TWI233361B - Methods of preventing UVB-induced skin damage - Google Patents

Description

1233361 五、發明說明（1) - 一 發明背景： 光老化，係由於長期暴露在紫外線B(UVB)照射導致， 尤其是，皺紋的形成。 發明概述： 本發明部份係基於：抑制皮膚血管新生 (angi〇genesis)可避免紫外線B引發之皮膚損傷的發現， 上述皮膚損傷如長期（慢性）紫外線B引發的光老化，如哺 乳動物活體，如人體中，皺紋的形成。 因此，本發明之特徵為一種預防或治療一個體中，長 期照射紫外線B引發之皮膚損傷，如皺紋，的方法。本方 法包含，制一個體之皮膚中的血管新生。在一較佳實施例 中血管新生係在暴露於紫外線B中之前或同時被抑制 的0 在一較佳實施例中，本方法亦包含確認一個體受到長 期暴露在紫外線B下引發皮膚損傷的風險，其中的個體可〜 為例如人類或非人類之哺乳類動物。一個體受到長期暴露 在紫外線B下引發皮膚損傷如皺紋之風險的確認，可以經 由例如該個體、健康看護者、或美容品提供者進行。血管 新生的抑制，可以經由例如該個體、健康看護者、或美容 品提供者進行。 、 在一較佳實施例中，上述個體至少有5歲。更佳者， 上述，體至少有1〇、15、20、25、3〇、35、4〇、讪、、 或更南的年齡。

1233361 五、發明說明（2) ~^ 在一較佳實施例中，皺紋的形成被預防或減少。 在一較佳實施例中，抑制血管新生係經由增加一個或 多個抗血官新生因子（anti—angiogenic factors)之活性 而達成的，例如，在一個體中增加自然產生抗血管新生蛋 白質，如TSP-2或TSP-1之活性，以避免皺紋的形成。 TSP-2之活性可經由例如投與一能提高TSP-2活性的藥劑而 增加。在一較佳實施例中，提高TSp-2活性的藥劑可包含 一個或多個下列物質：一TSP-2多胜肽，或其具生物活性 之片斷或相似物（analog)，例如一TSP-2衍生多胜肽或其 反向多胜肽（retro-inverso p〇iypeptide); —編碼TSP-2 多胜肽之核酸，或其生物活性片斷或相似物；一TSp一2之 促效劑（agonist)，如一具有TSP - 2活性或提高TSP-2活性 功能之抗體或小分子；或一提高Tsp_2核酸表現量之藥 劑，如一可與TSP-2之啟動子區結合並提高其表現量之小 分子。

在一較佳實施例中，TSP-2係由一藥劑增加，例如_ 引起TSP-2表現之小分子。可5丨起TSP-2表現之藥劑的例子 有胎牛血清及TGF- α。在較佳實施例中，引起TSP-2表現 之藥劑係局部投與個體。在較佳實施例中，足量的藥劑係 在個體暴露於紫外線B之前投與該個體，例如在日曬前， 如此該個體在暴露於紫外線B時已具有一抗血管新生的功 能0 TSP-2功能亦可由控制傳送一TSP-2核酸、TSP-2蛋白 質、片斷、或相似物至一個體而達成。一TSP-2核酸、

1233361 五、發明說明（3) TSP-2蛋白質、片斷、或相似物可利用一控制釋放元件如 一生物性相容聚合物、微粒子（micro particle)、或網狀 物（mesh)，而施與該個體。該元件可減少衰退並控制 TSP-2核酸、TSp-2蛋白質、片斷、或相似物之釋放。此類 一TSP-2生物性相容控制釋放系統可經由，如注射或移植 的方式施與該個體，上述方式可在例如肌肉内、皮下、靜 脈、或器官内、關節腔、或傷口内進行。 TSP-2程度亦可經由提昇内源性（end〇gen〇us)TSp —2之 活性而增加。活性的提昇可經由增加其基因表現程度達 成’例如增加TSP-2基因的轉錄；提高TSP_2 mRNA的穩定 性’如改變其mRNA的2級或3級結構；提高TSP-2 mRNA之轉 譯，例如改變TSP-2 mRNA的序列；及/或提高TSP_2蛋白 的穩疋性。TSP-2基因的轉錄可經由例如改變内源性up〜 基因的調節序列（regulat〇ry sequence)而增加。在一 =例中，此調節序列可經由下列方式改變：加人正向 因=(如增強子或一轉錄活化子之⑽^結 =因子“-轉錄抑制子鲁結合位）；及/或以另負—向 ^之=序列或因子取代内源性的TSp 子，以使TSP — 2基因的轉錄更有效率。 飞因 化a 2 f!佳實施例中該藥劑係-可引起tsp-2功能之 化口物’例如"一小分子。 ^ ^ ^TSP_1 ^^1 ^ 含-個或多個下列物質：：TSP提厂sp::活性的藥劑可包 負.TSP-1多胜肽，或其生物活性

1233361 五、發明說明（4) 片斷或相似物（analog) 向多胜肽；一編碼Ts 1如一^卜1衍生多胜肽或其反 斷或相似物二=—丄多胜肽之核酸，或其生物活性片 高TSP-!活性功能之效劑，如—具有TSP-Ι活性或提 現量之藥齋丨^ 几體或小分子，·或一提高TSP-1核酸表 現虿之#劑，如一可與Tsp 51 ^15'1 ^ ^ ^ ^ -- ^ ^ ^ ^TGFΛ^^0 JΛ^Γ15-1 ^ ^ 之藥劑係局部投與。在ί =實施例中’引起tsp-1表現 體I& & R、 ^在較佳實施例中，足量的藥劑係在個 兮個體^ 1 @ A #之别投與該個體，例如在日曬前，如此 tIp _時已具有-抗血管… 質、；i斯%1^可4由控制傳送一1^卜1核酸、1'評_1蛋白 TSP ι VV^ ° -TSP^H,S^ . 蛋f、片斷、或相似物可利用一控制傳送元件如 一生物性相容聚合物、料撕；、 «。缽^ π π $ I ^ 、子、或網狀物，而投與至該個 體“ 70件可減乂农退並控制一TSP-1核酸、Tsp-丨蛋白 質、片斷、或相似物之釋放。此種Tsp_ 釋放系統可經由，如注射或移植的方式投與於該Y控制 述方式可在例如肌肉内、皮下、靜脈、或器官内、關節 腔、或傷口内進行。 明即

TSP-1活性亦可經由提昇内源性TSP-〗之活性而增加。 活性的提昇可經由增加其基因表現達成’例如增加以卜工 基因的轉錄；提高TSP-1 mRNA的穩定性，如改變其mRNA的

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2級或3級結構，·提高TSP-l mRNA之轉譯，例如改變Tsp一 1 MNA的序列；及/或提高Tspy蛋白質的穩定性。Tspq基 因的轉錄可經由例如改變TSP-1基因的調節序列 土 (regUlatory seQuence)而增加。在一實施例中該調節 序列可經由下列方式改變：加入正·向調節因子（如增強子 或轉錄活化子之DNA一結合位）；移除負向調節因子（如轉 錄抑制子之DNA-結合位），及/或以另一基因之調節序列戍 因子取代内源性的tsp-i調節序列或因子，使得基因 的轉錄更有效率。 · 在一較佳實施例中，該藥劑係一可引起TSp-l功能之 化合物’例如一小分子。 在一較佳實施例中，該提高一或多個抗血管新生因子 之活性的藥劑，例如降低自然產生血管新生蛋白質（如 TSP-2或TSP-1)者’可以經由局部投與該藥劑，經由系統 性投與該藥劑，經由口服投與該藥劑，或經由注射投與該 藥劑（較佳為真皮或皮下注射）。在較佳實施例中，該藥劑 係經由一適合之傳送工具。較佳地，該藥劑係包含在一局 部投與之組合物中，該組合物可為如膠狀、膏狀、或液 狀。該組合物更可進一步包含一美容品成份：例如芳香劑 或防曬劑，如辛基甲氧基肉桂酸鹽（octyl methoxycinnamate)、氨基安息香酸（aminobenzoic acid)、笨甲 _(〇Xybenzone)、笨甲酸（padimate 0)、 homosalate、或二氧化鈦（titanium dioxide)。該組合物 亦可包含一植物萃取物，例如蘆薈萃取物或葡萄萃取物。

l〇57-4747-PF(N);Chiuincow.ptd 第8頁 1233361 五、發明說明（6) 該組合物亦可包含維生素，例如維生素A，如維生素A酸 (retinol);維生素c，如L-抗壞血酸（L-ascorbic acid) 或L-抗壞金酸综摘酸鹽（L-ascorbic acid palmitate); 維生素E，如生育醇醋酸鹽（tocopherol acetate)。 在一較佳實施例中，上述藥劑係在紫外線B照射前投 與足夠$至個體，例如在日曬前，如此在個體受紫外線B 照射時其體内已有一個抗血管新生功能存在。 另一較佳實施例中，該提高一或多個抗血管新生因子 之活性的藥劑，例如降低自然產生抗血管新生蛋白質（如 TSP-2或TSP-1)者，係重複投與，例如在 。、…，，、或更…在一較佳實施：中/該 樂劑係長期投與的&在一較佳實施例中，該藥劑每星期至 次’更佳者為在至少二星期t，每星期或每天投 ，、至夕2、3、4、5次，更佳者為投與至少i、2、3、4、 5二舉例來說’該藥劑係定期投與3至12星期， = 在一較佳實施例中，投與該藥劑並抑 臉部、頸部、臉頻、耳朵 '手、、=以的部位可為 或任何其它暴露在紫外線B下的：膚有毛髮覆盖的頭皮處、 在較佳貫^例中，§亥個艘已經哎將要赖麻i ^此 外線B照射。 次將要絰歷長期的紫 在一較佳實施例中，該個體顯 狀’例如敞紋、下垂、雀斑、％ ^ 先老化症 澱過度、老人斑如肝斑，皮膚變ς、f膚、變色、色素沉 肖复溥、白内障、表皮增生、

1233361 五、發明說明（7) " 皮膚彈性疲乏、細胞外間質降解、或未成癌的或癌化皮膚 生長（光角質化、曰光角質化）。 在較佳貫施例中，血管新生係經由減少個體内之 VEGF活性而抑制，例如經由抑制通過VEGF受器的訊息傳 導’ ^通過KDR ;經由抑制”評蛋白質量；減低VEGF基因 表=量；及/或減低VEGF蛋白質的生產及/或活性；因而避 f紫外線B一引發之皮膚損傷，如長期紫外線B引發之皮膚 損傷，如皺紋的形成。

在較佳實施例中，VEGF係經由投與一抑制VEGF活性 的藥劑而抑制的。抑制VEGF活性的藥劑可包含一個或多個 下列物質：一抑制VEGF受器的藥劑，如一小分子，其抑制 VEGF與其受器結合或抑制VEGF受器之訊息傳導；—VEGF核 酸分子，其可與一細胞内VEGF核酸序列如mRNA結合，並抑 制其蛋白質的表現，例如一反義（antisense)分子或Vegf 核糖酵素（rib〇zyme); —專一性地VEGF蛋白質結合的抗 體’例如一具有瓦解VEGF與其自然細胞内目標結合之功能 的抗體；及一降低VEGF基因表現之藥劑，例如一可與VEGF 啟動子（promoter)結合之小分子。

在另一幸父佳貫施例中’ VEGF活性係經由啤低内源性 (endogenous)VEGF之表現度而加以抑制，例如降低VEGF基 因的轉錄。在一較佳實施例中，VEGF基因的轉錄可經由例 如改變内源性VEGF基因的調節序列（regulatory sequence)而加以降低，例如加入負向調節序列（如一轉錄 抑制子（repressor)之DNA-結合位）。

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在另一較佳實施例中，上述藥 抑制VEGF活性的小分子，Α:糸化口物，例如〆 導，或經由直接或間接盥一 vprp从^ 又的之Λ息傳 vEGF活性。 接。VEGF啟動子相互作用而降低 在一較佳貫施例中，上述抑制VEGF表現之荜劑可如下 列方式投與，如：經由局部措鱼#銥W T兄之糸Μ 了如下 與該藥劑，經由口服投盥該筚劊，十 、 也才又 f to v土达古士々a /又〇 ”豕樂劑，或經由注射投與該藥劍 (較佳為真皮或皮下注射）。在齡往本 ώ ~ ^ ^ ^ a ^ X θ L在杈佳κ施例中，該藥劑係經 $適口之傳送工具。較佳地’該藥劑係包含在一局部我

與之組合物中，該組合物可為如膠狀'膏狀、或液狀。該 t合物更可進一μ含一纟容品成份，例如彡#劑或防瞒 劑，如辛基甲氧基肉桂酸鹽（octyl methoxycinnamate)、 氨基安息香酸（aminobenzoic acid)、苯曱_ (oxybenzone)、苯甲酸（padimate 0)、hom〇salate、或二 氧化鈦（titanium dioxide)。組合物亦可包含一植物萃取 物，例如蘆薈萃取物或葡萄萃取物、組合物亦可包含維生 素’例如維生素A，如維生素A酸（retinal);維生素c， 如L -抗壞血酸（L-ascorbic acid)或L-抗壞血酸棕櫚酸鹽 (L-ascorbic acid palmitate);維生素E，如生育醇醋酸

鹽（tocopherol acetate)。在一較佳實施例中，抑制veGF 表現之藥劑係局部投與在一個體β在一較佳實施例中，足 量的上述藥劑係在紫外線Β照射前投與，例如在曰曬之 前，如此，在個體受紫外線Β照射時其體内已有一個抗血 管新生功能存在。

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第11頁 1233361 五 '發明說明（9) 另一較佳實施例中，哕雜 例如在數天中重複至少i 係重複投與於一個體的， 在一較佳實施例中，該藥劑 '5、10、20、或更多次。 例中，該藥劑每星期至少投蛊/技與的。在一較佳實施 期中，每星期或每天投與至=^圭者為在至少二星 投與至少長達1、2、3、4、5、 、或5次，更佳者為 劑係定期投與3至1 2星期，w ^ = Μ固月。舉例來說，該藥 較佳實施射，投與該個夏季。在― ί，其預防敵紋產生的部位可j; 產 :B下有毛髮覆蓋的頭皮處、或任“它=二卜 在一較佳實施例中，本發明之方 下列藥劑：可增加TSP_2活性之Is技與一或多個 藥劑，或可抑制VEGF活性之藥劑、。在° S加^卯-1活性之 與-或多個血管新生抑制劑，：如實施例中’投 抗血管新生抑制劑者。 或多個彳丨起或增加一

