JP2002540163A - トロンボスポンジン−２およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＳＰ−２活性を高めることによって、例えば好ましくない皮膚または前立腺細胞の増殖等の好ましくない血管新生および／または好ましくない細胞増殖を特徴とする疾患を治療する方法に関する。また、本発明は、例えばＴＳＰ−２活性を阻害または促進させる等、ＴＳＰ−２活性を調節する化合物を同定する方法、ならびに、被検者が好ましくない血管新生および／または細胞増殖を特徴とする疾患の危険性を有するか否かを評価する方法に関する。また、本発明は、そのような疾患を治療するのに用い得るＴＳＰ−２の断片および類似物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、１９９９年３月３１日に出願の仮特許出願第６０／１２７，２２１
号の利益を主張し、その仮特許出願の内容の全てが組み込まれている。

【０００２】 発明の背景 腫瘍が最小サイズを超えて増殖し、さらに転移するためには、腫瘍に栄養物を
供給しおよび廃棄物を処理するための新たな血管の成長（血管新生）を誘導する
ことが必要である(Hanahan D and Folkman J Cell 1996, 86: 353-64)。腫瘍発
達は、血管新生因子、特に血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の遊離の増加に関
連する(Brown LF et al., Exs 1997, 79: 233-69)。いくつかの研究は、実験腫
瘍において、血管新生因子の過剰発現が腫瘍増殖および血管新生を高めることを
示しており、さらにＶＥＧＦ活性の治療的阻害が腫瘍増殖および転移を阻害する
ことが示されている(Ferrara et al., Breast Cancer Res Treat 1995, 36: 127
-37; Claffey et al., Cancer Res 1996, 56: 172-18; Skobe et al., Nat Med
1997, 3: 1222-7)。

【０００３】 トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）(Iruela-Arispe et al., Proc Natl Ac
ad Sci USA 1991, 88: 5026-5030)、アンギオスタチン(O’Reilly et al., Cell
1994, 79: 315-28)およびエンドスタチン (O’Reilly et al., Cell 1997, 88:
277-85)等のいくつかの天然の血管新生阻害物質が同定されている。ＴＳＰ−１
は、４２０ｋｄのホモ三量体のマトリックス細胞の(homotrimeric matricellula
r)糖タンパク質であり、種々のタイプの細胞の接着、増殖、遊走および分化を制
御する(Bornstein et al., J Cell Biol 1995, 130: 503-506)。ＴＳＰ−１は、
インビトロにおいて血管内皮細胞の増殖および遊走を阻害し、さらにインビボに
おいて新血管形成を阻害し、脈管構造の正常な静止に寄与する(Tolsma et al.,
J Cell Biol 1993, 122: 497-511)。ＴＳＰ−１タンパク質の発現は、いくつか
の扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞株における細胞分化に逆比例で相関していることが
分かっており(Goodson et al., Proc Natl Acad USA 1994, 91: 7129-7133)、さ
らにインビトロにおいてＳＣＣ増殖、細胞の接着、遊走および浸潤を誘導するこ
とが分かっている(Siemeister et al., Cancer Metastasis Rev 1998, 17: 241-
248; Bornstein FASEB J 1992, 6: 3290-3299; Gorczyca et al., Cancer Res 1
993, 53: 1945-51)。インビトロにおける、ＴＳＰ−１による腫瘍細胞浸潤の促
進が、乳癌、肺癌および膵癌の細胞株で報告されている(Albo et al., Biochem
Biophys Res Commun 1994, 203: 857-65; Robbins et al.; Arch Pathol Lab Me
d 1987, 111: 841-5; Albo et al.; Surgery 1997, 122: 493-500; Christofori
Angiogenesis 1998, 2: 21-23)。ＳＣＣにおけるＴＳＰ−１のアンチセンス阻
害が、結果的にインビボにおける腫瘍増殖の抑制をもたらすことの発見(Creamer
et al., Am J Pathol 1995, 147: 1661-7)に基づき、ＴＳＰ−１は腫瘍増殖を
促進させ得ることが示唆された（Tuszynski et al., Bioassays 1996, 18: 71-6
）。一方、他の研究は、ＴＳＰ−１発現がヒトの肺癌、乳癌および膀胱癌の細胞
株における悪性進行に逆比例で相関することを報告した(Zabrenetzky et al, In
t J Cancer 1994, 59: 191-5; Campbell et al., Cancer Res 1998, 58: 1298-3
04)。

【０００４】 ヒト皮膚において、ＴＳＰ−１は、基底膜に沈着し(Wight et al., J Histoch
em Cytochem 1985, 33: 295-302)、血管新生化真皮から血管表皮を分ける抗血管
新生バリアに寄与する。

【０００５】 発明の概要 本発明は、部分的に、インビボにおいてＴＳＰ−２ の過剰発現が腫瘍サイズ
を抑制することの発見に基づく。本発明は、好ましくない血管新生および腫瘍増
殖を調節する方法に関する。

【０００６】 全体として、本発明は、例えば疾患を有するような被検者を治療する方法に関
する。その疾患は、好ましくない細胞増殖または好ましくない血管新生を特徴と
する疾患であって差し支えない。好ましくない細胞増殖は、良性であっても悪性
であっても差し支えない。その方法は、ＴＳＰ−２活性を高めることを含む。例
えば、ＴＳＰ−２ 活性を高める物質を投与することによって、活性を高めるこ
とができる。好ましい実施形態において、ＴＳＰ−２活性を高める物質は、以下
の１つ以上であって差し支えない：ＴＳＰ−２ ポリペプチド、または例えばＴ
ＳＰ−２誘導ポリペプチドもしくはそのレトロ逆転(retro-inverso)ポリペプチ
ドのようなその生物活性断片もしくは類似物；ＴＳＰ−２ポリペプチドまたはそ
の生物活性断片もしくは類似物をコードする核酸；例えば抗体またはＴＳＰ−２
活性を有する低分子のようなＴＳＰ−２アゴニスト；あるいは例えばＴＳＰ−２
のプロモーター領域に結合する低分子のようなＴＳＰ−２核酸の発現を高める物
質。

【０００７】 内因性ＴＳＰ−２活性を高めることによって、ＴＳＰ−２レベルを高めること
ができる。例えばＴＳＰ−２遺伝子の転写を高めることによって遺伝子発現レベ
ルを高め；例えばｍＲＮＡの２次および３次構造を変化させることによってＴＳ
Ｐ−２ ｍＲＮＡの安定性を高め；例えばＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの配列を変化させ
ることによってＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの翻訳を高め；および／またはＴＳＰ−２
タンパク質の安定性を高める：ことによって、活性を高めることができる。例え
ば内因性ＴＳＰ−２遺伝子の調節配列を変化させることによって、ＴＳＰ−２遺
伝子の転写を高めることができる。１つの実施形態において、正の制御要素（例
えばエンハンサーまたは転写活性因子のためのＤＮＡ結合部位等）の付加；負の
制御要素（例えば転写レプレッサーのためのＤＮＡ結合部位等）の欠失；および
／または、別の遺伝子の制御配列による内因性制御配列もしくはその中の要素の
置換：によって、制御配列を変化させることができ、それによってＴＳＰ−２遺
伝子をより効率的に転写させることができる。

【０００８】 上記の方法をインビボまたはエキソビボで実施することができる。

【０００９】 好ましい実施形態において、静脈内、皮内、皮下、経口および／または経皮（
局所）投与によって、ＴＳＰ−２活性を高める物質を投与することができる。

【００１０】 好ましい実施形態において、疾患は、前癌細胞、癌細胞または新生細胞、ある
いは腫瘍の存在を特徴とする。その疾患は、例えば真皮または表皮のような皮膚
等の上皮組織を冒す。他の好ましい実施形態において、その疾患は、乳房、前立
腺、肺、胃または腸を冒す。好ましい実施形態において、その疾患は、例えば皮
膚の扁平上皮癌、悪性メラノーマ、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば非小
細胞肺癌）またはカポジ肉腫のような癌細胞増殖である。特に好ましい実施形態
において、その疾患は、例えば皮膚の扁平上皮癌または悪性メラノーマのような
皮膚の癌等の好ましくない皮膚細胞増殖を特徴とする。別の好ましい実施形態に
おいて、その疾患は、例えば前立腺癌のような前立腺細胞の好ましくない増殖を
特徴とする。

【００１１】 好ましい実施形態において、その方法は、ＴＳＰ−２活性の上昇を必要とする
被検者を特定することを含む。

【００１２】 好ましい実施形態において、その方法は、被検者において腫瘍増殖または血管
新生を阻害することを含む。その方法は、そのような阻害を必要とする被検者を
特定し、さらにその被検者において腫瘍増殖または血管新生が阻害されるように
、ＴＳＰ−２活性のレベルを高めることを含んでいて差し支えない。腫瘍の壊死
範囲のサイズ、腫瘍サイズの縮小、および／または腫瘍血管数の減少およびサイ
ズの縮小によって、腫瘍増殖の阻害を測定することができる。

【００１３】 １つの実施形態において、本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって皮
膚の扁平上皮癌を阻害することを含む。

【００１４】 別の実施形態において、本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって前立
腺癌を阻害することを含む。

【００１５】 別の実施形態において、本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって悪性
メラノーマを阻害することを含む。

【００１６】 さらに別の実施形態において、本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによっ
て乳癌を阻害することを含む。

【００１７】 さらに別の実施形態において、本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによっ
て結腸癌を阻害することを含む。

【００１８】 さらに別の実施形態において、本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによっ
て例えば非小細胞肺癌等の肺癌を阻害することを含む。

【００１９】 好ましい実施形態において、その疾患は、例えば乾癬または乳頭腫形成のよう
な皮膚における好ましくない皮膚増殖等の、良性の好ましくない細胞増殖を特徴
とする。本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって、例えば皮膚における
好ましくない増殖のような好ましくない増殖を阻害することを含む。

【００２０】 １つの実施形態において、その疾患は、血管新生に関連する炎症性疾患である
。例えば、その疾患は、感染、リューマチ様関節炎または多発性硬化症であって
差し支えない。本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって炎症性疾患を治
療することを含む。

【００２１】 別の実施形態において、その疾患は、例えば目における好ましくない血管新生
のような好ましくない血管新生を特徴とする。例えば、その疾患は、例えば糖尿
病性網膜症のような好ましくない血管新生を特徴とする網膜疾患であって差し支
えない。別の実施形態において、その疾患は、例えば、冠動脈血管形成術の後の
レステノシス(restenosis)であって差し支えない。本方法は、ＴＳＰ−２活性を
高め、それによって血管新生を阻害することを含む。

【００２２】 好ましい実施形態において、本方法は、ＴＳＰ−１活性を高めることをさらに
含む。同時にまたは順次にＴＳＰ−１とＴＳＰ−２の活性を高めて差し支えない
。通常、ＴＳＰ−２活性を高めるのに有用な任意の方法をＴＳＰ−１に適用する
ことができる。例として、例えばＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２の両方のポリペプ
チドまたはその生物活性断片もしくは類似物；ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２の両
方のポリペプチドまたはその生物活性断片もしくはその類似物をコードする核酸
、；例えば抗体、またはＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２の発現を高める低分子のよ
うなＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２アゴニスト；あるいは例えばＴＳＰ−１ポリペ
プチドとＴＳＰ−２をコードする核酸のような上記の要素の他の組合せ：を投与
することによって、ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２活性を高めることができる。ま
た、例えばＴＳＰ−２のために記載された方法に類似の方法によって、内因性Ｔ
ＳＰ−１活性を高めることによって、ＴＳＰ−１活性を高めることができる。

【００２３】 好ましい実施形態において、本方法は、ＶＥＧＦ活性を阻害することをさらに
含む。例えば以下の物質を投与することによってＶＥＧＦ活性を低下させること
ができる：例えば細胞ＶＥＧＦ ｍＲＮＡに結合しさらに例えばＶＥＧＦの転写
を阻害することによってそのタンパク質の発現を阻害し得るアンチセンス分子ま
たはＶＥＧＦリボザイム等のＶＥＧＦ核酸分子；例えばＶＥＧＦがその天然の細
胞ターゲットに結合する能力を阻害する抗体のような、ＶＥＧＦタンパク質に特
異的に結合する抗体；優性ネガティブＶＥＧＦタンパク質またはその断片；ある
いは例えばＶＥＧＦのプロモーターに結合する低分子のような、ＶＥＧＦ核酸発
現を低下させる物質。

【００２４】 別の好ましい実施形態において、本方法は、ＶＥＧＦ活性を阻害し、さらにＴ
ＳＰ−１および／またはＴＳＰ−２活性を高めることを含む。この中に記載の任
意の方法を用いることによって、ＶＥＧＦ活性を阻害しさらにＴＳＰ−１および
／またはＴＳＰ−２活性を高めることができ、例えば、ＶＥＧＦアンチセンス分
子を用いてＶＥＧＦ活性を阻害することができ、ＴＳＰ−１ポリペプチドを投与
することによってＴＳＰ−１活性を高めることができ、さらにＴＳＰ−２タンパ
ク質をコードする核酸配列を投与することによってＴＳＰ−２活性を高めること
ができる。

【００２５】 別の好ましい実施形態において、本方法は、化学療法剤を投与することをさら
に含む。そのような化学療法剤の例として、タキソールおよびカルボプラチンが
挙げられる。化学療法剤を投与するのと同時にまたは順次に、ＴＳＰ−２活性を
高めることができる。

【００２６】 別の実施形態において、本方法は、被検者に細胞を導入することを含んでいて
差し支えない。好ましい実施形態において、ＴＳＰ−２タンパク質またはその断
片もしくは類似物を発現するように細胞を遺伝子操作した。その細胞は、自家細
胞、同種細胞または異種細胞であって差し支えないが、好ましくは自家細胞であ
る。自家細胞は、好ましくは、例えば上皮細胞等の好ましくない細胞増殖の疾患
を有する被検者に由来する。操作された細胞は、例えば線維芽細胞、ケラチノサ
イト、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、リンパ球、骨髄細胞および
筋肉細胞等の任意のタイプの細胞であって差し支えない。好ましくは、その細胞
は、表皮細胞、前立腺上皮細胞、乳腺上皮細胞および腸上皮細胞等の上皮細胞で
ある。ＴＳＰ−２活性を高めるために、その細胞を被検者に導入して差し支えな
い。その細胞は、好ましくない増殖特性を有する細胞であっても正常細胞であっ
ても差し支えない。

【００２７】 理論的に説明はできないが、本出願人は、少なくとも部分的に、ＴＳＰ−２の
血管新生阻害能力によって、ＴＳＰ−２の腫瘍増殖阻害能力が生じると考えてい
る。

【００２８】 本発明の別の態様において、本方法は、例えば癌性皮膚疾患（例えば皮膚の扁
平上皮癌または悪性メラノーマ）、あるいは、例えば乾癬または乳頭腫形成等の
非癌性皮膚疾患のような、好ましくない皮膚細胞増殖を特徴とする疾患を有する
被検者を治療することを含む。本方法は、例えばＴＳＰ−２活性を高める物質を
投与することによって、ＴＳＰ−２活性を高めることを含む。ＴＳＰ−２活性を
高める物質は：ＴＳＰ−２ポリペプチド、または、例えばＴＳＰ−２誘導ポリペ
プチドまたはそのレトロ逆転ポリペプチド等のその生物活性断片もしくは類似物
；ＴＳＰ−２ポリペプチドまたはその生物活性断片もしくは類似物をコードする
核酸；例えば抗体または低分子等のＴＳＰ−２アゴニスト；あるいは、例えばＴ
ＳＰ−２のプロモーター領域に結合する低分子のようなＴＳＰ−２核酸の発現を
高める物質：の１つ以上であって差し支えない。内因性ＴＳＰ−２活性を高める
ことによって、ＴＳＰ−２レベルを高めることができる。

【００２９】 本発明の別の態様において、本方法は、例えば前立腺癌のような好ましくない
前立腺細胞増殖を特徴とする疾患を有する被検者を治療することを含む。本方法
は、例えばＴＳＰ−２活性を高める物質を投与することによって、ＴＳＰ−２活
性を高めることを含む。ＴＳＰ−２活性を高める物質は：ＴＳＰ−２ポリペプチ
ド、または、例えばＴＳＰ−２誘導ポリペプチドまたはそのレトロ逆転ポリペプ
チド等のその生物活性断片もしくは類似物；ＴＳＰ−２ポリペプチドまたはその
生物活性断片もしくは類似物をコードする核酸；例えば抗体または低分子等のＴ
ＳＰ−２アゴニスト；あるいは、例えばＴＳＰ−２のプロモーター領域に結合す
る低分子のようなＴＳＰ−２核酸の発現を高める物質：の１つ以上であって差し
支えない。内因性ＴＳＰ−２活性を高めることによって、ＴＳＰ−２レベルを高
めることができる。

【００３０】 別の態様において、好ましくない細胞増殖を有することを特徴とする細胞を処
理するために本方法を用いることができる。好ましくない細胞増殖は、良性であ
っても悪性であっても差し支えない。その細胞は、例えば皮膚または前立腺細胞
のような上皮細胞であって差し支えない。本方法は、例えばＴＳＰ−２活性を高
める物質を投与することによってＴＳＰ−２活性を高めることを含む。ＴＳＰ−
２活性を高める物質は：ＴＳＰ−２ポリペプチド、または、例えばＴＳＰ−２誘
導ポリペプチドまたはそのレトロ逆転ポリペプチド等のその生物活性断片もしく
は類似物；ＴＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸、またはその生物活性断片
もしくは類似物；例えば抗体または低分子等のＴＳＰ−２アゴニスト；あるいは
、例えばＴＳＰ−２のプロモーター領域に結合する低分子のようなＴＳＰ−２核
酸の発現を高める物質：の１つ以上であって差し支えない。

【００３１】 本方法をインビボ、インビトロまたはエキソビボで実施して差し支えない。

【００３２】 別の態様において、血管新生に関連する炎症性疾患を治療するために、本方法
を用いることができる。例えば、その疾患は、乾癬、リューマチ様関節炎または
多発性硬化症であって差し支えない。本方法は、例えばＴＳＰ−２活性を高める
物質を投与することによってＴＳＰ−２活性を高めることを含む。ＴＳＰ−２活
性を高める物質は：ＴＳＰ−２ポリペプチド、または、例えばＴＳＰ−２誘導ポ
リペプチドまたはそのレトロ逆転ポリペプチド等のその生物活性断片もしくは類
似物；ＴＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸、またはその生物活性断片もし
くは類似物；例えば抗体または低分子等のＴＳＰ−２アゴニスト；あるいは、例
えばＴＳＰ−２のプロモーター領域に結合する低分子のようなＴＳＰ−２核酸の
発現を高める物質：の１つ以上であって差し支えない。

