TWI230611B - Anti-infection composition and food containing such anti-infection composition - Google Patents

Anti-infection composition and food containing such anti-infection composition Download PDF

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TWI230611B
TWI230611B TW091110088A TW91110088A TWI230611B TW I230611 B TWI230611 B TW I230611B TW 091110088 A TW091110088 A TW 091110088A TW 91110088 A TW91110088 A TW 91110088A TW I230611 B TWI230611 B TW I230611B
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Tatsuhiko Kan
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Description

1230611 五、發明說明(1) 【發明之技術領域】 本發明係有關含有松簟屬·布萊傑·目利之k , 、 爻抽出物及 乳酸菌之加熱處理菌體作為有效成分之感染抑制組成物 含有該組成物之飲食品。 【發明之技術背景】 已知擔子菌綱ha ladake科之菇之松蕈屬·希常- • 唧來傑•目 利(Agaricus blazei Murill、日本名 川理哈、幸 」)為 具有可預防·改善癌症、過敏、糖尿病、高血壓等效果 成分,例如有關抗腫瘍活性成分,各自從該子實體^ 酸性多糖體(日本特開昭64- 6 71 94號公報)、中性多ϋ (曰本特開昭64-67195號公報)及蛋白多糖體(日士 # ^ β本特開平 2-78630號公報),從菌絲體分劃出蛋白多糖體f α丄 τ V日本特開 昭6 1 - 4 7 5 1 8號公報)、尤其是從菌絲體之培養溏 民/恩液分割出 蛋白多糖體(日本特開昭平61-47519號公報)。 一 松蕈屬·布萊傑·目利被廣泛利用於健康。 例如於特開2 0 0 1 -1 03927號公報揭示配合有將松葦 τ 在加壓下用水性溶劑抽出,將該抽出物用5 〇 % 磨兹 ^ ¢,1 獲得之松蕈屬蘑菇抽取物之食用組成物。 ▲ 於日本特開20 0 1 _17130號公報揭示有以於松 煎液中混合有醋及蜂蜜為特徵之含有松蕈屬 品。 1更康飲料食 於日本特開平1 1 -32 723號公報揭示有將松堇 之鹵4體、子實體及該混合物或該等之培養殘液 維素酶為主體之酵素劑進行分解處理,此時 、 J α侵件之含有
1230611 五、發明說明(2) 多量β -葡聚糖之生理活性物質作為主材料之健康食品。 又,自古以來乳酸菌亦作為健康食品廣泛被攝取,已 知除了具有改善腸内菌叢之平衡、減低腸内腐敗產物、改 善糞便性狀之效果之外還具有免疫賦活效果。例如於特開 〇1 48796號公報揭示有以乳酸球菌ADl〇l(Enterococcus faecalis AD101)菌株之死菌體作為主成分之免疫調整 劑0 =曰本特開平丨0_29946號公報揭示有以乳酸菌或該處 降低ϊ i有效成分之具有回復因藥劑所引起液性免疫機能 -之作用之液性免疫回復劑。 於曰本特開平6_805 75號公報揭 广或菌體含有物作為有效成分為特=== 體之公報揭示有以含有乳酸菌菌 活組成物“及/或細胞質劃分含有物為特徵之免疫賦 【發明解決課題】 利用品松丄π:自”或乳…然廣泛 生理效果者。 早獨攝取時能充分滿足 所以^ 交 制病# i t明之目的為提供經口攝$ , ¥ ϋ μ t # ㈣感染效果之感染抑制 ^優越之抑 飲令。 物及含有該組成物之 【解决課題之方法】
