KR20040021598A

KR20040021598A - Ｕｖｂ-유발 피부손상 방지 방법

Info

Publication number: KR20040021598A
Application number: KR10-2003-7013393A
Authority: KR
Inventors: 기이치로 야노; 제이. 데트마 마이클
Original assignee: 더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority date: 2001-04-13
Filing date: 2002-04-11
Publication date: 2004-03-10
Also published as: EP1377253A4; US20030008821A1; KR20080108366A; CN100340287C; CN1512868A; CA2446093A1; WO2002083088A1; JP2004526758A; US6712617B2; EP1377253A1; TWI233361B

Abstract

본 발명은 피험자의 장기간 UVB에 의해 유발되는 주름을 방지 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 피험자의 피부의 혈관형성을 저해함을 포함한다.

Description

ＵＶＢ-유발 피부손상 방지 방법{METHODS OF PREVENTING UVB-INDUCED SKIN DAMAGE}

본 발명은 피부의 혈관형성(angiogenesis)을 저해하여, 포유동물(예, 인간)에서, 생체내(in vivo), UVB에 의해 유발되는 피부손상, 예를 들면, 장기간(만성적으로) UVB에 의해 유발되는 광노화(예, 주름 형성)를 방지할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

따라서, 본 발명은 피험자의 장기간 UVB-유발 피부손상(예, 주름)을 방지 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 피험자의 피부에서의 혈관형성을 저해함을 포함한다. 바람직한 태양에서는, UVB 노출 전 또는 노출 시에 혈관형성을 저해한다.

또한, 바람직한 태양에서, 상기 방법은 장기간 UVB-유발 피부손상의 위험에 처해있는 피험자, 예를 들면 포유동물(예, 인간 또는 인간이외의 포유동물)을 식별함(identifying)을 포함한다. 장기간 UVB-유발 피부손상(예, 주름)의 위험에 처해 있는 피험자의 식별은 예를 들면, 피험자, 건강관리 공급자, 또는 화장품 공급자에의해 수행할 수 있다. 상기 혈관형성 저해는 예들 들면, 피험자, 건강관리 제공자, 또는 화장품 공급자에 의해 수행할 수 있다.

바람직한 태양에서, 피험자는 적어도 5세 이상의 연령이다. 바람직하게는 상기 피험자는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 이상의 연령이다.

바람직한 태양에서, 주름 형성은 방지 또는 감소된다.

바람직한 태양에서는, 피험자의, TSP-2 또는 TSP-1 등의 자연적으로 발생하는 혈관형성방지 단백질의 활성을 증가시키는 등의 하나 이상의 혈관형성방지 인자의 활성을 증가시켜 혈관형성을 저해함으로써, 주름 형성을 방지한다. TSP-2 활성은 예를 들면 TSP-2 활성을 증가시키는 약제를 투여함으로써 증가시킬 수 있다. 바람직한 태양에서, TSP-2의 활성을 증가시키는 약제는 다음 중의 하나 이상이어도 좋다: TSP-2 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적으로 활성이 있는 단편 또는 그 유사체, 예를 들면 TSP-2 유래 폴리펩티드 또는 그들의 레트로인버소(retro-inverso) 폴리펩티드; TSP-2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 그들의 생물학적 활성 단편 또는 그 유사체; TSP-2의 작동제(agonist), 예를 들면, TSP-2 활성을 갖거나 증가시키는 작은 분자(small molecule) 또는 항체; 또는 TSP-2 핵산 발현을 증가시키는 약제, 예를 들면, TSP-2의 프로모터 부위에 결합하여 발현을 증가시키는 작은 분자.

바람직한 태양에서, TSP-2는 TSP-2의 발현을 유도하는 약제(예, 작은 분자)에 의해 증가된다. TSP-2의 발현을 유도할 수 있는 약제의 예로는 소태아 혈청 및 TGF-α를 들 수 있다. 바람직한 태양에서, TSP-2의 발현을 유도하는 약제는 국소투여된다. 바람직한 태양에서, 상기 약제를 UVB 노출(예, 태양 노출) 전에 피험자에게 충분히 투여하여, UVB 노출시 피험자의 피부의 혈관형성을 방지하는 효과를 나타내게 한다.

또한 TSP-2 활성은 TSP-2 핵산, 또는 TSP-2 단백질, 단편, 또는 유사체를 피험자에 제어 전달함으로써 증가시킬 수 있다. TSP-2 핵산, 단백질, 단편, 또는 유사체는 제어 방출 디바이스(device)(예, 생체적합성 중합체, 마크로 입자, 또는 메쉬)와 함께 피험자에게 투여할 수 있다. 상기 디바이스는 분해를 감소시킬 수 있으며 TSP-2 핵산, 단백질, 단편, 또는 유사체의 방출을 제어할 수 있다. 이러한 TSP-2 생체적합성 제어 방출 시스템은 피험자에게, 예를 들면 근육내, 피하, 정맥내, 또는 기관, 관절 강(joint cavity), 또는 병소에 주사 또는 이식 등에 의해 투여할 수 있다.

TSP-2의 레벨은 내인성 TSP-2 활성을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 활성은 TSP-2 유전자의 전사 증가; mRNA의 2차 또는 3차 구조 변경 등에 의한 TSP-2 mRNA의 안정성 증가; TSP-2 mRNA의 서열 변경 등에 의한 TSP-2 mRNA의 번역 증가; 및/또는 TSP-2 단백질의 안정성 증가 등의 유전자 발현 수준의 증가에 의해 증가시킬 수 있다. TSP-2 유전자의 전사는 내인성 TSP-2 유전자의 조절 서열을 변경하는 등에 의해 증가시킬 수 있다. 하나의 태양에서는 상기 조절 서열은, 포지티브 조절 요소(인핸서, 또는 전사 활성화인자의 DNA 결합 부위 등)의 부가; 네거티브 조절 요소(전사 억제인자의 DNA-결합 부위 등)의 결실; 및/또는 내인성 조정 서열, 또는 그 안의 요소를 또다른 유전자로 치환함으로써, TSP-2 유전자가 더 효과적으로 전사되도록 할 수 있다.

바람직한 태양에서, 상기 약제는 TSP-2를 유도하는 화합물(예, 작은 분자)이다.

TSP-1의 활성은 예를 들면 TSP-1의 활성을 증가시키는 약제를 투여함으로써 증가시킬 수 있다. 바람직한 태양에서는, TSP-1의 활성을 증가시키는 약제는 다음 중의 하나이상이어도 좋다: TSP-1 폴리펩티드, 또는 그들의 생물학적으로 활성이 있는 단편, 또는 유사체, 예를 들면 TSP-1 유래의 폴리펩티드 또는 그들의 레트로인버소 폴리펩티드; TSP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 그들의 생물학적으로 활성이 있는 단편 또는 유사체; TSP-1의 작동제, 예를 들면, TSP-1 활성을 갖거나 증가시키는 항체 또는 작은 분자; 또는 TSP-1 핵산 발현을 증가시키는 약제, 예를 들면, TSP-1의 프로모터 영역에 결합하여 발현을 증가시키는 작은 분자.

바람직한 태양에서, TSP-1은 TSP-1의 발현을 유도하는 약제(예, 작은 분자)에 의해 증가된다. TSP-1의 발현을 유도할 수 있는 약제의 예로는 소태아 혈청 및 TGF-α를 들 수 있다. 바람직한 태양에서는, TSP-1의 발현을 유도하는 약제는 국소 투여된다. 바람직한 태양에서, 상기 약제는 UVB 노출(예, 태양 노출) 전에 피험자에게 충분히 투여하여, UVB 노출시 피험자의 피부의 혈관형성을 방지하는 효과를 나타내게 한다.

또한 TSP-1 활성은 TSP-1 핵산, 또는 TSP-1 단백질, 단편, 또는 유사체를 피험자에 제어 전달함으로써 증가시킬 수 있다. TSP-1 핵산, 단백질, 단편, 또는 유사체는 제어 방출 디바이스(예, 생체적합성 중합체, 마크로 입자, 또는 메쉬)와 함께 피험자에게 투여할 수 있다. 상기 디바이스는 분해를 감소시킬 수 있으며 TSP-1 핵산, 단백질, 단편, 또는 유사체의 방출을 제어할 수 있다. 이러한 TSP-1 생체적합성 제어 방출 시스템은 피험자에게, 예를 들면 근육내, 피하, 정맥내, 또는 기관, 관절 강(joint cavity), 또는 병소에 주사 또는 이식 등에 의해 투여할 수 있다.

TSP-1의 레벨은 내인성 TSP-1 활성을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 활성은 TSP-1 유전자의 전사 증가; mRNA의 2차 또는 3차 구조 변경 등에 의한 TSP-1 mRNA의 안정성 증가; TSP-1 mRNA의 서열 변경 등에 의한 TSP-1 mRNA의 번역 증가; 및/또는 TSP-1 단백질의 안정성 증가 등에 의해 유전자 발현 레벨을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. TSP-1 유전자의 전사는 내인성 TSP-1 유전자의 조절 서열 변경 등에 의해 증가시킬 수 있다. 하나의 태양에서는 상기 조절 서열은 포지티브 조절 요소(인핸서 또는 전사 활성화인자의 DNA 결합 부위 등)의 부가; 네거티브 조절 요소(전사 억제인자의 DNA-결합 부위)의 결실; 및/또는 내인성 조절 서열, 또는 그 안의 요소를 다른 유전자로 치환함으로써, TSP-1 유전자를 더 효과적으로 전사시킬 수 있다.

바람직한 태양에서, 상기 약제는 TSP-1를 유도하는 화합물(예, 작은 분자)이다.

바람직한 태양에서는, TSP-1 또는 TSP-2 등의 자연적으로 발생하는 혈관형성 저해 단백질의 활성을 유도함으로써 하나 이상의 혈관형성방지 인자의 활성을 증가시키는 약제를, 예를 들면, 국소 투여; 전신 투여; 경구 투여; 또는 주사, 바람직하게는 피부 또는 피하 주사로 투여한다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제를 적합한 전달 매체(vehicle)를 사용하여 투여한다. 바람직하게는, 상기 약제는 국소 사용 조성물에 함유되며, 그 조성물의 예로는 겔, 크림, 또는 액체가 있다. 상기 조성물은 향 또는 선스크린(예, 옥틸메톡시신나메이트, 아미노벤조산, 옥시벤존, 파디메이트 O, 호모살레이트, 또는 이산화티탄) 등의 화장품 원료를 더 함유해도 좋다. 또한 상기 조성물은 알로에 추출물, 그레이프 추출물 등의 식물 추출물을 함유해도 좋다. 또한 상기 조성물은 비타민 A(예, 레티놀); 비타민 C(예, L-아스코르브산 또는 L-아스코르브산 팔미테이트); 비타민 E(예, 토코페롤 아세테이트) 등의 비타민을 함유해도 좋다.

바람직한 태양에서는, 상기 약제를 UVB 노출(태양 노출) 전에, 피험자에게 충분히 투여함으로써, UVB 노출 시 혈관생성방지 효과를 나타내게 한다.

또다른 바람직한 태양에서는, TSP-2 또는 TSP-1 등의 자연적으로 생성되는 혈관형성방지 단백질의 활성을 유도하는 등에 의해 하나 이상의 혈관형성방지 인자의 활성을 증가시키는 약제의 투여를 반복해서 행하며, 예를 들면, 수일 이상 1, 2, 3, 5, 10, 20 이상의 회수를 반복한다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제를 장기 투여한다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제를 적어도 2주일 동안, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6달 동안, 적어도 일주일에 한번, 바람직하게는 일주일에 2, 3, 4, 5회, 또는 매일 투여한다. 예를 들면, 상기 약제를 3∼12주에 걸쳐 정기적으로 투여하며, 예를 들면, 여름내내 투여한다. 바람직한 태양에서는 상기 약제를 피험자의 얼굴, 목, 가슴, 귀, 손, 머리의 벗겨진 부분, 또는 UVB에 노출되는 기타 부위에 투여하여 주름 형성을 저해 또는 방지한다.

바람직한 태양에서는, 상기 피험자는 장기간 UVB 방사선에 노출되어왔거나 될 것이다.

바람직한 태양에서는, 상기 피험자는 하나 이상의 광노화 표시, 예를 들면, 주름, 라인, 늘어짐, 기미, 탄 피부, 변색, 과잉색소침착, 노인성 반점(예, 간반(liver spot)), 피부 박층화, 백내장, 표피 과다형성, 피부 탄력섬유증, 세포외 기질 감소, 전암성 또는 암성 피부 성장(자외선 각화증, 태양 각화증)을 나타낸다.

바람직한 태양에서는, VEGF 수용체(예, KDR)를 통한 신호전달(signaling)의 저해; VEGF 단백질 레벨의 저해; VEGF 유전자 발현 수준의 감소; 및/또는 VEGF 단백질 생성 및/또는 활성의 감소 등에 의해, 피험자의 VEGF 활성을 감소시켜 혈관형성을 저해함으로써, 주름 형성 등의 UVB-유발 피부손상(예, 장기간 UVB-유발 피부 손상)을 방지한다.

바람직한 태양에서는, VEGF는 VEGF 활성을 저해하는 약제를 투여함으로써 저해된다. VEGF 활성을 저해하는 약제는, VEGF의 수용체 결합을 저해하거나 VEGF 수용체의 신호전달을 저해하여 VEGF 수용체를 저해하는 약제(예, 작은 분자); 세포성 VEGF 핵산 서열(예, mRNA)에 결합하여, 안티센스 분자 또는 VEGF 리보자임(ribozyme) 등의 단백질의 발현을 저해할 수 있는 VEGF 핵산 분자; VEGF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(예, VEGF의 자연 세포 표적에 대한 결합력을 떨어뜨리는 항체); VEGF 유전자 발현을 감소시키는 약제(예, VEGF의 프로모터에 결합하는 작은 분자) 중의 어느 하나여도 좋다.

또다른 바람직한 태양에서는, VEGF 활성은 예를 들면, VEGF 유전자의 전사를 감소시킴에 의한 내인성 VEGF 유전자의 발현 수준을 감소시킴으로써 저해시킨다. 바람직한 태양에서, VEGF 유전자의 전사는 네거티브 조절 서열(전사 억제인자의 DNA 결합 부위 등)의 부가에 의해 내인성 VEGF 유전자의 조절 서열을 변경시킴으로써 감소시킬 수 있다.

또다른 바람직한 태양에서는, 상기 약제는 VEGF 수용체의 신호전달을 저해하거나, 직접 또는 간접적으로 VEGF 프로모터와 상호작용함에 의해서 VEGF 활성을 저해하는 화합물(예, 작은 분자)이다.

바람직한 태양에서, VEGF 발현을 저해하는 약제를 국소 투여; 전신 투여; 경구 투여; 또는 피부 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제를 적합한 전달 매체를 사용하여 투여한다. 바람직하게는 상기 약제는 국소용 조성물에 함유되며, 예를 들면, 그 조성물은 젤, 크림, 액체 등이다. 상기 조성물은 향 또는 선스크린(예, 옥틸메톡시신나메이트, 아미노벤조산, 옥시벤존, 파디메이트 O, 호모살레이트, 또는 이산화 티탄) 등의 화장품 원료를 더 함유해도 좋다. 또한 상기 조성물은 알로에 추출물, 그레이프 추출물 등의 식물 추출물을 함유해도 좋다. 또한 상기 조성물은 비타민 A(예, 레티놀); 비타민 C(예, L-아스코르브산 또는 L-아스코르브산 팔미테이트); 비타민 E(예, 토코페롤 아세테이트) 등의 비타민을 함유해도 좋다. 바람직한 태양에서는, VEGF 발현을 저해하는 약제는 국소 투여할 수 있다. 바람직한 태양에서는 상기 약제를 UVB 노출(태양 노출) 전에, 피험자에게 충분히 도포함으로써, UVB 노출 시 혈관생성 저해 효과를 나타내게 한다.

또다른 바람직한 태양에서는, 상기 약제의 투여를, 예를 들면, 적어도 1, 2, 3, 5, 10, 20회 이상 반복한다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제를 장기 투여한다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제를 적어도 2주일 동안, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6달 동안, 적어도 일주일에 한번, 바람직하게는 일주일에 2, 3, 4, 5회, 또는 매일 투여한다. 예를 들면, 상기 약제를 3∼12주에 걸쳐서 정기적으로 투여하며, 예를 들면, 여름내내 투여한다. 바람직한 태양에서는 피험자의 얼굴, 목, 가슴, 손, 또는 UVB에 노출되는 기타 부위에서 주름형성이 저해된다.

바람직한 태양에서 상기 방법은 TSP-2 활성을 증가시키는 약제, TSP-1 활성을 증가시키는 약제, 또는 VEGF를 저해하는 약제 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 바람직한 태양에서, 혈관생성 저해제 하나 이상, 예를 들면, 혈관형성방지 저해제를 유도 또는 증가시키는 하나 이상의 약제를 투여한다.

또다른 면에서, 본 발명은 피험자의 UVB-유발 피부 손상, 예를 들면, 장기간 UVB-유발 피부 손상(예, 주름)을 방지 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 피험자에게, 혈관형성을 저해하는 약제(예, 작은 분자) 등의 혈관형성 저해제를 함유하는 조성물을, UVB-유발 피부 손상, 예를 들면 장기간 UVB-유발 피부손상(예, 주름)을 감소 또는 방지할 정도의 충분한 양으로, 예를 들면, 국소 투여함을 포함한다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제를, UVB 노출시 혈관형성방지 효과를 나타내도록, UVB 노출(예, 태양광 노출) 전에 충분히 투여한다.

