結晶融化。 將電泳膠管置於下方槽中裝有0.01M磷酸而上方槽中 裝有0· 02M氫氧化鈉的等電點電泳槽。固定安培數（每管 0 · 2 5 m A)以1 2 0 0 0伏特—小時電泳樣本。當電壓增至5 0 0伏 特，電力控制即更改到固定電壓十二到十六小時後，將電

第40頁 1278517 發明說明（36) 壓升至1 0 0 0伏特以使蛋白質聚焦於等電點。 將管中膠體推出圓柱並浸泡於平衡緩衝液（1 〇 %甘 油，5%冷-乙醇氫硫，O.lMtris， ρΗ6·8，2%月桂醇酸 納）二十分鐘。然後將此梯度膠體水平置於含有〇 · 1 Μ tris、ρΗ6· 8及1%月桂醇酸鈉之7· 5%聚壓克力電泳膠上 以按照表面分子量來分離。 ' 此膠體以1 2 0伏特電泳四小時後由盤中取出，以醋酸· 福馬林：水（1 : 7 : 2 ν / ν) —晚。然後將膠體置於丨〇 %甘油溶 液二十分鐘後以真空加熱乾燥。乾燥膠體以X光底片感光 二十四小時以判讀勝體上的輻射蛋白質之模式。第八圖說 明所觀察到衍生自同病患的人類前脂肪細胞（二天）及已分 化脂肪細胞（十四天）所分泌之蛋白質經輻射標定之模式。 範例八 在活體外生產三度空間脂肪組織 依據前述方法由皮下脂肪組織分離基質細胞。每平方 公分以大約5 0 0到2 0 0 0 0個細胞的密度塗佈。塗佈後一天， 將細胞轉換至含有胰島素、生物素、泛酸、BRL49653、迪 皮質醇和異丁基甲基黃花色精或同樣功效的化合物依照本 領域所熟悉的濃度之、、脂肪細胞分化培養基〃。經過在此 培養基中培養三天後，在攝氏三十七度以胰蛋白晦/以底 酸消化一到十五分鐘以收成細胞，再將細胞懸浮在至少含 有百分之十胎牛血清的培養基中。以1〇〇到5〇〇Xg離心， 282Xg離心一到十分鐘較優，最好攝氏四到三十七度離心 五分鐘，以在攝氏二十度時離心為佳。再將濃縮的細胞重

1278517

新，浮在含有每公升1 0 0 0到1 0 00011^葡萄糖以每公升45〇〇 葡萄糖為佳、百分之1到1 〇胎牛血清以百分之三胎牛血 清巧佳、月夷島素、生物素、泛酸和本領域所熟知濃口度之迪 皮質醇的脂肪細胞維持培養基。然後將細胞以每毫升一千 到一千萬的濃度重新懸浮。如果是每毫升十 好，以二十五萬為最優。 〗百禹更 ^後將濃縮的細胞直接吸至聚乳酸—聚乙醇酸聚合物 ^二多孔性為5〇%到95%之間，最好90%。其厚度在一到十 之間二最好2. 5公釐。直徑5到25公釐之間，最好12.5 么厘。孔徑的範圍在5〇到1〇〇〇[1111111之間，最好在2⑽到 間基質可以生物材料單獨合成或加入可引導脂肪細 胞的材質。包括，❻不侷限於此，月旨肪生成化合物 雙酮噻唑BRL49653、生長激素、迪皮質醇、基礎纖维母 細胞生長因子及/或ΜΑΡ磷酸根轉移腾抑制劑）、血管生 成化合物（像是monobutyrin)及/或含有帶有表現脂肪生成 因子（像疋持續活化過氧化體再育活化受器丨加瑪2或持續活 化$質型態發生蛋白質受體IA)或血管生成誘導因子（像是 血官内皮細胞生長因子）密碼的互補去氧核糖核酸表現載 體。其它方面，可將細胞再懸浮於Matrigel或豆仓τ η > 生化適性材質，像是每毫升十萬到一百萬的二度；=之 鹽。在三度空間基質中的細胞以脂肪細胞維持培養基持續 維持’並每二到四天但最好在每各地三天更換&鮮ς養、’ ^。脂肪細胞系統的分化可根據、、分化人類前脂肪細胞為 脂肪細胞的方法與組成物"（序號0 9/240, 029 —九九九年