【００３３】 本方法をインビボ、インビトロまたはエキソビボで実施して差し支えない。

【００３４】 別の態様において、例えば目の好ましくない血管新生のような好ましくない血
管新生を特徴とする疾患を治療するために、本方法を用いることができる。例え
ば、その疾患は、例えば糖尿病性網膜症のような好ましくない血管新生を特徴と
する網膜疾患であって差し支えない。別の実施形態において、その疾患は、例え
ば、冠動脈形成術の後のレステノシスであって差し支えない。本方法は、例えば
ＴＳＰ−２活性を高める物質を投与することによってＴＳＰ−２活性を高めるこ
とを含む。ＴＳＰ−２活性を高める物質は：ＴＳＰ−２ポリペプチド、または、
例えばＴＳＰ−２誘導ポリペプチドまたはそのレトロ逆転ポリペプチド等のその
生物活性断片もしくは類似物；ＴＳＰ−２ポリペプチドまたはその生物活性断片
もしくは類似物をコードする核酸；例えば抗体または低分子等のＴＳＰ−２アゴ
ニスト；あるいは、例えばＴＳＰ−２のプロモーター領域に結合する低分子のよ
うなＴＳＰ−２核酸の発現を高める物質：の１つ以上であって差し支えない。

【００３５】 好ましい実施形態において、ＴＳＰ−２活性を高める物質を局所的に用いて差
し支えない。例えば、疾患が冠動脈形成術の後のレステノシスであり、ＴＳＰ−
２活性を高める物質をステント(stent)に適用し、例えばステントに局所的に適
用する。

【００３６】 本方法をインビボ、インビトロまたはエキソビボで実施して差し支えない。

【００３７】 別の態様において、本発明は、例えば好ましくない皮膚症状を有する被検者等
の被検者を治療する方法に関する。好ましくない皮膚症状は、例えば、真皮また
は表皮の構造に影響を及ぼす等、皮膚の構造に影響を及ぼし、あるいは発毛に影
響を及ぼす症状である。開始を遅らせ、発生の可能性を減らし、または現在の疾
患を治療するために、その治療を施して差し支えない。その症状は、例えば、遺
伝因子（例えば表皮剥離）または環境因子（例えば紫外線（ＵＶ）照射）、ある
いはそれら両方の組合せ（例えば老化）によって生じ得る。その症状は良性であ
っても悪性であっても差し支えない。

【００３８】 本方法は、例えばＴＳＰ−２活性を高めまたは低下させる等、ＴＳＰ−２活性
を調節することを含む。ＴＳＰ−２活性を高める物質は：ＴＳＰ−２ポリペプチ
ド、または、例えばＴＳＰ−２誘導ポリペプチドまたはそのレトロ逆転ポリペプ
チド等のその生物活性断片もしくは類似物；ＴＳＰ−２ポリペプチドまたはその
生物活性断片もしくは類似物をコードする核酸；例えば抗体またはＴＳＰ−２活
性を有する低分子等のＴＳＰ−２アゴニスト；あるいは、例えばＴＳＰ−２のプ
ロモーター領域に結合する低分子のようなＴＳＰ−２核酸の発現を高める物質：
の１つ以上であって差し支えない。内因性ＴＳＰ−２活性を高めることによって
ＴＳＰ−２活性のレベルを高めることができる。例えばＴＳＰ−２遺伝子の転写
を高めることによって遺伝子発現レベルを高め；例えばｍＲＮＡの２次および３
次構造を変化させることによってＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの安定性を高め；例えば
ＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの配列を変化させることによってＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの翻
訳を高め；あるいはＴＳＰ−２タンパク質の安定性を高める：ことによって、活
性を高めることができる。例えば内因性ＴＳＰ−２遺伝子の調節配列を変化させ
ることによって、ＴＳＰ−２遺伝子の転写を高めることができる。１つの実施形
態において、正の制御要素（例えばエンハンサーまたは転写活性因子のためのＤ
ＮＡ結合部位等）の付加；負の制御要素（例えば転写レプレッサーのためのＤＮ
Ａ結合部位等）の欠失；および／または、別の遺伝子の制御配列による内因性制
御配列もしくはその中の要素の置換：によって、制御配列を変化させることがで
き、それによってＴＳＰ−２遺伝子をより効率的に転写させることができる。

【００３９】 好ましい実施形態において、静脈内、皮内、皮下、経口および／または経皮（
局所）投与によって、ＴＳＰ−２活性を高める物質を投与することができる。

【００４０】 別の実施形態において、例えばＴＳＰ−２活性を低下させる物質を投与するこ
とによって、ＴＳＰ−２活性を低下させる。ＴＳＰ−２活性を低下させる物質は
：例えば細胞ＴＳＰ−２ ｍＲＮＡに結合し、さらに例えばＴＳＰ−２の転写を
阻害することによってそのタンパク質の発現を阻害するようなアンチセンス分子
またはＴＳＰ−２リボザイム等のＴＳＰ−２核酸分子；例えばＴＳＰ−２がその
天然の細胞ターゲットに結合する能力を阻害する抗体のような、ＴＳＰ−２タン
パク質に特異的に結合する抗体；優性ネガティブＴＳＰ−２タンパク質またはそ
の断片；あるいは、例えばＴＳＰ−２のプロモーターに結合する低分子のような
、ＴＳＰ−２核酸の発現を低下させる物質：の１つ以上であって差し支えない。
内因性ＴＳＰ−２活性を低下させることによって、ＴＳＰ−２レベルを低下させ
ることができる。例えば、ＴＳＰ−２遺伝子の転写を低下させることによって遺
伝子発現レベルを低下させ；例えばｍＲＮＡの２次および３次構造を変化させる
ことによってＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの安定性を低下させ；例えばＴＳＰ−２ ｍＲ
ＮＡの配列を変化させることによってＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの翻訳を低下させ；
および／またはＴＳＰ−２タンパク質の安定性を低下させる：ことによって活性
を低下させることができる。例えば内因性ＴＳＰ−２遺伝子の調節配列を変化さ
せることによって、ＴＳＰ−２遺伝子の転写を低下させることができる。１つの
実施形態において、負の制御配列（例えば転写レプレッサーのためのＤＮＡ結合
部位等）の付加によって、制御配列を変化させることができる。

【００４１】 好ましい実施形態において、静脈内、皮内、皮下、経口および／または経皮（
局所）投与によって、ＴＳＰ−２活性を低下させる物質を投与することができる
。

【００４２】 上記の方法をインビボまたはエキソビボで実施することができる。

【００４３】 好ましい実施形態において、本方法は、異常なまたは好ましくない皮膚構造を
有する被検者を治療することを含む。異常なまたは好ましくない皮膚構造は、例
えば、老化またはＵＶ障害等の遺伝因子または環境因子によって生じ得る。本方
法は、そのような治療を必要とする被検者を特定し、さらに異常なまたは好まし
くない皮膚構造が治療されるようにＴＳＰ−２活性レベルを高めることを含んで
いて差し支えない。

【００４４】 １つの実施形態において、本方法は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって老
化した皮膚を治療することを含む。

【００４５】 １つの実施形態において、本発明は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって乾
癬を治療することを含む。

【００４６】 １つの実施形態において、本発明は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによってバ
ラ疹(rosecea dermatosis)を治療することを含む。

【００４７】 別の実施形態において、本発明は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって、例
えばＵＶ照射のような光線照射によって生じた皮膚障害を治療することを含む。

【００４８】 別の実施形態において、本発明は、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって異常
な発毛を治療することを含む。

【００４９】 好ましい実施形態において、本発明は、ＴＳＰ−１活性を高めることをさらに
含む。同時にまたは順次にＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２活性を高めて差し支えな
い。通常、ＴＳＰ−２活性を高めるのに有用な任意の方法をＴＳＰ−１に適用す
ることができる。例として、例えばＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２の両方のポリペ
プチドまたはその生物活性断片もしくは類似物；ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２の
両方のポリペプチドまたはその生物活性断片もしくはその類似物をコードする核
酸、；例えば抗体、またはＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２の発現を高める低分子の
ようなＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２アゴニスト；あるいは例えばＴＳＰ−１ポリ
ペプチドとＴＳＰ−２をコードする核酸のような上記の要素の他の組合せ：を投
与することによって、ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２活性を高めることができる。
また、例えばＴＳＰ−２のために記載された方法に類似の方法によって、内因性
ＴＳＰ−１活性を高めることによって、ＴＳＰ−１活性を高めることができる。

【００５０】 別の実施形態において、ＴＳＰ−２タンパク質またはその断片もしくは類似物
を発現するように細胞を遺伝子操作した。その細胞は自家細胞、同種細胞または
異種細胞であって差し支えないが、好ましくは自家細胞である。自家細胞は、好
ましくは、例えば乾癬等の好ましくない皮膚症状を有する被検者に由来する。

【００５１】 別の態様において、本発明は、ＴＳＰ−２ ＲＮＡ；ＴＳＰ−２ ＤＮＡ；また
はＴＳＰ−２タンパク質の存在について、細胞、組織または被検者を評価する方
法に関する。好ましい実施形態において、その被検者は、例えば扁平上皮癌、メ
ラノーマまたは前立腺癌等の好ましくない皮膚または前立腺の細胞増殖の危険性
があると診断されている。好ましい実施形態において、危険性のある組織は、例
えば皮膚または前立腺組織のような上皮組織である。好ましい実施形態において
、本方法は、生物試料中のＴＳＰ−２核酸またはタンパク質の存在が検出される
ように、ＴＳＰ−２タンパク質または例えばｍＲＮＡのようなＴＳＰ−２核酸を
検出し得る化合物または物質と、生物試料（例えば細胞試料）とを接触させるこ
とを含む。その化合物または物質は、例えば標識核酸プローブのようなＴＳＰ−
２ ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸プローブ、または例えば標識抗体のよ
うなＴＳＰ−２タンパク質に結合し得る抗体等であって差し支えない。

【００５２】 １つの実施形態において、被検者が、例えば腫瘍を発症する等、好ましくない
増殖の危険性を有するか否かを評価するために本方法を用いることができる。Ｔ
ＳＰ−２活性の低下は、危険性を有する被検者の指標となり得る。別の実施形態
において、例えば腫瘍が初期ステージであるか例えば転移ステージのような進行
ステージであるかを特定することによって例えば癌のような腫瘍を段階付けする
等、障害または疾患の症状を特徴付けまたは段階付けするために本方法を用いる
ことができる。比較的低レベルのＴＳＰ−２は、比較的進行した疾患ステージを
示唆する。

【００５３】 １つの実施形態において、本方法は対照を評価することを含み、例えばその対
照は非癌性の細胞または組織であって差し支えない。

【００５４】 別の実施形態において、例えばその細胞が癌性か否かを特定する目的で、例え
ば皮膚細胞または前立腺細胞のような上皮細胞等の細胞を評価するのに本方法を
用いることができる。本方法は、例えば癌性であることが予測される上皮組織等
の組織由来の細胞を準備し；ストリンジェントな条件下でＴＳＰ−２核酸配列に
ハイブリダイズし得る一本鎖核酸プローブとその細胞のｍＲＮＡとを接触させ；
さらにそのプローブが細胞のｍＲＮＡにハイブリダイズした量を、そのプローブ
が例えば正常細胞のような対照細胞のｍＲＮＡにハイブリダイズした量と比較す
る：工程を含む。対照細胞と比較して、その細胞におけるハイブリダイズの量が
少ないことは（例えば信号強度によって特定）、その試験細胞が癌性であること
の指標となる。プローブは、任意の長さであって差し支えなく、例えば、プロー
ブは２０、３０、５０、６０ヌクレオチド以上の長さであって差し支えない。in
situハイブリダイゼーションを実施して差し支えなく、またはノーザン分析と
して実施しても差し支えない。

【００５５】 別の実施形態において、例えばその細胞が癌性か否かを特定する目的で、例え
ば皮膚細胞または前立腺細胞のような上皮細胞等の細胞を評価するのに本方法を
用いることができる。本方法は、例えば癌性であることが予測される上皮組織等
の組織由来の細胞を準備し；ＴＳＰ−２と免疫複合体を形成する抗体とその細胞
のタンパク質とを接触させ；さらにその細胞における免疫複合体形成の量を、例
えば正常細胞のような対照細胞における免疫複合体形成の量と比較する：工程を
含む。対照細胞と比較して、その細胞における免疫複合体形成の量が少ないこと
は、その関心細胞が癌性であることの指標となる。生物試料中のＴＳＰ−２核酸
またはタンパク質を検出するためのキットも本発明の範囲内に含まれる。そのキ
ットは、ＴＳＰ−２核酸配列またはタンパク質に選択的に結合し得るプローブを
含む。そのプローブは、例えば標識抗体のような標識プローブであって差し支え
ない。そのキットは、標準および対照も含んでいて差し支えなく、例えばキット
は野生型ＴＳＰ−２核酸配列を含んでいて差し支えない。また、そのキットは、
ＴＳＰ−２を検出するためにどのようにキットの成分を用いるかを概説した取扱
説明書も含んでいて差し支えない。

【００５６】 別の態様において、本発明は、候補化合物を評価する方法に関する。本方法は
、例えばＴＳＰ−２ポリペプチドまたはその断片もしくは類似物のような、例え
ば皮膚または前立腺の疾患のような上皮細胞疾患等の好ましくない増殖を特徴と
する疾患を治療するために用いることができる化合物を同定するのに有用である
。本方法は、例えばＴＳＰ−２遺伝子の発現またはＴＳＰ−２タンパク質の活性
を高めることによってＴＳＰ−２活性を高めるような化合物の能力を評価するこ
とができる。本方法は：細胞、組織または被検者を準備し；その細胞、組織また
は被検者を候補化合物で処理し；さらにＴＳＰ−２ ＲＮＡ、ＴＳＰ−２ ＤＮＡ
またはＴＳＰ−２タンパク質のレベルを特定する：ことを含む。本方法は、例え
ば候補化合物で処理されない同一細胞のような、対照細胞、組織または被検者を
評価することをさらに含んでいて差し支えない。対照と比較して、化合物で処理
された細胞、組織または被検者におけるＴＳＰ−２活性の上昇は、例えば良性ま
たは悪性の好ましくない細胞増殖のような、好ましくない細胞増殖を治療するた
めに有用な化合物の指標となり得る。本方法は、例えば皮膚または前立腺の腫瘍
等の血管新生または腫瘍増殖を阻害する化合物の能力について、化合物を試験す
ることをさらに含んでいて差し支えない。この中に記載のマウス腫瘍モデルは本
目的のために有用である。好ましい実施形態において、その化合物はＴＳＰ−２
の断片または類似物である。

【００５７】 また、本発明は、ＴＳＰ−２タンパク質と相互作用する化合物を同定する方法
に関する。好ましい実施形態において、本方法は：化合物がＴＳＰ−２タンパク
質に結合して複合体を形成し得る条件下において、化合物とＴＳＰ−２タンパク
質とを接触させ；さらにＴＳＰ−２タンパク質と化合物との複合体形成を検出し
、その複合体中に化合物が存在することによって、化合物がＴＳＰ−２タンパク
質に結合する能力が示唆される：各工程を含んでいて差し支えない。例えば、細
胞を含まない測定法を用いて、化合物または物質を同定する方法を実施する。例
えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＴＳＰ−２融合タンパク質のよう
な、基質にＴＳＰ−２を結合させることができる融合タンパク質を用いて、グル
タチオンセファロースビーズまたはグルタチオン誘導マイクロタイタープレート
のような適切な基質にＴＳＰ−２を固定化させることができる。この中に記載の
マウス腫瘍モデルは、同定された化合物が、例えば腫瘍増殖のような良性のまた
は悪性の好ましくない細胞増殖等の好ましくない細胞増殖を阻害し得るか否かを
評価するのに有用である。好ましい実施形態において、その化合物はＴＳＰ−２
の断片または類似物である。

【００５８】 別の実施形態において、細胞ベースの測定法を用いて、ＴＳＰ−２タンパク質
と相互作用する化合物を同定することができる。それら方法は、ＴＳＰ−２の生
物活性を促進させる化合物の能力に基づいて、化合物を同定することを含んでい
て差し支えない。好ましい実施形態において、その化合物は、ＴＳＰ−２の生物
活性を調節する。好ましい実施形態において、その化合物はＴＳＰ−２の断片ま
たは類似物である。

【００５９】 別の態様において、本発明は、ＴＳＰ−２核酸の発現を高める化合物を同定す
る方法に関する。好ましい実施形態において、例えば標識プローブのような、例
えばＴＳＰ−２ ｍＲＮＡのようなＴＳＰ−２核酸分子にハイブリダイズし得る
核酸プローブを用いて核酸発現を評価することができる。別の好ましい実施形態
において、例えばＴＳＰ−２核酸分子の調節配列のようなＴＳＰ−２核酸分子と
化合物とを接触させ、さらにインビトロまたはインビボにおいてＴＳＰ−２転写
を評価することによって、例えばＤＮＡ発現のようなＴＳＰ−２核酸の発現を評
価することができる。例えば、標識抗体のような抗体を用いてＴＳＰ−２タンパ
ク質の産生を検出することによって、あるいは、例えばＴＳＰ−２の調節配列に
融合させたマーカー遺伝子であって、マーカーを産生する、例えばｌａｃＺ遺伝
子のようなマーカー遺伝子を用いて細胞活性を特定することによって、ＴＳＰ−
２転写を評価することができる。本方法は、例えば皮膚または前立腺の腫瘍のよ
うな腫瘍増殖を阻害する化合物の能力について、化合物を試験することをさらに
含んでいて差し支えない。この中に記載のマウス腫瘍モデルは、同定された化合
物が、例えば腫瘍増殖のような良性のまたは悪性の好ましくない細胞増殖等の好
ましくない細胞増殖を阻害し得るか否かを評価するのに有用である。好ましい実
施形態において、その化合物はＴＳＰ−２の断片または類似物である。

【００６０】 本発明の別の態様は、候補化合物のインビボでの評価のための方法に関する。
１つの実施形態において、候補化合物が、ＴＳＰ−２活性を高め、それによって
好ましくない細胞増殖を阻害するか否かを評価するために本方法を用いることが
できる。好ましくない細胞増殖は、良性であっても悪性であっても差し支えない
。本方法は：その細胞のＴＳＰ−２活性が同じタイプの組織の正常細胞と比べて
抑制されている動物（例えばヌードマウスのような免疫不全動物）に、好ましく
ない細胞増殖を特徴とする細胞（例えばＡ４３１細胞株等の扁平上皮癌または例
えばＭｅＷｏ細胞株等のメラノーマのような癌等の好ましくない皮膚または前立
腺の細胞増殖のような好ましくない上皮細胞増殖）を導入し；さらに例えば癌形
成のような好ましくない細胞増殖をもたらし；候補化合物でその細胞を処理し；
さらにＴＳＰ−２活性を特定する：各工程を含んでいて差し支えない。本方法は
：例えば腫瘍壊死領域の同定によってまたは腫瘍サイズの同定によって、化合物
がその動物中の癌細胞の増殖または転写の速度に影響を及ぼすか否かを特定する
ことをさらに含んでいて差し支えない。化合物の存在下における増殖または転移
の速度の低下は、癌を治療するのにその化合物を用いることができることの指標
である。別の実施形態において、１つの特定形態の好ましくない細胞増殖（例え
ば皮膚癌等）においてＴＳＰ−２活性を高める能力を有する候補化合物を、別の
細胞タイプの癌（例えば前立腺癌）を治療するのに用いることができるか否かを
特定するために本方法を用いることができる。