바람직한 태양에서, 상기 약제는 VEGF를 저해하는 화합물(예, 작은 분자)이다.

바람직한 태양에서는, 상기 약제는 국소 투여한다. 상기 약제는 얼굴, 가슴, 귀, 목, 손, 머리의 벗겨진 부분, 및 신체의 기타 부위에 투여할 수 있다. 상기 치료는 혈관형성 저해제의 1회 투여 이상, 예를 들면, 적어도 2회, 3회, 또는 4회 투여를 포함할 수 있다. 상기 치료는 또한 혈관형성 저해제를 매일 투여함을 포함한다.

바람직한 태양에서는, 혈관형성 저해제, 예를 들면 혈관형성 저해제를 증가 또는 유도하는 약제를 멸균 조성물(sterile composition)로 제공한다.

바람직한 태양에서, 혈관형성 저해제는 TSP-2이다.

바람직한 태양에서, 혈관형성 저해제는 TSP-1이다.

바람직한 태양에서, 상기 조성물을 화장품 원료, 예를 들면, 향 또는 선스크린(예, 옥틸 메톡시신나메이트, 아미노벤조산, 옥시벤존, 파디메이트 O, 호모살레이트, 또는 이산화티탄)을 더 함유할 수 있다. 또한 상기 조성물은 식물 추출물(예, 알로에 추출물, 그레이프 추출물)을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 비타민예를 들면, 비타민A(예, 레티놀); 비타민C(예, L-아스코르브산 또는 L-아스코르브산팔미테이트); 비타민E(예, 토코페롤아세테이트)를 함유할 수도 있다.

바람직한 태양에서, 상기 조성물은 장기간 투여한다. 바람직한 태양에서,상기 조성물은 적어도 2주 동안, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6달 동안, 일주일에 적어도 한번, 바람직하게는 일주일에 2, 3, 4, 5회 또는 매일 도포한다. 예를 들면, 상기 조성물은 3∼12주 동안, 예를 들면 여름 동안 주기적으로 도포한다. 바람직한 태양에서, 상기 방법은 TSP-2 활성을 증가시키는 약제, TSP-1 활성을 증가시키는 약제, 또는 VEGF를 저해하는 약제 중의 하나 이상을 투여함을 포함한다. 바람직한 태양에서는 하나 이상의 혈관형성 저해제를 투여한다.

또다른 면에서, 본 발명은 피험자의 UVB-유발 피부 손상, 예를 들면 장기간 UVB-유발 피부손상(예, 주름)을 방지하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 UVB-유발 피부 손상, 예를 들면, 장기간 UVB-유발 피부 손상으로부터의 보호(예, 주름 형성으로부터의 보호)를 필요로 하는 피험자를 식별하고; 혈관형성 저해제, 예를 들면 혈관형성 저해제를 증가시키거나 유도하는 약제(예, 작은 분자) 또는 혈관형성 분자를 저해하는 약제(예, 작은 분자)를 피험자에 투여하고; 또한 주름형성에 대한 투여 효과를 평가함을 포함한다. 장기간 UVB-유발 피부 손상(예, 주름)으로부터 보호를 필요로 하는 피험자의 식별은 피험자, 건강관리 제공자, 또는 화장품 공급자에 의해 수행할 수 있다. 혈관형성 저해제의 투여와 주름 방지에 대한 투여 효과의 평가도 예를 들면, 피험자, 건강관리 제공자, 또는 화장품 공급자에 의해 수행할 수 있다.

바람직한 태양에서, 혈관형성 저해제는 TSP-2이다.

바람직한 태양에서, 혈관형성 저해제는 TSP-1이다.

바람직한 태양에서, 혈관형성 분자는 VEGF이다.

바람직한 태양에서, 주름은 UVB 방사선에 노출함에 의해 생긴다.

바람직한 태양에서, 상기 약제는 국소 투여된다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제를 UVB 노출(예, 태양 노출) 전에 충분히 도포하여, UVB 노출 시에 혈관형성 방지 효과를 나타내게 한다.

바람직한 태양에서, 상기 약제는 장기적으로 도포한다. 바람직한 태양에서, 상기 약제는 적어도 2주 동안, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6달 동안 적어도 일주일에 1회, 바람직하게는 일주일에 2, 3, 4, 5회, 또는 매일 도포한다. 예를 들어, 상기 약제는 3∼12주 동안, 예를 들면 여름 내내 정기적으로 도포한다.

바람직한 태양에서, 혈관형성 저해제, 예를 들면, 혈관형성 저해제를 유도하는 약제는 멸균 조성물로 제공한다.

바람직한 태양에서는, TSP-2 활성을 증가시키는 약제, TSP-1 활성을 증가시키는 약제(TSP-1의 활성은 여기에 TSP-2 활성 증가에 기재된 것들과 유사한 방법으로 증가시킬 수 있음), 또는 VEGF를 저해하는 약제 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 바람직한 태양에서는, 하나 이상의 혈관형성 저해제를 투여한다.

또다른 면에서, 본 발명은 혈관형성방지 단백질(예, TSP-1 또는 TSP-2)의 발현을 유도하는(예를 들면, 피부에서 그것을 유도하는) 시험화합물의 능력을 평가하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 혈관형성방지 유전자의 제어 부위(예, 프로모터)에 기능적으로 연결된 리포터(reporter) 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는트랜스진(transgene)을 갖는 세포(예, 표피 세포)를 제공하고(여기서, 상기 리포터 분자는 프로모터와 정상적으로 결합된 유전자에 의해 코딩된 단백질 이외의 것임); 상기 세포를 시험 화합물과 접촉시키고; 또한 시험 화합물에 의해 혈관형성방지 유전자의 발현을 조정하는 것과 상관관계가 있는 리포터 분자, 그 존재 또는 강도에 의해 생성되는 시그널을 평가함을 포함한다. 상기 화합물은 단백질, 폴리펩티트, 작은 분자(예를 들면, 분자량이 2000달톤(dalton) 미만, 바람직하게는 1000달톤 미만의 작은 분자)여도 좋다.

바람직한 태양에서, 상기 리포터는 형광 시그널를 제공할 수 있는 분자이다. 상기 리포터는 예를 들면, 루시퍼라제, GFP, 또는 BFP여도 좋다. 다른 태양에서, 상기 리포터는 효소이다.

바람직한 태양에서, 상기 세포는 배양 세포(예를 들면, 불멸화된 인간 표피 케라티노사이트)이다.

바람직한 태양에서, 상기 세포는 유전자도입 동물(transgenic animal) 유래이다.

바람직한 태양에서, 상기 세포는 유전자도입 동물 유래이고 상기 시험 화합물은 상기 유전자도입 동물에 투여되며, 예를 들면, 유전자도입 동물의 피부에 국소 도포된다.

바람직한 태양에서, 상기 방법은 상기 화합물을 상기 동물에 투여하고, 그 동물을 UVB에 노출시키고, 그 화합물의 효과를 평가함으로써, 상기 화합물을 인간 또는 인간이외의 동물에 대한 생체내(in vivo) 시험함을 더 포함한다.

또다른 면에서, 본 발명은 혈관형성 단백질(예, VEGF)의 발현 저해(예를 들면, 피부에서의 발현 저해)에 대한 상기 화합물의 능력을 평가하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 혈관형성 인자 유전자(예, VEGF)의 제어 영역(예, 프로모터)에 기능적으로 결합된 리포터 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스진을 갖는 세포(예, 표피 세포)를 제공하고(여기서, 상기 리포터 분자는 프로모터와 통상 결합된 유전자에 의해 코딩되는 단백질 이외의 것임); 또한, 시험 화합물에 의한 혈관형성 유전자의 발현의 조정과 상관관계에 있는 리포터 분자, 그 존재 또는 강도에 의해 생성된 시그널을 평가함을 포함한다. 상기 화합물은 단백질, 폴리펩티드, 작은 분자(예를 들면, 분자량이 2000달톤 미만, 바람직하게는 1000달톤 미만, 더 바람직하게는 500달톤 미만인 작은 분자)여도 좋다.

바람직한 태양에서, 상기 리포터는 형광 시그널을 제공할 수 있는 분자이다. 상기 리포터는 예를 들면 루시퍼라제, GFP, 또는 BFP여도 좋다. 다른 태양에서, 상기 리포터는 효소이다.

바람직한 태양에서, 상기 세포는 상기 세포는 배양 세포(예를 들면, 불멸화된 인간 표피 케라티노사이트)이다.

바람직한 태양에서, 상기 방법은 상기 화합물을 상기 동물에 투여하고, 그 동물을 UVB에 노출시키고, 그 화합물의 효과를 평가함으로써, 상기 화합물을 인간 또는 인간 이외의 동물에 대한 생체내(in vivo) 시험함을 더 포함한다.

또다른 면에서, 본 발명은 UVB-유발 피부 손상(예, 주름)을 방지 또는 치료하는 조성물을 특징으로 한다. 상기 조성물은 혈관형성 저해제, 예를 들면, TSP-1 또는 TSP-2를 증가 또는 유도하는 약제(예, 작은 분자); 또는 혈관형성 분자를 저해하는 약제(예, 작은 분자), 예를 들면, VEGF를 저해하는 약제, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 무균(멸균)상태이다.

바람직한 태양에서, 상기 조성물은 국소 투여된다.

바람직한 태양에서, 혈관형성 저해제는 TSP-2이다.

바람직한 태양에서, 혈관형성 저해제는 TSP-1이다.

바람직한 태양에서는 TSP-2의 활성을 증가시키는 약제, TSP-1의 활성을 증가시키는 약제, 또는 VEGF의 활성을 저해시키는 약제 중의 하나 이상을 포함한다.

바람직한 태양에서, 상기 조성물은 화장품 원료, 예를 들면, 향, 습윤제, 선스크린(예, 옥틸메톡시신나메이트, 아미노벤조산, 옥시벤존, 파디메이트 O, 호모살레이트, 또는 이산화티탄)을 더 함유한다. 또한 상기 조성물은 식물 추출물(예,알로에 추출물, 그레이프 추출물)을 함유한다. 또한 상기 조성물을 비타민, 예를 들면, 비타민A(예, 레티놀); 비타민C(예, L-아스코르브산 또는 L-아스코르브산팔미테이트); 비타민E(예, 토코페롤아세테이트)를 함유할 수도 있다.

또다른 면에서, 본 발명은 UVB-유발 피부 손상(예를 들면 장기간 UVB-유발 피부손상)으로부터의 보호(예, 주름으로부터의 보호)를 피험자에게 제공하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 혈관형성 저해제, 예를 들면, 혈관형성 저해제(예, TSP-2 또는 TSP-1)를 증가 또는 유도하는 약제(예, 작은 분자), 또는 혈관형성 분자를 저해하는 약제(예, VEGF를 저해하는 약제)(예, 작은 분자)를 함유하는 조성물을 피험자에게 제공하고; 또한, UVB-유발 피부손상, 예를 들면 UVB-유발 피부 손상(예, 주름)을 방지 또는 감소시키는 조성물을 사용하는 사용설명서를 피험자에게 제공함을 포함한다.

바람직한 태양에서, 상기 사용설명서는 상기 조성물을 장기적으로 도포하는 사용법을 포함한다. 바람직한 태양에서, 상기 사용설명서는 적어도 2주 동안, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6달 동안, 적어도 일주일에 1회, 바람직하게는 일주일에 2, 3, 4, 5회 또는 매일 도포하는 사용법을 포함한다. 예를 들면, 상기 상용법으로는 상기 조성물을 3∼12주 동안, 예를 들면 여름내내 주기적으로 도포하는 사용법을 들 수 있다.

바람직한 태양에서, 상기 혈관형성 저해제는 TSP-2이다.

바람직한 태양에서, 상기 혈관형성 저해제는 TSP-1이다.

바람직한 태양에서, 상기 약제는 TSP-2 또는 TSP-1을 유도하는 화합물(예, 작은 분자)이다.

바람직한 태양에서, 상기 조성물은 화장품 원료, 예를 들면, 향, 습윤제, 선스크린(예, 옥틸메톡시신나메이트, 아미노벤조산, 옥시벤존, 파디메이트 O, 호모살레이트, 또는 이산화티탄)을 더 함유한다. 또한 상기 조성물은 식물 추출물(예, 알로에 추출물, 그레이프 추출물)을 함유할 수 있다. 또한 상기 조성물은 비타민, 예를 들면, 비타민A(예, 레티놀); 비타민C(예, L-아스코르브산 또는 L-아스코르브산팔미테이트); 비타민E(예, 토코페롤아세테이트)를 함유할 수도 있다.

바람직한 태양에서, 상기 조성물은 TSP-2 활성을 증가시키는 약제, TSP-1의 활성을 증가시키는 약제, 또는 VEGF를 저해하는 약제 중의 하나 이상을 함유한다. 바람직한 태양에서, 상기 조성물은 하나 이상의 혈관형성 저해제를 함유한다.

또다른 면에서, 본 발명은 피험자의 UVB-유발 피부 손상, 예를 들면 장기간 UVB-유발 피부 손상(예, 주름)을 방지하는 키트를 특징으로 한다. 상기 키트는 혈관형성 저해제, 예를 들면, 혈관형성 저해제를 증가 또는 유도하는 약제(예, 작은 분자); 및 UVB-유발 피부 손상, 예를 들면 장기간 UVB-유발 피부손상(예, 주름)을 방지하는 상기 조성물을 사용하는 사용설명서를 포함한다.

바람직한 태양에서, 상기 지시는 태양광 노출 전 및/또는 노출 동안에 상기조성물을 도포하는 지시를 포함한다. 바람직한 태양에서, 상기 지시는 적어도 2주 동안, 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6달 동안, 적어도 일주일에 1회, 바람직하게는 일주일에 2, 3, 4, 5회 또는 매일 도포하는 지시를 포함한다. 예를 들면, 상기 지시로는 상기 조성물을 3∼12주 동안, 예를 들면 여름내내 주기적으로 도포하는 지시를 들 수 있다.

바람직한 태양에서, 상기 혈관형성 저해제는 TSP-2이다.

바람직한 태양에서, 상기 혈관형성 저해제는 TSP-1이다.

바람직한 태양에서, 상기 조성물은 화장품 성분, 예를 들면, 향, 선스크린(예, 옥틸메톡시신나메이트, 아미노벤조산, 옥시벤존, 파디메이트 O, 호모살레이트, 또는 이산화티탄)을 더 함유한다. 또한 상기 조성물은 식물 추출물(예, 알로에 추출물, 그레이프 추출물)을 함유할 수 있다. 또한 상기 조성물은 비타민, 예를 들면, 비타민A(예, 레티놀); 비타민C(예, L-아스코르브산 또는 L-아스코르브산팔미테이트); 비타민E(예, 토코페롤아세테이트)를 함유할 수도 있다.

바람직한 태양에서, 상기 사용설명서는 피부, 예를 들면, 노출된 피부(예, 얼굴, 목, 손, 귀, 가슴, 또는 머리의 벗겨진 부분)에 상기 조성물을 도포하는 사용법을 포함한다. 바람직하게는, 상기 사용설명서는 UVB(예, 태양광) 노출 전 및/또는 노출 동안 상기 조성물을 도포하는 사용법을 포함한다.

바람직한 태양에서, 상기 조성물은 TSP-2 활성을 증가시키는 약제, 또는TSP-1의 활성을 증가시키는 약제, 또는 VEGF를 저해하는 약제 중 하나 이상을 함유한다. 바람직한 태양에서, 상기 조성물은 하나 이상의 혈관형성 저해제를 함유한다.

여기서 사용되는 바와 같이, 주름은 피부 표면의 형상 변화를 말한다. 피부의 조직학적 레벨에서의 특이적인 구조 변화가 있을 수도 없을 수도 있다. 주름은 Kligman et al.(1985) Br J Derm 113:37-42에 기재된 바와 같이 분류할 수 있고, 여기서 참고로 기재한다. Kligman은 주름을 3종류로 분류한다: 선형 주름(linear wrinkle), 무늬있는 주름(glypic wrinkle), 크링클(crinkle). 선형 잔주름은 직선으로, 통상 얼굴의 피부에서 발견되고, 자연적으로 나이가 들어가고 자외선에 노출됨에 따라 생긴다. 무늬있는 잔주름은 명백한 삼각형 또는 직사각형의 주름 모양으로, 태양광에 노출된 얼굴, 손, 및 목에서 발견되며, 자외선 또는 피부헬리오시스(dermatoheliosis)에 노출함으로써 심화된다. 크링클은 처진 피부상의 얇고 구불구불한 주름으로, 피부 어느 곳에서나 발견되나, 일반적으로 손등 및 눈꺼풀 주변에서 발견된다. 주름은 종종 라인, 잔주름, 크링클, 까치발, 또는 처짐이라 칭한다.

여기서 사용되는 "작은 분자"라 함은 분자량이 2000dlt 미만, 바람직하게는 1000dlt 미만인 유기 분자 등의 펩티드, 펩티도미메틱스(peptidomimetics), 또는 비펩티드성 화합물을 포함한다.

여기서 사용되는 치료(treating)는 장애의 증상 또는 결과를 전체 또는 부분적으로 경감 또는 제거함를 의미한다. 여기서 사용되는 방지(preventing)는 장애의 증상 또는 결과를 완전히 방지하거나, 외관상 지연함을 의미할 수 있다.