1278517 五、發明說明（38) 、月二十九日存檔）以像位差顯微 視油脂空泡的出現。三度空間基質 ' ' 〇染色監 視或包埋在石犧中做切片。其$ =光學顯微鏡檢 包括以北方墨點法、西方墨點；皿;月=:=成的方法 合梅連鎖反應偵測脂肪細胞特有的免疫測試及聚 隈於）月曰肪細胞脂肪酸結合蛋白aP2 們 蛋白溶脂腾、adipsin。這些方法可#^蛋白1ePtln、脂 分化的條件更办盖，拍本七一软社二使知肪細胞在活體外 生成垂二Μ ί 2 q ί疋如或活體實驗前最大脂肪 王成貝仃的谷_時間長度。 範例九 免？I :小鼠模型生產可供移植的三度空間脂肪組織站 开《活⑲Ϊ:例人中發展出的三度空間基f細胞基質被用來 體移植。免疫不全老鼠模型包括但不限定 =不全小鼠(SCID)、裸鼠、米黃裸鼠、嚴重併發免疫不 王/非肥胖糖尿病小鼠（N〇D)及大裸鼠。以下敘述二種並 被取代的方法。第一種方法中，所收成的基質細胞 、·，坐由一到三次的培養基更換及分盤，以達最大細胞數量。 基質細胞根據、、分化人類前脂肪細胞為脂肪細胞的方法盥 組成物〃（序號0 9/240,029 —九九九年一月二十九日存 檔）由皮下脂肪組織取得。並以每平方公分50；到2〇〇〇〇+個 細胞的密度塗佈。此未分化前脂肪細胞基質細胞是在攝氏 三十七度以胰蛋白晦/以底酸消化一段一到十五分鐘的時 間，然後再懸浮於最少含有百分之十胎牛血清的7等’s體積培 養基。將細胞以100到500Xg離心，最好是282 Xg離心一到

第43頁 1278517

五、發明說明（39) 而在攝氏四度到三十七度離心五分鐘為佳 好在攝氏二十度離心。濃縮的細胞再重新懸浮於 t偏 1000到lO’OOOmg葡萄糖以每公升45〇〇 mg葡萄糖 A 分之1到10胎牛血清以百分之三胎牛血清為佳、2白 生物素、泛酸和迪皮質醇在本領域所熟知之 Μ、 胞維持培養基。然後將細胞以每毫升一千 :钻9肪細 4…π / ^ 丁判一千萬的澧唐 重新4洋。如果是每毫升十萬到一百萬更好，以二 為最優。然後將濃縮的細胞直接吸至一聚乳膠—聚—乙 聚合物片。多孔性為50%到95%之間，最好9〇〇/。其声= 一到十公釐之間，最好2· 5公釐。直徑5到25公釐之又 好12.5公釐。孔徑的範圍在5(Ulj1〇〇〇mum之間，最好3在’2〇敢 到600 mum之間。基質可以生物材料單獨合成或加入 導脂肪細胞的材質。包括，但不侷限於，脂肪生 (像疋雙’嚷嗤BRL49 653、生長激素、迪皮質醇、基 維母細胞生長因子及/或MAP磷酸根轉移晦抑制劑）土、血 管生成化合物（像是monobutyrin)及/或含有帶有表現脂肪 生成因子（像是持續活化過氧化體再育活化受器丨加瑪2 續活化骨質型態發生蛋白質受體IA)或血管生成誘導因3子 (像是血管内皮細胞生長因子）密碼的互補去氧核糖核酸表 現載體。其它方面，可將細胞再懸浮於Matrigel或其它不 同之生化適性材質，像是每毫升十萬到一百萬的濃度= 酸鹽。這些可再輔以如上所述之其它因子。 /y' 第,個方法是在置入三度空間基質之前即容許細胞分 化。基質細胞根據、、分化人類前脂肪細胞為脂肪細胞的方