【００６１】 また、本発明は、例えば異常な細胞増殖に関連する疾患（例えば皮膚癌または
前立腺癌のような癌等）のような、異常なＴＳＰ−２核酸の発現および／または
ＴＳＰ−２タンパク質活性を特徴とする疾患の危険性がある被検者を評価するた
めの方法に関する。本方法は、ＴＳＰ−２遺伝子中の遺伝子損傷を例えば検出等
して評価し、あるいはＴＳＰ−２遺伝子の誤発現(misexpression)を例えば検出
等して評価し、それによって、被検者がその疾患の危険性を有するか否か（例え
ばその疾患であるか、またはその疾患になりやすいか）を特定することを含む。
好ましい実施形態において、本方法は、例えば被検者由来の細胞試料中における
、例えばＴＳＰ−２タンパク質をコードする遺伝子に影響を及ぼす変化を特徴と
する損傷のような遺伝子損傷の存在または不在を評価し、あるいはＴＳＰ−２遺
伝子の誤発現を評価することを含む。例えば標識プローブのようなＴＳＰ−２
ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る核酸プローブと、試料とを接触させることによ
って、遺伝子損傷を評価することができる。例えば標識抗体のようなＴＳＰ−２
タンパク質に結合し得る抗体を用いて発現を評価することができる。好ましい実
施形態において、胎児診断または新生児診断において、本方法を用いることがで
きる。

【００６２】 別の態様において、本発明は：ＴＳＰ−２、または例えばＴＳＰ−２誘導ペプ
チドもしくはそのレトロ逆転ペプチドのような治療的に活性なＴＳＰ−２の断片
または類似物；ＴＳＰ−２または治療的に活性なその断片または類似物をコード
する核酸；ＴＳＰ−２遺伝子の発現または活性のレベルを高める化合物；および
１つ以上の付加的成分（例えば、担体、希釈剤または溶媒）：を含む、好ましく
ない増殖を阻害するための例えば治療組成物のような組成物に関する。付加的成
分は、インビトロおよびインビボでの薬剤的または獣医的な使用のためにその組
成物を有用にするような成分であって差し支えない。

【００６３】 別の態様において、本発明は、ＴＳＰ−２のコード領域を含む単離核酸分子、
またはＴＳＰ−２の断片またはペプチドベースの類似物に関する。核酸は、天然
のＴＳＰ−２ヒト配列には存在しない５’または３’核酸配列を包含していて差
し支えない。１つの実施形態において、ヒトＴＳＰ−２をコードする核酸は、例
えばＴＳＰ−２発現を調節する５’および／または３’配列のような機能的調節
配列を包含する。１つの実施形態において、対照配列は、内因性の調節配列であ
って差し支えない。異種調節配列は、ヒトまたはヒト以外の調節配列、あるいは
両方の組合せであって差し支えない。調節配列は、調節配列の１つ以上の要素を
包含していて差し支えなく、例えば調節配列は、プロモーター、エンハンサー、
インシュレーターまたはＤＮＡ結合要素を包含していて差し支えない。

【００６４】 １つの実施形態において、核酸分子は５’天然ＴＳＰ−２調節配列の２３９ｂ
ｐ、２５０ｂｐまたは３００ｂｐより長い配列を有する。

【００６５】 別の実施形態において、核酸分子は、３’天然ＴＳＰ−２調節配列の２０３６
ｂｐ、２５００ｂｐまたは３０００ｂｐより長い配列を有する。

【００６６】 別の実施形態において、核酸分子は、分泌シグナル配列を包含する。その分泌
シグナル配列は、ＴＳＰ−２ヒト遺伝子の天然の分泌シグナルであっても、異種
シグナル配列であっても差し支えない。好ましい実施形態において、その分泌シ
グナルは、ＴＳＰ−２が発現される細胞タイプにおいて機能的であるように選択
される。

【００６７】 別の好ましい実施形態において、ＴＳＰ−２のコード領域をコードする配列あ
るいはＴＳＰ−２のコード領域の断片または類似物をコードする配列は、好まし
くはストリンジェントな条件下において、配列番号１の配列に対してハイブリダ
イズし；配列番号１記載のヌクレオチド配列に対して６０％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％以上の配列同一性を有する。他の好ましい実施形態において、単離核酸分子は
、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。

【００６８】 １つの実施形態において、核酸配列は、配列番号２記載のアミノ酸配列に対し
て６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
または９９％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする。別の好ましい
実施形態において、ＴＳＰ−２のコード領域をコードする核酸は、配列番号２の
完全アミノ酸配列に実質的に相同である完全長タンパク質をコードする。別の実
施形態において、核酸は、配列番号２のアミノ酸配列またはその一部に実質的に
相同である哺乳類タンパク質をコードする。

【００６９】 好ましい実施形態において、コードされるＴＳＰ−２タンパク質またはコード
されるＴＳＰ−２の断片もしくは類似物は、アミノ酸配列において、配列番号２
のアミノ酸配列と、１以上で２、３、５、１０、２０または４０以下の残基にお
いて異なる。しかしながら、好ましい実施形態において、その相違は：ＴＳＰ−
２コードタンパク質がＴＳＰ−２の生物活性を表し、例えばコードされたＴＳＰ
−２タンパク質またはその断片もしくは類似物が、天然のＴＳＰ−２の生物活性
を保持しており、例えばＴＳＰ−２タンパク質またはその断片もしくは類似物が
腫瘍の増殖およびサイズを減らすことができる：ような違いである。相違は、ア
ミノ酸の置換、付加または欠失であって差し支えない。その相違が置換である場
合、その置換は保存的変化であって差し支えない。

【００７０】 好ましい実施形態において、ＴＳＰ−２タンパク質のコード領域をコードし、
またはその断片もしくは類似物をコードする核酸は、その核酸配列において、配
列番号１の配列と、１以上で２、３、９、１５、２０、５０または１２０以下の
ヌクレオチドにおいて異なる。しかしながら、好ましい実施形態において、その
相違は：ＴＳＰ−２またはその断片をコードする核酸が、ＴＳＰ−２の生物活性
を表し、例えばコードされたＴＳＰ−２タンパク質またはその断片もしくは類似
物が天然のＴＳＰ−２の生物活性を保持しており、例えばＴＳＰ−２タンパク質
、またはその断片もしくは類似物が腫瘍の増殖およびサイズを減らすことができ
る、ＴＳＰ−２をコードする：ような違いである。相違は、核酸配列の置換、付
加または欠失であって差し支えない。

【００７１】 好ましい実施形態において、コードされたポリペプチドは、例えばリーディン
グフレーム中において、付加的アミノ酸残基、好ましくは配列番号２の配列をコ
ードするゲノムＤＮＡの５’側のゲノムＤＮＡによってコードされる残基に融合
した、配列番号２のアミノ酸配列の全てまたは断片を包含する。

【００７２】 好ましい実施形態において、ＴＳＰ−２ポリペプチドは、１つ、２つまたは３
つ以上の１型反復を有する領域を包含する。好ましくは、１型反復は、約４０か
ら６０、４５から５５、４７から５２アミノ酸の長さであり、好ましくは、配列
番号２の１型反復と約７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有す
る。例えば、配列番号２のほぼ３８２から４２９のアミノ酸；配列番号２のほぼ
４３８から４９０のアミノ酸配列；配列番号２のほぼ４９５から５４７のアミノ
酸配列において、１型反復を見つけることができる。ＴＳＰ−２の１型反復は、
以下の活性の１つ以上を有するものであって差し支えない：（ｉ）膜タンパク質
ＣＤ３６に結合できる；（ｉｉ）内皮細胞の遊走に対するＴＳＰ−２の阻害効果
を促進できる；（ｉｉｉ）例えば内皮細胞アポトーシスのような細胞アポトーシ
スを誘導できる；（ｉｖ）ＴＳＰ−２の抗血管新生活性を有する；あるいは（ｖ
）例えば腫瘍増殖のような良性のまたは悪性の好ましくない細胞増殖等の好まし
くない細胞増殖を阻害できる。好ましい実施形態において、ＴＳＰ−２ペプチド
は、約４、５、６、７、８、１０、１５、２０または５０アミノ酸の長さであり
、かつ内皮細胞の遊走を阻害する配列を包含する。例えば、そのペプチドは、Ｐ
ＷＡＥＷ配列（配列番号２のほぼ３８６から３９０のアミノ酸残基）を包含して
いて差し支えなく、あるいはその断片はＷＳＰＷＡＥＷ配列（配列番号２のほぼ
３８４から３９０のアミノ酸残基）またはどちらかの配列の保存的置換を包含し
ていて差し支えない。他のペプチドは、ＷＳＰＷＡＥＷ配列からの４、５または
６アミノ酸、あるいはその保存的置換を包含していて差し支えない。別の実施形
態において、ＴＳＰ−２ペプチドは、ＴＳＰ−２の１型反復の約５から５０アミ
ノ酸、あるいは１型反復の１方または両方の側にあるＴＳＰ−２配列の約５から
５０アミノ酸を包含する。好ましい実施形態において、その断片は、４、５、６
、７、１０、１５、２０または５０アミノ酸の長さであり、かつ例えばＣＳＶＴ
ＶＧ配列のような、ＣＤ３６に結合する受容体結合配列を有する配列を包含する
。

【００７３】 また、本発明は、好ましくはＴＳＰ−２ポリペプチドの１つ以上の生物活性を
有する、ＴＳＰ−２ポリペプチドの断片および類似物に関する。１つの実施形態
において、ＴＳＰ−２の断片または類似物は、配列番号２のアミノ酸配列に対し
て６０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％相同であるアミノ酸配
列；あるいは配列番号２のアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有
する。ＴＳＰ−２の断片または類似物は：５、１０、２０、５０、１００、１５
０、１７０、２００または２５０アミノ酸以上の長さであり；５以上、好ましく
は１０以上、さらに好ましくは２０以上、最も好ましくは５０、１００、１５０
、２００、２１０または２５０以上の配列番号２の連続アミノ酸：を有するポリ
ペプチドであって差し支えない。好ましい実施形態において、断片または類似物
は：４、５、１０、１５、２０、２５アミノ酸以上の長さであるが、１００アミ
ノ酸の長さ以下であり；さらに天然のＴＳＰ−２ポリペプチドのアゴニストとし
て作用する能力を有し、例えば腫瘍増殖のような良性または悪性の好ましくない
細胞増殖等の好ましくない細胞増殖を阻害する能力を有する。１つの実施形態に
おいて、ＴＳＰ−２の断片または類似物は１型反復を包含し、例えばＴＳＰ−２
断片または類似物は、５、１０、２０、５０、１００、１５０、１７０、２００
または２５０アミノ酸以上の長さであり、さらに１型反復を包含する。別の実施
形態において、ＴＳＰ−２断片または類似物は、１７０アミノ酸以上の長さであ
り、さらに配列番号２の３３０−５００のアミノ酸を包含する。好ましい実施形
態において、その断片は５０アミノ酸以上の長さであり、さらに配列番号２の３
３０−３９０のアミノ酸を包含する。

【００７４】 好ましい実施形態において、核酸は、ＴＳＰ−２タンパク質またはアミノ酸配
列において、配列番号２の配列と、１以上、２、３、５、１０、２０または４０
以下の残基において異なるＴＳＰ−２の断片または類似物をコードする。しかし
ながら、好ましい実施形態において、その相違は：その核酸がＴＳＰ−２生物活
性を表すＴＳＰ−２タンパク質をコードし、例えばコードされたＴＳＰ−２タン
パク質またはその断片もしくは類似物が天然のＴＳＰ−２の生物活性を保持して
おり、例えばその核酸が腫瘍の増殖およびサイズを減らすことができるＴＳＰ−
２タンパク質またはその断片もしくは類似物をコードする：ような違いである。
相違は、核酸の置換、付加または欠失であって差し支えない。別の実施形態にお
いて、ＴＳＰ−２類似物はレトロ逆転ペプチドであって差し支えなく、例えばそ
の配列のアミノ酸の一部または全てがこの中に記載のＴＳＰ−２ペプチドのＤア
ミノ酸であって差し支えない。

【００７５】 別の態様において、本発明は、ＴＳＰ−２ポリペプチドの活性断片または類似
物を同定する方法に関する。１つの実施形態において、断片または類似物が、腫
瘍増殖を阻害する等、好ましくない細胞増殖を阻害し得るか否かを特定するため
に、この中に記載の癌異種移植マウスモデルを用いることができる。

【００７６】 別の態様において、本発明は、例えば天然ＴＳＰ−２ポリペプチドの１つ以上
の生物活性を有するＴＳＰ−２ポリペプチドのような、ＴＳＰ−２ポリペプチド
の断片または類似物を作成する方法に関する。本方法は、例えば、好ましくは非
保存残基であるＴＳＰ−２ポリペプチドの１つ以上の残基の置換または欠失によ
って配列を変化させ、さらに所望の活性についてその修飾ポリペプチドを試験す
ることを含む。別の好ましい実施形態において、本方法は、配列を変化させて、
レトロ逆転ポリペプチド、すなわちそのアミノ酸の一部または全てがＤアミノ酸
であるポリペプチドを得ることを含む。

【００７７】 好ましい実施形態において、コードされたＴＳＰ−２タンパク質は、この中に
記載のＴＳＰ−２配列、ならびに他のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸配列
を含む。

【００７８】 別の態様において、本発明は、例えばこの中に記載の核酸のようなＴＳＰ−２
またはその断片もしくは類似物をコードする核酸を包含する、例えばクローニン
グベクターまたは発現ベクター等のベクターに関する。そのベクターは、プラス
ミドベクターであってもウィルスベクターであっても差し支えない。そのベクタ
ーは、環状であっても線状であっても差し支えない。好ましい実施形態において
、そのベクターは、例えば、複製起点、プロモーターおよび例えば薬剤耐性マー
カーのような選択マーカー等の要素の１つ以上を包含していて差し支えない。ウ
ィルスベクターは、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、Ｓ
Ｖ４０ウィルス、またはヘルペスウィルスであって差し支えない。レトロウィル
スベクターは、例えば腫瘍細胞のような複製細胞のゲノム中に選択的に組み込ま
れるため、特に有用である。あるいは、例えば、ｐＣＤＭ８(Seed (1987) Natur
e 329: 840)およびｐＭＴ２Ｐｃ(Kaufman, (1987) EMBO J., 6: 187-195)等の非
ウィルスベクターを用いても差し支えない。

【００７９】 例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウ
ム沈降法、改変リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン(polybrene)沈降法、リポ
ソーム融合、受容体介在ＤＮＡ輸送等の標準トランスフェクション技術によって
、例えば細菌細胞、酵母細胞、鳥類細胞、または例えばヒト上皮細胞のようなヒ
ト細胞等の哺乳類細胞のような、宿主細胞にベクターを導入することができる。
ベクターは、エピソームのままであっても、あるいは宿主細胞のゲノム中に組み
込まれていても差し支えない。

【００８０】 本発明の別の態様は、ＴＳＰタンパク質またはその断片もしくは類似物を発現
およびコードするように遺伝子操作された細胞に関する。１つの実施形態におい
て、上昇レベルのＴＳＰ−２タンパク質を発現およびコードするように細胞の内
因性ＴＳＰ−２遺伝子を遺伝子操作し、例えば、上昇レベルのＴＳＰ−２を発現
およびコードするようにＴＳＰ−２の調節配列を置換する。別の実施形態におい
て、ＴＳＰ−２を発現およびコードする発現ベクターを用いて、例えばトランス
フェクトしまたは感染させる等、細胞を操作する。その細胞は自家細胞、同種細
胞または異種細胞であって差し支えないが、好ましくは自家細胞である。自家細
胞は、例えば腫瘍のような良性のまたは悪性の好ましくない細胞増殖等の好まし
くない細胞増殖の疾患を有する被検者に由来する細胞であって差し支えない。操
作される細胞は、例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、グ
リア細胞、神経細胞、リンパ球、骨髄細胞および筋肉細胞等の任意のタイプの細
胞であって差し支えない。好ましくは、その細胞は、表皮細胞、前立腺上皮細胞
、乳腺上皮細胞および腸上皮細胞等の上皮細胞である。この中に記載のＴＳＰ−
２核酸配列をエキソビボまたはインビボで細胞に挿入しても差し支えない。エキ
ソビボで細胞を挿入する場合は、その細胞を被検者に導入して差し支えない。

【００８１】 別の態様において、本発明はＴＳＰ−２抗体に関する。その抗体は、ポリクロ
ナール抗体であってもモノクロナール抗体であっても差し支えない。例えば無傷
のタンパク質またはその断片に対して抗体を作成することができる。１つの実施
形態において、抗体は、ＴＳＰ−２タンパク質または断片に対して特異的に結合
することができる。別の実施形態において、抗体は、ＴＳＰ−１に対するよりも
、例えば１０％、２０％または５０％高い親和性のような、有意に高い親和性で
ＴＳＰ−２に結合する。好ましい実施形態において、ＴＳＰ−２エピトープは、
配列番号２の１０、１５、２０または３０アミノ酸ペプチドであり、例えばその
エピトープは１５アミノ酸ペプチドＤＫＤＴＴＦＤＬＦＳＩＳＮＩＮである。別
の好ましい実施形態において、そのエピトープは、１５アミノ酸ペプチドエピト
ープＤＫＤＴＴＦＤＬＦＳＩＳＮＩＮを重複していて差し支えない。

【００８２】 「好ましくない細胞増殖」とは、例えば癌細胞のような非制御増殖等、正常レ
ベルを超えて分裂および複製する細胞を称する。好ましくない細胞増殖は、良性
であっても悪性であっても差し支えない。１つの実施形態において、好ましくな
い細胞増殖は、結果的に、有用な機能を果たさない異常な組織の塊をもたらし、
さらに例えば腫瘍のように、生物の生存に有害となり得る。その腫瘍は良性であ
っても悪性であっても差し支えない。好ましくない細胞増殖は、好ましくない癌
細胞の広がりをも称する。癌細胞の広がりは、局所的または末梢的であっても差
し支えない。ある例において、癌細胞は、血液系およびリンパ系を介して体の他
の部分に遊走（転移）することができる。

【００８３】 この中で用いられている、ポリペプチドの「精製した」または「実質的に純粋
な」、あるいは単離した「調製物」とは、天然において共存する他のタンパク質
、脂肪および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、そのポ
リペプチドは、例えば抗体または例えばアクリルアミドのようなゲルマトリック
ス等の、精製するために用いられる物質からも分離される。好ましくは、そのポ
リペプチドは、精製調製物の１０、２０、５０、７０、８０または９５乾燥重量
％以上を構成する。好ましくは、その調製物は：タンパク質の配列決定を可能と
するのに十分なポリペプチドであり；１、１０または１００μｇ以上のポリペプ
チドであり；１、１０または１００ｍｇ以上のポリペプチドである。