1230611 五、發明說明(4) 之抽出物及乳酸菌之加熱處理菌體作為有效成分 f ’攝取該等、组成物可期待優越之預防病5菌=安 ’、。又,於飲食品中添加本發明之减毕抑杳丨。感染 可提供預防病原菌等感染之飲食品。之感木抑制組成物, 本發明感染抑制組成物之抑制感 今尚不明瞭。認為是經由將松蕈屬·布' 用機序至 體及/或菌絲體培養物之抽出:目利之子實 併用攝取,可使以E % έ田胎=及礼酸菌之加熱處理菌體 胞性免产機谨Li ΝΚ細胞及7細胞為中心之Γ 【發明之實施形態】 ,、有效率地進行。 本發明感染抑制組成物有八 :·目利之子實體抽出物可 ;蕈屬.布萊 實體原物或是由將該經乾燥 2,·目利之子 出獲得。具體而言,可由蔣p乾鹿物用水、乙醇等溶劑抽 鐘,將所獲得之抽出液 7於120C抽出30分 又,松輩屬.ίίϊ Hi濃縮、乾燥獲得。 由將松蕈屬·布萊傑·目' 利,絲體培養物之抽出物可 養基培養,將獲得之之種菌用含有碳源及氮源之培 之操作、抽出獲得。、5經乾燥之菌體經由與上述相同 本發明中,松蕈屬 布μ 絲體培養物之抽出物亦可使隹目利之子實體及/或菌 本發明感染抑制組成物二=品。 處理菌體為將乳酸菌體經由之乳酸菌之加熱 m處理所獲得之死菌體,可
313641.ptd 1230611 五、發明說明(5) 由下述之方法獲得。 乳酸菌可由在樂果撒培養基,於30至45 °C培養12至72 小時後,經由離心分離等適當之方法將菌體回收。將所回 收之菌體水洗、濃縮,將該濃縮菌體懸濁液於8 〇至1 1 5 °C 加熱處理30分鐘至3秒鐘後經由喷霧乾燥、凍結乾燥等適 當方法乾燥獲得。上述之乳酸菌可列舉乳酸球菌 (Enterococcus faecalis)、乳酸腸球菌(Enterococcus faecium)、嗜乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)、 乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳桿菌 (Lactobacillus lactis)、瑞士 乳桿菌(Lactobacillus herveticus)、長雙岐桿菌(Bifidobacterium Longum)、 短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)、嗜熱性鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)等°本發明中又以使用具 有更強力免疫賦活活性之乳酸腸球菌(E n t e r 〇 c 〇 c c u s faecalis)(ATCC 1 9433、ATCC 1 450 8、ATCC23655)特別理 想。乳酸球菌之加熱處理菌體亦可使用市售之例如「EF巴 瓦」、「EF- 2 00 1」(二者均為商品名,控必(股)公司製 造)、「FK-23」(商品名,曰曰製藥公司製造)。 本發明之感染抑制組成物以含有上述松蕈屬·布萊 傑·目利之子實體及/或菌絲體培養物之抽出物〇. 5至9 9. 5 質量%、上述乳酸菌之加熱處理菌體99.5至0·5質量%較 理想。又以含有松葦屬·布萊傑·目利之子實體及/或菌 絲體培養物之抽出物含有10至90質量%、上述乳酸菌之加 熱處理菌體90至10質量%更理想。各有效成分若在上述範