여기서 사용되는, 장기간(또는 만성적인) UVB 방사선 노출이라 함은 자연 태양광 또는 인위적인 UVB 방사선(예, 태닝(tanning)용, 또는 건선, 아토피성피부염, 또는 백반 등의 치료를 위한 광치료용 UVB 태양광 램프)에 장기간 노출함을 의미한다. 예를 들면, 장기 노출은 3∼6, 또는 더 높은 UV 지수에서, 3이상, 더 바람직하게는 5이상에서 10분 이상, 또는 소정의 기간 동안 10회 이상 태양에 노출하는 것일 수 있다. 상기 소정의 기간은 1달, 2달, 3달, 6달, 12달 또는 24달일 수 있으며, 예를 들면, 12달 동안 UVB 방사선(예, 태양광 또는 인공 UVB 방사선)을 누적하여 5시간 노출할 수 있다. 장기간 UVB-유발 손상(예, 주름)에 노출된 위험에 있는 피험자는 3∼6, 또는 그 이상의 UV 지수에서, 일년동안 10회 이상, 적어도 10분 동안 노출되었거나 될 수 있는 피험자, 또는 일년동안 누적하여 5시간 동안 UVB 방사선에 노출되는 피험자일 수 있다. 바람직하게는 상기 피험자는 오전 11시와 오후 3시 사이에 태양에 노출되거나, 여름 동안 태양에 노출되거나, 또는 극도로 UV 지수가 높은 날에 태양에 노출된다. 장기간 UVB-유발 피부 손상(예, 주름)의 위험에 있는 피험자로는 높은 고도에 살고 있는 사람(예, 해발 1000피트 이상에 살고 있는 사람); 1년에 10회 이상 실외 스포츠에 참가하는 사람(예, 조깅, 테니스, 등산, 스키, 또는 수상 스키에 참가하는 사람); UVB 광치료를 하고 있는 중이거나 경험한 사람을 들 수 있다.

[상세한 설명]

UVB 방사선에 노출

UVB 방사선의 주요원은 자연 태양광이다. UVB선의 강도는 하루중 시간, 일년중 시간, 하늘에서 태양의 위치, 고도 및 적도로부터의 거리에 따라 다르다. 이들 광선은 비록 그들이 항상 존재하더라도, 여름의 정오에 가장 강하고, 심지어 겨울 동안에도 정오에 강하다. 고도가 더 높을수록 UVB 선의 강도가 더 강하다. 그러므로, 등산하는 사람, 스키 타는 사람, 및 높은 고도에 사는 사람은 장기간 UVB 손상의 위험에 처해있다. 또한, 적도에 더 가까운 사람이 더 강한 UV 방사선과 더 높은 장기간 UVB 손상의 위험에 처해 있다.

눈, 물, 및 모래는 태양광을 반사시키고, 피부에 도달하는 UVB 방사선의 양을 증대시킨다. 구름이 태양을 가릴 때 조차도, UVB 수준은 장기간 노출시 여전히 광노화(예, 주름)를 일으킬 정도로 충분히 높다.

UV 지수(환경 보호국에 의해 개발됨)는 지정된 날의 태양의 UV선 강도를 나타낸다. 이것은 4개의 카테고리로 나뉜다-보통(UV 지수가 3미만), 높음(UV 지수가 3∼6), 매우 높음(UV 지수 6∼10) 및 극도로 높음(UV 지수가 10보다 높음). 보통 UV 지수는 피부를 태우는데 1시간 이상 걸림을 의미하고; 극도로 높은 수준은 15분 미만이 걸림을 의미한다. 상기 지수는 종종 일기 발표에 포함된다. 임상적으로, UVB 노출은 MED로 측정된다. 1 MED는 민감한 피부에서 선번(sunburn)을 생성하는데 요구되는 UVB의 양이다. UVB 노출 결과는 누적되기 때문에, 장기간 또는 만성적인 UVB-유발 주름은 홍반 또는 부종 또는 작열감을 일으킬 수 있는 지수 이하(예, I MED 이하)의 UVB 수준에서 장기간 노출한 결과로서 일어날 수 있다. 예를들면, 비록 피험자가 낮거나 보통의 UV 지수인 날에만 태양광에 노출될 지라도 만성적으로 태양에 노출될 경우, 피험자는 장기간 UVB-유발 주름의 위험에 처해진다.

혈관형성과 만성적인 UVB 노출

광노화된 피부는 표피 과다형성, 진피 탄력섬유증 및 매트릭스 단백질 분해(5, 38)를 특징으로 하고, 또한, 혈관주위(perivenular) 림프구조직구성의 피부 침윤물(23)의 존재를 특징으로 한다. 여기에 기재된 결과에 의해, 피부의 만성 UVB 자극이 명백한 피부 혈관형성과 관련이 있고 과다형성된 표피에서의 증가된 VEGF 발현과 관련이 있음을 나타내며, 또한 TSP-1에 의한 피부 혈관형성의 선택적인 저해는 UVB-유발 피부 손상 및 주름 형성을 방지함을 나타낸다.

Skh-1 헤어리스 마우스(만성 광노화(26)용으로 확립된 실험 모델)를 10주간 UVB 조사한 후, 명확한 주름 형성, 및 조직이 붕괴된 탄력 섬유 및 콜라겐 섬유의 검출이 증가된 것과 관련이 있는 표피와 진피의 과다 형성의 특징이 있는 조직학적인 형상을 확인하였다. 내피 연결 분자(endothelial junction molecular) CD31(39)을 염색한 조직 절편을 컴퓨터를 이용하여 화상 정량 분석한 결과, 장기간 UVB 조사 후 피부 혈관형성이 현저하게 유도되고, 동시에 혈관 밀도와 혈관 사이즈 둘다 현저하게 증가함이 확인되었다. 이들 혈관 변화는, 이미 존재하는 혈관의 성장과 혈관 확장 둘다에 의해 혈관-리치 과립상 조직(24)이 형성되는 경우의 피부의 상처 치유동안 일어나는 혈관형성 변화와 비교할 수 있었다. 이와 반대로, 건선 등의 만성적인 염증성 피부 질환은 새로운 혈관 발아 없이 피부 미세 혈관이 신장 및 확장되는 혈관 리모델링을 나타낸다. 이러한 발견은 피부에 만성적인 UVB 조사로 인해 만성적인 조직 복원(repair) 반응이 일어남을 나타내며 혈관형성이 UVB-유발 피부 손상의 중재에 중요한 역할을 함을 나타낸다.

혈관 내피 성장 인자(VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor)는, 피부 혈관형성(14, 41)과 관련된 건선 피부 병변 및 다른 피부 질환을 가진 과다형성된 표피에서는 물론, 상처 치유(13, 42) 신생 표피에서 발현이 증가되는 케라티노사이트 유래의 피부 혈관형성 인자로 확인되었다. 여기서 기재하는 실험에서는, 만성적으로 UVB 조사한 피부의 과형성 표피에서, 바람직하게는 기저상부의 케라티노사이트에서 VEGF mRNA 발현의 현저한 과조절(upregulation)이 확인되었다. 이러한 발견은, 격렬한 UVB 조사가 시험관내(43)(44) 및 생체내(7)에서 인간 표피 케라티노사이트에서 VEGF 발현을 유도한다는 이전 보고와 일치한다.

혈관형성 및 만성적인 UVB-유발 주름

혈관형성 저해제 TSP-1의 피부 특이적인 과발현이 일어나는 유전자도입 마우스를 만성적인 UVB 조사에 노출시켰다. 표피 케라티노사이트에서 TSP-1 트랜스진 발현을 목표로 하는 확립된 케라틴 14(K14) 프로모터 카세트를 사용하여, 표피 TSP-1의 증가된 발현 수준, 표피와 진피의 정상적인 두께 및 형태, 및 피부 상처를 치유하는 동안 피부 혈관형성의 강력한 저해를 특징으로 하는 K14/TSP-1 유전자도입 마우스를 미리 확립한다. K14 유전자 발현이 케라티노사이트의 증식을 상당히 증강시키기 때문에, K14 프로모터 사용에 의해 표피 과형성의 조건 하에 트랜스진의 높은 발현이 보장된다. 본 실시예에서 기재된 결과는 TSP-1의 표피 과발현이 진피 광손상 및 콜라겐 및 엘라스틴 섬유 붕괴를 저해하고 또한 피부 주름 형성을완전히 저해함을 나타내었다. 이것은 피부 혈관형성의 강력한 저해와 관련있으며 내피 증식 감소와 내피 세포의 세포소멸(apoptosis) 증가와 관련있다. 마찬가지로, 이 결과들은 복원 관련된, UVB-유발 혈관형성의 저해에 의해 주름 형성을 포함한 진피 광손상도 방지함을 나타낸다.

TSP-1이 타입 I 리피트내의 특정 서열과 내피 세포상의 CD36 수용체의 특이적인 상호작용에 의한 혈관형성의 저해를 중재하여, 내피 세포의 세포소멸율을 증강시킴은 이미 알려져 있다.(46). 최근 증거는, TSP-1은 관련 분자인 TSP-2와 마찬가지로, 그의 혈관형성 방지 효과에 대해 중요한 함축의미를 가지고, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)의 활성화를 저해할 수도 있다. 이 결과에 의해 MMP-9 활성화의 저해를 통하여 TSP-1이 UVB 조사에 의해 유도되는 피부 혈관형성을 감소시키는 부가적인 메카니즘을 확인할 수 있다. MMP-9는 세포외기질 성분을 소화하는 징크 프로테나제 패밀리의 일원이며, UV가 조사된 인간의 피부에서는 MMP-9 발현 수준과 활성이 증가되어 있음이 확인되었다(35, 50, 51).

역으로, TSP-2 녹아웃(knock out) 마우스는 야생형 마우스에 비해, 장기간 UVB 노출에 반응하여 증가된 주름을 나타내었다. 그러나, 만성 UVB 조사 후에 TSP-2 녹아웃 마우스와 야생형 마우스 사이에서 MMP-9 활성의 주요한 차이는 검출되지 않았다. 이러한 결과들은 피부 혈관형성의 특이적인 저해(MMP 효과에 반하여)는 피부의 만성적인 UVB 손상(예, 주름) 방지에 대한 가능한 새로운 접근을 나타낼 수 있다.

TSP의 유사체

유사체는 자연적으로 생성되는 TSP-1 또는 TSP-2와 아미노산 서열이 다르거나 또는 서열 외의 것에서 다르거나, 또는 둘다 다르다. 서열 변경 이외의 것으로는 TSP-1 또는 TSP-2의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도를 들 수 있다. 또 서열 변경 이외의 것은 아세틸화, 메틸화, 인산화, 카복실화, 또는 포도당화의 변화를 포함한다.

TSP-1 및 TSP-2(예, 인간 TSP-1 및 TSP-2)의 서열은 공지되어 있다. 바람직한 유사체로는 TSP-1 또는 TSP-2의 생물학적 활성을 없애지 않는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 그 서열이 야생형 서열과 다른 TSP-1 또는 TSP-2(또는 그들의 생물학적으로 활성이 있는 단편)를 들 수 있다. 보존적 치환으로는 일반적으로 유사한 특징을 갖는 또다른 것으로 하나의 아미노산 치환, 예를 들면, 다음 군내의 치환을 들 수 있다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.

기타 보전적 치환은 하기 표로부터 행할 수 있다.

[표 1]

<보존적 아미노산 치환>

본 발명 중에서의 다른 유사체는 펩티드 안정성을 증가시키도록 변형된 것이다; 이러한 유사체는, 예를 들면, 펩티드 서열내에 하나 이상의 비펩티드성 결합(펩티드 결합을 대체함)을 함유해도 좋다. 또한 자연적으로 생성되는 L-아미노산(예, D-아미노산) 또는 자연적으로 생기지 않거나 합성한 아미노산(예, β 또는 γ아미노산) 이외의 잔기; 및 고리모양(cyclic) 유사체도 포함된다.

단편 및 유사체의 제조

단편의 생성

단백질 단편은 재조합, 단백질분해 소화, 또는 화학합성 등의 여러 방법에 의해 생성할 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 한 말단 또는 양 말단으로부터 하나 이상의 뉴클레오티드를 제거함으로써 생성할 수 있다. 변이가 일어난 DNA의 발현에 의해 폴리펩티드 단편이 생성된다. 따라서 "말단-니블링(end-nibbling)" 엔도누클레아제로 소화하여 일련의 단편을 코딩하는 DNA를 생성할 수 있다. 단백질 단편을 코딩하는 DNA는 랜덤 시어링(random shearing), 제한 소화 또는 상술한 방법의 조합에 의해 생성할 수도 있다.

또한 단편은 종래의 Merrifield solid phase f-Moc or t-Boc Chemistry 등의 공지의 기술을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드는 단편의 겹침(overlap)없이 원하는 길이의 단편으로 임의로 나눌 수 있거나, 또는 원하는 길이의 겹침이 있는 단편으로 나눌 수 있다.

유사체의 생성: 랜덤한 방법에 의한 변경된 DNA 및 펩티드 서열의 생성

단백질의 아미노산 서열 변이체를 단백질 또는 단백질의 특정 도메인 또는 영역을 코딩하는 DNA의 랜덤 돌연변이 유발에 의해 제조할 수 있다. 유용한 방법으로는 PCR 돌연변이유발 및 포화 돌연변이유발을 들 수 있다. 또한 랜덤 아미노산 서열 변이체의 라이브러리를, 축중(degenerate) 올리고뉴클레오티드 서열 세트의 합성에 의해 제조할 수 있다(변이체의 라이브러리 중의 단백질을 스크리닝하는방법).

PCR 돌연변이유발

PCR 돌연변이유발에 있어서, 감소된 Taq 폴리머라제 충실도(fidelity)를 이용하여, 클로닝된 DNA 단편에 랜덤 돌연변이를 도입한다(Leung et al., 1989,TechniqueI:11-15). 이것은 매우 강력하고 비교적 빠른 램덤 돌연변이 도입 방법이다. 예를 들면, dGTP/dATP비를 5로 하여 사용하고 Mn²⁺을 PCR 반응에 첨가함에 의해 Taq DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성의 충실도를 감소시키는 조건 하에서, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, 돌연변이를 일으킬 DNA 영역을 증폭시킨다. 증폭된 DNA 단편의 풀(pool)을 적당한 클로닝 벡터에 삽입하여 랜덤 돌연변이 라이브러리를 제공한다.

포화 돌연변이유발

포화 돌연변이유발에 의해, 클로닝된 DNA 단편에 다수의 단일 염기 치환을 빠르게 도입할 수 있다(Mayers et al., 1985,Science229:242). 이 기술은 예를 들면, 시험관내에서 단일가닥 사슬 DNA의 화학처리 또는 UV 조사에 의한 돌연변이 형성, 및 상보적인 DNA 가닥의 합성을 포함한다. 돌연변이 빈도는 처리의 가혹도를 조정함으로써 조절할 수 있으며, 본질적으로 모든 가능한 염기 치환을 얻을 수 있다. 이 방법은 돌연변이 단편에 대한 유전적인 선택을 포함하지 않기 때문에, 중립치환(neutral substitution) 외에, 기능을 변화시키는 치환이 얻어진다. 점돌연변이의 분포는 보존적 서열 요소쪽에 치우치지 않는다.

축중(degenerate) 올리고뉴클레오티드

또한, 축중 올리고뉴클레오티드 서열 세트로부터 상동체(homolog)의 라이브러리를 생성할 수 있다. 축중 서열의 화학 합성은 자동 DNA 합성기로 행할 수 있으며, 그 다음 합성한 유전자를 적합한 발현 벡터에 결합시킨다. 축중 올리고뉴클레오티드의 합성은 공지되어 있다(참조, Narang, SA(1983)tetrahedron39:3; Itakura et al.(1981)Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos.Macromolecules,ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al.(1984)Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al.(1984)Science198:1056; Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res. 11:477). 이러한 기술은 다른 단백질들의 지정 진화(directed evolution)에 적용된다(참조, Scott et al.(1990)Science249:386-390; Roberts et al.(1992)PNAS89:2429-2433; Devlin et al.(1990)Science249:404-406; Cwirla et al.(1990)PNAS87:6378-6382; 및 미국특허번호 5,223,409, 5,198,346, 및 5,096,815).

유사체의 생성: 지정 돌연변이유발(directed mutagenesis)에 의해 변경된 DNA 및 펩티드 서열의 생성

논-랜덤 또는 지정 돌연변이유발 기술은 특정 영역에서 특정 서열 또는 돌연변이를 제공하는데 사용할 수 있다. 이 기술은 아미노산 서열이 공지된 단백질 잔기의, 예를 들어, 결실, 삽입, 또는 치환을 포함하는 변이체 생성에 사용할 수 있다. 돌연변이 부위는, 예를 들면, (1)보존적 아미노산을 일차 치환한 다음 얻어진 결과에 따라서 더 래디칼 초이스를 하고, (2) 표적 잔기를 결실시키고, 또한 (3)동일 또는 상이한 클래스의 잔기를 정해진 부위에 삽입함에 의해, 또는 상기 (1)∼(3)의 조합함으로써, 단독으로 또는 연속하여 변이를 일으킬 수 있다.

알라닌 스캐닝 돌연변이유발(Alanine Scanning Mutagenesis)

알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 돌연변이유발에 바람직한 위치 또는 도메인으로 되는 원하는 단백질의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법이다(Cunningham and Wells,Science244:1081-1085, 1989). 알라닌 스캐닝에서, 표적 잔기들 중의 잔기 또는 기를 확인하여(예, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu 등의 전하를 띠는 잔기), 중성 또는 음 전하를 띠는 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 아미노산 치환은 아미노산과 세포 내부 또는 외부의 주변 수성 환경의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 그 다음, 그들 도메인이 나타내는 치환에 대한 기능적인 민감성을 치환 부위에 다른 변이체를 더 도입함으로써 순화시킨다. 그러므로, 아미노산 서열 변이체를 도입하는 부위는 미리 정해지는 반면, 돌연변이의 특성은 본질적으로 미리 정할 필요가 없다. 예를 들면, 정해진 부위에서의 돌연변이 발생을 최적화하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 랜덤 돌연변이유발을 행할 수 있으며 그 발현된 목표 단백질 서브유니트 변이체에 대해서 원하는 활성의 최적 조합을 스크리닝한다.