【００８４】 この中で用いられている「細胞の精製調製物」とは、植物細胞または動物細胞
の場合、完全な無傷の植物または動物ではなく、細胞のインビトロ調製物を称す
る。培養細胞または細菌細胞の場合、対象細胞の１０％以上、より好ましくは５
０％以上の調製物から成る。

【００８５】 この中で用いられている「治療」とは、例えば薬物のような治療剤または治療
物質の投与等、任意の治療的処理を含む。

【００８６】 この中で用いられている「被検者」の用語は、例えばヒトのような哺乳類等の
動物を称する。哺乳類は、ヒトであっても、あるいは例えばブタ、トリ、ネコ、
イヌ、サル、ヤギまたはラット、もしくはマウスのような齧歯類等の、ヒト以外
の哺乳類であっても差し支えない。

【００８７】 例えば実質的に純粋なＤＮＡのような、「単離された」または「純粋な核酸」
とは：その核酸が由来する生物の天然ゲノムにおいて直ぐ隣接する配列の１方ま
たは両方（すなわち５’末端にある配列および３’末端にある配列）に直ぐには
隣接しない；またはその核酸が由来する生物において一緒に生じる核酸配列を実
質的に含まない：核酸である。その用語は、例えば、自律複製プラスミドもしく
はウィルス等のベクターに組み込まれた、または原核細胞または真核細胞のゲノ
ムＤＮＡに組み込まれた、あるいは他のＤＮＡ配列から独立した分離分子（例え
ばＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作成したｃＤＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡを含む。実質的に純粋なＤＮＡ
は、配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。

【００８８】 「調節配列」とは、遺伝子発現を制御する任意のまたは全てのＤＮＡ配列を称
する。調節配列の例として：プロモーター；正の調節要素（例えばエンハンサー
または転写活性化因子のためのＤＮＡ結合部位）；負の調節要素（例えば転写レ
プレッサーのためのＤＮＡ結合部位）；およびインシュレーター：が挙げられる
。

【００８９】 「異種」とは、異なる種に由来するＤＮＡまたは組織を称する。

【００９０】 「異種調節配列」とは、その遺伝子の正常な調節配列ではない配列を称する。

【００９１】 この中で用いられている「配列同一性または相同性」とは、２つのポリペプチ
ド分子間または２つの核酸分子間における配列類似性を称する。２つのアミノ酸
配列（例えば配列番号２）または２つの核酸の相同性（％）を特定するため、最
適比較の目的のため配列を整列させる（例えば、他方のタンパク質または核酸と
の最適な整列のため、１方のタンパク質または核酸の配列中にギャップを導入す
る）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残
基またはヌクレオチドを比較する。１方の配列（例えば配列番号２）における位
置が、他方の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチド
で占められている場合、その分子はその位置において相同である（すなわち、こ
の中で用いられているアミノ酸または核酸の相同性は、アミノ酸または核酸の「
同一性」と同義である。その２つの配列間の相同性（％）は、それら配列が共有
する同一である位置の数の関数である（すなわち、相同性（％）＝同一の位置の
＃／全ての位置の＃ｘ１００）。例えば、２つの配列において、１０の内６の位
置が一致または相同である場合、その２つの配列は６０％相同でありまたは６０
％の配列同一性を有する。例示として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣ
は、５０％相同性または配列同一性を有する。通常、最大の相同性または配列同
一性をもたらすように整列させてから比較を実施する。

【００９２】 配列の比較および２つの配列の相同性（％）の特定は、数学アルゴリズムを用
いて実施され得る。好ましい、配列の比較のために利用される数学アルゴリズム
の非限定的例は、Karlin およびAltschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87: 2264-68, 1990)、またはそれを改変したアルゴリズム(Karlin and A
ltschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993)である。そのような
アルゴリズムをＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)(Alts
chul, et al. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990)に組み込む。本発明のＴＳＰ
−２核酸分子に対して相同であるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴ
プログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド
サーチを実施することができる。本発明のＴＳＰ−２タンパク質分子に対して相
同であるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、
ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質サーチを実施することができる。比
較の目的でギャップの入った整列を得るために、Altschul et al., Nucleic Aci
ds Res. 25(17): 3389-3402, 1997に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する
ことができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用す
る場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初
期パラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。
別の好ましい、配列の比較に利用される数学アルゴリズムの非限定的例は、Maye
rs and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズム
をＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム(v
ersion 2.0)に組み込む。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを
利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および
４のギャップペナルティを用いることができる。

【００９３】 「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」の用語は、この中で互
換的に用いられる。

【００９４】 この中で用いられている「低分子」の用語は、２，０００未満の、好ましくは
１，０００未満の分子量を有する、例えば有機分子等のペプチド、ペプチド模倣
物または非ペプチド化合物を含む。

【００９５】 例えばこの中に記載のインビボマウスモデルにおいて腫瘍サイズを縮小しまた
は血管分布を減らすことができる等、この中に開示のＴＳＰ−２の１つ以上の特
性を有する場合、そのポリペプチドは、ＴＳＰ−２生物活性を有する。この中に
開示のＴＳＰ−２の１つ以上の特性を有するポリペプチドのアンタゴニスト、ア
ゴニストまたはスーパーアゴニストである場合、そのポリペプチドは生物活性を
有する。

【００９６】 この中で用いられている「誤発現」とは、ＲＮＡまたはタンパク質レベルにお
ける、非野生型パターンの遺伝子発現を称する。その用語は：非野生型レベルで
の発現、すなわち過剰または過少発現；その遺伝子が発現される時間または段階
に関して野生型と異なる発現パターン、例えば予定された発生期間または段階に
おける上昇したまたは低下した発現（野生型と比較して）；予定された細胞型ま
たは組織型における低下した発現（野生型と比較して）に関して野生型と異なる
発現パターン；発現ポリペプチドのスプライシングサイズ、アミノ酸配列、翻訳
後修飾または生物活性に関して野生型と異なる発現パターン、例えば刺激物の強
さの上昇または低下の存在下における上昇したまたは低下した発現（野生型と比
較して）のパターン：を含む。この中に記載のように、本発明の１つの態様は、
ＴＳＰ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する実質的に純粋
な（または組換え）核酸および／またはそのような核酸の等価物に関する。この
中で用いられている核酸の用語は、断片および等価物を含めて差し支えない。等
価物の用語は、機能的に等価であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を称する。等価ヌクレオチド配列は、例えば対立遺伝子変異体のような1つ以上
のヌクレオチドの置換、付加または欠失による異なる配列を含み、さらに遺伝暗
号の縮重によってこの中に開示されたヌクレオチド配列と異なる配列も含む。

【００９７】 この中で用いられている「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」
の用語は、その条件下でヌクレオチド配列が通常お互いにハイブリダイズしたま
まであるような、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を称する。そのよう
なストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molec
ular Biology, John Wiley ＆ Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されてい
る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例は、６ｘ塩化
ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、４５℃でのハイブリダイゼーシ
ョン、およびそれに続く、０．２ｘＳＳＣ、００．１％ＳＤＳ中、５０−６５℃
での１回以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下において、
配列番号１の配列に対してハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、
天然の核酸分子に相当する。この中で用いられている「天然の」核酸分子は、天
然に生じるヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば天然タン
パク質をコードする）を称する。１つの実施形態において、その核酸は、天然Ｔ
ＳＰ−２タンパク質をコードする。

【００９８】 以下の詳細な説明および請求項によって本発明の別の特徴および利点が明らか
になるであろう。

【００９９】 図面の簡単な説明 図１は、ＴＳＰ−２のヌクレオチド配列を表す（配列番号１）。

【０１００】 図２は、ＴＳＰ−２のアミノ酸配列を表す（配列番号２）。

【０１０１】 図３は、トランスフェクトされたＴＳＰ−２がＡ４３１扁平上皮癌細胞（左）
およびＭｅＷｏ悪性メラノーマ（右）の皮内での腫瘍増殖を阻害することを示す
グラフである。

【０１０２】 図４は、腫瘍血管新生、平均血管密度（図４Ａ）、血管サイズ（図４Ｂ）、５
００μｍ２未満から１５００μｍ^２ を超えるサイズの範囲で観察される血管の
数（図４Ｃ）、および血管によって覆われる組織面積の割合（％）（図４Ｄ）に
対するＴＳＰ−２の効果を示すグラフである。

【０１０３】 図５は、ＤＭＢＡ／ＴＰＡ発癌プロトコルで処理したＴＳＰ−２欠損マウスに
おける、乳頭腫の発達および発生を示す。図５ＡはＴＳＰ−２欠損マウスにおけ
る乳頭腫の加速された発達を示す。図５ＢはＴＳＰ−２欠損マウスにおける乳頭
腫の非常に高い発生を示す。

【０１０４】 図６は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）の遊走、およびそれら細胞
に対する、ＣＤ３６受容体へのＴＳＰ−１（Ｔ１）またはＴＳＰ−２（Ｔ２）の
結合の影響を示すグラフである。ＨＤＭＥＣを単独で（Ｃ）；ＴＳＰ−１（Ｔ１
）またはＴＳＰ−２（Ｔ２）の存在下で；あるいは抗ＣＤ３６抗体（３６）、な
らびにＴＳＰ１（ＴＳ１）またはＴＳＰ−２（ＴＳ２）の存在下で：インキュベ
ートした。

【０１０５】 図７は、種々の合成ＴＳＰ−２誘導ペプチドの存在下におけるＨＤＭＥＣの遊
走を示すグラフである。ペプチド１、２、３および４（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４
）はＴＳＰ−２のプロコラーゲン領域から派生し、ペプチド７（Ｐ７）はＴＳＰ
−２の最初の１型反復から派生した。

【０１０６】 発明の詳細な説明 本発明は、例えば腫瘍増殖を阻害する等、好ましくない血管新生および細胞増
殖を治療するために、ＴＳＰ−２分子を用いることができることの発見に部分的
に基づく。

【０１０７】 抗ＴＳＰ−２抗体の作成 ＴＳＰ−２コード領域のＮ末端配列（ＡＡ２２−３６）に由来するＡ１５ア
ミノ酸ペプチドＤＫＤＴＴＦＤＬＦＳＩＳＮＩＮ（配列番号３）を用いて、標準
技術によって２匹のウサギを免疫した。その配列は、シグナル配列の終わりの直
ぐ後に始まり、ヒトＴＳＰ−１と共通のアミノ酸を３つしか持たない。抗血清が
ヒトＴＳＰ−１と交差反応しない可能性を高めるためその配列を選択した。

【０１０８】 内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、ならびに内皮細胞溶解物およびなら
し培地のウェスタンブロットにおいて、ＴＳＰ−２に相当する約１８０および１
３５ｋＤａの２つのバンドを特異的に検出したポリクロナール抗体Ｒ８１９３９
を得た。ヒト血小板から精製された天然ヒトＴＳＰ−１が検出されないことに基
づき、その抗体の特異性を実証した。上記と同一の１５-ＡＡペプチドを用いて
アフィニティー精製し、免疫組織化学分析に用いた。抗体Ｒ８１９３９を用いた
場合に、ＴＳＰ−２をトランスフェクトしたＡ４３１のならし培地から得たＴＳ
Ｐ−２タンパク質が強く検出され、一方、ベクターのみをトランスフェクトした
Ａ４３１クローンおよびＴＳＰ−１過剰発現クローンから得たならし培地ではＴ
ＳＰ−２が検出されなかったことから、その抗体の特異性がさらに実証された。
従って、Ｒ８１９３９は、選択的に分泌ＴＳＰ−２を認識し、トランスフェクト
されたＡ４３１腫瘍細胞のならし培地中のＴＳＰ−１を認識しなかった。

【０１０９】 ヒトＴＳＰ−２ ｃＤＮＡのクローニング ヒト胎盤から得たMarathon-Ready cDNA(Clontech, Palo Alto, CA)、ならび
にヒトＴＳＰ−２特異的プライマー５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣ
ＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号４）（前方プライマー）および５’−Ｇ
ＡＡＴＴＣＴＡＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣ−３’（配列番号５）を用
いて、ヒトＴＳＰ−２ ｃＤＮＡにおいてＰＣＲ増幅を実施した。Expand Long T
emplate PCR System(Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany)を用いて、製品
の使用説明書に従ってＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は以下の通りである：９４
℃での２分間のインキュベーション、続いて９４℃で１０秒間、６５℃で３０秒
間、６８℃で２分間の工程を１０サイクル。続いて、６８℃でのインキュベーシ
ョンをさらに２０秒間延長することを除いて同じインキュベーション温度および
時間でさらに２５サイクル。１％アガロース／１ｘＴＡＥゲル上において、３．
６ｋｂＰＣＲ産物を可視化し、さらにＱＬＡＥＸキット(Qiagen)を用いて、その
製品の使用説明書に従って、ゲル精製した。次に、洗浄し、さらに製品の使用説
明書に従って、PCR-Script クローニングベクター(Invitrogen)のＥｃｏＲＩ制
限酵素部位にクローン化した。制限酵素地図を作成することによって、およびサ
ンガーのジデオキシ法を用いて直接配列決定することによって、クローニングベ
クターへの挿入を上手く実施した。４つの別個のｃＤＮＡクローンを完全に配列
決定した。クローン１０は、完全コード配列（ヌクレオチド２６からヌクレオチ
ド３５４４）を包含する３，５９６ｂｐの特異的ヒトＴＳＰ−２配列から成る。
そのｃＤＮＡ配列は、遺伝子バンク登録番号Ｌ１２３５０と９９．６％の同一性
を示す(LaBell et al., Genomics, 1992, 12: 421-429)。クローン１０の推定ア
ミノ酸配列は、１１７２アミノ酸を包含し、さらにＬ１２３５０の推定アミノ酸
配列と９９．６％の類似性を示す。

【０１１０】 次に、ＴＳＰ−２ ｃＤＮＡをｐＳｅｃＴａｇベクター(Invitrogen)中にクロ
ーン化し、さらに昆虫細胞をトランスフェクトするのに用いた。培地中に分泌さ
れた組換えヒトＴＳＰ−２を、ヘパリン−セファロースカラムによって精製し、
還元条件下において、１８０ｋＤａの無傷分子および１３５ｋＤａの切断産物の
２つの形態が認められた。

【０１１１】 それら方法を用いて、完全長ＴＳＰ−２を得たが、そのタンパク質収率は相対
的に低かった。従って、２９３のヒト胚性腎臓細胞を、異なるヒトＴＳＰ−２発
現ベクターでトランスフェクトした。以下のように改変されたＰＣＥＰ４ベクタ
ー(Invitrogen)を用いた：ＴＳＰ−２挿入部位の前にＢＭ４０シグナルペプチド
配列を導入し；安定にトランスフェクトされたクローンの迅速でかつ効率的な抗
生物質選択のために抗生物質選択遺伝子をプロマイシン遺伝子で置換し；さらに
、組換えタンパク質の精製を容易にするため、全部で８のヒスチジン残基をＣ末
端の端部に入れた。そのベクターを用いて、安定にトランスフェクトされた２９
３細胞は、大量の組換えタンパク質を産生し、さらに哺乳類細胞を用いることに
よって組換えＴＳＰ−２の効率的なグリコシル化が確実となった。４つの異なる
組換えＴＳＰ−２タンパク質が発現された。構成物１は、ＴＳＰ−１とほとんど
相同性を有さないＴＳＰ−２のＮ末端プロコラーゲン領域（ヌクレオチド２９４
−１３６７）を選択的に発現する。構成物２は、内皮細胞上のＣＤ３６受容体へ
の結合を仲介する２つのＣＳＶＴＣＧ配列を包含するいくつかの生物活性部位を
有する１型反復（ヌクレオチド２９４−１８８３）をさらに発現する。構成物３
は、１型反復（ヌクレオチド１３８３−１８８３）のみを発現する。構成物４は
、発現ベクターにおいて提供されたシグナルペプチドを除く完全長の成熟ＴＳＰ
−２分子（ヌクレオチド２９４−３７５５）を発現する。抗ＴＳＰ−２モノクロ
ナール抗体の作成のため、ヒトＴＳＰ−２ ＥＬＩＳＡの確立のため、および実
験腫瘍の全身的治療のため、そのような組換えタンパク質を用いることができる
。

【０１１２】 細胞培養 American Type Culture Collection(Rockville, MD)からヒト内皮細胞株Ａ４
３１を得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％Ｌ−グルタミン（全てGi
bco BRLから購入）を補充したダルベッコ最小必須培地(DMEM; Gibco BRL, Grand
Island, NY)中において維持した。ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）を
新生児包皮から単離し、Richard et al., Exp Cell Research 1998,240: 1-6に
最近記載されたように培養した。Cloneticsから正常ヒト前立腺上皮細胞を購入
し、さらにAmerican Type Culture CollectionからヒトＰＣ−３前立腺癌細胞を
得た。

【０１１３】 ＴＳＰ−２ ＲＮＡの単離およびノーザンブロット分析 RNeasyキット(Qiagen)を用いて、その製品の使用説明書に従って、ヒト前立
腺上皮細胞、ＰＣ−３前立腺癌細胞、安定なＡ４３１細胞トランスフェクタント
、および皮内腫瘍から、全細胞ＲＮＡを単離した。単離されたＲＮＡを電気泳動
し、さらにBiotransナイロン支持膜(ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA)に
移した。ランダムプライムド合成キット(Multiprime; Amersham, Arlington Hei
ghts, IL)を用いて、^３２ Ｐ放射能標識したｃＤＮＡプローブを調製した。３．
６ｋｂ ＴＳＰ−２ ｃＤＮＡプローブ、４．１ｋｂ ＴＳＰ−１ ｃＤＮＡプロー
ブおよび全ての公知のＶＥＧＦ変異体を認識する３００ｋｂヒトＶＥＧＦ ｃＤ
ＮＡプローブを用いた。等しいＲＮＡ装填のための対照として、Clontech(Palo
Alto, CA)から購入した２．０ｋｂヒトβ−アクチンｃＤＮＡプローブを用いた
。Detmar et al. (J Invest Dermatol 1997, 108: 263-268)に記載のような高い
ストリンジェントな条件下においてブロットを洗浄し、さらに、X-OMAT MRフィ
ルム(Kodak, Rochester, NY)またはPhosphor Imagerスクリーン(Molecular Dyna
mics, Sunnyvale, CA)に曝した。ImageQuantソフトウェアを用い、Molecular Dy
namicsスキャニングデンシトメーターでｍＲＮＡ発現を定量化した。RNeasyキッ
ト(Qiagen)を用いて、その製品の使用説明書に従って、安定なトランスフェクタ
ントおよび皮内腫瘍から、全細胞ＲＮＡを単離した。単離ＲＮＡを電気泳動し、
さらにBiotransナイロン支持膜(ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA)に移し
た。ランダムプライムド合成キット(Multiprime; Amersham, Arlington Heights
, IL)を用いて、^３２ Ｐ放射能標識ｃＤＮＡプローブを調製した。４．１ｋｂ
ＴＳＰ−１ ｃＤＮＡプローブおよび全ての公知のＶＥＧＦ変異体を認識する３
００ｋｂヒトＶＥＧＦ ｃＧＮＡプローブを用いた。等しいＲＮＡ装填のための
対照として、Clontech(Palo Alto, CA)から購入した２．０ｋｂヒトβ−アクチ
ンｃＤＮＡプローブを用いた。Detmar et al. (J Invest Dermatol 1997, 108:
263-268)に記載のような高いストリンジェントな条件下においてブロットを洗浄
し、さらに、X-OMAT MRフィルム(Kodak, Rochester, NY)またはPhosphor Imager
スクリーン(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に曝した。ImageQuantソフト
ウェアを用い、Molecular DynamicsスキャニングデンシトメーターでｍＲＮＡ発
現を定量化した。