引起ί = = 徵係一種預防或治療紫外線B 引起之皮膚知傷的方法，例如一個體中因長 Β引起之皮膚損傷如敵紋。本方法包含在此個^上以例如 局部的方法投與一組合物，該組合物包含一足 :二：劑，例如一藥劑，如一小分子，丨可抑制一血管 新生釦子’以預防或治療紫外線Β引起 :個體”長期暴露紫外線Μ丨起之皮膚損傷：敵J如 在一較佳貫施例中’足夠量的該藥劑係在紫外線β照射之 l〇57-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第12頁 1233361 明說明（丨〇7~~ ' " -------' =與的’例如在日嘴前’如此在該個體受到紫外㈣照k 射8^ —抗血管新生的功能已經存在。 在一較佳實施例中，該藥劑係一化合物，例如一 子’其能引起TSP-2之功能。 在一較佳實施例中，該藥劑係一化合物，例如一小八 子，其能抑制VEGF之功能。 刀 在一較佳實施例中，該藥劑係投與於臉部、頸部'臉 =、耳朵、手、沒有毛髮覆蓋的頭皮處、或身體的任何^ 匕部位。治療可包含投與該血管新生抑制劑達一次以上、 例如至少2、3、或4次。治療亦可包括每日投與該血管 生抑制劑。 在一較佳實施例中，該血管新生抑制劑，例如增加或 弓丨起血管新生抑制因子的藥劑，係以一無菌組合物的形式 投與的。 在一較佳實施例中’該血管新生抑制因子係血管新生 抑制因子TSP-2。 在一較佳實施例中，該血管新生抑制因子係血管新生 抑制因子TSP-1。 在一較佳實施例中’該組合物更可進一步包含一美容 品成份，例如芳香劑或防曬劑如辛基甲氧基肉桂酸鹽、氨f 基安息香酸、笨甲闕、苯甲酸、homosalate、或二氧化 鈦。組合物亦可包含/植物萃取物，例如蘆薈萃取物或葡 萄萃取物、組合物亦町包含維生素，例如維生素A，如維 生素A酸；維生素C，如L -抗壞血酸或L -抗壞血酸棕櫚酸

1057-4747-PF(N);Chiumcow.ptd 第13頁 1233361 五、發明說明（11) —- 鹽’維生素E ’如生育醇醋酸鹽。 一較佳實施例中，該藥劑係重複投與於一 如在數5中重複至少i、2.、3、5、10、2〇、或更==。2 一較佳實施例中，該藥劑係長期投與的。在一二二 中，該藥劑每星期至少投與！次，更佳者為在至少二K &列 中，每星期或每天投與至少2、3、4、或5次，更佳者 與，少長達1、2、3、4、5、或6個月。舉例來說，該藥: 係定期投與3至1 2星期，例如連續投與整個夏季。在一μ 佳實施例中，本方法包含投與一或多個下列藥劑：一古 TSP-2活性之藥劑，一提高1^卜1活性之藥劑，、或一同 VEGF活性之藥劑。較佳實施例中係投與一或多個血= 抑制劑。 啊生

另一方面，本發明之特徵係一種預防或治療紫外線Β 引起之皮膚損傷的方法，例如一個體中因長期暴露 Β引起之皮膚損傷如皺紋。此方法包含確認一需要保護自 紫外線Β引起之皮膚損傷的個體，例如長期暴露在紫外線β 下而引起之皮膚損傷而需要防止皺紋的形&;對該個體投 與一血管新生抑制劑，例如一藥劑如一小分子，苴提昇或 導致一血管新生抑制因子的功能，或者一藥劑如二小分〆 子’其抑制-血管新生分子；及對該藥劑的投與進行其對 防止皺紋形成之功效的評價。上述對於一需要保護自紫外 線B引起之皮膚損傷的個體’例如長期暴露在紫外線b下而 引起之皮膚損傷而需要防止皺紋的形成，其確認動作可經 由’例如該個體提供、健康管理者提供，《由美容品提供

1233361 五、發明說明（12)

者提供。上述血管新生抑制劑之 , 彳又及其效果Ί平價可經 由，例如該個體提供、健康管理者接 、、、 者提供。 香挺供，或由美容品提供 在一較佳實施例中 在一較佳實施例中 在一較佳實施例中 在一較佳實施例中 生 ，血3新生抑制因子係TSP-2。 ，血官新生抑制因子係TSP-1。 该血官新生分子係VEGF。 敵、、文係因照射紫外線B輻射而產 在一較佳實施例中，該藥劑伤A如 施例中，該藥劑係在紫外線B照射在一較佳實 照前投與，如此在紫外線Β照射時瞢7 ^在日 經存在。 町 抗血管新生效用已 在一較佳實施例中，該藥劑俜晷 星期*，每星期或每天投與至；r3 V”為在至少二 為投與至少長達！、2、3、4、5 '或伽4曰、或5次’更佳者 在一較佳實施例中，該血管新 久于 -血管新生抑制因子活性之藥劑 盈：的例如-引起 劑，提高TSP-2活性之藥劑，提高m 個下列藥 活，可經由本文描述之提高Tsp_2活性之方之藥劑（TSP-1 提尚），或一抑制VEGF活性之藥二貝似方法 投與-或更多個也管新生抑制劑幻“佳貫施例中’

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五、發明說明（13)

另方面本發明之特徵為提供一種評估一測試化合 物引起抗血管新生蛋白質表現之能力的方法，該蛋白質可 為如TSP-1或TSP-2，其表現部位可為如皮膚内。本方法包 含：提供一細胞如一表皮細胞，其具有一轉殖基因 (transgene)，其包含一核酸，該核酸包含一與一抗血管 新生基因（如TSP-1或TSP-2)之調節區（如一啟動子）連結之 報導（reporter)基因，其中之報導基因不同於通常與該啟 動子連結之基因所表現之蛋白質；使上述細胞與一受測化 合物接觸並評估由報導基因產生的訊息，該訊息的存在或 強度係與抗血管新生基因在受測化合物調整下之表現量相 對應。受測化合物可為一蛋白質，一多胜肽、一小分子， 如一具有小於2000道爾頓之分子量，更佳者為小於1〇〇〇道 爾頓，之小分子。 在一較佳實施例中，報導子（reporter)係一可提供瑩 光訊息之分子。報導子可為，例如：蟲螢光素酶 (luciferase)、GFP、或BFP。在另一實施例中，該報導子 係一酶。 在一較佳實施例中，上述細胞係一培養細胞（cul ture cell)，例如一不老衰（immortalized)人類表，皮角質細 胞0 在一較佳實施例中’上述細胞係來自一基因轉殖動物 (transgenic animal)。 在一較佳實施例中，上述細胞係來自一基因轉殖動物 且受測化合物係投與於該基因轉殖動物身上，例如局部投

1057-4747-PF(N);Chiumcow.ptd 第16頁 1233361 五、發明說明（14) 與在該基因轉殖動物之皮膚中 在一較佳實施例中，上述方法 類動物中，活體（Μ “切）測試該化入包含在一人類或非人 物投與在動物身上，使該動物暴靈物例如’將該化合 該化合物之效果。 《紫外線8下’並評價 本發明之另一特徵為提供一種 管新生蛋白質表現之能力的方法，^價受，化合物抑制血 為如VEGF ,其作用部位可為如皮盧述血管新生蛋白質可 一細胞如一表皮細胞，其具有一轉 =方=包含··提供 酸，該核酸包含一與一血管新生土 ，其包含一核 (如一啟動子）連結之報導基因，其 碉知& 常與該啟動子連結之基因所表 報導基因不同於通 -受測化合物接觸並；=以；=質"吏上述細胞與 的存在或強度係與血管新： = ; = =整該訊息 現量相對應。受測化合物可為哲《 整下之表 1_道爾頓，之子道爾頓之分子量’更佳者為小於 子。dm:!，報導子係一可提供營光訊息之分 r: 例如：蟲螢光素酶(luciferaSe) ' 或jFP。在另-實施例中，該報導子係一酶。 丨^在一較佳實施例中，上述細胞係一培養細胞（culture cell)，例如一不老衰（imm〇rtaiized)人類表皮角 胞。 、 在一較佳實施例中，上述細胞係來自一基因轉殖動物 第17頁 1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 1233361 五、發明說明（15) (transgenic animal 在一較佳實施例中，上述細胞係來自一基因轉殖動物 且受測化合物係投與於該基因轉殖動物身上，例如局部投 與在該基因轉殖動物之皮膚中。 在一較佳實施例中，上述方法更包含在一人類或非人 類動物中’活體（仏Wvo )測試該化合物，例如，將令化人 物投與在動物身上，使該動物暴露於紫外線B下，並Λ僧7 該化合物之效果。 ° 、 本發明之另一特徵為提供一種組合物，其可預防 療紫外線B引起之皮膚損傷如敵紋。該組合物包含一血 新生抑制劑，例如一藥劑，如一小分子，其增加或引發— 血管新生抑制因子（如TSP-1或TSP-2)之活性；或者例如: 藥劑，如一小分子，其抑制一血管新生因子如VEGF之活 =，及一藥學上可接受載體。較佳者，上述組合物係無菌 在一較佳實施例中，藥劑為一化合物，例如一小分 子，其可引發TSP-2活性。 在一較佳實施例中，該組合物係局部投與。 在一較佳實施例中，血管新生抑制因子停Tgp — 2。 在一較佳實施例中，血管新生抑制因子係TSP一 1。 在一較佳實施例中，該方法包含投與一或多個下列 劑，提高TSP-2活性之藥劑，提高TSP〜1活性之藥劑，或二 抑制VEGF活性之藥劑。在一較佳實施例中，投與一或更; 個血管新生抑制劑。 夕

1233361 五、發明說明（16) 在一較佳實施例中，該組合物更可進一步包含一美容 品成份’例如芳香劑或防曬劑，如辛基甲氧基肉桂酸鹽、 乱基女息香酸、本曱酮、苯曱酸、h〇mosaiate、或二氧化 鈦。組合物亦可包含一植物萃取物，例如蘆薈萃取物或葡 萄萃取物、組合物亦可包含維生素，例如維生素A，如維 生素A酸，維生素C，如1^抗壞血酸或抗壞血酸掠櫚酸 鹽；維生素E，如生育醇醋酸鹽。

本發明之另一特徵為一種提供保護一個體免受紫外線 B引發皮膚損傷之方法，例如長期紫外線B曝曬引起之皮膚 損傷，如皺紋。此方法包含煶供該個體一組合物，其包含 一血管新，抑制劑，例如一藥劑，如一小分子，其增加或 引發一士管新生抑制因子（如Tsp—j aTSp-2)之活性；或者 例如一藥劑’如一小分子，其抑制一血管新生因子wVEGF 之活性；及提供該個體投與該組合物之指示，以避免或減 低紫外線B引起之皮膚損傷，如長期紫外線B曝曬引起之皮 膚損傷，如皺紋。 在一較佳實施例中，上述指示包含在日曬之前或曰曬 時，投與該組合物於皮膚之說明。

在一較佳實施例中’上述指示包含長期投與藥劑之說 明。在一較佳實施例中，指示中說明藥劑每星期應至少投 與1次，更佳者為在至少二星期中，每星期或每天投與至 少2、3、4、或5次，更佳者為投與至少長達1、2、3、4、 )、或6個月。舉例來說，該藥劑係定期投與3至i 2星期， 例如連續投與整個夏季。

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生抑制因子係TSP-2。 生抑制因子係TSP-1。 之藥劑係一化合物，如_ 活性。 物更可進一步包含一美$ 如辛基甲氧基肉桂酸鹽， 、h〇m〇salate、或二氧>(丨 物’例如蘆薈萃取物或崔 素’例如維生素A，如維 酸或L -抗壞血酸棕摘酸

在一較佳實施例中，血管新 在一較佳實施例中，血管新 在一較佳實施例中，所投與 小分子，其5丨起Tsp_2 *TSp—1之 在一較佳實施例中，該組合 品成份，例如芳香劑或防曬劑， 氨基安息香酸、苯甲酮、苯甲酸 鈦。組合物亦可包含一植物萃取 萄萃取物、組合物亦可包含維生 生素A酸；維生素c，如L -抗壞血 鹽；維生素E，如生育醇醋酸鹽。 在一較佳實施例中，該組合物包含一或多個下列藥 劑，提高TSP-2活性之藥劑，提高TSP-1活性之藥劑，或一 抑制VEGF活性之藥劑。在一較佳實施例中，盥一或更多 個血管新生抑制劑。 ’、〆 本發明之另一特徵為提供一種套組，用以預防一個體 因紫外線B而受到皮膚損傷，例如長期紫外線b曝曬引起之 皮膚損傷，如皺紋。該套組包含一組合物，其包含一血管 新生抑制劑，例如一藥劑，如一小分子，其增加或引發一 血管新生抑制因子之活性；及一投與該組合物之指示，用 以避免或減低紫外線B引起之皮膚損傷，如長期紫外線b曝 曬引起之皮膚損傷，如皺紋等。 在一較佳實施例中，上述指示包含在日曬之前或曰曬 時，投與該組合物於皮膚之說明。

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在一較佳實施例中，該組合物包含一或多個下列藥 劑，提高TSP-2活性之藥劑，提高TSP-1活性之藥劑，或一 抑制VEGF活性之藥劑。在一較佳實施例中，投與一或更多 個血管新生抑制劑。

1057.4747.PF(N);Chiumeow.ptd 第21頁 1233361 五、發明說明（19) 本文中，皺紋係指皮膚表面結構之改變。皺紋可能有 或沒有組織學上的特異結構改變。K1 igman et al. ( 1 985)在啟/·炎這 1 1 3:37-42所述為本文參考文獻，其 對敵紋之歸類有詳盡的描述。K1 igman將皺紋分為3類，線 紋（linear wrinkles)、縱溝紋（glyphic wrinkles)、及 波紋（crinkles)。線紋係直的，大多發現於臉部皮膚，且 係因自然老化及紫外線照射而形成。縱溝紋係三角形或方 形般的皺紋，出現在曝曬在日光下的臉部 '手部、及頸 部，且會因紫外線照射或皮膚日射症（dermat〇heli〇sis)

而加重。波紋係鬆弛皮膚上細小、捲曲之皺紋，出現在任 何部位的皮膚，但特別常見於手背及眼皮周圍。皺紋包括 線、細紋、波紋、烏鴉腳（crow，s feet)、或下垂。 「小分子」一詞在本文中包含胜肽、胜肽類似物、或 非胜肽化合物，例如有機分子，且其分子量少於2〇〇〇道爾 頓’更佳者少於1 00 0道爾頓。 4 =在本文中可指全部或部份減輕或消除一病症之症 。預防在本文中可指^預防，或 之症狀或影響。 則 ϋ ^中’長期紫外線B照射係指長期暴露於自然或 Φ ..ώ t二用於嘴黑或忐療之紫外線燈泡，如治癖 牛皮癖、遺傳性皮膚炎、或白斑' 裸 照射可為在一事先定義的時間內 ’長期 争古认間内’照射紫外線指數Η或 的曰，光’歷時至少10分鐘’經過至少3次、更佳者至 〉、5次、或至少1 〇次昭射。搴a a Μ …、 事先疋義的時間可為1個月、2

