TWI228508B - Thieno[2,3-d]pyrimidines with combined LH and FSH agonistic activity - Google Patents

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1228508 告本j A7 B7 五、發明説明（彳） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於具有糖蛋白激素激動活性之化合物，具 體地說是同時具有黃體生成激素（L Η)及卵泡刺激素（F S Η) 之激動活性之化合物，本發明還關於含此化合物之醫藥組 成物以及這些化合物在醫療上的用途，尤其是作爲控制生 育之用途。 促性腺激素在多種身體功能中具有重要的功能，包括 代謝、溫度調節及生殖過程，例如垂體促性腺激素FSH 及LH在刺激卵泡發育及成熟中扮演重要的角色，而LH 牽涉引發排卵過程（Sharp，R.M. Clin. Endocrinol 33:787-807，1990; Dorrington and Armstrong, Recent Prog. Horm. Res 35:30 1 -342, 1 979; Levy et al, Human Reproduction 15:2258-2265， 2000)。 目前，在臨床上LH是與FSH結合使用供卵巢刺激， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 也就是卵巢過度刺激用於試管內受精（IVF)及在不孕的不 排卵女性中引發排卵（Insler，V.，Int. Fertility 11:85 -97, 1988, Navot and Rosenwaks, J. Vitro Fert. Embryo Transfer i, 3- 1 3, 1 988),以及用於男性生殖性機能不足及男性不孕 症。 促性腺激素作用在特定性腺細胞型以引發卵巢及睪九 分化與類固醇生成，這些腦下垂體與胎盤的激素之作用是 由大群G-蛋白質偶合的受體一員之特定胞膜受體居間影 響，其包括有七個透膜區之單一多肽且能與Gs蛋白質作 用，導致腺苷酸環化酶之活化。 用於醫療目的之促性腺激素可以在低純度下從人類尿 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1228508 A7 B7 __ 五、發明説明（2) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 液源分離（Morse et al，Amer. J. Reproduct. Immunol. And Microbiology 11:143，1 9 8 8)，或者是，其可製備成再重組 的促性腺激素，除了這些蛋白質外，促性腺激素受體可以 經由合成的低分子量化合物活化或減活化，二環雜芳族化 合物經揭示在W0 00/61 586，經由試管內及活體內的實驗 ，其顯示可作爲LH激動劑使用。 在正常女性中，釋放腦下垂體LH及FSH之特徵是進 行排卵之中途週期起伏（mid-cycle surge)，排卵之特徵是 三個獨特的生理現象，也就是卵母細胞成熟、卵泡破裂及 黃體化，雖然LH-起伏在活體內引發這些現象之角色是毋 庸置疑，FSH-起伏之角色較不if楚，但是最近經顯示FSH 經由引發細胞丘產生確實可克服次黃嘌呤引發減數分裂停 止之因子而在試管內引發卵母細胞成熟（Lu et al，Mol.

Cell. Endocrinol. 1_64:19 1 - 1 9 6, 2000)，此因子咸信是減數 分裂活化的固醇（MAS)。 在排卵引發中，需要提供LH之效應作爲主要成份， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 根據本發明之化合物當在強化生育之實驗方案中使用時， 經發現具有特別有利的性質，在這些化合物中，LH活性 伴隨著FSH活性。 因此本發明提供低分子量的化合物，其除了有LH活 性之外，還意外地有FSH活性，通常這些化合物是噻嗯 並[2,3-d]嘧啶類其在嘧啶環之4-位置經在相間位置經取代 之苯基取代。 本發明係關於根據通式I之噻嗯並[2,3-d]嘧啶衍生物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5- 1228508 A7 B7 五 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 、發明説明（

