TWI225070B

TWI225070B - Novel peptides used as angiotensin converting enzyme inhibitor and preparation process thereof

Info

Publication number: TWI225070B
Application number: TW088120997A
Authority: TW
Inventors: Yi-Hung Chen; Yung-Shiang Yang; Yu-Huei Liou; Jian-Di Jang; Shiau-Huei Feng
Original assignee: Food Industry Res & Dev Inst
Priority date: 1999-12-01
Filing date: 1999-12-01
Publication date: 2004-12-11
Also published as: JP2004182739A; US20040162244A1; US7335722B2; JP2001163896A; JP2004189748A; JP3739992B2; US6767990B1

Description

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225070 A7 B7 五、發明說明（i) 發明背景血管收縮素轉換酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE)主要存在於人體的血管内皮細胞、肺部、腎臟及腦部，該酵素可將原本無活性的血管收縮素I經由切除碳端二個胺基酸（His_Leu)得到具有活性的血管收縮素II，造成血管收縮及血壓上升。同時，血管收縮素轉換酶可將具有血管舒張功能的bradykinin去活化，因此能引起血壓上升的現象。血管收縮素轉換酶抑制物(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor，ACEI)，與血管收縮素轉換酶結合，可減緩血管收縮素II之生成及bradykinin之去活化。若能在飲食中添加血管收縮素轉換酶抑制物，對於減輕高血壓的症狀具有正面的效果。目前已知有許多胜肽具有血管收縮素轉換酶抑制物功效，其各具不同胺基酸序列及長度。該等具有血管收縮素轉換酶抑制物功效之胜肽可自食品中分離得之。此類食品包括動物或植物蛋白質的水解產物，例如赂蛋白 (Maruyama and Suzuki, 1982)、玉米蛋白（Miyoshi et al·， 1991)、沙丁魚肉（Matsui et al·，1993)及經魚肉（Matsumura et al.，1993);及發酵食品，例如清酒與酒潰（Saito et al.， 1994)、酱油（Kinoshita et al·，1993)、乳酿（Okamoto et al·，1995) 及發酵乳品（Nakamura et al.，1995)等。曰本專利公告第5-87052號及曰本專利特開平2_154693號揭示含有寡肽之物質，而在文獻Food Chemiccal Mothly，1990, 6:80中亦揭示特定之寡肽，其具有脂質代謝之改良效果，包括抑制血液中三甘油酯之濃度。上述專利或文獻中含有 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -I----訂·！ ·線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1225070 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ---------'___ 五、發明說明（2 ) 寡月太〈物質係為蛋白質水解物之混合物，然其並未說明Jt 活性成份之胺基酸序列。此並說明上述含有胜肽之物質^ 又低並無法作為醫藥品。再者，當此等物質含在食品中時很難將其與食品中所含有之其他多肽分別定量地檢測出，造成品質管制之之問題。日本專利特開平6_298794號揭示一種自動物及植物性蛋白質來源製備血管收縮素轉換酶抑制物之方法，如魚類、肉及難肉#方法係利用蛋白質水解酶，如嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)、胃蛋白酶（pepsin)或胰蛋白酶（办ps㈨於適當介質中及條件下分解，水解液經由離心、過濾、濃縮及树月曰及附等純化步驟得到具有抑制血管收縮素轉換酶活性 <胜肽。