1233361 - 五、發明說明（20) 中累叶3昭個身月、6士個月、12個月、或24個月，例如在12個月 累^射5小時紫外線心射’如日光或人工紫外線β輻 為二：ί於^期紫外線引起損傷(如皺紋)風險中的個體可 少十八二經或將要在一年内接受至少十次，每次至 已經以i 或:射高照；或是-個體^ ^ US在三年的期間内，每年接受至少2〇ί，ίί至 鐘的紫外線請射。較佳者， ΓΛ?Λν照，或個體在夏季接… 兩至極高紫外線指數的曰子中接受 傷（如皺紋）風險的個趙包^ 首處ί住在兩於海平面至州⑽英吸者；居住在近 士 $處者，如居住在赤道1 000哩内者；一年内 :至外運動者，如參與慢跑、網球、$山、滑雪、或滑水 者，已經接受或將要接受紫外線B光療者。 / 詳細說明 紫外線B輻射照射 紫外線B的自然來源為自然日光。 度依一天中的時間、一年t的時間、/陽外在線天B = 2強 ίίίί及ί赤道的距離而有不同。輻射線總是存在甚 '也疋，然而在夏季正午時分為最強的。洛姑抵古 則紫外線β輻射線越強。因該，登山者、爺冋 在高海拔者都處於長期紫外線8引起損傷的=險中二同主 第23頁 1057-4747-PF(N);Chiumcow.ptd 1233361 五、發明說明（21) ----—------· 時’越靠近赤道紫外線輻射線越強，受到長期紫 傷的風險也越高。 雪、水、及沙反射曰光，放大到達皮膚之紫外線Β輻 射線的量。即使雲層遮避太陽時，紫外線Β的強度在長^ 照射下仍然可能達到可引起光老化的程度，例如皺紋。 务、外線指數（由環境保護局（Ε η ν丨r 0 n m e n f a 1 Protection Agency)制定）標示一天中太陽紫外線的強 度。其具有4個級數-輕度（紫外線指數低於3)、高度（紫外 線指數3至6)、極高度（紫外線指數6至1〇)、及超高（紫外 線指數高於1 0 )。輕度紫外線指數需要一小時以上才會曬 傷皮膚；超高度則會在1 5分鍾内曬傷皮膚。紫外線指數常 包含在氣象報告中。臨床上，紫外線B照射係以MED測量。 1 MED指在敏感皮膚中造成曬傷的紫外線β量。由於紫外線B 照射是可累積的，即使紫外線B的強度低於強烈照射下會 引起紅斑、浮腫、或曬傷的程度（例如低於1MED)，長期照 射仍可能產生皺紋。舉例來說，如果一個體長期照射的 光’即使只是在紫外線指數為輕度或低於輕度時照射，該 個體也有長期紫外線B引起皺紋的風險。 血管新生及長期紫外線B照射 光老化的皮膚具有下列特徵：表皮增殖：真皮彈性疲f 乏、及間質蛋白質衰退（5，38)，及靜脈周淋巴組織球性 真皮浸潤（perivenular lymphohistocytic dermal infiltrates )(23)。此處描述的結果揭露皮膚的長期紫 外線B照射伴隨著明確的皮膚血管新生及增生的表皮中

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第24頁 1233361 五、發明說明（22) VDGF表現量提高，且以TSP-1針對古膚士其虹止 τ耵皮贗血官新生的抑 避免紫外線B引起之真皮損傷及皺紋形成。 1 %』

Skh-Ι無毛鼠係一已建立的慢性光老化實驗模 (2 6 )’在接受1 0星期紫外線B照射後，出現明確 生及典型的表皮及真皮增殖之組織特徵，且伴隨直i 彈性纖維及膠原蛋白纖維瓦解率的上升。内皮接點分$中 CD31(endothelial junction molecule CD31) (39) 刀 之組織切片經由電腦量化影像分析（24)顯示，經過$ 外線B照射後，產生明顯的皮膚血管新生，且血管密产及' 血管尺寸均有顯著地增加。這些血管改變與皮膚傷口^人 時的血管新生狀態相當，其中原本存在的血管抽芽及^ 擴大使得富有血管之粒狀組織得以形成（24)。另一方面， 長期皮膚發炎症狀，如牛皮癬，主要顯現血管重組，具有 皮膚微血管增長及擴大的現象，但並無新血管抽芽。這些 發現心出皮膚經長期紫外線Β照射會產生長期性的組織修 復反應’這些發現並指出血管新生可能與紫外線Β引起皮 膚損傷的產生有關。 血管内皮生長因子（vascular endothelial grQwth factor， VEGF)已經確認為一主要的，角質細胞 (keratinocyte)衍生之皮膚血管新生因子（4〇),其在患牛 皮癬之皮膚（12)及其它伴隨皮膚血管新生之皮膚疾病 (14，41)的增殖表皮中，以及在傷口癒合後的新表皮中

(1 3，4 2 )，均有較高的表現量。在本文描述之實驗中，經 長期紫外線照射之皮膚中，其增殖表皮有明顯上昇的veGF

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第25頁 1233361

mRNA表現量，特別是基底上（suprabasal )之角質細 述發現與之前關於強烈紫外線B照射引發試管内貝^ ϋ ° (MW加）（43)(44)及體内（以)(7)人類表"皮角 VEGF表現之結果是相符合的。 行貝、，田肥 血管新生及長期紫外線B引起之皺紋

使具有皮膚專一性血管新生抑制因子^卜丨過曰 特徵之基因轉殖老鼠接受長期紫外線照射。投盘°一$已建立 之角質素14 (keratin 14，K14)啟動子組，針對表 質細胞之TSP-1轉殖基因表現，我們已在先前建立了 K14/TSP-1基因轉殖老鼠，其特徵為，在正常表皮及真皮 厚度及形態下，且在有效的皮膚血管新生抑制作用下的皮 膚傷口癒合過程，具有高量的表皮Tsp-1表現量（24)❶由 於K14基因在增殖的角質細胞中大量表現，投與n4啟動 子可確保表皮增殖的情況下轉殖基因的高表現量。在此， 實加例的描述揭露在表皮中過量的以？_1表現可有效地抑 制表皮受到光害（photodamage)，膠原蛋白及彈性纖維的 瓦解也受到有效的抑制，而皮膚皺紋則是被完全抑制。此 結，係與有效抑制皮膚血管新生，降低内皮增殖速度，及 提向内皮細胞凋零（apoptosis)相關連的。綜，合這些結 果’顯示抑制與修復相關之紫外線B引起的血管新生亦有 避免内皮光害（包含皺紋的形成）的效果。 先前的實驗顯示TSP-1經由第1類重複序列（type I repeats)中之特定序列片斷專一性地與内皮細胞上之CD36 受器父互作用，使得内皮細胞凋零速度增加（4 6 )。最近的

1233361 五、發明說明（24)

證據顯示TSP-1與其相關分子TSP_2類似，在其抗血管新生 功能的功能中’亦牵涉抑制基質金屬蛋白酶一 2 ( ma t r i X metalloproteinase-2，MMP-2)的活化（48，49)。這些結 果顯示另一個TSP-l可能降低紫外線b引起之皮膚血管新生 的機制，即抑制MMP-9活化。mmp-9係鋅蛋白酶家族（zinc proteinase family)中的一個成員，為分解細胞外間質構 成要素之分子，另外在紫外線照射之人類皮膚中，已證實 有MMP-9表現量及活性提高的現象（35，50，51)。 相反地，在長期紫外線B照射後，TSP-2剔除（knock out)老鼠出現較野生型（Wiidtype)老鼠多的敵紋。不過在 長期紫外線Β照射後，並沒有偵測到TSp-2剔除老鼠與野生 型老鼠在ΜΜΡ-9活性上有重大的不同。這些結果指出專一 性地抑制皮膚金管新生（與ΜΜΡ的效果相反）可能提供一避 免長期紫外線Β損傷（如皺紋）的一個新方向。 TSP之相似物 相似物（analogs)可能在胺基酸序列上或以不涉及胺 基酸序列的其它方式，或兩者上與自然產生之Tsp — 1或 TSP-2相異。非序列修飾包含活體内（ )或試管内 ()之TSP-1或TSP-2衍生物。非序列修飾包含乙酿 化、甲醇化、磷酸化（phosphorylation)、羰基化、或醋 化（glycosylation)等改變。 較佳之相似物包含TSP-1或TSP-2(或其具生物活性之 片斷）’其序列與野生型序列有一或多個保留性 (conservative)胺基酸取代的不同，或有一或多個並不會

1057-4747-PF(N);Chi umcow.ptd 第27頁 1233361 五、發明說明（25) 破壞T S P - 1或T S P - 2生物活性之非保留性胺基酸取代、刪 除、或插入的不同。保留性取代單位通常包括以一胺基酸 取代另一個具有類似性質之胺基酸’例如下列的群組： <p20，#1>。其它保留性取代可取自下列表格中。 表1

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 胺基酸 竹Pfg 付萌 可被下列取代 胺基丙酸 A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys 精胺酸 R D-Arg, Lys, -Lys,同 Arg, D-同 Arg, Met, lie, D~Met, D-Ile, Orn, D-Orn 天門冬醢胺 N D-Asnf Asp/ D-Asp, Gill, D-Gluf Glnf D-Gln 天門冬酿胺酸 D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D - Gin 半腕胺酸 C D-Cys, S-Me-Cys f Met, D-Met, Thrf D-Thr 麩胺酸 E D-Gln, Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp 涵酸醯胺 Q D-Gluf D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln 甘胺酸 G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, beta-Ala, Acp 吴白胺酸 I D-lie, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met 白胺酸 L D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met 離胺酸 K D-Lys, Arg, D-Arg,同 Arg, D-同 Arg, Met, D-Met, lie, D-Ile, Orn, D-〇rn 甲_酸 Μ D-Met, S-Met-Cys, lie, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val ’ 苯胺基丙酸 F D-Phe, Tyr, D~Thrf L-Dopa, His, 胺酸，順-3,4,或5-苯基脯胺酸 脑胺酸 P D-Pi:o, L-Ι-硫雜氣嗤症_4_羧酸，D-或L-1-噁唑啶-4-羧酸 第28頁 1233361 五、發明說明（26) 絲胺酸 S D~Ser:, Thr, D-Thr,別-Thr, Met, D-Met, Met (0) , D~Met(0)f L~Cys, D~Cys 息寧胺酸 T D-Thr, Sei:, D-Sei:,別-Thr, Met, D-Met, Met(0), D-Met(0)f L-Cys, D-Cys 酪胺酸 Y D-Tyr, Phef D-Phef L-Dopa, His, D-His 纈胺酸 V D~Val, Leu, D~Leu, lie, D-lie, Met, D - Met 本發明中的其它相似物係可增加胜肽穩定性之修飾， 此類相似物可包含，例如在胜肽序列中，一或多個非胜肽 鍵（peptide bond)(以取代胜肽鍵）。另外也包含··具有自 然產生胺基酸之外的殘基的相似物，如卜胺基酸或非自 然產生或合成之胺基酸，如沒或7胺基酸；及環狀相似 物0 片斷及相似物之製備 片斷之產生 一蛋白質之片斷 蛋白質分解消化、或 斷可以經由從一編碼 兩端（内部片斷）移除 表現產生多胜肽之片 產生編碼一片段陣列 可由隨機切斷、限制 片斷亦可採用本 如傳統之Merrifield 本發明之胜肽可任意 分成所需長度且重疊 可經由數種方式製備，例如，重組、 化學合成。一多胜肽之内部或末端片 5亥多胜肽之核酸上一端（末端片斷）或 一或多個分子而取得。該突變DN A之 斷。以M end-nibbl ing”内切酶消化可 的dna。編碼一蛋白質之片斷的DNA亦 酶消化或上述方式之組合而取得。 領域中熟知之化學合成技術取得，例 固，f〜Moc或t-Boc化學。舉例來說， 地刀成所需長度且不重疊之片斷，或 之片斷。

1233361 五、發明說明（27) 相似物之產生：以隨機方式修改DNA及胜肽序列的生產 一蛋白質之胺基酸序列變異可由含有一蛋白質或一蛋 白質之特定部分或區域之DNA的隨機突變而製備。有用的 方法包含PCR突變及飽合突變（saturation mutagenesis)。一隨機胺基酸序列變異資料庫亦可由一系 列退化寡核苷酸序列之合成而產生。（在一變異資料庫中 篩選蛋白質之方法將在本文他處說明。） PCR突變 PCR突變中，以低準確度Taq聚合酶使一DNA轉殖 (cloned)片斷產生隨機突變（Leung et al.，1 989， φ

Technique 1:11-15)，為一效力強大且較快速之造成隨機突 變的方法。需要被突變之DNA區域係在降低Taq DNA聚合酶 合成DNA準確度的條件下，由聚合酶連鎖反應（pcR)大量增 殖，例如投與dGTP/dATP比例為5且在PCR反應中加入Mn2+。 所得之增殖DNA片斷接著插入適當的轉殖載體以形成隨機 突變資料庫。 飽合突變 飽合突變允許短時間内在轉殖DNA片斷中形成大量的 單一鹼基取代（Mayers et al·，1 9 85，如娜亡 \ 229:242)。此技術包含產生突變，例如在試管中以化學處 f 理或以放射線照射單股DNA，並合成一互補DNA。突變率可 由調整處理方式的強烈程度而改變，基本上，所有可能的 鹼基取代都可以此方法取得。由於此方法對於突變並不作 基因上的選擇，具有不影響功能之取代的片斷及具有影響

1057-4747-PF(N) ;Gii umeow.ptd 第 30 頁 1233361 五、發明說明（28) 功能之取代的片斷皆會產生。點突變（point mutation)之 分佈並不會傾向保留性序列。 退化寡核苷酸 一同源（homologs)片斷之資料庫亦可經由一組退化募 核苷酸產生。退化序列之化學合成可在一自動化DMA合成 儀中進行，合成基因再接進一適當之載體。退化寡核苷酸 之合成技術在本領域是熟知的（請參考如：Narang，SA ( 1 9 8 3) Tetrahedron 39:3; Itakura et a 1. , (1981)

Recombinant DNA. Proc 3rd Cleveland Srmpos, MaccOmolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et ah ( 1984) Anna. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. ( 1 9 83) Nucleic Acid Res. 11:477)。此類技術已應用在其它 蛋白質之發展（例如：Scott et al· (1990)24 9 : 386-390; Roberts et al. ( 1 992 ) pnas 89:2429-2433； Devlin et al. ( 1 990 ) Science 249:404-406; Cwirla et al· ( 1 990) /ms 87:6378 - 6382;及美國專利第 5,223,409 及5, 096，815 號）。 相似物之產生：以直接突變改變DN A及蛋白質序列的生產 非隨機突變，又稱為直接突變（directed mutagenesis)技術可提供特定區域之專一性序列或突變〇 此技術可用於產生不同的變異，包含如：一已知蛋白質核 酸序列中殘基之刪除、插入、或取代。突變之部位可個別 或依續修飾，例如以下列方式進行··（ 1)先取代保留性胺