313641.ptd 第9頁 1230611 五、發明說明(7) 中,調製試驗液(250¾克/毫升)。 料,實驗MR庫存品」、曰本農業工業(股)公司製 投予後母曰觀察一次(觀察期為1 4曰),任何一群都 死亡例。觀察期結束時將所有之老鼠解剖檢查時主要 未發現異常。又,於投予後第7日、第1 4日測定體 經由t-檢定,以有意義水準5%進行群間之比較。妹 表1所示。 Q 1】 將4週歲之ICR系老鼠(雄雌各2〇隻,購自日本艾斯— 滋(股)公司)進行預備飼育約1週後分成試驗群(雄二各^ 隻)及對照群(雄雌各10隻),於試驗群,將上述試驗液以 乳酸球菌之加熱處理菌體換算為5,0 0 0毫克/公斤體重用田 管強制單次經口投予。於對照群,將精製水(雄·· 〇 · 7毫月 升、雌· 0 · 6毫升)以同樣之'方法投予,於將室溫設定為 土 2 °C、照明時間設定為1 2小時/日之飼育室飼育。又,、 試驗期間自由攝取水及飼料(商品名「老鼠、小老鼠用㈤; 形J 造) MTV if
看臟重果L
------ ---(公克) 〜 投 予前 投土後7日 投予後14日 — 雄 雌 雄 雌 雄 雌〜 對照群 30.7+ 1.2 26.7土 1.5 34.9± 1.4 29.2± 1.9 37.3± 1.9 31.0± l.f 群 3〇.7± 1.3 27.0± 1.4 35.5+ 2.0 -—---- 29,2± 1·7 38.3土 2.7 31.3+ 1.9^ 1230611 五、發明說明(8) 從表1 ’各群間雄 、 結果認為於乳酸球菌加重之增加並…差異。由以上之 之LD5G在5, 〇〇〇毫八:處理菌體之老鼠,單次經口投予 笔克’公斤體重以上。 將7週歲之Β Α丨R ι 公司)分成4群(每群各?〇隻雌二(:二曰本克雷亞(股) 制經口於試驗群投予γ ),用月s母群母日1次各自強 物(乾燥子實體0_3毫^/售屬布萊傑.目利之子實體抽出 微克/隻)之混合物、於史隻私)與乳酸球菌加熱處理菌體(10 體(20微克/隻)、於比較群較9群丨投予/L酸球菌加熱處理菌 、 較群2投予松蕈屬·布萊傑.目利之 子實體抽出物(乾燥子實體〇. 6毫克/隻)、⑨對照群投予磷 酉夂緩衝鹽水(phosphsate buffer saline' PBS)(0 2 毫升/ 隻)投予1週。 | 然後,於老鼠腹腔内注射李斯特菌(Listeria monocytogenes )使成2x 10 5CFU/隻後,觀察各群老鼠之 生存率。又’於試驗期間自由攝取水及飼料(商品名「粉 末飼料CE-2」、日本克雷亞公司製造)。 該結果如第1圖所示,於第1圖,試驗群、比較群1、》 與對照群相比,顯示非常高之生存率。尤其是於試驗群之 老鼠,連1隻都沒有死亡,明瞭李斯特菌之感染·增殖被 抑制。 置例2_ 與實施例1相同操作,從試驗開始1週前起,每日j次 於各群之老鼠強制經口投予試驗試樣,使感染李斯特菌。
1230611 五、發明說明(9) 然後採取老鼠之脾臟’測定脾臟所感染李斯特菌數之變 化。具體而言’感染後於苐1、3、5、7曰採取脾臟,將該 脾臟磨碎’懸濁於填酸緩衝鹽水中’將該懸濁液階段式稀 釋,移至「李斯特增邊培養基」(商品名、默克公司製 造)、培養(2 5°C、48小時),测定所出現之菌群體數,該 結果如第2圖所示。 由第2圖明瞭從感染後第3日起,於對照群,李斯特菌 數增加,相對地,於試驗群、比較群1、2則減少。尤其是 於試驗群,該減少之比例較大。
由該等結果明暸,將松蕈屬·布萊傑·目利之子實體 抽出物與乳酸球菌加熱處理菌體併用,經口攝取比各自單 獨攝取時顯示優越之感染抑制效果。 經由 體抽出物 抑制效果 下述之方法研究將松簟屬·布萊傑·目利之子實 與乳酸球菌加熱處理菌體併用,經口攝取,感染 之作用機序。 ^ 1 ) C D 3陽性α点型T細胞之表面抗原解析 了、於檢疫·驗收完成後將已飼育1週之BALB/C老鼠(雌、 I週歲、購自曰本查爾滋利巴(股)公司)分成2群(每群3 用胃管每群每日1次連續經口投予,於試驗群投予松 蕈凰 * /隹15 ·布萊傑·目利之子實體抽出物(乾燥子實體0·2毫克 )與乳酸球菌加熱處理菌體(2 〇微克/隻)之混合物(〇 _ 2 =升/隻)、於對照群投予磷酸緩衝鹽水(0 · 2毫升/隻)1週 從老鼠尾靜脈注射李斯特菌(Listeria