日本專利特開平5_3;31192號揭示自鰹魚乾經由嗜熱菌蛋白酶分解製得具有血管收縮素轉換酶抑制物活性之胜肤’該胜肽之序列為H_Tyr_Ser-Trp_Ala-〇H。日本專利特開平4-264098號揭示一種自不含脂肪之難肉製備具有血管收縮素轉換酶抑制物活性之胜肽，該胜肽之序列為 Lyn-Pro-Lys-Arg。美國專利第5,854,〇29號揭示一種製備具有血^收縮素轉換酶抑制物活性之二肤Tyr_pr〇之方法，該方法係培養乳酸捍菌於含有包括Tyr-Pro之胜肽及/或蛋白質 k養基中進行培養’以得到大量含有Tyr_pr〇之培養液。前述之先前技術中，大部份係自動物性蛋白質，如魚肉、雞肉或豬肉，利用不同之酵素水解及分離純化以製備具有血管收縮素轉換酶抑制物功效之胜肽，原料成本較為昂貴。 —5 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公髮） --------訂---------線一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 階段使用size 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225070 五、發明說明（發明概诚 /申叫人發現將製造難精過程所產生的廢棄物予以水解 "再以虫白負水解酶處理可得具有相當強的血管收縮素轉換酶抑制物活降 > 念奶右〖生 < 產品，該方法不但所花費的成本低廉，且可增加的雞精副產物的利用價值。月之主要目的係提供具有抑制血管收縮素轉換酶功效之新穎胜肽。發月之另目的係提供具有血管收縮素轉換酶抑制物、產αα之1備方法，包括雞肉逢以蛋白質水解酶處理製得έ血管收縮素轉換酶抑制物功效之產品，該產品可應用於保健食品中。圖一為根據本發明製得之胜肽於第 exclusion管柱分離之結果。圖二為根據本發明製得之胜肽於第二階段使用Rpi8管柱進行純化之結果。圖三為根據本發明製得之胜肽於第三階段使用分析級的 C-18管柱進行純化之結果。 Ώ四為根據本發明製得之胜肽於第四階段亦使用分析級的C-18管柱進行純化之結果。圖五為自發性鬲血壓老鼠餵食含血管收縮素轉換酶抑制物飼料期間之生長狀況。圖六為自發性高血壓老鼠餵食含血管收縮素轉換酶抑制物飼料期間之血壓變化情形。 —___ - 6 - 本氏財ίϊ家標準（CNS)A4規格（21G X 297公爱)—'" --- 丨丨丨丨丨丨丨丨丨丨！ |丨_ —丨丨丨丨訂---丨丨丨丨！線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1225〇7〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ^------B7_ —__ 1、發明說明（4) 爱-gl詳細說明本發明具有抑制血管收縮素轉換酶活性之胜肽，為具有下列胺基酸序列：纈胺酸白胺酸·脯胺酸（VLP); 異白胺酸·白胺酸·脯胺酸（ILP); 纈胺酸白胺酸-酪胺酸（VLY); 纈胺酸-白胺酸脯胺酸·脯胺酸（VLPP);及異白胺酸-白胺酸-脯胺酸-脯胺酸（ILPP)。該等胜肽可由天然物分離純化而得，或可由習知之化學合成方法所製得，亦可根據胺基酸序列，選殖具有對應於此等胜肽之核甞酸序列片段，插入適當之載體，並在適當之寄主細胞内表現而製得。根據本發明，該等胜肽係利用製造雞精過程中所產生的廢棄物作為原料，其為水解不完全的難肉及難骨殘潰，加入適量的水及蛋白質水解酶，於適當的反應條件下進行水解反應後’將水解液與殘渣分離並收集該液體，再將所得之液體經過進一步的過濾及濃縮後進行乾燥得粗產物，再經純化得該等胜肽。經定序儀測定其胺基酸序列。其可用為醫藥品’保健食品或添加於食品中。本發明另揭示一種製備具血管收縮素轉換酵素抑制物 (ACEI)功效產品之方法，其包括下列之步驟·· (a) 於雞肉渣溶液中加入蛋白質水解酶反應； (b) 分離（a)步騾反應後之難肉渣及液體，並收集該經分離之液體；及 ---------------------訂---------線‘ (請先閱讀^r面之注意事項再填寫本頁) 一 Ί 一