H3C

R1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (式I) 或其藥學上可接受之鹽類，其中N(Ri)R2是連接在 (2-6C)雜環院基環。 最佳的化合物是第三丁基5_胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-( π丫丁啶-1-基）-乙醯胺基）-苯基）_噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 ;第三丁基5-胺基-2-甲硫基_4-(3-(2-(嗎福啉-4-基）-乙醯 胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺；第三丁基5-胺 基-2-甲硫基-4-(3-(2-(硫嗎福啉-4-基）-乙醯胺基）-苯基）-噻 嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺；第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2 -(六氫吡啶-1 -基）-乙醯胺基）-苯基）_噻嗯並[2，3 - d ]嘧啶-6-醯胺；第三丁基5 -胺基-2-甲硫基- 4- (3-(2-(吡咯啶-1-基 )-乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺及第三丁基 5-胺基-2-甲硫基- 4-(3-(2-(六氫吡啡-1-基）-乙醯胺基）-苯基 )-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺。 式I定義之名詞連接在（2-6C)雜環烷基環係指R1及 R2 —起與和其連接之氮原子形成含2-6個碳原子之環， 視需要含一或多個選自N、0及/或S的雜原子，此環之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6- 1228508 A7 B7 五、發明説明（4) 實例是吖丁啶、吡略啶、六氫吡啶、六氫吡啡、嗎福啉及 硫嗎福啉。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經顯示上述式I化合物具有LH及FSH激動活性，在 使用分別是穩定轉染人類LH或FSH受體之CHO細胞之 試管內生物試·驗中，發現LH受體之EC5〇低於5.10_8莫耳 濃度而FSH受體之EC5〇低於10_5莫耳濃度，通常FSH活 性範圍是從約1%的LH激動刺激至約10%之LH激動刺 激之活性。 本發明也關於一種醫藥組成物，其含通式I之噻嗯並 [2,3-d]嘧啶衍生物化合物或其鹽類。 據此，根據本發明之化合物可以在醫療中使用，本發 明之另一個方面是關於通式I之噻嗯並[2,3-d]嘧啶化合物 用於生產藥劑供控制生育更宜是引發排卵之用途，本發明 化合物可用於活化LH及FSH受體，本發明化合物因此可 在治療女性生育問題之方法中使用。 經濟部智慧財4局Μ工消費合作社印製 對於醫療用途，式I化合物之鹽類是其中抗衡離子是 藥學上可以接受，但是根據式I之鹼之酸加成鹽類也可用 於例如製備或純化藥學上可以接受的化合物，不論是藥學 上可以或不可以接受的全部鹽類，都包含在本發明之範圍 內。 酸加成鹽之實例包括衍生自無機酸例如氫氯酸、磷酸 、硫酸，較宜是氫氯酸，及有機酸例如檸檬酸、酒石酸、 醋酸、乳酸、馬來酸、丙二酸、富馬酸、乙醇酸、琥珀酸 等。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 1228508 A7 B7 五、發明説明（5) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本文中也稱爲活性成份之式I化合物或其藥學上可 以接受的鹽類之合適用藥途徑是肌肉內注射、皮下注射、 靜脈內注射或腹膜內注射、口服及鼻內用藥，較宜口服此 化合物，活性成份或其醫藥組成物用藥之確實劑量及攝生 法，必須由所要達到的醫療效應（治療不孕症、避孕）決定 ，且將隨著特定的化合物、用藥途徑、及服用藥物的個別 患者之年齡及情形而改變。 通常，不經腸道用藥所需的劑量低於其他用藥方法， 其更與吸收相關，但是用於人類之劑量較宜含0.〇〇〇 1 -25 毫克每公斤體重，所要的劑量可呈現爲單一劑量或多重次 劑量並在整天之適當間隔下用藥，在女性病人之情形下， 劑量可以在整個月經週期的適當每日間隔下用藥用於卵配 固定或作爲單一劑量用於引發排卵，用藥之劑量及攝生法 在女性及男性病人之間可以不同。 在試管內或活體外使用之情形下，例如在IVF應用時 ，本發明化合物是在約0.01-5微克/毫升之濃度下在培養 介質中使用。 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 本發明因此也關於一種醫藥組成物，其含根據式I之 噻嗯並[2,3-d]嘧啶化合物並摻混藥學上可以接受的輔劑， 並視需要使用其他醫療藥劑，輔劑必須是”可以接受”係指 可以和組成物中的其他成份相容且不會使其病人惡化。 醫藥組成物包括合適用於口服、直腸、鼻子、局部（ 包括經皮、頰或舌下）、陰道或不經腸道（包括皮下、肌肉 內、靜脈內及皮內）用藥之組成物，這些組成物可以經由 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -8 - 1228508 A7 B7 五、發明説明（ 性成份，可植入的醫藥裝置之製備方法已知於此向技藝， 例如揭不在歐洲專利〇，3 0 3，3 0 6 (A K Z〇N. V.)。 據此，根據本發明之化合物可用在與天生的L Η相同 之臨床目的，其具有FSH活性之優點，顯現改變的安定 性質並可不同地用藥。 製備式（I)代表之本發明化合物可以普遍地經由使通 式（II)化合物其中Q = C1或Br與式（III)之（環狀）二級胺類 在適當溶劑例如N，N-二甲基甲醯胺或THF中，在室溫及 在三級鹼例如N，N-二異丙基乙基胺（DIPEA)存在下之親核 性取代反應。