1230611 五、發明說明(10) monocytogenes )使成14χ i〇4CFlj/隻。又,於飼養期間 自由攝取水及飼料(商品名「粉末飼料CE-2」、日本克雷 亞公司製造)。 於接種李斯特菌後第5日將各群之老鼠屠殺,採取腸 管膜淋巴結。將該腸管膜淋巴結用毛玻璃夾住,懸濁於含 有10%FBS之RPMI-1640培養液(商品名、姻厝晉 (Introgen)公司製造)、洗淨,用不銹鋼篩子除去多餘之 組織片,分別調製試驗群及對照群之腸管膜淋巴結細胞 (以下稱為MLN)。 將各MLN懸濁於含有i〇%FBS之RPMI-1640培養液中, 使成5x 10 5個/毫升,於6個洞之培養盤(可寧克斯塔 (Corning Co star )公司製造)之每個洞注入1毫升。又, 於每個洞加入經絲裂霉素C(mi tomycin C)處理過、未處理 過之來自8人18/(:老鼠之脾細胞(5父105個)及李斯特菌加熱 死菌體(1· Ox 106CFU)混合作為刺激劑(Stimulator),於 37 °C、5%二氧化碳存在下培養48小時。上述未處理之老 鼠為未投予被驗物質及未進行菌接種之老鼠。 將各MLN用下述3種類之標識抗體(所有抗體均購自貝 克頓迪克森法敏公司(Becton Dickinson PharMingen)) 染色,進行細胞表面抗原之解析。 0〇丫-〇:1^〇111(〇7)標識抗003£111八1)/^1丁(:標識抗1^1^;3 mAb/PE標識抗CD4mAb /生物素(biotin)標識抗CD8mAb ②Cy標識抗CD3 ε mAb/FITC標識抗TCR a /5 mAb/PE標識 抗〔0 6 911^1)/生物素標識抗[0811^乜
313641.ptd 第14頁 1230611 五、發明說明(11) ③Cy標識抗CD3 ε mAb/F ITC標識抗TCR α Θ niAb/PE標識 抗CD 12 2mAb/生物素標識抗CD8mAb 亦即,於調製成1_ Ox l〇5個之MLN浮游液申添加上述 ①所示之標識抗體5微升,於4°C保溫45分鐘後用含有5% FBS之漢克(Hank’s)緩衝液洗淨2次,加入莎紅613(SA-RED 613)(商品名、姻厝晉公司製造)5微升,於4它保溫45分鐘 後用含有5% FBS之漢克(Hank,s)緩衝液洗淨3次。經由流 動細胞計算器(型式「Epics XL」、貝克曼卡特公司 (Beckman Coulter Inc·)製造)解析MLN之表面抗原,求 CD4—CD8+對於CD4+CD8-之比率,比較CD8陽性率。該結果如 表2所示。 【表2】 對於CD3 + α /3 TCR+細胞總數之% MLN(mean土 SD) 比率(Β/Α) CD4 + CD8-(A) CD4-CD8 + (B) 對照群 29.1+ 1.3 26.4土 1·2 0·9± 0.3 試驗群 20·4± 1·2 43·7± 1·2 2·1± 0·3 由表2明瞭,試驗群之CD8陽性率與對照群相比較為約 2倍高’經由攝取松蕈屬·布萊傑·目利之子實體抽出物 及乳酸球菌加熱處理菌體,CD8陽性率變高。 又’以CD69(初期活性標識器)及CD 122(1 L-2接受體/3 鏈)作為指標,檢討CD8陽性τ細胞有無活性化。亦即使用 上述②、③所示之標識抗體,依照與上述相同之方法解析 細胞之表面抗原。該結果如表3所示。
313641.ptd
第15頁 1230611 五、發明說明(12) 【表3】 對於0〇3+«々1^11+〇〇8 +細胞總數之% MLN(mean土 SD) CD69 + CD122 + 對照群 38.6 土 1.2 35.5土 1.8 試驗群 42.2± 1.2 43.8士 1.4 由表3明瞭,試驗群之CD69及CD122之陽性率比對照群 高,經由攝取松蕈屬·布萊傑·目利之子實體抽出物及乳 酸球菌加熱處理菌體,促進CD8陽性T細胞活性化。 (2)細胞漿(cytokin)產生量 與上述同樣操作,調製對照群及試驗群之MLN,加入 刺激劑,於37°C、在5%二氧化碳存在下培養48小時。 