1057-4747.PF(N);Chiumcow.ptd 第31頁 1233361 五、發明說明（29) 基酸，再依據所得結果作調整，（2 )刪除標的殘基，或（3 ) 在目標區旁插入一同類或不同類之殘基，或方式丨_3之組 合0 胺基丙酸掃描突變 胺基丙酸掃描突變（alanine scanning mutagenesis) 是一有效確認蛋白質中較佳進行突變之殘基或區域的方法 (Cunningham and Wells {science 2 44:1 081 -1 085, 1 9 8 9 )。在胺基丙酸掃描中’一標的殘基或區域被確認（例 如，帶電單位如Arg，Asp，His，Lys，或Glu)並以一中性 或帶負電荷之胺基酸取代（最佳者為胺基丙酸或苯胺基丙 敗）。一個胺基酸的取代可以對該胺基酸與在細胞内或細 胞外週圍水性環境的互動產生影響。對於取代單位顯示功 能性敏感的區域’再以進一步或其它在取代位置的變異加 以調整。如此，在引進一胺基酸序列變異的位置為預先確 定的同時’其產生之突變的特性則不需是預先確定的。舉 例來說，為使一位置上之突變達到最佳的效果，胺基丙酸 掃描或隨機突變可以在標的密碼子或區域進行，且其表現 的所需蛋白質次單位變異經過掃描而選出具有所需活性的 最佳組合。 寡核苷酸-媒介突變 1 募核苷酸-媒介突變係一有用的製造DNA取代、刪除、 及插入變異的方法，參考，如，Adelman et al·,(侧 2: 183， 1 983)。簡單來說，所需的DNA係由一編螞突變之 募苷核酸與一DNA模板雜交而改變，其中該模板係一取自

1057.4747-PF(N);Chiumcow.ptd 第32頁 1233361 五、發明說明（30) 質體（plasmid)或嗟菌體（bacteriphage)之單股核酸，質 體或嗟囷體則含有未經改變或天然的，具有所需蛋白質編 碼之DNA序列。雜交後，利用一DNA聚合酶合成模板的完整 第二互補股，此第二互補股因此含有募核苷酸引子與具有 所選擇之改變的蛋白質DNA。一般而言，會投與至少25核 苷酸長度之寡核苷酸。一最有效之寡核苷酸為在兩端各含 有1 2至1 5個與具有該突變之模板完全互補之核苷酸者。如 此可確保寡核苷酸將與該單股DNA模板分子正確地雜交。 上述募核苷酸可由本領域中熟知之技術合成，如Crea e1：

al·， （Proc· Natl· Acad· Sci· (1978) USA, 75:5765) 所述者。 卡夾突變 另一個製備變異之方法為卡夾突變（cassette mutagenesis)，其係以Wells et al·((；咖（1 985) 34 :315)所述之技術為基礎。起始材料為一質體（或其它載 體），其包含將被突變的蛋白質次單位之DNA\確認將進行 突變之蛋白質次單位DNA中的密碼子，確認的密碼子兩側 至少t有一特定限制内切核酸酶位置。如果沒有此類限制 位置存在，可由前述寡核苷酸-媒介突變在該蛋白次單位 DNA中的適當位置產生。在質體中取得限制位 制位置將質體切斷以使其線化，投與標準技術製備— 在入限 上述限制位置之間DNA序列但具有所需突變之雙股募3 酸。其兩股係分別合成再以標準程序雜交，/甘 寡核苷酸即稱為卡夾。該卡夾俦_ 斤$成之雙股 Q下人3卞火係叹叶為具有與上述線化質

1233361 五、發明說明（31) λα之^尾i 才目當的q e， 接。所得質體因而勺人舳，如此即可直接為卡夾與質體連 組合突變、 i 3所需的蛋白次單位DNA突變序列。 群组C可用來產生突變。舉例來說，將-同質物 社士 L/、匕相關蛋白質之胺基酸序列排列，較佳者A侣推 在排列序列中的-個=== *組合突= 資料庫係 职舉彳j來說，一合成寡核苷酸混合物可由酵素連結 土 列，使得該潛在序列之退化組可以表個胜 肽巧者-組較大之含有該退化序列組之融合別胜 初級尚產量篩選胜肽片斷或同質物資料庫之方法 f領域中有數種已知的方法可用於筛選突變基因產 物。篩選大型基因庫之技術常包含將基因庫無性繁殖 (cloning)成可複製之表現載體，且在適當的條件下進疒 基因表現，使得所需活性之偵測，三聚體分子之組成斑 自然配位體（l igand)之結合，如一受體或基質，使得編與 被偵測產物之基因的載體易於被分離。下文中敘述的每碼 技術都可勝任高產量分析以篩選大量的序列，如 ^， 變產生之序列。 ， &機大 雙雜合系統 雙雜合（two hybrid, interaction trap)分析可用 確認一與VEGF互動之蛋白質。這些蛋白質可包含促效齊彳於 (agonists)，及拮抗劑（antagonists)。（個體蛋白及— 1057-4747-PF(N);Chiumcow.ptd 第34頁 1233361 五、發明說明（32) 其交互作用之蛋白係用作餌蛋白（bai t Proteins)及魚蛋 白（fish proteins))。此分析係依靠偵測一功能性轉錄活 化劑經由蛋白-蛋白互動與一餌蛋白的重組而達成。特別 是，此類分析係利用欲合基因（chimeric genes)，其表現 雜交蛋白。第一雜交包含一 DN A—結合區，其與餌蛋白，如 一 TSP-1或TSP-2分子或其片斷，是融合在一起的。第二雜 合蛋白包含一轉錄活化區’其與「魚」蛋白融合，如一表 現資料庫。如果魚蛋白及餌蛋白可以交互作用，即可使 DNA-結合蛋白及轉錄活化區互相接近，導致一報導基因 (reporter gene)的表現’此報導基因係在操作上與一轉 錄調節位置相連，而該轉錄調節位置則由該DNA-結合區識 別。該報導基因之表現可被偵測並用來評估該餌蛋白與另 一蛋白互動的程度。 陳列資料庫 一篩選分析之方式中，候選胜肽係陳列在一細胞或病 毒分子之表面，而特定細胞或病毒分子經由該陳列之產物 與一適當的受體蛋白結合的能力則由一「鑲嵌分析」 (panning assay)偵測。舉例來說，基因庫可被複製到一 細菌細胞之表面薄膜蛋白的基因中，所得之融合蛋白即可 由鎮嵌測得（Ladner et al·，W0 8/06630; Fuches et a 1. ( 1 99 1 ) Bio/Technology 9 : 1 3 7 0」1 371 ;及Goward e t a 1 · (1 992) 18:136-140)。一^可偵測標識配位體（ligand) 可用於評估潛在的功能性胜肽同質物。螢光標識配位體， 例如受體，可用於偵測保有配位體-結合活性之同質物。

1233361 五、發明說明（33) 螢光標識配位體的使 胞，或者，若細胞的 類器加以分離。 用允許以螢光顯微鏡觀察及分離細 形態允許，可利用一螢光活化細胞分

基因庫叮在一病毒表面以融合蛋白的形式表現。舉 例來說，絲狀噬菌體系統中，夕卜來胜肽序列可在感染噬菌 艘，表面上表現’提供了兩個重要的優點。第一，由於此 嗟菌體可應用在親和基質，其濃度可高於每毫升個噬 菌體，大量噬菌體可同時進行篩選。第二，由於各感染噬 菌艘在其表面展示一基因產物，如果一特定由親和基質中 取得的嗟菌體只有低產量，該嗟菌體可經由另一個感染循 環增殖。一組幾乎一致的五絲狀噬菌體以3，fd.及丈i 為最常用於噬菌體陳列資料庫者。噬菌體gI〖丨或"丨〖I包 覆蛋白之任一個皆可用於產生融合蛋白而不會對病毒粒子 的基本結構造成破壞。外來抗原決定位（epit〇peS)可表現 在Ρ Π I之NHZ-端及由一過量缺乏此抗原決定位之噬菌體中 重新取得具有此抗原決定位之嗟菌體（Ladner etal. pey publication WO 90/02909; Garrard et al·， PCT publication WO 92/09690; Marks et al. (1992) J. Biol. Qim. 267: 16007-16010; Griffiths et al· \

( 1 993) EMBOJ 1 2:725-734; Clackson et ah (1991) Afetore 352:624-638;及Barbas et al· (1992) /ms 89:4457-4461) 〇 一常用之方式為利用i： 麥牙糖受器（外膜蛋白

LamB)作為胜肽融合的另一半（Charbit et al· (1986)

1057-4747-PF(N) ;Qiiumcow.ptd 第36頁 1233361 五、發明說明（34) Μ如5， 30 1 6-3037 )。寡核酸可插入一具有LamB基因之質 體，以產生與該蛋白之細胞外環狀結構結合之胜肽。這些 胜肽可與配位體結合，例如，抗體，而且，當該細胞被引 進動物體内時可引起免疫反應。其它細胞表面蛋白，如 OmpA (Schorr et al. (1991) Vaccines 91 , PP. 387-392) > PhoE (Agterberg et al. ( 1 990 ) Gene 88 ,

3 7-45)，及大型的細菌表面結構亦可作為胜肽陳列的承載 體。胜肽可與菌毛蛋白（pilin)融合，菌毛蛋白係一蛋白 質，其聚合而成纖毛-a (pilus-a)以導引菌體間基因資訊 的交換（Thiry et al· (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55, 984-993)。由於其在與其它菌體互動的角色，纖毛為胜肽 在細胞外環境的陳列提供一有用的支持。另一個投與在胜 肽陳列的大型表面結構為細菌的推動器官，鞭毛 (f lagel lum)。將胜肽與其次單位蛋白鞭毛融合，可在宿 主細胞上形成具有許多複製多胜肽之高密度陣列 (Kuwajima et al. ( 1 988) Bio/Tech. 6，1 0 8 0 - 1 0 8 3 )。其 它種細菌之表面蛋白亦可用來進行多胜肽融合，例如葡萄 球菌之蛋白A及奈瑟氏菌（此/岛e/7· »3 )之外膜蛋白酶IgA (Hansson et al. ( 1 992) i BacterioL 174， 4239-4245 及 Klauser et al. ( 1 990) EMBO J. 9，1 99 1 -1 999 ) 〇 在上述絲狀嗟菌體系統及LamB系統中，胜肽與其編碼 DNA之間的物理連結係因一在其表面上帶有該胜肽之粒子 (細胞或嗟菌體）感染該D N A而發生的。捕捉該胜肽時即捕 捉該粒子及其中的DNA。另一個方式係利用DNA—結合蛋白 1233361 發明說明（35)

LacI形成一胜肽與DNA之間的連結（Cull et ai· (1 PNAS USA 89: 1 865- 1 869 )。此系統採用一含右I * 2 ) 己W LdC i基因之 質體，該LacI基因在3’ -端則具有寡核苷酸無性繁殖點。 在樹膠醛醣（arabinose) 的控制引發下，可產生—/ 胜肽融合蛋白。此融合保有LacI與一稱為Lac〇操縱^ (operator)之短鏈DNA序列結合的能力。經由扃本ιθ 、、工阳％农現質體 中安置兩個LacO，上述LacI-多胜肽融合體與該質體 、 緊密的結合。由於每個細胞中的質體只具有單一個/ 酸，且每一細胞只表現單一個胜肽序列，該胜肽便 f = 且穩定地與引導其合成之DNA序列形成連結。資料庫 胞經過溫和地溶解，使胜肽-DNA複合體暴露在一固 基質中，以重新取得含有活性多胜肽之複合體。相=二= 體DNA接著重新引進細胞中進行增殖及DNA定序， 、 B4： 肽配位體的特性。作為此方法粒子應用之示範，一 1 十二胜肽隨機資料庫被建立起來，並由一抗類鸦片 里的 (opioid)胜肽強啡肽B (dynorphirl B)之單株抗體選 濾。一胜肽群由此重新取得，其皆與強啡肽B之一 6 '過口 域具有一致序列的關聯（Cul 1 et al. ( 1 992 ) 土區

Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 89- 1 869 )。 此程序有時亦稱為質體上胜肽 ’ (peptides-on-plasmids),與噬菌體陳列的方法有 同點。第一，胜肽係連接到融合蛋白的c-端，使得=不 成員以具有自由羰基端的胜肽陳列出來。絲狀噬二f 蛋白pi I I及pVI I I皆經由C一端固定在噬菌體上， 匕i

1233361 五、發明說明（36) 肽係置於向外伸展的N—端區域。在某些設計中，陳列於噬 菌體上之胜肽係緊鄰在融合蛋白的氨基端。（Cwirla，et： al· ( 1 990 ) Proa Natl. Acad. Sci. U.S. A. 7, 6378 - 6382)。 第二個不同點是誤差對實際上存在於資料庫中的胜肽具有 影響。Lac I融合分子對宿主細胞質有限制作用。轉錄過程 中，噬菌體包覆融合蛋白短暫地暴露在細胞質中但會快速 地自内層薄膜分泌至前原生質隔間（preplasmic compartment)中，同時經由其c一端恐水區保持固定在薄膜 上，而其N-端則含有融合之胜肽，伸進前原生質中，等待 被集結成噬菌體粒子。Lac I及噬菌體資料庫中的胜肽可能 會有重大的差異，這是它們暴露於不同蛋白分解活性中所 導致的。在併入噬菌體前，噬菌體包覆蛋白需要被傳送過 内層薄膜及經過單一胜肽酶的處理。某些胜肽對這些過程 具有負面影響，因而在資料庫中的表現量會降低（GaU〇p et al. ( 1 994) jm Med. Chm. 3 7 ( 9 ) : 1 2 3 3 -1 2 5 1 )。這些誤差 對LacI陳列系統並不造成影響。 一、 可用在重組隨機資料庫中之小胜肽的數量是非常龐大 的。含有1 07 -1 09個獨立轉殖系的資料庫是常被製備的。含 有多達1〇1〗個重組的資料庫亦被創造過，但已接近轉殖操 作上的尺寸限制。這種資料庫尺寸上的限制係發生在轉染 含有隨機片斷之DNA到宿主細胞的步驟◊為了避免這個限 制，一立基於新生胜肽在多核醣體（p〇lys〇me)複合體陳列 的試管内系統已被發展出來。此陳列資料庫方法具有產生 比目前噬菌體/噬菌體質體或質體資料庫要大上3至6次方 1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第39頁 1233361 五、發明說明（37) 之資料庫的潛力。而且，此資料庫的組成、胜肽之表現、 及篩選皆在不採用細胞的狀態下完成。 本方法之一應用中（Gallop et al· ( 1 994 )

J· Med. Cheat. 37(9):1233-1251)，建立一具有 j〇i2 個十二 胜肽之DNA資料庫，且使此資料庫表現在一£⑵"s3〇試 管内連結轉錄/轉譯系統中。經由選擇使核醣體待在mRNA 上的條件，使得大量RN A聚積在多核醣體中並產生新生胜 肽與其編碼RN A連接在一起之複合體。這些多核醋體的量 足以在固定受器上被親和純化，其純化方法與較常見的重 組胜肽陳列資料庫的篩選方法類似。RNA由被補人 體中重新取得，轉化成cDNA，並以PCR增殖 驟之合成與篩選的模板。此多核醣體陳列方法可與噬菌體 陳列系統一起採用。在數個循環的篩選後，將經過增殖多 =醣體之eDNA m菌體f體載體。此載體係作為一胜 肽表現載體，以陳列與包覆蛋白融合之胜肽，其亦具有 DNA疋序載體的角色，以為胜肽確認之用。

上表現該衍生自多核醣體之胜肽，可繼績進行親在和二 j，或刀析個別種株系申之多胜肽在噬菌體el I 中的結 。活性，或在完整ELISA中測試其結合專一性ρπΜ，et a . ( 1 992) AnaL Biochent 204, 35 7-364)。活性胜月大之序 列的則可由嗟菌體質體宿主產生之腦的定序序 則文所述之南產量分析可由一二級篩選接續以確認進 ’的生物活性，例如，使得熟習此領域者能分辨促效劑 1233361

及扣抗劑。二級篩選的方式視 來說，可發展一分姑古、1二汀而刀析之活性而定。舉例 J 士展刀析方法，使得抑制一特定蛋白乃1处主 配位體之間互動的能力可用來將拮級撰 之-方法選出之胜肽片斷群中分離出來。由心級師選 因此，產生片斷及相似物及對其活 2域所熟習…旦所需的主要序列被確 似物及片斷應是熟習本領域者可執行的。 ' 胜肽擬態 、本發明亦提供減少TSP-1或TSP-2多胜肽之蛋白質結合 位以產生擬態，例如胜肽或非胜肽藥劑。請參考如：ΰ 「Peptide inhibitors 〇f human papiii〇mavirus protein binding to retinoblastoma gene protein」， 歐洲專利申請書EP 0 41 2 762及EP 0 03 1 080。 關鑑殘基之非可水解胜肽相似物可利用苯二氮平 (benzodiazepine)(參考如Freidinger et al·

Peptide: Chemistry and Bioloby, G· R· Marshall ed. , ESCOM

Publisher: Leiden，Netherlands， 1 988 )，氮平 (azepine)(參考如Huffman et al·

Marshall ed·， ESCOM 1 988)，取代τ内醯·

Peptide： Chemistry and Bioloby, G. R. Publisher: Leiden， Netherlands， 胺環（Garvey et al· Peptide： Chemistry and Bio loby, G · R ·

Marshall ed·, ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands， 1988)，酮-亞曱基前多胜肽（Ewenson et al· ( 1 986 ) J Med Chem 29 : 295 ;及Ewenson et a 1·，

1233361 五、發明說明（39)

Peptide： Structure and Function (Porceedings of the 9th .