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、發明說明（ 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製。⑷將(b)步騾中所得之該液體進行乾燥，即得到該產品 0 據本發月，忒方法係利用製造難精過程中所產生的廢棄物作為原料，其為水解不完全的難肉及難骨㈣。該等 1料可自難精工廠取#，再加入適量的水及蛋白質水解於週當的反應條件下進行水解反應i，將纟解液與殘 =刀離並收集液體，再將所得之液體經過進一步的過濾及敬鲕後進行乾燥後製得。該產品經測定後發現具有血管收縮素轉換酵素之抑制活性，其可廣泛地應用於保健食品中，或作為食品添加物。若將水解物產品進一步分離純化為/、有抑制血管收縮素轉換酶活性之胜肽，可作為醫藥品之用。於步驟（a)中之蛋白質水解酶，可為任一具有水解蛋白質功效者，例如嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、 omelain、Alcalase、Flavorzyme 或 Esperase，較佳為 Alcalase 〇蛋白質水解酶進行水解反應之溫度及時間，视其所選用之蛋白質水解酶種類而定。舉例而言，選用Alcalase進行難肉渣之水解，其較佳之反應溫度為約5〇至7(rc之間，反應的時間約1至5小時之間。經酵素反應後之水解液，接著進行液渣之分離。一般而吕’可以任何熟習此項技術者習知達成液渣分離之操作步驟進行，並進一步濃縮該水解液，以除去大部份之水份予’便於其後之乾燥步驟之操作。舉例而言，含有殘逢之一 8 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） « — — — — — — — — —II ·1111111 11111111 · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225070 A7 B7 五、發明說明（6 ) 水解液可置入濾袋離心後收集濾液，再將濾液加入矽藻土混合後壓濾，並經過真空濃縮處理。經濃縮之水解液可進一步經由超過濾膜過濾 (Ultrafiltration)之步驟處理，除去分子量較大之分子，該步騾係使用分子量截斷值100至20000的膜進行膜過濾，較佳係使用分子量截斷值10000的膜進行膜過滤。本發明中提及之乾燥步騾可以任何熟習此項技術者習知之方法進行，例如冷凍乾燥、喷霧乾燥、鼓風乾燥機乾燥、流動床乾燥，較佳為使用喷霧乾燥。經乾燥所製得之產品，即可應用於保健食品中，或作為食品添加物。亦可進一步純化製得純化型式之胜肽供作醫藥品之用。純化之步騾可依任何熟習此項技術者習知純化蛋白質之方法進行，例如使用膠過濾（Gel filtration)、離子交換層析（Ion exchange chromatography)、親和性層析（Affinity chromatography)等。依據本發明之方法，其中一具體實施例所獲得之產品，經純化得具有抑制血管收縮素轉換酶活性之胜肽，定序後得之其胺基酸序列為：纈胺酸白胺酸-脯胺酸（VLP)、異白胺酸白胺酸·脯胺酸（ILP)、纈胺酸-白胺酸-酪胺酸 (VLY)、纈胺酸-白胺酸-脯胺酸-脯胺酸（VLPP)及異白胺酸 -白胺酸-脯胺酸-脯胺酸（ILPP)等。本發明具有抑制血管收縮素轉換酶活性之胜肽可以化學合成之製備方法，例如，氮疊化合物法、酸氯化物法、酸酐法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、碳基咪唑法、氧 -9 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂---------線| 1225070 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7) 化還原法或DCC加成法（如The Peptide，v〇1 ^ (1966)，