올리고뉴클레오티드-매개(mediated) 돌연변이유발

올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발은 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하기 위한 유용한 방법이다(참조, Aldlman et al.,DNA2:183, 1983). 다시말해, 원하는 DNA는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 DNA 주형(template)에 하이브리디제이션시켜서 변경시키며, 이때 주형은 원하는 단백질의 변경없는 또는 고유의 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 또는 박테리오파지의 단일가닥 사슬 형태이다. 하이브리디제이션 후, DNA 중합효소를 사용하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 주입하고, 원하는 단백질의 DNA의 선택 변경을 코딩하는 상기 주형의 전체 2차 상보적인 가닥(strand)을 합성한다. 일반적으로, 적어도 25개의 뉴클레오티드로 된 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적 올리고뉴클레오티드는 변이를 코딩하는 뉴클레오티드의 양쪽의 주형에 완전히 상보적인 12∼15 뉴클레오티드를 갖는다. 이것에 의해 상기 올리고뉴클레오티드는 단일가닥 사슬 DNA 주형 분자에 적합하게 하이브리디제이션할 수 있게 한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 Crea et al.(Proc. Natl. Acad. Sci.(1978) USA, 75:5765)에 의해 기재된 바와 같은 종래 공지의 기술을 사용하여 쉽게 합성할 수 있다.

카세트 돌연변이유발

변이체를 제조하기 위한 또다른 방법인 카세트 돌연변이유발은 Wells et al.에 의해 기재된 기술(Gene(1985) 34:315)에 근거한 것이다. 출발물질은 변이될 단백질 서브유니트 DNA를 포함하는 플라스미드(또는 다른 벡터)이다. 변이될 단백질 서브유니트 DNA의 코돈을 식별한다. 식별한 변이 장소의 각 부위에는 유일한 제한 엔도누클레아제 부위가 있어야 한다. 만약 상기 제한효소 부위가 존재하지 않을 경우에는, 원하는 단백질 서브유니트 DNA 중의 적당한 위치에 그들을 도입하는 상술한 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발법을 이용하여 생성할 수 있다. 제한부이를 플라스미드에 도입한 후, 그 플라스미드는 이들 부위에서 절단되어 선형으로 된다. 제한 부위 사이의 DNA 서열을 코딩하고 원하는 변이를 포함하는 두가닥 사슬 올리고뉴클레오티드를 표준 방법을 사용하여 합성한다. 두가닥은 개별적으로 합성한 뒤 표준 기술을 사용하여 서로 하이브리디제이션시킨다. 이 두가닥 사슬 올리고뉴클레오티드를 카세트라 부른다. 이 카세트는 선형 플라스미드의 말단에 필적하는 3' 및 5'말단을 갖도록 디자인되며, 곧바로 플라스미드에 결합시킬 수 있다. 그 결과, 이 플라스미드는 변이된 원하는 단백질 서브유니트 DNA 서열을 함유한다.

조합 돌연변이유발(combinatorial Mutagenesis)

또한, 돌연변이를 발생시키기 위해 조합 돌연변이유발을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상동체 또는 다른 관련 단백질 군의 아미노산 서열을, 바람직하게는 가능한한 가장 높은 상동성을 조장하도록 정렬한다. 정열된 서열의 정해진 위치에 있는 모든 아미노산을 선택하여 조합 서열의 축중 세트를 만들 수 있다. 변이체의 다양한 라이브러리는 핵산 레벨에서의 조합 돌연변이유발에 의해 생성되고, 다양한 유전자 라이버리에 의해 코딩된다. 예를 들면, 잠정적인 서열의 축정 세트가 개개의 펩티드로서, 또는 필요에 따라서, 축중서열 세트를 함유하는 더 큰 융합 단백질 세트로서 발현할 수 있도록 하기 위해서, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 하도록 유전자 서열내로 효소학적으로 결합(ligation)시킬 수 있다.

펩티드 단편 또는 상동체의 라이브러리의 일차 고처리 스크리닝 방법(Primary High-Throug-Put methods for screening libraries of peptidefragments or homologs)

생성된 변이 유전자 산물을 스크리닝하는 각종 기술이 공지되어 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 종종 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터에 클로닝하는 단계, 그 결과 얻어진 벡터의 라이브러리를 가진 적합한 세포를 형질전환시키는 단계, 및 원하는 활성의 검출, 삼량체 분자로의 어셈블리, 자연 리간드(예, 수용체 또는 기질)에 결합에 의해, 검출된 유전자 산물을 코딩하는 벡터의 비교적 용이한 분리를 촉진시키는 조건 하에서 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 하기에 기재한 각 기술은 랜덤 돌연변이 유발 기술 등에 의해 생성된 다수의 서열을 스크링하는 고처리 분석에 따른다.

2 하이브리드 시스템(two hybrid systems)

2 하이드리드(상호작용 트랩) 검정(assay)은 VEGF와 상호작용하는 단백질을 동정하기 위해 사용할 수 있다. 이들은 작동제(agonist), 과작동제(superagonist), 및 길항제를 포함한다(시험 단백질 및 그것과 상호작용하는 단백질은 미끼 단백질 및 물고기 단백질로서 사용된다.). 이들 검정은 미끼 단백질과 단백질-단백질 상호작용에 의해 매개되는 기능적인 전사 활성화제의 재구성을 검출함에 따른 것이다. 특히, 이들 검정은 하이브리드 단백질을 발현하는 키메라 유전자(chimeric gene)를 사용한다. 제1 하이브리드는 미끼 단백질(예, TSP-1 또는 TSP-2 분자 또는 그들의 단편)에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함한다. 제2 하이브리드 단백질은 "물고기" 단백질(예, 발현 라이브러리)에 융합된 전사 활성화 도메인를 포함한다. 상기 물고기 단백질과 미끼 단백질이 상호작용할 수 있는 경우, 그들은 DNA 결합도메인과 전사 활성화제 도메인의 상당한 근접을 초래한다. 이러한 근접은 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 전사 조절 부위에 작동적으로 결합되는 리포터 유전자(reporter gene)의 전사를 일으킬 정도로 충분하며, 그 마커 유전자의 발현을 검출하여 미끼 단백질과 또다른 단백질의 상호작용 결과를 평가하는데 사용할 수 있다.

디스플레이 라이브러리(Display Libraries)

스크리닝 검정의 한 연구법에서는, 후보(candidate) 펩티드는 세포 또는 바이러스 입자 표면에 디스플레이되고, 상기 디스플레이된 산물을 거쳐서 적합한 수용체 단백질에 결합하는 특정 세포 또는 바이러스 입자의 능력은 "패닝 검정 (panning assay)"으로 검출한다. 예를 들면, 상기 유전자 라이브러리는 박테리아 세포의 표면 막단백질의 유전자에 클로닝될 수 있으며, 그 결과 얻어진 융합 단백질은 패닝에 의해 검출할 수 있다(Ladner et al., WO88/06630; Fuchs et al. (1991)Bio/Technology9:1370-1371; 및 Goward et al.(1992)TIBS18:136-140). 유사한 방법에서, 검출가능한 표지된 리간드를 사용하여 잠정적으로 기능적인 펩티드 상동체를 평가할 수 있다. 형광 표지된 리간드(예, 수용체)를 이용하여 리간드-결합 활성을 보유한 상동체를 검출할 수 있다. 상기 형광 표지된 리간드를 사용함으로써 세포를 형광 현미경 하에서 가시적으로 검사 및 분리할 수 있으며, 또한 세포의 형태가 허용하는 한, 형광 활성화 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter)에 의해 분리할 수 있다.

유전자 라이브러리는 바이러스 입자의 표면상의 융합 단백질로서 발현시킬수 있다. 예를 들면, 사상 파지(filamentous phage) 시스템에서, 외래 펩티드 서열은 감염 파지의 표면상에 발현될 수 있으므로, 2가지 중요한 이점을 나타낸다. 첫째, 이들 파지는 밀리리터당 10¹³파지 이상인 농도로 친화성 매트릭스(affinity matrices)에 적용할 수 있기 때문에, 다수의 파지를 한번에 스크리닝할 수 있다. 둘째, 각 감염 파지은 그 표면에 유전자 산물을 디스플레이하므로, 특정 파지가 저효율로 친화성 매트릭스로부터 회수되는 경우, 그 파지는 또다른 감염 라운드 (round)에 의해 증폭될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리 중에서, 거의 동일한 대장균(E.coli) 사상 파지 M13, fd., 및 f1로 이루어진 군이 가장 자주 사용된다. 파지 gIII 또는 gVIII 외피 단백질의 어느 하나를 사용하여 바이러스 입자의 최종 패키징을 붕괴하지 않고 융합 단백질을 생성할 수 있다. 외래 에피토프는, 이 에피토프가 부족한 과량의 파지로부터 회수된 상기 에피토프를 가진 pIII 및 파지의 NH₂-말단에 발현시킬 수 있다(Ladner et al. PCT 공개 WO90/02909; Garrard et al., PCT 공개 WO92/09690; Marks et al.(1992)J. Biol. Chem.267:16007-16010; Griffithes et al.(1993)EMBOJ12:725-734; Clackson et al.(1991)Nature352:624-628; 및 Barbas et al.(1992)PNAS89:4457-4461).

통상의 연구법에서는 펩티드 융합 파트너로서 대장균의 말토스 수용체(외막 단백질, LamB)를 사용한다(Charbit et al.(1986)EMBO 5, 3029-3037). 올리고뉴클레오티드는 LamB 유전자를 코딩하는 플라스미드에 삽입되어 단백질의 세포외 루프(extracellular loop)의 하나에 융합되는 펩티드를 생성한다. 이들 펩티드는리간드(예, 항체)에 대한 결합에 이용할 수 있고, 상기 세포가 동물에 투여될 때 변역 반응을 유발시킬 수 있다. 다른 세포 표면 단백질, 예를 들면, OmpA(Schorr et al.(1991)Vaccines91, pp.387-392), PhoE(Agterberg, et al.(1991)Gene88, 37-45), 및 PAL(Fuchs et al.(1991)Bio/Tech9, 1367-1372) 외에, 큰 박테리아 표면 구조는 펩티드 디스플레이용 매체(vehicle)로 작용한다. 펩티드는, 중합하여 박테리아간 유전 정보의 교환을 위한 섬모관(pilus-conduit)을 형성하는 단백질인 필린(pilin)에 융합될 수 있다(Thiry et al.(1989)Appl. Environ. Microbiol. 55, 984-993). 다른 세포와의 상호작용에 관여하는 그들의 역할에 의하여, 상기 섬모는 세포외 환경으로 펩티드를 내놓는데 대한 유용한 서포트를 제공한다. 펩티드 디스플레이에 사용되는 또다른 큰 표면 구조로는 박테리아 운동 조직인 편모(flagellum)가 있다. 상기 서브유니트 단백질 플라젤린에 펩티드를 융합함으로써 숙주 세포 상에 밀집한 일련의 많은 펩티드 카피를 제공한다(Kuwajima et al.(1998)Bio/Tech. 6, 1080-1083). 또한 다른 박테리아 종의 표면 단백질은 펩티드 융합 파트너로서 역할을 한다. 그 예로는 스타필로코커스(Staphlococcus) 단백질 A와 네이세리아(Neisseria)의 외막 프로테아제 IgA를 들 수 있다(Hansson et al.(1992)J. Bacterial. 174, 4239-4245 및 Klauser et al.(1990)EMBO J. 9, 1991-1999).

상기한 사상 파지 시스템 및 LamB 시스템에서, 펩티드와 그들을 코딩하는 DNA사이의 물리적인 결합은 그들의 표면상의 펩티드를 나르는 입자(세포 또는 파지)내의 DNA의 함유에 의해 발생한다. 상기 펩티드를 포획하여 그 안에 상기 입자및 DNA를 포획한다. 대체 방법(alternative scheme)에서는 DNA 결합 단백질 LacI을 사용하여 펩티드와 DNA 사이에 결합을 형성한다(Cull et al.(1992)PNAS USA89:1865-1869). 이 시스템은 3' 말단에 올리고뉴클레오티드 클로닝 부위를 갖는 LacI 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용한다. 아라비노스에 의한 제어 유도 하에, LacI-펩티드 융합 단백질이 생성된다. 이 융합물은 LacO 작동유전자(LacO)로 알려진 짧은 DNA 서열에 결합하는 LacI의 고유 능력을 보유한다. LacO의 2 카피를 발현 플라스미드에 설치함(installing)으로써, LacI-펩티드 융합물은 그것을 코딩하는 플라스미드에 단단하게 결합한다. 각 세포 중의 플라스미드는 단지 단일 올리고뉴크레오티드 서열을 함유하고 각 세포는 단지 단일 펩티드 서열을 발현하기 때문에, 상기 펩티드는 그들의 합성이 지시된 DNA 서열과 특이적 및 안정적으로 결합한다. 상기 라이브러리의 세포를 온화하게 용해시켜서 그 펩티드-DNA 복합체를 고정화된 수용체 매트릭스에 노출시켜 활성이 있는 펩티드를 함유하는 복합체를 회수한다. 그 다음 상기 결합된 플라스미드 DNA를 증폭용 세포에 재도입하여 상기 펩티드 리간드의 동일성(identity)을 결정하기 위해 DNA 염기서열을 결정한다. 상기 방법의 실질적인 유용성의 표시로서, 도데카펩티드의 큰 랜덤 라이브러리를 만들어서 오피오이드 펩티드 다이노르핀 B((opioid peptide dynorphin B)에 대하여 생기는 모노클로날 항체에 의하여 선별하였다. 펩티드 코호트(cohort)를 회수하였으며, 모두 다이노르핀 B의 6-잔기 부분에 대응하는 공통서열(consensus sequence)에 의해 관련되어 있었다(Cull et al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A89-1869).

이러한 연구법은 종종 펩티드-온-플라스미드라 부르며, 파지 디스플레이 방법과 2가지 중요한 점에서 다르다. 첫째, 상기 펩티드는 융합 단백질의 C-말단에 부착되고, 그 결과 프리 카복시 말단을 갖는 펩티드로서 라이브러리 멤버들이 디스플레이된다. 상기 사상 파지의 외피 단백질, pIII 및 pVIII 둘다 그들의 C-말단을 통하여 파지에 고착(anchor)되고, 그 게스트 펩티드는 바깥쪽으로 뻗은 N-말단 도메인에 배치된다. 몇몇 디자인에서, 파지-디스플레이된 펩티드는 융합 단백질의 아미노 말단측에 존재한다(Cwirla, et al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87, 6378-6382). 두 번째 차이는 라이브리에 실제로 존재하는 펩티드의 개체수에 영향을 미치는 생물학적 편재(biases) 성향이다. 상기 LacI 융합 분자는 숙주 세포의 세포질에 들어있다(confine). 상기 파지의 외피 융합물은 번역하는 동안 상기 세포질에 일시적으로 노출되나 내막을 통하여 주변세포질(periplasm) 구획으로 빠르게 분비되고, 그들의 C-말단 소수성 도메인에 의해 막에 고정되어 남아있으며, 파지 입자로의 어셈블리를 기다리는 동안 주변세포질에 돌출되는 상기 펩티드를 함유하는 N-말단을 갖는다. 상기 LacI 및 파지 라이브러리의 펩티드는 다른 단백질 분해 활성에 대한 그들의 노출 결과에 따라 현저하게 달라질 수 있다. 상기 파지 외피 단백질은 내막을 가로지르는 이송 및 파지로의 도입을 위한 준비단계로서의 시그널 펩티다제의 프로세싱을 필요로 한다. 어떠한 펩티드는 이들 프로세스에 대한 해로운 영향을 미치며 상기 라이브러리 중에 저하되어 나타난다(Gallop et al.(1994)J. Med. Chem.37(9):1233-1251). 이러한 특별한 편재는 LacI 디스플레이 시스템의 인자(factor)가 아니다.

재조합 랜덤 라이브러리에서 이용할 수 있는 작은 펩티드의 수는 방대하다. 일반적으로 10⁷∼10⁹의 독립적인 클론의 라이브러리가 제조된다. 10¹¹의 재조합체 정도로 큰 라이브러리가 제조되지만, 이 크기는 클론 라이브러리에 대한 실질적인 한계에 이른다. 라이브러리 크기에서의 이러한 한계는 임의 추출된 세그먼트를 함유하는 DNA를 숙주 박테리아 세포에 형질전환시키는 단계에서 일어난다. 이러한 한계를 극복하기 위해서, 폴리좀 복합체 중의 발생기(nascent) 펩티드의 디스플레이에 근거한 시험관내 시스템(in vitrosystem)이 최근 개발되었다. 이 디스플레이 라이브러리 방법은 현재 사용할 수 있는 파지/파지미드 또는 플라스미드 라이브러리 보다 3∼6 차수 더 큰 라이브러리를 생성하는 잠재력을 가지고 있다. 게다가, 상기 라이브러리의 구성, 펩티드의 발현, 및 스크리닝은 전체적으로 셀-프리 포맷(cell-free format)으로 행해진다.