American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co.

Rockland· IL，1985)，b-旋轉胺醇（Gordon et al. (1 9 8 5 ) Biochem Biophys Res Conmun 126:419;及 Dann et al (1 9 8 6 ) Biochem Biophys Res Comun 134:71)而產生。 融合蛋白 用於調控TSP-1或TSP-2蛋白含量之多胜肽可與另一蛋 白或其部分加以融合。舉例來說，TSP-1或TSP-2蛋白或其 部分可在操作上與另一多胜肽的一部分連接使溶解性得到 加強。可與TSP-1或TSP-2蛋白或其部分融合之蛋白的例子 包含蛋漿蛋白或其片斷，其可改善VEGF之循環半衰期。例鼸 如，融合蛋白可以是TSP-1或TSP-2-免疫蛋白球（Ig)融合 蛋白’其中之TSP-1或TSP-2序列係與一衍生自免疫蛋白球 超家族之序列融合。數種可溶性融合蛋白結構已被揭露， 其中一細胞表面糖蛋白之細胞外區域係與免疫蛋白球之恆 常 F(c)部分融合。例如，Capon et al. ( 1 989 ) Nature 337(9):525 - 531中提供一將CD4與一免疫蛋白球（i gGl)融 合而產生更持久之CD4相似物之指導。參考，Capon et al·，美國專利 5, 116, 964 及5, 428, 1 30 (CD4 - I gG 融合構 成）；1^115167 6{31.,美國專利5,434,1 31 (1：1'1^4-186及^| B7 - IgG 融合構成）；Linsley et al:， （1991) / AW· 174:561-569 (CTLA4-IgG 融合構成）；Linsley et al·， (1991) J. Exp. Med 1 73 ·· 72 卜73 0 (CTLA4 - I gG 及B7 - I gG 融 合構成）。此類融合蛋白已被證實對調控受器—配位體互動

1057-4747-PF(N);Qiiumeow.ptd 第 42 頁 1233361 五、發明說明（40) 及在活體中減低發炎是有用的。舉例來說，具有細胞表面 腫瘤壞死因子受器（TNFR)蛋白之細胞外區域與一免疫蛋白 球恆常F ( C )部分融合之融合蛋白已被使用於活體中。參考 如，Moreland et al· ( 1 997) Λ 表取人 乂^ 337(3) : 141-147;及 van der Poll et al· (1997) 89(10):3727-3734)。 反義核酸序列

與一編碼有血管新生促進正向因子如VEGF之核酸呈反 義（antisense)之核酸分子，可用在此處描述之方法中作 為抑制血管新生之藥劑。一「反義」核酸包含一與具有一 正向血管新生因子（如VEGF)編碼之「順義」（sense)核酸 互補核苷酸序列者，例如與一雙股cDNA分子或與一mRNA序 列互補者。因此，一反義核酸可與一順義核酸形成氫鍵。 此反義核酸可與一完整之VEGF編碼股互補，或者只與其部 分互補。舉例來說，一與VEGF編碼股之核苷酸序列呈反義 之反義核酸分子即可投與。

編碼VEGF之編碼股序列是已知的。有了編碼VEGF之編 碼股序列，反義核酸可依據W a t s ο η及C r i c k驗基配對規則 而設計。反義核酸分子可與完整VEGF之mRNA編碼部分互 補，但較佳地是一只有與部分VEGF之mRNA密碼或非密碼區 域呈反義之募核苷酸。舉例來說，反義募核苷酸可與VEGF 之mRNA轉錄起始點附近的區域互補。一反義寡核普酸可 為，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45、或 5 0個核苔酸長。一反義核酸可利用本領域中已知之化學合

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第43頁 1233361 五、發明說明（41) 成及酵素連接反應構建而成。舉例來說，一反義核酸（如 一反義募核苷酸）可採用自然產生之核苷酸或數種修飾核 苷酸之設計，經由化學合成，以提高其分子之生物穩定性 或提高反義與順義核酸之間雙重形式之物理穩定性，例 如，硫代磷酸脂（phosphorothioate)衍生及吖啶 (acridine)取代核酸皆可採用。可用來產生反義核酸之修 飾核苔酸包含5-氟尿嘴咬（5-fluorouracil)，5 -漠尿喷咬 (5-bromouracil), 5 -氣屎嘴唆（5-chorouracil)，5-埃尿 嘯咬（5-iodouracil)，次黃嘌吟（hypoxanthine)，黃嗓吟 (xanthine)，4-乙醯胞嘴咬（4-acetylcytosine), 5-(幾 基經基甲基）尿喊咬（5 -（ c a r b ο X y h y d r ο X y 1 m e ΐ h y 1 ) uracil), 5-羰基曱基胺基曱基一2-硫代尿苷 (5-carboxymethylaminomethyl -2 - thiouridine)，5 -獄基 甲基氨基甲基尿，咬 (5-carboxymethy laminomethyluraci 1 )，去氫尿嘧啶 (dihydrouracil )，beta-D-galactosylqueosine，肌核普 (i nos i ne)，N6 - isopen tenyl adenine，1- 甲基烏糞膘呤 (1-11^1：1^1忌11&1^116)，1-曱基肌核苷（卜11^1：1^11110 31116)， 2,2-二甲基鳥糞膘吟（2,2-dimethylguanine)， 2- 曱基腺 嘌呤（2-methyladenine)，2-甲基烏糞膘呤 (2-methylguanine), 3-甲基胞嘧啶（3-methylcytosine)， 5-甲基胞喊咬（5 -methylcyctosine), N6 - 腺嗓吟 (N6-adenine )，7-曱基鳥糞膘吟（7-me thy 1 guanine )，5-曱基氨基甲基鳥糞月票〇令（5-methylaminomethyluracil)，

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第44頁 1233361 五、發明說明（42) 5-曱氧基氨基曱基-2_硫代鳥糞膘呤 (5-methoxyaminomethyl-2-thiouraci1)， beta-D-mannosylqueosine，5’ -甲氧基幾基甲基尿喊咬 (5’ -methoxycarboxymethyluracil)，5- 甲氧基尿喊咬 (5-methoxyuraci1), # 2 - methylthio-N6 - isopentenyladenine，尿嘴咬-5-基基 醋酸（v) (uracil-5-oxyacetic acid (v))， wybutoxosine，pseudouracil，queos i ne, 2-硫代胞嘴咬 (2-thiocytosine)，5-甲基-2-硫代尿嘧啶 (5 - methyl-2-thiouracil), 2 -硫代尿嘴咬 (2-1±1〇11『8(^1)，4-硫代尿嘧啶（4-1;111〇1^&〇^1),5-甲基 尿嘧啶（5-methyluracil), 尿嘧啶-5 -氧基醋酸甲脂 (uracil - 5-oxyacetic acid methy lester),尿喷咬-5-氧 基醋酸（v) (uracil - 5-oxyacetic acid (V))，5-甲基 -2 -2 硫代尿嘧咬（5-methyl-2-thiouracil)，3-(3 -氨基 -3-N-2 -幾基丙基）尿喊咬（ 3-（3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil), (acp3)w, 及2,6-二氨基嘌呤（2,6-(11&111111〇0111^116)。另外，反義核 酸可經生物方法，使用一含有以反義的方向嵌入之核酸的 表現載體產生（即，由該嵌入核酸轉錄之RNA將與標的核酸 呈反義。 投與 一調控血管新生之藥劑，例如，一血管新生抑制劑， 如’TWP-1或TSP-2，或一調控TSP-1或TSP-2之藥劑，可在

1057-4747-PF(N)；Chiumcow.ptd 第45頁 1233361 五、發明說明（43) " -- .$ 上以標準方法投與。例如，此藥劑可由數種不同方 式技與包含’靜脈内、皮内、皮下、口服（如吸入）、經 由皮膚（局部），及經由肌肉投與。在一實施例中，TSP-1 或TSP-2或其調控藥劑可局部投與。 調控TSP-1或TSP-2蛋白含量之藥劑，例如TSP-1或 TSP一酸分子，TSP一 1或TSP-2多胜肽、片斷或相似物， UP — 1或TSP —2調控子，及抗-TSP-1或TSP-2抗體（在此亦作 為「活，化合物」）可被併入適於投與在一個體（如人類） 身上之藥學組合物中。此類組合物典型地包含上述核酸分 子三多胜肽、調控子，或抗體及一藥學上可接受之載體。 「藥學上可接受之載體」在此包含任何及所有，溶劑、懸浮 介質、塗層'抗生素及抗黴藥劑、等張（13〇1;〇111幻及吸收 延遲劑、及其類似物，與藥學投與為相容的。此類用於藥 學活性物質之介質及藥劑係已知的。任何常用之介質或藥 劑，除了與活性化合物不相容者之外，皆可用在本發明之 組合物。補充之活性化合物亦可併入本發明之組合物。 一藥學組合物可被設計為與其預定之投與途徑相容。 投與於靜脈、皮内、或皮下之溶液或懸浮劑可包含下列組 合物· 一無菌稀釋液，如注射用水、食鹽水、固定油、聚 乙二醇、甘油、丙二醇、或其它合成溶劑；抗菌劑如苯曱 醇、尼泊金曱酯（以6 1±71?&^5611)’；抗氧化劑如維它命(： (ascorbic acid)、或亞硫酸氫鈉（s〇dium bisulfite); 重金屬補捉劑如乙二銨四醋酸 (ethylenediaminetetraacetic acid);緩衝液如錯酸、 1233361 五、發明說明（44) 檸檬酸、或磷酸及用於調整張力之試劑如氣化鈉或葡萄 糖。pH值以投與酸或鹼調整，例如鹽酸或氫氧化鈉。靜脈 投與者可以是包含在無菌真空針劑内、可丟棄針筒、或玻 璃或塑膠製之多劑量瓶。 適用於注射之藥學組合物包含無菌水溶液（若可溶於 水）或懸浮液，及可臨場調製成無菌注射溶液或懸浮液之 無菌粉末。若是靜脈内投與，適當之載體包含生理食鹽 水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany，NJ)、 或磷酸鹽緩衝液（PBS)。在所有狀況下，該組合物必需是 無菌的且可輕易注射的液態。該組合物必需在製造過程及 儲存中保持穩定，且必需防止微生物的污染，如細菌及黴 菌。上述載體可以是一溶劑或懸浮介質，其含有，例如 水、乙醇、多元醇（例如如油、丙二酵、及液態聚丙二 醇、及其相似物）、及其適當的混合物。適當的流體狀態 可由下列方式保持，例如，使用一塗佈物，如卵磷脂，經 由維持懸浮物中所需顆粒尺寸及使用介面活性劑等。防止 微生物活動可經由使用數種抗生素及抗黴素達成，例如 parabens、三氣叔丁醇（chl〇r〇butanol)、酚（phenol)、 維它命C (ascorbic acid)、乙基汞柳酸鈉鹽 (thimerosal)、及其相似物。在許多情況中，在組合物中 包含等張劑是較佳的，例如，糖、多醇，如甘露酵、山梨 酵、氯化鈉等。注射組合物之延長吸收可以由在組合物中 加入延遲吸收之試劑而達成，例如鋁化單硬脂酸 (aluminum monostearate)及動物膠（gelatin)。

1057-4747-PF(N);Chiumcow.ptd 第47頁 1233361 五、發明說明（45) 無菌可注射溶液可由下列方式製備，將所需含量之活 性化合物（例如，一TSP-1或TSP-2多胜肽），依照需求，在 一適當溶劑中與一或多種前文中所述之成份混合，接著過 濾消毒。一般來說，懸浮液係如下製備，將活性化合物併 入一無菌載體，其包含一驗性懸浮介質，及其它需要的如 前文所述的成份。至於用在製造無菌注射溶液之無菌粉 末’較佳的製備方法是以真空乾燥及冷涑乾燥，形成一含 有活性成份及任何來自先前無菌過濾溶液之額外成份的粉 末。 η 口服組合物一般包含一插入稀釋或一可食載體。可包 含在一動物膠（gelatin)膠囊或壓製成一藥片。投與於D 服治療時，活性化合物可經由賦形劑（excipient)以藥 片、藥錠（troches)、或膠囊的形式投與。口服組合物亦 可由使用一液態載體，以用於嗽口，其中該液態載中的化 合物係口服投與及吸入咳出或吞服。藥學上之競爭結合試 劑’及/或佐藥（ad juvant)材質可作為組合物的一部份。 上述藥片、藥丸、膠囊、藥錠及其類似物可包含任何下列 成份，或類似特性之化合物：一結合劑如微晶纖維素、樹 膠、或動物膠；及賦形劑如殿粉或乳糖，一分解劑如海藻 酸、Primogel或玉米澱粉；一潤滑劑，如硬▲酸鎂或 Sterotes ; — glidant，如二氧化矽膠；一增甜劑，如蔗 糖或糖精（saccharin);或一調味劑，如薄荷、水腸酸甲 脂、或橘子調味劑。 系統性投與亦可經由黏膜穿透或皮膚穿透的方式投