Academic Press，New York，USA 出版，或 Peptide synthesis，

MarUzen Co.，Ltd (1975)出版）。此等胜肽之合成可在固相或液相中進行。具有侧鏈官能基如色胺酸及絲胺酸之胺基魬，較佳係將其侧鏈官能基團，以已知之保護基團如苄氧羰基、第二丁氧基羧基或苄基等進行保護。此保護基團可再以任何習知之方法移除。下列實施例係以進一步說明本發明之可實施性，俾使本發明技術内容更加具體，然非欲以侷限本發明之範圍。其它熟習該項技術者基於習知技藝之教示而可達成的本發明之種種變化及改良，皆應歸屬本發明範_。實施例皇-Μ-!:-自難肉渣水解物製_備具血管收縮素棘拖醢柚制你活性之脸肤將難肉骨架54公斤、水43.2公斤、Neutrase 162克、 Protamex 270克、多磷敗鹽162克及生育醇（t〇COpherol) 32克混合，於65°C下加熱水解2小時。水解結果得到骨渣7,48〇克’水解液經濾袋離心後，得到遽渣11，〇6〇克。接著進行再水解，以11，060克濾渣加入4倍水稀釋（44,000克），並加入110克之Alcalase，於65°C下水解2.5小時。所得之水解液再以滤袋離心，得到滤潰6,600克，滤液中加入秒藻土 1公斤’經壓滤處理可得Brix值為2.0的再水解液。為利於噴霧乾燥，須先加以濃縮，並以分子量截斷10000的膜進行超過濾膜過濾處理。本實例將其濃縮至Brix為11.8時再進行一 10 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ 訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225070 A7 B7 五、發明說明（8 ) 喷霧乾燥，噴霧用水解液重4,850克，經喷霧後製得粉末 391.4 克。實例2 - _測定ACE活性之方法 1 .難肉骨架水解渣再水解將實例1所得之難肉水解液濾渣以二倍水稀釋攪勻後，分裝為五組，每組分別加入水解逢重量1%的bromelain、 Alcalase、Flavorzyme 及 Esperase 與水，於 60。(3 下反應 2.5 小時，再加熱至90°C後反應10分鐘將酵素失活，取出水解液以10,000 rpm進行離心20分鐘，取上清液進行血管收縮素轉換酶抑制活性之測試，所得之結果如表一所示，其中 IC5〇值係為能夠抑制50%血管收縮素轉換酶活性所需的血管收縮素轉換酶抑制物之濃度。 2 .血管收縮素轉換酶抑制物活性測試 (a) HHL 法本方法係修改自 Cushman and Cheung，1971，Biochem. Pharmacol.，20:1637之方法。取80微升水解液樣品加入HHL 培養液，此培養液包括5 mM的HHL(Hippuryl-Histidyl-Leucine，馬尿醯基-組胺醯基-白胺酸）及0.3M氯化鈉於 0.1M之硼酸鈉缓衝液。於37°C靜置（預熱）5分鐘，加入20 微升之0.1 U /毫升之血血管收縮素轉換酶溶液，再於37°C 反應30分鐘。加入1 N的鹽酸，並以1.7毫升的乙酸乙酯萃取；取出有機層進行真空乾燥，以1毫升水溶解乾燥粉末，測定UV 228 nm的吸光值。所得之難肉渣再水解液蛋白質濃度以此技藝中已知之 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂---------線 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 血管收縮素轉換酶活性 1225070 A7 B7 五、發明說明（9 )

Micro-biuret方法測定。再將再水解液分別稀釋為50、100、 200、300、400倍等五個濃度，經由對數函數做出迴歸曲線，由此函數推算IC5〇值。 (b) Sigma套組法本方法係修改自Sigma套組之使用手冊。1毫升的反應液 (血管收縮素轉換酶基質）加入0.05毫升的去離子水（對照組）或0.05毫升之樣品（實驗組）。加入0.05毫升的校正液（諸的血管收縮素轉換酶），於37°C水浴槽靜置5分鐘後，測量340 nm之吸光值（所得讀數為起始A值）；測完後重新置回水浴中，5分鐘後再取出測吸光值（所得讀數為最終A值）。所得讀值以下列方式處理·· 起始A值一最終A值（樣品）起始A值一最終A值（校正液）校正液於37°C之活性（一般為45U /升）表一不同種類再水解液之IC5〇值