【０１１４】 ウェスタンブロット分析 安定にトランスフェクトされたＡ４３１およびＨＤＭＥＣからの細胞溶解物
およびならし培地において、ウェスタンブロット分析を実施した。１００ｍｍデ
ィッシュ中において細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、リン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、さらにGallop et al.(J Med Chem 1994, 37: 1233-
1251)に記載のように溶解させた。細胞粉砕機を用いて細胞溶解物をホモジナイ
ズし、さらに、Bio-Radタンパク質アッセイ(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いてタ
ンパク質濃度を特定した。血清を含まない培地中において４８時間増殖させたコ
ンフルエント細胞から、ならし培地を得た。ヘパリンビーズ(Sigma, St Louis,
MO)を用いてＴＳＰ−２を濃縮した。変性試料緩衝液中において全ての試料を沸
騰させ、さらにタンパク質測定と同じ量を、還元条件下において、ポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動した(Laemmli, Nature 1970, 227: 680-685)。ポリビニ
リデン２フッ化物膜(Bio-Rad)上にタンパク質をブロットした。等量のタンパク
質を装填したことを確認するため、５％酢酸で希釈した０．１％ポンソーレッド
(Sigma)で膜を染色した。非特異的結合をブロックするため、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０および３％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中において、１晩、膜を
インキュベートした。次に、ＴＳＰ−２（クローンＲ８１９３９）またはヒトＴ
ＳＰ−１（クローン１３３；Genzyme, Cambridge, MA）に対する１次抗体と共に
膜をインキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、西洋わさびペロキシダー
ゼ結合抗マウスＩｇＧ(Amersham)と共にインキュベートし、さらに強化−化学ル
ミネセンスシステム(Amersham)によって分析した。ImageQuantソフトウェアを用
いて、Molecular Dynamicsスキャニングデンシトメーターでタンパク質発現を定
量化した。

【０１１５】 前立腺癌細胞におけるＴＳＰ−２発現の分析 ノーザンブロット分析を用いて、ＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの発現について、正常
ヒト前立腺上皮細胞および悪性ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３を分析した。それら
研究は、正常前立腺細胞がＴＳＰ−２を強く産生するが、一方、ＰＣ−３細胞で
は全くＴＳＰ−２が発現されないことを示した。それらデータは、扁平上皮癌に
おける我々の所見と類似して、悪性前立腺癌の病因における重要過程としてのＴ
ＳＰ−２発現の喪失を示唆し、さらに前立腺癌増殖および腫瘍血管新生の制御に
おけるＴＳＰ−２の重要な役割を示唆する。さらには、インビボでの同所前立腺
内注入後、ＰＣ−３細胞においてＴＳＰ−２発現が無いことが認められた。

【０１１６】 扁平上皮癌におけるＴＳＰ−２発現の分析 抗ＴＳＰ−２抗体Ｒ８１９３９を用いた免疫組織化学研究は、健常成人の皮
膚、扁平上皮癌（ＳＣＣ）を有する患者の皮膚および新生児包皮の、基底表皮ケ
ラチノサイトにおいて、ＴＳＰ−２が強く発現されていることを示した。さらに
は、ＴＳＰ−２は基底膜領域に沈着した。それら所見は、ＴＳＰ−２が、非血管
新生化表皮への血管の伸長を防ぐ皮膚における天然の抗血管新生バリアに寄与す
ることを示唆する。さらには、ＴＳＰ−２は、正常な表皮構造の維持にも寄与す
るであろう。一方、ＴＳＰ−２発現は、ＳＣＣに近接する過剰増殖性表皮中の基
底表皮層には存在しないが、基底の上の層には広く存在していた。悪性グレード
の異なる、評価した４つのヒトＳＣＣの内４つにおいて、ＴＳＰ−２発現が非常
に低下していた。腫瘍細胞の周りにＴＳＰ−２の沈着は検出されず、さらに、浸
潤腫瘍細胞はＴＳＰ−２を発現していなかった。それら結果は、ヒトＴＳＰ−２
アンチセンスリボプローブを用いたin situハイブリダイゼーションによって支
持され、さらにそれら結果は、ＳＣＣにおけるＴＳＰ−２の発現の低下が内因性
抗血管新生バリアを減らし、さらに腫瘍血管新生、増殖および浸潤を促進させ得
ることを示唆する。

【０１１７】 ＴＳＰ−２トランスフェクト細胞株の作成 完全ＴＳＰ−２コード配列を包含する３．６ｋｂマウスＴＳＰ−２ ｃＤＮＡ
配列は、Paul Bomstein博士(University of Washington, Seattle)によって提供
された。ＰＩＲＥＳ／Ｎｅｏベクター(Clonetics, Palo Alto, CA)のＥｃｏＲＩ
部位に、３．６ｋｂＥｃｏＲＩ−ｍＴＳＰ−２断片をクローン化した。SuperFec
tトランスフェクション試薬(Qiagen, Chatsworth, CA)を用い、その製品プロト
コルに従って、完全長マウスＴＳＰ−２ ｃＤＮＡを包含するＰＩＲＥＳ／Ｎｅ
ｏベクターまたはＰＩＲＥＳ／Ｎｅｏベクター単独で、サブコンフルエントＡ４
３１培養細胞を安定にトランスフェクトした。さらには、ヒトＴＳＰ−１遺伝子
を包含するｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ+発現ベクターですでにトランスフェクト
したＡ４３１細胞をトランスフェクトした。リン酸カルシウム法を用いてトラン
スフェクションを実施し、さらに、Ｇ４１８の存在下においてトランスフェクト
細胞を培養することによって薬剤選択を実施した。詳細には、トランスフェクシ
ョンの４８時間後、４００ｍｇ／ｍｌのネオマイシン(G418, Sigma, St Lous, M
O)を含有する完全成長培地で細胞を１：３に希釈して、トランスフェクタントを
選択した。安定にトランスフェクトされたクローンを増やし、さらに１０クロー
ンにおいて、ＴＳＰ−１ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現について特徴付けした
。各構成物に関して１０より多くの安定にトランスフェクトされたクローンが得
られ、細胞溶解物およびならし培地のノーザンハイブリダイゼーションおよびウ
ェスタンブロットによって、効率的なＴＳＰ−２発現を確認した。重要なことと
して、ベクターのみをトランスフェクトされた対照Ａ４３１のコンフルエント培
養細胞から得られたならし培地中には、ＴＳＰ−２が実質的に存在しなかった。
細胞の形態およびプラスチック培養ディッシュでの増殖速度、軟寒天コロニー形
成、または自発的および誘導されたアポプトーシス速度において、対照トランス
フェクトＡ４３１クローンとＴＳＰ−２過剰発現Ａ４３１クローンとの間で有意
差は認められなかった。さらには、ＴＳＰ−２過剰発現ＭｅＷｏ悪性メラノーマ
細胞およびＰＣ−３前立腺癌細胞を樹立および特徴付けした。

【０１１８】 ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１は、ＶＥＧＦを強く分泌するがＴＳＰ−２をほ
とんどまたは全く分泌しないことを特徴とし、さらにインビボにおいて急速に増
殖しかつ高度に血管新生された腫瘍を形成する(Myoken et al., Proc Natl Acad
Sci USA 1991, 88: 5819-5823)。ノーザンブロット分析によって、複合ＴＳＰ
−２トランスフェクトクローンおよび対照トランスフェクトクローンのＴＳＰ−
２発現レベルを特定した。更なるインビボでの研究のために用いられたＡ４３１
クローン６、１２、１９において、高レベルのＴＳＰ−２ ｍＲＮＡを検出した
。さらに、それらクローンはＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現の抑制を示さなかった。ウ
ェスタンブロット分析によって、ＴＳＰ−２ ｍＲＮＡレベルの上昇が、ＴＳＰ
−２タンパク質の量の増加に相関することを確認した。ＴＳＰ−２トランスフェ
クトＡ４３１細胞クローンにおいて、培養上清中、１８０ｋｄのＴＳＰ−２タン
パク質の強い発現が認められ、ＴＳＰ−２の効率的分泌を支持した。一方、ベク
ターのみをトランスフェクトしたＡ４３１細胞においては、ほとんどまたは全く
ＴＳＰ−２タンパク質は検出されなかった。

【０１１９】 インビトロでの細胞増殖およびアポトーシスに対する、ＴＳＰ−２過剰発現の 影響 ＴＳＰ−２の過剰発現が、腫瘍増殖に影響を及ぼすか否かを特定するため、S
chirner et al. (Clin Exp Metastasis, 1998, 16: 427-435)に記載のように、
付着非依存性細胞増殖速度を測定した。６つの２ｍｍの格子を有する３０ｍｍの
細胞培養ディッシュ(Nunc, Naperville, IL)に、１ｘ１０^４ の対照トランスフ
ェクトＡ４３１細胞およびＴＳＰ−２トランスフェクト４３１細胞を移した。デ
ィッシュを３７℃および５％ＣＯ_２ でインキュベートし、さらに８日後、コロ
ニーを計数した。各群当たり４つのディッシュの平均値±標準偏差（ＳＤ）とし
て結果を表した。

【０１２０】 軟寒天測定法におけるコロニー数を特定することによって、付着非依存性細胞
増殖を調べた。ＴＳＰ−２過剰発現細胞クローンと対照細胞クローンとの間で、
コロニー数に有意差は認められなかった。

【０１２１】 ヌードマウスにおけるＴＳＰ−２発現細胞の異種移植片の分析 インビボでのＡ４３１細胞の同所移植腫瘍増殖に対するＴＳＰ−２の過剰発
現の生物学的効果を特定するため、免疫抑制ヌードマウスの横腹に腫瘍細胞を皮
内注射した。

【０１２２】 トランスフェクトされていないコンフルエントＡ４３１細胞、またはマウスＴ
ＳＰ−２発現ベクター、ヒトＴＳＰ−１発現ベクター、または発現ベクター単独
で安定にトランスフェクトされたコンフルエントＡ４３１細胞をトリプシン処理
し、さらに２ｘ１０^７ 細胞／ｍｌの密度で、血清を含まないＤＭＥＭ培地(Gibc
o BRL)中に再懸濁させた。５匹の８週の雌Ｂａｌｂ／ｃ(nu/nu)マウスの両方の
横腹に、各タイプの腫瘍細胞(２ｘ１０^６ )を皮内注射した。親Ａ４３１細胞株
、３つの対照クローン、３つのＴＳＰ−２過剰発現細胞クローンおよび３つのＴ
ＳＰ−１過剰発現細胞クローンについて調べた。詳細には、３つのＴＳＰ−２ト
ランスフェクトクローン、３つのベクタートランスフェクト対照クローン、およ
び親Ａ４３１細胞株をマウスに注射した。ＴＳＰ−２効果を、以前記載したＴＳ
Ｐ−１効果と比較するため、３つのＴＳＰ−１トランスフェクトクローン、なら
びにＴＳＰ−１とＴＳＰ−２の両方をトランスフェクトしたＡ４３１細胞の３つ
のクローンもマウスに注射した。毎週、デジタルキャリパーを用いて最小および
最大の腫瘍径を測定し、以下の式を用いて腫瘍体積を計算した： 体積＝４／３ｘｐｘ(１／２ｘ最小径)² ｘ１／２ｘ最大径 親細胞、対照トランスフェクト細胞またはＴＳＰ−１トランスフェクト細胞を注
射した動物の群において、３週間後、マウスを屠殺した。ＴＳＰ−２過剰発現Ａ
４３１クローンを注射した５匹の動物の内、３匹を３週間後に屠殺し、２匹を６
週間後に屠殺した。

【０１２３】 図３（左）に示すように、対照Ａ４３１およびベクタートランスフェクト細胞
クローンは、急速に増殖する扁平上皮癌を形成し、３週間後には２０００−３０
００ｍｍ³ の体積に達した。ＴＳＰ−２の過剰発現は、結果として、対照腫瘍と
比較して、３週間後、腫瘍増殖の９０％を超える有意な阻害(p<0.001)をもたら
した。扁平上皮癌増殖のＴＳＰ−２誘導阻害は、ＴＳＰ−１発現腫瘍において認
められた４０−５０％阻害よりも有意に強力であった(p<0.001)。重要なことと
して、ＴＳＰ−２とＴＳＰ−１の両方を同時トランスフェクトした３つのクロー
ンのいずれも、１２週間までの観察期間の間、目に見える腫瘍を全く形成しなか
った。また、ＴＳＰ−２過剰発現は、対照腫瘍と比較して、腫瘍血管の密度の減
少によって示されるように、腫瘍血管新生も減らした。図３（右）に示すように
、ヒト悪性メラノーマ細胞株ＭｅＷｏを用いて、類似の結果が得られた。

【０１２４】 ＴＳＰ−２を発現する異種移植片を有するマウスでのin situハイブリダイゼ
ーションおよび免疫組織化学分析 上記のGallop et al., によって記載されたように、腫瘍異種移植片の６μｍ
パラフィン切片において、in situハイブリダイゼーションを実施した。全ての
公知のＶＥＧＦスプライシング変異体に共通である２０４ｋｂ ＰＣＲ断片を包
含するｐＧＥＭ−3Ｚｆ(+)から、ヒトＶＥＧＦのためのセンスおよびアンチセン
ス一本鎖ＲＮＡ−プローブを転写させた。ヒトＴＳＰ−２のアミノ末端コード領
域の３５０ｂｐ ＰＣＲ断片を包含するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ+ベクター
から、マウスＴＳＰ−２に対するＲＮＡ−プローブを転写させた。ヒトＴＳＰ−
１に対するモノクロナール抗体(Genzyme)およびヒトＴＳＰ−２に対するウサギ
ポリクロナール抗体Ｒ８１９３９を用いて、Detmar et al.,(J Invest Dermatol
1998, 111: 1-6)に以前記載されたように、健常成人の皮膚、健常新生児の包皮
、皮膚のヒト扁平上皮癌およびＡ４３１腫瘍異種移植片の６μｍの凍結またはパ
ラフィン切片において、免疫組織化学染色を実施した。Ｒ８１９３９は、ヒトお
よびマウスＴＳＰ−２の両方を認識する。

【０１２５】 ＴＳＰ−２過剰発現腫瘍において、広範囲の壊死が検出されたが、一方、対照
腫瘍では小さな壊死の点が認められるのみであり、さらにＴＳＰ−１過剰発現腫
瘍では、ほとんど壊死は認められなかった。対照腫瘍細胞において、ＴＳＰ−２
ｍＲＮＡ発現はほとんどまたは全く検出されず、さらにＴＳＰ−２タンパク質
発現は、隣接する正常な皮膚の基底表皮層または血管において広く認められたが
、腫瘍細胞中には認められなかった。一方、ＴＳＰ−２過剰発現腫瘍において、
強いＴＳＰ−２ ｍＲＮＡ発現が検出され、さらに免疫組織化学染色は、腫瘍細
胞および腫瘍ストローマにおける大規模なＴＳＰ−２発現を示した。in situハ
イブリダイゼーションにおいて、ＴＳＰ−２過剰発現腫瘍と対照腫瘍との間で、
ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現の違いは認められなかった。ヒト悪性メラノーマ細胞株
ＭｅＷｏを用いて、類似の結果が得られた。

【０１２６】 腫瘍血管新生におけるＴＳＰ−２の過剰発現の役割 腫瘍−誘導血管新生の程度を特定するため、腫瘍異種移植片のクリオスタッ
ト切片をラット抗マウスＣＤ３１モノクロナール抗体(Pharmingen, San Diego,
CA)で染色した。Nikon E-600(Nikon; Melville, NY)顕微鏡を用いて、各細胞ク
ローン由来の５つの腫瘍から得た代表的切片を分析した。Spotデジタルカメラ(D
iagnostic Instruments; Sterling Heights, MI)を用いて画像を撮り、さらにIP
LABソフトウェア(Scanalytics Inc.; Fairfax, VA)を用いて形態計測分析を実
施した。各切片において、６０ｘの倍率で３つの異なる領域を調べ、ｍｍ^２ 当
たりの血管数を特定した。形態計測分析は、対照クローンＣ９（８４±２２血管
／ｍｍ^２ ）、Ｃ１２（９８±２７血管／ｍｍ^２ ）、Ｃ１５（１０５±１９血管
／ｍｍ^２ ）と比較して、ＴＳＰ−２過剰発現クローンＴ６（４６±１５血管／
ｍｍ^２ ）、Ｔ１６（３９±１４血管／ｍｍ^２ ）およびＴ１８（４１±１４血管
／ｍｍ^２ ）由来の３週間後の腫瘍において、微小血管密度が非常に減少してい
ることを示した。それら切片は、ＴＳＰ−２発現腫瘍内の微小血管の劇的な減少
を示した。腫瘍血管新生に対するＴＳＰ−２の効果をさらに詳細に定量化するた
めに、Detmar et al. (2000) Am. J. Pathol. 156: 159-167 ; Streit et al.(1
999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 14888-14893に以前記載されたように、
代表的デジタル画像のコンピューターによる画像分析によって、血管で覆われて
いる組織面積の割合（％）を特定した。図４Ａに示すように、対照腫瘍はｍｍ^２ 腫瘍面積当たり８０から１２５の間のＣＤ３１陽性血管を示したが、ＴＳＰ−
２発現腫瘍では血管密度が５０％以上減少した。さらには、ＴＳＰ−２過剰発現
腫瘍において、平均血管サイズが、４５％以上縮小した（図４Ｂを参照）。詳細
には、図４Ｃに示すように、対照腫瘍において全ての血管の１５％を占める１５
００μｍ^２ より大きな血管が、ＴＳＰ−２発現によって完全に無くなった。そ
れらデータに基づき、血管によって占められている相対的腫瘍面積は、ＴＳＰ−
２トランスフェクト腫瘍において７０％減少した(p<0.001)（図４Ｄを参照）。
それらデータは、実験扁平上皮癌におけるＴＳＰ−２の過剰発現が、腫瘍血管新
生を強力に阻害することを示す。

【０１２７】 ＴＳＰ−２欠損マウスにおける皮膚乳頭腫および扁平上皮癌の発達 ＴＳＰ−２欠損マウスの血統対(breeding pairs)は、Paul Bornstein博士か
ら得た。標的ベクターの構築および同種１２９ｖ遺伝子背景に基づくＴＳＰ−２
欠損マウスの作出については、Kyriakides et al. (1998) J. Cell Biol. 140:
419-430に以前記載されている。ＴＳＰ−２欠損マウスは、皮膚等のいくつかの
臓器において血管密度が増加していることが分かっている。