1233361 五、發明說明（46) 與。使用於黏膜穿透或皮膚穿透應用時，在組合物中使用 對需要被穿透之屏障適當的穿透劑。此類穿透劑是一般熟 知的，包含，例如，用於黏膜穿透的有，清潔劑、膽鹽、 及fusidie acid衍生物。黏膜穿透投與可為鼻子喷劑或銓 劑。皮膚穿透投與時，活性化合物可製成本領域中熟知的 膏狀、油膏、膠狀、或乳狀。此類皮膚穿透配方可應用在 皮膚上以促進或抑制毛髮生長。

在一實施例中，活性化合物係與一載體製備，此載韻 將保護此化合物免於快速地從體内消滅，例如一控制釋放 的配方，包含植入及微膠囊運送系統。生物可分解、生物 相容之聚合物可以被投與，例如聚乙烯乙烯基醋酸 (ethylene vinyl acetate)、聚酸酐、聚乙二醇酸、膠元 蛋白、聚原酸脂、及聚乳酸。對於熟知此領域者，此類配 方之製備方法應是顯而易見的。±述材質亦可由Ah 2=〇二7°!及心^1>1^1_1^^11^(^13，111(：.購得。微脂 二i3以具有抗病毒抗原之單株抗體的受感染細胞 的之微脂體）亦可作為藥學可接受載體。這些皆可依 所揭ί :習知的方法製備’例如’美國專利4,522,81 1號

載雜本之核酸分子可被嵌入一載趙並作為基因治 =基因治療載體可由下列方式送達一個體，例如， (V者/rh局部投與（參考美國專利5, 328, 470)或定位注身 /疼恭神 et a1.，娜 91:3〇54-3〇π H94)。基 载 樂學配製彳將該S因治包含在一可接

1233361 五、發明說明（47) 之稀釋劑中，或可包含一铸 送子。或者，當完整的基因私基貝，其中含有基因輸送運 產生，例如反轉錄載體，哕‘ 2載$可由重組細皰完整地 胞，以產生基因輸送系統老學配製可包含-或多個細 該藥學組合物可於容s 你 {A . 、 ^ 益、袋子、或藥劑師 (dispenser)，同時包含投與指示。 护別中 調控血管新生程唐^^ μ ' 述装Η齡★甘4 y L 之樂划’例如Tsp-1或TSP〜2多W日士 或其片斷或其相似物，可力4 z夕胜肽 此藥劑可投與一次或可=部位投與，如局部投與。 六 人4 j符續投與，例， 頻率投與以使對於TSP-1或TSp ?恭ώ人s二劑係以足夠 噃探从β β日 Aisp—2蛋白含量的作用可持锖遠 _天:Λ 一例如？、1〇、2〇、3〇、5。1^ ^夕 調控藥劑，如可提高或降低TSP-1或 弋-蛋白（如TSFM或挪_2多胜狀或其片斷或其相似 含篁者’亦可被製備。 物) 基因治療 Φ 本發明之基因構成亦可作為一基因治療程序的一部 份，以輸送一編碼正向或負向血管新生因子的核酸，例 如，一血管新生抑制子，如TSP-J或以卜2多胜肽或其片斷 或相似物。本發明提供一表現載體，其係用於在特定細胞 種類（如上皮細胞）中進行活體轉染，並表現一 Tgp_l或 TSP_2多胜肽，以抑制（如上皮中之）血管新生。TSP-1或 TSP-2多胜肽之表現構成，可由任何生物有效運送體施 予’例如’任何可在活體中有效輸送該TSP-1或TSP-2基因 至細胞之配方或組合物。方法包括將該基因嵌入一病毒載

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第50頁 1233361 五、發明說明（48) 體’包含重組反轉錄病毒、腺病毒、腺體—相關病毒 (adeno-associated virus)，及單純皰疹病毒-! (herpes simplex virus-1)。病毒載體直接轉染細胞；質體dna可 經由如下列物質之協助而輸送··陽離子微脂體（cati〇nic 1 lposomes)(脂質體（1 ip〇f ect in))或衍生物（如抗體共輛 者）、多胜肽共枥體、gramacidin S、人造病毒套膜 (viral envelopes)或其它類似細胞間運送體，以及在活 體直接將該基因構成或C a P 04沉澱注射。 一較佳的在細胞中進行活體引入核酸之方式為投與一 病毒載體，其包含核酸，例如，具有—Tsp —i或以卜2多胜 肽編碼之cDNA，或一VEGF反義核酸。使細胞受病毒感染具 有可使大量標的細胞接受該核酸的優點。另外，該病毒載 體編碼之分子，例如，由該病毒載體包含2cDNA所編碼 者，在接受該病毒載體核酸的細胞中可有效地被表現。 反轉錄病毒載體及腺體—相關病毒載體可作為一重組 基因之輸送系統，以在活體中傳送外源性基因，特別是 ，至人肢中二這些載體提供有效地將基因輸送進細胞的方 :，且被輸送的核酸穩定地被完整嵌入宿主細胞的染 中。專一性細胞株之發展（所謂「包裝細胞」），其;; :製-缺陷反轉錄病毒，提高了反轉錄病毒在基因、治療上 ^可利用性，且缺陷反轉錄病毒具 ’的 =傳送的特性（參考Miller，A.D (_) 广為评論；。複製-缺陷反轉錄病毒可被包裝成病毒粒子 (-—，其可經由一幫助者病毒(helper 及子標 第51頁 1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 1233361 五、發明說明（49) 準技術，用來感染一標的細胞。涉及這些病毒之產生重組 反轉錄病毒及活體或試管内感染細胞的程序可以由 r Current Protocols in Molecular Biology」，

Ausube1, F.M. et a 1. (eds. ) Greene Publishing Associates， （1989)，Secions 9·10-9.14 及其它標準實 驗室手冊中找到。適合之反轉錄病毒的例子包含pLj， pZIP，pWE，及pEM，皆為本領域中人士所熟知的。適於用 來製備親外性（ecotropic)及親兩性（amphotropic)反轉錄 病毒系統之包裝病毒株的例子包含WCrip， ¥Cre， Ψ2， 及Warn。反轉錄病毒已被用來引入數種基因至許多不同的 細胞種類中，包含上皮細胞，試管内（M )及/或活體 内（/λ Wto )(參考 Eglitis，et al· (1985 ) 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1998)

Proc. Natl. Acad ScJ. USA 8 5:64 60-6464; Wilson et al. ( 1 9 88) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. ScL USA 87:6141-6145; Huber et al· (19 91) Proc. Natl. Acad. ScL USA 88:8039-8043; Ferry et al· (1991)

Proc. Natl. Acad. ScJ. USA 88:8377-8381; Chowdhury et \ al., (1991) Science 2 54:1 802-1 805; van Beusechem et al. ( 1 992) Proc. Natl. Acad. ScJ. USA 89:7640-7644; Kay et al· ( 1 992) Human Gene Therapy 3:641 -647; Dai et al. ( 1 99 2 ) Proc. Natl. Acad Sci\ USA 89 : 1 0892- 1 0895; Hwu et al· ( 1 993 ) J. Immunol· 1 50:4 1 04-4 1 1 5;美國專利4， I··

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第52頁 1233361 五、發明說明（50) 980,286 號；PCT 中請書 WO 89/07 1 3 6; PCT 申請書 W〇 89/02468; PCTf 請書WO 89/0 534 5;及PCT 申請書WO 89/07573)。 另一種可用於本發明之病毒基因輸送系統係利用腺病 毒衍生載體。一腺病毒之基因組可被修改以使其編碼並表 現一所需的基因產物，但同時關閉其正常之細胞溶解生命 循環的能力。參考，如Berkner et al· (1988)

BioTechniques 6:616; Rosenf eld et al. (1991) Science 252:431 -434;及Rosenfeld et al· ( 1 992)⑽ 68:143 -155。衍生自腺病毒Ad系第5型dl324 (Ad type 5 dl324)或其它腺病毒系（如，Ad2, Ad3，Ad7等等）的適當 腺病毒載體是此領域中所熟知的。重組腺病毒可在某些狀 況下佔優勢，這是因為它們不能感染非分裂細胞，且可用 來感染許多種類的細胞，包含上皮細胞（如前文提及之 Rosenfeld et al· ( 1 992 ))。再者，其病毒粒相較之下較 穩疋且經彳于起純化及濃縮’且如上述，可以經由修改而調 整其感染的範圍。另外’被引進的腺病毒DNA(及其包含的 外來DNA)並不會被整合進宿主細胞的基因組而保持游離基 因的形態，因此避免當引進的DNA整合進宿主基因組時， 由於同步嵌入突變基因而可能引發的潛在問題（例如，反 轉錄DNA)。另外’與其它基因輸送載體相較，腺病毒基因 組對外來DNA的運送能力較大（可至8 kb)(如上文提及之 Berkner et al·; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 5 7:267)。

1057-4747-PF(N);Chi umeow.ptd 第53頁 1233361 五、發明說明（51) 另一個適用於輸送基因之病毒載體系統是腺體-相關 病毒（adeno-associated virus，AAV)。腺體—相關病毒係 自然產生之缺陷病毒，其需要另一個病毒，例如一腺病毒 或一皰疹病毒，作為幫助者病毒（helper virus)來進行有 效的複製繁殖及有效的生命週期循環（相關評論請參考 Muzyczka et al. ( 1 992 ) Curr. T_s in Micro. aM I腿unoL 158:97-129)。它也是少數可以將自身DNA整合進非分裂中 細胞的病毒之一，且展現高頻率的穩定整合（參考如 Flotte et al. ( 1 992) Am. I Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. ( 1 989) J. Virvl. 63:3822-3828;及McLaughlin et al· ( 1 989) /· 62:1 963-1 973)。含有少至300鹼基對的AAV載體可被包裝 並整合。其可供外源性DNA使用的空間限制約為4. 5kb。一 個如Tratschin et al· ( 1 985 )射.如. 5 :3251 -3260所述之AAV載體可用來將DNA引進細胞中。數 種核酸已經由AAV載體被引進不同細胞型中（參考如 Hermonat et al· ( 1 984 ) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81:6466-6470; T rats chin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. ( 1 988 ) Mol. EndocrinoL 2:32-39; Tratschin et al· (1984) J. Virol. 51:6H-619;&Flotteetal.(1993)/.jWW.CAm 268: 378卜3790) 〇 除了如前文描述之病毒輸送方法之外’非病毒方法亦 可應用在TSP-1或TSP-2多胜肽、片斷、或相似物在一動物

1057-4747.PF(N);Chiumeow.ptd 第 54 頁 1233361 五、發明說明（52) 組織中的表現上。大多數非病毒的基因輸送方法係依靠哺 乳類動物細胞之正常機制攝入（u p t a k e )及細胞間大分子傳 送機制而達成。較佳實施例中，此類非病毒基因輸送系統 依罪標的細胞的内胞途徑（endocytic pathway)攝入TSP-1 或TSP-2基因。此類基因輸送系統的範例包含微脂體 (liposomal)竹生系統，多離胺基酸共輛體（p〇iy-iyS^ne con jugates)，及人造病毒套膜。其它實施例包含質體注 射系統，如Meuli et al· (200 1 ) //脚“此⑽⑹· 116(1):131-135; Cohen et al. ( 2000) Gene Ther 7(22): 1896-905;或Tamj et al· ( 2000 ) 7(21):1867-74 〇 在一代表性實施例中，一編碼有TSP一 1或丁^一2多胜 肽、活性片斷、或相似物的基因可被置於表面帶正電荷之 微脂體中（如脂質體）且（選擇性的）帶有一抗標的組織之細 胞表面抗原之抗體（Mizuno et al. ( 1 992)此劭Me/.tJeAa 20:547-55 1; PCT出版WL9 1 /06309;日本專利申請書 1 04 7381 ;及歐洲專利出版ep一a-430 75 )。 臨床設置中，治療用TSp一丨或^卜？基因之基因輸送系 統可由數種方法引入一病患，這些方法是本領域中熟知 的。例如’此基因輸送系統之治療配方可系統性地引入， 例如，經由靜脈注射，且在標的細胞中，該蛋白之專一性 傳輸大部份是經由該基因輸送運載子提供之轉染專一性產 生的’細胞種類或組織種類表現結果則是來自控制受體基 因表現之轉錄調控序列，或上述因素的綜合作用而產生

1057.4747.PF(N);Chiumeow.ptd 第55頁 1233361 五、發明說明（53) ^----* 的。其它實施例中，重組基因輪送的起始則由於引入動 的部位相當局部’而受到較多限制。例如，基因輸送運 子可由一導管引入（參考美國專利5, 328’470)或由立體定 位注射（stereotactic injection)引入（如Chem et “义 (1 994 )權S 91:3054-3057)。 · 基因治療構成之藥學配方之主要成份可為存在於— 接受稀釋劑中的基因輸送系統，或者可包含一緩釋質體 其中含有基因輸送系統。或者，若是完整的基因輸送系統 可由重組細胞（recombinant celis)產生，例如反轉錄病、 毒載體’該藥學配方可包含一或多個產生該基因輸送系統 之細胞〇 ^ 細胞治療 一個體中之TSP-1或TSP-2亦可經由引進一細胞而增 加，例如，一上皮細胞如角質細胞（keratin〇cyte); 一調 控TSP-1或TSP-2生產之核酸序列，例如，一編碼了3? —1或 TSP-2多胜肽 '活性片斷、或相似物之核酸序列；一啟動 子序列，如來自TSP-1或TSP-2基因或其它基因之啟動子序 列；一增強子（enhancer)序列，如5，非轉錄區域（UTR)， 如一TSP-1或TSP-2基因或其它基因之5, UTR，例如一 3’ UTR，如TSP-1或TSP-2基因或其它基因之3, UTR ; —多聚 腺苷酸化（polyadenylation)位置；一絕緣子（insuiator) 序列；或其它調控TSP-1或TSP-2表現量之序列。該細胞可 被引進一個體中。 品要進亍基因工程之初代及繼代細胞可由數種組織取

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第56頁 1233361 五、發明說明（54)

ί于且包含可由培養維持繁衍之細胞種類。例如，初代及 繼代細胞，包括纖維母細胞、角質細胞、上皮細胞（如哺 乳類上皮細胞，小腸上皮細胞）、内皮細胞、神經節細 胞神經細胞、血液中之形成元素（formed elements) (如淋巴細胞、骨髓細胞）、肌肉細胞（肌肉母細胞）及這些 身體細胞（somatic cells)種類之前驅物。較佳地，初代 細胞為取自將要投與該基因工程之初代或繼代細胞的同一 個體。然而，初代細胞可取自一同種或不同種（如，小 鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、牛、烏、羊、山羊、馬） 之捐贈者（不同於接受者）。 「初代細胞」一詞包含下列細胞：存在於一自脊椎動 物組織來源分離出之懸浮細胞之細胞（在它們被置於披覆 (plated)前，即固定在一組織培養基底如一培養皿或培養 瓶），增殖自一組織之細胞，上述兩種細胞皆為第一.次披 覆，且細胞懸浮係衍生自這些被彼覆之細胞。「繼代細 胞」一詞或「細胞系」一詞指後續培養步驟中的細胞。意 即’被披覆之初代細胞第一次從培養基底上移除並重新彼 覆（繼代，passaged)，以及後續繼代所得之所有細胞，在 此皆稱作繼代細胞。繼代細胞為含有繼代細胞之細胞系， 該繼代細胞已被繼代一或多次。一含有繼代細胞之細胞系 且該繼代細胞為：1)已被繼代一或多次；2)在培養過程中 展現一平均加倍總數之有限數量；3 )展現接觸抑制特性、 固定依存生長（anchorage dependent growth)(u 定依存 生長並不適用於在懸浮培養液中繁衍之細胞）；及4)非永