第44頁 1278517

法與組成物"（序號09/240,029 一九九九年一月二十九日 存檔）由皮下脂肪組織取得。並以每平方公分5 0 0到2 〇 〇 〇 〇 個細胞的密度塗佈。塗佈一天之後便將細胞轉入含有胰島 ，、生物素、泛酸、BRL496 53、迪皮質醇和異丁基曱基黃 才匕色精或相當之化合物以本領域所熟知之濃度的脂肪細胞 分化培養基。加入此培養基三天之後，此細胞在攝氏三十 七度以胰蛋白梅/乙底酸消化一段一到十五分鐘的時間以 將之收成，然後再懸浮於最少含有百分之十胎牛血清的等 體積培養基。將細胞以100到50 0Xg離心，最好是282 乂§離 心一到十分鐘，而在攝氏四度到三十七度離心五分鐘為 佳，較偏好在攝氏二十度離心。濃縮的細胞再重新懸浮於 含有每公升1 0 0 0到10, 〇〇〇mg葡萄糖以每公升45〇〇 mg葡萄 糖為佳、百分之一到十胎牛血清以百分之三胎牛血清為 佳、胰島素、生物素、泛酸和在本領域所熟知濃度之迪皮 貝醇的脂肪細胞維持培養基。然後將細胞以每毫升一千到 一千萬的濃度重新懸浮。如果是每毫升十萬到一百萬更 好，以一十五萬為最優。然後將濃縮的細胞直接吸至一聚 乳酸-聚乙醇酸聚合物片。多孔性為50%到95%之間，最好 90%。其厚度在一到十公釐之間，最好2· 5公釐。直徑5到 25公釐之間，最好12·5公釐。孔徑的範圍在5(^n〇(^mum 之間，最好在20 0到60 0 mum之間。基質可以生物材料單獨 合成或加入可引導脂肪細胞的材質。包括但不侷限於此， 脂肪生成化合物（像是雙酮噻唑BRL49653、生長激素、迪 皮質醇、基礎纖維母細胞生長因子及/或MAP磷酸根轉移

1278517 五、發明說明（41) 酶抑制劑）、血管生成化合物（像a κ + . Λ 有帶有表現脂肪生成因子（像是Ϊ 及/或含 化受器办瑪2或持;活化過氧化體再育活 管生成嗜寡二，％發生蛋白質受體ια)或血 去軋核糖核酸表現載體。苴t i因千）山馬的互補 百不同之生化適性材質，像是每毫升十萬到 子。萬的/辰度於藻酸鹽。這些可再輔以如上所述之其它因 在Λ入之冑，細胞可暴露於表現綠&螢光蛋白質、貝 主韵辨 匕‘ 5己蛋白貝或酵素的螢光探針腺病 體:表現相同標記的反轉錄病毒載體、螢光探針將之 不，\ s以其它標準或新發展方法來標定細胞。這些方 保d稍晚可在宿主受體動物中辨識捐贈細胞。 將所製造出的三度空間基質移植到如前所述之 老鼠模型全老鼠模型之—的皮下。將動物以氣胺_及厂又不 rompine或等同之麻醉劑/止痛劑注射於腹膜或以其它 界m並ΐ審的給藥方式。本研究以協會動物照顧二 用委員2的複查及認可為指引。植入體將維持一天到十二 個月’二週到十二週較佳，最適合的是五週。自物在部份 或全部的這段時間裡以日常食物（脂肪佔4%到5%)、高浐 食物（脂肪佔10%到30%，奥米佳_3及奥米佳—6均特別豐富） 、高碳水化合物食物（碳水化合物多於50%)或高脂肪/"高田石户 水化合物食物餵食。這段時間中將以血清收集和酵素連^ 免疫測试分析是否有人類形式的脂肪細胞特有荷爾蒙減肥