【０１２８】 ＴＳＰ−２は、基底表皮ケラチノサイトにおいて発現されるが、ＳＣＣでは発
現されないため、およびＴＳＰ−２の過剰発現はＳＣＣ増殖を阻害するため、皮
膚におけるＴＳＰ−２発現は皮膚腫瘍発達に対する防御的役割を果たすであろう
。従って、２５匹の雌のＴＳＰ−２欠損マウス、および２５匹の年齢を合わせた
雌の野生型マウスにおいて、Hennings et al. (1981) Cancer Res. 41: 773-779
; Hennings et al. (1993) Carcinogenesis 14: 2353-2358に記載のように、標
準の２段階皮膚発癌プロトコルを実施した。８週のマウスの毛を剃った背中に、
２００μｌのアセトン中に溶解させた２５μｇＤＭＢＡを局所投与し、続いて、
２０回、５μｇＴＰＡを毎週投与した。ＴＳＰ−２欠損マウスにおいて、有意に
速い乳頭腫形成の発達が認められた（ＴＳＰ−２欠損マウスでは８週間後に５０
％のマウスが腫瘍を持っていたのに対して、野生型対照では１４週間後に５０％
のマウスが腫瘍を持っていた）。さらには、野生型と比較して（マウス当たり５
個未満）、ＴＳＰ−２欠損マウスは、非常に多くの数の乳頭腫を発達させた（２
０週後、マウス当たり１９個以上）。また、野生型マウスにおけるよりも、それ
ら乳頭腫は大きくかつ血管がより発達していた。重要なこととして、ＴＳＰ−２
欠損マウスは、より多くの数の扁平上皮癌も発達させた。それら結果は、化学的
皮膚発癌に対するＴＳＰ−２の防御的役割を示した。

【０１２９】 選択的に皮膚においてＴＳＰ−２を過剰発現するトランスジェニックマウスの 作出 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳベクター中に、完全ＴＳＰ−２コード配列を
包含する４．１ｋｂマウスＴＳＰ−２ ｃＤＮＡ配列をクローン化した。Ｓａｌ
ＩおよびＸｂａＩによる制限酵素消化の後、４．１ｋｂ断片をゲル精製し、平滑
末端処理し、さらに、ヒトケラチン１４（Ｋ１４）プロモーター(導入遺伝子の
発現を皮膚に標的化することが以前示されている)を包含するＢａｍＨＩ消化ｐ
ＧＥＭ−３Ａベクター中（平滑末端処理されている）に連結させた。Ｋ１４は、
表皮における基底ケラチノサイトおよび皮膚における毛嚢の外根鞘(outer root
sheath)によって広く発現されているが、食道、墳門洞、胸腺の扁平上皮島(squa
mous islets)および角膜においてもいくらかの発現が報告されている。サンガー
のジデオキシ法を用いて直接配列決定することによって、ＴＳＰ−２挿入部分の
正確な配列および配向を確認した。

【０１３０】 制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて、上記の完全１１．５ｋｂ Ｋ１
４−ＴＳＰ−２−ｐＧＥＭ３Ｚ構成物を消化した後、８．３ｋｂ発現ベクターを
ゲル精製し、さらに、１細胞期のＦＶＢ／Ｎマウス胚の雌の前核に注入した。１
晩培養後、擬似妊娠マウスの子宮に胚（２細胞期）を注入した。プローブとして ^３２ Ｐ標識３５０ｂｐマウスＴＳＰ−２ ｃＤＮＡを用いて、生後２週間に得た
ＢａｍＨＩ消化ゲノム尾部ＤＮＡをサザンブロット分析することによって、トラ
ンスジェニック初代マウスを検出した。迅速な同定のため、それぞれ導入遺伝子
構造中のヒト成長ホルモン遺伝子の位置３２１−３３８および６５０−６３０に
対して結合してそのゲノム中に導入遺伝子構造が組み込まれている場合に３３０
ｋｂ断片の選択的増幅をもたらす１８マープライマーおよび２１マープライマー
を用いて、ゲノム尾部ＤＮＡについてＰＣＲを行った。異なるレベルの導入遺伝
子発現を有する、１２匹の生存力のあるＴＳＰ−２のための初代トランスジェニ
ックマウスが得られた 全てのトランスジェニック初代マウスを野生型マウスと戻し交配した。１１匹
の初代マウスが妊娠し、８匹がその子孫に導入遺伝子を伝えた。サザンブロット
およびホスホイメージャー定量化によって特定して、約１０から約２０の間のコ
ピー数を有する３匹の初代マウスを、トランスジェニック系統を作るために選択
した。ヘテロ接合体Ｆ１世代マウスを交配させ、さらにホモ接合体およびヘテロ
接合体のトランスジェニックＦ２世代マウスと野生型Ｆ２世代マウスを得た。皮
膚から抽出した全ＲＮＡのin situハイブリダイゼーションおよびノーザンハイ
ブリダイゼーションによって、導入遺伝子発現を確認した。生後２週間のトラン
スジェニックＴＳＰ−２初代マウスの尾部から得た組織切片の免疫組織化学分析
によって、上皮の基底ケラチノサイト近くおよび毛嚢の周りに広く沈降した、Ｔ
ＳＰ−２の過剰発現を確認した。お決まりのＨ＆Ｈ−染色した組織切片において
、主な皮膚の異常は全く検出されなかった。しかしながら、内皮細胞特異的抗原
ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）の染色は、同腹子の対照と比較して、ＴＳＰ−２過
剰発現トランスジェニックマウスの皮膚における微小血管密度の減少を示した。

【０１３１】 ＴＳＰ−２過剰発現ヒト真皮線維芽細胞の作成 完全ＤＭＥＭ培地中において、ＰＴ６７−パッキング細胞を７０％コンフル
エントになるまで増殖させ、さらに、ｐＬＸＳＮベクター(Clontech)単独または
ヒトＴＳＰ−２遺伝子の完全コード配列を包含するｐＬＸＳＮベクターでトラン
スフェクトした。８００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を用いた抗生物質選択の後、約５
０クローンを増やし、さらに、製品に記載のように、濾過培養上清およびＧ４１
８処理ＮＩＨ３Ｔ３細胞の連続希釈を用いて、ウィルス価を特定した。将来の使
用のために、１ｘ１０^６ 以上のウィルス価で十分と考えられた。次の工程にお
いて、ＰＴ６７パッキング細胞から得られた高いウィルス価を有する濾過培養上
清を用いて、ＩＭＲ９１をトランスフェクトした。Ｇ４１８抗生物質選択によっ
て、感染効率を評価した。トランスフェクト細胞をコンフルエントまで増殖させ
、培地を交換し、さらに４８時間細胞を培養した。Qiagen RNeasyキットを用い
て細胞ＲＮＡを抽出し、さらにノーザンブロットを実施した。ウェスタンブロッ
ト分析のために培養上清を用いた。トランスフェクト線維芽細胞による高レベル
のＴＳＰ−２ ｍＲＮＡ発現およびＴＳＰ−２分泌が認められた。

【０１３２】 内皮細胞の遊走に対する、ＣＤ３６受容体へのＴＳＰ−２の結合の影響の特定 ヒト真皮微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）の遊走に対する、ＣＤ３６受容体
へのＴＳＰ−１またはＴＳＰ−２の結合の影響を特定するため、ＴＳＰ−１また
はＴＳＰ−２の存在下、あるいはＴＳＰ−１またはＴＳＰ−２と抗ＣＤ３６抗体
の存在下において、ＨＤＭＥＣをインキュベートした。詳細には、１０μｇ／ｍ
ｌＩ型コラーゲン(Nalgene, Palo Alto, CA)で、８μｍ孔径のTranswell遊走チ
ャンバー(Costar, Cambridge, CA)の裏面をコートした。３００μｌのＤＭＥＭ
培地、または１０μｇ／ｍｌヒトトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）を含有
するＤＭＥＭ培地、あるいは対照トランスフェクトＡ４３１クローン（ＣＭ−Ｃ
ｏ）またはＴＳＰ−２トランスフェクトＡ４３１クローンから得たならし培地中
の１ｘ１０⁵ ＨＤＭＥＣを上方のチャンバーに添加した。全ての培地に、１０ｍ
ｇ／ｍｌのＢＳＡを補充した。また、１０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）ま
たは１０μｇの抗ＣＤ３６抗体(クローンＦＡ６−１５２, Immunotech)の何れか
を培地に補充した。４時間後、Senger et al. (1996) Am. J. Pathol. 49: 293-
305に以前記載されているように、遊走した細胞を固定および染色した。Nikon E
-600顕微鏡(Nikon; Melville, NY)に取り付けたSpotデジタルカメラ(Diagnostic
Instruments; Sterling Heights, MI)を用いて、各膜から３つの異なる領域の
１０ｘの画像を撮り、さらに、ＩＰ−ＬＡＢソフトウェア(Scanalytics, Fairfa
x, VA)を用いて、ｍｍ^２ 当たりの遊走細胞数を計算した。全ての測定法を４重
で実施した。

【０１３３】 図６に示すように、ＤＭＥＭ培地中において２２６±５２ＨＤＭＥＣ／ｍｍ²
が挿入物の裏面に遊走した（カラム１）。ＴＳＰ−１はＨＤＭＥＣ遊走を５４％
阻害した（１０４±２０ＨＥＤＭＣ／ｍｍ^２ 、カラム２）。抗ＣＤ３６抗体の
存在下において、ＴＳＰ−１はＨＤＭＥＣ遊走を２０．８％しか阻害しなかった
（１７９±３６ＨＥＤＭＣ／ｍｍ^２ 、カラム３）。このことは、ＴＳＰ−１の
阻害効果の大部分が、ＨＤＭＥＣ上のＣＤ３６受容体との相互作用を介している
ことを示す。

【０１３４】 対照−ならし培地（対照トランスフェクトＡ４３１細胞から得た）において１
２０±４ＨＤＭＥＣ／ｍｍ^２ が挿入物の裏面に遊走した（カラム４）。ＴＳＰ
−２ならし培地は、ＨＤＭＥＣ遊走を５４．２％阻害した（５５±９ＨＥＤＭＣ
／ｍｍ^２ 、カラム５）。抗ＣＤ３６抗体の添加によってＨＤＭＥＣ遊走は阻害
されなかった（１３３±２７ＨＥＤＭＣ／ｍｍ^２ 、カラム６）。抗ＣＤ３６抗
体の存在下において、ＴＳＰ−２ならし培地はＨＤＭＥＣ遊走を３６．１％阻害
した（８５±４ＨＥＤＭＣ／ｍｍ^２ 、カラム７）。それらデータは、ＴＳＰ−
２介在阻害効果の大部分が、ＨＤＭＥＣ上のＣＤ３６受容体との相互作用に非依
存的であることを示す。

【０１３５】 合成ＴＳＰ−２誘導ペプチド ヒトＴＳＰ−２のアミノ酸配列から誘導された以下の合成ペプチドを合成し
た： ペプチド１：ＲＥＳＨＦＲＧＬＬＱＮＶＨＬＶＦ：プロコラーゲン領域、 ＡＡ２０７−２２２ ペプチド２：ＰＡＴＣＡＮＰＳＦＶＥＧＥＣＣＰＳＣ：プロコラーゲン領域、 ＡＡ３６６−３８３ ペプチド３：ＦＡＥＮＥＴＷＶＶＤＳＣＴＴＣＴＣＫＫＦＫＴ：プロコラーゲン
領域、ＡＡ３３６−３５７ ペプチド４：ＥＬＩＧＧＰＰＫＴＲＮＭＳＡＣ：プロコラーゲン領域、 ＡＡ３１５−３２９ ペプチド７：ＷＳＰＷＡＥＷ：最初の１型反復、ＡＡ３８４−３９０。

【０１３６】 実質的に上記のように、ＨＤＥＭＣ遊走実験を実施した。３００μＬのＤＭＥ
Ｍ培地または１０μｍｏｌ／ｌの合成ペプチドを有するＤＭＥＭ培地中の１ｘ１
０⁵ ＨＤＭＥＣを上方のチャンバーに添加した。全ての培地に１０ｍｇ／ｍｌＢ
ＳＡを補充した。図７に示すように、ＤＭＥＭ培地中において、２１２±１２Ｈ
ＤＭＥＣ／ｍｍ^２ が挿入物の裏面に遊走した（Ｃ：カラム１）。ペプチド１、
２、３および４はＨＤＭＥＣ遊走を顕著には変化させなかった。ペプチド２（Ｗ
ＳＰＷＡＥＷ）はＨＤＭＥＣ遊走を４７．６％阻害した（１１１±３９ＨＥＤＭ
Ｃ／ｍｍ^２ 、カラム２）。それら結果は、ＴＳＰ−２の抗血管新生活性のため
のＴＳＰ−２特異的ペプチドの重要な役割を示している。重要なこととして、そ
のペプチドは、内皮細胞上のＣＤ３６受容体に結合することが記載されているＣ
ＳＶＴＣＧ配列と異なっている（Dawson et al. (1997) J. Cell. Biol. 138: 7
07-717）。全ての測定を四重で実施した。

【０１３７】 ＴＳＰ−２の生物活性 ベクターのみをトランスフェクトした対照腫瘍と比較して、Ａ４３１細胞異
種移植片におけるＴＳＰ−２の過剰発現は、腫瘍増殖を強く低下させる。インビ
トロでの最も高いＴＳＰ−２発現を有する腫瘍クローンは、インビボにおいて最
も顕著な増殖阻害を示した。ＴＳＰ−２過剰発現ＭｅＷｏ細胞を免疫抑制マウス
に移植した場合にも、類似の結果が得られた。ならし培地のウェスタンブロット
分析によって、安定なトランスフェクタントによるＴＳＰ−２分泌の上昇を確認
した。腫瘍異種移植片のin situハイブリダイゼーションは、ＴＳＰ−２トラン
スフェクト腫瘍細胞クローンにおいて、ＴＳＰ−２発現が高レベルで維持されて
いることを示した。それらデータは、共に、皮膚癌増殖に対するＴＳＰ−２の強
力な阻害効果の証拠を提供する。

【０１３８】 皮膚扁平上皮癌における、ＴＳＰ−２によって誘導された腫瘍増殖阻害は、直
接ＴＳＰ−２が介在した腫瘍細胞増殖の阻害によるものではなかった。軟寒天に
おけるコロニーを形成する能力によって特定した接着非依存性細胞増殖は、ＴＳ
Ｐ−２トランスフェクトＡ４３１クローンと対照トランスフェクトＡ４３１クロ
ーンとの間で有意差を示さなかった。その結果は、Ａ４３１細胞増殖がＴＳＰ−
２によって影響を受けないことを示唆する。同様に、血管新生阻害剤アンギオス
タチンで処理した腫瘍も腫瘍細胞増殖速度を変化させないで腫瘍サイズの縮小を
もたらした(O’Reilly et al. (1996) Nat Med 2: 689-92)。

【０１３９】 おそらくＴＳＰ−２の抗血管新生効果のため、および腫瘍血管密度の減少のた
め、および血管サイズの縮小のため、Ａ４３１異種移植片におけるＴＳＰ−２過
剰発現は、結果的に広範囲の腫瘍細胞壊死をもたらした。血管新生因子ＶＥＧＦ
に対する抗体で実験腫瘍を処理する間に観察された最初の血管の変化は、血管径
の劇的な縮小であった(Yuan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93: 14
765-70)。さらには、トランスジェニックマウスの皮膚におけるＶＥＧＦの過剰
発現(Detmar et al. (1998) J. Invest Dermatol. 111: 1-6)、またはＭＥＬ−
５７メラノーマ異種移植片(Claffey et al. (1996) Cancer Res. 56: 172-181)
におけるＶＥＧＦの過剰発現は、屈曲したおよび拡張した血管の発達を導き、な
らびにＶＥＧＦ誘導α１−およびα２−インテグリンは、平均血管径の縮小にお
いて最も顕著なように、インビボにおいてＶＥＧＦ誘導腫瘍血管新生を顕著に阻
害した(Senger et al. (1997) Proc Natl. Acad. Sci. USA 94: 13612-13617)。
ＴＳＰ−２過剰発現Ａ４３１異種移植腫瘍において観察された血管サイズの縮小
がＶＥＧＦ発現の抑制によることを排除するため、腫瘍移植片のin situハイブ
リダイゼーションを実施した。それら研究は、対照に対するＴＳＰ−２過剰発現
腫瘍でのＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルが変化していないことを示した。したがって
、血管サイズの縮小は、腫瘍血管形成に対するＴＳＰ−２の重要な生物活性を反
映し、さらに、ＴＳＰ−２の過剰発現によってまたはＶＥＧＦの阻害によって類
似の血管効果が得られ得ることを示しており、腫瘍血管新生におけるその２つの
分子の正反対の役割を示唆した。

【０１４０】 さらには、ＴＳＰ−２発現マウスにおけるよりも、ＴＳＰ−２欠損マウスにお
いて、皮膚乳頭腫の有意に迅速な発達、および皮膚乳頭腫および扁平上皮癌の数
の増加が認められた。

【０１４１】 概して、ＴＳＰ−２は、悪性皮膚上皮癌の強力な増殖阻害を誘導する。ＴＳＰ
−２の抗腫瘍効果は、同一のＡ４３１細胞異種移植系において比較した場合、Ｔ
ＳＰ−１の抗腫瘍効果よりも非常に顕著であった。その効果は、腫瘍血管新生の
顕著な阻害に関連していた。

【０１４２】 投与 標準方法によって被検者にＴＳＰ−２を投与することができる。例えば、静脈
内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、筋肉内および直腸投与等
の多くの異なる経路の任意の方法によってＴＳＰ−２を投与して差し支えない。
１つの実施形態において、ＴＳＰ−２物質を局所的に投与した。例えば、皮膚腫
瘍または乾癬のような好ましくない皮膚症状に局所的に投与できるようにＴＳＰ
−２物質を製剤化する。別の実施形態において、ＴＳＰ−２物質を経口的に投与
しても差し支えない。例えば、そのＴＳＰ−２物質は経口的に摂取されるレトロ
逆転ペプチドであって差し支えない。

【０１４３】 例えば、核酸分子、ＴＳＰ−２ポリペプチド、断片または類似物、ＴＳＰ−２
調節因子、および抗ＴＳＰ−２抗体等のＴＳＰ−２活性を調節する物質（または
「活性成分」とも称する）を、例えばヒトのような被検者に投与するのに適した
薬剤組成物中に加えて差し支えない。そのような組成物は、通常、核酸分子、ポ
リペプチド、調節因子または抗体、ならびに薬剤的に許容される担体を含む。こ
の中で用いられている「薬剤的に許容される担体」の用語は、任意のおよび全て
の、薬剤投与に適した、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤
、等張剤および吸収遅延剤等を含むことが意図されている。そのような薬剤活性
物質のための媒体および物質の使用は公知である。任意の従来の媒体または物質
が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の組成物においてそのような媒
体を用いることができる。また、追加の活性化合物も組成物中に加えて差し支え
ない。