이러한 방법의 하나의 적용(Gallop et al.(1994) J. Med. Chem. 37(9):1233-1251)에서, 10¹²데카펩티드를 코딩하는 분자 DNA 라이브러리를 구축하였고 상기 라이브러리는 전사/번역 시스템이 커플링된 시험관내의 대장균(E.coli)S30에서 발현되었다. mRNA 상에 리보좀을 고정시키고, 폴리좀 중에 상기 RNA를 실질적인 비율로 축적시킨 뒤, 그들의 코딩 RNA에 여전히 결합되어있는 발생기 펩티드를 함유하는 복합체를 생산하도록, 조건들이 선택되었다. 상기 폴리좀은 종래의 재조합 펩티드 디스플레이 라이브러리를 스크니링하는 방법과 매우 동일한 방법으로 고정화된 수용체 상에 친화 정제될 정도로 충분히 강건하다. 결합된 복합체로부터 RNA를회수하여, cDNA로 전환시키고, PCR에 의해 증폭시켜 다음 라운드(round)의 합성 및 스크리닝을 위한 주형을 제조한다. 상기 폴리좀 디스플레이 방법은 파지 디스플레이 시스템에 커플링시킬 수 있다. 후속의 여러 라운드의 스크리닝을 한 다음, 풍부한 폴리좀 풀(pool)로부터의 cDNA를 파지미드 벡터에 클로닝시킨다. 이 벡터는 외피 단백질에 융합된 펩티드를 디스플레이하는 펩티드 발현 벡터와, 펩티드 식별용 DNA 염기서열결정 벡터로서 역할을 한다. 폴리좀 유래의 펩티드를 파지상에 발현시킴으로써, 이 포맷에서의 친화성 선별 과정을 계속할 수 있거나, 또는 개개의 클론 상의 펩티드의 파지 ELISA에서의 결합 활성, 또는 완성 파지 ELISA에서의 결합 특이성을 검정할 수 있다(Barret, et al.(1992)Anal. Biochem204, 357-364). 상기 활성 펩티드의 서열을 확인하기 위해서 파지미드 숙주에 의해 생성된 DNA를 염기서열결정하였다.

2차 스크리닝

상술한 고처리 검정 후, 당업자에 의해 길항제로부터 작동제를 구별하는 등의 생물학적 활성을 더 확인하기 위해서 2차 스크리닝을 할 수 있다. 사용되는 2차 스크리닝의 종류는 테스트할 필요가 있는 목적 활성에 따라 다르다. 예를 들면, 흥미있는 단백질(예, TSP-1 또는 TSP-2)과 리간드 사이의 상호작용을 저해하는 능력을 이용하여, 상술한 1차 스크리닝 중의 하나를 통해서 분리한 펩티드 단편의 군으로부터 작동제 또는 길항제를 식별하는 검정법이 개발될 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물의 피부의 혈관형성 저해력은, 피험자(예, 실험 동물(예, 마우스))의피부에 시험 화합물을 도포하거나 처리하고; 또한 상기 화합물의 존재시와 비교하여 부재시의 피험자의 피부에서의 혈관의 수 및/또는 크기를 평가하는 등의 다수의 종래 공지의 방법으로 시험할 수 있다. 피험자의 피부의 혈관 수 또는 크기의 감소를 일으키는 화합물을 피부의 혈관형성을 저해하는 화합물로 식별한다.

따라서, 단편 또는 유사체를 생성하고 그들의 활성을 시험하는 방법은 종래 공지되어 있다. 중요한 코어 서열이 확인된 경우, 유사체 또는 단편을 얻는 것과 그들의 원하는 활성을 시험하는 것은 당업자에게는 일상적인 일이다.

펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)

또한 본 발명은 상기 피험자 TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드의 단백질 결합 도메인을 감소시켜, 미메틱스(예, 펩티드 또는 비펩티드성 약제)을 생성한다(참조, "레티노블라스토마(retinoblastoma) 유전자 단백질에 결합하는 인간 파필로마바이러스 단백질의 펩티드 저해제" 유럽특허출원 EP 0 412 765 및 EP 0 031 080).

비가수분해성 펩티드 유사체의 중요한 잔기는 벤조디아제핀(참조, Freidinger et al. inPeptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 아제핀(참조, Huffman et al. inPeptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 치환 감마 락탐환류(Garvey et al. inPeptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al.(1986)J Med Chem29:295; 및 Ewensonet al. inPeptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), β-턴 디펩티드 코어류(Nagai et al.(1985)Tetrahedron Lett26:647; and Sato et al.(1986)J Chem Soc Perkin Trans1:1231), 및 β-아미노알콜류(Gordon et al.(1985)Biochem Biophys Res Commun126:419, 및 Dann et al.(1986)Biochem Biophys Res Commun134:71)을 사용하여 생성할 수 있다.

융합 단백질

TSP-1 또는 TSP-2 단백질의 레벨을 조정하기 위해서 폴리펩티드를 또다른 단백질 또는 그들의 일부에 융합시킬 수 있다. 예를 들면, TSP-1 또는 TSP-2 단백질 또는 그들의 일부는 용해성을 증강시키기 위해 또다른 폴리펩티드 일부분에 작동적으로 결합시킬 수 있다. TSP-1 또는 TSP-2 또는 그들의 일부와 융합할 수 있는 단백질의 예로는 VEGF의 순환 반감기를 향상시킬 수 있는 플라즈마 단백질 또는 그들의 단편을 들 수 있다. 예를 들면, 상기 융합 단백질은 TSP-1 또는 TSP-2 서열이 면역글로불린 수퍼패밀리(superfamily) 유래의 서열에 융합되는 TSP-1 또는 TSP-2 -면역글로불린(Ig) 융합 단백질일 수 있다. 여러 가용성 융합 단백질 구조물은 세포 표면의 당단백질의 세포외 도메인이 면역글로불린의 불변부 F(c)와 융합함을 개시하고 있다. 예를 들면, Capon et al.(1989) Nature 337(9):525-531에서는, CD4를 면역글로불린(IgG1)에 융합함으로써 더 오래 지속되는 CD4 유사체를 생성하는 가이드를 제공한다(참고, Capon et al., 미국특허번호:5,116,964 및 5,428,130(CD4-IgG 융합 구조물); Linsley et al., 미국특허번호: 5,434,131(CTLA4-IgG1 및 B7-IgG1 융합 구조물); Linsley et al.(1991)J. Exp. Med. 174:156-569(CTLA4-IgG1 융합 구조물); 및 Linsley et al.(1991)J. Exp. Med. 173:721-730(CD28-IgG1 및 B7-IgG1 유합 구조물)). 상기 융합 단백질은 수용체-리간드 상호작용을 조정하여 생체내 염증을 감소시키는데 유용함이 증명되었다. 예를 들면, 세포 표면 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 단백질의 세포외 도메인이 면역글로불린 불변부(Fc)에 융합된 융합 단백질이 생체내에서(in vivo) 사용되었다(참조, 예, Moreland et al.(1997)N. Engl. J. Med.337(3):141-147; 및 van der Poll et al.(1997) Blood 89(10):3727-3734).

안티센스 핵산 서열

포지티브 혈관형성 인자(예, VEGF)를 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 핵산 분자를, 여기서 기재하는 방법 중의 혈관형성 저해 약제로서 사용할 수 있다. "안티센스" 핵산은 포지티브 혈관형성 인자(예, VEGF)를 코딩하는 "센스" 핵산에 상보적인, 예를 들면 두가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 VEGF 코딩 가닥, 또는 단지 그들의 일부에 상보적일 수 있다. 예를 들면, VEGF를 코딩하는 핵산 서열의 코딩 가닥의 "코딩 영역"에 안티센스하는 안티센스 핵산 분자를 사용할 수 있다.

VEGF를 코딩하는 상기 코딩 가닥 서열은 공지되어 있다. 상기 코딩 가닥 서열이 VEGF를 코딩하는 코딩 가닥 서열이 주어진 경우, 안티센스 핵산은 왓슨과 크릭의 염기쌍의 규칙에 따라 디자인할 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 VEGF mRNA의 전체 코딩 영역에 상보적일 수 있으나, VEGF mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 단지 일부에만 안티센스인 올리고뉴클레오티드가 더 바람직하다. 예를 들면, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 VEGF mRNA의 변역 시작 부위 주변 영역에 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 안티센스 핵산은 공지의 방법을 이용한 화합 합성 및 효소 결합 반응을 이용하여 구성할 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산(예, 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드, 또는 그 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 안티센스와 센스 핵산 사이에 형성된 이중 구조의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학 합성할 수 있으며, 예를 들면 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 유도체 및 아크리딘 치환 뉴클레오티드를 사용하여 합성할 수 있다. 상기 안티센스 핵산의 생성에 사용될 수 있는 변형 뉴클레오티드의 예로는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오드우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시히드록실메틸)우라실, 5-카복실메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닐, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노푸린을 들 수 있다. 필요에 따라서, 상기 안티센스 핵산은, 핵산이 안티센스 방향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성할 수 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 흥미있는 표적 핵산에 안티센스 방향으로 된다.)

RNAi

여기서 기재하는 IR 신호전달 경로의 구성성분을 코딩하는 유전자를 사일런스(silence)할 수 있는 두가닥 사슬 핵산 분자는, IR 신호전달 경로의 구성성분의 발현을 저해하는 약제로서 사용할 수도 있다. RNA 간섭(RNAi)은 흥미있는 유전자에 대응하는 두가닥 사슬 RNA(dsRNA)를 세포 또는 유기체에 도입하면 그 결과 그 대응하는 mRNA의 분해가 일어나는 전사후 유전자 사일런싱 메카니즘(post-transcriptional gene silencing mechanism)이다. 상기 RNAi 효과에 의해 유전자 발현이 복귀되기 전에 다중 세포 분열이 지속된다. 따라서, RNAi는 RNA 레벨에서 목표로 하는 녹아웃(knockout) 또는 "녹다운(knockdown)"을 만드는 매우 강력한 방법이다. RNAi는 인간의 배아 신장(embryonic kidney) 및 HeLa 세포를 포함한 인간세포에서 성공적임이 판명되었다(참조, Elbashir et al.Nature2001 May 24;411(6836):494-8). 하나의 태양에서, 유전자 사일런싱을, RNA 헤어핀의 내인성 발현을 강화함으로써 포유동물의 세포에서 유도할 수 있다(참조, Paddison et al., 2002,PNAS USA99:1443-1448). 또다른 태양에서는 작은 (21-23nt) dsRNA의 트랜스펙션에 의해 유전자 발현을 특이적으로 저해한다(참조, Caplen(2002)Trends in Biotechnology20:49-51).

다시 말해, RNAi는 다음과 같이 작용하는 것으로 생각된다. 사일런싱 되는 유전의 일부에 대응하는 dsRNA를 세포에 도입한다. 상기 dsRNA는 21∼23 뉴클레오티드 siRNA나, 또는 짧은 간섭성 RNA(short interfering RNA)로 소화된다. 상기 siRNA 이중 구조는 누클레아제 복합체에 결합하여 RNA-유도 사일런싱 복합체, 또는 RISC로 알려진 것을 형성한다. 상기 RISC는 siRNA 가닥 중의 하나와 내인성 mRNA 사이의 염기쌍 상호작용에 의한 상동 전사체를 표적으로 한다. 그 다음 siRNA의 3'말단으로부터 상기 mRNA∼12 뉴클레오티드를 절단한다(참조, Sharp et al(2001)Genes Dev15:485-490; 및 Hammond et al.(2001)Nature Rev Gen2:110-119).

유전자 사일런싱에서의 RNAi 기술은 표준 분자 생물학 방법을 이용한다. 불활성화시킬 표적 유전자의 서열에 대응하는 dsRNA는 표준 방법, 예를 들면 T7 RNA 중합효소를 이용한 주형 DNA의 양가닥 동시 전사에 의해 생성할 수 있다. RNAi에 사용되는 dsRNA의 생성 키트는 예를 들면, New England Biolabs, Inc.사제의 시판품을 사용할 수 있다. dsRNA 또는 dsRNA를 제조하도록 처리된 플라스미드의 트랜스펙션 방법은 종래 공지의 기술이다.

RNAi의 효과와 유사한 유전자 사일런싱 효과는, 유전자 사일런싱에 대한 또하나의 전략을 제공하는, mRNA-cDNA 하이브리드 구조물을 트랜스펙션시킨 포유동물 세포에서 보고되어 있다(Lin et al., Biochem Biophys Res Commun 2001 Mar 2;281(3):639-44).

투여

혈관형성을 조정하는 약제, 예를 들면, 혈관형성 저해제(예, TSP-1 또는 TSP-2), 또는 TSP-1 또는 TSP-2를 조정하는 약제는 표준 방법에 의해 피험자에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 상기 약제는 정맥내, 내피, 피하, 경구(예, 흡입), 경피(국소), 및 경점막을 포함한 다수의 상이한 경로 중의 하나에 의해 투여할 수 있다. 하나의 태양에서는, TSP-1 또는 TSP-2 또는 그들의 조정제를 국소적으로 투여할 수 있다.

TSP-1 또는 TSP-2 단백질 레벨을 조정하는 약제, 예를 들면, TSP-1 또는 TSP-2 핵산 분자, TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드, 단편 또는 유사체, TSP-1 또는 TSP-2 조정제(modulator), 및 항-TSP-1 또는 TSP-2 항체를, 피험자(예, 인간)에 투여하기 적합한 약제학적 조성물에 주입할 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 핵산 분자, 폴리펩티드, 조정제, 또는 항체와, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 여기서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체"라 함은 약제학적으로 투여하기에 적합한 어떠한 모든 용제, 분산 매체(media), 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것이다. 상기 매체 및 약제의약제학적인 활성성분으로서의 용도는 공지되어 있다. 어떠한 종래 공지의 매체 또는 약제가 상기 활성 화합물과 함께 첨가할 수 없는 경우를 제외하고는, 상기 매체는 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 보충 활성 화합물도 본 발명의 조성물 내에 첨가할 수 있다.

약제 조성물은 의도하는 투여 경로에 적합하게 제형화(formulation)할 수 있다. 비경구적, 내피, 또는 피하 적용용으로 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함할 수 있다: 주사용 물, 식염액, 고정 오일류, 폴리에틸렌글리콜류, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 기타 합성 용제 등의 멸균 희석제; 벤질알콜 또는 메틸알콜 등의 항균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨 등의 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산 등의 킬레이팅제; 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염 등의 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스 등의 긴장도(tonicity) 조정제. pH는 염산 또는 수산화나트륨 등의 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 비경구 약제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 주사기 또는 다중 복용 바이알에 넣을 수 있다.

주사용으로 적합한 약제학적 조성물로는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액을 즉시 제조할 수 있는 멸균 분말을 들 수 있다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor EL^TM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산 완충 식염액(PBS)을 들 수 있다. 모든 경우, 상기 조성물은 멸균되어야 하며 용이하게 주입할 수 있을 정도의 유동성이 있어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정해야하며 박테리아 및 진균 등의 미생물의 오염 작용을 받지 않도록 보존되어야 한다. 상기 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 및 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 및 그들의 적합한 혼합물을 함유하는 용제 또는 분산 매체일 수 있다. 적당한 유동성은 레시틴 등의 코팅제를 사용하고, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하고 또한 계면활성제를 사용하여 유지할 수 있다. 미생물의 작용 방지는, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 타이메로살 등의 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 성취할 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들면, 설탕, 만니톨, 솔비톨, 염화나트륨 등의 폴리알콜류를 조성물 중에 함유시키는 것이 바람직하다. 상기 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 함유시킴으로써, 주사가능한 조성물의 지연 흡수를 일으킬 수 있다.

멸균 주사가능 용액은 활성 화합물(예, TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드)을 상기한 원료중의 하나 또는 조합물을 함유한 적당한 용제에 필요한 양만큼 첨가하고, 필요에 따라서, 여과 살균하여, 제조할 수 있다. 일반적으로 분산액은 기본적인 분산 매체와 필요에 따라서 상기한 기타 원료를 함유하는 멸균 부형제(vehicle)에 활성 화합물을 첨가함으로써 제조한다. 멸균한 주가가능 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로는 그들을 미리 살균 건조한 용액으로부터 활성성분 플러스 어떠한 부가 필요 성분의 분말을 생산하는 진공건조 및 동결건조법이 있다.

일반적으로 경구 조성물은 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 그들은 젤라틴 캡슐에 넣거나 또는 압축하여 정제로 만들 수 있다. 경구 치료 투여를 위하여, 상기 활성 화합물을 부형제와 함께 주입하여 정제, 트로키, 또는 캡슐 형상으로 사용할 수 있다. 또한, 경구 조성물은 마우스워시로서 사용되는 유동성 담체를 사용하여 제조할 수 있고, 이때 유동성 담체 중의 화합물은 경구적으로 적용되고 쏴소리를 내고 객출되거나 삼켜진다. 약제학적으로 적합한 결합제, 및/또는 보조제를 상기 조성물의 일부로서 포함할 수 있다. 정제, 환, 캡슐, 크로키 등은 하기의 원료 중 어느 하나, 또는 유사한 특성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다: 마이크로크리스탈린 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴 등의 바인더; 전분 또는 락토스 등의 부형제; 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수전분 등의 붕괴제(disintegrating agent); 스테아린산마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes) 등의 윤활제; 콜로이드성 이산화규소 등의 활택제; 설탕 또는 사카린 등의 감미제; 또는 페퍼민드, 메틸살리실레이트 또는 오렌지 향 등의 향신료.