-X (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 HHL法測得之IC50 (毫克/毫升） Sigma套組測得之IC50 (毫克/毫升） Alcalase 再水解物 0.0953 0.2725 Bromalain 再水解物 0.1525 0.3134 Esperase 再水解物 0.1993 0.3724 Flavourzym 再水解 0.3121 0.463 控制組 0.6292 1.424 -12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1225070 A7 五 ____B7___發明說明（10 ) 從表一之結果可知，不論使用HHL法或Sigma套組所測得之血管收縮素轉換酶抑制活性IC5G值，所得之再水解液活性大小順序均相同’且均以Alcalase水解所得之再水解產物具有最高之活性。實例3 - 超過篇膜過爐（Ultrafiltration)之方法為進一步純化再水解液，並便於噴霧乾燥之產品製備，遂以超過濾膜過濾之方法進行濃縮過濾。選用的超過濾膜分別為分子量截斷值10000及500的膜，將再水解液依序經過10000及500超過濾膜過濾，所得之透析液分別以前述之方法測定血管收縮素轉換酶抑制物活性，其結果如表二所示： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製原始再水解液 IC50=0.33184 毫克 / 亳升未通透分子量截斷值10000膜的部伶 IC50=0.34725 毫克 / 亳升通逯分子量截斷值10000膜的部价 IC50=0.23825 亳克 / 亳升德通透分子 IC50=0.37065 毫克 / 亳升值1000峨且通透分子量截 ^ 1 —'—-—-—.— IC50=0.37724 毫克 / 亳升由上表經比較可知，分子量截斷值10000的膜可除去部毒令 4- JLL· 伐文的物質（即滯留時間較短者），而分子量截斷 500的膜通透前後則有非常明顯的差異，可得到較純的子詈較山+ & <物質。再比較表二中IC5G之結果，可發現通分子量截斷值10000的膜之物質可相當有效地提升血管紙本