【０１４４】 意図された投与経路に適合するように薬剤組成物を製剤化して差し支えない。
投与経路の例として、例えば静脈内、皮内、皮下等の非経口、経口（例えば吸入
）、経皮（局所）、筋肉内および直腸投与等が挙げられる。非経口、皮内または
皮下投与のために用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含んでいて差し
支えない：例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グ
リセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；例えばベ
ンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌物質；例えばアスコルビン酸ま
たは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；例えばエチレンジアミン四酢酸のよう
なキレート剤；例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等の緩衝剤；および例
えば塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張性調節用の物質。例えば塩
酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することが
できる。非経口用の調製物を、アンプル、使い捨てシリンジ、あるいはガラス製
またはプラスチック製の多容量バイアル中に入れて差し支えない。

【０１４５】 注射用に適した薬剤組成物として、溶液または分散液が挙げられる。静脈内投
与のために、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL^TM (BASF, Pars
ippany, NJ)またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合
、その組成物は無菌でなければならず、さらに、容易に注射できる程度に流動的
でなければならない。製造および保存の条件下において安定でなければならず、
さらに細菌および真菌等の微生物の汚染行為に対して保護される必要がある。担
体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレング
リコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、ならびに適切なそれらの混合
物等を含有する溶媒または分散媒であって差し支えない。例えばレクチンのよう
なコーティング剤の使用によって、および分散の場合のように必要な粒子径の維
持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することが
できる。例えばパラベン、クロロブタノーール、フェノール、アスコルビン酸、
チメロサール等の種々の抗生物質および抗真菌剤によって、微生物の作用から保
護することができる。多くの場合、例えば、糖、例えばマンニトールのようなポ
リアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウム糖の等張剤を組成物中に含んでい
ることが好ましいであろう。例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチ
ン等の吸収を遅延させる物質を組成物中に含めることによって、注射用組成物の
持続性吸収をもたらすことができる。

【０１４６】 上記において列挙した成分の１つまたはそれらの組合せを含有する適切な溶媒
中に、必要量の活性化合物（例えばＴＳＰ−２ポリペプチドまたは抗ＴＳＰ−２
抗体）を加え、その後、濾過滅菌することによって、滅菌注射液を調製すること
ができる。通常、基本分散媒体および上記において列挙した必要な他の成分を含
有する滅菌媒体中に、活性化合物を加えることによって、分散液を調製する。滅
菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および
凍結乾燥であり、予め滅菌濾過したその溶液から、活性成分および任意の追加の
所望成分の粉末をもたらす。

【０１４７】 経口用組成物は、通常、不活性な希釈剤または食用の担体を含有する。それら
をゼラチン中に封入し、または錠剤中に圧縮させて差し支えない。経口治療投与
のために、賦形剤と共に活性化合物を加えて、錠剤、トローチまたはカプセルの
形態で用いて差し支えない。また、うがい薬として使用するために液体担体を用
いて経口用組成物を調製して差し支えなく、その際、液体担体中の化合物を経口
で飲んで、吐出すかまたは飲み込む。薬剤的に適合する結合剤および／またはア
ジュバント物質を組成物の一部として含めて差し支えない。錠剤、丸剤、カプセ
ル、トローチ等は、任意の以下の成分または類似の特性を有する化合物を包含し
ていて差し支えない：微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン等
の結合剤；デンプンまたはラクトース等の賦形剤；アルギン酸、プリモゲル(Pri
mogel)またはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステ
ロート(Sterotes)等の潤滑剤；コロイド状ニ酸化ケイ素等の滑剤(glidant)；ス
クロースまたはサッカリン等の甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチ
ルまたはオレンジ香料等の香味添加剤。

【０１４８】 吸入による投与のために、例えば二酸化炭素等の適切な高圧ガスを含有する加
圧容器またはディスペンサーから出されるエアゾールスプレー、またはネブライ
ザーの形態で化合物を運搬させる。

【０１４９】 また、経粘膜的または経皮的手段によって全身投与を行っても差し支えない。
経粘膜または経皮投与のために、透過すべきバリアに適切である浸透剤を製剤中
において用いて差し支えない。そのような浸透剤は一般的に公知であり、例えば
、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸塩誘導体等が挙
げられる。スプレー式点鼻薬または座剤の使用によって、経粘膜投与を実施する
ことができる。経皮投与のために、当業界で一般的に知られている軟膏、ゲルま
たはクリームの形態に活性化合物を製剤化して差し支えない。そのような経皮用
製剤を皮膚に塗って、乾癬のような皮膚の炎症性疾患、ならびに扁平上皮癌のよ
うな皮膚癌を治療することができる。

【０１５０】 また、座剤（例えばカカオバターおよび他のグリセリドのような従来の座剤用
基材を用いて）、または直腸吸収のための保持浣腸剤の形態に製剤化して差し支
えない。

【０１５１】 １つの実施形態において、例えば、埋め込み物およびマイクロカプセル運搬シ
ステム等の徐放性製剤のように、体からの迅速な排泄に対して化合物を防御する
担体と共に活性化合物を調製する。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、
ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸等の生体分
解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製する方
法は当業者に明らかであろう。また、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuti
cals, Incから材料を購入することができる。また、リポソーム懸濁液（感染細
胞を標的とする、ウィルス抗原に対するモノクロナール抗体を有するリポソーム
等）も薬剤的に許容される担体として用いることができる。例えば、米国特許第
４，５２２，８１１号に記載のような、当業者に公知の方法に従って、それらを
調製することができる。

【０１５２】 投与の容易さおよび投与量の均一性のために、投与量単位形態で、経口用また
は非経口用組成物を製剤化することは、特に好都合である。この中で用いられて
いる投与量単位形態の用語は、単位投与量として、治療されるべき被検者に適し
た物理的に独立した単位を称する：各単位は、必要とされる物質担体と関連して
、望ましい治療効果をもたらすために計算された予め定めた量の活性化合物を含
有する。本発明の投与量単位形態の詳述は、活性化合物の独自の特性および達成
されるべき特定の治療効果、ならびに個体を治療するためのそのような活性化合
物を配合する分野に固有の制限によって決定されかつそれらに直接依存する。

【０１５３】 この中に記載の核酸分子をベクター中に挿入し、遺伝子治療ベクターとして用い
ることができる。例えば、静脈注射、局所投与（例えば米国特許第5,328,470号
）によって、または定位固定注射（例えば、Chen et al., PNAS 91: 3054-3057,
1994）によって、遺伝子治療ベクターを被検者に投与することができる。遺伝
子治療ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含有し
、あるいはその中に遺伝子運搬媒体が埋め込まれた徐放性マトリックスを含有し
ていて差し支えない。あるいは、例えばレトロウィルスベクターのように組換え
細胞から完全遺伝子運搬ベクターがそのまま産生され得る場合は、その医薬品は
、遺伝子運搬システムを産生する１つ以上の細胞を含んでいて差し支えない。

【０１５４】 投与の指示書と共に、容器、包装またはディスペンサー中に薬剤組成物を含め
て差し支えない。

【０１５５】 例えばＴＳＰ−２ポリペプチド等のＴＳＰ−２活性を高める物質の投与を繰り
返して差し支えない。

【０１５６】 組合せ治療 ＴＳＰ−２活性を高める物質を単独で、あるいは他の物質と組み合わせて投
与して差し支えない。例えば、好ましくない細胞増殖または血管新生を特徴とす
る疾患を有する被検者を治療する際に、ＴＳＰ−１活性を高める物質と組み合わ
せて、ＴＳＰ−２活性を高める物質を投与して差し支えない。それら物質を同時
にまたは順次に投与して差し支えない。通常、ＴＳＰ−２活性を高めるのに有用
な任意の方法をＴＳＰ−１に適用させることができる。例えば、ポリペプチドま
たはその断片もしくは類似物；ポリペプチドまたはその生物活性断片もしくは類
似物をコードする核酸；例えば抗体または低分子のようなアゴニスト；あるいは
上記の要素の組合せ等：を投与することによって、ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２
活性を高めることができる。

【０１５７】 ＴＳＰ−２物質と組み合わせて用いることができる別の物質として、ＶＥＧＦ
活性を阻害する物質が挙げられる。例えば、以下の１つ以上：例えば、細胞ＶＥ
ＧＦ核酸配列に結合しさらにそのタンパク質の発現を阻害することができるアン
チセンスまたはＶＥＧＦリボザイム等のＶＥＧＦ核酸分子；ＶＥＧＦタンパク質
に特異的に結合する抗体；優性ネガティブＶＥＧＦタンパク質またはその断片；
ならびに、例えばＶＥＧＦのプロモーターに結合する低分子のようなＶＥＧＦ核
酸の発現を低下させる物質：を投与することによって、ＶＥＧＦ活性を低下させ
ることができる。

【０１５８】 また、ＴＳＰ−２活性を高めることと組み合わせて、化学療法剤を投与して差
し支えない。投与できる化学療法剤として、以下に開示したものから選択された
ものが挙げられる。例示的化学療法剤として：パクリタキセル、ビンクリスチン
、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール、タポテカン、カ
ンプトセシン、イリノテカン、塩酸カンプトサール、デキソルビシン、エトポシ
ド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサク
リン、エピルビシン、メルバロン、塩酸ピロキサトロン、５−フルオロウラシル
、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダ
ラビン、シタラビン(Ara-C)、トリメトレキサート、ゲンシタビン、アシビシン
ン、アラノシン、ピラゾフリン、N−ホスホールアセチル−L−アスパレート＝Ｐ
ＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−Ａｚａ−２’−デオキシシチ
ジン、アデノシンアラビノシド(Ara-A)、クラドリビン、フトラフール、ＵＦＴ
（ウラシルとフトラフールの組合せ）、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン
、５−フルオロウリジン、５’−デオキシ−５’−フルオロウリジン、ヒドロキ
シウレア、ジヒドロレンクロラムブシル、チアゾフリン、シスプラチン、カルボ
プラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵカルムスチン、メル
ファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、デカル
バジン、リン酸イフォスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタ
ード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール、ジヒドロール
エンペロン、スピロムシチン、ゲルデナマイシン、サイトカラシン、デプシペプ
チド、ルプロン、ケトコナゾール、タモキシフェン、ゴセレリン(Zoledax)、フ
ルタミド、４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒド
ロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオナニリド、ヘルセ
プチン、抗ＣＤ２０(Rituxan)、インターフェロンα、インターフェロンβ、イ
ンターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキ
ン１２、腫瘍壊死因子および放射線：が挙げられる。

【０１５９】 １つ以上の上記の物質の投与と合わせて、ＴＳＰ−２活性を高める方法を実施
して差し支えない。例えば、ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２活性を高め、またはＴ
ＳＰ−２活性を高めかつＶＥＧＦ活性を低下させ、または化学療法剤の投与と合
わせてＴＳＰ−２活性を高めて差し支えない。

【０１６０】 １つ以上のそれら物質の投与を繰り返して差し支えない。

【０１６１】 ＴＳＰ−２の類似物 類似物は、アミノ酸配列において、または配列に関係ない側面において、あ
るいはその両方において、天然のＴＳＰ−２と異なっていて差し支えない。非配
列修飾として、ＴＳＰ−２のインビボまたはインビトロでの化学誘導が挙げられ
る。非配列修飾として、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化また
はグリコシル化における変化が挙げられる。

【０１６２】 好ましい類似物として、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって、あるいはＴ
ＳＰ−２生物活性を消滅させない１つ以上の非保存的アミノ酸の置換、欠失また
は挿入によって、その配列が野生型配列と異なるＴＳＰ−２（またはその生物活
性断片）が挙げられる。保存的置換は、１つのアミノ酸を類似の特性を有する別
のアミノ酸で置換すること、例えば以下の群内での置換を含む：バリン、グリシ
ン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、
グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アル
ギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。他の保存的置換を以下の表から選
択して差し支えない。

【０１６３】

【表１】 本発明内の他の類似物は、ペプチドの安定性を高める修飾を有する類似物であ
り；そのような類似物は、例えば、ペプチド配列中に、１つ以上の非ペプチド結
合（ペプチド結合に置き換わる）を包含し得る類似物である。また、例えばＤ−
アミノ酸等、天然のＬ−アミノ酸以外の残基、あるいは例えばβまたはγアミノ
酸等の非天然のまたは合成のアミノ酸を包含する類似物；および環状類似物も含
まれる。

【０１６４】 １つ以上のアミノ酸がＤアミノ酸である類似物は、ここで「レトロ逆転ポリペ
プチド」と称される。レトロ逆転ポリペプチドは、ペプチド配列の安定性および
／または生物活性を高めるために用いられてきた。例えば、Chover et al. (199
3) Acc. Chem. Res. 26: 266-273; Goodman et al. (1979) Acc. Chem. Res. 12
: 1-7を参照。１つの態様において、完全なまたは部分的なレトロ逆転配列を包
含するようにＴＳＰ−２ポリペプチドを修飾して差し支えない。そのようなポリ
ペプチドは、配列が部分的にまたは完全にＤアミノ酸を包含し、従ってＬアミノ
酸を用いて合成したペプチドと逆の化学量論(stoichemistry)を有することを除
いて、この中に記載のポリペプチド配列を含む。例えば、Chover et al.（上記
）およびGoodman et al.（上記）に記載のような従来の技術によって、ＴＳＰ−
２のレトロ逆転類似物を調製することができる。

【０１６５】 レトロ逆転ポリペプチドは、ポリペプチドの酵素分解を減らすことができる。
従って、レトロ逆転ポリペプチドは、酵素分解に対してそのようなポリペプチド
が耐性であることから、例えば、経口投与に有用となり得る。

【０１６６】 この中に記載の異種移植マウスモデルを用いて、例えば腫瘍増殖等の好ましく
ない増殖を阻害する能力について、ＴＳＰ−２類似物を試験することができる。

【０１６７】 遺伝子治療 ＴＳＰ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの形態の何れかを
コードする核酸を運ぶための遺伝子治療プロトコルの一部として本発明の遺伝子
構成物を用いることができる。本発明は、ＴＳＰ−２ポリペプチドの機能を再構
築し、またはポリペプチドが誤発現された細胞においてＴＳＰ−２ポリペプチド
の機能を相殺するように、インビボでトランスフェクトし、さらに特定細胞タイ
プにおいてＴＳＰ−２ポリペプチドを発現させるための発現ベクターに関する。
例えば、インビボで効率的にＴＳＰ−２遺伝子を細胞に運搬し得る任意の製剤ま
たは組成物のような、任意の生物学的に効率的な担体中のＴＳＰ−２ポリペプチ
ドの発現構成物を投与することができる。方法は、組換えレトロウィルス、アデ
ノウィルス、アデノ随伴ウィルスおよび１型単純ヘルペスウィルス等のウィルス
ベクター、あるいは組換え細菌プラスミドまたは真核プラスミドに、対象遺伝子
を挿入することを含む。ウィルスベクターは直接細胞をトランスフェクトし；プ
ラスミドＤＮＡは例えば陽イオンリポソーム（リポフェクション）または誘導（
例えば抗体結合）、ポリリジン共役、グラマシジンＳ、人工的なウィルスエンベ
ロープまたは他のそのような細胞内キャリアー等の助けを借りて運搬され、なら
びに遺伝子構造物の直接注入またはＣａＰＯ_４ 沈降法がインビボで実施される
。

【０１６８】 インビボでの核酸の細胞内への導入のための好ましい方法は、ＴＳＰ−２ポリ
ペプチドをコードする例えばｃＤＮＡ等の核酸を包含するウィルスベクターの使
用によって成される。ウィルスベクターを用いた細胞の感染は、標的細胞の大部
分が核酸を取り込むことができるという利点を有する。あるいは、例えばウィル
スベクター中に包含されるｃＤＮＡによってウィルスベクター内にコードされた
分子が、ウィルスベクター核酸を取り込んだ細胞内において効率的に発現される
。

【０１６９】 特にヒトへの、インビボでの外来遺伝子の運搬のための組換え遺伝子運搬シス
テムとして、レトロウィルスベクターおよびアデノ随伴ウィルスベクターを用い
ることができる。それらベクターは、細胞中に遺伝子を効率的に運搬し、さらに
運搬された核酸は宿主の染色体ＤＮＡ中に安定に組み込まれる。複製欠損レトロ
ウィルスのみを産生する特定細胞株（「パッケージング細胞」と称する）の開発
によって、遺伝子治療のためのレトロウィルスの有用性を高め、さらに遺伝子治
療のための遺伝子運搬における使用のために欠損レトロウィルスを特徴付けする
(再考のため、Miller, A.D. (1990) Blood 76: 271を参照)。標準技術によって
、ヘルパーウィルスの使用を介して標的細胞を感染させるのに使用できるビリオ
ン中に、複製欠損レトロウィルスを詰め込むことができる。組換えレトロウィル
スを作成し、さらにインビトロまたはインビボにおいてそのようなウィルスで細
胞を感染させるためのプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel. F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sec
tions 9.10-9.14および他の標準的実験マニュアルに記載されている。適切なレ
トロウィルスの例として、当業者に公知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよび
ｐＥＭが挙げられる。エコトロピックおよび両種性のレトロウィルスシステムの
両方を調製するための適切なパッケージングウィルス株として、ψＣｒｉｐ、ψ
Ｃｒｅ、ψ２およびψＡｍが挙げられる。レトロウィルスは、インビボおよび／
またはインビトロにおいて、上皮細胞等の多くの異なるタイプの細胞に種々の遺
伝子を導入するのに用いられてきた(例えば、Eglitis, et al. (1985) Science
230: 1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85: 3014-3018
; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141-6145; Hube
r et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043; Ferry et al. (
1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al. (1991)
Science 254: 1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 89: 7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; D
ai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu et al.
(1993) J. Immunol. 150: 4104-4115; 米国特許第4,868,116号；米国特許第4,98
0,286号；国際特許公開第WO89/07136号；国際特許公開WO89/02468号；国際特許
公開第WO89/05345号；国際特許公開WO92/07573号を参照)。

【０１７０】 本発明において有用な別のウィルス遺伝子運搬システムは、アデノウィルス派
生ベクターを用いる。関心遺伝子産物をコードしかつ発現するが、正常な溶菌ウ
ィルスライフサイクルにおいて複製する能力に関して不活化されるように、アデ
ノウィルスのゲノムを操作して差し支えない。例えば、Berkner et al. (1988)
BioTechniques 6: 616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434; Rose
nfeld et al. (1992) Cell 68: 143-155を参照。アデノウィルス株、５型Ａｄ
ｄｌ３２４または他のアデノウィルス株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）由
来の適切なアデノウィルスベクターは、当業者に公知である。組換えアデノウィ
ルスは、細胞分裂しない細胞を感染させることができず、かつ上皮細胞等の種々
のタイプの細胞を感染させるのに用いることができるという点において、ある特
定の状況では好都合となり得る(上記のRosenfeld et al. (1992))。さらには、
ウィルス粒子は比較的安定でありかつ精製および濃縮しやすく、さらに上記のよ
うに、感染可能なスペクトル影響を及ぼすように修飾することができる。さらに
は、導入されたアデノウィルスＤＮＡ（およびその中に包含される外来ＤＮＡ）
は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれないで、エピソームのままで存在し、従っ
て、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えばレトロウィルスＤＮＡ）に一体化さ
れるin situ 挿入突然変異の結果として生じ得る潜在的な問題を避けることがで
きる。さらには、アデノウィルスゲノムが外来遺伝子を運搬する能力は、他の遺
伝子運搬ベクターに比べて大きい（最大８キロベースまで）(上記のBerkner et
al.;Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57: 267)。