1278517 五、發明說明（42) 蛋白1 e p t i η的出現’以摘測人類脂肪細胞的出現。當研究 結束時，植入體便以手術移出並以分析化學、免疫螢光、 生化、分子生物技術分析植入體處是否有脂肪細胞或肥胖 、、、田胞的出現。已分化人類脂肪細胞的出現是經由丨n s丨t ^ 連鎖聚合腾反應偵測人類獨有的基因標記"a丨u，，片段來判 斷。 此外， 法都被利用 現。細胞的 時。這些方 物分化為脂 去氧核糖核 這個方 可將生物材 方式，準備 來測定創造 可能有所限 考慮用來測 積比可能和 出植入物本 以免疫不全 組織站 植物中 生存能 人類基 、因子 〇 型的三 的規格 厚度的 在老鼠 型（狗， 理的極 關’而 偵測任何標記蛋白質、 來考證最終分化脂肪移 組成、大小及植入物的 法是使對支撐由捐贈者 肪細胞必要的生長狀況 酸及生物基質達到最佳 法可調整為準備特定模 料塑造成符合特殊需求 了各種不同寬度高度及 ^設計師〃軟組織站。 制。不同的大型動物模 試面對這種組織工程處 宿主動物的實際大小有 身的幾何學。 範例十 老鼠模型在活體内生產 螢光探針的的方 捐贈細胞的出 力便決定於此 夤細胞在宿主動 、蛋白質、互補 度空間移植物。 。為測試此處理 生物適性聚合物 體内的測試程度 豬、綿羊）將被 限。組織站的體 且可能無法反映 可 >主射之三度空間脂肪 上面範例八所發展之三度空間基質細胞基質被用來行

1278517 五、發明說明（43) 活體内移植。免疫不全老鼠模型包括但不限定於嚴重併發 免疫不全小鼠（SC ID)、裸鼠、米黃裸鼠、嚴重併發免疫不 全/非肥胖糖尿病小鼠（N〇D )及大裸鼠。以下敘述二種並 非不可被取代的方法。第一種方法中，所收成的基質細胞 經由一到三次的培養基更換及分盤，以達最大細胞數量。 基質細胞根據、、分化人類前脂肪細胞為脂肪細胞的方法與 ，成物〃（序號0 9/240,029 —九九九年一月二十九日存 植）由皮下脂肪組織取得。並以每平方公分5 〇 〇到2 〇 〇 〇 〇個 細胞的密度塗佈。此未分化前脂肪細胞基質細胞是在攝氏 二十七度以胰蛋白腾/以底酸消化一段一到十五分鐘的時 間，然後再懸浮於最少含有百分之十胎牛血清的等體積培 養基。將細胞以1〇〇到500Xg離心，最好是282 Xg離心一到 十分鐘，而在攝氏四度到三十七度離心五分鐘為佳，較偏 好在攝氏二十度離心。濃縮的細胞再重新懸浮於每公升 1 00 0到lOOOOmg葡萄糖以每公升45〇〇 mg葡萄糖為佳、百分 之1到1 0胎牛血清以百分之三胎牛血清為佳、胰島素、生 物素、泛酸和迪皮質醇在本領域所熟知之濃度的脂肪細胞 維持培養基。然後將細胞以每毫升一千到一千萬的濃度重 新懸洋。士口果是每毫升十萬到一百萬更好，以二百萬為最 優。 第二個方法是在置入三度空間基質之前即容許細胞分 化。基質細胞根據、、分化人類前脂肪細胞為脂肪細胞的方 法與組成物〃（序號09/240,029 一九九九年一月二十九日 存檔）由皮下脂肪組織取得。並以每平方公分500到20000

第48頁 1278517

五、發明說明（44) 個細胞的密度塗佈。塗佈一天之後便將細胞轉入含有胰島 素、生物素、泛酸、BRL49653、迪皮質醇和異丁基甲基黃 花色精或相當之化合物以本領域所熟知之濃度的脂肪細胞 分化培養基。加入此培養基三天之後，此細胞在攝氏三十 七度以胰蛋白騰/以底酸消化一段一到十五分鐘的時間以 將之收成，然後再懸浮於最少含有百分之十胎牛血清的等 體積培養基。將細胞以1 0 0到5 Ο Ο X g離心，最好是2 8 2 X g離 心一到十分鐘，而在攝氏四度到三十七度離心五分鐘為 佳’較偏好在攝氏二十度離心。濃縮的細胞再重新懸浮於