培養完成後回收培養液上層澄清液,用ELISA法測定 培養液上層澄清液中之細胞漿量(IL-2、IL-10、IL-12、 IFN-7 )。又,使用購自姻得晉(Endogen)公司之測定工具 測定IL-2、IL-12、IFN-τ ,使用購自安氏阿札科技公司 (AN’ ALYZA TECHNE Co_,)之測定工具測定IL-1 0。該結果 如第3圖所示。 由第3圖明瞭,於試驗群,τ helper l(Th-l)型細胞 漿之IFN_r及IL-12之產生量非常高,T helper 2(Th-2) 型細胞漿之IL-10之產生量非常低。 又,經由RT-PCR法研究細胞漿特異性mRNA之發現量時 明瞭,於試驗群,Th-Ι型細胞漿之IL-12、IFN-γ及TNF-α之mRNA顯現量增強。另一方面,Th-2型細胞漿之IL-10
313641.ptd 第16頁 1230611 五、發明說明(13) 之mRNA顯現量無差異。 已知,於感染李斯特菌等細胞内寄生細菌之生體内, 巨噬細胞或NK細胞被活化,各自產生IL-12及IFN-T該等 細胞漿更能使細菌抗原特異性CD8陽性T細胞活化,該結果 可經由具有細胞障礙活性(CTL)之CD8陽性T細胞將菌排 除。又,經由T細胞產生之TNF-α具有將嗜中性白血球或 巨噬細胞等食細胞集合在感染之局部地方之作用。 亦即,由上述之各結果認為,將松蕈屬.布萊傑.目 利之子實體抽出物及乳酸球菌併用、投予,更促進巨嘆細 胞或NK細胞之活化,IL-12及IFN-r等之產生量增大之結 果亦促進李斯特菌特異性CD8陽性細胞活化,菌之排除比 對照群更快。 【發明之效果】 如以上之說明’根據本發明,可提供以含有松蕈屬· 布萊傑·目利之子實體及/或菌絲體培養物之抽出物及乳 酸菌之加熱處理菌體作為有效成分之具有優越感染抑制效 果之組成物。又,經由將本發明之感染抑制組成物添加於 飲食品,可提供可預防病原菌等感染之飲食品。 、 本發明之感染抑制組成物係來自食品,安全性高,經 由攝取該組成物,可促進以細胞性免疫為中心之生體防〶 機構活性化,可期待預防病原菌等之感染之效果。 w
1230611 圖式簡單說明 【圖表之簡單說明】 【第1圖】為表示感染李斯特菌後老鼠生存率之圖 表。 【第2圖】為表示於感染李斯特菌之老鼠脾臟中李斯 特菌數測定結果之圖表。 【第3圖】為用ELISA法測定腸管膜淋巴結細胞(MLN) 培養液上層澄清液中細胞漿量(IL-2、IL-10、IL-12、 IFN-7 )之結果之圖表。
313641.ptd 第18頁

Claims (1)

  1. 0 :^无 §a iL — 5 _號 91110088_M 年/ / 月 Γ a__ 六、申請ϊ利範s 1. 一種感染抑制組成物,其特徵為:含有松蕈屬·布萊 傑·目利(Agaricus blazei Murill)之子實體及/或菌 絲體培養物之抽出物及乳酸菌之加熱處理菌體作為有 效成分。 2·如申請專利範圍第1項之感染抑制組成物,其中,該上 述乳酸菌係為乳酸球菌(E n t e r 〇 c 〇 c c u s f a e c a 1 i s )者。 3. 如申請專利範圍第1項或第2項之感染抑制組成物,其 中,該組成物係含有上述松蕈屬·布萊傑·目利 (Agaricus blazei Murill )之子實體及/或菌絲體培養 物之抽出物0 . 5至9 9. 5質量%、上述乳酸菌之加熱處理 菌體99. 5至0. 5質量%者。 4. 一種食品組成物,其特徵為:含有如申請專利範圍第1 項至第3項任何一項之感染抑制組成物。 5. 如申請專利範圍第4項之食品組成物,其中,該食品組 成物之每回攝取量係含有上述感染抑制組成物0. 0 1至 1 0公克者。
    313641 修正本.ptc 第19頁
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