또한 전신적인 투여는 근육내 또는 경피 수단으로 행할 수 있다. 경점낙 또는 경피 투여를 위해서는, 투과시킬 배리어에 대한 적합한 침윤제를 제형 중에 첨가한다. 상기 침윤제는 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들면, 경점막 투여를 위해, 계면활성제, 담즙염, 및 푸시딘산 유도체를 들 수 있다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여를 위해서는, 상기 활성 화합물을 종래 공지된 연고, 고약, 젤, 또는 크림으로 제형화시킨다. 이러한 경피 제형은 피부에 도포하여 모발 성장을 촉진 또는 저해할 수 있다.

하나의 태양에서, 상기 활성 화합물은 이식 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제형 등의, 인체로부터의 빠른 배설이 되지 않도록 상기 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조된다. 에틸렌비닐아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르류 및 폴리엑틴산 등의 생물분해성, 생체적합성 중합체를 사용할 수 있다. 상기 제형의 제조 방법은 당업자가 명백히 알 수 있다. 또한 상기 재료로는 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.제의 시판품을 이용할 수 있다. 리포솜형의 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 가진 감염 세포를 표적으로 하는 리포솜을 포함함)도 약제학적으로 허용가능한 담체로서 사용할 수 있다. 이들은 종래 공지의 방법(예, 미국특허번호 4,522,811)에 따라서 제조할 수 있다.

여기서 기재하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하여 유전자 치료 벡터로서 사용할 수 있다. 유전자 치료 벡터는 예를 들면, 정맥내 주사, 국소 투여(참조, 미국특허 5,328,470), 또는 정위고정성(stereotactic) 주사(참조, Chen et al.,PNAS91:3054-3057, 1994)에 의해 피험자에 전달할 수 있다. 상기 유전자 치료 벡터의 약제학적 제제는 허용가능한 희석제내에 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 매체(vehicle)가 들어 있는 느린 방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 필요에 따라서, 완전한 유전자 전달 벡터를 재조합 세포로부터 손상없이 생성할 수 있는 경우(예, 레트로바이러스 벡터), 상기 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.

약제학적 조성물은 투여 사용설명서와 함께 컨테이너, 팩, 또는 디스펜스에 포함될 수 있다.

혈관형성 레벨을 조정하는 약제(예, TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드 또는 그들의 단편 또는 유사체)는 국부적으로 투여(예, 국소 투여)할 수 있다. 상기 약제는 1회 투여하거나 또는 계속하여 투여할 수 있으며, 예를 들면, 상기 약제는 TSP-1 또는 TSP-2 단백질 레벨에 대한 효과가 선정한 기간 동안(예, 5, 10, 20, 30, 50, 90, 180, 365일 이상) 유지될 정도의 충분한 빈도로 투여할 수 있다. 또한 TSP-1 또는 TSP-2 단백질(예, TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드 또는 단편 또는 그들의 유사체)의 레벨을 조정(예, 증가 또는 저해)하는 시약의 투여는 반복하여 행할 수 있다.

유전자 치료

본 발명의 유전자 구성물은 포지티브 또는 네거티브 혈관형성 인자, 예를 들,면 혈관형성 저해제(예, TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드 또는 그들의 단편 또는 유사체)를 코딩하는 핵산을 전달하기 위한 유전자 치료 프로토콜의 일부분으로써 사용될 수 있다. 본 발명은, 예를 들면, 표피에서의, 혈관형성을 저해하기 위한, 특정 세포타입(예, 표피 세포)에서의 TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드의 생체내(in vivo) 트랜스펙션 및 발현용 발현 벡터를 특징으로 한다. TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드의 발현 구성물은 생물학적으로 효과적인 담체, 예를 들면, TSP-1 또는 TSP-2 유전자를 생체내에서 세포에 효과적으로 전달할 수 있는 제형 또는 조성물에 첨가할 수 있다. 연구법은 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노수반 (adeno-associated) 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 등의 바이러스 벡터, 또는 재조합 박테리아 또는 진핵 플라스미드 중에 상기 해당 유전자를 삽입함을 포함한다. 바이러스 벡터는 직접 세포를 트렌스펙션시키고; 플라스미드 DNA은 예를 들면, 양이온성 리포좀(리포펙틴) 또는 유도체화된(예, 항체 접합된), 폴리리신 접합체, 그라마시딘 S, 인공적인 바이러스 외피(envelope) 또는 기타 그러한 세포내 담체의 도움으로 전달될 수 있고, 또한 생체내에서 수행되는 유전자 구성물의 직접 주입 또는 CaPO₄침전법에 의해 전달될 수 있다.

핵산을 세포에 시험관내 도입하기 위한 바람직한 연구법은 핵산(예, TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA, 또는 VEGF 안티센스 핵산)을 함유하는 바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 바이러스 벡터를 이용한 세포 감염은 표적세포의 대부분이 상기 핵산을 받아들일 수 있다는 장점이 있다. 부가적으로, 예를 들면, 바이러스 벡터에 함유된 cDNA에 의해, 바이러스 벡터 중에 코딩된 분자는 바이러스 벡터의 핵산을 받아들인 세포에서 효과적으로 발현된다.

레트로바이러스 벡터 및 아데노수반 바이러스 벡터는 외인성 유전자의 생체내 전이(trnasfer)에 대한 재조합 유전자 전달 시스템으로서 사용할 수 있다. 이들 벡터는 세포로의 유전자의 효율적인 전달을 제공하며, 상기 전이(transfer)된 핵산은 숙주의 염색체 DNA에 안정하게 삽입된다. 단지 복제-결손 레트로바이러스만을 생성하는 특수화된 세포 라인("패키징 세포"라 함)의 개발에 의해 유전자 치료용 레트로바이러스의 이용성이 증가하였고, 결손 레트로바이러스는 유전자 치료 목적을 위한 유전자 전이에서의 용도를 특징으로 한다(참조, Miller, A.D.(1990)Blood76:271). 복제 결손 레트로바이러스는 표준 기술에 의해, 헬퍼 바이러스를 사용하여 표적세포를 감염시키는데 사용될 수 있는 비리온(virion)속으로 패키징될 수 있다. 재조합 레트로바이러스를 생성 및 상기 바이러스로 세포를 시험관내 또는 생체내 감염시키기 위한 프로토콜은Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 및 다른 표준 실험실 메뉴얼에서 알 수 있다. 적합한 레트로바이러스의 예로는 당업자에게 공지된 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM을 들 수 있다. 에코트로픽 레트로바이러스 시스템과 암포트로픽 레트로바이러스 시스템 둘다를 제조하기 위한 적합한 패키징 바이러스 라인의 예로는 ψCrip, ψCre, ψ2 및 ψAm을 들 수 있다. 레트로바이러스는 다양한 유전자를 상피세포를 포함한 많은 상이한 세포 종류에 시험관내 및/또는 생체내 도입하기 위해 사용될 수 있다(참조, Eglitis, et al.(1985)Science230:1395-1398; Danos and Mulligan(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:6460-6464; Wilson et al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:3014-3018; Armentano et al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:6141-6145; Huber et al.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:8039-8043; Ferry et al.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:8377-8381; Chowdhury et al.(1991)Science254:1802-1805; van Beusechem et al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:7640-7644; Kay et al.(1992)Human Gene Therapy3:641-647; Dai et al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10892-10895; Hwu et al.(1993)J. Immunol. 150:4104-4115; 미국특허번호 4,868,116; 미국특허번호 4,980,268; PCT출원WO89/07136; PCT출원 WO89/02468; PCT출원 WO89/05345; 및 PCT출원 WO92/07573).

본 발명에 유용한 또다른 바이러스 유전자 전달 시스템은 아데노바이러스 유래의 벡터를 이용한다. 아데노바이러스의 게놈은 흥미 있는 유전자 산물을 코딩하여 발현하도록 조작할 수 있지만, 정상적인 용균 바이러스 라이프 사이클에서 복제할 수 있는 그 능력에 의하여 불활성화 된다(참조, Berkner et al.(1988)BioTechniques6:616; Rosenfeld et al.(1991)Science252:431-434; 및 Rosenfeld et al.(1992)Cell68:143-155). 아데노바이러스 균주(strain) Ad 타입 5 dl324 또는 다른 아데노바이러스 균주(예, Ad2, Ad3, Ad7 등)로부터 유래하는 적합한 아데노바이러스 벡터는 당업자에게 공지되어 있다. 재조합 아데노바이러스는, 비분열(non-dividing) 세포를 감염시킬 수 없고, 상피 세포를 포함한 다양한 범주의 세포타입를 감염시키는데 사용할 수 있는 점에서, 특정 상황에 유용할 수 있다(상기 인용된 Rosenfeld et al.(1992)). 또한, 상기 바이러스 입자는 비교적 안정하며 정제 및 농축이 용이하며, 상기한 바와 같이, 감염 스펙트럼에 영향을 미치도록 변형시킬 수 있다. 부가적으로, 도입된 아데노바이러스 DNA(및 그 안에 포함된 외래 DNA)는 숙주 세포의 게놈내로 삽입되는 것이 아니라 에피솜에 남아 있으므로, 도입된 DNA가 숙주 게놈에 삽입되는 경우의 인시튜(in situ) 삽입 돌연변이유발의 결과로서 발생할 수 있는 잠정적인 문제를 피할 수 있다(예, 레트로바이러스 DNA). 더욱이, 상기 아데노바이러스 게놈의 외래 DNA 전달력은 다른 유전자 전달 벡터에 비해 크다(8kilobase까지)(상기에서 인용한 Berkner et al.; Haj-Ahmand and Graham(1986) J. Virol. 57:267).

상기 해당 유전자의 전달에 유용한 또다른 바이러스 벡터 시스템으로는 아데노수반 바이러스(AAV)가 있다. 아데노수반 바이러스는 효율적인 복제 및 증식성 라이프 사이클을 위해, 아데노바이러스 또는 헤르퍼스 바이러스 등의 또다른 바이러스를 헬퍼 바이러스로 요구하는 자연적으로 발생하는 결손 바이러스이다(참조 Muzyczka et al.(1992)Curr. Topics in Micro. and Immunol.158:97-129). 또한 그의 DNA를 비분열 세포에 삽입할 수 있고, 또한 높은 빈도의 안정한 삽입을 나타내는 몇몇 바이러스 중의 하나이다(참조, Flotte et al.(1992)Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.7:349-356; Samulski et al.(1989)J. Virol.63:3822-3828; 및 McLaughlin et al.(1989)J. Virol. 62:1963-1973). 300염기쌍 정도를 포함하는 AAV 벡터는 패키징될 수 있고 삽입(integration)될 수 있다. 외인성 DNA를 위한 공간은 약 4.5kb로 제한된다. Tratschin et al.(1985)Mol. Cell. Biol.5:3251-3260에 기재된 바와 같은 AAV 벡터는 DNA를 세포에 도입하기 위해 사용할 수 있다. AAV 벡터를 사용하여 상이한 세포타입에 다양한 핵산을 도입하였다(참조, Hermonat et al.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6466-6470; Tratschin et al.(1985)Mol. Cell. Biol.4:2072-2081; Wondisford et al.(1988)Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al.(1984)J. Virol.51:611-619; 및 Flotte et al.(1993)J. Biol. Chem.268:3781-3790).

상술한 바와 같은, 바이러스 전이(viral transfer) 방법 외에도, 비바이러스성(non-viral) 방법을 적용함에 의해서도, 동물의 조직내에서의 TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드, 단편, 또는 유사체의 발현을 일으킬 수 있다. 대부분의 비바이러스성유전자 전이 방법은 거대분자의 흡수(uptake) 및 세포내 수송을 위해 포유동물 세포에 의해 사용되는 정상적인 메카니즘에 의한다. 바람직한 태양에서는, 본 발명의 비바이러스성 유전자 전달 시스템은 표적 세포에 의한 상기 해당 TSP-1 또는 TSP-2 유전자의 흡수를 위한 세포내이입 경로(endocytic pathway)에 의한다. 이러한 타입의 전형적인 유전자 전달 시스템으로는 리포좀에 의해 유도되는 시스템, 폴리-리신 접합체, 및 인공적인 바이러스 외피(envelope)를 들 수 있다. 다른 태양은 Meuli et al.(2001)J Invest Dermatol. 116(1):131-135; Cohen et al.(2000)Gene Ther7(22):1896-905; 또는 Tam et al.(2000)Gene Ther7(21):1867-74에 기재된 바와 같은 플라스미드 주입 시스템을 포함한다.

대표적인 태양에서, TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드, 활성 단편, 또는 유사체를 코딩하는 유전자는, 그들의 표면에서 양전하를 띠고(예 lipofectine) 또한 (필요에 따라서) 표적 조직의 세포 표면 항원에 대응하는 항체로 표지된 리포좀에 가둬둘 수 있다(Mizuno et al.(1992)No Shinkei Geka20:547-551; PCT 공개 WO91/06309; 일본특허출원 1047381; 및 유럽특허공개 EP-A-43075).

임상 세팅에서, 치료용 TSP-1 또는 TSP-2 유전자에 대한 유전자 전달 시스템은 공지된 다수의 방법 중 어느 하나의 방법에 의해서 환자에 도입할 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자 전달 시스템의 약제학적 제제는 정맥내 주사 등에 의해 전신적으로 도입할 수 있으며, 또한 표적 세포 중의 단백질의 특이적인 형질 도입(transduction)은 유전자 전달 매체(Vehicle), 수용체 유전자의 발현을 제어하는 전사 조절 서열에 기인한 세포형 또는 조직형 발현, 또는 그들의 조합에 의해제공되는 트랜스펙션의 특이성으로부터 우세하게 일어난다. 다른 태양에서, 재조합 유전자의 초기 전달은 꽤 국한된 동물로의 도입으로 더 제한된다. 예를 들면, 유전자 전달 매체는 카테터(catheter)(참조 미국특허 5,328,470) 또는 정위고정성 주사(예, Chen et al.(1994) PNAS 91:3054-3057)에 의해 도입할 수 있다.

상기 유전자 치료 구성물의 약제학적 제제는 특히 허용가능한 희석제 중의 유전자 전달 시스템으로 구성할 수 있으며, 유전자 전달 매체가 들어간 느린 방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 필요에 따라, 완전한 유전자 전달 시스템을 재조합 세포로부터 손상없이 생성할 수 있는 경우(예, 레트로바이러스), 상기 약제학적 제제는 상기 유전자 전달 시스템을 생성할 수 있는 하나 이상을 세포를 포함할 수 있다.

세포 치료

TSP-1 또는 TSP-2는, TSP-1 또는 TSP-2의 생성을 조정하는 핵산 서열(예, TSP-1 또는 TSP-2 폴리펩티드 또는 그 기능적 단편 또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열; 프로모터 서열(예, TSP-1 또는 TSP-2 유전자 또는 또다른 유전자 유래의 프로모터 서열); 인핸서 서열, 예를 들면, 5' 비번역 영역(UTR)(예, TSP-1 또는 TSP-2 유전자 또는 다른 유전자 유래의 3' UTR); 폴리아데닐화 부위; 인슐레이터(insulator) 서열; 또는 TSP-1 또는 TSP-2의 발현을 조정할 수 있는 또다른 서열을 표피 세포(예, 케라티노사이트) 등의 세포에 도입함으로써 피험자내에 증가시킬 수 있다. 그 다음, 상기 세포를 피험자에게 도입할 수 있다.

유전자 조작할 1차 및 2차 세포는 다양한 조직으로부터 얻을 수 있으며 배양 시 증식되어 유지될 수 있는 세포타입을 포함한다. 1차 및 2차 세포의 예로는 섬유아세포, 케라티오사이트, 상피세포(예, 유방 상피세포, 장 상피세포), 내피 세포, 신경교(glial) 세포, 신경 세포, 혈관 형성 요소(예, 림프구, 골수세포), 근육세포(근아세포) 및 이들 체세포 종류의 전구체를 들 수 있다. 1차 세포는 유전자 조작한 1차 또는 2차 세포를 투여할 개체로부터 얻는 것이 바람직하다. 그러나, 동일 종 또는 다른 종(예, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 소, 새, 양, 염소, 말)의 공여자(수용자 외)로부터 얻어도 좋다.

상기의 "1차 세포"로는 (접시 또는 플라스크 등의 조직 배양판에 도말되기(부착되기) 전의) 척추동물 조직원(tissue source)으로부터 분리한 세포의 현탁액에 존재하는 세포, 조직 유래의 이식편에 존재하는 세포, 처음 도말된(plated) 상기 두 종류의 세포, 및 이들 도말 세포로 부터 유래한 세포 현탁액을 들 수 있다. 상기의 "2차 세포" 또는 "세포주(cell strain)"라 함은 배양에서의 모든 후속 단계에서의 세포를 말한다. 즉, 최초 도말된 1차 세포는 배양판으로부터 제거되어 재도말(배양)되고, 여기서는 후속 배양되는 모든 세포를 2차 세포라 칭한다. 2차 세포는 1회 이상 배양한 2차 세포로 이루어진 세포주이다. 세포주는 1) 1회 이상 배양되고; 2) 배양 중 한정된 수의 평균 개체군 배가(mean population doubling)를 나타내고; 3) 접촉이 저해된, 고착 의존성 성장의 특성을 나타내고(고착-의존성은 현탁 배양에서 성장하는 세포에는 적용되지 않음); 또한 4) 불멸화되지 않은 2차 세포로 구성된다. "클론성 세포주(clonal cell strain)" 는 단일 기초(founder) 세포로부터 유래하는 세포주로 정의된다. "이종 세포주(heterogenous cell strain)"는 둘 이상의 기초 세포로부터 유래하는 세포주로 정의된다.