含有每公升1 00 0到lOOOOmg葡萄糖以每公升450 0 mg葡萄糖 為佳、百分之一到十胎牛血清以百分之三胎牛血清為佳、 胰島素、生物素、泛酸和在本領域所熟知濃度之迪皮質醇 的脂肪細胞維持培養基。然後將細胞以每毫升一千到一千 萬的濃度重新懸浮。如果是每毫升十萬到一百萬更好，以 二百萬為最優。 在植入之前，細胞可暴露於表現綠色螢光蛋白質、貝 :-乳糖分解酶或其它標記蛋白質或酵素的螢光探針腺病 毒載體、表現相同標記的反轉錄病毒載體、螢光探針 標定，或以其它標準或新發展方法來標定細胞。這些方 保證稍晚可在宿主受體動物中辨識捐贈細胞。 / 习將分別由二種方法得到的細胞與液態Matr igel (第四 型膠原蛋白）或其它液態生物適性聚合物混合。細胞的濃 度是每耄升五萬到五百萬個細胞，最好是每毫升一百萬辰 細胞。Matrigel的濃度是每毫升5到2〇赇，最好是每毫升

第49頁 1278517 五、發明說明（45) 1 〇mg。基質可以生物材料單獨合成或加入可引導脂肪細胞 的材質。包括，但不侷限於，脂肪生成化合物（像是雙酮 噻唑BRL496 53、生長激素、迪皮質醇、基礎纖維母細胞 生長因子及/或MAP磷酸根轉移梅抑制劑）、血管生成化 合物（像是111〇11〇1)1^71^11)及/或含有帶有表現脂肪生成因子 (像是持續活化過氧化體再育活化受器珈瑪2或持續活化骨 質型態發生蛋白質受體IA)或血管生成誘導因子（像是也管 内皮細胞生長因子）密碼的互補去氧核糖核酸表現載體。

將所製造出的細胞/Matri gel注射到如前所述之免疫 =老乳模型全老鼠模型之一的皮下。注射之前，將動物以 氯胺酮及rompine或等同之麻醉劑/止痛劑注射於腹膜或以 其它獸醫界已核准並複審的給藥方式。本研究以協會動物 照顧及利用委員會的複查及認可為指引。植入體將維持一 天到十二個月，三週到十二週較佳，最適合的是五週。動 ，在部^或全部的這段時間裡以日常食物（脂肪佔4%到 5%)、高脂肪食物（脂肪佔10%到3〇%，奥米佳—3及奥米佳—6 ===豐富^ 、高碳水化合物食物（碳水化合物多於5〇0/〇) ，同月曰肪/阿；5反水化合物食物餵食。這段時間中將以血清 ^ ^ ^酵素連結免疫測試分析是否有人類形式的脂肪細胞 的+何爾豕減肥蛋白1 ePt 1 η的出現，以偵測人類脂肪細胞 M ^ ，研究結束時，植入體便以手術移出並以分析化 二光、生化、分子生物技術分析植入體處是否有 β ^、二3肥胖細胞的出現。已分化人類脂肪細胞的出現 疋、、生由喊管内連鎖聚合臃反應偵測人類獨有的基因標記

1278517

Ί U π片段來判斷。 、此外，偵測任何標記蛋白質、酵素、螢光探針的的方 法都被利用來考證最終分化脂肪移植物中捐贈細胞的出 現。=胞的組成、大小及植入物的生存能力便決定於此 時。这些方法是使對支撐由捐贈者人類基質細胞在宿主動 物分化為脂肪細胞必要的生長狀況、因子、蛋白質、立補 去氧核糖核酸及生物基質達到最佳。 、 範例十一 利用動物杈型中的三度空間人類脂肪細胞墊篩選及測試具 療效的化合物 以前的人類脂肪組織研究被限制在含有分離的人類脂 肪細，的二^空間活體外培養，除非研究已進展至第一期 人體貫驗。這些方法已在上面被陳述過。範例二與範例三 中陳述的方法可用以篩選及/或測試新的或已存在之具療 效的化合物’來決定在生理狀況下它們對人類脂肪組織的 影響。免疫不全老鼠模型提供了 一個生理條件的背景，擬 人化的脂肪組織站加以分析。以下的陳述只是一個範例， 無論，何不可被當作限制或絕對。為測試一新的雙酮噻唑 或過氧化體再育活化受器珈瑪2刺激物在糖尿病對脂肪細 胞功能的影響’而用帶有人性化脂肪墊模型的老鼠創造一 個糠尿病模型是可能的。此老鼠可以鏈尿菌素達到化學引 起的膜臟炎。動物可依據血清中葡萄糖水平來監視糖尿病 的形成。一旦糖尿病被建立，這些動物便被分成不接受任 何處置的對照組，及接受不同劑量及不同處方路徑之待測