【０１７１】 対象遺伝子の運搬に有用であるさらに別のウィルスベクターシステムは、アデ
ノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウィルスは、効率的な複製および
増殖ライフサイクルのためのヘルパーウィルスとしてアデノウィルスまたはヘル
ペスウィルス等の別のウィルスを必要とする、天然の欠損ウィルスである（再考
のために、Muzyczka et al. (1992) Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158
: 97-129を参照）。また、アデノ随伴ウィルスは、細胞分裂しない細胞中にその
ＤＮＡを組み込むことができ、さらに高い頻度の安定な組込みを生じさせること
ができる数少ないウィルスの１つである(例えば、Flotte et al. (1992) Am. J.
Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 6
3: 3822-3828; McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62: 1963-1973)。ＡＡＶ
の３００塩基対を含有するベクターを詰め込みさらに組み込むことができる。外
来ＤＮＡのための空間は、約４．５ｋｂに制限される。Tratschin et al. (1985
) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260に記載のようなＡＡＶベクターを用いて、細
胞内にＤＮＡを導入することができる。ＡＡＶベクターを用いて、種々の核酸を
異なるタイプの細胞に導入してきた(例えば、Hermonat et al. (1984) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Bio
l. 4: 2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39; Tra
tschin et al. (1984) J. Virol. 51: 611-619; Flotte et al. (1993) J. Biol
. Chem. 268: 3781-3790を参照)。

【０１７２】 上記のようなウィルス運搬法に加えて、動物の組織においてＴＳＰ−２ポリペ
プチドの発現を生じさせるために、非ウィルス法も用いることができる。遺伝子
運搬のほとんどの非ウィルス法は、巨大分子の取り込みおよび細胞内輸送のため
に哺乳類細胞によって用いられる通常の機構に頼る。好ましい実施形態において
、本発明の非ウィルス遺伝子運搬システムは、標的細胞による対象ＴＳＰ−２遺
伝子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に頼る。そのタイプの例示的遺
伝子運搬システムとして、リポソーム誘導システム、ポリリジン共役および人工
的ウィルスエンベロープが挙げられる。

【０１７３】 例示的実施形態において、その表面上に陽電荷を有し、さらに（必要に応じて
）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグ付けされたリポソーム中に、ＴＳ
Ｐ−２ポリペプチドをコードする遺伝子を封入することができる（例えばリポフ
ェクション）(Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka 20: 547-551; 国際特許
公開WO91/06309号；日本特許出願第1047381号；欧州特許公開第EP-A-43075号)。

【０１７４】 臨床的設定において、当業界でよく知られている任意の多くの方法によって、
患者に治療的ＴＳＰ−２遺伝子のための遺伝子運搬システムを導入することがで
きる。例えば静脈注射等によって遺伝子運搬システムの医薬品を全身的に導入し
て差し支えなく、遺伝子運搬媒体によってもたらされたトランスフェクションの
特異性、または受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞タイプも
しくは組織タイプ特異的発現、またはそれらの組合せから、標的細胞において顕
著にそのタンパク質の特異的形質転換が生じる。他の実施形態において、かなり
局在化された動物への導入によって、組換え遺伝子の最初の運搬はより限定され
る。例えば、カテーテル（米国特許第5,328,470号）によって、または定位注射
（例えばChen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057）によって、遺伝子運搬媒体
を導入することができる。

【０１７５】 遺伝子治療構成物の医薬品は、実質的に、許容される希釈剤中に含まれる遺伝
子運搬システムから構成されていて差し支えなく、あるいは遺伝子運搬媒体が埋
め込まれた徐放性マトリックスを包含していて差し支えない。あるいは、例えば
レトロウィルスベクター等の組換え細胞からそのまま完全遺伝子運搬システムが
産生され得る場合には、その医薬品は、遺伝子運搬システムを産生する１つ以上
の細胞を包含していて差し支えない。

【０１７６】 ２ハイブリッドシステム ＴＳＰ−２と相互作用するタンパク質を同定するために、２ハイブリッド（
相互作用トラップ）法を用いることができる。それらは、アゴニスト、スーパー
アゴニストおよびアンタゴニストを含んでいて差し支えない（対象タンパク質と
それと相互作用するタンパク質は、おとり(bait)タンパク質とフィッシュタンパ
ク質として用いられる）。それら測定法は、おとりタンパク質とのタンパク質−
タンパク質相互作用によって仲介される機能的転写活性因子の再構築を検出する
ことに頼る。特に、それら測定法は、ハイブリッドタンパク質を発現させるキメ
ラ遺伝子を使用する。第１のハイブリッドタンパク質は、おとりタンパク質に融
合させた、例えばＴＳＰ−２分子またはその断片等のＤＮＡ結合領域を包含する
。第２のハイブリッドタンパク質は、「フィッシュ」タンパク質に融合させた、
例えば胚性肢芽発現ライブラリー等の発現ライブラリーのような転写活性領域を
包含する。フィッシュタンパク質とおとりタンパク質とが相互作用し得る場合は
、それらは、ＤＮＡ結合領域と転写活性領域とを非常に近接させる。その近接性
は、ＤＮＡ結合領域によって認識される転写調節部位に作動可能に結合した受容
体遺伝子の転写を生じさせるのに十分であり、さらに、そのマーカー遺伝子の発
現を検出して、おとりタンパク質と別のタンパク質との相互作用を評価するのに
用いることができる。

【０１７７】 ペプチド模倣物 また、本発明は、例えばペプチドまたは非ペプチド物質等の模倣物を作成す
るために、対象ＴＳＰ−２ポリペプチドのタンパク質結合領域の還元をもたらす
。例えば、”Peptide inhibitors of human papillomavirus protein binding t
o retinoblastoma gene protein” 欧州特許出願第EP-412,762A号およびEP-B31,
080A号を参照。

【０１７８】 ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and
Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988を
参照)、アゼピン（例えば、Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biolo
gy, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988を参照
）、置換されたγラクタム環(例えばGarvey et al. in Peptides: Chemistry an
d Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988
を参照)、ケト−メチレンシュードペプチド(Ewenson et al. (1986) J Med Chem
29: 295; Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceeding
s of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, I
L, 1985を参照)、β−ターンジペプチドコア(Nagai et al. (1985) Tetrahedron
Lett 26: 647; Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231)、およ
びβ−アミノアルコール(Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 1
26: 419; Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134: 71)を用いて
、重要な残基の非加水分解型ペプチド類似物を作成することができる。

【０１７９】 抗体 また、本発明は、対象ＴＳＰ−２ポリペプチドと特異的に反応する抗体も包
含する。標準的プロトコル(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual ed. by
Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照)を用いることによっ
て、この中に記載のような抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクロナー
ル抗体を作成することができる。

【０１８０】 また、ＴＳＰ−２発現の量およびパターンを評価するために、組織試料の免疫
組織化学染色において、ＴＳＰ−２エピトープに特異的に結合する抗体を用いる
ことができる。臨床的試験法の一部として、組織または体液中におけるＴＳＰ−
２レベルを検出および評価するために、免疫沈降および免疫ブロッティングにお
いて、抗ＴＳＰ−２抗体を診断的に用いることができる。

【０１８１】 本発明の抗体の別の応用は、例えばλｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ
およびλＯＲＦ８等の発現ベクター中に構築されたｃＤＮＡライブラリーの免疫
学的スクリーニングにおける使用である。正確なリーディングフレーム中に正確
な配向で挿入されたコード配列を有するそのタイプのメッセンジャーライブラリ
ーは、融合タンパク質をもたらすことができる。例えば、λｇｔ１１は、アミノ
酸末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列から成り、かつカルボキシル末端が
外来ポリペプチドから成る融合タンパク質をもたらすであろう。さらに、例えば
、感染プレートから取り除いたニトロセルロースフィルターを本発明の抗体と反
応させる等、抗体を用いて、対象ポリペプチドの抗原性エピトープを検出するこ
とができる。さらに、本測定法によって評価したファージを感染プレートから単
離させることができる。従って、他の動物からの相同物の存在を検出しかつクロ
ーン化することができ、さらにヒト供給源からの別のアイソフォーム（スプライ
シング変異体を含む）を検出しかつクローン化することができる。

【０１８２】 他の実施形態 詳細な説明と関連させて本発明を記載しているが、前記の説明は例示であり、
添付した請求の範囲によって特定される本発明の範囲を限定することを意図して
いないことが理解される。他の態様、利点および変更も以下の請求の範囲に含ま
れる。

【０１８３】 この中で挙げられている全ての特許および引例は、参照によってその全てが組
み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、ＴＳＰ−２のヌクレオチド配列を表す（配列番号１）

【図１Ｂ】 図１Ｂは、図１Ａの続きである

【図２】 図２は、ＴＳＰ−２のアミノ酸配列を表す（配列番号２）

【図３】 図３は、トランスフェクトされたＴＳＰ−２がＡ４３１扁平上皮癌細胞（左）
およびＭｅＷｏ悪性メラノーマ（右）の皮内での腫瘍増殖を阻害することを示す
グラフ

【図４】 図４は、腫瘍血管新生、平均血管密度（図４Ａ）、血管サイズ（図４Ｂ）、５
００μｍ^２ 未満から１５００μｍ^２ を超えるサイズの範囲で観察される血管の
数（図４Ｃ）、および血管によって覆われる組織面積の割合（％）（図４Ｄ）に
対するＴＳＰ−２の効果を示すグラフ

【図５】 図５は、ＤＭＢＡ／ＴＰＡ化学発癌プロトコルで処理したＴＳＰ−２欠損マウ
スにおける、乳頭腫の発達および発生を示す

【図６】 図６は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）の遊走、ならびにそれら細
胞に対する、ＣＤ３６受容体へのＴＳＰ−１（Ｔ１）またはＴＳＰ−２（Ｔ２）
の結合の影響を示すグラフ

【図７】 図７は、種々の合成ＴＳＰ−２誘導ペプチドの存在下におけるＨＤＭＥＣの遊
走を示すグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ２０６ 35/00 43/00 １１１ ４Ｈ０４５ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｑ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ Ｍ 33/53 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CB01 CB09 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 CA04 CA09 DA03 HA12 HA17 4B063 QA01 QQ02 QQ43 QQ79 QQ96 QR55 QS34 4C084 AA02 AA07 AA17 BA18 BA23 CA18 NA14 ZA89 ZB21 ZB26 4C086 AA01 BA02 MA02 NA05 ZA89 ZB26 ZC75 4C206 AA01 JB16 MA02 MA04 NA05 ZA89 ZB26 ZC75 4H045 AA10 AA30 BA09 CA40 EA28

Claims (52)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 好ましくない細胞増殖を特徴とする疾患を有する被検者を治
   療する方法であって、ＴＳＰ−２活性を高めることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 ＴＳＰ−２活性を高める物質を投与することによってＴＳＰ
   −２活性を高めることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記物質が、ＴＳＰ−２ポリペプチドまたはその生物活性断
   片もしくは類似物であることを特徴とする請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記断片が、合成ＴＳＰ−２誘導ペプチドであることを特徴
   とする請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 前記類似物が、ＴＳＰ−２のレトロ逆転ペプチドであること
   を特徴とする請求項３記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ペプチドが、配列番号３ 記載の配列を包含することを
   特徴とする請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ペプチドが、配列番号３ 記載の配列から成る ことを特
   徴とする請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 前記物質が、ＴＳＰ−２ポリペプチドまたはその生物活性断
   片もしくは類似物をコードする核酸であることを特徴とする請求項２記載の方法
   。
9. 【請求項９】 前記物質が、ＴＳＰ−２アゴニストであることを特徴とする
   請求項２記載の方法。
10. 【請求項１０】 内因性ＴＳＰ−２活性を高めることによってＴＳＰ−２活
    性を高めることを特徴とする請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 ＴＳＰ−２活性が：その遺伝子発現のレベルを高める；Ｔ
    ＳＰ−２ ｍＲＮＡの安定性を高める；ＴＳＰ−２ ｍＲＮＡの翻訳を高める；お
    よびＴＳＰ−２タンパク質の安定性を高める：のいずれか１以上によって高めら
    れることを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 内因性ＴＳＰ−２遺伝子の調節配列を変えることによって
    ＴＳＰ−２遺伝子の転写を高めることを特徴とする請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記疾患が、前癌細胞、癌細胞または新生細胞、あるいは
    腫瘍の存在によって特徴付けられることを特徴とする請求項１記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記疾患が、上皮組織を冒すことを特徴とする請求項１３
    記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記疾患が、好ましくない皮膚細胞増殖によって特徴付け
    られることを特徴とする請求項１記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記疾患が、皮膚の扁平上皮癌または悪性メラノーマであ
    ることを特徴とする請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記疾患が、好ましくない前立腺細胞増殖によって特徴付
    けられることを特徴とする請求項１記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記疾患が、良性の好ましくない皮膚細胞増殖によって特
    徴付けられることを特徴とする請求項１記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記疾患が、乾癬または乳頭腫形成であることを特徴とす
    る請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 ＴＳＰ−１活性を高めることをさらに含むことを特徴とす
    る請求項１記載の方法。
21. 【請求項２１】 ＶＥＧＦ活性を阻害することをさらに含むことを特徴とす
    る請求項１または２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 化学療法剤を投与することをさらに含むことを特徴とする
    請求項１記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記化学療法剤が、タキソールまたはカルボプラチンであ
    ることを特徴とする請求項２２記載の方法。
24. 【請求項２４】 ＴＳＰ−２タンパク質またはその断片もしくは類似物を発
    現するように遺伝子操作された細胞を被検者に導入することを特徴とする請求項
    １記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記細胞が：線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内
    皮細胞、グリア細胞、神経細胞、リンパ球、骨髄細胞および筋肉細胞：より成る
    群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
26. 【請求項２６】 好ましくない皮膚症状を有する被検者を治療する方法であ
    って、ＴＳＰ−２活性を調節して疾患を治療することを含むことを特徴とする方
    法。
27. 【請求項２７】 前記好ましくない皮膚症状が、皮膚の構造を冒す症状であ
    ることを特徴とする請求項２６記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記症状が、遺伝因子によって生じ得ることを特徴とする
    請求項２７記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記遺伝因子が、表皮剥離であることを特徴とする請求項
    ２８記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記症状が、環境因子によって生じることを特徴とする請
    求項２７記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記環境因子が、紫外線照射であることを特徴とする請求
    項３０記載の方法。
32. 【請求項３２】 ＴＳＰ−２活性を高めることを特徴とする請求項２６記載
    の方法。
33. 【請求項３３】 ＴＳＰ−２活性を高める物質を投与することによってＴＳ
    Ｐ−２活性を高めることを特徴とする請求項３２記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記ＴＳＰ−２活性を高める物質が：ＴＳＰ−２ポリペプ
    チドまたはその生物活性断片もしくは類似物；ＴＳＰ−２ポリペプチドまたはそ
    の生物活性断片もしくは類似物をコードする核酸；およびＴＳＰ−２アゴニスト
    ：より成る群から選択されることを特徴とする請求項３３記載の方法。
35. 【請求項３５】 内因性ＴＳＰ−２活性を高めることによって、ＴＳＰ−２
    のレベルを高め得ることを特徴とする請求項３２記載の方法。
36. 【請求項３６】 ＴＳＰ−２活性を低下させることを特徴とする請求項２６
    記載の方法。
37. 【請求項３７】 ＴＳＰ−２活性を低下させる物質を投与することによって
    ＴＳＰ−２活性を低下させることを特徴とする請求項３６記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記ＴＳＰ−２活性を低下させる物質が：細胞ＴＳＰ−２
    ｍＲＮＡに結合しかつそのタンパク質発現を阻害し得るＴＳＰ−２核酸分子；
    ＴＳＰ−２タンパク質に特異的に結合する抗体；優性ネガティブＴＳＰ−２タン
    パク質またはその断片；ならびにＴＳＰ−２核酸の発現を低下させる物質：より
    成る群から選択されることを特徴とする請求項３７記載の方法。
39. 【請求項３９】 内因性ＴＳＰ−２活性を低下させることによってＴＳＰ−
    ２レベルを低下させ得ることを特徴とする請求項３６記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記好ましくない皮膚症状が、老化した皮膚であることを
    特徴とする請求項３２記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記好ましくない皮膚症状が、乾癬であることを特徴とす
    る請求項３２記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記好ましくない皮膚症状が、バラ疹であることを特徴と
    する請求項３２記載の方法。
43. 【請求項４３】 前記好ましくない皮膚症状が、光線照射によって生じた皮
    膚障害であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
44. 【請求項４４】 被検者が好ましくない細胞増殖の危険性を有するか否かを
    評価する方法であって、ＴＳＰ−２核酸またはタンパク質の存在を評価すること
    を含み、ここで、ＴＳＰ−２活性の低下が、該被検者が危険性を有することの指
    標となることを特徴とする方法。
45. 【請求項４５】 扁平上皮癌の危険性について被検者を評価することを特徴
    とする請求項４４記載の方法。
46. 【請求項４６】 メラノーマの危険性について被検者を評価することを特徴
    とする請求項４４記載の方法。
47. 【請求項４７】 前立腺癌の危険性について被検者を評価することを特徴と
    する請求項４４記載の方法。
48. 【請求項４８】 生物試料中のＴＳＰ−２核酸またはタンパク質の存在が検
    出されるように、ＴＳＰ−２タンパク質またはＴＳＰ−２核酸を検出し得る化合
    物または物質と、生物試料とを接触させることによって、ＴＳＰ−２の存在を評
    価することを特徴とする請求項４４記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記化合物または物質が、ＴＳＰ−２ ｍＲＮＡにハイブ
    リダイズし得る核酸プローブ、またはＴＳＰ−２タンパク質に結合し得る抗体で
    あることを特徴とする請求項４８記載の方法。
50. 【請求項５０】 好ましくない細胞増殖を特徴とする疾患を治療するのに使
    用できる化合物を同定する方法であって： 細胞、組織または被検者を準備し； 該細胞、組織または被検者を候補化合物で処理し；さらに ＴＳＰ−２核酸またはＴＳＰ−２タンパク質のレベルを特定する： 各工程を含み、ここで、化合物がＴＳＰ−２核酸またはＴＳＰ−２タンパク質を
    高め得ることが、前記疾患を治療するのに使用できる化合物の指標となることを
    特徴とする方法。
51. 【請求項５１】 候補化合物で処理されない対照細胞、組織または被検者を
    評価する工程をさらに含むことを特徴とする請求項５０記載の方法。
52. 【請求項５２】 前記化合物が、ＴＳＰ−２の断片または類似物であること
    を特徴とする請求項５０記載の方法。