1057*4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第 57 頁 1233361 五、發明說明（55) 生化。一「無性繁殖細胞系（c 1 〇 n e d c e 1 1 s t r a i η )」係定 義為一細胞系，其係衍生自單一個細胞。一「異源 (heterogenous)細胞系」係定義為一衍生自二或多個細胞 之細胞系。

源自脊椎動物’特別是哺乳動物之初代或繼代細胞可 與外源性核酸序列一同轉染，該外源性核酸序列包含一核 S文序列’其編碼卓一多胜狀，及/或一異源核酸序列，例 如編碼TSP-1或TSP-2，且在一延長的時間内，在活體内及 試管内皆可穩定地且有複製性地產生其編碼產物。一異質 (heterologous)胺基酸亦可是一調控序列，例如，一啟動 子，其導致表現活動，例如一内源性TSP-1或TSP-2序列之 可引發表現或提高表現。一外源性核酸序列可由，如本文 之參考文獻：美國專利5, 641，670號中所述之同質重組 (homologous recombination)而被引進初代或繼代細胞。

受轉染之初代或繼代細胞亦可包含DNa，其編碼一選 =性標記碼，以確認一選擇性形態，以便於細胞的確認及 刀離產生穩疋表現外源性合成D N A之轉染初代及繼代細 胞、’以及這些轉染細胞之無性繁殖細胞系及異源細胞系之 方法產生無性繁殖異源細胞糸之方法，以及經由使用轉 染初代或繼代細胞來處理或預防異常或不欲發生;^況之 方法皆為本發明之一部分。 無丨生=殖細胞系或異源細胞系之初代或繼代細胞之轉染 脊椎動物組織可由標準方法，如穿孔組織切片或其 取仔所需初代細胞種類之組織來源之外科方法取得。例

1233361 五、發明說明（56) 如，穿孔組織切片可用來取得以皮膚為來源 心纖維母細胞 或角質細胞。經由已知的方法，例如酵素消仆 '' 匕'夕卜；|:畜，才刀 代細胞之混合物可由組織中取出。如果使用酵素 素如膠原蛋白酵素、琉玻糖碳基酸酵素 ’化’酵 (hyaluronidase)、分離酵素（dispase)、胰蛋白 (trypsin)、彈性酵素及（chymotryps in)皆可投與。 所得之初代細胞混合物可直接轉染或在轉染前先培 養’從培養孤上移開且重新懸浮。初代細胞或繼二細^與 外來核酸序列組合，例如，穩定整合至基因組中且經^ 處理使其完成轉染。此外來核酸序列可選擇性地包含二具 有選擇性標記之DNA。此外來核酸序列及選擇性標U編碼' DNA可屬於不用構成上或在同一構成上。應使用適量的⑽八 以確保產生至少一穩定轉染細胞，其包含且適當地表現外 來DNA。一般來說，應使用大約〇·；[至5〇〇 之⑽八。 在本文中’ 「轉染」一詞包含數種引進一外來核酸到 一細胞内的方法，包括磷酸鈣或氣化鈣沉澱、微注射、 DEAE-糊精（dextrin) -間介轉染、脂質化（lip〇fecti〇n)或 電泳（electrophoration) 〇 電泳係在一約略電壓及電容流量（相對於時間系數）下 進行，以使DNA構成進入初代或繼代細胞。電泳可在一個 大範圍的電壓（如50至2000伏特）及相對的電容下進行。通 常總量為0· 1至500 //g之DNA會被投與。 類似填酸約沉澱的方法，修飾磷酸的沉殿及凝聚胺 (polybrene)沉澱，微質體（lip〇some)融合及受器-間介基

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第59頁 1233361 五、發明說明（57) 因輸送亦可投與在轉染細胞上。初代或繼代細胞亦可使用 微注射轉染。一穩定的轉染細胞可接著被分離、培養、進 行次培養（sub cultivated) ’在適當的條件及足^的時間 下穩定繁衍轉染繼代細胞’並產生一轉染繼代細胞之盔^ 繁殖細胞系。或者，一個以上的轉染細胞可被培養及次培 養，以產生一異源細胞系。 〇 轉染初代或繼代細胞進行足夠次數的加倍繁殖，產生 一夠大之無性繁殖細胞系或一異源細胞系，二為一個體 供足夠量之治療性蛋白。一般來說，例如’O k#之皮 被取得且估計含有1 000, 〇〇〇個細胞；每一細胞皆被用來 產生一無性繁殖細胞系並經歷大約27次加倍以產生一億個 轉染繼代細胞。若是要從一個大約有1 000,000個細胞=最 初轉染群中產生一異源細胞系，只需要10次加倍就 一億個轉染細胞。 在一轉染無性異源細胞系中所需的細胞數量是可 的，並依存數個因素而決定，包含但不限於，該 ::二外來DNA在轉染細胞中的功能性、移植轉染細胞 的。卩位（例如，可使用的細胞數量係受限於移植部位解剖 士白:位置）、及病患之年紀、表面積、及臨床狀態。檢： 1因素時’I將治療性含量的人類生長荷爾蒙輸送至一 有。广=1荷爾蒙缺陷’但在其它方面處於健康狀 〜、j^Okg重的患者，需要大約一至五億個轉染纖維母細胞 (乂二細胞的體積大約與該病患的拇指頂端相當）。 無性繁殖細胞系或異源細胞系之轉染繼代細胞之移植

1233361 五、發明說明（58) 轉染細胞，例如，如本文所述而產生之細胞，可被引 進一將接受該產物之個體内。無性繁殖細胞系或異源細胞 系被引進一個體内。數種執行及數個部位（如腎次囊 (renal sub capsular)、皮下、中央神經系統（包括腦脊 趙膜内神經）、血管内、肝内、内臟内、膜内（包括網膜 内）、肌肉内移植皆可使用。一旦移植入一個體内，轉染 細胞即產生其異質DNA編碼之產物或受到該異質的影 響。例如，一個受失去毛髮所苦之個體即是一個移植 TSP-1或TSP-2產生細胞的候選人。

一小型皮膚組織切片可取自該個體，這是一個可以在 門診基礎上執行的簡單步驟。這片皮膚係取自，例如，手 淥下方，且費時約一分鐘進行。該樣本經過處理，產生該 病患之分離細胞（如纖維母細胞）且經由基因工程以產生 TSP-1或TSP-2或其它蛋白或分子，以引發^卜丨或丁81)一2之 產生。依據病患之年紀、體重、及臨床狀態，以大型培養 產生所需數量之細胞。這整個過程應需要4—6星期，且在 此時間終了時，同樣是在門診基礎上，適量之基因工程細 胞將被引進該個體（例如，注射至該病患之皮膚，如頭皮

或臉上）。病患此時即可產生TSp—l 4TSP_2而防止或 皺紋。 對於某些人，這可以是一次性的治療，而對其它人， 多次的細胞治療是需要的。 如同本例所建議的，使用的細胞一般都是病患專一性 的基因工程細胞。然而，由另一個同種或不同種之個體取

1233361

轉染之初代或繼代細胞可單獨投與，或與一抑制受 中對抗此細胞之免疫反應的屏障或試劑一起投盘。例如 一抑制劑可投與在該個體中以抑制或干擾該個體之正常 應。較佳者，該免疫抑制劑係可抑制一個體内τ細胞及/或 Β細胞活性之免疫抑制藥物。此類免疫抑制藥物的例子中 有市場上可購得者（如CyCl〇Sp〇rin Α可自Sand〇Z c〇rp East Hanover, NJ 購得）〇 一免疫抑制劑，例如一藥物，可在一個體上，以足夠彳i 達成所需效果的劑量投與（例如，抑制該細胞的排斥）。免 疫抑制藥物之劑量範圍係本領域中所熟知的。參考如，

Freed et al ( 1 992 ) K Engl. J. Med 327:1 549; Spencer et al. ( 1 992) N. EngL J. Med. 327: 1 541 ； Widner et al· ( 1 992 ) N. EngL J. Med. 327 : 1 55 6。劑量可依據如下的 因素改變·該個體的症狀、年紀、性別、及體重。 另一個可用於抑制一個體内T細胞活性之試劑係一抗 體’或其衍生片斷。具有在活體中減低或消滅T細胞活性 之抗體是此領域中所熟知的。可投與多株抗i清，例如，_ 抗-淋巴球血清。或者，可投與一或多個單株抗體。較佳 的T細胞降低抗體包含與細胞表面CD2，CD3，CD4，CD8， CD40，配位體（1 igand)結合之單株抗體。此類抗體係為本 領域所熟知的且可於市場上購得，例如，可購自American

1233361 五、發明說明（60)

Type Cul ture Col lect ion。用來與人類τ細胞上之CD3結 合之一較佳抗體為〇KT3 (ATCC CRL 80 0 1 )。 一具有減低或消滅T細胞活性之抗體可依一定劑量投 與一段時間以抑制在一受體中移植細胞的排斥。較佳地， 抗體係在一藥學可接受載體之稀釋液（例如食鹽水）中經由 靜脈投與。

另一個干擾或抑制一受體中對移植細胞之免疫反應的 方法為投與一免疫屏障。在此，「免疫屏障」指一元件， 其作為一介於該移植細胞及一個體中涉及免疫反應之細胞 之間的屏障。例如，細胞可置於一可移植元件中投與。〆 可移植元件可包含置於一半穿透性屏障之細胞，此半穿透 性屏障允許養份及細胞產物擴散進出該屏障，但阻止較大 的免疫系統成員如抗體或補體的進入。一個典型的可移植 元件包含一基質，例如，一水膠、生物相容網狀物、或一 可放置細胞之核心。依據需要，一半穿透性塗覆物可包覆 该膠質。若是將細胞放置於一膠狀核心，該細胞應避開免 疫系統細胞及個體中的細胞和細胞毒素抗體。較佳地是投 與塗覆物如P L L或P L 0。此塗覆物通常是多孔性的，其避

免受體免疫系統中的成員進入並消滅可移植元件中的細 胞。 許多封裝細胞之方法係本領域中所熟知的。例如，以 一水溶性膠質封裝以形成一半穿透性非水溶性膠質來包裝 生產的細胞，其它封裝方法係揭露於美國專利4，3 5 2，8 8 3 號。其它可投與的移植元件係揭露於美國專利5, 〇84, 35〇

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第63頁 1233361 五、發明說明（61) 號、美國專利5, 427, 935號、W0 95/19743出版於1995年7 月27日’美國專利5, 545, 423號、美國專利4, 4 0 9, 33 1號、 美國專利4, 663, 286號、及歐洲專利301，777號。

使用轉染或繼代細胞的優點之一為，經由控制引進一 個體内的細胞數量，即可控制送至體内的蛋白數量。另 外’在某些情況下，在已不再需要產物時，移除這些轉染 、細胞是可能的。使用本發明轉染初代或繼代細胞治療之方 法的另一個優點為，治療產物的生產可以被控制，例如經 由使用鋅、類固醇、或對蛋白轉錄、產物或核酸產物有影 響’或對核酸產物穩定性有影響的試劑。 實施例 實施例1 :長期紫外線B照射後之強化皮膚血管新生 在表外線β照射1 〇星期後（累計劑量：5. 6 5 J / c m2 )， 由紫外線B照射小鼠及未照射小鼠背部皮膚取得複製樣 本’以利評估皮膚表面替換，以作為皮膚損傷的指標。在 紫外線B照射小鼠上觀察到皺紋形成。顯微鏡下對皮膚底 部的檢驗顯示紫外線照射小鼠的皮下血管形成量提高，且 伴隨著增大的血管及血管分支的增加。 組織分析顯示紫外線B照射小鼠的上皮、’真皮，及皮 脂腺增厚（36)，且伴隨著發炎細胞在上部真皮的堆積。另 外’我們在紫外線B照射皮膚中發現，與未照射控制皮膚 的規律格式相較下，呈現斷裂及較不具組織性的膠原蛋白 纖維及彈性纖維。CD3丨的免疫染色揭示，與未經處理的對

1057-4747-PF(N);Chiumeow.ptd 第64頁 1233361 照組相較，紫外線B照射小鼠在直&且右你曰A 管。此現象在緊臨上皮下方的w擴大血 ―)中更為㈣二的礼頭真皮(papiUary 马』者。内皮接點分子CD3丨繁 的差別免疫瑩光毕色福干Α @ 之^'何s己唬Kl67 血管内的繁衍=:ΐ! 'Γ照射皮膚中，在擴大的 :少發現繁衍性内皮細胞。最高的内皮細：繁； 外線照射皮膚的上真皮觀察到的。在未照射皮η》 的上皮角質細胞在基底層有選擇性地偵測到。相對地，2 外線Β照射後，在增生上皮的上基底層則發現大是的繁街、 角質細胞。

、一項對皮膚血管密度及尺寸的量化電腦輔助形態分析 被執行’其投與CD31 -染色組織切片。與未照射對照組相 較’長期紫外線Β照射的結果產生一血管密度的明顯（ρ < 〇. 〇 01)增加。紫外線照射皮膚中的血管亦明顯地較大 (Ρ<0·001)，具有67%尺寸上的增加，導致被血管覆蓋的皮 膚有大於130%的增加（ρ〈〇·〇〇ΐ)。 實施例2 :長期紫外線Β照射後的強化上皮VEGF表現

本實施例檢驗長期紫外線照射對皮膚VEGF mRNA表現 量的影響。利用同步雜交，發現在長期紫外線B照射後， VEGF mRNA表現量在上基底上皮角質細胞有顯著的增加， 而未照射小鼠的皮膚中只有少量或沒有VEGF mRNA的表 現。 實施例3 : TSP-1的過量表現預防紫外線B引起的皮膚損 傷、皺紋形成及血管新生

