KR20040029134A - ＬＨ 및 ＦＳＨ의 조합 작용 활성을 갖는티에노[2,3-ｄ]피리미딘 - Google Patents

ＬＨ 및 ＦＳＨ의 조합 작용 활성을 갖는티에노[2,3-ｄ]피리미딘 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 티에노[2,3-d]피리미딘 유도체 또는 이의 약학적 허용염에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 LH 및 FSH 수용체 활성화 활성을 지니며, 생식능력 조절 치료에 사용할 수 있다.
화학식 I
상기 화학식에서, N(R1)R2는 (2-6C)헤테로시클로알킬 고리에서 결합된다.

Description

ＬＨ 및 ＦＳＨ의 조합 작용 활성을 갖는 티에노[2,3-ｄ]피리미딘{THIENO[2,3-D]PYRIMIDINES WITH COMBINED LH AND FSH AGONISTIC ACTIVITY}
본 발명은 당단백질 호르몬 작용 활성을 갖는 화합물, 구체적으로 황체형성 호르몬(LH) 및 난포 자극 호르몬(FSH) 작용 활성을 모두 갖는 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들을 함유하는 약학 조성물 및, 의약 치료에, 특히 생식 능력의 조절로서 사용하기 위한 이들 화합물의 용도에 관한 것이다.
생식선자극호르몬은 대사, 체온 조절 및 생식 과정을 비롯한 각종 신체 기능에 있어서 중요한 작용을 한다. 뇌하수체 생식선자극호르몬 FSH 및 LH는, 예를 들어 난포 발생과 성숙을 자극하는 중추적 역할을 하는 반면에, LH는 배란 과정 유도에 관여한다. 문헌 [Sharp, R.M.Clin. Endocrinol33:787-807, 1990; Dorrington and Armstrong,Recent Prog. Horm. Res35: 301-342, 1979; Levy et al,Human Reproduction15:2258-2265, 2000].
현재, 무배란 불임 여성에서의 난소 자극, 즉 체외 수정(IVF)을 위한 난소 과다자극과 배란 유도를 위해 [문헌: Insler, V.,Int. J. Fertility33:85-97, 1988, Navot 및 Rosenwaks,J. Vitro Fert. Embryo Transfer5:3-13, 1988], 그리고 남성 생식선저하증 및 남성 불임을 위해 LH를 FSH와 병용하여 임상적으로 사용하고 있다.
생식선자극호르몬은 난소 및 고환의 분화 및 스테로이드형성을 개시하는 특정 생식선 세포 종류에 작용한다. 이들 뇌하수체 및 태반 호르몬의 작용은 G-단백질이 커플링된 수용체의 거대군 중 그 구성원인 특이적 혈장막 수용체에 의해 매개된다. 이들은 7개의 경막 도메인과 단일 폴리펩티드로 구성되며 Gs 단백질와 상호작용할 수 있어서, 아데닐 시클라제의 활성화를 유도한다.
치료 목적의 생식선자극호르몬은 인간의 뇨 공급원으로부터 분리할 수 있으며, 그 순도는 낮다 [문헌: Morse et al,Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology17:143, 1988]. 또는, 이들 호르몬은 재조합 생식선자극호르몬으로서 제조할 수 있다. 생식선자극호르몬 수용체는, 이들 단백질 외에도 합성 저분자량 화합물에 의해 활성화 또는 탈활성화될 수 있다. 이환식 헤테로방향족 화합물은 WO00/61586호에 개시되어 있다. 시험관내 및 생체내 실험에 의해, 이들 화합물이 LH 작용제로서 유용한 것이 확인되었다.
정상 여성에서, 뇌하수체 LH 및 FSH의 방출 특징은 배란이 일어나기에 앞서 월경중기에 급증한다는 점이다. 배란은 3가지 특징적인 생리적인 현상, 즉 난모세포 성숙, 난포 급증 및 황체화를 특징으로 한다. 이들 현상의 생체내 유도에 있어서 LH-급증의 역할에 대해서는 이의가 없지만, FSH-급증의 역할은 아직 명확하지 않다. 그러나, FSH는, 히포크산틴이 유도하는 감수분열 정지를 긍정적으로 해소하는 인자를 난모세포 더미가 생성하도록 하여 시험관내 난모세포 성숙을 유도한다는 것이 최근에 밝혀졌다 [문헌: Lu et al,Mol. Cell. Endocrinol.164:191-196,2000]. 이 인자는 감수분열 활성화 스테롤(MAS)인 것으로 생각된다.
배란 유도에서, 주요 성분으로서의 LH의 효과를 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명에 의하면, 화합물은 개선된 생식능력을 위한 프로토콜에서 사용시 특히 이로운 성질을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 화합물에서는 LH 활성이 FSH 활성을 수반한다.
그래서, 본 발명은 LH 활성 이외에, 예상밖으로 FSH 활성을 갖는 저분자량 화합물을 제공한다. 일반적으로, 이러한 화합물은 피리미딘 고리의 4-위치에서 페닐기가 치환되고, 다시 메타 위치에서 치환된 티에노[2,3-d]피리미딘이다.
본 발명은 하기 화학식 I의 티에노[2,3-d]피리미딘 유도체 또는 이의 약학적 허용염에 관한 것이다.
상기 화학식에서, N(R1)R2는 (2-6C)헤테로시클로알킬 고리에서 결합된다.
가장 바람직한 화합물은 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(아제티딘-l-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드; t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(모르폴린-4-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드; t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(티오모르폴린-4-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드; t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피페리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드; t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피롤리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 및 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피페라진-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드이다.
화학식 I의 정의에서 (2-6C)헤테로시클로알킬 고리에서 결합되었다라는 것은 R1 및 R2가 이들이 결합되어 있는 질소 원자와 함께 결합하여 2∼6 개의 탄소 원자를 포함하는, N, O 및/또는 S로부터 선택된 1 이상 이종원자를 임의로 포함하는 고리를 형성하는 것을 의미한다. 이러한 고리의 예로는 아제티딘, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 및 티오모르폴린 등이 있다.
전술한 화학식 I의 화합물은 LH 및 FSH 작용 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 사람의 LH 또는 FSH 수용체로 각각 안정하게 형질감염시킨 CHO 세포를 사용하는 시험관내 생체분석에서, LH 수용체에 대한 EC50은 5×10-8M 미만이고, FSH 수용체에 대하여서는 EC50이 10-5M 미만이다. 통상적으로, FSH 활성의 범위는 LH 작용제 자극의 약 1%의 활성∼LH 작용제 자극의 약 10%의 활성이다.
추가로, 본 발명은 화학식 I의 티에노[2,3-d]피리미딘 유도체 화합물 또는 이의 염을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
그래서, 본 발명에 의한 화합물은 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 추가의 구체예는 생식능력의 조절, 더욱 바람직하게는 배란 유도를 위한 약제의 제조를 위한 화학식 I의 티에노[2,3-d]피리미딘 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 LH 및 FSH 수용체 모두를 활성화시키는데 사용된다. 그리하여, 본 발명의 화합물은 생식능력에 문제가 있는 여성의 치료 방법에 사용될 수 있다.
치료용으로 사용하기 위해서 화학식 I의 화합물의 염은 반대이온이 약학적으로 허용되는 것이어야 한다. 그러나, 화학식 I의 염기의 산부가염을, 예컨대 약학적 허용 화합물의 제조 또는 정제에 사용할 수 있다. 약학적 허용 여부와 관련 없이 모든 염이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
산 부가염은 염산, 인산, 황산 등과 같은 무기산, 바람직하게는 염산으로부터 유도된 것과, 구연산, 주석산, 아세트산, 락트산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 글리콜산, 숙신산 등의 유기산으로부터 유도된 것을 포함한다.
본 명세서에서 활성 성분으로서 언급하고 있는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적 허용염에 대한 적절한 투여 경로는 근육내 주사, 피하 주사, 정맥내 주사 또는 복강내 주사, 경구 및 비강내 투여 등이 있다. 화합물을 경구 투여하는 것이 바람직하다. 활성 성분 또는 이의 약학 조성물의 정확한 투여량 및 투여법은 실현하고자 하는 치료 효과(불임 치료; 피임)에 따라 달라질 것이며, 구체적인 화합물, 투여 경로, 약제를 투여하고자 하는 개별 피험체의 연령 및 증상에 따라 달라질 것이다.
일반적으로, 비경구 투여법에서는 흡착에 더욱 의존하는 다른 투여법에 비하여 소량을 투여해도 된다. 그러나, 인간에 대한 투여량은 바람직하게는 체중 1 ㎏당 0.0001∼25 ㎎이다. 목적하는 용량을 1회 용량으로서 또는 해당일에 적절한 간격을 두고 투여되는 복수회 분할용량으로서 제공될 수 있다. 여성 수용체의 경우에는, 난포 지지를 위한 월경 주기를 통해서 매일 적절한 간격을 두고 투여하거나 또는 배란 유도용 1회 용량으로서 투여할 수 있다. 투여량 및 투여법은 여성 수용체와 남성 수용체 간에 차이가 있을 수 있다.
IVF 응용예에서와 같은 시험관내 또는 생체외 응용예의 경우, 본 발명의 화합물은 약 0.01∼5 ㎍/㎖의 농도로 배양 배지 중에 사용된다.
따라서, 본 발명은 약학적 허용 보조제와 함께 화학식 I의 티에노[2,3-d]피리미딘 화합물과, 경우에 따라 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 보조제는 조성물의 다른 성분과 상용성이 있어야 하고 수용체에게 무해해야 한다는 측면에서 "허용가능"해야 한다.
약학 조성물은 경구, 직장, 비강, 국소(예, 경피, 협측 및 설하), 질내 또는 비경구 (예, 피하, 근육내, 정맥내 및 피내) 투여용으로 적절하다. 조성물은, 약학 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 문헌 [Gennaro et al.,Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing company, 1990, 특히 Part 8:Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture]에 개시된 방법으로 제조할 수 있다.
이러한 방법은 활성 성분을 임의의 보조제와 함께 혼합하는 단계를 포함한다. 보조 성분이라고 불리우는 보조제(들)는 당업계에 통상적인 것들(Gennaro 문헌 참조), 예컨대 충전제, 결합제, 희석제, 붕해제, 윤활제, 착색제, 착향제 및 습윤제 등을 포함한다.
경구 투여용으로 적절한 약학 조성물은 환제, 정제 또는 캡슐과 같은 분리형용량 단위로서, 산제 또는 과립으로서, 또는 용액 또는 현탁액으로서 제공될 수 있다. 활성 성분은 환괴 또는 페이스트로서 제공될 수 있다. 조성물은 직장 투여용 좌약 또는 관장제로 추가 가공될 수도 있다.
비경구 투여용으로 적절한 조성물은 수성 및 비수성 멸균 주사를 포함한다. 조성물을 단위 용량 또는 다회 용량 용기, 예컨대 밀폐된 병과 앰플에 제공하고, 멸균 액체 담체를 첨가하기만 하면 되는, 예컨대 사용 전에 물을 붓기만 하면 되는 동결 건조된(동결건조) 상태로 보관할 수 있다.
비강 흡입 투여에 적절한 조성물 또는 조제물은 용량 계량형 가압 에어로졸, 분무기 또는 취입기에 의해 형성할 수 있는 미세 가루 또는 분무제를 포함한다.
본 발명의 티에노[2,3-d]피리미딘 화합물은 방출 속도를 제어하는 막으로 둘러싸인 활성 물질의 코어로 구성된 이식용 약학 디바이스의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 이식체는 피하 또는 국소 적용되며, 비교적 오랫 동안, 예를 들어 수주 내지 수년 동안 대략 일정한 속도로 활성 성분을 방출한다. 이식용 약학 디바이스의 제조를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 유럽 특허 제0,303,306호 (악조 엔.브이.)에 개시되어 있다.
따라서, 본 발명의 화합물은 천연 LH와 동일한 임상적 용도로 사용될 수 있으며, 이들 화합물은 FSH 활성을 보유하며, 변경된 안정성을 나타내며, 다르게 투여할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 의한 화학식 I의 화합물은 일반적으로 적절한 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 또는 THF 중에서 실온에서 3차 염기, 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA)의 존재하에 하기 화학식 II의 할로겐화물 (여기서 Q는 Cl 또는 Br임)과 화학식 III의 (고리형) 2차 아민과의 친핵성 치환 반응에 의하여 생성될 수 있다.
화학식 II의 유도체 (여기서 Q는 Cl 또는 Br임)는 3차 염기, 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재하에, 적절한 용매, 예컨대 디클로로메탄 또는 THF중에서 메타 아닐린 유도체 (V)와 (IV)형의 염화아실 (여기서 Q는 Cl 또는 Br임)의 위치선택성 아실화 반응에 의하여 생성될 수 있다.
화합물 (V)는 적절한 환원제, 예컨대 염화주석 (II)을 사용하여 양성자성 용매, 예컨대 에탄올중에서 염산의 존재하에 고온에서 유도체 (VI)에서의 니트로 작용기의 공지의 환원 반응에 의하여 얻을 수 있다. 문헌 [J. Heilbron,J. Chem.Soc, 1279 (1940)].
티에노피리미딘 (VI)은 커플링제, 예컨대 0-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU) 또는 브로모트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (PyBrOP) 및 3차 염기, 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민의 영향하에서 카르복실산 (VII)과 t-부틸 아민의 축합 반응에 의하여 생성될 수 있다.
에틸 에스테르 (VIII)의 해당 카르복실산 (VII)으로의 비누화 반응은 염기, 예컨대 수산화리튬, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨의 존재하에서 수성 디옥산중에서 고온 (80℃∼환류 온도)의 존재하에 수행된다.
바이사이클 (VIII)은 N,N-디이소프로필에틸아민을 사용하여 에틸 머캅토아세테이트를 사용한 염화물 (X)의 치환 반응 후, 중간체 티오에테르 (IX)의 염기 촉매화 폐환 반응에 의하여 형성된다. 이러한 유형의 티에노[2,3-d]피리미딘 고리 형성 반응은 문헌 [S.A. Abdel-Hady, M.A. Badawy, Y.A. Ibrahim,Sulfur Lett. 9, 101 (1989) and S. Tumkevicius,Liebigs Ann., 1703 (1995)]에 기재되어 있다.
고리화 반응에 적절한 조건은 톨루엔/에탄올(1/1, v/v)중에서 환류 온도에서 에탄올 또는 N,N-디이소프로필에틸아민중의 나트륨 에톡시드이다.
필수 클로로이민 (X)은 문헌 [A.A. Santilli, D.H.Kim and S.V. Wanser,J. Heterocycl. Chem. 8, 445, 1971]에 기재된 바와 같은 절차에 의하여 합성할 수 있다. 이러한 절차에 의하면, 락탐(XI)을 POCl3로 고온에서 (80℃∼환류) 처리하여 염화물 (X)을 산출한다. 반응 혼합물에 적절한 용매, 예컨대 디옥산의 첨가 및/또는 PCl5또는 N,N-디메틸아닐린의 첨가에 의해 염화물 (X)의 반응 시간이 단축되며, 수율이 높아진다.
락탐 (XI)에 대한 적절한 경로는 염기, 예컨대 탄산칼륨하에서 고온 (60℃)에서 에탄올중의 3-니트로-벤즈알데히드 및 S-메틸 이소티오우레아를 사용한 에틸 시아노아세테이트의 다중성분 축합 반응을 포함한다.
관련된 절차는 문헌 [S. Kambe, K. Saito and H. Kishi,Synthesis, 287 (1979); A.M. Abd-Elfattah, S.M. Hussain and A.M. El-Reedy,Tetrahedron 39, 3197 (1983); S.M. Hussain, A.A. El-Barbary and S. A. Mansour,J. Heterocycl. Chem.22, 169 (1985)]에 기재되어 있다.
생식선자극호르몬의 생물학적 활성을 측정하는 시험관내 및 생체내 분석 뿐 아니라 수용체 결합을 측정하는 방법도 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 발현된 수용체를 시험하고자 하는 화합물과 접촉시키고, 작용 반응의 결합 또는 자극 또는 억제를 측정한다.
작용 반응을 측정하기 위해서 LH 또는 FHS 수용체 유전자, 바람직하게는 인간 수용체를 암호화하는 분리된 DNA를 적절한 숙주 세포 중에서 발현시킨다. 이러한 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포일 수 있지만, 다른 세포도 적절하다. 세포는 포유류 기원인 것이 바람직하다. 문헌 [Jia et al,Mol. Endocrin.,5, 759-776, 1991).
재조합 LH 또는 FSH 발현 세포주를 구성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 최종판]. 수용체의 발현은 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA의 발현에 의해 실현된다. 부위 지정 돌연변이 유발, 부가 서열의 결찰, PCR 및 적절한 발현계의 구성을 위한 기술은 모두 당업계에 공지되어 있다. 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA의 전부 또는 일부는 표준 고상 기법으로 합성하여, 바람직하게는 결찰 부위에 대한 제한 부위를 포함하도록 구성할 수 있다. 포함된 암호 서열 중 적절한 전사 및 번역 제어 성분이 DNA 암호 서열에 제공될 수 있다. 알려진 바와 같이, 박테리아와 같은 원핵 숙주와 효모, 식물 세포, 곤충 세포, 포유류 세포, 조류 세포 등과 같은 진핵 숙주를 비롯한 각종 숙주와 적합한 발현계가 이용가능하다.
그 다음 수용체를 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시켜 작용 반응의 결합 또는 자극 또는 억제를 관찰한다.
대안적으로, 발현된 수용체를 포함하는 분리된 세포막을 사용하여 화합물의 결합을 측정할 수 있다.
결합을 측정하기 위해서, 방사성 또는 형광성 표지된 화합물을 사용할 수 있다. 기준 화합물로서 인간 재조합 LH 또는 FSH를 사용할 수 있다. 대안적으로, 경쟁 결합 분석을 실시할 수 있다.
또 다른 분석 방법은 수용체 매개된 cAMP 축적의 자극을 측정하여 LH 또는 FSH 작용 화합물에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다. 따라서, 그러한 화합물은 숙주 세포의 세포 표면 상에 수용체를 발현한 다음 그 세포를 시험 화합물에 노출시키는 것을 포함한다. 그 다음 cAMP의 양을 측정한다. 수용체에 대한 결합을 기초로 시험 화합물의 억제 또는 자극 효과에 따라서 cAMP의 양을 감소 또는 증가시킨다.
예컨대 노출된 세포 중의 cAMP 농도를 직접 측정하는 것 외에도, 수용체를 암호화하는 DNA로 형질감염시킨 후에, 발현량이 cAMP 농도에 반응하는 리포터 유전자를 암호화하는 제2의 DNA로 형질감염시킨 세포를 사용할 수 있다. 이러한 리포터 유전자는 cAMP 유도성이거나 또는 신규 cAMP 반응성 성분에 연결되도록 하는 방식으로 구성할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자 발현은 cAMP의 농도 변화에 반응하는 임의의 반응 성분으로 제어할 수 있다. 적절한 리포터 유전자는, 예컨대 LacZ, 알칼리 포스파타제, 반딧불 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질이다. 이러한 트랜스액티베이션 분석의 원리는 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 문헌[Stratowa, Ch, Himmler, A and Czernilofsky, A.P.,Curr. Opin. Biotechnol.6:574 (1995)]에 개시되어 있다.
LH 또는 FSH 수용체에 대한 활성 화합물을 선별하기 위해서, 10-5M에서의 시험은 LH 또는 FSH가 기준 물질로서 사용될 때 얻어지는 최대 활성의 20% 이상의 활성을 나타내어야 한다. 또 다른 기준은 EC50값으로서, < 10-5M, 바람직하게는 < 10-7M이어야 한다.
당업자는 바람직한 EC50값이 시험 화합물에 따라 달라진다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 10-5M 미만의 EC50을 갖는 화합물은 일반적으로 약물 선택용 후보로서 생각된다. 이 값은 10-7M 미만인 것이 바람직하다. 그러나, EC50이 더 높지만 특정 수용체에 대해 선별적인 화합물도 양호한 후보일 수 있다.
LH 수용체 작용 화합물에 대한 스크리닝은 마우스 Leydig 세포 생체분석을 이용하여 실시할 수 있다. 문헌 [Van Damme, M., Robersen, D. and Diczfalusy, E.,Acta Endocrinol.77: 655-671 (1974) Mannaerts, B., Kloosterboer, H. and Schuurs, A.,Neuroendocrinology of reproduction. R. Rolland et al. Eds., Elsevier Science Publishers B.V., 49-58 (1987)]. 이 분석에서, LH 수용체가 매개하는 테스토스테론 생성 자극은 수컷 마우스로부터 분리된 Leydig 세포에서 측정할 수 있다.
화합물의 FSH 작용 활성은 문헌 [Nayudu, P. and Osborn, S.J. Reproduction and Fertility 95:349-362 (1992)]에 따라 배양된 마우스 난포를 사용하여 생체외 모델에서 측정할 수 있다. 따라서, 마우스 난소 난포를 분리하고 난포 성장을 유도하기 위해서 FSH 작용 화합물의 존재하에 배양한다. 난포 직경과 배양 배지 중의 에스트라디올의 양을 측정하여 이를 난포 성장의 지표로 한다.
화합물의 생체내 LH 활성을 측정하기 위해서, 미성숙 마우스의 배란 유도를연구할 수 있다. 이 분석에서 미성숙 암컷 마우스를 뇨 FSH로 감작(prime)시키고, 약 48 시간 후에 LH 작용 화합물로 처리한다. LH 작용제 처리 후에 동물을 죽이고, 난관 내의 난자 수를 현미경으로 평가한다.
화합물의 FSH 생체내 활성을 측정하기 위해서, FSH 작용 화합물로 0, 8, 24 및 32 시간에 미성숙 암컷 래트를 처리하여 난포 성장을 유도한다. 실험 개시 52시간 후에 동물에게 hCG를 주사하여 배란을 유도한다. 실험 개시 72 시간 후에 동물을 죽이고, 난관 내의 난자 수를 현미경으로 평가한다. 또한, 난소의 중량을 측정한다.
본 발명의 화합물은 LH 또는 hCG가 사용되는 치료법에 임상적으로 적용할 수 있다. 치료법의 예로는 생식선저하에 의한 생식선저하증을 갖는 수컷 및 암컷 피험체에서의 LH 대체법, 배란을 유도하는 월경중기 투여법 [배란 유도(OI) 또는 제어형 과다자극(COH)] 또는 황체의 자극 등이 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
실시예
실시예 1
t-부틸-5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(아제티딘-1-일)아세트아미도)-페닐)-티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드
(a) 5-시아노-4-(3-니트로페닐)-2-메틸티오-6-옥소피리미딘
무수 EtOH (1500 ㎖) 중 S-메틸이소티오우레아 설페이트 (69.0 g), 3-니트로벤즈알데히드 (75.0 g), 에틸 시아노아세테이트 (56.0 ㎖) 및 탄산칼륨 (72.5 g)의 혼합물을 60℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙조에서 0℃로 냉각하였다. 생성된 침전물을 여과하고, 무수 EtOH로 세척하고, 고온수(100℃)에 용해시켰다. 용액을 실온으로 냉각하고, 2 N HCl을 이용하여 pH 2로 산성화하고 빙조에서 0℃로 냉각하였다. 생성된 침전물을 여과하고 얼음물로 세척하였다. 침전물 중의 잔류수를 1,4-디옥산과 동시증발시켜 제거하였다.
수율: 54.0 ㎎.
MS-ESI: [M+H]+= 289.0
TLC: Rf= 0.3, 실리카겔, DCM/MeOH = 9/1 (v/v).
(b) 6-클로로-5-시아노-4-(3-니트로페닐)-2-메틸티오-피리미딘
POCl3(100 ㎖)를 무수 1,4-디옥산 (300 ㎖) 중 5-시아노-4-(3-니트로페닐)-2-메틸티오-6-옥소피리미딘 (실시예 1(a), 25.0 g)의 교반 용액에 첨가하였다. 90℃에서 3 시간 후에, 혼합물을 실온으로 냉각하고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 1,4-디옥산 (100 ㎖) 중에 용해시키고, 생성된 용액을 0℃로 냉각하였다. 얼음물을 조심하여 첨가하였다. 생성된 침전물을 여과하고 물로 세척하였다. 침전물 중의 잔류수를 1,4-디옥산과 동시증발시켜 제거하였다.
수율: 26.0 g.
MS-ESI: [M+H]+= 307.0
TLC: Rf= 0.5, 실리카겔, 헵탄/EtOAc = 3/2 (v/v).
(c) 에틸 5-시아노-4-(3-니트로페닐)-2-메틸티오-6-(에톡시카르보닐메틸티오)-피리미딘
DIPEA (15.7 ㎖)를 EtOH (250 ㎖) 및 DCM (250 ㎖) 중 에틸 2-머캅토아세테이트 (9.3 ㎖) 및 6-클로로-5-시아노-4-(3-니트로페닐)-2-메틸티오-피리미딘 (실시예 1(b), 26.0 g)의 교반 용액에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 후에, 0.1 N 수성 HCl (500 ㎖)을 혼합물에 첨가한 다음 DCM (3×500 ㎖)로 추출하고, 건조한(MgSO4) 다음 감압 하에 농축하였다.
수율: 28.0 g
MS-ESI: [M+H]+= 390.4
TLC: Rf= 0.5, 실리카겔, 헵탄/EtOAc = 3/2 (v/v).
(d) 에틸 5-아미노-4-(3-니트로페닐)-2-메틸티오-티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복실레이트
톨루엔 (150 ㎖) 및 EtOH (150 ㎖)의 혼합물 중 에틸 5-시아노-4-(3-니트로페닐)-2-메틸티오-6-(에톡시카르보닐메틸티오)-피리미딘 (실시예 1(c), 28.0 g) 및 DIPEA (30 ㎖)의 혼합물을 16 시간 동안 환류 온도(100℃)에서 교반하였다. 그 다음 혼합물을 실온으로 냉각하고 감압 하에 농축시켰다. 톨루엔과 동시 증발시켜 잔류 DIPEA를 제거하였다.
수율: 28.0 g
MS-ESI: [M+H]+= 391.2
TLC: Rf= 0.6, 실리카겔, 헵탄/EtOAc = 3/2 (v/v).
(e) 에틸 5-아미노-4-(3-아미노페닐)-2-메틸티오-티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복실레이트
EtOH (400 ㎖)를 1,4-디옥산 (400 ㎖) 중 에틸 5-아미노-4-(3-니트로페닐)-2-메틸티오-티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (실시예 1(d), 28.0 g), 진한 수성 HCl (15 ㎖) 및 염화주석(II) (41.0 g)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 16 시간 동안 90℃에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc (1000 ㎖) 중에 현탁시켰다. 4 N 수성 NaOH를 첨가하여 10∼11의 pH를 얻었다. 이 혼합물을 격렬하게 교반하고 유기층을 분리하고, 건조(MgSO4)한 다음 감압 하에 농축시켰다.
수율: 21.0 g
MS-ESI: [M+H]+= 361.0
TLC: Rf= 0.6, 실리카겔, 헵탄/EtOAc = 3/2 (v/v).
(f) 5-아미노-4-(3-아미노페닐)-2-메틸티오-티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복실산
수산화칼륨 (32.4 g)을 1,4-디옥산 (300 ㎖) 및 물 (100 ㎖)의 혼합물 중의 에틸 5-아미노-4-(3-아미노페닐)-2-메틸티오-티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복실레이트 (실시예 1(e), 21.0 g) 용액에 첨가하였다. 90℃에서 16 시간 후에 혼합물을 10℃로 냉각하고 2N 수성 구연산 (300 ㎖)을 격렬히 교반하면서 첨가하였다. 생성되는 침전물을 여과하고, 물 (180 ㎖)로 세척한 다음 진공에서 건조하였다.
수율: 14.0 g
MS-ESI: [M+H]+= 333.0
TLC: Rf= 0.5, 실리카겔, DCM/MeOH = 9/1 (v/v).
(g) t-부틸 5-아미노-4-(3-아미노페닐)-2-메틸티오-티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드
TBTU (16.1 g)를 DCM/DMF (1/1, v/v, 250 ㎖) 중의 5-아미노-4-(3-아미노페닐)-2-메틸티오-티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복실산 (실시예 1(f), 14.0 g), DIPEA (17.4 ㎖) 및 t-부틸아민 (7.3 g) 용액에 첨가하였다. 실온에서 3 시간 후에 수성 포화 NaHCO3(3×100 ㎖), 0.1 N 수성 HCl (100 ㎖) 및 물 (100 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 감압 하에 농축하였다. 미지근한 무수 EtOH (300 ㎖)로부터 결정화하여 미정제 생성물을 정제하였다.
수율: 10.5 g
MS-ESI: [M+H]+= 388.2
HPLC:Rf= 30.72 분, Luna C-18(2), 5 ㎛, 250×2.0 ㎜ 검출 UV = 210 ㎚, 오븐 온도 = 40℃, 유속 = 0.25 ㎖/분, 용리제 물/ACN/MeOH = 90/9.5/0.5 ∼0/95/5, 실행 시간 = 50 분.
(h) t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-브로모아세트아미도)-페닐)-티에노 [2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드
브로모아세틸 클로라이드 (615 ㎎)를 무수 DCM (20 ㎖) 중 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-아미노페닐)-티에노[2,3-d]-피리미딘-6-카르복스아미드 (실시예 1(g), 1.08 g) 및 DIPEA (2.43 ㎖) 용액에 첨가하였다. 실온에서 3 시간 후에, 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3로 세척한 다음, 건조(MgSO4)하고 감압 하에 농축시켰다. 헵탄/EtOAc = 3/2 (v/v)를 용리제로서 사용한 실리카겔 상에서의 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제하였다.
수율: 910 ㎎
MS-ESI: [M+H]+= 510.2
TLC:Rf= 0.3, 실리카겔, 헵탄/EtOAc = 3/2 (v/v).
(i) t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(아제티딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드
t-부틸 5-아미노-4-(3-(2-브로모아세트아미도)페닐)-2-메틸티오티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 (실시예 1(h), 91 ㎎)를 DCM (5 ㎖)중의 아제티딘 염산염 (120 ㎎) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.25 ㎖)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16 시간 후, 혼합물을 포화 NaHCO3수용액으로 세정하고, 건조 (MgSO4), 감압하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 0.1% 수성 TFA + 10% 수성 ACN/ACN =90/10∼10/90의 구배를 갖는 Luna C-18 컬럼을 사용하여 HPLC로 30 분간 정제하였다. 그후, 표제 화합물을 0.1% TFA를 사용하여 물로부터 동결건조시켰다.
수율: 56 ㎎ (TFA-염)
MS-ESI: [M+H]+= 485.2
HPLC: Rt = 13.45 분, 컬럼 Luna C-18 (2), 3 ㎛, 100*2.0 ㎜, 검출 UV = 210 ㎚, 오븐 온도 = 40℃, 유량 = 0.25 ㎖/분, 용리액 인산염 완충액 50 mM pH 2.1/물/ACN = 10/70/20∼10/10/80 (v/v), 실행 시간 = 20 분.
실시예 2
t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(모르폴린-4-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드
모르폴린 (5.0 ㎖)을 THF (50 ㎖)중의 t-부틸 5-아미노-4-(3-(2-브로모아세트아미도)페닐)-2-메틸티오티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 (실시예 1(h), 1.0 g)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16 시간 후, 혼합물을 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로서 DCM/MeOH = 9/1을 사용하는 실리카 겔상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 미정제 생성물을 0.1% 수성 TFA/물/ACN = 3/97/0∼3/7/90의 구배를 갖는 Luna C-18 컬럼을 사용하여 HPLC에 의하여 30 분간 더 정제하였다. 0.1%의 수성 TFA 및 물의 혼합물로부터 순수한 표제 화합물을 동결건조시켰다.
수율: 215 ㎎ (TFA-염)
MS-ESI: [M+H]+= 515.2
HPLC: Rt = 20.62 분, Luna C-18 (2), 5 ㎛, 150*2 ㎜, 검출 W = 210 ㎚, 오븐 온도 = 40℃, 유속 = 0.25 ㎖/분, 용리액 인산염 완충액 50 mM pH 2.1/물/ACN/MeOH = 10/72/17/1∼10/18/68/4 (v/v), 실행 시간 = 40 분.
실시예 3
t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(티오모르폴린-4-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-dl피리미딘-6-카르복스아미드
티오모르폴린 (2.16 ㎖)을 DCM (50 ㎖) 중의 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-브로모아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 (실시예 1(h), 1.09 g)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16 시간 후, 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 NaHCO3수용액으로 세정하고, 건조 (MgSO4), 감압하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 0.1% 수성 TFA + 10% 수성 ACN/ACN = 100/0∼10/90의 구배를 갖는 Luna C-18 컬럼을 사용하여 30 분간 HPLC로 정제하였다. 수성 1 N HCl로 산성화한 물로부터 순수한 표제 화합물을 동결건조시켰다.
수율: 816 ㎎
MS-ESI: [M+H]+= 531.2
HPLC: Rt = 14.72 분, 컬럼 Luna C-18 (2), 3 ㎛, 100*2 ㎜, 검출 UV = 210 ㎚ + 254 ㎚, 오븐 온도 = 40℃, 유속 = 0.25 ㎖/분, 용리액 인산염 완충액 50 mM pH 2.1/물/ACN/MeOH = 10/72/17/1∼10/18/68/4 (v/v), 실행 시간 = 20 분.
실시예 4
t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피페리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드
피페리딘 (3.0 ㎖)을 CH2Cl2(50 ㎖)중의 t-부틸 5-아미노-4-(3-(2-브로모아세트아미도)페닐)-2-메틸티오티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 (실시예 1(h), 1.0 g)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16 시간 후, 혼합물을 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로서 DCM/MeOH = 9/1을 사용하는 실리카 겔상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 0.1% 수성 TFA/ACN = 100/0∼10/90의 구배를 갖는 Luna C-18 컬럼을 사용하여 HPLC로 미정제 생성물을 30 분간 더 정제하였다. 0.1 %의 수성 TFA 및 물의 혼합물로부터 순수한 표제 화합물을 동결건조시켰다.
수율: 851 ㎎ (TFA-염)
MS-ESI: [M+H]+= 513.2
HPLC: Rt = 37.3 분, Luna C-18 (2), 5 ㎛, 150*2 ㎜, 검출 UV = 210 ㎚, 오븐 온도 = 40℃, 유속 = 0.25 ㎖/분, 용리액 인산염 완충액 50 mM pH 2.1/물/ACN = 20/60/20∼20/0/80 (v/v), 실행 시간 = 40 분.
실시예 5
t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피롤리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드
피롤리딘 (3.0 ㎖)을 CH2Cl2(50 ㎖)중의 t-부틸 5-아미노-4-(3-(2-브로모아세트아미도)페닐)-2-메틸티오티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 (실시예 1(h), 1.0 g)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16 시간 후, 혼합물을 감압하에서 농축시켰다. 용리액으로서 DCM/MeOH = 9/1를 사용하는 실리카 겔상에서 컬럼 크로마토그래피에 의하여 잔류물을 정제하였다. 0.1% 수성 TFA/ACN = 100/0∼10/90의 구배를 갖는 Luna C-18 컬럼을 사용하여 HPLC로 30 분간 미정제 생성물을 더 정제하였다. 0.1 % 수성 TFA 및 물의 혼합물로부터 순수한 표제 화합물을 동결건조시켰다.
수율: 616 ㎎ (TFA-염)
MS-ESI: [M+H]+= 499.2
HPLC: Rt = 37.5 분, Luna C-18 (2), 5 ㎛, 150*2 ㎜, 검출 UV = 210 ㎚, 오븐 온도 = 40℃, 유속 = 0.25 ㎖/분, 용리액 인산염 완충액 50 mM pH 2.1/물/ACN = 20/60/20∼20/0/80 (v/v), 실행 시간 = 40 분.
실시예 6
t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피페리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드
피페라진 (2.5 g)을 CH2Cl2(50 ㎖)중의 t-부틸 5-아미노-4-(3-(2-브로모아세트아미도)페닐)-2-메틸티오티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 (실시예 1(h), 1.0 g)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 16 시간 후, 혼합물을 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로서 DCM/MeOH = 7/1을 사용하는 실리카 겔상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 0.1% 수성 TFA/ACN = 100/0∼10/90의 구배를 갖는 Luna C-18 컬럼을 사용하여 HPLC로 30 분간 미정제 생성물을 더 정제하였다. 0.1 % 수성 TFA 및 물의 혼합물로부터 순수한 표제 화합물을 동결건조시켰다.
수율: 766 ㎎ (비스 TFA-염)
MS-ESI: [M+H]+= 514.4.
HPLC : Rt = 33.7 분, Luna C-18 (2), 5 ㎛, 150*2 ㎜, 검출 UV = 210 ㎚, 오븐 온도 = 40℃, 유속 = 0.25 ㎖/분, 용리액 인산염 완충액 50 mM pH 2.1/물/ACN = 20/60/20∼20/0/80 (v/v), 실행 시간 = 40 분.
실시예 27
CHO-LH 및 CHO-FSH의 시험관내 생활성
화합물의 LH 작용제 활성은 인간 수용체로 안정하게 형질감염되고 cAMP 반응성 성분(CRE)/반딧불 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터로 동시형질감염시킨 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포에서 시험하였다. Gs-커플링된 LH 수용체에 리간드가 결합하면 cAMP가 증가할 것이며, 그 후 루시퍼라제 리포터 구성체의 트랜스액티베이션 증가가 유도될 것이다. 루시퍼라제 시그널은 발광 계수기로 정량하였다. 시험 화합물의 대해서 EC50값 (최대의 1/2 (50%) 자극을 유발하는 시험 화합물의 농도)을 계산하였다. 이를 위해서, 소프트웨어 프로그램 GraphPad PRISM, 버젼 3.0 (미국 샌디에고 소재의 GraphPad 소프트웨어 인코포레이티드)를 사용하였다.
유사한 방식으로 화합물의 FSH 작용제 활성을 루시퍼라제 리포터 유전자와 인간 FSH 유전자로 형질감염된 CHO 세포에서 시험하였다. 결과는 표 1에 제시되어 있다.
생체내 활성
LH/FSH 리포터 작용제 화합물의 생체내 활성을 측정하기 위해서, 미성숙 마우스에서 배란 유도를 연구하였다. 이 분석에서는 미성숙 암컷 마우스를 뇨 FSH (Humegon 12.5 IU/동물)로 감작시켰다. 약 48 시간 후에, 동물을 LH/FSH 작용제 화합물 50 ㎎/kg의 용량 농도로 처리하였다. LH/FSH 작용제 처리 24 시간 후에 동물을 죽이고, 난관의 난자 수를 현미경으로 평가하였다. 결과를 하기 표 1에 기재하였다.
실시예 화합물명 EC50CHOLHR (M) EC50CHOFSHR (M) 테스트동물수 난자평균수(50 ㎎/㎏경구)
1 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(아제티딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 3.86E-09 4.62E-07 15 1.6
2 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(모르폴린-4-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 2.24E-09 4.20E-08 10 9.3
3 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(티오모르폴린-4-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 8.03E-09 1.04E-06 10 19.8
4 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피페리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 6.63E-09 2.01E-07
5 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피롤리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 6.68E-09 4.80E-07
6 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피페라진-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 3.17E-09 1.50E-07

Claims (6)

  1. 하기 화학식 I의 티에노[2,3-d]피리미딘 유도체 또는 이의 약학적 허용염.
    화학식 I
    상기 화학식에서, R1 및 R2는 이들이 결합되어 있는 질소 원자와 함께 2∼6 개의 탄소 원자를 포함하며, N, O 및/또는 S로부터 선택된 1 이상의 이종원자를 임의로 포함하는 고리를 형성한다.
  2. t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(아제티딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드; t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(모르폴린-4-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드; t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(티오모르폴린-4-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드; t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피페리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드; t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피롤리딘-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드 또는 t-부틸 5-아미노-2-메틸티오-4-(3-(2-(피페라진-1-일)아세트아미도)페닐)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드로 구성된 군에서 선택된 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 것인 화합물.
  4. 약학적 허용 보조제와 혼합된 제1항 또는 제2항에 의한 티에노[2,3-d]피리미딘 화합물 또는 이의 약학적 허용염 또는 이의 용매화물을 포함하는 약학적 조성물.
  5. 생식능력의 조절을 위한 약제의 제조를 위한 제1항 또는 제2항에 의한 티에노[2,3-d]피리미딘 화합물 또는 이의 약학적 허용염 또는 용매화물의 용도.
  6. 제1항 또는 제2항에 의한 유효량의 화합물을 투여함으로써 이를 필요로 하는 환자의 생식능력 질환의 치료 방법.
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