1278517 - _ 、發明說明（47) 化合物的實驗組。待測化合物 侵略性的血清葡萄糖柃 動物糖尿病的影響可以非 免疫測；Πΐ ;;蛋白1epti_合進行。以酵素連結 白質，且將其與任何豆它去巧分類減肥蛋白1ePtin之蛋 分，如η ^、主时肛’、老鼠減肥蛋白1 ept i η蛋白質區 刀，如冋血清脫脂脂蛋白水準（人 一 游離脂肪酸及酮體水準。在此 ' 鼠）、二甘油脂、 成及代謝活性可在實驗組及對照組的動 a中被比較。此法使得在國家衛生局核准第一期研究之 月IJ，能夠先對人類脂肪組織測試具潛力的治療性化人 藥物公司在藥物研發的這個緊要關頭的：功機 對於本發明在前面的敘述及伴同的圖式所展現 的助益，一個熟悉本領域的人可想到有關本發明 化還有其。因此須了解本發明並不侷限於已揭露出二二 定實施例及其修正，也應該將其他實施例包括在 、特 的範圍中。雖然在這裡用到一些專有名詞，但它們J1訴請 般性及陳述性的觀念被使用，而不應以限制為目的，以一 1278517

第53頁

Claims (1)

1. 1278517 案號 89113427 修正 六、申請專利範圍 培養基和前述細胞之接觸乃維持在P Η 7到7 . 6。 2. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該前脂肪細胞培養 基、該分化培養基以及該脂肪細胞培養基更包含3 % - 1 0 %胎 牛血清。 3. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該分化培養基以及 該脂肪細胞培養基更包含1到1 Ο Ο β Μ泛酸以及約1到1 0 0 # Μ 生物素。 4. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該化學限定培養基 更包含一 ρ Η值為7. 0至7. 6的一生物緩衝液。

   5. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該化學限定培養基 為多貝科氏修飾依格氏（Dulbeccos Modified Eagle)/ 漢姆 F-10 營養培養基（Hams’ F-10 Nutrient Broth)(體積 比為1 : 1)。 6 .如申請專利範圍第1項的方法，其中該雙酮坐為BRL 4 9 6 5 3。 7. 如申請專利範圍第6項的方法，其中該BRL 4 9 6 5 3的濃度 為 0 · 5-1 · 0 // Μ 〇 # 8. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該雙酮養吐為曲格列 Si^lCTrogl itazone) 〇 9. 如申請專利範圍第8項的方法，其中該曲格列酮 (Troglitazone)的濃度為 1-5"M。· 1 0.如申請專利範圍第1項的方法，其中該類皮質糖為迪皮 質醇、氫化可體頌或可體頌。 1 1.如申請專利範圍第1項的方法，其中更包含使用一環狀

   第55頁 1278517 案號™ 六、申請專利範圍 單磷酸鳥糞嘌呤誘導物，其為異丁基甲基黃嘌呤或佛司可 林（forskolin) ° 1 2.如申請專利範圍第1 1項的方法，其中該異丁基甲基黃 嘌呤的最終濃度為0. 2至0. 5mM。

   第56頁 1278517 .式 *

   >

   CO 1278517 -圖式 1 ’補尤: ^ ^、ν11 MW 蒜穿Hi¾il穿笤窗

   第6頁 7 1 5 8 7 d 7 2 /54 αο Ρ5表 式 圖 .1—A -απ Ι/Μ ϊ 丨一1A

   ί ΒΒ 鉍^荟變更原Irf'srB _

   3