Crr° ΠΓΥΎ I Γ2 + /R1 ΊΓ Γ2 HN R2 Η〇 ⑼4 ⑽ ο Γί / R1 製備式（II)之衍生物其中Q = Cl或Br可以經由使式（V) 之間位苯胺衍生物與式（IV)之醯基氯其中Q = C1或Br在三 級鹼例如N，N -二異丙基乙基胺存在下，在適當溶劑例如 二氯甲烷或THF中之立體選擇性醯基化反應。 (Π) (IV) -—-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10 1228508 A7 B7 五、發明説明（

8J 製備式（V)化合物可使用適當的還原劑例如氯化錫（II) 在質子溶劑例如乙醇中，在氫氯酸存在下並在高溫下進行 此項技藝中已知的還原反應（J. Heilbron，J· Chem· Soc， 1 279 ( 1 940))。

(V) 噻嗯並嘧啶（VI)可在偶合劑例如〇-(苯並三唑-1-基）-N，N，N\N、四甲基鈮四氟硼酸鹽（TBTU)或溴三吡咯啶鐵六 氟磷酸鹽（PyBrOP)及三級鹼例如N，N-二異丙基乙基胺之影 響下，經由羧酸（VII)與第三丁基胺之縮合作用而獲得。

經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 • (VII) 乙酯（VIII)與對應羧酸（VII)之皂化作用是在鹼例如氫 氧化鋰、氫氧化鉀或氫氧化鈉存在下，在二鳄烷水溶液中 並在高溫（80°C至迴流）下進行。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 1228508 A7 B7 五、發明説明（9)

(VII) 二環（VIII)是在N，N-二異丙基乙基胺存在下，經由式 (X)之氯化物與锍基醋酸乙酯之取代反應，隨後經由中間 物硫醚（IX)之鹼催化的環閉合反應而形成，此種噻嗯並 [2,3-d]嘧啶環形成經揭示在：S.A. Abdel-Hady，M.A. Badawy，Y.A. Ibrahim，Sulfur Lett. 9，101 (1989)及 S. T u m k e v i c i u s，L i e b i g s A η n ·，1 7 0 3 ( 1 9 9 5) o

(VIII) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (IX) 合適用於環化反應之情形是在乙醇中的乙醇鈉或在甲 苯/乙醇（1/1，v/ν)中的N，N-二異丙基乙基胺並在迴流溫度 下進行。