척추 동물, 특히 포유류 기원의 1차 또는 2차 세포는 시그널 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 서열, 및/또는 예를 들면 TSP-1 또는 TSP-2를 코딩하는 이종 핵산 서열로 트랜스펙션시킬 수 있으며, 그 코딩된 산물을 장기간에 걸쳐 안정적으로 시험관내 및 생체내에서 반복하여 생성할 수 있다. 또한 이종 아미노산은 내인성 TSP-1 또는 TSP-2 서열의 발현(예, 유도성 발현 또는 과조절)을 일으키는 조절 서열(예, 프로모터)일 수 있다. 외인성 핵산 서열은 예를 들면, 미국특허번호 :5,641,670에 기재된 바와 같이, 상술한 상동적 재조합에 의해 1차 또는 2차 세포에 도입할 수 있으며, 참고로 그 내용을 여기에 포함시켰다.

또는 상기 트랜스펙트된 1차 또는 2차 세포는 그들의 동정 및 분리가 용이하도록 그들에게 선별가능한 표현형을 부여하는 선별가능 마커를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다. 트랜스펙트된 외인성 합성 DNA를 안정적으로 발현하는 1차 또는 2차 세포, 상기 트랜스펙트된 세포의 클론성 세포주 및 이종 세포주를 생성하는 방법, 클론성 이종 세포주을 생성하는 방법, 및 비정상적이거나 바람직하지 못한 질환(condition)을 트랜스펙트된 1차 또는 2차 세포 개체군을 사용하여 치료 또는 방지하는 방법은 본 발명의 일부분이다.

클론성 또는 이종 세포주의 1차 또는 2차 세포의 트랜스펙션

척추동물 조직은 흥미있는 1차 세포 타입의 조직원을 얻기 위한 펀치 생검법(punch biopsy) 또는 다른 외과적 방법 등의 표준 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 펀치 생검법은 섬유아세포 또는 케라티노사이트의 근원으로서의 피부를 얻는데 사용된다. 1차 세포의 혼합물은 공지의 방법(예, 효소적 소화 또는 조직배양)을 이용하여, 조직으로부터 얻을 수 있다. 효소적 소화가 이용되는 경우, 콜라게나제, 히아룰로니다제, 디스파제, 프로나제, 트립신, 엘라스타제 및 키모트립신 등의 효소를 사용할 수 있다.

그 결과 얻어진 1차 세포 혼합물은 직접 트랜스펙트시키거나, 또는 먼저 배양하고, 그 배양판으로부터 제거하여 재현탁시킨 후 트랜스펙션을 행할 수 있다. 1차 세포 또는 2차 세포는 그들의 게놈내에 안정하게 삽입되는 외인성 핵산 서열과 결합시켜, 트랜스펙션을 수행하도록 처리된다. 상기 외인성 핵산 서열은 필요에 따라서 선별가능 마커를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다. 상기 외인성 핵산 서열 및 선별가능 마커 코딩 DNA는 별개의 구성물상에 존재해도 단일 구성물상에 존재해도 좋다. 적합한 양의 DNA를 사용하면, 외인성 DNA를 함유하여 적합하게 발현시키는 적어도 하나의 안정하게 트랜스펙트된 세포가 생산됨을 보장할 수 있게 된다. 일반적으로, 약 0.1∼500㎍의 DNA를 사용한다.

여기서 사용된 바와 같이, "트랜스펙션(transfection)"은 외인성 핵산을 세포에 도입하기 위한 인산칼슘 또는 염화칼슘 침전, 미량주입(microinjection), DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙션 또는 일렉트로포레이션을 포함한 다양한 기술을 포함한다.

일렉트로포레이션(electroporation)은 DNA 구성물을 1차 또는 2차 세포에 도입할 수 있을 정도의 전압 및 정전용량에서 행한다. 일렉트로포레이션은 광범위한전압(예, 50∼2000볼트) 및 대응 정전용량에 걸쳐서 행할 수 있다. 일반적으로 토탈 DNA는 약 0.1∼500㎍가 사용된다.

인산칼슘 침전, 변형 인산칼슘 침전, 폴리브렌 침전, 리포좀 융합 및 수용체 매개 유전자 전달 등의 방법은 세포 트랜섹트(transect)에 사용할 수도 있다. 또한, 1차 또는 2차 세포는 마이크로인젝션을 이용하여 트랜스펙트시킬 수도 있다. 그 다음, 안정하게 트랜스펙트된 2차 세포를 증식시키고 트랜스펙트된 2차 세포의 클론성 세포주를 생성할 수 있을 정도의 충분한 시간 동안, 배양 조건 하에서, 안정하게 트랜스펙트된 세포를 분리하여 배양하고 계대 배양(subcultivate)할 수 있다. 필요에 따라서, 하나 이상의 트랜스펙트된 세포를 배양하고 계대 배양하여, 이종 세포주를 생성한다.

트랜스펙트된 1차 또는 2차 세포를 충분한 수의 배가(doubling)를 행하여 치료 단백질을 개체에 유효량으로 제공할 수 있을 정도의 충분한 크기의 클론성 세포주나 이종 세포주를 생성한다. 일반적으로, 예를 들면, 0.1㎠의 피부를 생검하면 1,000,000세포를 함유하는 것으로 생각되며; 세포 하나를 이용하여 클론성 세포주를 생성하고 약 27 배가(doubling)를 행하면 1억개의 트랜스펙트된 2차 세포를 생성하게 된다. 이종 세포주가 약 1,000,000 세포의 오리지날 트랜스펙트된 개체군로부터 생성될 경우, 1억개의 트랜스펙트된 세포를 생성하기 위해서는 단지 10 배가가 필요하게 된다.

트랜스펙트된 클론성 이종 세포주의 필요한 세포의 수는 다양하며, 특별한 제한은 없지만, 트랜스펙트된 세포의 용도, 트랜스펙트된 세포 중의 외인성 DNA의기능적인 레벨, 트랜스펙트된 세포의 이식 부위(예, 사용될 수 있는 세포의 수는 이식되는 해부학적 위치에 따라 제한됨), 및, 환자의 나이, 표면적 및 임상적인 조건을 포함한 다양한 인자에 따라 다르다. 고립된 성장 호르몬 결핍(isolated growth hormone deficiency)을 가지며 그 나머지는 건강한 10kg의 환자에게 치료가능 레벨의 인간 성장 호르몬을 전달하기 위해서는, 약 1∼5억개의 트랜스펙트된 섬유아세포가 필요하다(이들 세포의 체적은 바로 환자의 엄지손가락 끝과 같다.)

트랜스펙트된 2차 세포의 클론성 세포주 또는 이종 세포주의 이식

상기 트랜스펙트된 세포, 예를 들면, 여기서 기재하는 바와 같이 생성된 세포를 그 산물이 전달되도록 개체에 도입시킬 수 있다. 따라서, 상기 클론성 세포주 또는 이종 세포주가 개체에 도입된다. 각종 투여 경로 및 각종 부위(예, 신장 피막하, 피하, 중추신경계(초내(intrathecal) 포함), 정맥내, 간내, 장내(intrasplanchnic), 복강내(망내(intraomental) 포함), 근육내 이식)를 사용할 수 있다. 개체에 이식된 경우, 상기 트랜스펙트된 세포는 이종 DNA에 의해 코딩된 산물을 생성하거나 또는 이종 DNA 그자체에 의해 영향을 받는다. 예를 들면, 탈모증에 걸린 개체는 TSP-1 또는 TSP-2 생성 세포의 이식을 위한 후보가 된다.

상기 개체는 작은 피부 생검법이 행해질 수 있으며; 이것은 외래 환자에 행할 수 있는 간단한 방법이다. 피부 단편을 예를 들면 팔아래쪽로부터 취하여 제거하는데 약 1분 정도 걸린다. 상기 샘플을 처리하여 환자의 세포(예, 섬유아세포)를 분리하고 유전자 조작에 의해 TSP-1 또는 TSP-2의 생성을 유도하는 TSP-1 또는 TSP-2 또는 또다른 단백질 또는 분자를 생성한다. 환자의 나이, 몸무게 및 임상조건에 근거하여, 필요한 수의 세포를 대용량 배양으로 증식시킨다. 전체 공정은 4∼6주가 소요되며, 그 마지막에, 외래환자로서 다시 왔을 때, 적합한 수의 유전자 조작세포를 개체에 도입시킨다(예, 그들을 환자의 피부(예, 머리가죽 또는 얼굴)의 아래후면에 주입함에 의함).

어떤 경우에, 이것은 1회 처리(one-time treatment)되고, 그 밖의 경우에는, 다중 세포 치료 처리가 요구된다.

이러한 예가 제안한 바와 같이, 사용된 세포는 일반적으로 환자 특이적인 유전자 조작 세포이다. 그러나, 동일종의 다른 개체 또는 다른 종으로부터 세포를 얻을 수 있다. 이러한 세포를 사용할 때에는, 이식된 세포의 거부반응을 방지하기 위해, 면역억제제의 투여, 조직적합성 항원의 변경, 또는 배리어 디바이스의 사용을 필요로 한다.

트랜스펙트된 1차 또는 2차 세포는 단독으로 또는 수용하는 피험자의 세포에서의 면역 반응을 저해하는 배리어 또는 약제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들면, 면역억제제를 피험자에게 투여하여 피험자의 정상 반응을 저해 또는 방해할 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역 억제제는 피험자의 T 세포/또는 B 세포 활성을 저해하는 면역억제용 약제이다. 이러한 면역억제용 약제의 시판품의 예로는 Sandoz Corp. East Hanover, NJ사제의 시클로스포린 A를 들 수 있다.

면역억제제(예, 약제)는 피험자에게 원하는 치료 효과(예, 세포 거부반응을 저해)를 얻을 수 있을 정도의 투여량으로 투여할 수 있다. 면역 억제 약제의 투여량의 범위는 공지되어 있다(예, Freed et al.(1992)N. Engl. J. Med.327:1549;Spencer et al.(1992)N. Engl. J. Med.327:1541; Windner et al. (1992)N. Engl. J. Med.327:1556). 투여량의 값은 개체의 질병 상태, 나이, 성, 및 몸무게 등의 인자에 따라 다양하게 할 수 있다.

피험자의 T 세포 활성을 저해하는데 사용할 수 있는 또다른 약제는 항체, 또는 그들의 유도체의 단편이다. 생체내(in vivo)에서 T 세포를 고갈 또는 분리 (sequester)할 수 있는 항체는 공지되어 있다. 폴리클론성 항혈청, 예를 들면, 항림프구 혈청을 사용할 수 있다. 필요에 따라서, 하나 이상의 단일클론성 항체를 사용할 수 있다. 바람직한 T세포 고갈 항체로는 세포 표면상의 CD2, CD3, CD4, CD8, CD40, CD40, 리간드에 결합하는 단일클론성 항체를 들 수 있다. 이러한 항체는 공지되어 있으며 예를 들면, American Type Culture Collection으로부터 구입할 수 있다. 인간의 T 세포상의 CD3에 결합하는 바람직한 항체는 OKT3(ATCC CRL 8001)이다.

수용자 내의 T 세포를 고갈, 분리 또는 저해하는 항체를, 이식시의 세포 거부 반응을 저해하기에 적합한 시간 동안 일정 복용량으로 투여할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 희석제(예, 식염액) 중의 항체는 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.

수용자 내에서의 상기 세포에 대한 면역 반응을 방해 또는 저해하는 또다른 방법은 면역배리어(immunobarrier)를 사용하는 것이다. 여기서 사용되는 "면역배리어"라 함은 투여된 세포와 피험자의 면역 반응에 관여하는 세포 사이에 배리어로서 작용하는 디바이스를 말한다. 예를 들면, 상기 세포는 이식가능한 디바이스에투여될 수 있다. 이식 가능 디바이스는 반투과성 배리어내, 즉, 영양분과 그 산물은 배리어의 안과 밖을 확산시킬 수 있지만 더 큰 면역 시스템 성분(예, 항체 또는 보체)의 도입은 막는 배리어내에 함유된 세포를 포함할 수 있다. 통상 이식가능 디바이스로는 세포가 배치되어 있는 매트릭스, 예를 들면, 하이드로겔, 생체적합성 메쉬, 또는 코어를 들 수 있다. 필요에 따라서, 반투과성 코팅제로 상기 겔을 둘러쌀 수 있다. 상기 투여 세포는, 상기 겔 코어내에 배치되는 경우, 면역 시스템의 세포로부터 분리되어야하며 숙주의 세포 및 세포독성 항체로부터 은폐되어야한다. 바람직하게는 PLL 또는 PLO와 같은 선택투과 코팅제가 사용된다. 상기 코팅제는 수용자의 면역 시스템의 성분이 들어가서 이식가능한 디바이스내의 세포를 파괴하는 것을 막는 다공성을 종종 갖는다.

세포를 피막형성(encapsulating)하는 많은 방법이 공지되어 있다. 예를 들면, 미국특허번호:4,352,883에는 수용성 검을 사용하여 반투과성의 수불용성 겔을 얻어서 생산용 세포를 피막형성하는 피막형성법 및 다른 피막형성 방법이 개시되어 있다. 미국특허번호:5,084,350, 미국특허번호:5,427,935, 1995년 7월27일에 공개된 WO95/19743, 미국특허번호:5,545,423, 미국특허번호;4,409,331, 미국특허번호:4,663,286, 및 유럽특허번호 301,777에는 사용할 수 있은 다른 이식가능 디바이스가 개시되어 있다.

트랜스펙트된 또는 2차 세포를 사용함에 따른 이점은, 개체에 도입되는 세포 수를 제어함으로써 인체에 전달되는 단백질의 양을 제어할 수 있는 것이다. 또한, 어떤 경우에는, 그 산물을 더 이상 요구하지 않는 트랜스펙트된 세포를 제거할 수있다. 본 발명의 트랜스펙트된 1차 또는 2차 세포를 사용하여 치료함에 따른 다른 이점은, 단백질, 산물 또는 핵산 산물의 전사에 영향을 미치거나 핵산 산물의 안정성에 영향을 미치는 약제, 스테로이드 또는 징크의 투여 등에 의해, 치료 물질의 생성을 제어할 수 있다는 점이다.

자외선-B(UVB) 조사에 만성적으로 노출함으로써, 특히, 주름이 형성되는 광노화가 일어난다.

실시예1: 장기간 UVB 조사한 후의 증강된 피부 혈관형성

10주동안 UVB를 조사한 후(누적량: 5.65 J/㎠), UVB를 조사한 마우스와 조사하지 않은 마우수의 등 피부(back skin)로부터 레블리카(replica)를 얻어서, 피부 손상 정도에 대한 파라미터로서 피부 표면 릴리프(relief)를 평가하였다. UVB를 조사한 마우스에서는 뚜렷한 주름 형성이 관찰되었으나, 미조사 대조구 마우스에서는 눈에띄는 주름이 검출되지 않았다. 피부 내면을 육안 관찰한 결과, UVB를 조사한 마우스에서 피하 혈관발달 증가와 동시에 혈관 확장 및 혈관 브랜칭(branching)이 확인되었다.

조직학적 분석에 의하면 UVB 조사 마우스에서는 표피, 진피 및 피지선의 두꺼워지고(36), 이와 동시에 상부 진피(upper dermis)에 염증 세포가 축적되는 것으로 나타났다. 더욱이, 미조상 대조구 피부에서는 규칙적인 패턴이 관찰되는데 비해, UVB 조사 피부에서는 콜라겐 섬유과 엘라스틴 섬유가 단편화되고 덜 조직화됨을 확인하였다. CD31을 면역염색(immunostain)한 결과, UVB 조사 마우스의 진피에서는 미처리 대조구에 비해, 확장된 혈관수가 증가됨이 확인되었다. 이러한 변화는 표피 바로 아래에 놓여있는 영역인, 유두상의 진피(papillary dermis)에서 가장 두드러졌다. 증식 마커 Ki67 및 내피 접합 분자 CD31에 대한 시차 면역형광 염색 결과, UVB 조사 피부에서는, 확장된 혈관내에 증식성 내피 세포의 수가 상당히 증가되는 반면, 대조구의 피부에서는 증식성 내피 세포가 거의 검출되지 않음을 확인하였다. UVB 조사 피부의 상부 진피에서 가장 높은 내피 세포 증식율이 관찰되었다. 미조사 표피에서는, 증식성 표피 케라티노사이트가 기저층에서 선택적으로 검츨되었다. 반대로, UVB 조사 후 과다형성된 표피의 상부 기저층에서는 다수의 증식하는 케라티노사이트가 발견되었다.

CD31-염색 조식 절편을 사용하여, 피부 혈관 밀도 및 크기에 대한 양적인, 컴퓨터를 이용한 생물형태계측 분석을 행하였다. 만성적인 UVB 조사 결과, 미조사 대조구에 비해, 혈관 밀도가 현저하게(p<0.001) 증가하였다. UVB 조사 피부의 혈관은 사이즈가 67% 이상(p<0.001) 현저하게 증가하였고, 혈관에 의해 덮힌 피부 면적은 130%이상(p<0.001) 증가하였다.

실시예 2: 장기간 UVB 조사 후의 증강된 표피 VEGF 발현

피부 VEGF mRNA 발현에 대한 장기간 UVB 조사 효과를 시험하였다. 인시튜 하이브리디제이션(in situ hybridization)을 이용하여, 장기간 UVB 조사 후에는 VEGF mRNA 발현이 상부기저 표피 케라티노사이트에서 매우 과조절되나, UVB 미조사 마우스의 피부에서는 VEGF mRNA의 발현이 거의 또는 전혀 검출되지 않음을 확인하였다.

실시예 3: TSP-1의 과발현이 UVB-유발 피부 손상, 주름 형성 및 혈관형성을 저해한다

장기간 UVB 조사의 효과에 대한 피부 혈관형성의 생물학적 중요성을 묘사하기 위해서, 내인성 혈관형성 저해제 TSP-1의 피부 특이적인 과발현을 일으키는 유전자도입 마우스(transgenic mouse)에 동일한 UVB 조사 섭생(regimen)를 행하였다. 이들 마우스는 그 특징이 상세하게 알려져 있으며 유발된 혈관형성의 강력한 저해를 나타낸다(24). UVB 조사 10주 후(누적 UVB량 6.52J/㎠), 모든 야생형 마우스는 등 피부에 현저하게 주름이 형성되었다. 반대로, TSP-1 과발현 유전자도입 마우스에서는 주름이 거의 또는 전혀 형성되지 않았다. 육안으로 보아, K14/TSP-1 유전자도입 마우스는 야생형 동복자(littermate)에 비해 피부혈관발달이 감소되었다.

조직학적 분석 결과, UVB에 의해 유발되는 진피 및 피하조직의 후층화(thickening)가 야생형 동복자에 비해, K14/TSP-1 유전자도입 마우스에서 덜 두드러짐이 확인되었다. 또한, 야생형 동복자에 비해 K14/TSP-1 유전자도입 마우스에서는 부수적인 염증세포의 침입이 감소됨이 확인되었고, 콜라겐 섬유의 더 규칙적인 배열과 구조가 확인되었다. 더욱이, 피부 혈관이 K14/TSP-1 유전자도입 마우스에서 상당히 감소되었다. CD31 염색 피부 절편의 생물형태계측 분석결과 TSP-1 유전자도입 마우스에서 혈관 크기가 55%이상 감소(p<0.001)되고 혈관에 의해 덮인 피부 면적이 현저하게 감소(p<0.001)됨이 확인되었다. TSP-1 유전자도입 마우스에서 혈관 밀도의 현저한 감소는 검출되지 않았다. CD31 및 Ki-67에 대한 이중면역형광 염색 결과, UVB를 조사한 야생형 동복자에 비해, UVB를 조사한 TSP-1 유전자도입 마우스의 진피에서 증식성 내피 세포의 수가 현저하게 감소함을 확인하였다. 또한, CD31 염색을 함께 한 TUNEL 검정(assay) 결과, 야생형 동복자에 비해 TSP-1 유전자도입 마우스의 피부에서 세포소멸 내피세포의 수가 증가함을 확인하였다.

실시예 4: TSP-1의 과발현이 UVB 유발 MMP-9 활성화를 방지한다

매트릭스 메탈로프로테나제-9(MMP-9)는 UVB에 의해 유발되는 세포외기질 성분의 감소를 중재하는데 관여해왔으며(35), 최근에는 MMP-9의 활성이 VEGF의 생체이용율을 제어함으로써 혈관형성에 결정적인 역할을 함이 제안되었다(37). 야생형 및 TSP-1 유전자도입 마우스의 등 피부에 일회 UVB 조사(126J/㎠)를 행하고 젤라틴 자이모그래피(zymography)에 의해 피부 용액액의 MMP-9 활성을 측정하였다. 야생형 마우스의 일회 UVB 조사 결과, 24시간 후 피하 혈관발달이 두드러지게 증가되었으며 TSP-1 유전자도입 마우스에서는 덜 두드러졌다. 젤라틴 자이모그래피 결과, 야생형과 TSP-1 유전자도입 마우스의 정상 피부에서 동일한 레벨의 MMP-9 활성을 나타내었다. 그러나, UVB 조사 24시간 후에는, MMP-9 활성이 야생형 마우스의 피부에서는 매우 증가하였으나, TSP-1 유전자도입 마우스에서는 감소하였다.

실시예 5: TSP-2 녹아웃 마우스는 증가된 주름 형성을 나타낸다.

장기간 UVB 조사(누적 UVB량: 7.23J/㎠)에 의해 TSP-2 결손 마우스에서는 야생형 마우스에 비해, 현저한 주름이 형성되었다. 만성적인 UVB 조사 후, TSP-2 결손 마우스에서는 야생형 동복자에 비해, 피부 혈관이 확장되고 혈관 브랜칭이 증강되었다.

헤마톡실린-에오신 염색 결과, 장기간 UVB 조사 후의 TSP-2 결손 마우스의 피부에서, 야생형 대조구 피부에 비해 표피와 진피의 후층화가 확인되었다. 트리크롬(trichrome) 염색 결과, 만성적인 UVB 조사 후에 TSP-2 결손 유두상의 진피의 콜라겐 섬유가 야생형 마우스에 비해 불규칙하게 조직화됨이 확인되었다. CAE 염색 결과, TSP-2 결손 마우스의 염증세포의 침입이 야생형 마우스에 비해 증가함이 확인되었다.

CD31의 면역 염색 결과, 만성적인 UVB 조사 후에 TSP-2 결손 마우스의 토탈 피부(진피+피하조직) 및 상부 진피에서의 혈관 확장이, 야생형 동복자에 비해 더 많이 일어남이 확인되었다. CD31 염색 절편을 컴퓨터를 이용하여 화상분석한 결과, 만성적인 UVB 조사 후에 TSP-2 결손 마우스의 토탈 피부의 혈관 사이즈와 혈관 밀도가 야생형 동복자에 비해 뚜렷하게 증가함이 확인되었다. 토탈 피부에서의 혈관발달과 마찬가지로, 만성적인 UVB 조사 후에 TSP-2 결손 마우스의 표피-진피 경계면으로부터 100㎛ 거리에 있는 상부 진피에서도 혈관발달이 증가하였다.

CD31 및 BrdU의 이중 면역형광 염색 결과, TSP-2 결손 마우스 피부의 상부 진피 및 저부 진피에서의 증식성 내피 세포(화살표)의 수가 야생형 마우스에 비해 현저하게 증가함이 확인되었다.

VEGF의 인시튜 하이브리디제이션 결과, 야생형 표피의 VEGF mRNA 발현이 거의 또는 전혀 없는 데 비해, 만성적인 UVB 조사 후, TSP-2 결손 마우스의 과다형성 표피의 상부기저 케라티노사이트에서의 VEGF mRNA 발현은 증가하였다.

젤라틴-자이모그래피 결과, UVB 조사 야생형 마우스의 피부의 MMP-9의 활성이, 미조사 야생형 마우스에 비해, 강하게 유도됨이 확인되었다. 만성적인 UVB 조사 후의 TSP-2 결손 마우스와 야생형 MMP-9 활성의 주요한 차이는 검출되지 않았다.

실시예 6: 방법 및 재료

UVB 조사 섭생

첫 번째 실험에서, 8주된 자성 헤어리스 Skh-1 마우스(군(group) 당 n=7)를, 4개의 일렬로 고르게 배치된 형광램프(Elder Pharmacuticals, Bryan, OH)를 사용하여 UVB 조사에 노출시켰다(25). 램프의 높이는 마우스의 등 피부 표면에 0.35mW/㎠를 전달하도록 조정하였다. 출발량을 0.5 최소홍반량(MED)(20mJ/㎠)으로 하여, 10주동안 일주일에 2번 마우스에 UVB를 조사하고 0.5MED에서 최고량 4.5MED로 점진적으로 증가시켰다(26). UVB의 총 누적량은 5.62J/㎠였다. 급성 선번 반응은 관찰되지 않았다. 대조구 마우스는 가염증(sham-irritation)이 일어났다. 부가 실험에서, 8주된 자성 k14/tsp-1 유전자도입 마우스(24) 또는 FVB 야생형 대조구(군 당 n=7)를 합계 12주 동안 상기한 바와 같이 UVB 조사 처리를 하였다(누적 UVB량 6.52J/㎠). 12주 후, 마우스를 죽여서 실리콘 고무(SILFLO; Flexico Developments Ltd., U.K.)를 사용하여 피부 레플리카를 얻었다((27) 참조). 등 피부 샘플을 액체 질소에 순간동결(snap-frozen)시키거나 10% 포름알데히드에 고정화시킨다((28) 참조). 모든 동물 실험은 메사추세츠 제너럴 하스피털 리서치 애니멀 케어 소위원회에 의해 입증되었다.

CD21의 면역조직화학 및 피부 혈관의 컴퓨터 세포형태계측 분석

단일클론성 래트 항-마우스 CD31 항체(Pharmingen, San Diego, CA)를 사용하여, (24)에 기재된 바와 같이 7㎛ 동결 절편에 대해 면역조직 화학적 염색을 행하였다. UVB 조사 마우스 5마리와 연령이 같은 UVB 미조사 마우스 5마리로부터 견본 절편을 얻어서, Nikon E-600 현미경(Nikon; Melville, NY)을 이용하여 분석하였다. 화상은 Spot 디지털 카메라(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)로 잡고(capture), (24)에 기재된 바와 같이 세포형태계측 분석은 IP-LAB 소프트웨어 (Scanalytics Inc, Fairfax, VA)를 사용하여 수행하였다. 각 절편의 3 다른 필드를 60x 배율로 검사하여, 표피-진피 접합부로부터 100㎛이내의 영역에서, 진피의 ㎟당 혈관의 수, 평균 혈관 크기 및 혈관에 의해 점유된 상대 면적을 측정하였다. 양측 짝이아닌 스튜던츠 t-테스트(two-sided unpaired Student's t-test)를 이용하여 미소혈관 밀도 및 혈관 크기의 차이를 분석하였다. 또한, 동일한 마우스의 피부로부터 파라핀 절편을 얻어서, (29)에 기재된 바와 같이 헤모톡실린-에오신, 베르회프(Verhoeff's) 엘라스틱 및 바이게르트(Weigert's) 리소르신 푹신 염색을 행하였다.

증식 및 세포괴사 검정

내피 세포의 증식을 분석하기 위해서, 단일클론성 래트 항-마우스 CD31 항체및 토끼 항-Ki-67 폴리클론성 항체(Nobocastra Laboratories, Burlingame, CA)를 사용하여, 7㎛의 동결 절편상의 내피 세포 마커 CD31 및 증식 마커 Ki-67(30, 31)에 대한 이중 면역형광 염색을 수행하였다. FITC가 접합된 항-래트 IgG와 Texas-Red(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)가 접합된 항-토끼 IgG를 2차 항체로서 사용하였다(32). 각 실험군에 대해서 5마리의 마우스로부터 견본 절편을 얻어서 Nikon E-600 현미경을 사용하여 분석하였다. CD31 및 Ki-67 염색의 디지털 화상을 동일 필드에서 얻어서 증식성 내피 세포를 확인하기 위해서 결합시켰다. 형광-FragEL DNA 단편 검출 키트(Oncogene, Cambridge, MA), 및 Texas-Red가 접합된 항-래트 IgG를 함께 가진 항-마우스 CD31 항체를 사용하여(24), 이중 면역형광에 의해 세포소멸성 내피 세포를 검출하였다.

인 시튜 하이브리디제이션

(19) 기재와 같이, 파라핀 절편 상에 인 시튜 하이브리디제이션을 수행하였다. 다시말해, 슬라이드를 크실렌을 처리하여 파리핀을 제거한 다음, 순차적으로 그래이디드 알콜; 0.2M HCl; 3㎍/㎖의 프로테나제 K를 함유한 Tris/EDTA; 0.2% 글리신; 4% 파라포름알데히드의 인산완충 식염액 pH7.4; 1/200(부피/부피) 무수아세트산을 함유하는 0.1M의 트리에탄올아민; 및 2XSSC를 통과시킨다. 슬라이드를, 혼합물(0.3M NaCl, 0.01M Tris pH7.6, 5mM EDTA, 50% 포름아미드, 10% 데스트란 설페이트, 0.1mg/㎖ 효모 tRNA, 및 0.01M 디티오트레이톨) 중에서 35S 표지된 리보프로브를 이용하여 52℃에서 하룻밤 하이브리디제이션 시킨다. 포스트-하이브리디제이션 워시는 65℃의 2XSSC/50% 포름아미드/10mM 디티오트레이톨 및 2XSSC를 포함한다. 그 다음, 슬라이드를 0.3M 암모늄아세테이트를 함유하는 그래이디드 알콜을 통하여 탈수시키고, 건조시켜, Kodak NTB2 에멀젼으로 코팅한 다음 2주동안 4℃의 암소에 저장하였다. 상기 에멀션은 Kodak 19 현상액으로 현상시키고 상기 슬라이드를 헤마톡실린으로 대조염색하였다. VEGF에 대한 안티센스 및 센스 단일가닥 35S-표지 RNA 프로브는 pGEM-3Z(Promega)에 클로닝된 393-bp 래트 VEGF cDNA 단편(12)으로부터 제조하였다.

젤라틴 자이모그래피

야생형 FVB 마우스 및 유전자도입 마우스의 면도한 등 피부를, 1회 UVB 조사(126mJ/㎠)에 노출시켰다. 24시간 후, 마우스를 죽여서 등 피부 샘플을 잘라내어, 추출 완충액(0.05M Tris/pH 7.5, 0.2M NaCl, 5mM CaCl₂, 0.1% Triton X-100)에 균질화시켰다. 원심분리 후, 상청액을 젤라틴 자이모그래피용으로 채취하였다. 자이모그래피는 (33, 34)에 기재된 방법에 약간의 변화를 주어 수행하였다. 다시말해, 피부 용해액을 비환원 4X SDS 샘플 완충액(0.5M Tris-HCl/pH 6.8, 0.02% 브로모페놀 블루, 40%(v/v) 글리세롤, 3% SDS)에 재현탁시켜서, 0.1%의 돼지 피부 젤라틴(SIGMA)를 함유하는 SDS 폴리아크릴아미드 겔에 로딩시킨다. 각 단백질 용해액 20㎍을 SDS-PAGE시킨다. 상기 겔을 2.5% Triton X-100으로 배양(incubation)하여 SDS를 제거한 다음 배양 완충액(0.05M Tris-HCl/pH 8.0), 5mM CaCl2, 5μM ZnCl)으로 하룻밤 배양한다. 그 다음 겔을 0.5% 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) R-250/30% 메탄올/10% 아세트산 용액으로 염색한뒤, 30% 메탄올/10% 아세트산 용액을 사용하여 탈색하였다. MMP-9 활성은 92 kDa 분자량 밴드로서 검출되었다(35).

< 참고문 >

Claims

주름 방지를 필요로 하는 피험자를 식별하고;

피험자의 피부에서의 혈관형성을 저해하여,

그로 인해 장기간 UVB에 의해 유발되는 주름을 방지하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 방법.
제1항에 있어서,

피험자의 TSP-2 또는 TSP-1 활성을 증가시킴으로써 혈관형성을 저해하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 방법.
제1항에 있어서,

피험자에 혈관형성방지 인자를 유도하는 화합물을 투여함으로써 혈관형성을 저해하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 방법.
제3항에 있어서,

혈관형성방지 인자가 TSP-1 또는 TSP-2인 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 방법.
혈관형성 저해제 또는 혈관형성 저해제를 유도하는 약제를 상기 주름을 감소또는 방지할 수 있을 정도의 충분한 양으로 함유하는 조성물을 피험자에게 투여하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료 방법.
제5항에 있어서,

상기 주름이 자연 태양광에 노출함에 의해 발생되는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료 방법.
제5항에 있어서,

혈관형성 저해제를 국소 투여하여 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료 방법.
제5항에 있어서,

혈관형성 저해제가 멸균 조성물로 제공되는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료 방법.
제5항에 있어서,

혈관형성 저해제가 TSP-2 또는 TSP-1인 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료 방법.
혈관형성 저해제 또는 혈관형성 저해제를 유도하는 약제; 및 약제학적으로허용가능한 담체를 함유하는 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료용 조성물.
제10항에 있어서,

혈관형성 저해제가 TSP-2 또는 TSP-1인 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료용 조성물.
제10항에 있어서,

화장품 원료를 더 함유하는 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료용 조성물.
제12항에 있어서,

상기 화장품 원료가 향(fragrance)인 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료용 조성물.
제12항에 있어서,

상기 화장품 원료가 선스크린인 장기간 UVB-유발 주름 방지 또는 치료용 조성물
혈관형성 저해제 또는 혈관형성 저해제를 유도하는 약제를 함유하는 조성물을 피험자에게 공급하고;

주름을 방지하는 상기 조성물을 사용하는 사용설명서를 피험자에게 공급하는피험자의 장기간 UVB-유발 주름에 대한 보호를 제공하는 방법.
제15항에 있어서,

혈관형성 저해제가 TSP-2 또는 TSP-1인 피험자의 장기간 UVB-유발 주름에 대한 보호를 제공하는 방법.
제15항에 있어서,

상기 사용설명서가 태양 노출 전에 피부에 상기 조성물을 도포하도록 하는 사용법을 포함하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름에 대한 보호를 제공하는 방법.
제15항에 있어서,

상기 조성물이 화장품 원료를 더 함유하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름에 대한 보호를 제공하는 방법.
혈관형성 저해제 또는 혈관형성 저해제를 유도하는 약제를 함유하는 조성물; 및

주름 방지 조성물을 사용하는 사용설명서

를 포함하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지용 키트.
제19항에 있어서,

상기 혈관형성 저해제가 TSP-1 또는 TSP-2인 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지용 키트.
제19항에 있어서,

상기 조성물이 화장품 원료를 더 함유하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지용 키트.
제19항에 있어서,

상기 사용설명서가 태양 노출 전 또는 노출 중에 피부에 상기 조성물을 도포하는 사용법을 포함하는 피험자의 장기간 UVB-유발 주름 방지용 키트.