訂---------線. 1225070 11 樣品量：溶離液：流速：檢出器：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（鈿素轉換酶抑制物之活性，至於分子量截斷值5〇〇的膜在通透則後則無差別。因此，以分子量截斷值10000的膜處里再水解液，可除去邵份大分子物質，消除水解液的沉澱現象，並有效提升血管收縮素轉換酶抑制物的IC⑽值。免例4…胜肽纟^之方法取1克於前述噴霧乾燥所得之粉末溶於5〇毫升水中，利用〇·45μ <離心過濾管過濾後，進行下列之純化及定性步驟。 1.第一階段分離使用size exclusion管柱，條件如下：系統： AKTA純化器（purifier) 分離管柱： Superdex Peptide HR 1030 0.5微升 5%醇溶於純水 · 0.5毫升/分 214，2M及28〇奈米之波長檢測所得結果如下圖一所示。將以上的四個餾份重複收集十次，所得收集液以Speed Vac真空冷凍乾燥後秤重。餘份2、3及4的總乾重分別為 0.054 ’0.143與0.019毫克，此三個餾份分別以二次水重新溶解’配成1毫克/毫升及10毫克/毫升二個濃度。其中1毫克 /毫升用於測量對血管收縮素轉換酶之抑制活性，1〇毫克/ 毫升用於作為分離純化使用。餾份2、3及4 (丨毫克/毫升）以Sigma套組測得分別可抑制〇%、46·69%及27.71%的血管收縮素轉換酶活性。將餾份3 (以下稱為A3 )進行接下來之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1225070 A7 B7 五、發明說明（12) 純化分離。 2 ·第二階段使用RP18管柱進行純化，條件如下系統：分離管柱 RT250-25 樣品量：溶離液A1 溶離液B1 梯度： AKTA純化器 LiChrosorb RP-i8(7微米）預包裝之管柱經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5000微升含0.1%TFA的水含0.1%TFA的甲醇 0.5倍管柱體積使用〇%的β1 3倍管柱體積使用o-ioo%的Bi I·2倍管柱體積使用100〇/(^々B1 0.5毫升/分使用214 ’ 254及28〇奈米之波長檢測所得的結果如圖二所示：圖二所得之結果可分為五個餘份。此五個餾份收集三次後，利用Speed Vac加以真空乾燥，所得之乾燥固型物重量分別為 0.0085、0.0222、0.0303、0.0432 及 0.0214 克，與前一步驟相同’將此五餾份配成1毫克/毫升用於測量對血管收縮素轉換酶之抑制活性，10毫克/毫升用於作為分離純化使用。所得之五個餾份以Sigma套組測得抑制血管收縮素轉換酶之結果如下：流速：檢出器一 15 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ! — ！♦ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線| 1225〇7〇 A7 B7 13 &、發明說明（表三 i管收縮素轉換酶抑制百分比餾份 1(A3_B1) 0 餾份 2(A：3-B2) 0 餾份 3(A3_B3) 4.76 餾份 4(A3-B4) 59.37 餾份 5(A3_B5) 36.51 由表三可知，餾份A3-B4具有最佳之血管收縮素轉換酶抑制效果’因此將饀份A3-B4進行進一步之純化分離。 3 ·第三階段使用分析級的C-18管柱進行純化，條件如下：系統： AKTA純化器分離管柱： Sephaasil Peptide RP-18 ( 5 微米）ST 4.6/250 樣品量： 100微升溶離液A1 : 含0.1%TFA的水溶離液B1 : 含0· 1%TFA的甲醇梯度： 2倍管柱體積使用〇%的b 1 10倍管柱體積使用0-100%的B1 3倍管柱體積使用1〇〇%的B1 流速： 0.6毫升/分檢出器·· 使用214，254及280奈米之波長檢測所得的結果如圖三所示。圖三所得之結果可分為八個餾份。此八個館份收集十五次後，利用Speed Vac加以真空乾燥，再將此八個館份配成 1毫克/毫升用於測量對血管收縮素轉換酶之抑制活性，1〇一 16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線一經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 K25070 _____________B7____ 五、發明說明（16 ) 制組）、1%血管收縮素轉換酶抑制物及3%血管收縮素轉換 _抑制物飼料、蒸館水採自由攝食，每曰更新飼料並記錄$取量。動物房維持在24±rc，相對澄度5〇〜7〇%，以自動足時器控制光照與黑暗週期各12小時。實驗期共17週，實驗期間每1〜2週記錄體重及量測血壓一次。老鼠收縮壓與心跳速率係利用Pr〇grammed electrophyg〇manometer (PB98A，s〇ftr〇n)以尾巴測定法間接測量有意識老鼠血壓。測量程序為老鼠先在”它的恆溫箱中預熱10分鐘，然後以固定器將老鼠身體固定住，且持續保持在37 C的％境，並將裸露的尾巴套上尾套感應器以偵測血壓及心跳。所得之結果如圖五及六所示：圖五是自發性高血壓老氣餵食含血管收縮素轉換酶抑制物飼料期間 < 生長狀況，其中，3組老鼠的體重隨著飼養時間的增加而增加，且各組間並沒有顯著差異，飼料攝取量方面亦無差異（控制組、1%血管收縮素轉換酶抑制物組及3°/❶血管收縮素轉換酶抑制物組平均每天分別攝取20.1± 1.5 20.3 ± 1·7、19.6 ± 1.3克），顯示血管收縮素轉換酶抑制物粉的添加並不影響食慾，亦不妨礙成長。圖六為自發性高血壓老鼠餵食含血管收縮素轉換酶抑制物飼料期間之血壓變化情形，整體而言，自發性高血壓老鼠的血壓隨年齡會逐漸升高，若未餵食含血管收縮素轉換酶抑制物，大約達2〇〇毫米汞柱之後，血壓呈現持續平穩狀態；攝食血管收縮素轉換酶抑制物組在進行至第8週（16 - 19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ χ 297公爱） ------ 1% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線·· 1225070