1057-4747-PF(N);Chiume〇w.ptd 第65頁 1233361 五、發明說明（63) 為了描述皮膚血管新生對長期紫外線B照射的生物性 重要性’具有皮膚專一性内源性血管新生抑制劑TSP- 1過 量表現的基因轉殖小鼠接受了相同的紫外線B照射處理。 這些小鼠的特徵在先前已被詳細地描述，且顯示對被引發 的血管新生可有效的抑制（24 )。在紫外線b照射丨〇週後（累 ^紫外線劑量為6· 52 j/cf),所有野生型小鼠顯示其背 邛皮膚有明顯的皺紋形成。相對地，在TSP—1過量表現基 因轉殖小鼠上，只發現少量或是沒有皺紋。由顯微鏡觀 察，與野生型相較，K14/TSP_1基因轉殖小鼠亦顯示減量 的皮膚血管化。 組織分析揭示，與野生型小鼠相較，〖“八卯]基因 轉殖小鼠身上因紫外線B引起的真皮及次真皮肥厚較不明 顯對於上皮則無此現象。伴隨而來的，與野生型小鼠相 較，在K14/TSP-1基因轉殖小鼠中，炎症細胞滲透減低亦 被觀察到，且其膠原蛋白纖維的排列及構造也較有規律。 另外，K14/TSP-1基因轉殖小鼠的皮膚血管明顯地減少。 CD31染色之形態分析顯示，^卜丨基因轉殖小鼠的血管尺 寸具有多於55%的減少（ρ<0.〇〇1)，且其被血管覆蓋的皮膚 面積也有重要的減少（ρ<0.001)。在TShj*因轉殖小鼠中 並未發現顯著的血管密度減少eCD31&Ki_67，之雙免疫华 · 色顯示，與紫外線B照射野生型小氣相較，紫外糾照射、 TSPM基因轉殖小鼠真皮中的繁衍内皮細胞有明顯的減 。、。另外’TUNEL分析與CD31染色一同進行，顯示與野生 型小鼠相車交，TSP-1基因轉殖小鼠皮膚中的細胞调零内皮 第66頁 i057-4747-PF(N) ;Chiumeow.ptd 1233361 五、發明說明（64) 細胞量較多。 實施例4 : TSP-1過量表現預防紫外線B引起MMP_9活性 基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)已被證實與調解紫外線B引 發的細胞外間質成分衰退有關（3 5 )，且有跡象指出，

MMP-9活性在血管新生中，經由VEGF之控制生物可利用性 而扮演一個重要的角色。野生型及TSP-1基因轉殖小鼠接 受背部單一劑量的紫外線B照射（1 2 6 m J/cm2)，且其皮膚 細胞溶解物中的MMP-9活性由動物膠酵素譜法（geiat in zymography)確認。野生型小鼠之單一劑量紫外線b照射， 在24小時後產生了明顯提高的皮下血管化，而在TS卜1基 因轉殖小鼠中此現象則較不明顯。動物膠酵素譜法顯示在 野生型小鼠的正常皮膚中與在以卜i基因轉殖小鼠上的 MMP-9含量是相同的。在紫外線b照射後24小時，野生型小 鼠皮膚中的MMP-9有明顯的提高，但是在丁^-；^基因轉殖小 鼠中是減少的。 貫施例5 · TSP-2剔除小鼠顯示增加的皺紋形成

與野生型小鼠相較，長期紫外線B照射（累計紫外線B 劑量：7· 23 J/cm2)在TSP-2缺陷小鼠中產生明顯的皺紋形 成。長期紫外線B照射後，與野生型小鼠相較，TSP-2缺陷 小鼠發現有擴大的皮膚血管及強化的血管分支。 蘇木素-曙紅（hematoxy 1 in-eosin)染色揭示，與野生 型小氣相較，在長期紫外線B照射後，TSP-2缺陷小鼠的皮 膚”、、員示上皮及真皮的增厚。三鉻黃（trichrome)染色結果 顯不’與野生型小鼠相較，在長期紫外線B照射後，TSP-2

1233361 五、發明說明（65) 缺陷小鼠之乳頭真皮中出現膠原蛋白纖維的不規則組織。 · CAE染色揭示，與野生型小鼠相較，TSP-2缺陷小鼠出現提 高的炎症細胞滲透。 CD3 1之免疫染色揭示，與野生型小鼠相較，在長期紫 外線B照射後，TSP-2缺陷小鼠的總體（上皮+次真皮 (subcutis))皮膚及上部真皮中，出現較多的且擴大的血 官。C D 3 1染色切片之電腦輔助影像分析顯示，與野生型小 鼠相較，在長期紫外線B照射後，TSP-2缺陷小鼠的總體皮 膚中的血管尺寸及血管密度有明顯的增加。與總體皮膚之 血管化相似，在長期紫外線B照射後，TSP-2缺陷小鼠上部 真皮的血管化也非常明顯，其範圍為與上皮—真皮界線的 1 00 /z m 内0 CD31與BrdU之雙免疫瑩光染色揭示，與野生型小鼠相 較，TSP-2缺陷小鼠皮膚之上部及下部真皮中繁衍性内皮 細胞（箭頭處）有明顯的增加。 VEGF之同步雜交顯示，與野生型小鼠上皮中少量或沒 有VEGF mRNA表現量相較，在長期紫外線b照射後，Tsp_2 缺P曰小机增居上皮中的上基底角質細胞有增加的V E G ρ mRNA表現量。 動物膠酵素譜法揭示，與未照射野生小故相較，紫外 線B照射野生型小鼠皮膚中出現MMp:9活性的強烈引發。在 長期紫外線B照射後TSP-2缺陷小鼠與野生型小鼠之間的 MMP-9活性並未顯現明顯的不同。 實施例6 ··方法及材料

1233361 五、發明說明（66) 紫外線B照射 在一第一實驗中，使8週大的雌性無毛Skh-Ι小鼠（每 一組n = 7 )暴露在紫外線B照射下，投與一排具有4個等間隔 的瑩光燈泡（Elder Pharmaceuticals，Bryan，OH)(25)。 燈泡的高度係調整至照射在小鼠背部皮膚為〇. 3 5 mW/cm2。1 0週中，每週給小鼠照射紫外線B三次，其起始 劑量為0.5最低紅斑劑量（20 mJ/cm2)並逐漸以0.5 MED增 加至一最高劑量4· 5MED (26)。紫外線B的累計總劑量為5. 62 J/cm2。沒有發現劇烈曬傷的現象。對照組小鼠接受模 擬照射。在一增加的實驗中，使8週大的雌K14/TSP-1基因 轉殖小鼠（24)或FVB野生型對照組（每組n = 7)接受如上述之 紫外線B照射達12週（累計紫外線B劑量：6. 52 J/cm2)。12 週後’將小鼠犧牲並投與矽膠（SILFLO; Flexico Developments Ltd，Ιί·Κ·)取得皮膚樣本（27)。背部皮膚 樣本如（28)所述，在液態氮中急速冷凍或在1〇%曱醛中固 定。所有動物研究皆經由Massachusette General Hospital Subcommittee on Research Animal Care許

O CD3 1免疫組織化學及皮膚血管之電腦輔助形態分析 免疫組織化學染色係如（24)所述，在7 /zm冷凍切片 上進行’使用一單株大鼠抗小鼠CD31抗體（Pharmingen， San Diego，CA)。代表性之切片係由五隻紫外線B照射小 鼠及五隻同齡未經紫外線B照射之控制小鼠，且使用n i kon E-600顯微鏡（Nikon; Mel vi 1 le，NY)分析。影像係使用光

1057-4747-PF(N);Chiumcow.ptd 第69頁 1233361 五、發明說明（67) 點數位相機（Diagnostic Instruments，Sterling ·

Heights，MI)，形態分析則使用

Inc， Fairfax, VA)，如（24)所述。每個切片有三個不同 區域以60倍放大檢視，且真皮中，與上皮-真皮接點相距 100 //m之内的區域，每平方公厘中的血管數量、平均血 管尺寸及使血管覆蓋的相對區域皆被確認。雙面非配對學 生 t-測試（two-sided unpaired Student’s t-test)被投 與來分析微血管密度及血管尺寸的差異。另外，石臘切片 由同樣的小鼠之皮膚取得，且慣用的蘇木素-曙紅，

Verhoef Γ s 彈性及Weigert，s 間苯二酚洋紅（resorcin 丨_ fuchsin)染色皆如（29)所述進行。 繁衍及細胞凋零分析 為了分析内皮細胞繁衍，内皮細胞標記CD3 1及繁衍標 記Ki - 67雙免疫瑩光染色（30、31)皆在7 冷凍切片上進 行，投與一單株大鼠抗小鼠CD31抗體及一兔子抗Ki-67多 株抗體（Novocastra Laboratories，Burlingame，CA)。 與FITC結合之抗大鼠IgG及與Texas-Red結合之抗兔子IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA )則作為二級抗體（3 2 )。代表性切片由各組的五隻小鼠 取得，並以Nikon E-600顯微鏡分析。CD31及ii-67染色之 I® 數位影像係取自同一個區域並合成以揭示繁衍性内皮細 胞。細胞凋零内皮細胞係由雙免疫瑩光染色偵測，投與

Fluorescence-FragEL DNA 片斷偵測組（Oncogene,

Cambridge，ΜΑ)及一抗小鼠CD31 抗體和一與Texas-Red 結

1057-4747-PF(N);Chiumcow.ptd 第70頁 1233361 五、發明說明（68) 合之抗大鼠I gG，如（2 4 )所述。 同步雜交 同步雜交係在石臘切片上進行，如（1 9 )所述。簡單地 說，切片經由二曱苯處理以移除石臘，依續以分級酒精， 0·2Μ HCL，Tris/EDTA 加 3 //m 蛋白酶 Κ，0·2°/。氨基乙酸， 4%溶於pH 7. 4磷酸鹽緩衝液之對曱醛 (paraformaldehyde), 0·1 Μ 含1/200 (vol/vol)醋酸軒之 三乙醇胺（triethanolamine)， 及2xSSC處理。切片35S才票 識核醣探針經過一個晚上52 °C之雜交，其係在下列混合物

中進行：0·3 M NaCl，0·01Μ Tris ρΗ7·6，5mM EDTA， 5 0%甲醯胺（formamide), 10%葡萄聚糖硫酸鹽，0. lmg/ml 酵母tRNA,及0· 01M 二硫秀克糖醇（di thiothrei tol)。雜 交後清洗包含65 °C之2xSSC/50%甲醯胺/lOmM二硫秀克糖 醇及2xSSC。接著將切片以含有0· 3M醋酸銨之分級酒精去 水化，乾燥，塗以科達NTB2感光乳劑並在4 〇c下保存2星 期。將此感光乳劑以科達19顯影劑顯影，並將切片以蘇木 紫反染。反義及順義單股VEGF 35S-標識RNA探針係由的 393-bp大鼠VEGF cDNA>}斷製備而得（12) ’嵌入一 (Promega)。 "μ 以

動物膠酵素譜法 使除毛後之野生型削小鼠及基因轉殖 背部皮膚暴露在單-劑量之紫外線B照射（126 mj/cm2)n。 24小時後，小鼠被犧牲且割去背 中(°.°5ΜΤΓί·5, 〇，NaCl，5mMCaCl2,=衝

1233361 五、發明說明（69)

Tri ton X-1 〇〇)予以均質化。離心後，將表層物收集進行 動物膠酵素譜法。酵素譜法係依（3 3、3 4 )所述稍加修改進 行。簡單地說，將皮膚溶解物重新懸浮在非還原之4XSDS 樣本緩衝液中（0·5Μ Trix-HCl/pH6.8，0.02% 溴酚藍，40% (v/v)甘油，3°/。SDS)並置入含有〇·1%豬皮動物膠（SIGMA) 之SDS聚丙烯醯（polyacrylamide)凝膠中。每一蛋白溶解 物取2 0 //m進行SDS-PAGE。該凝膠係置於2. 5% Triton X -100以移除SDS，接著置於浸泡緩衝液（0.05M Trix-HCl/pH8· 0，5mM CaCl2，5 μΜ ZnCl)中一個晚上。 接著將凝勝以0.5% Coomassie brilliant blue R-250/3 0%甲醇/10%醋酸溶液染色，接著使用30%曱醇/10% 醋酸溶液去染色。MMP-9活性係以一92kD分子量之條紋被 測得（3 5 )。 參考文獻 1. Kripke, M.L. 1994. Ultraviolet radiation and immunology: something new under the sun- presidential address. Cancer Res. 54:6102-6105. 2. Cox, N.H., B.L. Diffey, and P.M. Farr. 1992. The relationship between chronological age and the erythemal response to ultraviolet B radiation. Br JDermatol. 126:315-319. s 3. Pearse, A.D., S.A. Gaskell, and R. Marks. 1987. Epidennal changes in human skin following irradiation with either UVB or UVA. J Invest Dermatol. 88:83-87. 4. Berton, T.R., D.L. Mitchell, S.M. Fischer, and M.F. Locniskar. 1997. Epidermal proliferation but not quantity of DNA photodamage is correlated with UV-induced mouse skin carcinogenesis. J Invest Dermatol. 109:340-347.

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其它實施例 I 雖然本發明已以詳細說明揭露如上，然此說明及實施 例係用以闡明但並非用以限定本發明之範圍，本發明之保 護範圍當視本案之申請專利範圍所界定者為準。其它概 念、優點、及修飾皆不脫離本發明之精神範圍内。 在此列出之參考文獻，其整體皆作為參考。其它實施 例係在後文中之申請專利範圍之界定内。

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Claims (1)

1. 六 日 、申請專利範圍j 111 9110721« 年 α月 f< 曰 修正毛 期紫外線B引發之皺紋之組合 發一血管新生抑制劑之藥 藥學上可接受之載體 •一種預防或治療長 物’包含： 一血管新生抑制劑，或一引劑；及 \ Ή 線";·發如之=專之?I圍物= TSP - 2 期紫*夕卜 物’其中該血管新生抑制劑係 線J發如之申=範二第1; 或治療長期紫外 TSP-1。 σ物，其中該血官新生抑制劑係 外線Β弓丨發之申鈹%專1乾圍第1項所述之預11方或治療長期紫 與。纟之鈹紋之組合物’其中該組合物係適於局部投 ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ #, t .h 與。 、、、σ物，其中該組合物係適於局部投 ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ f ^ 與。 皺汶之組合物，其中該組合物係適於局部投 防或治療二；J : f圍第1、2、3、4、5、或6項所述之預 容成份外線㈠1發之皺紋之組合物，更包含-美 8.如申請專利範圍第7項所述之預防或治療長期紫外 第80頁 1057-4747-PFl(N).ptc 1233361 案號9110^^ 六、申請專利範^ ^ ~x--L日 倏丨下 線B引發之皺紋之叙合物，… ^〜 9. 如申請專利範圍第7項二美容成份係一芳香劑。 線B引發之皺紋之組合物，复、J之f防或治療長期 10. —種在一個體 防容成份係一防曬 組，該套組包含： 預防長期紫外線B引發之皺紋之套 一組合物，該組人 發-血管新生抑制劑：華;;血管新生抑㈣，或一力 :投與該上合物預防鈹紋之指示。 新生抑制劑^SP1範圍第10項所述之套組，其中該血管 新斗▲如中’專利範圍第1 G項所述之套組，㊣中該血管 新生抑制劑係TSP-2。 U·如申請專利範圍第1〇、n、或12項所述之套組， ，、中該組合物係適於局部投與。 ， 14. 如申請專利範圍第1 〇、1丨、或12項所述之#組 其中該組合物進一牛— ,,^ 初進步包含一美容成伤。 < 袭.組， 15. 如申請專利範園第i〇、u、或12項所述之。爹 其中該指示包含—脾# 於古膚之説明 上匕系 〇 3將该組合物應用於反屑二β中该指 16. 如申請專利範園第15項所述之套組，，、說明。 17·種預防皺纟文之人物 接受載體。 18· 一種預防皺紋之入物，包括TSP-2及 接受載體。 、、、口斗 包含一將該組合物在曰曬前或日釀中應用於皮膚藥學上町 1 7 —從. 包括TSP一1及〆/ 藥 #上 l〇57-4747-PFl(N).ptc 第81頁