〇 + r~K HS OEt (X) (IX) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-12- 1228508 A7 B7 五、發明説明（y (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 測定受體結合之方法以及在試管內與活體內測定促性 腺激素生物活性之方法已經熟知，通常，表現的受體與測 試化合物接觸並測量結合或功能回應之刺激或抑制。 爲了測量功能回應，將分離的DNA編碼之LH或FSH 受體基因，較宜是人類受體，表達於合適的宿主細胞中， 此細胞可以是中國大頰鼠卵巢細胞，但是其他細胞也合適 ，較佳的細胞是哺乳動物來源Uia et al，Mol. Endocrin.， 5:759-776· 1991) o 經濟部智葸財產局負工消費合作社印製 建造再重組的LH或FSH表達細胞系之方法熟知於此 項技藝（Sambrook et al·，Molecular Cloning: a Laboratory Mannul, Gold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，larest ediion)，受體之表達是經由表達的DNA編 碼所要的蛋白質而達成，進行誘變之部位、其他序列之結 紮、PCR及建造合適的表達系統之技術目前都熟知於此項 技藝，部份或全部DNA編碼的所要蛋白質可以使用標準 的固相技術合成地建造，較宜包括限制部位使結紮容易， 用於轉錄及轉譯包含的編碼序列之合適的控制元素可以提 供至DNA編碼的序列，已經熟知現在已有表達系統可與 多種宿主相容，包括原核生物宿主例如細菌及真核生物宿 主例如酵母、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、鳥類 細胞等。 表達受體之細胞隨後與測試化合物接觸以觀察結合， 或功能回應之刺激或抑制。 或者是，可以使用含表達受體之分離的細胞膜測量化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14- 1228508 A7 B7 五、發明説明（^ 合物之結合。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 放射活性或螢光標示的化合物可以用於測量結合，可 以使用人類再重組的LH或FSH作爲參考化合物，或者是 進行競爭性結合測試。 另一種測試法包括經由測量受體居間影響的cAMP累 積之刺激而檢視L Η或F S Η受體激動化合物，據此，此方 法包括在宿主細胞之細胞表面表達受體，並將細胞暴露在 測試化合物，然後測量c A Μ Ρ之量，c A Μ Ρ之量將根據測 試化合物結合至受體之抑制或刺激效應而降低或增加。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 除了直接測量例如暴露細胞之cAMP量以外，細胞可 用於其中除了轉染受體結合的DNA外，也轉染第二種 DNA，編碼的受體基因其表達是回應cAMP之量，此受體 基因可以是cAMP可引發的或建造的方式是連接至新穎的 cAMP回應元素，通常，受體基因表達可經由任何回應元 素反應cAMP之變化量而控制，合適的受體基因是例如鹼 性磷酸酶、螢火蟲螢光素酶及綠螢光蛋白質，此轉活化測 試法之原理熟知於此項技藝且揭示在例如Stratowa，Ch， Himmler, A and Czernilofsky, A.P. (1995) Curr. Opin. B i o t e c h η o 1. 4，5 7 4 o 對於在LH或FSH受體上之選擇性活化化合物，在 1〇_5莫耳濃度之測試必須導致大於當LH或FSH是作爲參 考物質使用時之20%最大活性，另一種標準是EC^値， 其必須<10·5莫耳濃度，較宜<1(Τ7莫耳濃度。 熟諳此藝者將了解所要的ECs。値是決定於測試化合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15- 1228508 A7 B7 五、發明説明（^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 物，例如EC5。値低於10_5莫耳濃度之化合物通常視爲藥 劑選擇之候選物，較宜此値是低於1 〇_7莫耳濃度，但是較 高EC^値卻選擇性對於特定受體之化合物，可以是更佳 的候選物。 檢視LH受體激動性化合物也可以使用小白鼠Ley dig 細胞生物測試法進行（Van Damme，M.，Robersen，D. and Diczfalusy, E. ( 1 974). Acta Endocrinol. 77_ , 655 -67 1 Mannaerts, B., KlOosterboer, H. and Schuurs, A. (1987). Neuroendocrinology of reproduction. R. Rolland et al. Eds., Elsevier Science Publishers B.V.，49-58)，在此測試法中， LH受體刺激居間影響的睪九素製造可經由從雄性小白鼠 分離的Leydig細胞測量。 化合物之FSH激動活性也可根據Nayudu, P. and Osborn, S. (1992, J. Reproduction and Fertility 9_5_ , 349-362)在活體外模式中使用培養的小白鼠卵泡測定，據此， 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 將小白鼠卵巢的卵泡分離並在FSH激動化合物存在下培 養以引發卵泡成長，在培養介質中測量卵泡直徑及雌二醇 可顯示卵泡成長。 爲了測量化合物在活體內之LH活性，可以硏究未成 熟的小白鼠之排卵引發，在此測試法中，未成熟的雌性小 白鼠用尿FSH處理且約48小時後用LH激動化合物處理 ，將經LH激動處理後的動物殺死並用顯微鏡評估輸卵管 內的卵數。 爲了測量化合物在活體內之FSH活性，將未成熟的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -16- 1228508 A7 __ _JB7_ 五、發明説明（^ 取，乾燥（M g S〇4)並在減壓濃縮。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 產量：28.0克 MS-ESI ·· [M + H]、390.4 TLC : Rf = 0.5，矽膠，庚烷/Et〇Ac = 3/2 (v/v) (d) . 5-胺基- 4-(3-硝基苯基）-2-甲硫基-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯 將乙基5-氰基-4-(3-硝基苯基）-2-甲硫基- 6-(乙酯基甲 硫基）-嘧啶（實例1(c)，28.0克）及DIPEA (30毫升）在甲苯 U50毫升）及EtOH (150毫升）混合物中的混合物在迴流溫 度（10CTC)攪拌16小時，然後使混合物冷卻至室溫並在減 壓下濃縮，經由與甲苯一起蒸發將沈澱物中殘留的DIPEA 去除。 產量：28.0克 MS-ESI : [Μ + ΗΓ二391.2 TLC:Rf二0:6，矽膠，庚烷/Et〇Ac = 3/2 (v/v) 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 (e) · 5-胺基-4-(3-胺基苯基）-2-甲硫基-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯 將EtOH (400毫升）添加至5-胺基- 4-(3-硝基苯基）-2-甲硫基-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯（實例1(d)，28.0克） 、濃HC1水溶液（15毫升）及氯化錫（II) (41·0克）在1，4 -二 噚烷（400毫升）中的混合物，將混合物在901攪拌16小 時，然後使混合物冷卻至室溫並在減壓下濃縮，將殘留物 懸浮在EtOAc (1000毫升），加入4當量濃度NaOH水溶液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -19- 1228508 A7 B7 五、發明説明（4 使得到pH爲1 0-11，將混合物激烈攪拌並將有機層分離 ，乾燥（MgSOO並在減壓下濃縮。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 產量：2 1.0克 MS-ESI : [Μ + ΗΓ二361.0 TLC : R「0.6，矽膠，庚烷/Et〇Ac = 3/2 (v/v) (Ο. 5-胺基-4-(3-胺基苯基）-2-甲硫基-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-羧酸 將氫氧化鉀（32.4克）添加至5-胺基-4-(3-胺基苯基）-2-甲硫基-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯（實例1(e)，21.0克） 在1，4-二噚烷（300毫升）及水（100毫升）混合物中的溶液， 在90°C經16小時後，使混合物冷卻至10°C並在激烈攪拌 下加入2當量濃度檸檬酸水溶液（300毫升），將所得的沈 澱物過濾，用水（180毫升）淸洗並在真空乾燥。 產量：14.0克 MS-ESI : [Μ + ΗΓ = 333.0 TLC: Rf = 0.5，矽膠，DCM/Me〇H二9/1 (v/v) 經濟部智慧財產局g(工消f合作ii印製 (g).第三丁基5-胺基-4-(3-胺基苯基）-2-甲硫基-噻嗯並 [2,3-d]嘧啶-6-醯胺 將TBTU (16.1克）添加至5-胺基-4-(3-胺基苯基）-2-甲 硫基-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-羧酸（實例1(f), 14.0克）、 DIPEA (17.4 毫升）及第三丁基胺（7.3 克）在 DCM/DMF (1/1， v/v，250毫升）之溶液，在室溫經3小時後，將混合物用 DCM (50毫升）稀釋，用飽和的NaHC〇3水溶液（3x100毫升） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公®) -20- 1228508 A7 B7 五、發明説明（^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 、0.1當量濃度HC1水溶液（100毫升）及水（100毫升）淸洗 ，將有機層在減壓下濃縮，將粗產物經由從溫熱的無水 E t〇Η (3 0 0毫升）結晶而純化。 產量：1 0.5克 MS-ESI : [Μ + Η] +二3 8 8.2 HPLC ·· 30.72 分鐘，Luna C-18(2)，5 微米， 250x2.0毫米，偵測UV = 210毫微米，爐溫=4(TC，流速 = 0.25毫升/分鐘，流洗液水/ACN/Me〇H = 90/9.5/0.5至 0/95/5，操作時間=50分鐘。 (h).第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-U-溴乙醯胺基）-苯基 )-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 將溴乙醯氯（615毫克）添加至第三丁基5-胺基-4-(3-胺 基苯基）-2-甲硫基-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺（實例1(g)， 1.08克）及DIPEA (2·43毫升）在無水DCM (20毫升）之溶液 ，在室溫經3小時後，將混合物用DCM稀釋，用飽和的 NaHCCh水溶液淸洗，乾燥（MgS〇4)並在減壓下濃縮，將粗 產物在矽膠上使用庚烷/EtOAc = 3/2 (v/v)作爲流洗液經由 層析法純化。 產量 ·· 9 1 0毫克 MS-ESI : [Μ + ΗΓ二510·2 TLC:Rf = 0.3，矽膠，庚烷/Et〇Ac = 3/2(v/v) (1).第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-(吖丁啶-i-基）-乙 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 1228508 A7 _ B7 五、發明説明（^ 醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-溴乙醯胺基）-苯 基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺（實例1(h)，91毫克）添加至 吖丁啶鹽酸鹽（120毫克）及N，N-二異丙基乙基胺（0.25毫升） 在DCM (5毫升）之溶液，在室溫經16小時後，將混合物 用飽和的，NaHCOs水溶液淸洗，乾燥（MgS〇4)並在減壓下 濃縮，將粗產物使用Luna C-18管柱在下列梯度經由 HPLC純化UTFA7JC溶液+10%ACN水溶液 /ACN = 90/10至10/90 (v/v)在30分鐘，然後使標題化合物 從0.1% TFA之水冷凍乾燥。 產量：56毫克（TFA-鹽） MS-ESI : [M + H]、485.2 HPLC : Rt=13.45 分鐘，管柱 Luna C-18(2)，3 微米， 100x2.0毫米，偵測UV = 210毫微米，爐溫=4(TC，流速 二0.25毫升/分鐘，流洗液磷酸鹽緩衝液50毫莫耳濃度pH 2.1/水/ACN= 10/70/20 至 10/10/80(v/v/v)，操作時間=20 分 鐘。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實例2 第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-(嗎福啉基-4-基）-乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 將嗎福啉（5.0毫升）添加至第三丁基5 -胺基-2 -甲硫基-4-(3-(2-溴乙醯胺基）-苯基）_噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺（實 例1 (h)，1.0克）在T H F (5 0 升）之溶液，在室溫經1 6小 本紙張尺度適i中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） " ~ ~ -22- 1228508 A7 ___B7 五、發明説明（2匕 時後，將混合物在減壓下濃縮，將殘留物在矽膠上使用 DCM/MeOH = 9/l作爲流洗液經由管柱層析法純化，將粗產 物使用Luna C-18管柱在下列梯度經由HPLC進一步純化 :0.1%TFA 水溶液 / 水/ACN = 3/97/0 至 3/7/90 在 30 分鐘， 使標題化合物從0.1 % TFA水溶液及水之混合物冷凍乾燥 〇 產量：215毫克（TFA-鹽） MS-ESI : [Μ + ΗΓ二515·2 HPLC : U0.62 分鐘，管柱 Luna C-18(2)，5 微米， 150x2毫米，偵測UV = 210毫微米，爐溫=4CTC，流速 =0 · 2 5毫升/分鐘，流洗液磷酸鹽緩衝液5 0毫莫耳濃度p Η 2.1/水/ACN/Me〇H=10/72/17/l 至 10/18/68/4 (ν/ν)，操作時 間二40分鐘。 實例3 第三丁基5-胺基-2-甲硫基- 4-(3-(2-(硫嗎福啉基-4-基 )-乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 將硫嗎福咐（2 · 1 6毫升）添加至第三丁基5 -胺基-2 -甲 硫基-4 - (3 - (2 -溴乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2，3 - d ]嘧啶-6 -醯 胺（實例1(h), 1.09克）在THF (50毫升）之溶液，在室溫經 1 6小時後，將混合物用D C Μ稀釋，用飽和的n a H C 0 水 溶液淸洗，乾燥（MgS〇4)並在減壓下濃縮，將粗產物使用 Luna C -1 8管柱在下列梯度經由HPLC純化·· 〇. 1 % TFA水 溶液+10%ACN水溶液/ACN=100/0至10/90在30分鐘，然 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 -23- 1228508 A7 B7 五、發明説明（d 後使標題化合物從用1當量濃度HC1水溶液酸化之水冷凍 乾燥。 產量：8 1 6毫克 MS-ESI : [Μ + ΗΓ二531.2 HPLC : Rt=14.72 分鐘，管柱 Luna C-18(2)，3 微米， 100x2毫米，偵測UV = 210毫微米，爐溫二40°C，流速 = 0.25毫升/分鐘，流洗液磷酸鹽緩衝液50毫莫耳濃度pH 2.1/水/ACN/Me〇H=10/72/17/l 至 10/18/68/4 (v/v)，操作時 間=20分鐘。 實例4 弟二丁基5 -肢基-2-甲硫基- 4- (3-(2-(六氯卩比卩疋-1-基）-乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 將六氫吡啶（3.0毫升）添加至第三丁基5-胺基-2-甲硫 基-4-(3-(2-溴乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-(1]嘧啶-6-醯胺（ 實例1(h)，1.0克）在CH2Ch (50毫升）之溶液，在室溫經 1 6小時後，將混合物減壓下濃縮，將殘留物在矽膠上使 用DCM/MeOH = 9/l作爲流洗液經由管柱層析法純化，將粗 產物使用Luna C-18管柱在下列梯度經由HPLC進一步純 化：0.1%TFA水溶液/ACN=100/0至10/90在30分鐘，使 標題化合物從0.1 % TF A水溶液及水之混合物冷凍乾燥。 產量：851毫克（TFA -鹽） MS-ESI : [Μ + Η]、513·2 HPLC : Rt = 37.3 分鐘，管柱 Luna C-18(2)，5 微米， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局"'a (工消費合作社印製 -24 - 1228508 A7 B7 五、發明説明（d

150x2毫米，偵測UV = 210毫微米，爐溫=40°C，流速 = 0·25毫升/分鐘，流洗液磷酸鹽緩衝液50毫莫耳濃度PH (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2.1/水 / ACN = 20/60/20 至 20/0/80 (v/v)，操作時間=40 分鐘 〇 實例5 第三丁基5-胺基-2-甲硫基- 4-(3-(2-(吡咯啶-1-基）-乙 醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 將吡咯啶（3.0毫升）添加至第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-溴乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺（實 例1(h)，1.0克）在CH2C12 (50毫升）之溶液，在室溫經16 小時後，將混合物在減壓下濃縮，將殘留物在矽膠上使用 DCM/MeOH = 9/l作爲流洗液經由管柱層析法純化，將粗產 物使用Luna C-18管柱在下列梯度經由HPLC進一步純化 :0.1%TFA水溶液/ACN=100/0至10/90在30分鐘，使標 題化合物從0.1 % TFA水溶液及水之混合物冷凍乾燥。 產量：616毫克（TFA-鹽） 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 MS-ESI ·· [Μ + ΗΓ二499.2 HPLC ·· Rt = 37.5 分鐘，管柱 Luna C-18(2)，5 微米， 150x2毫米，偵測UV = 210毫微米，爐溫=40°C，流速 = 0.25毫升/分鐘，流洗液磷酸鹽緩衝液50毫莫耳濃度pH 2.1/水 /ACN = 20/60/20 至 20/0/80 (v/v)，操作時間=40 分鐘 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） -25- 1228508 A7 B7 五、發明説明（^ 實例6 第三丁基5-胺基-2-甲硫基- 4-(3-(2-(六氫吡畊-1-基）-乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 將六氫吡畊（2.5克）添加至第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-溴乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺（實 例1(h)，1.0克）在CH2C12 (50毫升）之溶液，在室溫經16 小時後，將混合物在減壓下濃縮，將殘留物在矽膠上使用 DCM/MeOH = 7/l作爲流洗液經由管柱層析法純化，將粗產 物使用Luna C-18管柱在下列梯度經由HPLC進一步純化 :0.1%TFA水溶液/ACN=100/0至10/90在30分鐘，使標 題化合物從0.1 % TFA水溶液及水之混合物冷凍乾燥。 產量：7666毫克（雙TFA -鹽） MS-ESI : [Μ + Η]、514·4 HPLC : Rt = 33.7 分鐘，管柱 Luna C-18(2)，5 微米， 150x2毫米，偵測UV = 210毫微米，爐溫=40°C，流速 二0.25毫升/分鐘，流洗液磷酸鹽緩衝液50毫莫耳濃度pH 2.1/水 / ACN = 20/60/20 至 20/0/80 (v/v)，操作時間=40 分鐘 實例7 CHO-LH及CHO-FSH試管內生物活性 在穩定轉染人類LH受體且協同轉染cAMP回應元素 (CE)/促進劑引起表達螢火蟲螢光酶受體基因之中國大頰 鼠卵巢（CHO)細胞中測試化合物之LH激動活性，配體對 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、·!' 經濟部智慧財產局g(工消貴合作社cr製 -26 - 1228508 A7 B7 五、發明説明（j

Gs-偶合的LH受體之結合將導致cAMP增加，其隨後將引 發增加螢光酶受體之轉活化，使用螢光計數器定量螢光酶 訊號，對於測試化合物，計算EC5。値（造成半-最大（50% ) 剌激之濃度），此目的係使用軟體程式GraphPad PRISM, 3.0 版（GraphPad software Inc.，San Diego) 〇 在類似的方式下，在轉染螢光酶受體基因及人類fsh 受體之CH0細胞測試化合物之FSH激動活性，結果列在 表1 〇 活體內生物活性 _ 在未成熟的小白鼠中硏究排卵引發以測試LH/FSH受 體激動化合物之活體內活性，在此測試法中，未成熟的雌 性小白鼠用尿FSH (Humegon 12.5 IU/動物）處理，約48小 時後將動物在50毫克/公斤之劑量下用LH/FSH激動化合 物處理，LH/FSH激動處理經24小時後將動物殺死並顯微 鏡評估輸卵管內的卵數，結果列在表1。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 『装. 訂 經濟部智慧財產局肖工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） -27- 1228508 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（d 表1 實例 編號 名稱 EC50 CHO LHR (M) EC50 CHO FSHR (M) 測試動 物數 卵平均數 (50毫克/公 斤腹膜內） 1 第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-(吖丁啶-1-基）-乙醯胺基）-苯基 )-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 3.86E09 4.62E-07 15 1.6 2 第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-(嗎福琳-4-基）-乙釀胺基）-苯基 )-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 2.24E-09 4.20E-08 10 9.3 3 第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-(硫嗎福啉-4-基）-乙醯胺基）-苯 基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 8.03E-09 1.04E-06 10 19.8 4 第三丁基5-胺基-2-甲硫基-‘θα·-(六 氫吡啶-1-基 ）-乙 醯胺基）-苯 基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 6.63E-09 2.01E-07 5 第三丁基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-(吡咯啶-1-基）-乙醯胺基）-苯基 )-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 6.68E-09 4.80E-07 6 第三丁基5-胺基-2-甲硫基Ι-Ο-β-(六氫吡畊-1-基）-乙 醯胺基）-苯 基）-噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺 3.17E-09 1.50E-07 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） - 28-

Claims (1)

1. ~一一一吻一…，一 __丨丨丨咖丨 義,,|| _ 一122嶋K| D8 申請專利範圍 附件四A:第91116284號修正後無劃線之 中文申請專利範圍替換本民國93年11月8日呈 1 . 一種通式I之噻嗯並[2，3 - d ]嘧啶衍生物，

   -裝— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 或其藥學上可接受之鹽，其中及R2 一起與其連接之 氮原子形成含有2-6個碳原子之環，其可選擇地含有一或 多個選自N、〇及/或S的雜原子。 2 ·如申請專利範圍第1項之化合物，其係選自第三丁 基5-胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-(吖丁啶_卜基卜乙醯胺基）_苯 基）·噻嗯並[2,3-d]嘧啶-6-醯胺；第三丁基5_胺基-2_甲硫 基-4 - (3 - (2 -(嗎福啉· 4 -基）-乙醯胺基卜苯基广噻嗯並[2，3 · d ] 嘧啶-6-醯胺；第三丁基s胺基-2-甲硫基-4-(3-(2-(硫嗎福 啉-4 -基）-乙醯胺基）-苯基）-噻嗯並[2，3 - d ] il·密d定-6 -醯胺；第 三丁基5 -胺基-2 -甲硫基-4 - (3 - (2 -(六氫吡啶-1 _基卜乙醯胺 基）-苯基）-噻嗯並[2，3 - d ]嘧啶-6 -醯胺；第三丁基5 ·胺基—2 _ 甲硫基-4-(3-(2-(吡咯啶-1_基）-乙醯胺基）—苯基）_噻嗯並 [2，3 - d ]喃卩定-6·醯胺或第三丁基5 -胺基-2-甲硫基 六氫吡哄-1-基）-乙醯胺基卜苯基）—噻嗯並[2,3_d]嘧陡醯 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1228508 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 胺。 3 ·如申請專利範圍第1或2項之化合物，其係用於活 化黃體生成激素（LH)和卵泡刺激激素（FSH)。 4. 一種用於治療與LH和FS Η活性有關之生育障礙之 醫藥組成物，其包含申請專利範圍第1或2項之噻嗯並 [2，3-d]嘧啶化合物或其藥學上可接受之鹽或溶劑化物，並 摻混藥學上可接受的輔劑。 5 ·—種申請專利範圍第1或2項之噻嗯並[2，3 - d ]嘧 啶化合物於製造藥劑以治療與LH和FSH活性有關之生育 障礙上之用途。 •裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -之-