化齡)後’呈現微幅調控血壓的現象，但與控制組間並無統計差異，直到持續匈養至第15週後，血管收縮素轉換酶抑制物組的血壓才顯著低於控制組（p<o〇5)，且劑量的效應也完全呈現，P/O血管收縮素轉換酶抑制物組及3%血管收縮素轉換酶抑制物組血壓分別降低14及25毫米汞柱，但兩組間並無統計上的差異。此趨勢一直延績到24週齡，甚至再經一週以控制飲食取代原來的血管收縮素轉換酶抑制物飼料，老鼠依然呈現降壓狀態。此顯示再水解物長期攝取確具有降血壓之生理功效，且劑量愈多，降壓效果愈顯著。終止攝取血管收縮素轉換酶抑制物一週，尚可維持〜段時間的降壓效果。 --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

1225070 第088120997號專利申請案中文申請專利範圍替換本(93年3月) 8 8 8 8 A BCD 2 ί 9f iii^充修補 Λ.-ί 六、申請專利範圍 1. 一種具有抑制血管收縮素轉換酶活性之胜肽，其係選自下列所組成之群：纈胺酸-白胺酸-脯胺酸（VLP); 異白胺酸-白胺酸-脯胺酸（ILP); 纈胺酸-白胺酸-酪胺酸（VLY); 纈胺酸-白胺酸-脯胺酸-脯胺酸（VLPP);及異白胺酸-白胺酸-脯胺酸-脯胺酸（ILPP)。 2. 根據申請專利範圍第1項之胜肽，其係作為血管收縮素轉換酵素抑制物。 3. 根據申請專利範圍第1項之胜肽，係為纈胺酸-白胺酸-酪胺酸（VLY)。 4. 一種製備含有申請專利範圍第1項之胜肽之產品之方法，其包括下列之步驟： (a) 於雞肉逢:溶液中加入Alcalase蛋白質水解酶反應，該雞肉渣之水解反應係於50至70°C下進行1至5小時； (b) 分離（a)步驟反應後之雞肉渣及液體，並收集該經分離之液體；及 (c) 將（b)步驟中所得之該液體進行乾燥，即得到該產品。 5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其另包括步驟（b〇，係壓濾雞肉渣及液體，及濃縮該經分離之液體。 6. 根據申請專利範圍第4項之方法，其另包括步驟（b")，係使用分子量截斷值10000的膜進行超過濾膜過濾。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) -裝· 訂· 1225070 A BCD 六、申請專利範圍 7.根據申請專利範圍第4項之方法，其另包括步驟（句，係將該產品進行純化為純化型胜肽。 8·根據申請專利範圍第7項之方法，其中所得純化型胜肽為根據申請專利範圍第i項所列之胜肽。 9· 一種含有申請專利範圍第1項之胜肽之產品，其係以申凊專利範圍第4至8項中任一項之方法所製得。 1〇· —種用於抑制血管收縮素轉換酶之醫藥組合物，其包括根據申請專利範圍第1項之胜肽。種用於抑制血管收縮素轉換酶之保健食品，其包括根據申請專利範圍第1項之胜肽。 12. 種用於抑制血管收縮素轉換酶之食品添加物，其包括根據申請專利範圍第1項之胜肽。 13. —種製備申請專利範圍第1項之胜肽之方法，其包括下列步驟： (a) 於雞肉渣溶液中加入Alcalase蛋白質水解酶反應，該雞肉渣之水解反應係於50至70°C下進行1至5小時； (b) 分離（a)步驟反應後之雞肉渣及液體，並收集該經分離之液體； (c) 將（b)步驟中所得之該液體進行乾燥，即得到該產品；及 (d) 將該產品進行純化為純化型胜肽。 14_根據申請專利範圍第丨3項之方法，其另包括步驟（b,)，係壓滤雞肉渣及液體，及濃縮該經分離之液體。 -2 - 本紙張尺度適用中@ gj家標準(CNS) Μ規格(21G><297公着) 1225070 A8 B8 C8 -一 —____ D8 _ 六、申請專利範圍巧.根據申請專利範圍第1 3項之方法，其另包括步驟，係使用分子量截斷值10000的膜進行超過濾膜過濾。此根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中所得純化型胜肽為根據申請專利範圍第！項所列之胜肽。 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐P ----