TW555853B - Recombinant beta-fructofuranosidase, its gene and preparation - Google Patents

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經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（i ) 發明領域 本發明爲關於θ -呋喃果糖苷酶基因及其單離方法以 及其生產系，更詳之，本發明爲關於新穎的Θ—呋喃果糖 苷酶及編碼其之DNA、及編碼/3 -呋喃果糖苷酶之 DNA的單離方法，不顯示出Θ -呋喃果糖苷酶活性之新 穎絲狀菌及以此絲狀菌作爲宿主之製造重組/3 -呋喃果糖 酶之方法，及，令蔗糖之特定的果寡糖，例如1 -蔗果三 糖，選擇性地且效率地生成/5 -呋喃果糖苷酶變異體。 背景技術 一般果寡糖爲在蔗糖之果糖中，其1〜3個分子之果 糖爲在（：1與（：2之位置以Θ鍵結合，爲難消性之糖，具有 腸內雙岐桿菌增殖之促進作用，膽固醇等脂質代謝之改善 效果，難蝕性等之優良的生理效果。 果寡糖已知爲在自然界中廣泛分布於植物中，例如爲 含有蘆筍、洋蔥、菊芋、蜂蜜等中，最近，利用來自微生 物之Θ -呋喃果糖苷酶的轉移反應而由蔗糖大量製造之技 術已被確立，且被工業地生產。現在果寡糖之工業生產中 所利用的—呋喃果糖苷酶製劑，由於爲利用來自黑曲霉 菌體內之Θ —呋喃果糖替酶，故含有較多夾雜的蛋白質。 因此，乃期望作出夾雜之蛋白質少，且純度高，力價高之 冷-呋喃果糖苷酶製劑。又，若以Θ -呋喃果糖苷酶作爲 固定化酵素，雖可提高其利用效率，但在固定酵素時，以 酵素爲被菌體外所生產者爲有利，故期望令該Θ -呋喃果 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T ά0. ;> 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 4 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 糖苷酶被菌體外生產。 對於編碼召一呋喃果糖苷酶之基因，由細菌（Fouet, A. Gene, 45，221 — 225(1986), Martin ,1. 等人，Mol.Gen· Genet·, 2 0 8,1 7 7-1 8 4( 1 9 8 7 ),8七6111111(：12,11.等人.，％〇1.6611.661161:.， 191， 138 — 144(1983)，Scholle,R·等人，

Gene, 80, 49—56(1989), Aslanidis, C.等 人，J. Bacteriol·, 171, 6753- 6763( 1 9 8 9 ), Sato, Y.和 Kuramitsue, Η. K. Infect·

Immun., 56, 1956—1960 ((1 9 8 9 ), G u n a s e k a r a n，P ·等人，J · B a c t e r i o 1. , 1 7 2 , 6727 -6735(1990))、酵母（Taussing，R， 和 M· Carlson， Nucleic Acids Res·， 1 1 , 1 9 4 3 - 1954(1983 )，Laloux,0.等人，FEBS Lett.， 289，64-68(1991),霉菌（Boddy, L. M.等人， Curr· Genet·, 2 4， 6 0 — 6 6(1 9 9 3)，植物（Arao ，M·等人，Plant Cell Physiol., 3 3 , 2 4 5 - 2 5 2 ( 1 9 9 2 ), Unger, C.等人，Plant Physiol·, 104,1351-1357(1994), Elliott, K. 等人，Plant Mol. Biol.,2 1,5 1 5 - 5 2 4(1 9 9 3 ),Sturm, Α·和 Chrispeels, M.J·, Plant Cell, 2 , 1 1 07-1 1 1 9(1 990))等已分離出數個。然而 ，關於具有轉移活性，於果寡糖之工業生產上可利用之編 碼/3 —呋喃果糖苷酶之基因，就本發明者等人所知則爲未 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 一 5 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 555853 A7 B7 五、發明説明（3 ) 知。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，若取得於果寡糖之工業生產上可利用之編碼石-呋喃果糖苷酶之基因，則利用與此基因之相同性可單離出 具有類似機能之基因。就本發明者等所知，並無使用此手 法進行新穎ys -呋喃果糖苷酶基因之節選例被報導。即使 於ys —呋喃果糖苷酶之節選中，若可發明使用此新手法單 離石一呋喃果糖苷酶基因之方法，則可將篩選之勞力及時 間較習知大幅縮短。即，利用與編碼-呋喃果糖苷酶基 因之相同性，單離出類似的θ -呋喃果糖苷酶基因，其次 令單離之基因導入無蔗糖資化性之宿主，即綠啶木霉（ Trichoderma viride)和缺乏蔗糖資化性之酵母 （Oda, Y. Ouchi, K., Appl. Environ. Microbiol., 1989 ，55，1742 - 1747)等，藉由令其表現而評價 其基因產物yS -呋喃果糖苷酶之特性。由於此時所表現之 yg -呋喃果糖苷酶爲單一物質，故可將篩選之勞力及時間 較習知大幅縮短。加上於所表現之/3 -呋喃果糖苷酶爲具 有優異之特性之情形中，將此基因導入安全性及生產性優 異之菌株，則亦使優異的ys -呋喃果糖苷酶之生產變爲可 能。 再者，於如前述之優良的-呋喃果糖苷酶之生產中 ，必須確立其生產系。尤其是，必須確立無蔗糖資化性之 宿主。即，於利用之宿主本身中原本存在万-呋喃果糖@ 酶活性之情形中，所得之酵素爲來自宿主之/3 -呋喃果糖 苷酶與來自導入基因之θ -呋喃果糖苷酶的混合物。爲此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 6 555853 A7 ____B7 五、發明説明（4 ) ’爲了誘發出來自導入基因之y3 -呋喃果糖苷酶的優良性 質，乃必須與來自宿主之-呋喃果糖苷酶分離後供使用 。另一方面，若可利用不顯示出yS -呋喃果糖苷酶活性之 宿主’則酵素之分離乃變爲不必要，且可以粗酵素之狀態 ，利用來自導入基因之Θ -呋喃果糖苷酶的優良性質。不 顯示出/3 -呋喃果糖苷酶活性之微生物，迄今已知屬於前 述之木霉（Trichoderma)屬之數個菌株和缺乏蔗糖資化 性之酵母（Oda，Y.前述）。然而，若考慮所生產之 /3 —呋喃果糖苷酶的利用領域爲食品領域時，則期望利用 具有長的食用經驗，亦可利用於酵素之工業生產等，且安 全性高的曲霉屬之絲狀菌中，以不顯示出/3 -呋喃果糖苷 酶活性之菌株作爲宿主。 再者，若可取得於果寡糖之工業生產上可利用之編碼 -呋喃果糖苷酶之基因，則可製造其特性更爲改善之變 異體。例如，若可取得令1 -蔗果三糖選擇性地且效率地 生產之石一呋喃果糖替酶，則存在如下述之優點。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 -蔗果三糖及Nistose爲在蔗糖之果糖中分別結合 1及2分子之果糖，爲現在工業上所製造之果寡糖混合物 之一成分。最近發現其分別經由高純度地調製並結晶化， 可依舊保持作爲果寡糖之生理效果、物性及食品加工，且 表現出新的優良特性（特願平7 - 2 2 2 9 2 3號、特開 平6 - 3 11 60號公報），其被稱爲具有新穎特徵之果 寡糖。 於此類狀況下，本發明者等人之一部分提案以蔗糖作 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -7 - 555853 A7 ____B7_ 五、發明説明（5 ) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲原料之結晶1 -蔗果三糖的工業性製造方法（特願平8 -64682號、特願平8 - 77534號、特願平8 -77539號各說明書）。即，令具有果寡糖移活性之酵 素作用於蔗糖使其變換成1 -蔗果三糖，並經由色譜分離 法將1 -蔗果三糖分級成純度8 0%以上之後，將其作爲 結晶化原液取得純度爲9 5%以上之結晶1 -蔗果三糖的 方法。此方法中所使用具有果糖轉移活性之酵素的性零， 當然要求由蔗糖成爲1 一蔗果三糖的變換率高，且要求在 色譜分離及結晶化各工程中具有阻礙性作用之Nistose的 生成低。現在，利用果寡糖混合物之工業性製造所利用之 來自黑曲霉酵素之情形之由蔗糖成爲1一蔗果三糖的變換 率爲4 4%，此時之Nistose的生成率爲7% (特願平8 一64682號說明書）。此酵素之性質由所謂結晶1一 蔗果三糖的工業生產觀點而言則仍有需改善的餘地。於是 再進行優良性質之酵素的篩選，並由Penici Ilium rogue fort i及短尾帚霉分別發現新的酵素。此些酵素之性 質，由蔗糖成爲1 -蔗果三糖之變換率最大分別爲4 7% 及5 5 %，此時之Nistose的生成率分別爲7%及4% ( 特願平8 — 77534號，特願平8 - 77539號說明 書）。如此，此些酵素由蔗糖成爲1-蔗果三糖之變換率 及Nistose生成之抑制方面雖比來自黑曲霉之酵素優異， 但在酵素之生產性和安定性中仍留有更需改善之餘地。即 ，期待酵素之生產性和安全性等性質爲與現在果寡糖混合 物之工業性製造所利用之來自黑曲霉酵素爲同等，且由蔗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 8 - 555853 A7 _______B7__ 五、發明説明（6 ) 糖成爲1 一蔗果三糖之變換率性質爲與Penicillium rogueforti及短尾帚霉同等或爲其以上之酵素的開發。 〔發明概要〕 本發明者等人，此次成功地單離出新穎的/3 —呋喃果 糖苷酶基因，且再使用此新穎基因確立其他之Θ -呋喃果 糖苷酶基因的單離方法。 又，本發明者等人成功地作出不顯示/3 -呋喃果糖苷 酶活性之新穎絲狀菌，並再以此絲狀菌作爲宿主確立重組 冷一呋喃果糖替酶之生產系。 再者本發明者等人發現藉由令具有果寡糖移活性之/3 -呋喃果糖苷酶之胺基酸序列變化則可改變其性質，且亦 成功作出令蔗糖之特定的果寡糖，例如1 -蔗果三糖，選 擇性地且效率地生成之/3 -呋喃果糖苷酶變異體。 本發明爲基於前述之發現。 因此，若依據本發明之第一態樣，爲提供新穎的点-呋喃果糖苷酶基因及其所編碼之-呋喃果糖苷酶。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 又，若依據本發明之第二態樣，爲提供使用前述新穎 石一呋喃果糖苷酶基因之Θ -呋喃果糖苷酶基因的單離方 法。 又，根據此本發明之第二態樣之方法，提供新穎的万 -呋喃果糖苷酶。 再者，若依據本發明之第三態樣，爲提供不顯示出 一呋喃果糖苷酶活性之新穎絲狀菌及以其作爲宿主之重組 一 9 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 555853 A7 __B7 五、發明説明（7 ) 冷一呋喃果糖苷酶之生產系。 更且，若依據本發明之第四態樣，爲提供令蔗糖之特 定的果寡糖，例如1 -蔗果三糖，選擇性地且效率地生成 之万一呋喃果糖苷酶變異體。 而依據本發明之第一態樣之ys -呋喃果糖苷酶，爲具 有序列表之序列編號1所示之胺基酸序列。 又，依據本發明之第一態樣之/5 -呋喃果糖苷酶基因 ，爲編碼序列表之序列編號1所示之胺基酸序列。 又，依據本發明之第二態樣之ys -呋喃果糖苷酶基因 之單離方法，爲藉由利用與序列表之序列編號2記載之驗 基序列或含其一部分所組成之鹼基序列之相同性，單離出 /3 —呋喃果糖苷酶基因。 又，依據本發明之第二態樣所單離之新穎/3 —呋喃果 糖苷酶爲含有序列表之序列編號11或13記載之胺基酸 序列或其相同體所組成之多肽。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 再者，依據本發明之第三態樣之絲狀菌，爲藉由令母 曲霉屬絲狀菌染色體D N A上之；5 —呋喃果糖苷酶基因之 一部分或全部予以缺失，而成爲不顯示出-呋喃果糖苷 酶活性之物質。 更且依據本發明之第四態樣之-呋喃果糖苷酶變異 體’爲可令母Θ -呋喃果糖苷酶變異結果所得之具有果糖 轉移活性之Θ -呋喃果糖苷酶變異體，變異爲指在母石-呋喃果糖苷酶之胺基酸序列中，將1個或多數個胺基酸插 入’取代、或缺失，或者對其一終端或兩終端加成，且以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐ〇χ297公釐） -10 - 555853 A7 B7 五、發明説明（8 ) 蔗糖作爲受質並利用A -呋喃果糖苷酶變異體之果糖轉移 反應所生成之果寡糖之成分組成，令與母-呋喃果糖替 酶情形之組成爲不同者。 〔發明之具體說明〕 侬據本發明第一熊樣之jg -眹喃果糖锊塵 依據本發明第一態樣之多肽，爲具有序列表之序列編 號1所示之胺基酸序列。具有此序列編號1所示之胺基酸 序列之多肽，其作用爲具有yS —呋喃果糖苷酶作用之酵素 。又、於本發明之多肽中，含有序列表之序列編號1所示 之胺基酸序列的相同體。此處所謂「其相同體」，意指在 序列編號1所示之胺基酸序列中，被完成數個胺基酸之插 入，取代或缺失、或對其一端或兩端形成加成者，且保持 此点-呋喃果糖苷酶作用之物質。此類「相同體」，若參 照序列編號1所示之序列，則業者顯然可無特別的困難性 地選擇並製造。 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 具有序列編號1所示胺基酸序列之-呋喃果糖苷酶 爲轉移活性高，且以良好的效率生成果寡糖。具體而言， 於使用濃度1 0重量％以上之蔗糖溶液作爲受質之反應中 ，轉移活性爲比水解活性高1 0倍以上，且對果寡糖之變 換率爲50%以上。 级據本發明第一態樣之i8 -眹喃果糖锊脑某因 若依據本發明之第一態樣，則編碼-呋喃果糖苷酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 555853 A7 B7 五、發明説明（9 ) 之新穎基因，被提供爲以含有編碼序列編號1所示胺基酸 序列之D N A序列所組成之D N A斷片。 若依據本發明之較佳態樣’則本發明新穎基因之較佳 具體例，被提供爲以含有序列表序列編號2所示之鹼基序 列所組成之D N A序列所構成的D N A斷片。 一般，若給與蛋白質的胺基酸序列’則將其編碼的鹼 基序列，可參照所謂的密碼表而容易地定出。依此可適當 選擇編號序列編號1所示胺基酸序列的各種鹼基序列。因 此，本發明中所謂的「編碼序列編號1所示胺基酸之 D N A序列」，除了使用具有序列編號2所示之鹼基序列 ，及與其具有簡併關係之密碼組以外’亦爲意指具有相同 鹼基序列且編碼序列編號1所示之胺基酸之鹼基序列。 更且，如前述，於本發明之新穎酵素中，亦包含序列 編號1所示之胺基酸序列的相同體。因此，於本發明之 DNA斷片中，再亦包含編碼此相同體之鹼基序列。 由於本發明之DNA斷片其鹼基序列已被定出，故取 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 得此D N A斷片的一個方法爲依核酸合成之手法將其製造 〇 又，此序列可由黑曲霉（Aspergillus niger)，較 佳爲黑曲霉ACE — 2 — 1株（FERM — P5886或 ATC C 2 0 6 1 1 )使用基因工程之手段而取得。其具 體的方法爲在後述的實施例A中詳細說明。 編碼S -蛀喃果糖ΐ?酶基因之表現 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ' 一 12 - 555853 A7 B7 五、發明説明（ίο) 依據本發明第一態樣之/9 -呋喃果糖苷酶，可經由編 碼其之DNA斷片，於轉形之宿主細胞中製造。更具體而 言，編碼依據本發明第一態樣A -呋喃果糖苷酶的DNA 斷片，或含有可在宿主細胞內複製且以可表現該基因狀態 之DNA分子，特別以表現載體之形態，經由其進行宿主 細胞之轉形，並培養此轉形體。 因此，若依據本發明，再提供含有編碼本發明Θ -呋 喃果糖苷酶基因之D NA分子，特別是表現載體。此 DNA分子可藉由在載體分子中，重組入編碼本發明冷一 呋喃果糖苷酶之D NA斷片而取得。若依據本發明之較佳 態樣，則此載體爲質體。 此依據本發明之D N A的作成可依遺傳工程領域所慣 用之手法爲準而實施。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明中所利用之載體可參考所使用之宿主細胞種類 ，由病毒、質體、粘接質體載體等適當選取。例如，宿主 細胞爲大腸桿菌時可列舉λ噬菌體系之噬菌體、pBR、 P U C系之質體，於枯草桿菌之情形可列舉p U B系之質 體，酵母菌之情形中可列舉YEp、YCp系之載體。 此質體以含有轉形體之選擇標記者爲較佳，且選擇標 記可使用耐藥性標記、營養需求標記基因。其較佳具體例 ，於使用之宿主細胞爲細菌之情形中可列舉安比西林耐受 基因、康霉素耐受基因、四環徽素耐受基因等，於酵母菌 之情形中可列舉色胺酸合成基因（TRP I )、尿嘧啶合 成基因（URA3)、白胺酸合成基因（LEU2)等， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13 - 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（11 ) 霉菌之情形中可列舉潮霉素耐受基因（Hyg)、 Biaraphos耐受基因（B a r )、硝酸還原酶基因（ n i a D )等。 再者，作爲本發明表現載體之DNA分子，爲以具有 冷-呋喃果糖苷酶基因表現上所必要的D N A序列，例如 啓動基因，轉錄起始訊號，核糖體結合部位，轉譯停止訊 號，轉錄終結訊號等轉錄調節訊號，轉譯調節訊號等者爲 較佳。 啓動基因當然爲在含有插入斷片之宿主細胞中可具有 機能的啓動基因，於大腸桿菌中可列舉乳糖操縱子（ lac)、色胺酸操縱子（trp)等之啓動基因，於酵 母菌中可列舉酒精去氫酶基因（ADH)、酸性磷酸酯酶 基（PHO)、半乳糖基因（GAL)、甘油醛一 3 —磷 酸去氫酶基因（GPD)等之啓動基因，於霉菌中可列舉 α —澱粉酶基因（amy)、纖維二糖水解酶基因（ CBHI)等之啓動基因爲較佳使用。 又，於宿主細胞爲枯草桿菌、酵母菌、霉菌之情形中 ，亦有利使用分泌型載體，並令於菌體外分泌產生重組之 万-呋喃果糖苷酶。宿主細胞若爲可令宿主-載體系確立 則任何一種均可利用，但較佳可列舉酵母菌、霉菌等。更 且於後述之本發明第三態樣中亦以使用絲狀菌爲較佳。 前述之轉形體所產生的重組新穎酵素，可依如下處理 而取得。首先令前述之宿主細胞於適當條件下培養，並由 所得之培養物依公知方法，例如離心分離而取得培養上清 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 • LT. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -14 一 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 555853 A7 B7 五、發明説明（12 ) 液或菌體。於菌體之情形中爲將其懸浮於適當的緩衝液中 ’並依冷凍融解、超音波處理，磨碎等將菌體弄碎，並經 由離心分離或過濾取得含有重組之新穎酵素的菌體萃取物 〇 酵素之精製之適當組合慣用之分離、精製法而實施。 例如’可列舉例如，如熱處理之利用耐熱性差異之方法、 如鹽沈澱及溶劑沈澱之利用溶解性差異之方法，如透析、 超過濾、凝膠過濾及S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳之利用 分子量差異之方法，如離子交換層析之利用電荷差異之方 法，如親和性層析之利用專一性親和性之方法，如斥水層 析、逆相層析之利用斥水性差異之方法、及如等電點電泳 之利用等電點差異之方法等。 使用依據本發明第一態樣之S - P关喃果糠符酶製浩果寡糖 更且若依據本發明，其爲提供使用前述重組宿主或重 組之ys -呋喃果糖苷酶，製造果寡糖之製造方法。 即，依據本發明之果寡糖之製造方法，爲令前述之重 組宿主或重組之-呋喃果糖苷酶，與蔗糖接觸而施行。 依據本發明之重組宿主或重組之-呋喃果糖苷酶與 蔗糖之接觸態樣及其條件，只要重組之新穎酵素爲以可作 用於該糖之樣態則無特別限定。若示出令於溶液中接觸時 之較佳態樣則爲如下。即，蔗糖之使用濃度，若爲可溶解 所用之糖的範圍，則可考慮本酵素之活性，反應溫度等予 以適當選擇，但一般爲以5〜8 0%之範圍，更佳爲3 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0'〆297公釐） -15 - 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（l3 ) 〜7 0%之範圍。在糖與酵素之反應中，反應溫度及P η 條件爲以在重組之新穎酵素的最適條件下進行爲較佳。依 此，一般爲在30〜80 °C左右、ρΗ4〜10左右之條 件下進行，較佳爲40〜70 °C、ρΗ5〜7之範圍。 又，亦可適當選擇重組之新穎酵素的精製程度，亦可 直接使用來自轉形體之培養上清液或菌體破碎物之粗酵素 ，又，亦可利用以各種精製工程所得之精製酵素。再者亦 可使用經過各種精製手段所單離精製之酵素。 再者，酵素亦可以依常法於擔體上被固定化之狀態與 蔗糖接觸。 生成之果寡糖可經由令反應液依公知方法予以精製而 取得。可列舉例如，加熱令酵素失活後，經活性炭脫色， 並再以離子交換樹脂予以脫鹽之方法。 依據本發明第二態樣S _眹喃果糖μ酶基因之單離^法 於依據本發明第二態樣之基因單離方法中’所利用之 鹼基序列爲序列編號2所示者。 於依據本發明第二態樣之基因單離方法中’爲利用與 序列表序列編號2所示之鹼基序列或含其一部分所構成之 鹼基序列的相同性。其具體方法可列舉， ① 令預測含有-呋喃果糖苷酶基因之基因庫’以該 鹼基序列作爲探針予以篩選之方法。 ② 根據該鹼基序列資料調製引子，並以預測含有点一 呋喃果糖苷酶基因之樣品作爲鑄模實施P C R之方法。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ -16 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（14 ) 若更具體說明前述①之方法，則其方法爲含有 準備預測含有Θ -呋喃果糖苷酶基因之基因庫的工程 使用序列表序列編號之記載之鹼基序列或含其一部分 所構成之鹼基序列，篩選該基因庫，並將與該序列表序列 編號2記載之鹼基序列或含其一部分所構成之鹼基序列雜 交的序列由基因庫選出，其後將所選出之序列予以分離之 工程、及 由基因庫所選出、分離之序列，分離出—呋喃果糖 苷酶基因之工程。 此處，基因庫可爲染色體庫、cDNA庫之任一者均 可。基因庫之製作可依公知方法實施。 又，在基因庫的篩選中，以使用序列編號2記載之鹼 基序列或含其一部分所構成之鹼基序列，較佳爲以含有序 列編號2記載之鹼基序列之一部分所構成之鹼基序列，即 以其作爲探針者較佳。又，此探針以被標幟者爲較佳。 基因庫之篩選方法，可經由標幟探針之方法及將此標 幟、所選出之序列分離，再由此分離序列分離出Θ -呋喃 果糖苷酶基因，乃爲依基因工程領域所慣用之手法，於適 當地選擇條件下實施即可。由於序列編號2之序列已被提 供，故業者可容易地選擇此些之手法及條件。 又，若具體說明前述②之方法，則其方法爲含有 準備序列表序列編號2記載之鹼基序列或含其一部分 所構成之鹼基序列所作成之引子的工程、 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -17 - 555853 A7 ____B7_ 五、發明説明（15 ) 使用該引子，並以預測含有ys -呋喃果糖苷酶基因之 樣品作爲鑄模實施p c R之工程、及 由所放大之P CR產物，分離—呋喃果糖苷酶基因 之工程。 此處，所利用之引子的調製，預測含有-呋喃果糖 苷酶基因之樣品的調製，P CR，乃爲依基因工程領域所 慣用之手法，於適當地選擇條件下實施即可。由於序列編 號2之序列已被提供，故業者可容易地選擇此些之手法及 條件。 依據本發明-呋喃果糖苷酶基因之單離方法所適用 之對象，若爲預測含有Θ -呋喃果糖苷酶者則無特別限定 ，例如爲真菌類，更具體爲屬於曲霉屬、青霉屬、或帚霉 屬之微生物。 由依據本發明第二熊樣某因之單離方法所得之新穎Θ —眹 喃果糖Μ酶及：¾:某闵 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由依據本發明第二態樣基因之單離方法所提供之新穎 冷-呋喃果糖苷酶爲具有序列表序列編號11或13所示 之胺基酸序列。 更且，依據本發明之Θ -呋喃果糖苷酶爲包含序列表 序列編號1 1或1 3所示之胺基酸序列之相同體。此處所 謂「其相同體」，意指在序列編號1 1或1 3所示之胺基 酸序列中，被完成數個胺基酸之插入、取代或缺失、或對 其一端或兩端形成加成者，且保持此yS -呋喃果糖苷酶作 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18 - 555853 A7 B7 五、發明説明（l6) 用之物質。此類「相同體」，若參照序列編號11或13 所示之序列，則業者顯然可無困難性地選擇並製造。 具有依據本發明序列編號11及13記載之胺基酸序 列之-呋喃果糖苷酶，爲轉移活·性高，且以良好的效率 生成果寡糖。具體而言，於使用3 0%以上之蔗糖作爲受 質之反應中，轉移活性與水解活性相比較分別爲高至4倍 以上及7倍以上，且對果寡糖之變換率均爲5 0%以上。 編碼由依據本發明第二態樣基因之分離方法所提供之 沒-呋喃果糖苷酶之新穎基因，爲含有編碼序列表序列編 號11或13所示胺基酸序列或其相同體之DNA序列所 構成者。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一般，若給與蛋白質的胺基酸序列，則將其編碼的鹼 基序列，可參照所謂的密碼表而容易地定出。依此可適當 選擇編號序列編號11或13所示胺基酸序列的各種鹼基 序列。因此，本發明中所謂的「編碼序列編號1 1或1 3 所示胺基酸序列之D N A序列」，除了使用具有序列編號 1 2或1 4所示之鹼基序列，及與其具有簡併關係之密碼 組以外，亦爲意指具有相同鹼基序列且編碼序列編號1 1 或1 3所示胺基酸序列之鹼基序列。 若依據本發明之較佳態樣，則本發明新穎基因之較佳 具體例，被提供爲以含有具序列表序列編號1 2或1 4所 示鹼基序列之D N A序列所組成之D N A斷片。 更且，如前述，於本發明之新穎基因所編碼之酵素中 ，亦包含序列編號1 1或1 3所示之胺基酸序列的相同體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~~ ~ 19 ~ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 555853 A7 _____B7 五、發明説明（l7 ) 。因此，於本發明之DNA斷片中，再亦包含編碼此相同 體之鹼基序列。 由於本發明之D N A斷片其鹼基序列已被定出，故取 得此D N A斷片的一個方法爲依核酸合成之手法將其製造 〇 又’此序列可由Penicillium roqueforti或短尾帚 霉（Scopulariopsis brevicaulis)，較佳爲 Penicillium roqueforti I AM 7 2 5 4 株或短尾帚 霉I F04843株，使用基因工程之手段而取得。其具 體的方法爲在後述的實施例B中詳細說明。 依據本發明第三態樣之不顯示出θ - n夫喃果糖g酶活件之 曲霉屬絲狀菌及其取得 所謂依據本發明第三態樣之不顯示出5 -呋喃果糖苷 酶活性之曲霉屬絲狀菌，意指使用該絲狀菌培養所得之培 養上清液和/或弄碎菌體所得之粗酵素，令以蔗糖作爲受 質予以反應時，對受質蔗糖不會產生變化之物質。 此類絲狀菌，可藉由編號Θ -呋喃果糖苷酶之基因本 身之失活而取得。更且，亦可藉由編碼Θ -呋喃果糖苷酶 基因之表現所相關之機構失活、和/3 —呋喃果糖苷酶蛋白 質生產，分泌所相關之機構失活等而取得。 然而，於考慮利用不顯示出Θ -呋喃果糖苷酶活性之 絲狀菌，作爲生產重組Θ -呋喃果糖苷酶宿主之情形中， 由所謂的變異安定性和酵素生產性之觀點而言，以編碼万 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ ~ -20 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 555853 A7 B7 五、發明説明（is ) -呋喃果糖苷酶基因本身之失活爲較佳。特別以脫落編碼 石-呋喃果糖苷酶區域之一部分或全部者爲較佳。 用於取得此類絲狀菌之方法雖可利用令母曲霉屬絲狀 菌經由所謂的NTG (1_甲基一 2 —硝基一 2 —亞硝基 胍），紫外線之變異原處理，誘發變異之方法，但以利用 重組D N A技術之方法爲較佳。 利用重組D N A技術令A -呋喃果糖苷酶基因失活化 之方法，爲利用相同重組機構而進行之方法，大致上可列 舉一階段基因標的化法及二階段基因標的化法2種方法。 於一階段基因標的化法中，爲利用插入型載體或取代 型載體。 準備含有失活化Θ -呋喃果糖苷酶基因、和用於選擇 轉形體之選擇標記基因所組成之載體作爲插入型載體。此 處，所謂失活化一呋喃果糖苷酶基因，意指除了於分開 之兩處被導入單獨下可令標的Θ -呋喃果糖苷酶基因產生 失活之變異（較佳爲缺失）以外，與標的θ -呋喃果糖苷 酶無不同處之Θ -呋喃果糖苷酶基因。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 令此類插入型載體導入細胞中，於兩處變異處間之區 域中，可引起與染色體上之標的-呋喃果糖苷酶基因相 同的重組。其結果，令染色體上標的θ -呋喃果糖苷酶基 因變爲2複製。任一者之標的Θ -呋喃果糖苷酶均分別地 於一處導入變異，而可令標的-呋喃果糖苷酶失活化。 另一方面，準備含有在標的Θ —呋喃果糖苷酶基因內 部插入選擇標記基因，並被分段之/3 -呋喃果糖苷酶基因 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ _ 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（19 ) 之載體作爲取代型載體。 令此取代型載體導入細胞中，令選擇標記基因之兩側 來自Θ —呋喃果糖苷酶基因的區域中分別引起相同的重組 。其結果，由於染色體上之標的yS -呋喃果糖苷酶基因被 選擇標記基因所插入的基因所取代，而令標的点一呋喃果 糖苷酶基因失活化。 又，於二階段基因標的化法中，可利用直接取代法及 打跑（hit and run)取代法。 直接取代法之第一階段爲，與一階段基因標的化法之 使用取代型載體之方法進行同樣之操作。第二階段爲在載 體上，製作被導入至少1個以上之於單獨下可令標的沒-呋喃果糖苷酶基因失活之變異（較佳爲缺失）之標的石-呋喃果糖苷酶基因。令此載體導入細胞中，於變異處的兩 側區域，今其引起與染色體上之以選擇標記基因所分段之 標的Θ —呋喃果糖苷酶基因相同的重組。其結果，標的冷 -呋喃果糖苷酶基因，可被失活化之標的-呋喃果糖苷 酶基因所取代。被引起此類重組之菌株，可經脫落標記基 因作爲其指標而被選出。 另一方面，於打跑（hit and run)取代法之第一階 段中，準備被導入至少1個以上之於單獨下可令標的石一 呋喃果糖苷酶基因失活之變異（較佳爲缺失）之標的冷一 呋喃果糖苷酶基因及選擇標記基因所組成之載體。令此載 體導入細胞中，並於標的/5 -呋喃果糖苷酶基因上之變異 處的上游區域，令其引起與染色體上之標的卢一呋喃果糖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 22 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 555853 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 苷酶基因相同的重組。其結果，於染色體上，含有選擇標 記基因之載體本身爲以被二複製之標的yg -呋喃果糖苷酶 基因所夾住之形式，而在二複製之標的-呋喃果糖苷酶 基因中，產生含有及不含有變異者。接著，令二複製之標 的々一呋喃果糖苷酶基因之間所夾住之載體部分予以成圈 排出（loop-out)，令於變異處之下游區域再產生相同重 組。藉此，令含有選擇標記基因之載體與一複製之標的汐 -呋喃果糖苷酶基因脫落，而可將染色體上之基因以含有 變異之標的/3 -呋喃果糖苷酶基因取代。被引起此類重組 之菌株，可經脫落標記基因作爲其指標而被選出。此時， 可知即使令於變異處之下游部分引起相同之重組作爲第一 階段，並續於上游部分令以引起相同之重組，亦可取得同 樣之結果。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於進行以上之操作中，若爲可選擇轉形體者則均可使 用作爲選擇標記基因。又，於二階段基因標的化法中，由 於具有選拔此選擇標記基因脫落株之操作，故以可陽性地 選擇此選擇標記基因脫落株之例如硝酸還原酶基因（ niaD)、乳清酸核苷酸去碳酶基因（pyrG)、 ATP硫醯酶基因（s C)等爲較佳。 依據本發明第三態樣之絲狀菌具體例可列舉黑曲霉 N I A 1 6 0 2 株。 以依據本發明第三熊樣之不顯示出/3 -呋喃果糖g酶活性 之絲狀菌作爲宿主之重組/3 -蛀喃果糖苷酶的製造方法_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -23 - 555853 A7 B7 五、發明説明（21 ) 依據本發明之絲狀菌，爲於重組Θ -呋喃果糖苷酶之 製造上所較佳使用者。具體而言，今編碼Θ -呋喃果糖Μ 酶之D ΝΑ斷片，以含有可在本發明宿主細胞內複製且可 表現同基因狀態之DNA分子，特別是以表現載體之形態 ，並以其進行依據本發明絲狀菌之轉形，且於此轉形體中 ，具有-呋喃果糖苷酶活性之物質爲以單一物質之形式 ，產生重組—呋喃果糖苷酶。 於上述中D NA分子的較佳態樣爲質體，可依基因工 程領域所慣用之手法實施。 若依據本發明之較佳態樣，則編碼/5 -呋喃果糖苷酶 之DNA斷片的具體例可列舉，前述編碼依據本發明第一 態樣/3 -呋喃果糖苷酶之DNA，編碼依據本發明第二態 樣方法所單離之新穎-呋喃果糖苷酶之D NA、後述編 碼依據本發明第四態樣-呋喃果糖苷酶變異體之D NA 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，以依據此第三態樣之絲狀菌作爲宿主，用於表現 点一呋喃果糖苷酶之表現系的較佳例，可利用關於前述本 發明第一態樣所說明之表現系。 具體而言，前述質體以含有轉形體之選擇標記基因者 爲較佳，且可使用耐藥性標記基因，營養需求標記基因作 爲選擇標記基因。其較佳具體例可列舉潮霉素耐受基因（ Hy g ) 、Biaraphos耐受基因（B a r )、硝酸還原酶 基因（niaD)、乳清酸核苷酸去碳酶基因（ pyrG) 、ATP —硫醯酶基因（sC)等。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 一 -24 - 555853 A7 ______B7 五、發明説明（22 ) 更且，作爲表現載體之DNA分子，以具有点一呋喃 果糖苷酶基因表現上所必要的D N A序列，例如啓動基因 ，轉錄起始訊號、轉譯終止訊號、轉錄終結訊號等之轉錄 調節訊號、轉譯調節訊號等者爲較佳。啓動基因當然爲在 含有插入斷片之本發明宿主中可具機能之啓動基因，其可 列舉α -澱粉酶（amy)、葡萄糖澱粉酶基因（g 1 a )、/5 -呋喃果糖苷酶基因、甘油醛一 3 -磷酸脫氫酶（ gpd)、磷酸甘油酸激酶（pgk)等之啓動基因爲可 較佳使用者。 又，亦有利將表現載體作成分泌型載體，令於菌體外 分泌生產重組之-呋喃果糖苷酶。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用依據本發明第三態樣絲狀菌之_呋喃果糖苷酶 的生產係爲將經編碼-呋喃果糖苷酶D N A所轉形之本 發明絲狀菌於適當條件下培養，並由所得之培養物依公知 之方法，例如依離心分離而取得培養上清液或菌體。於菌 體之情形中，可將其懸浮於適當的緩衝液中，並經冷凍熔 解、超音波處理、磨碎等而令菌體破碎，經由離心分離或 過濾可取得含有重組Θ -呋喃果糖苷酶之菌體萃取的。 依據本發明第四態樣之θ -眹喃果糖μ酶變異體 依據本發明第四態樣之/3 -呋喃果糖苷酶變異體，爲 令母—呋喃果糖苷酶變異所得結果者。更且，本發明中 ，此變異爲意指在母Θ-呋喃果糖苷酶之胺基酸序列中， 令以1個或複數個胺基酸之插入、取代或缺失、或者對其 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 〇c -25 - 555853 A7 _____B7 五、發明説明（23 ) 一端或兩端進行加成，且以蔗糖作爲受質之利用yS -呋喃 果糖苷酶變異體之果糖轉移反應所生成之果寡糖之成分組 成，爲令與母-呋喃果糖苷酶時之組成不同者。 於本發明中，母yS -呋喃果糖苷酶若爲具有果糖轉移 活性之-呋喃果糖苷酶則對其來源並無限制，較佳爲來 自真菌類，特別以來自屬於曲霉屬、青霉屬、帚霉屬、鐮 刀菌屬、或Oleobasidium屬之/5 -呋喃果糖苷酶爲較佳。 更佳爲，來自曲霉之yS -呋喃果糖苷酶，即以前述之依據 本發明第一態樣之序列表序列編號1所示胺基酸序列所組 成之Θ -呋喃果糖苷酶或其相同體。又，母-呋喃果糖 苷酶亦可爲前述之由依據本發明第二態樣單離方法所得之 冷一呋喃果糖苷酶或其相同體。 若依據本發明之較佳態樣，則於母石-呋喃果糖苷酶 爲由序列編號1所示之胺基酸序列所組成者之情形中，其 具體例可列舉由該序列中之第1 70、300、3 1 3及 3 8 6個胺基酸所組成之群選出1個或2個以上胺基酸爲 經其他胺基酸殘基所取代組成之變異體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 若依據本發明之較佳態樣， 較佳者可列舉第1 7 0個之胺基酸爲以選自色胺酸、 苯基丙胺酸、及酪胺酸之芳香族胺基酸，更佳爲以色胺酸 所取代者、 第3 0 0個之胺基酸爲以選自色胺酸、纈胺酸、麩胺 酸、及天冬胺酸之胺基酸所取代者、 第3 1 3個之胺基酸爲以選自離胺酸、精胺酸、及組 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 555853 Α7 Β7 五、發明説明（24 ) 胺酸鹼性胺基酸，更佳爲以離胺酸或精胺酸所取代者、 第3 8 6個之胺基酸爲以選自胺基酸、精胺酸、及組 胺酸之鹼性胺基酸，更佳爲以離胺酸所取代者。此些變異 體爲具有由蔗糖令1-蔗果三糖選擇性地且效率地生成的 有利性質。 若依據本發明之特佳態樣，則爲在第1 7 0個、第 3 0 0個及第3 1 3個之胺基酸色胺酸、色胺酸、及離胺 酸分別以色胺酸、纈胺酸、及離胺酸所取代者。此些變異 體爲具有由蔗糖令1-蔗果三糖爲更選擇性地且效率地生 成的有利性質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，母yS -呋喃果糖苷酶爲序列編號1所示之胺基酸 序列之相同體時，其具體例可列舉由相當於前述第1 7 0 、300、313、及386號之胺基酸位置的胺基酸所 組成之群所選出1個或2個以上之胺基酸殘基爲經其他胺 基酸殘基所取代者。此處，於序列編號1所示胺基酸序列 所組成之母y3 -呋喃果糖苷酶相同體中所應被取代之胺基 酸殘基之位置，可經由公知之算法依胺基酸序列比較而輕 易地選擇。另一方面，於經由公知之算法依胺基酸序列比 較爲困難時，可經由比較酵素之立體構造而特定出應被取 代之胺基酸殘基位置。 依據本發明第四熊樣之θ -眹喃果糠甘酶變體之製作 依據本發明第四態樣之万一呋喃果糖苷酶變體，可藉 由重組DNA技術、多肽合成技術等而予以製作。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） - 27 - 555853 A7 B7 五、發明説明（25 ) 於使用重組DNA技術之情形中’於取得編碼母万- 呋喃果糖苷酶之DNA，並令此DNA內之特異部位發生 突變取代編碼之胺基酸後，令含有施以變異處理之D N A 的表現載體形至宿主細胞，並培養轉形細胞，則可調製 -呋喃果糖苷酶變異體。 於基因之特定部位導入突變的數種方法爲Gapped duplex法（Methods in Enzymology, 1 5 4 ， 3 5 0 ( 1 9 8 7 ) )、Kunkel 法（Methods in Enzymology, 154，367 (1987))等業者所公知。此些方法 可利用於令編碼Θ -呋喃果糖苷酶之D N A內之特異部位 發生突變。變異處理後之D ΝΑ的鹼基序列可依Makisam-Gilbad之化學修飾法（Methods in Enzymology,6 5， 499 (1980))和雙去氧核苷酸鏈終止法（ Gene ，19 ，269 (1982))等將其確認，冷 一呋喃果糖苷酶變異體之胺基酸序列，可由經確認之鹼基 序列將其解讀。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依據本發明第四態樣之S -映喃果糖g酶變異體之生產 依據本發明第四態樣之Θ -呋喃果糖苷酶變異體，可 令編碼其之DNA斷片，以含有可在宿主細胞內複製且可 表現同基因狀態之D NA分子，特別以表現載體之形態於 宿主細胞進行轉形，並於此宿主細胞中令其產生。 因此，若依據本發明，爲提供含有編碼本發明-呋 喃果糖苷酶變異體基因之DNA分子，特別是表現載體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 28 _ 555853 A7 ____B7 五、發明説明（26 ) 此DNA分子，可藉由在載體分子中重組入編碼依據本發 明—呋喃果糖苷酶變異體之D NA斷片而取得。若依據 本發明之較佳形態，則此載體爲質體。 此依據本發明之D NA的製作爲依基因工程領域中所 模用之手法實施即可。 本發明中所利用之載體，可一邊參考所使用之宿主細 胞種類，而由病毒、質體、粘接質體載體等序以適當選擇 。例如，宿主細胞爲大腸桿菌之情形可列舉λ噬菌體系之 噬菌體、pBR、pUC系之質體、枯草桿菌之情形可列 舉PUB系之質體、酵母菌之情形可列舉YEp、YRp 、YCp系之質體載體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 此質體以含有轉形體之選擇標記者爲較佳，且選擇標 記可使用耐藥性標記、營養需求標記基因。其較佳之具體 例，於使用之宿主細胞爲細菌之情形中可列舉安比西林耐 受基因、康霉素耐受基因、四環徽素耐受基因等，於酵母 菌之情形中下可列舉色胺酸合成基因（TRPI)、尿嘧 啶合成基因（URA3)、白胺酸合成基因（LEU2) 等，霉菌之情形中可列舉潮霉素耐受基因（Hyg)、 Biaraphos耐受基因（B a r )、硝酸還原酶基因（ n i a D )等。 再者，作爲本發明表現載體之DNA分子，爲以具有

編碼-呋喃果糖苷酶變異體基因表現上所必要的D NA 序列，例如啓動基因，轉錄起始訊號，核糖體結合部位， 轉譯停止訊號，轉錄終結訊號等轉錄調節訊號，轉譯調節 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 ~ _ _ 555853 A7 B7 五、發明説明（27) 訊號等者爲較佳。 啓動基因當然爲在含有插入斷片之宿主細胞中可具有 機能的啓動基因，於大腸桿菌中可列舉乳糖操縱子（ lac)、色胺酸操縱子（trp)等之啓動基因，於酵 母菌中可列舉酒精去氫酶基因（ADH)、酸性磷酸酯酶 基（PHO)、半乳糖基因（GAL)、甘油醛一 3 —磷 酸去氫酶基因（GPD)等之啓動基因，於霉菌中可列舉 澱粉酶基因（amy)、葡糖澱粉酶基因（gal) 、纖維二糖水解酶基因（CBH I ) yS -呋喃果糖苷酶基 因等之啓動基因爲較佳使用。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 又，於宿主細胞爲估草桿菌、酵母菌、霉菌之情形中 ，亦有利使用分泌型載體，並令於菌體外分泌產生重組之 点一呋喃果糖苷酶變異體。宿主細胞若爲可令宿主-載體 系確立則任何一種均可利用，但較佳可列舉酵母菌、霉菌 等。又，無蔗糖資化性之宿主，由於除了經表現之万一呋 喃果糖苷酶變異體以外並不存在以蔗糖作爲受質之酵素， 故不會精製；3 -呋喃果糖苷酶，而可於粗酵素之狀態下利 用於果寡糖之製造，故其在利用上爲特佳。因此，若依據 本發明之較佳態樣，則宿主細胞可使用依據前述本發明第 三態樣之絲狀菌。又，再者，可利用屬於木霉屬之數種菌 株和數種酵母作爲無蔗糖資化性之宿主（Oda, Y.和Ouchi ,K., Appl. Enriron. Microbiol., 55 J 1 7 4 2 — 1 7 4 7，1 9 8 9 ) o 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -30 - 555853 A7 ______B7 ___ 五、發明説明（28 ) 使用依據本發明第四態樣夕θ —陆喃爭精益酯變異 果寡糖 更且若依據本發明，其爲提供使用前述-呋喃果糖 苷酶變異體之果寡糖的製造方法。此果寡糖之製造方法， 可藉由令具有前述y9 -呋喃果糖苷酶變異體生產能力之宿 主細胞或iS -呋喃果糖苷酶變異體，與蔗糖接觸而施行。 使用此ys -呋喃果糖苷酶變異體之果寡糖製造方法， 可在與前述使用依據本發明第一態樣3 -呋喃果糖苷酶之 果寡糖製造方法實質上同樣之條件下實施。又，其精製亦 可爲相同。

實施例 實施例A 實施—例A 1 : θ -呋喃果糖苷酶之精製及部分胺基酸序列 之決定 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由黑曲霉 ACE — 2 — 1 (ATCC2061 1)菌 體之/3 —呋喃果糖苷酶的精製，可依Agric. Biol.Chem. 53，667 - 673 (1989)記載之方法進行，以 電泳性地取得均勻樣品。 精製之酵素以離胺醯肽鏈內切酶（生化學工業公司） 予以分解，並將生成之胜肽以HPLC ( Wat ers公司）分 級。使用TSKge 1 ODS120T柱（東曹公司） ，且分級之各胜肽的胺基酸序列使用蛋白質定序儀（島津 製作所公司）予以解析。由其，決定4處之胺基酸部分序 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） - 31 - 555853 A7 _____Β7_ 五、發明説明（29 ) 列。決定之4處胺基酸部分序列爲如序列表之序列編號3 〜6所示® 另一方面，以離胺醯肽鏈內切酶分解前之酵素蛋白的 N末端同樣地使用蛋白質定序儀予以解析。其序列爲如序 列表之序列編號7所示。 复施例A 2 :經由P CR法取得y3 -呋喃果糖苷酶基因之 部分D N A斷片 將黑曲霉八0£ — 2 — 1(八丁（：0 2 0 6 1 1 ) 植菌於YPD培養基（1%酵母萃取物、2%聚蛋白膝、 2%葡萄糖）並培養。其後，集菌並冷凍乾燥。將其細粉 碎後，加入8毫升TE緩衝液（l〇mM Tr i s — U C il ( p Η 8 . 0) ，ImM EDTA)，並再加入 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4毫升含有1 〇%SDS之TE緩衝液，於60°C保溫 30分鐘。其後，加入12毫升酚·氯仿·異戊醇（25 :24 : 1)並激烈振盪。離心後，將水層移至另外的容 器，並於其中加入1毫升之5M醋酸鉀溶液，於冰中放置 1小時以上。離心後，將水層移至另外的容器，加入 2. 5倍容量之乙醇，令以乙醇沈澱。令沈澱物乾燥後， 溶解於5毫升之TE緩衝液中，並加入5微升之1 0毫克 /毫升RNa s e A (Sigma公司）溶液，於37 °C ( 保溫1小時，並再加入5 0微升之2 0毫克/毫升蛋白酶 K (和光純藥公司），於3 7 °C保溫1小時。其次，加入 3毫升之PEG溶液（20%聚乙二醇6000、2. 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） - 32 - 555853 A7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 B7五、發明説明（30 ) Μ氯化鈉），含DNA沈澱。將沈澱物溶解於500微升 之Τ Ε緩衝液中，以酚·氯仿·異戊醇萃取2次，令以乙 醇沈澱。沈澱物以7 0%乙醇洗淨後、乾燥，並溶於適量 之ΤΕ緩衝液中，作成染色體DNA試料。 P C R 爲使用 Perkin Elmer Cetus D N A Thermal Cycler進行。即，加入如上述所調製之染色體DNA 0. 5微升（相當1微克量）、10倍濃度之反應緩衝液 [5 0 0 m M KC 芡、100mM Tris — HC 芡 (pH8. 3) 、15mM MgCj?2、l%Triton X-100〕10 微升、2. 5 m M dNTP 溶液 8 微 升、1 m M之以序列表序列編號8之十股D N A引子作爲 引子# 1及以序列表序列編號9之一股D N A引子作爲引 子#2各1微升、Ta g DNA聚合酶（和光純藥公司 )0. 5微升、滅菌79微升作成100微升。反應爲在 94 °C、5分鐘前處理後、進行94 °C1分鐘（變性步驟 )、54 °C 2分鐘（粘接步驟）、7213分鐘（延長步 驟）之培養共25次循環。最後於72 °C下進行7分鐘培 養並終止反應。所得之反應液以酚.氯仿.異戊醇萃取， 其後進行乙醇沈澱。將此沈澱物溶解於2 0微升之Τ E緩 衝溶液，進行瓊脂糖凝膠電泳，並將專一性放大之約 8 0 Ob p的帶（b a n d)依常法切出並回收DNA斷 片，進行乙醇沈澱。 將DNA沈澱物溶解於8微升之滅菌水中，並使用 DNA鈍端化組套（寶酒造公司）將末端平滑化。更且， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~一 33 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（31 ) 利用T4DNA激酶（日本Ge n e公司）將5 /末端磷 酸化後，選殖至PUC119之Sma I部位。關於此質 體之插入斷片，爲使用Pharmacia公司製螢光定序儀 A L F r e d DNA定序儀決定其鹼基序列。其結果， 所決定之P C R斷片的鹼基序列爲如序列表之序列編號 10所示。此PCR斷片之全長爲788bp，此DNA 斷片所編碼之胺基酸序列中，來自5 >側之1 4個胺基酸 爲相當於序列表序列編號3之第7〜2 0個胺基酸，由 5 >側之第1 7 6〜1 9 5個之胺基酸爲相當於序列表序 列編號4之第1〜2 0個胺基酸，又，來自3 >側之1 0 個胺基酸爲相當於序列表之序列編號5之第1〜1 0個胺 基酸，爲與由精製/3 -呋喃果糖苷酶所決定之胺基酸序列 一致。 實施例A 3 :含有編號-呋喃果糖苷酶之完全長度 D N A斷片的選殖株的篩選 將上述實施例A2所調製之染色體DNA樣品約10 微克，以限制酶E c 〇 R I切開後，進行瓊脂糖凝膠電泳 ，依Molecular Cloning (冷泉港，1 9 8 2年）記載之 方法，點漬於Hybond-N +膜（Amersham公司）上。 此膜與使用上述實施例A 2所作成之7 8 8 b p PCR斷片，使用ECL直接DNA/RNA標幟·檢測 系統（Amersham公司）進行南向解析。其結果，可得知在 約1 5 k b p之位置上存在有與探針雜交之DNA斷片。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -34 — 555853 A7 B7 五、發明説明（32 ) 因此將前述之染色體DNA樣品約2 0微克；以限制 酶E c oR I切開後，進行瓊脂糖凝膠電泳，並依 Molecnlar C 1 on i ng (前述）記載之方法，分離、回收 15kbp附近之DNA斷片。 將如此回收之約15kbp DNA斷片約〇. 5微 克及事先以限制酶Hi nd I I I和EcoRI雙重切 開之ADASH I I 1微克予以連接，並使用 Stratagen公司製之生體外包裝套組G I G A PACK II Go 1 d予以包裝，並經由令其感染至大腸桿菌 XL1— B 1 ue MRA (P2)作成基因庫。 使用前述之788bp PCR斷片作爲探針，使用 ECL直接DNA/RNA標幟·檢測系統（Amersham公 司）進行噬菌斑雜交作用，由1 5，000個噬菌斑中取 得2 5個陽性選殖株。對於其中3個陽性選殖株施行二次 篩選，將陽性選殖株純化後，調製其噬菌體DNA，並以 限制酶進行解析。其結果，可得知任一選殖株均具有相同 之約15kbp之EcoRI斷片。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 對此約1 5 kb p之E c oR I斷片將必要的DNA 區域以適當的限制酶予以小斷片化後，於質體載體P U C 1 1 8或PUC 1 1 9中進行繼代選殖。由所得之繼代選 殖株依常法調製其質體DNA，並與前述實施例A2同樣 地使用Pharmacia公司製II光定序儀A L F r e d DNA定序儀決定其鹼基序列。其結果’取得如序列表之 序列編號2所示之鹼基序列。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 35 - 555853 A7 B7 五、發明説明（33) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例.A 4 :經由綠陡木霉（Trichoderma viride)之冷 -呋喃果糖苷酶基因的表現 由實施例A 3所調製之噬菌體DNA，調製含有編碼 冷一呋喃果糖替酶基因之約5. 5 kb ρ的Hind I I I 一 Xhol斷片，並將其連結至質體載體PUC 119之Hind I I I - Sal I部位，取得質體 p A W 2 0。 另一方面，將質體pDH2 5 (D. Cullen等人，（ 1 9 8 7 ) Gene, 57，21 — 26)以 EcoRI 部分 切開，並連結Xb a I連結子（linker)後，再以 Xb a I切開，並調製來自構巢曲霉（Aspergillus nidulans) t r p C基因之啓動基因、終止基因及來自大 腸桿菌潮霉素B磷酸化酵素基因所構成之潮霉素耐受基因 表現卡匣之3 k b p的Xb a I斷片。將此斷片連結於質 體PAW20之XbaI部位並構築成質體PAW20— H y g (圖 1 )。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 令綠啶本霉以種（s e e d)培養基（3%葡萄糖、 〇· 1%聚蛋白膝、1%酵母萃取物、〇· 14%硫酸銨 、〇· 2%磷酸二氫鉀、〇· 〇3%硫酸鎂）於28 °C培 養20小時，菌體以3000r. p_ m.離心分離10 分鐘集菌，並以〇· 5M蔗糖溶液洗淨2次。 令上述所得之絲狀菌懸浮於含有5毫克/毫升纖維酶 0 η Ο Z k a R — 10 (生化學工業公司）、5毫克/ 紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐了 一 36 555853 A7 B7 五、發明説明（34 ) 毫升 Novozyme 2 3 4 ( Novono 1 D i sc公司）之 0 . 5 Μ 蔗糖溶液中，並於3 0°C慢慢振盪1小時令其形成原子質 體。以過濾除去菌體殘渣，並於2500r. p. m·離 心1 0分鐘，收集原子質體。原子質體以SUTC緩衝液 (0.5M蔗糖、10mM Tris—HC艾（pH 7. 5) 、10mM氯化鈣）洗淨2次，並令最終爲 1 0 7個/毫升懸浮於同緩衝液中。 對原子質體懸浮液1 0 0微升，加入質體PAW2 0 一 Hy g以1毫克/毫升濃度溶解於TE緩衝液之DNA 溶液1 0微升，並於冰冷下放置5分鐘。其後，加入 400微升之PEG溶液（60%聚乙二醇4000、 lOmMTris — HCj?(pH7· 5) 、10mM 氯 化鈣），並再於冰冷下放置20分鐘。其次，以SUTC 緩衝液將原子質體洗淨後，於含有潮霉素B 1 0 〇微克 /毫升及0. 5M蔗糖之馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基（ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) D i f c 〇)中與含有0. 5M蔗糖之馬鈴薯葡萄糖軟洋 菜培養基共同重疊，並於2 8 °C培養5天，且將出現的菌 落視爲轉形體。 所取得之轉形體與母株於上述之種培養基中，2 8°C 培養4天後，培養上清液之yS -呋喃果糖苷酶活性依

Agric. Biol· Chem·， 53 ， 667—673 (1989 )記載之方法測定，結果於母株中未檢測出活性，但於轉 形體中檢測出1 X 1 〇 2單位/毫升之活性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -37 - 555853 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 A7 B7五、發明説明（35 ) 實施例B 眚施例B 1 :對y3 -呋喃果糖替酶生產菌之染色體 D· N A以南向解析 (1 )探針用D、NA斷片之調製 含有由序列表序列編號2鹼基序列所組成之D Ν Α的 質體pAW2 0—Hyg作爲鑄模DNA ’調製使用作爲 P C R探針之D NA斷片。P C R爲使用perkin Elmer Cetus D N A Thermal Cycler進行。即，加入質體 DNA (pAW20-Hyg) 0. 5 微升（相當 0. 1 微克量）、1〇倍濃度之反應緩衝液〔500mM KC5 ' lOOmM Tris-HCj?(pH8. 3) ' 1 5 m M MgCj?2' l%Triton X - 1 00〕 10微升、2_ 5mM dNTP溶液8微升、0· 01 m M之以序列表序列編號1 5之十股D N A引子作爲引子 # 1及以序列表序列編號1 6之一股D Ν A引子作爲引子 #2各2微升、Ta g DNA聚合酶（和光純藥公司） 0. 5微升、滅菌77微升作成100微升。反應爲在 94 °C、5分鐘前處理後、進行94 °C1分鐘（變性步驟 )、54 °C 2分鐘（粘接步驟）、7213分鐘（延長步 驟）之培養共2 5次循環。最後於7 2 °C下進行7分鐘培 養並終止反應。所得之反應液以酚.氯仿.異戊醇萃取， 其後進行乙醇沈澱。將此沈澱物溶解於2 0微升之T E緩 衝溶液，進行瓊脂糖凝膠電泳，並將專一性放大之約 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -38 - 555853 A7 B7 五、發明説明（36 ) 2Kb p的帶（b a n d)依常法切出並回收DNA斷片 ’進行乙醇沈澱。將DNA沈澱物以1微克/微升之濃度 溶解於滅菌水中作成試料。 (2)Θ-呋喃果糖苷酶生產菌之染色體DNA之調製及 南向解析 分別令具有yS 一呋喃果糖苷酶生產能力之絲狀菌體， 即曰本曲霉（Aspergillus japonicus) I F 0 4 4 0 8 株、有刺曲霉（Aspergillus aculeatus) I F 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 3 1 3 4 8 株、Penici11ium roqueforti I A M 7 2 5 4 株、短尾帚霄（Scopulariopsis brevicaul is) IF04843 株、IF05828 株、IF05841 株、IF06588 株、IF031688 株、IFO 3 1 9 1 5株、光滑變異短尾帚霉（Scopulariopsis brevicaulis var.qlabra) I F07239 株、玫塊渗短 尾霉菌（Scopulariopsis roseola) I F 〇 7 5 6 4 株於 YPD液體培養基（1%酵母萃取物、2%聚蛋白膝、2 %葡萄糖）中，2 8°C培養2天。由所得之菌體依上述實 施例A2記載之方法調製染色體DNA。各染色體DNA 樣品約1 0微克以限制酶E c 〇 R I切開後，進行瓊脂糖 洋菜電泳，並依Molecular cloning (前述）記載之方法 ，於Hybond-N +膜（Amersham公司）上進行點漬。 將此膜與使用上述（1 )所調製之約2 kb p的 DNA斷片，使用ECL直接DNA/RNA標幟•檢測 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -39 - 555853 A7 . B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（37) 系統（Amersham公司）進行南向解析。其結果，於曰本 曲霉（Aspergillus japonicus) I F 0 4 4 0 8 株爲在 約 2 0 k b p 之位置、有刺曲霉（Aspergillusaculeatus )IF031348株爲在約13kbp之位置、 Penicillium roqueforti I AM 7 2 5 4 株爲在約 4 k b p 之位置、短尾帚霉（Scopulariopsisbrericaulis )IF04843 株、IF05828 株、IFO 5841 株、IF06588 株、IF031688 株、 I F03 1 9 1 5株爲在約1 Okb p之位置、先滑變異 短尾帚霉(Scop ulariopsisbrevicaul is var. glabra) IF07239株爲在約2. 7kbp之位置，玫瑰疹帚 霉（Scopu 1 ar i ops i s roseo 1 a ) I F 0 7 5 6 4 株爲在 約1 0 k b p之位置分別檢測出雜交帶。因此，顯示藉由 利用此些Θ -呋喃果糖苷酶生產菌與序列表序列編號2記 載DNA之相同性，可分離出/9 一呋喃果糖苷酶基因。 實施例 B 2 : Penicillium roqueforti I A Μ 7 2 5 4 株之/3 —呋喃果糖苷酶基因的分離 Penicillium roqueforti I ΑΜ 7 2 5 4 株之染色 體DNA樣品約2 0微克以限制酶E c 〇 R I切開後，進 行瓊脂糖凝膠電泳，依Molecular cloning (前述）記載 之方法，分離、回收4kbp附近之DNA斷片。 令如此回收之約4kbp DNA斷片約0· 5微克 ，與事先以限制酶E c 〇 R I切開並施以磷酸酯酶處理之 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂297公釐） -40 - 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 38 ) 1 λ g t 1 0 載 體 1 微 克 連 接 y 並使 用St ratagen公司製之 1 1 生 體 外 包 裝 套 組 G I G A Ρ A C K I I Go 1 d予 以包 1 1 裝 並 經 由 令 其 感 染 至 大 腸 桿 菌N Μ 5 1 4 株作成基 因庫 1( 請 1 〇 先 閲 1 1 使 用 實 施 例 B 1 所 用 之 約 2 k bp D N A斷片 作爲 背 1 I 探 針 並 使 用 E C L 直 接 D Ν A / R Ν A 標 幟•檢測 系統 之 注 意 1 1 1 ( Arne r sh am 公 司 ) 進 行 噬 菌 斑 雜交 作用 > 由 約2 5 0 0 0 事 項 1 I 再 1 1 個 噬 菌 斑 中 取得 4 個 陽 性 選 殖 株。 對此 些 陽 性選殖株 實施 填 寫 A 本 二 次 篩 選 將 陽 性 選 殖 株 純 化 後， 調製 噬 菌 體D Ν A ，並 頁 >—^ 1 I 以 限 制 酶 進 行 解 析 j 結 果 可 得 知任 一選 殖 株 均具有相 同之 1 I 約 4 k b P 的 E C 0 R I 斷 片 0 1 1 I 對 此 約 4 k b P 之 E C 0 R I 斷片 將 必 要的D N A區 1 訂 I 域 以 適 當 的 限 制 酶 予 以 小 mi m 片 化後 ，於 P U C 1 1 8 或 1 1 Ρ U C 1 1 9 中 進 行 繼 代 選 殖 。由 所得 之 繼 代選殖株 依常 1 1 法 製 其 質 體 D N A 並 使 用 Pharmac i a公司製螢光定序 1 1 儀 A L F r e d D N A 定 序 儀決 定其 鹼 基 序列。其 結果 嚀 9 取 得 如 序 列 表 之 序 列 編 號 2 所示 之鹼 基 序 列。又， 對應 1 I 之 胺 基 酸 序 列 爲 如 序 列 表 之 序 列編 號1 1 所 示者。 1 1 1 實 施 例 B 3 ； 短 尾 帚 霉 ( Scopu1ar i ops is brev i cau 1 is) 1 1 I F 0 4 8 4 3 株 之 β — 呋 喃果 糖苷 酶 基 因的分離 1 1 將 短 尾 帚 霉 ( Scopu 1 ar i ops i s br ev i cau1i s ) I F 0 1 1 4 8 4 3 株 之 染 色 im W D Ν A 樣 品約 2 0 微 克 ，以 1 I Ε C 0 R I 切 開 後 > 進 行 瓊 脂 糖凝 膠電 泳 > 依 Mo 1 ecu 1 ar 1 I 1 張 紙 尽 準 標 家 國 國 中 用 通 公 97 555853 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 __B7五、發明説明（39 ) (：1〇11丨112(前述）記載之方法，分離、回收1〇1^6 0附 近之D N A斷片。 將如此回收之約lOkbp DNA斷片約〇. 5微 克及事先以限制酶H i n d I I I和E c o R I雙重切 開之ADASH I I 1微克予以連接，並使用 Stratagen公司製之生體外包裝套組G I G A PACK II Go 1 d予以包裝，並經由令其感染至大腸桿菌 XL1— B 1 ue MRA (P2)株作成基因庫。 使用實施例B 1所使用之約2 k b p的DNA斷片作 爲探針，使用E C L直接DNA/RNA標幟·檢測系統 (Amersham公司）進行隨菌斑雜交作用，由約 1 5，000個噬斑中取得3個陽性選殖株。對於此些陽 性選殖株施行二次篩選，將陽性選殖株純化後，調製噬菌 體DNA，並以限制酶進行解析，結果可得知任一選殖株 均具有相同之約1 〇 kb p的E c oR I斷片。 對此約1 0 kb p之E c oR I斷片將必要的DNA 區域以適當的限制酶予以小斷片化後，於P U C 1 1 8或 pUC119中進行繼代選殖。由所得之繼代選殖株依常 法調製其質體DNA，並使用Pharmacia公司製螢光定序 儀ALF r e d DNA定序儀決定其鹼基序列。其結果 ，取得如序列表之序列編號1 4所示之鹼基序列。又，對 應之胺基酸序列爲如序列表之序列編號1 3所示者。 眚施例B 4 :經由綠卩定木霉（Trichoderma viride)之來 本紙張尺度適用中國國家標準( CNS ) A4規格（210X297公麓1 ' -42 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 555853 A7 ____B7_ 五、發明説明（40 ) 自 Penicillium roqueforti I AM 7 2 5 4 株之冷一 呋喃果糖苷酶基因的表現 由實施例B 2所調製之噬菌體DNA，調製含有編碼冷 —呋喃果糖苷酶基因之約4 kb p的E c 〇 R I斷片，並 將其連結至質體載體pUC 1 1 8之E c oR I部位，取 得質體PPRS01。 另一方面，將質體PDH25 (D. Cullen等人，（ 1 9 8 7 ) Gene, 57，21 - 26)以 EcoRI 部分 切開，並連結Xb a I連結子（linker)後，再以 Xb a I切開，並調製來自構巢曲霉（AspergillUS nidulans) t r p C基因之啓動基因、終止基因及來自大 腸桿菌潮霉素B磷酸化酵素基因所構成之潮霉素耐受基因 表現卡匣之3kbp的XbaI斷片。將此斷片連結於質 體PPRS0 1之Xba I部位並構築成質體 pPRSo— Hyg (圖 2) 〇 令綠啶本霉以種（s e e d)培養基（3%葡萄糖、 0. 1%聚蛋白膝、1%酵母萃取物、0. 14%硫酸銨 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、0. 2%磷酸二氫鉀、0. 03%硫酸鎂）於28 °C培 養2 0小時，菌絲體以3 0 0 0 r . p . m .離心分離 10分鐘集菌，並以0. 5M蔗糖溶液洗淨2次。 令上述所得之絲狀菌懸浮於含有5毫克/毫升纖維酶 Onozka R — 10 (養樂多公司）、5毫克/毫升 Novozyme 2 3 4 ( Novono 1 D i sc公司）之 0 · 5 Μ 蔗糖 溶液中，並於3 0°C慢慢振盪1小時令其形成原子質體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 一 一 43 一 555853 A7 __B7 五、發明説明（41 ) 以過濾除去菌體殘渣，並於2500r. p. m.離心 1 0分鐘，收集原子質體。原子質體以SUTC緩衝液 (0.5M 蔗糖、10mM Tris— HCj2(pH 7. 5) 、10mM氯化鈣）洗淨2次，並令最終爲 1 0 7個/毫升懸浮於同緩衝液中。 對原子質體懸浮液1 0 0微升，加入質體 p P RS ο 1 - Hy g以1毫克/毫升濃度溶解於TE緩 衝液之DNA溶液1 0微升，並於冰冷下放置5分鐘。其 後，加入400微升之PEG溶液（60%聚乙二醇 4000 ' lOmMTr i s-HCj? (pH7. 5)、 lOmM氯化鈣），並再於冰冷下放置20分鐘。其次， 以S U T C緩衝液將原子質體洗淨後，於含有潮霉素B 100微克/毫升及0. 5M蔗糖之馬鈴薯葡萄糖洋菜培 養基（Difco)中與含有0· 5M蔗糖之馬鈴薯葡萄 糖軟洋菜培養基共同重疊，並於2 8 °C培養5天，且將出 現的菌落視爲轉形體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 所取得之轉形體與母株於上述之種培養基中，2 8°C 培養4天後，測定培養上清液之β -呋喃果糖苷酶活性。 冷一呋喃果糖苷酶活性爲令於10重量％蔗糖溶液、pH 5. 5、40°(：之條件下反應時，於1分鐘令1从111〇又 葡萄糖游離之活性視爲1單位。其結果，於母株中未檢測 出活性，但於轉形體中檢測出〇 . 〇 4單位/毫升之活性 〇 今如此調製之/3 -呋喃果糖苷酶以每1克蔗糖添加 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 44 _ ' 555853 A7 B7 五、發明説明（42 j 4. 2單位，並於60重量％蔗糖溶液、pH7. 0、 4 0°C之條件下反應2 3小時。反應後之糖組成爲果糖爲 1. 6%、葡萄糖爲16. 2%、蔗糖爲42. 3%、 GF2 爲 37· 3%、GF3 爲 2. 1%。

實施例C 眚施例C 1 ：由黑曲霉ACE — 2-1株取得n i aD變 異株 令黑曲霉 ACE-2 — 1 (ATCC 2 0 6 1 1 ) 株之孢子塗布於含有6 %氯酸鹽之最少洋菜培養基（ 0. 2%麩胺酸鈉、0. 1%磷酸氫二鉀、0. 05%硫 酸鎂、0. 05%氯化鉀、0. 001%硫酸鐵、3%蔗 糖、0. 5%洋菜、PH5. 5)，並於30 °C保溫。約 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5天培養後，形成菌落者視爲鹽酸耐受株。將此些耐受株 植菌於分別含有麩胺酸鹽、硝酸鹽、或亞硝酸鹽作爲單一 氮源之最少培養基中，並進行氮源需求性之檢討。其結果 ，存在有可在含有麩胺酸鈉、亞硝酸鹽作爲單一氮源之最 少培養基中生長，但於硝酸鹽中無法生長之鹽酸耐受株， 將其視爲n i aD變異株候補株。 對於n i a D變異株候補株內之3株進行菌體內硝酸 還原酶（硝酸還原酶=n i a D基因產物）活性之測定。 將此3株於液體培養基（0 2%麩胺酸鈉、〇. 1%磷 酸氫二鉀、〇. 05%硫酸鎂、0. 05%氯化鉀、 0. 00 1%硫酸鐵、3%蔗糖3克）中，30 °C振盪培 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) " ' -45 - 555853 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43) 養60小時。令所得之濕菌體〇· 2克懸浮於2毫升之 5〇mM磷鈉緩衝液（ρΗ7· 5)中，以均質器超音波 弄碎，將不溶之餾分以離心除去，將所得之上清液視爲 樣品。對樣品液5 0微升加入蒸餾水1 〇 〇 〇微升、 〇. 2Μ磷酸鈉溶液（ρΗ7· 5) 750微升、 〇. 04毫克/毫升FAD100微升、2毫克/微升 NADPH100微升、及22. 5毫克/毫升硝酸鈉 1 0 0 0微升，並令於3 7 °C下反應。對反應樣品，加入 10%磺胺（溶解於3N鹽酸）500微升、〇. 02% N - 1 一棻二胺5 0 0微升令其呈色，雖嘗試藉由測定 A 5 4 0以檢測出硝酸還原酶活性，但於此3株中未檢測 出硝酸還原酶活性。於是，結論此3株爲n i aD變異 株，並將其中之1株命名爲N I A5 2 9 2株，供於以 下之實驗。 眚施例C 2 :黑曲霉NRRL4337株之n i aD基因 的取得 令黑曲霉NRRL4 3 3 7株於YPD液體培養基（ 1%酵母萃取物、2%聚蛋白腺、2%葡萄糖）中培養。 另一方面，以 Unk 1 e s，S. Ε·,等人，Gene 111 ，149 一 155 (1992)記載之黑曲霉 n i a D基因之鹼基序列爲準，製作序列表序列編號 17及18之合成DNA引子。由所得之前述菌體依實施 例A 2記載之方法萃取全DNA作爲鑄模，使用前述合成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ 一 46 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 555853 A7 B7 五、發明説明（44 ) 引子依P CR法進行DNA之放大。反應液每1 〇 〇微升 含有染色體DNA 〇. 5微克、引子各lOOpmol 、及 Tag DNA 聚合酶 2. 5U( Nipp0ngene公司） ，並於94°C1分鐘、50°C2分鐘、72°C2分鐘之溫 度條件下反應2 5次循環。其結果，約8 0 0 b p之 D N A斷片被專一性地放大。於決定此D NA斷片之鹼基 序列時，與已被報導之黑曲霉n i a D基因的鹼基序列爲 1 0 0% —致。可知此DNA斷片爲來自n i a D基因。 於是將此約8 0 0 b p之DNA斷片使用作爲探針。 (2 )黑曲霉之染色體DNA的南向解析 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將黑曲霉NRRL4 3 3 7株之全DNA以限制酶（ Hindi I I 、EcoRI 、BamHI)完全切開後 ’以瓊脂糖凝膠電泳予以分級，依Molecular cl〇ning( 冷泉港，1982年）記載之方法，於尼龍膜！：！^!^"-N+、Amersham公司）上進行點漬。對此尼龍膜，以前述約 8 0 0 b p的DNA斷片作爲探針，進行南向雜交作用。 尙’於探針之標幟•訊號之檢測上，爲使用Amersham公司 之E C L直接DNA標幟•檢測系統，並依所附手冊之條 件。其結果，以Hind+I I I切開時，於約15 k b p之位置檢測出訊號。 (3)niaD基因之分離 黑曲霉NRRL 4 3 3 7株之全DNA以限制酶 Hindi I I完全切開後，以瓊脂糖凝膠電泳予以分級 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -47 - 555853 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明（45 ) ，並依常法萃取1 5 k b p附近之DNA斷片，並回收。 回收之DNA斷片連結至ADASHI I之Hind I I I 部位，並依 STRATAGENE 公司之 GIGAPACK II Gold 進 行包裝，藉由令其感染大腸桿菌而製作基因庫。 使用前述之約8 0 0 b p的DNA斷片作爲探針，使 用Amersham公司之E C L直接DNA標幟·檢測系統進行 噬菌雜交作用，取得陽性選殖株。對於所得之陽性選殖株 實施二次篩選，並純化陽性選殖株。 由陽性選殖株調製噬菌體DNA，確認其被插入約 15kbp之Hindi I I斷片。對此插入斷片進行南 向解析，發現比含有n i a D基因更小之DNA斷片形式 的約6. 5 k b p Xba I斷片，並製作此斷片之限制 酶輿圖。再將此X b a I斷片以適當的限制酶小斷片化後 繼代選殖至P UC 1 1 8中，並以此質體作爲鑄模，決定 鹼基序列，並特定出分離之DNA斷片內的n i a D基因 位置（圖3 )。 眚施例C 3 :基因標的化用質體pAN2 0 3之構築 基因標的化用質體p AN 2 0 3爲如以下處理而製作 (圖 4 )。 由上述實施例A 3中所得之含有-呋喃果糖苷酶基 因的約1 5KBP Ec oRI斷片，調製含有点一呋喃 果糖苷酶基因之開始密碼組及上游區域之約3 k b p Sa1I斷片，並於質體pUCl19中繼代選殖化’取 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -48 一 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（46 ) 得質體PW2 0。由此質體調製單股DNA，並使用序列 表序列編號1 9之合成D N A，以Amersham公司之 Sculptor in vitro mutagenesis system 進行部位專一性 變異，於Θ -呋喃果糖苷酶基因之開始密碼組前製作新的 BamHI切開部位（pW20B) 又，由含有—呋喃果糖苷酶基因之約1 5 kb p E c 〇 R I斷片，調製含有y3_呋喃果糖苷酶基因之終止 密碼組及下游區域之約1. 5kbp Ps t I斷片，並 於質體pUC 1 1 9中繼代選殖化，取得質體p BW2 0 。由此質體調製單股DNA，並使用序列表序列編號2 0 之合成 DN A，以Amersham 公司之 Sculptor in vitro mutagenesis system進行部位專一性變異，於θ —呋喃 果糖苷酶基因之終止密碼組後製作新的B a mH I切開部 位（pBW 20B)。由 pBW20B 調製約 1. 5 kbp Ps t I斷片，以取代實施例A4中所得之 PAW20的約1· 5kbp Ps t I斷片，構築質體 p A W 2 0 B。 其次，將質體PUC118以限制酶Hindi I I 切斷，並以T4 DNA聚合酶（寶酒造公司）將末端平 滑化後，連結以S a 1 I連接子。以限制酶S a 1 I切斷 ，並再連結構築質體PUC18 PHd。pUC18 PHd以Sa 1 I及EcoRI切開後，與由PW20B 調製之約2· 5kbp Sal I - BamHI斷片、及 由pAW 20B調製之約3kbp BamHI- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~~' "~- 一 -49 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 555853 A7 B7 五、發明説明（47 )

EcoRI斷片連結，構築成paN202。更且將 PAN202於Xb a I部位插入含有n i aD基因之約 6· 5 k b p Xba I斷片（圖3)並構築成質體 P A N 2 0 3。 實施例C 4 :里曲霉N I A5 2 9 2株之經由質體PAN 2 0 3的轉形 將黑曲霉N I A5 2 9 2株於液體培養基（2%可溶 性澱粉、1%聚蛋白膝、〇_ 2%酵母萃取物、0· 5% 磷酸二氫鈉、〇· 05%硫酸鎂）中，28 °C振盪培養 2 4小時。以波璃濾紙收集菌體，並懸浮於酵素溶液（1 毫克/毫升yS —尿甘酸酶（Sigma公司）、5毫克/毫升 Novozyme ( Novo.Nordisc 公司）、1 0 mM 磷酸鈉（ρ Η 5· 8) 、0· 8Μ氯化鉀）中，於30°C下平穩加溫 1 · 5小時。原子質體化之細胞以玻璃濾紙過濾，並將通

過之餾分以離心集菌且以STC緩衝液（1〇mM T r i s ( ρ Η 7 . 5) 、10mM氯化鈣、1. 2M 山

梨糖醇）洗淨2次後，懸浮於STC緩衝液中。續將原子 質體與事先以限制酶H i nd I I I切開之質體pAN 2 0 3混合，並於冰上放置2 0分鐘後，再加入Ρ E G液 (1 〇 m M Tris(pH7.5)、10mM氯化鈣 、60%聚乙二醇6000)並於冰上再放置20分鐘’ 將DNA導入原子質體內。原子質體以S TC緩衝液洗淨 數回後，懸浮於含有1· 2M山梨糖醇與〇· 8%洋菜之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -50 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T # 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（48) TuaPaK培養基（〇· 2%硝酸鈉、0_ 1%磷酸氫 二鉀、0. 05%硫酸鎂、0. 05%氯化鉀、 0. 001%硫酸鐵（II) 、3%蔗糖），並於含有 1 . 2M山梨糖醇與1. 5%洋菜之TuaPaK洋菜培 養基上重疊，於3 0°C下培養。約5日培養後，選出形成 菌落者視爲轉形體。將此轉形體予以液體培養，並由菌體 調製全DNA。對此全DNA進行南向解析，選出質體 P A N 2 0 3爲在宿主之Θ -呋喃果糖苷酶基因之上游 區域僅經1個複製之相同重組所插入的轉形體。 其次，將此轉形體之分生孢子塗布於含有6 %氯酸鉀 、以2%葡萄糖作爲單一碳源之最少洋菜培養基（0. 2 %麩胺酸鈉、0. 1%磷酸氫二鉀、0. 05%硫酸鎂、 0. 05%氯化鉀、0. 001%硫酸鐵、2%葡萄糖、 6%氯酸鉀、1. 5%洋菜、ρΗ5· 5)並於30°C下 培養。約4日，顯示出n i aD變異表現型而不顯示出對 氯酸鹽耐受之耐受株多數再度出現。對於此些氯酸耐受株 檢討/5 -呋喃果糖苷酶活性之有無，結果在約半數之氯酸 耐受株中，並未檢測出yS -呋喃果糖苷酶活性，且在宿主 之々一呋喃果糖苷酶基因之下游區域再引起相同重組，顯 示含有n i a D基因之載體/3 -呋喃果糖苷酶基因爲被脫 落。由此些氯酸耐受株調製全DNA，並對此全DNA進 行南向解析，結果確認含有n i a D基因之載體及/3 -呋 喃果糖苷酶基因爲由染色體上脫落，並將其1株命名爲 N I A 1 6 0 2 ◊ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 51 - 555853 A7 __B7 _ 五、發明説明（49 ) 眚施例C 5 :以黑曲霉N I A 1 6 0 2株作爲宿主之來自 Penicillium roqueforti之沒一呋喃果糖替酶的生產 來自Penicillium roqueforti之Θ —呋喃果糖替酶基 因的表現用載體PAN5 7 2爲如以下處理製作（圖5 ) 〇 首先，將質體PUC18以限制酶Hindi I I切 斷，並以T4DNA聚合酶（寶酒造公司）將末端平滑化 後予以再連結。再以限制酶B a m Η I切斷，並以 T4DNA聚合酶將末端平滑化後予以連結，構築成質體 pUCl 8ΗΒΧ。於此質體 pUCl 8ΗΒΧ 之 Ps t I部位，插入含有由質體pAN202所調製之冷 一呋喃果糖替酶基因之啓動基因及終止基因之約2 k b p 的PsTI斷片，製成成質體pAN204。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其次，n i a D基因令以處理成更小的DNA斷片， 而再將B amH I切開部位破壞，故以序列表序列編號 2 1及2 2之合成D N A作爲引子，並使用Amersham公司 之 Sculptor in vitro mutagenesis system 進行部位專一 性變異，將B amH I切開部位予以破壞，同時於 n i aD基因之下游製作新的Xba I切開部位，而可調 製不含BamHI切開部位之以約4. 8kbp Xbal斷片的niaD基因。將此4. 8kbp之 XbaI斷片插入至質體pAN204之XbaI部位， 製作成質體PAN205。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ -0Δ - 555853 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _____B7五、發明説明（50 ) 另一方面’將來自 Penicillium roqueforti 之 iS —呋 喃果糖苷酶基因，以實施例B k所得之含有此基因之質體 p PR S 0 1所調製之單股DNA作爲鑄模，以序列表序 列編號2 3之合成D N A作爲引子，使用Amersham公司之 Sculptor in vitro mutagenesis system進行部位專一性 變異，令/3 -呋喃果糖苷酶基因之轉譯區域內存在之 B a mH I部位，以不會變化所編碼胺基酸序列之形式予 以破壞（PPRS02)。再者，以質體PPRS02作 爲鑄模，以序列表之序列編號2 4及2 5之合成DNA作 爲引子進行P CR，於—呋喃果糖苷酶基因之轉譯區域 調製約1. 8kbp之BamHI斷片，並將其插入質體 PAN 205之BamHI I部位中，製作成質體 p A N 5 7 2 〇 · 使用預先以Hi nd I I I切開呈線狀之質體pAN 5 7 2，並依實施例C4記載之方法轉形至黑曲霉N I A 1 6 0 2株。將所得之轉形體內之1株於液體培養基（ 5. 0%蔗糖、0. 7%麥芽糖、1. 0%聚蛋白臃、 0. 5%羧甲基纖維素、0. 3%氯化鈉）中，28 °C培 養3天。將所得之菌體回收，並以超音波弄碎後，測定万 -呋喃果糖苷酶活性。-呋喃果糖苷酶活性爲令於1 〇 重量％蔗糖溶液、PH5. 5、40 °C之條件下反應時， 於1分鐘令1 //m ο 5葡萄糖游離之活性視爲1單位。其 結果，檢測出1 X 1 0 ―3單位/毫升之活性。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -53 - 555853 A7 B7 五、發明説明（51 ) 實施例D : 以下，於Θ -呋喃果糖苷酶變異體之記載，使用如下 之命名以便於參照： 原胺基酸：位置：取代胺基酸 依據此命名，例如於第1 7 0個之苯基丙胺酸以色胺 酸取代者，爲以F 1 7 0W表示。 又，多數之變異，爲依+所分離，例如 F 1 70W+G300V + H3 1 3K 爲表示第 1 70、3 00、及3 1 3個之胺基酸苯基丙胺酸、甘胺 酸、及組胺酸爲分別被色胺酸、纈胺酸、及離胺酸所取代 〇 又，以下，果糖略記爲F、葡萄糖記爲G、及蔗糖記 爲GF，且於蔗糖中果糖爲以1〜3個分子結合之寡糖禪 ，爲分別略記爲GF2、GF3、及GF4。 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例D 1 : F 1 70W變異體之製作與生產 (1 )經由部位專一性變異之；3 -呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 以含有黑曲霉ACE — 2 — 1 (ATCC2061 1 )株之iS —呋喃果糖苷酶基因之質體pAW2 0 — Hy g (參照實施例A4)作爲鑄模DNA進行pCR，並取出 冷一呋喃果糖苷酶基因之轉譯區域。P C R爲使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 進行。反應液爲加 入質體DNA (pAW20 — Hyg) 0. 5微升（相當 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -54 - 555853 A7 B7 五、發明説明（52) 於〇·1微克量）、10倍濃度之反應緩衝液〔500 m M KCj? ' 100mM Tris-HCj?(pH 8.3)、15mM M g C 2 ^ 1 % Triton X — 100〕10微升、2· 5mM dNTP溶液8微升、 〇· OlmM之以序列表序列編號26之十股DNA引子 作爲引子# 1及以序列表序列編號2 7之一股D N A引子 作爲引子#2各2微升、Ta g DNA聚合酶（和光純 藥公司）0. 5微升、滅菌77微升作成100微升。反 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 應爲在94 °C、5分鐘前處理後、進行94 °C1分鐘（變 性步驟）、54°C2分鐘（粘接步驟）、72°C3分鐘（ 延長步驟）之培養共2 5次循環。最後於7 2 °C下進行7 分鐘培養並終止反應。所得之反應液以酚.氯仿.異戊醇 萃取，其後進行乙醇沈澱。將此沈澱物溶解於2 0微升之 T E緩衝溶液，進行瓊脂糖凝膠電泳，並將專一性放大之 約2 kb p的帶（b a n d)依常法切出並回收DNA斷 片。此DNA斷片以限制酶B amH I切開後，插入質體 PUC118 (寶酒造）之BamHI部位，取得質體 PAN120 (圖 6)。 此質體導入大腸桿菌C J 2 3 6株後，依常法調製單 股DNA，並以其作爲鑄模DNA進行部位專一性變異。 部位專一性變異爲使用Mutagene in vitro突變套組（日 本Bio. Rad Laboratory)進行。部位專一性變異用引子 爲使用序列序列編號2 8之D N A引子，依套組說明書實 施，取得作爲變異處理後質體之PANI20(F170 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 55 - 555853 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（53 ) W ) 〇 於調查PAN120 (F170W)插入斷片之鹼基 序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代，且其以外之部 分則無變化。即，可得知變異處理後之基因爲編碼僅在第 1 7 0個之胺基酸爲由苯基丙胺酸變成色胺酸所取代之石 -呋喃果糖苷酶。 (2 )酵母用表現載體pY 2 8 3 1之構築 酵母用表現載體ΡΥ 2 8 3 1爲如以下構築（圖7 ) 。良口，質體 PYPR2831 (H. Horiuchi 等人， Agric. Biol· Chem.， 54 ， 1771—1779 ， 1 9 9 0 )以限制酶E c o R I及S a 1 I切開後，末端 使用T4DNA聚合酶予以平滑化。於此連結以 * BamHI 連接子（5^ - CGGATCCG - 3，）， 並以B amH I切開後，自我連結取得質體pY28 3 1 〇 (3 )經由酵母之F 1 7 0W變異體的生產 ΡΑΝ120 (F170W)以 BamHI 切開， 並取出含有變異基因之2kbp的BamHI DNA斷 片。將其插入PY283 1之BamHI部位，構築成 質體PYSUC(F170W)(圖8)。此時，對於 P AN 1 2 0亦進行同樣之處理，亦可構築用於表現野生 型酵素之質體pYSUC。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -56 - 555853 A7 B7 五、發明説明（54 ) 此些質體於醇酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) MS - 161 株（Sue—、ura3、t rpl)依醋 酸鋰法（Ito，H.等人，J. Bacteriol.,1 5 3，1 6 3-168，1983)導入，取得轉形體。此轉形體於SD —U r a 培養基（0 . 6 7% 酵母 Nitrogen Base(

Dif co公司）、2%葡萄糖、50微克/毫升尿嘧啶）中 ，3 0°C培養一晚。將此培養液以終濃度爲1%播於生產 培養基（0 6 7% 酵母 Nitrogen Base(Difco 公司）、 2%葡萄糖、2%酪蛋白胺基酸、5 0微克/毫升尿嘧D定 )上，並於3 0°C培養2天，取得培養上清液。此些培養 上清液之/3 —呋喃果糖苷酶活性依Agr ic. Biol. Chem., 53，667 - 673 (1989)記載之方法測定，結 果分別檢測出，於表現野生型酵素之情形爲1 2 . 7單位 /毫升、於表現F170W變異體之情形爲10. 1單位 /毫升之活性。 (4)F170W變異體之評估 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對於野生型酵素及F 1 7 0W變異體，使用酵母之培 養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量％蔗糖溶液、 40°C、pH7下進行，且反應後之糖組成依HPLC予 以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果三糖（GF 2 )之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲如下所示。 ( CNS ) ( 210X297/^ ) ~ -57 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 555853 i、發明説明（55 ) A7 B7 F G G F G F 2 G F 3 G F 4 野生型 0.4 22· 3 20. 5 45. 1 11.3 0. 3 F170W 0.6 22. 1 20. 9 45· 8 10. 3 0.3 由此結果，可得知經由F 1 7 0W之取代令GF 2爲 增加，且G F 3爲減少。 复A例D 2 : G300W變異體之製作與生產 (1 )經由部位專一性變異之-呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 除了使用序列表序列編號2 9之D N A引子作爲部位 專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載之方法同樣之 方法進行，取得資體pAN120(G300W)。 於調査PAN120 (G300W)插入斷片之鹼基 序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代，且其以外之部 分則無變化。即，可得知變異處理後之基因爲編碼僅在第 3 0 〇個之胺基酸爲由甘胺酸變成色胺酸所取代之Θ -0夫 喃果糖苷酶。 (2 )經由酵母之G 3 0 0 W變異體的生產 PAN120 (G300W)以 BamHI 切開，取 出含有變異基因之2kbp的BamHI DNA斷片。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 t. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -58 - 555853 A7 ___ B7 五、發明説明（56 ) 將其插入PY2 8 3 1之B amH I部位，構築成質體 pYSUC (G300W) 〇 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S — 1 6 1 株 中，令其生產G 3 0 0W變異體時，於培養上清液檢測出 5 . 0單位/毫升之万-呋喃果糖苷酶果糖苷酶活性。 (3)G300W變異體之評估 對於野生型酵素及G 3 0 0W變異體，使用酵母之培 養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量％蔗糖溶液， 40°C，pH7下進行，且反應後之糖組成依HPLC予 以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果三糖（GF 2 )之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲如下所示。 F G G F G F 2 G F 3 G F 4 野生型 0. 4 22. 3 20. 5 45.1 11.3 0. 3 G30 0W 0. 6 22.1 21.7 46. 4 9. 4 0. 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由此結果？可得知經由G 3 0 0W之取代令G F 2爲 增加，且G F 3爲減少。 眚施例D 3 : H3 1 3K變異體之製作與生產 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 59 - 555853 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7五、發明説明（57 ) (1 )經由部位專一性變異之iS -呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 除了使用序列表序列編號3 0之D N A引子作爲部位 專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載之方法同樣之 方法進行，取得資體PAN120CH313K)。 於調查PAN120 (H3 13K)插入斷片之鹼基 序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代，且其以外之部 分則無變化。即，可得知變異處理後之基因爲編碼僅在第 3 1 3個之胺基酸爲由組胺酸變成離胺酸所取代之yS - B夫 喃果糖苷酶。 (2 )經由酵母之H3 1 3 K變異體的生產 PAN120 (H313K)以 BamHI 切開，取 出含有變異基因之2kbp的BamHI DNA斷片。 將其插入ΡΥ2 8 3 1之B amH I部位，構築成質體 pYSUC (H313K)。 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（S a c c h a r 〇 m y c e s c e r e v i s i a e ) M S — 1 6 1 株 中，令其生產Η 3 1 3 K變異體時，於培養上清液檢測出 5 . 0單位/毫升之Θ -呋喃果糖苷酶活性。 (3)Η313Κ變異體之評估 對於野生型酵素及Η 3 1 3 Κ變異體，使用酵母之培 養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量％蔗糖溶液' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐) ' -60 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 555853 A7 __B7_ 五、發明説明（58 ) 40°C、pH7下進行，且反應後之糖組成依HPLC予 以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果三糖（GF 2 )之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲如下所示。 F G GF GF2 GF3 GF4 野生型 0.4 22.3 2 0.5 45.1 1 1.3 0.3 H313K 0.4 22. 9 1 8. 8 52. 9 6. 0 0· 0 由此結果，可得知經由H3 1 3 K之取代令GF 2爲 增加，且G F 3爲減少。 實施例D 4 : E386K變異體之製作與生產 (1 )經由部位專一性變異之Θ -呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 除了使用序列表序列編號31之DNA引子作爲部位 專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載之方法同樣之 方法進行，取得資體PAN120(E386K)。 於調査PAN120 (E386K)插入斷片之鹼基 序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代，且其以外之部 分則無變化。即，可得知變異處理後之基因爲編碼僅在第 3 8 6個之胺基酸爲由麩胺酸變成離胺酸所取代之Θ —呋 喃果糖苷酶。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 _ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 555853 Α7 Β7 五、發明説明（59 ) (2 )經由酵母之E 3 8 6 K變異體的生產 PAN120 (E386K)以 BamHI 切開，取 出含有變異基因之2kbp的BamHI DNA斷片。 將其插入pY28 3 1之B amH I部位，構築成質體 pYSUC (E386K)。 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S — 1 6 1 株 中，令其生產Ε 3 8 6 Κ變異體時，於培養上清液檢測出 10. 7單位/毫升之Θ-呋喃果糖苷酶活性。 (3)Ε386Κ變異體之評估 對於野生型酵素及Ε 3 8 6 Κ變異體，使用酵母之培 養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量％蔗糖溶液' 40°C、ρΗ7下進行，且反應後之糖組成依HPLC予 以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果三糖（G F 2 )之變換率分別爲最大時之糖組成（％ )爲如下所示。 F G GF GF2 G F 3 G F 4 野生型 0.4 22. 3 20. 5 45. 1 1 1.3 0.3 Ε386Κ 22.3(F+G) 19.9 49.3 7.9 〇·6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂- -62 - 555853 A7 B7 五、發明説明（6〇 ) 由此結果，可得知經由H3 1 3K之取代令GF 2爲 增加，且GF3爲減少。 眚施例D 5 : F170W+G300W變異體之製作與生 產 (1 )經由部位專一性變異之-呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 除了使用序列表序列編號2 8及2 9之D N A引子作 爲部位專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載之方法 同樣之方法進行，取得資體PAN120 (F170W + G 3 0 0 W ) 〇 於調查 PAN120 (F170W+G300W)插 入斷片之鹼基序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代， 且其以外之部分則無變化。即，可得知變異處理後之基因 爲編碼僅在第1 7 0個及第3 0 0個之胺基酸分別爲由苯 基丙胺酸變成色胺酸、由甘胺酸變成色胺酸所取代之；S — 呋喃果糖苷酶。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (2)經由酵母之F170W+G300W變異體的生產 PAN120 (F170W+G300W)以 B amH I切開，取出含有變異基因之2 k b p的 BamHI DNA斷片。將其插入pY2831之 BamHI部位，構築成質體pYSUC (F170W + G 3 0 0 W ) 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~ ' 一 63 — 555853 A7 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（61 ) 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S — 1 6 1 株 中，令其生產F 1 7 0W + G 3 0 0W變異體時，於培養 上清液檢測出2 . 3單位/毫升之Θ -呋喃果糖苷酶活性 〇 (3)F170W+G300W變異體之評估 對於野生型酵素及F 1 7 0W+G 3 0 0W變異體， 使用酵母之培養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量 %蔗糖溶液、40 °C、pH7下進行，且反應後之糖組成 依HP L C予以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果 三糖（GF 2 )之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲 如下所示。 F G GF GF2 GF3 GF4 野生型 0.4 22.3 2 0. 5 45.1 1 1.3 0.3 F170W+ 0.7 21.7 22.5 46.7 8.0 0.3 G30 0W 由此結果，可得知經由F 1 7 0W+G 3 0 0W之取 代令GF 2爲增加，且GF 3爲減少。 實施例 D 6 ： F 1 7 0W+G3 0 0W+H3 1 3R 變異 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 一 64 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 555853 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___B7五、發明説明（62 ) 體之製作與生產 (1 )經由部位專一性變異之-呋喃果糖苷酶基因的驗 基取代 除了使用序列表序列編號2 8、2 9及3 2之DNA 引子作爲部位專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載 之方法同樣之方法進行，取得資體pANl20( F170W+G300W+H313R)。 於調查 PAN120 (F170W+G300W + H313R)插入斷片之鹼基序列時，可確認僅目的部分 之鹼基被取代，且其以外之部分則無變化。即，可得知變 異處理後之基因爲編碼僅在第1 7 0個、第3 0 0個及第 3 1 3個之胺基酸分別爲由苯基丙胺酸變成色胺酸、由甘 胺酸變成色胺酸、由組胺酸變成精胺酸所取代之Θ -呋喃 果糖苷酶。 (2)經由酵母之FI70W+G300W+H313R 變異體的生產 PAN120 (F170W+G300W+H313 R)以B amH I切開，取出含有變異基因之2 kb P的 BamHI DNA斷片。將其插入pY2831之 BamHI部位，構築成質體pYSUC (F170W + G300W+H313R)。 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母2 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S — 1 6 1 株 本i張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -65 - 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（63 ) 中，令其生產F 1 70W+G3 00W+H3 1 3R變異 體時，於培養上清液檢測出0 . 9單位/毫升之—呋喃 果糖苷酶活性。 (3)F170W+G300W+H313R變異體之評 估 對於野生型酵素及F 1 7 OW+G 3 0 0W + H3 1 3R變異體，使用酵母之培養上清液進行評估。反 應條件爲在4 8重量％蔗糖溶液、4〇°(：、0117下進行 ，且反應後之糖組成依HP L C予以分析。於野生型及變 異體中，對1 一蔗果三糖（GF 2 )之變換率分別爲最大 時之糖組成（％ )爲如下所示。 F G GF G F 2 GF3 GF4 野生型 0.4 22.3 2 0.5 45. 1 1 1· 3 0· 3 F170W+ 1·4 24.0 18.6 48.8 7·2 0·0 G300W+ H313R 由此結果，可得知經由F 1 70W+G3 0 OW + H313R之取代令GF2爲增加，且GF3爲減少。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 555853 A7 B7 五、發明説明（64 ) 實施例D 7 : G300W+H3 1 3K變異體之製作與生 產 (1 )經由部位專一性變異之-呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 除了使用序列表序列編號2 9及3 0之DNA引子作 爲部位專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載之方法 同樣之方法進行，取得資體PAN120 (G300W + Η 3 1 3 K )。 於調査 ΡΑΝ120 (G300W+H313K)插 入斷片之鹼基序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代， 且其以外之部分則無變化。即，可得知變異處理後之基因 爲編碼僅在第3 0 0個及第3 1 3個之胺基酸分別爲由甘 胺酸變成色胺酸、由組胺酸變成離胺酸所取代之/3 -呋喃 果糖苷酶。 (2)經由酵母之G300W+H313Κ變異體的生產 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ΡΑΝ120 (G300W+H313K)以 B amH I切開，取出含有變異基因之2 kb ρ的 BamHI DNA斷片。將其插入pY2831之 BamHI部位，構築成質體pYSUC (G300W + Η 3 1 3 K )。 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S - 1 6 1 株 一 67 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 555853 A7 B7 五、發明説明（65 ) 中，令其生產G3 00W+H3 1 3K變異體時’於培養 上清液檢測出1 2單位/毫升之石-呋喃果糖©酶活性 〇 (3)G300W+H313K變異體之評估 對於野生型酵素及G3 0 0W+H3 1 3K變異體， 使用酵母之培養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量 %蔗糖溶液、4 0°C、pH7下進行，且反應後之糖組成 依HP L C予以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果 三糖（GF2)之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲 如下所示。 F G GF GF2 GF3 GF4 野生型 0.4 22.3 20.5 45. 1 1 1.3 0· 3 G30 0W+ 0. 8 2 1.2 1 9. 4 53.8 4. 7 0·0

H313K 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由此結果，可得知經由G3 0 0W+H3 1 3K之取 代令CG2爲增加，且GF 3爲減少。 實施例D 8 : G3 0 0V + H3 1 3K變異體之製作與生 產 (1 )經由部位專一性變異之iS -呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 一 68 - 555853 A7 ____B7 五、發明説明（66 ) 除了使用序列表序列編號3 0及3 3之DMA引子作 爲部位專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載之方法 同樣之方法進行，取得資體PAN120 (G300V + Η 3 1 3 K ) 〇 於調査 ΡΑΝ120 (G300V + H313K)插 入斷片之鹼基序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代， 且其以外之部分則無變化。即，可得知變異處理後之基因 爲編碼僅在第3 0 0個及第3 1 3個之胺基酸分別爲由甘 胺酸變成纈胺酸、由組胺酸變成離胺酸所取代之/3 -呋喃 果糖苷酶。 (2) 經由酵母之G300V + H3 1 3Κ變異體的生產 ΡΑΝ120 (G300V + H313K)以 B amH I切開，取出含有變異基因之2 kb ρ的 BamHI DNA斷片。將其插入pY2831之 BamHI部位，構築成質體pYSUC (G300V + 3 1 3 K )。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S — 1 6 1 株 中，令其生產G300V + H3 1 3Κ變異體時，於培養 上清液檢測出3. 6單位/毫升之/5 -呋喃果糖苷酶活性 〇 (3) G300V+H313K變異體之評估 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）~~~ 一 b9 _ 555853 A7 B7 五、發明説明（67 ) 對於野生型酵素及G300V+H313K變異體’ 使用酵母之培養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量 %蔗糖溶液、4 0°C、pH7下進行，且反應後之糖組成 依HP L C予以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果 三糖（GF 2 )之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲 如下所示。 F G GF GF2 G F 3 GF4 野生型 0.4 22.3 2 0.5 45. 1 1 1.3 0. 3 G300V+ 0.9 21.6 19.0 53.7 4.7 0.0

H313K 由此結果，可得知經由G 3 0 0V + H3 1 3K之取 代令GF 2爲增加，且GF 3爲減少。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例D 9 : G300E + H313K變異體之製作與生 產 (1 )經由部位專一性變異之θ -呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 除了使用序列表序列編號3 0及3 4之DNA引子作 爲部位專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載之方法 同樣之方法進行，取得資體PAN120 (G300E + 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 70 - 555853 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7五、發明説明（68 ) Η 3 1 3 K )。 於調查 ΡΑΝ120 (G300E+H313K)插 入斷片之鹼基序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代， 且其以外之部分則無變化。即，可得知變異處理後之基因 爲編碼僅在第3 0 0個及第3 1 3個之胺基酸分別爲由甘 胺酸變成麩胺酸、由組胺酸變成離胺酸所取代之Θ -呋喃 果糖苷酶。 (2)經由酵母之G300E + H3 1 3Κ變異體的生產 ΡΑΝ120 (G300E + H313K)以 B amH I切開，取出含有變異基因之2kb ρ的 BamHI DNA斷片。將其插入pY2831之 BamHI部位，構築成質體pYSUC (G300E + Η 3 1 3 K ) 〇 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S — 1 6 1 株 中，令其生產G300E + H3 1 3Κ變異體時，於培養 上清液檢測出2 . 9單位/毫升之-呋喃果糖苷酶活性 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (3)G300E+H313K變異體之評估 對於野生型酵素及G 3 0 0 E + H3 1 3K變異體’ 使用酵母之培養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量 %蔗糖溶液、40 °C、pH7下進行，且反應後之糖組成 本紙H度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I"— 一 71 - 555853 A7 B7 五、發明説明（69 ) 依HP L C予以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果 三糖（GF2)之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲 如下所示。 F G GF GF2 GF3 GF4 野生型 0.4 22.3 20. 5 45. 1 1 1.3 0.3 G300E+ 1.2 22.0 19.3 52.8 4.7 0·0

H313K 由此結果，可得知經由G 3 Ο Ο E + H 3 1 3 K之取 代令GF 2爲增加，且GF 3爲減少。 實施例D 1 0 : G300D + H3 1 3K變異體之製作與 生產 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (1 )經由部位專一性變異之/9 一呋喃果糖苷酶基因的驗 基取代 除了使用序列表序列編號3 0及3 5之DNA引子作 爲部位專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載之方法 同樣之方法進行，取得資體PAN120 (G300D + Η 3 1 3 K ) 〇 於調查 ΡΑΝ120 (G300+H313K)插入 斷片之鹼基序列時，可確認僅目的部分之鹼基被取代，且 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） - 72 - 555853 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 __B7五、發明説明（7〇 ) 其以外之部分則無變化。即，可得知變異處理後之基因爲 編碼僅在第3 0 0個及第3 1 3個之胺基酸分別爲由甘胺 酸變成天冬胺酸、由組胺酸變成離胺酸所取代之Θ -呋喃 果糖苷酶。 (2) 經由酵母之G3 00D + H3 1 3K變異體的生產 PAN120 (G300D + H313K)以 B amH I切開，取出含有變異基因之2kb p的 BamHI DNA斷片。將其插入pY2831之 BamHI部位，構築成質體PYSUC (G300D + Η 3 1 3 K ) 〇 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S — 1 6 1 株 中，令其生產G300D + H3 1 3Κ變異體時，於培養 上清液檢測出4 . 3單位/毫升之；3 -呋喃果糖苷酶活性 〇 (3) G300D+H313K變異體之評估 對於野生型酵素及G 3 0 0D + H3 1 3 Κ變異體， 使用酵母之培養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量 %蔗糖溶液、4 0°C、ρΗ7下進行，且反應後之糖組成 依Η P L C予以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果 三糖（GF2)之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲 如下所示。 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 555853 A7 ____ B7 五、發明説明（71 ) F G GF GF2 GF3 G F 4 野生型 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3 G300D+ 0.5 21.6 19.6 53.3 5.0 0·0

H313K 由此結果，可得知經由G300D+H313K之取 代令GF 2爲增加，且GF 3爲減少。 實施例 D 1 1 ： F 1 70W+G300W+H3 1 3K 變 異體之製作與生產 (1 )經由部位專一性變異之-呋喃果糖苷酶基因的驗 基取代 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 除了使用序列表序列編號2 8、29及3 0之DNA 引子作爲部位專一性變異用引子以外，與實施例D 1記載 之方法同樣之方法進行，取得資體pANl20( F170W+G300W+H313K)。 於調査 PAN120 (F170W+G300W + H3 1 3K)插入斷片之鹼基序列時，可確認僅目的部分 之鹼基被取代，且其以外之部分則無變化。即，可得知變 異處理後之基因爲編碼僅在第1 7 0個、第3 0 0個及第 313個之胺基酸分別爲由苯基丙胺酸變成色胺酸由甘胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~~ -74 - 555853 A7 B7____ 五、發明説明（72 ) 酸變成色胺酸、由組胺酸變成離胺酸所取代之β -呋喃果 糖苷酶。 (2) 經由酵母之 F 1 70W+G3 00W+H3 1 3Κ 變異體的生產 ΡΑΝ120 (F170W+G300W + Η3 1 3Κ)以B amH I切開，取出含有變異基因之 2kbp的BamHI DNA斷片。將其插入ρΥ 283 1之BamHI部位，構築成質體PYSUC ( F170W+G300W+H313K) 〇 此質體同實施例D 1記載之方法處理，並導入酵母之 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) M S - 1 6 1 株 中，令其生產F 1 70W+G300W+H3 1 3Κ變異 體時，於培養上清液檢測出2 . 0單位/毫升之/3 -呋喃 果糖苷酶活性。 (3) F170W+G300W+H313K變異體之評 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 估 對於野生型酵素及G3 0 0W+H3 1 3Κ變異體’ 使用酵母之培養上清液進行評估。反應條件爲在4 8重量 %蔗糖溶液、4 0°C、ρΗ7下進行，且反應後之糖組成 依HP L C予以分析。於野生型及變異體中，對1 一蔗果 三糖（GF2)之變換率分別爲最大時之糖組成（％)爲 如下所示。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -75 - 555853 A7 B7 五、發明説明（73 ) F G GF GF2 G F 3 G F 4 野生型 0.4 22.3 2 0.5 45.1 1 1.3 0. 3 F170W+ 0.7 22.3 18.9 54.3 3.9 〇·〇 G300W+

H313K 由此結果，可得知經由F 1 7 0W+G3 0 OW + H3 1 3K之取代令GF 2爲增加，且GF 3爲減少。 (4)經由黑曲霉之F170W+G300W+ H313K變異體的生產與評估 PAN120 (F170W+G300W + 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 H3 1 3K)以B amH I切開，取出含有變異基因之 2kbp的BamHI DNA斷片。將其插入pAN 205 (參照實施例C5)之BamHI部位，構築成質 體 PAN531 (圖 9)。 PAN531以Hindi I I切開呈直鏈狀後，經 由其轉形黑曲霉NIA1602株（sue -，n i aD )。對於所得之轉形體的全DNA進行南向解析，於冷一 呋喃果糖苷酶基因之啓動基因區域中引起相同重組，並選 擇出在宿主染色體上之/3 -呋喃果糖苷酶基因之位置僅被 導入PAN5 3 1爲1複製之轉形體。 一 76 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 555853 A7 B7 五、發明説明（74 ) 爲了由此轉形體令以脫落載體DNA，調製分生孢子 ，並塗布於含有氯酸之培養基上（6%氯酸鉀、3%蔗糖 、0. 2% 麩胺酸鈉、0· 1%K2HP04、〇. 05%

MgS04· 7H20 ' 0. 05%KCj?、0. 01%

FeS04.7H20、l· 5%洋菜）。於此培養基上形 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 成菌落之菌株，再引起相同重組，雖可期待載體DNA脫 落，但此時，若於與導入時相同之啓動基因區域引起重組 ，則恢復成原來的宿主，但若在Θ -呋喃果糖苷酶基因之 終止基因區域引起重組，則剩餘編碼F 1 7 0W + G300W+H3 1 3K變異體之基因，其可由石一呋喃 果糖苷酶活性之有無而可容易地區別。實際上，在顯示出 氯酸耐受之株內，顯示/5 -呋喃果糖苷酶活性者與不顯示 者爲以1 : 1之比例出現，由顯示；3 -呋喃果糖苷酶活性 之株中·選出1株，並命名爲黑曲霉N I A3 1 44株（ Suc+，niaD)。對於此株之全DNA進行南向解 析，可確認載體DNA脫落，且在宿主染色體上之石- D夫 喃果糖苷酶基因位置被導入編碼F 1 7 0W+G 3 0 0W +H313K變異體之基因。 其次，黑曲霉N I A3 1 44株於酵素生產培養基（ 5%蔗糖、0. 7%麥芽萃取物、1%聚蛋白腩、0. 5 %羧甲基纖維素、0. 3%NaCj?)中，28°C培養3 天後，菌體以超音波弄碎調製成粗酵素液。測定粗酵素液 之石-呋喃果糖苷酶活性，結果檢測出培養液每1毫升具 25單位之活性。此粗酵素對蔗糖每1克添加2. 5單位 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -77 - 555853 A7 B7 五、發明説明（75 ) ，並令以55重量％蔗糖溶液、pH7、40°C、反應 2 0小時。反應後之糖組成以HP L C分析，爲果糖 1. 2%、葡萄糖 22. 8%、蔗糖 17. 1 % ' G F 2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 5. 3 % ' G F 3 3.8%。 (5)F170W+G300W+H313K變異體之精 製與酵素化學各性質 將前述（4 )所調製之粗酵素液對2 OmM Tris-HCJ2(pH7. 5)緩衝液透析後，添加至 事先以同緩衝液平衡化之D E A E Toyopearl 650 S (東曹）拉（1· 6X18公分）。其次，於Tris -H C ^ ( ρ Η 7 . 5)緩衝液中，以NaC义之〇至 3 0 OmM直線濃度梯度予以溶出，並收集活性餾分。再 者，將此活性餾分添加Sephacryl S — 3 0 0 ( Pharmacia)桎（2· 6x60 公分）’並以 5 OmM 三 甲胺一醋酸緩衝液（ρΗ8· 0)，收集活性餾分，作爲 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 F 1 70W+G3 00W+H3 1 3Κ變異體精製樣品。 其以S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳調査時，顯示出與原來 母；0 -呋喃果糖苷酶相同分子量之約1 〇萬道耳吞的均句 帶。 使用此精製樣品，與原來之母Θ 一呋喃果糖苷酶比較 最適pH、最適溫度、pH安定性、溫度安定性，則幾乎 相同。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 78 - 555853 A 7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（76 ) 實施例 D」_2_ ： G170W+G300V + H313K 變 異體之製作與生產 (1 )經由部位專一性變異之—呋喃果糖苷酶基因的鹼 基取代 除了使用序列表序列編號28、30、及33之 D N A引子作爲部位專一性變異用引子以外，與實施例d 1記載之方法同樣之方法進行，取得資體pANl 20 ( F170W+G300V + H313K)。 於調查 PAN120 (F170W+G300V + Η 3 1 3 K)插入斷片之鹼基序列時，可確認僅目的部分 之鹼基被取代，且其以外之部分則無變化。即，可得知變 異處理後之基因爲編碼僅在第1 7 0個、第3 0 0個及第 3 1 3個之胺基酸分別爲由苯基丙胺酸變成色胺酸、由甘 胺酸變成纈胺酸、由組胺酸變成離胺酸所取代之Θ -呋喃 果糖苷酶。 (2)經由黑曲霉之F170W+G300V+H313 Κ變異體的生產與評估 ΡΑΝ120 (F170W+G300V + Η3 1 3Κ)以B amH I切開，取出含有變異基因之 2kbp的BamHI DNA斷片。將其插入pAN 205之BamHI部位，構築成質體pAN5 1 7。 PAN517以Hindi I I切開呈直鏈狀後，與 實施例1 1記載之方法同樣地轉形黑曲霉N I A 1 6 0 2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）^ -79 ~ 555853 A7 B7 五、發明説明（77 ) 株（suc_，niaD)，取得載體DNA爲脫落，且 在宿主染色體上之Θ -呋喃果糖苷酶基因之位置中被導入 編碼F 1 70W+G300V + H3 1 3K變異體基因之 黑曲霉 NIA1717 株（Suc+、niaD)。 其次，黑曲霉N I A1 7 1 7株於酵素生產培養基（ 5%蔗糖、0· 7%麥芽萃取物、1%聚蛋白臃、〇. 5 %羧甲基纖維素、0. 3%NaCj?)中，28°C培養3 天後，菌體以超音波弄碎調製成粗酵素液。測定粗酵素液 之石-呋喃果糖苷酶活性，結果檢測出培養液每1毫升具 45單位之活性。此粗酵素對蔗糖每1克添加2. 5單位 ，並令以BX45蔗糖、pH7、40°C、反應24小時 。反應後之糖組成以HPLC分析，爲果糖1. 8%、葡 萄糖 22. 3%、蔗糖 16. 1%、GF255. 7%、 GF3 4. 1%。由此結果，可得知經由F170W + G3 00V + H3 1 3K之取代令GF2爲增加，且GF 3爲減少® 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (3)F170W+G300V+H313K變異體之精 製與酵素化學各性質 將前述（2 )所調製之粗酵素液對2 OmM Tris-HCj?(pH7. 5)緩衝液透析後，添加至 事先以同緩衝液平衡化之D E A E Toyopearl 6 5 〇 S (東曹）拉（1. 6x18公分）。其次，於Tris -H C ^ ( ρ Η 7 . 5)緩衝液中，以NaC5之〇至 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 80 - 555853 A7 B7 五、發明説明（78 ) 3 0 OmM直線濃度梯度予以溶出，並收集活性餾分。再 者，將此活性餾分添加Sephacryl S - 3 0 0 (

Pharmacia)柱（2. 6x60 公分），並以 50mM 三 甲胺一醋酸緩衝液（pH8_ 0)，收集活性餾分，作爲 F 1 70W+G300W+H3 1 3K變異體精製樣品。 其以S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳調査時，顯示出與原來 母—咲喃果糖替酶相同分子量之約1 〇萬道耳吞的均勺 帶。 使用此精製樣品，與原來之母β一呋喃果糖替酶比較 最適pH、最適溫度、pH安定性、溫度安定性，則幾乎 相同。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 555853 A7 B7 __ 五、發明説明（79 ) 序列表 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列編號：1 序列長度：6 3 5 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類·’蛋白質 起源 生物名：黑曲霉ACE — 2-1 (ATCC 2 0 6 1 1 )

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 序列特徵 表示特徵之記號：mat peptide 存在位置：1 . . 6 3 5

決定特徵之方法：E

Ser Tyr His Leu Asp Thr Thr Ala Pro Pro Pro Thr Asn Leu Ser Thr 序列 15 10 15

Leu Pro Asn Asn Thr Leu Phe His Val Trp Arg Pro Arg Ala His lie 20 25 30

Leu Pro Ala Glu Gly Gin He Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Thr Asp 35 40 45

Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asp Gly Asp Gly 50 55 60 lie Ala Gly Ala Thr Thr Ala Asn Leu Ala Thr Tyr Thr Asp Thr Ser 65 70 75 80

Asp Asn Gly Ser Phe Leu lie Gin Pro Gly Gly Lys Asn Asp Pro Val 85 90 95 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 82 - 555853 A7 B7 五、發明説明（8〇)

Ala Val Phe Asp Gly Ala Val lie Pro Val Gly Val Asn Asn Thr Pro loo 105 no

Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu Pro lie His Trp Ser lie 115 120 125

Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gin Ser Leu Ala Val Ala Arg Asp 130 135 140

Gly Gly Arg Arg Phe Asp Lys Leu Asp Gin Gly Pro Val lie Ala Asp 145 150 155 160

His Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe 165 170 175

Arg Ser Ala Lys Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Glu Glu Val Ala 180 185 190

Arg Asn Glu Thr Ala Val Gin Gin Ala Val Asp Gly Trp Thr Glu Lys 195 200 205

Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly 210 215 220

Pro Ala Gin Phe Leu Tyr Arg Gin Asn Gly Gly Asn Ala Ser Glu Phe 225 230 235 240 經濟部中央標準局員工消费合作社印策 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gin Glu Ala Thr Asn Ser 245 250 255

Ser Trp Gly Asp Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly Phe Asn Phe 260 265 270

Glu Thr Gly Asn Val Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His Asp Pro Gin 275 280 285 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS) A4規格（2l〇X297公釐）—83 _ 555853 A7 _B7_ 五、發明説明（81 )

Thr Gly Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Thr Glu Gly Ser Gly Leu Pro 290 295 300 lie Val Pro Gin Val Ser Ser lie His Asp Met Leu Trp Ala Ala Gly 305 310 315 320

Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Gin Glu Gly Ala Lys Val Glu Phe Ser 325 330 335

Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser Ala Tyr Ala Ala 340 345 350

Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Val Ser Lys Thr Ser Gly 355 360 365

Val Glu Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr Gly Asp Gin 370 375 380

Tyr Glu Gin Ala Asp Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Gly Trp Thr Gly 385 390 395 400

Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gin Thr Val Glu Asn Val 405 410 415

Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu Gly Val Ser Trp Val Val Gly 420 425 430 經濟部中央樣準局員工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Glu Ser Asp Asn Gin Thr Ala Arg Leu Arg Thr Leu Gly lie Thr lie 435 440 445

Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala Leu Leu Ala Asn Gly Ser Val Thr Ala 450 455 460

Glu Glu Asp Arg Thr Leu Gin Thr Ala Ala Val Val Pro Phe Ala Gin 465 470 475 480 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 555853 A7 B7 五、發明説明（82 )

Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr Ala Gin Leu Glu Phe Pro 485 490 495

Ala Ser Ala Arg Ser Ser Pro Leu Gin Ser Gly Phe Glu lie Leu Ala 500 505 510

Ser Glu Leu Glu Arg Thr Ala lie Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser 515 520 525

Leu Val Val Asp Arg Ser Gin Thr Ser Ala Ala Ala Pro Thr Asn Pro 530 535 540

Gly Leu Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val 545 550 555 560 lie Glu Asn Gly Gin Glu Gin Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Val 565 570 575

Val Asp Asn Ala Val Val Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu 580 585 590

Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Asp Asn Ser Thr Gin lie Arg Phe 595 600 605

Phe His Asn Gly Glu Gly Glu Val Gin Phe Arg Asn Val Ser Val Ser 610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Ala Trp Pro Glu Arg Asn 625 630 635 序列編號：2 序列長度：1 9 〇 5 序列類型：核酸 股數：雙股 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ #π. _ 85 - 555853 經濟部中央揉準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（83 ) 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：D N A 起源 生物名：黑曲霉ACE — 2 — 1 (ATCC 2 0 6 1 1 序列特徵 表示特徵之記號：mat peptide 存在位置：1 . · 1 9 〇 5 決定特徵之方法：Ε

序列 TCATACCACC TGGACACCAC GGCCCCGCCG CCGACCAACC TCAGCACCCT CCCCAACAAC ACCCTCTTCC ACGTGTGGCG GCCGCGCGCG CACATCCTGC CCGCCGAGGG CCAGATCGGC GACCCCTGCG CGCACTACAC CGACCCATCC ACCGGCCTCT TCCACGTGGG GTTCCTGCAC GACGGGGACG GCATCGCGGG CGCCACCACG GCCAACCTGG CCACCTACAC CGATACCTCC GATAACGGGA GCTTCCTGAT CCAGCCGGGC GGGAAGAACG ACCCCGTCGC CGTGTTCGAC GGCGCCGTCA TCCCCGTCGG CGTCAACAAC ACCCCCACCT TACTCTACAC CTCCGTCTCC TTCCTGCCCA TCCACTGGTC CATCCCCTAC ACCCGCGGCA GCGAGACGCA GTCGTTGGCC GTCGCGCGCG ACGGCGGCCG CCGCTTCGAC AAGCTCGACC AGGGCCCCGT CATCGCCGAC CACCCCTTCG CCGTCGACGT CACCGCCTTC CGCGATCCGT TTGTCTTCCG CAGTGCCAAG TTGGATGTGC TGCTGTCGTT GGATGAGGAG GTGGCGCGGA ATGAGACGGC CGTGCAGCAG GCCGTCGATG GCTGGACCGA GAAGAACGCC CCCTGGTATG TCGCGGTCTC TGGCGGGGTG CACGGCGTCG GGCCCGCGCA GTTCCTCTAC CGCCAGAACG GCGGGAACGC TTCCGAGTTC CAGTACTGGG AGTACCTCGG GGAGTGGTGG CAGGAGGCGA CCAACTCCAG CTGGGGCGAC GAGGGCACCT GGGCCGGGCG CTGGGGGTTC AACTTCGAGA CGGGGAATGT GCTCTTCCTC ACCGAGGAGG GCCATGACCC CCAGACGGGC GAGGTGTTCG TCACCCTCGG CACGGAGGGG TCTGGCCTGC CAATCGTGCC GCAGGTCTCC AGTATCCACG ATATGCTGTG GGCGGCGGGT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -86 - 555853 A7 B7

五、發明説明 GAGGTCGGGG GGGTTTCTGG TCGGCGGTGT ACGGGCGACC TCGCTGCTGC CTGGTGCGCG CTGCGCACGC TCGGTGACCG TCGCCGAGCT TCGTCCCCGC TACTACCAGT CCCACGAACC ATCGAGAACG GTTGTCGAGG GACAACTCCA GTCTCCGTGT (84 )

TGGGCAGTGA

ACTGGGGGTT

CGAAGACCAG

AGTACGAGCA

TGCCGCGCGA

AGGAGGGCGT

TGGGGATCAC

CGGAGGAGGA

CCAAGTTCTT

TCCAGTCCGG

TCAGCAACGA

CCGGGCTGGA

GCCAGGAGCA

TGTATGCCAA

CCCAGATCCG

CGGAGGGGCT

GCAGGAGGGT

CAGCGCCTAC

CGGCGTGGAG

GGCGGACGGG

GCTGAAGGTG

GTCGTGGGTG

GATCGCCCGG

CCGCACGCTG

CGTGCTGACG

GTTCGAAATC

GTCGCTGGTC

TAGCTTTACT

GGTCGAGACG

CGGGCGCTTT

CTTCTTCCAC

CTATAACGCC

GCCAAGGTCG

GCTGCGGCGG

GTGGATCGGT

TTCCCCACGG

CAGACGGTGG

GTGGGGGAGT

GAGACCAAGG

CAGACGGCGG

GCCCAGCTGG

CTGGCGTCGG

GTCGACCGCA

GAGTCCGGCA

TTGGATCTCA

GCGTTGAGCA

AACGGCGAGG

TGGCCGGAGA

AGTTCTCCCC

GCAAGGTGCT

ATGTCTCGTT

CCCAGCAGGG

AGAACGTCGT

CGGACAACCA

CGGCCCTGCT

CCGTCGTGCC

AGTTCCCCGC

AGCTGGAGCG

GCCAGACTAG

AGTTGCGGTT

CTGTCGTCGT

CCTGGGCGAG

GCGAGGTGCA

GAAAT CTCCATGGCC 1020 GCCGGCCAGC 1080 CGTCTGGTTG 1140 GTGGACGGGG 1200 CGACAACGAG 1260 GACGGCCAGG 1320 GGCCAACGGC 1380 GTTCGCGCAA 1440 GAGCGCGCGC 1500 CACGGCCATC 1560 TGCGGCGGCG 1620 GTTCGACGTG 1680 GGATAACGCG 1740 ATCGTGGTAC 1800 GTTCAGGAAT 1860 1905 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製

序 列 編 號 ·· 3 序 列 長 度 ·· 2 0 序 列 類 型 ： 胺 基 酸 拓 蹼 學 ： 直 鏈 狀 序 列 種 類 ： 胜 肽 斷 片 型 : 中 間 部 斷片 起 源 生 物 名 ; 黑 曲 霉 A C 2 0 6 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）_ 87 _ 555853 A7 B7 五、發明説明（85 ) 序列

Leu Asp Gin Gly Pro Val lie Ala Asp His Pro Phe Ala Val Asp Val 15 10 15

Thr Ala Phe Arg 20 序列編號：4 序列長度：2 0 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜肽 斷片型：中間部斷片 起源 生物名：黑曲霉ACE — 2 — 1 (ATCC 2 0 6 1 1 ) 序列

Val Glu Phe Ser Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser 1 5 10 15 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Ala Tyr Ala Ala 20 序列編號：5 序列長度：2 0 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜肽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -88 - 555853 A7 B7 五、發明説明（86) 斷片型：中間部斷片 起源 生物名：黑曲霉ACE — 2 — 1 (ATCC 2 0 6 1 1 ) 序列

Val Gin Thr Val Glu Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu 15 10 15

Gly Val Ser Trp 20 序列編號：6 序列長度：2 Ο 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜肽 斷片型：中間部斷片 起源 生物名：黑曲霉ACE-2-1 (ATCC 2 0 6 1 1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ) 序列 Ala Ala Leu Leu Ala Xaa Gly Ser Val Thr Ala Glu Glu Asp Arg Thr 1 5 10 15

Leu Gin Thr Ala 20 序列編號：7 序列長度：6 一 89 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 555853 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（87 ) 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜肽 斷片型：N末端斷片 起源 生物名：黑曲霉ACE — 2 — 1 (ATCC 2 0 6 1 1 ) 序列 Ser Tyr His Leu Asp Thr 1 5 序列編號：8 序列長度：2 0 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列 ATCGCSGAYC AYCCSTTYGC 20 序列編號：9 序列長度：2 0 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他核酸 合成DNA 序列 TCRTTRTCSA CSACRTTYTC 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -90 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 555853 A7 B7 五、發明説明（济） 序列編號· 1 〇 序列長度：7 8 8 序列類型：核酸 股數：雙股 拓蹼學··直鏈狀 起源 生物名：黑曲霉ACE — 2 — 1 (ATCC 2061 1 ) 序列特徵 表示特徵之記號：P CDS (部分的胺基酸序歹〇 存在位置：1 · _ 7 8 8 決定特徵之方法：E 序列 ATC GCC GAC CAC CCC TTC GCC GTC GAC GTC ACC GCC TTC CGC GAT CCG 48 lie Ala Asp His Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro 15 10 15 TTT GTC TTC CGC AGT GCC AAG TTG GAT GTG CTG CTG TCG TTG GAT GAG 96

Phe Val Phe Arg Ser Ala Lys Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Glu 20 25 30 GAG GTG GCG CGG AAT GAG ACG GCC GTG CAG CAG GCC GTC GAT GGC TGG 144

Glu Val Ala Arg Asn Glu Thr Ala Val Gin Gin Ala Val Asp Gly Trp 35 40 45 ACC GAG AAG AAC GCC CCC TGG TAT GTC GCG GTC TCT GGC GGG GTG CAC 192

Thr Glu Lys Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His 50 55 60 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標率局員工消費合作社印策

555853

GGC GTC GGG CCC GCG CAG TTC CTC TAC CGC CAG AAC GGC GGG AAC GCT

Gly Val Gly Pro Ala Gin Phe Leu Tyr Arg Gin Asn Gly Gly Asn Ala 65 70 75 80

TCC GAG TTC CAG TAC TGG GAG TAC CTC GGG GAG TGG TGG CAG GAG GCG

Ser Glu Phe Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gin Glu Ala 85 90 95

ACC AAC TCC AGC TGG GGC GAC GAG GGC ACC TGG GCC GGG CGC TGG GGG

Thr Asn Ser Ser Trp Gly Asp Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly 100 105 110

TTC AAC TTC GAG ACG GGG AAT GTG CTC TTC CTC ACC GAG GAG GGC CAT

Phe Asn Phe Glu Thr Gly Asn Val Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His 115 120 125

GAC CCC CAG ACG GGC GAG GTG TTC GTC ACC CTC GGC ACG GAG GGG TCT

Asp Pro Gin Thr Gly Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Thr Glu Gly Ser 130 135 140

GGC CTG CCA ATC GTG CCG CAG GTC TCC AGT ATC CAC GAT ATG CTG TGG

Gly Leu Pro lie Val Pro Gin Val Ser Ser lie His Asp Met Leu Trp 145 150 155 160

GCG GCG GGT GAG GTC GGG GTG GGC AGT GAG CAG GAG GGT GCC AAG GTC

Ala Ala Gly Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Gin Glu Gly Ala Lys Val 165 170 175

GAG TTC TCC CCC TCC ATG GCC GGG TTT CTG GAC TGG GGG TTC AGC GCC

Glu Phe Ser Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser Ala 180 185 190 本紙張尺度適财關_^( CNS ) M規格（21GX297公楚）一 92 - 240 288 336 384 432 480 528 576

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 555853 A7 ___B7 五、發明説明（9〇 ) TAC GCT GCG GCG GGC AAG GTG CTG CCG GCC AGC TCG GCG GTG TCG AAG 624

Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Val Ser Lys 195 200 205 ACC AGC GGC GTG GAG GTG GAT CGG TAT GTC TCG TTC GTC TGG TTG ACG 672

Thr Ser Gly Val Glu Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr 210 215 220 GGC GAC CAG TAC GAG CAG GCG GAC GGG TTC CCC ACG GCC CAG CAG GGG 720

Gly Asp Gin Tyr Glu Gin Ala Asp Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Gly 225 230 235 240 TGG ACG GGG TCG CTG CTG CTG CCG CGC GAG CTG AAG GTG CAG ACG GTG 768

Trp Thr Gly Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gin Thr Val 245 250 255 GAG AAC GTC GTC GAC AAC GA ^88

Glu Asn Val Val Asp Asn 260 序列編號：1 1 序列長度：5 6 5 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：蛋白質 起源 生物名·· Penicillium roQueforti IAM7254 序列特徵 表示特徵之記號：mat peptide 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-93 - 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印裝 555853 A7 B7 __ 五、發明説明（91 ) 存在位置：1_ · 565 決定特徵之方法：E 序列

Val Asp Phe His Thr Pro He Asp Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu 15 10 15

Ser Thr Leu Ala Asn Ala Ser Leu Phe Lys Thr Trp Arg Pro Arg Ala 20 25 30

His Leu Leu Pro Pro Ser Gly Asn lie Gly Asp Pro Cys Gly His Tyr 35 40 45

Thr Asp Pro Lys Thr Gly Leu Phe His Val Gly Trp Leu Tyr Ser Gly 50 55 60

He Ser Gly Ala Thr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Lys Asp Leu Asn 65 70 75 80

Pro Asp Gly Ala Pro Ser He Val Ala Gly Gly Lys Asn Asp Pro Leu 85 90 95

Ser Val Phe Asp Gly Ser Val lie Pro Ser Gly lie Asp Gly Met Pro 100 105 110

Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Tyr Leu Pro lie His Trp Ser lie 115 120 125

Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gin Ser Leu Ala Val Ser Tyr Asp 130 135 140

Gly Gly His Asn Phe Thr Lys Leu Asn Gin Gly Pro Val lie Pro Thr 145 150 155 160

Pro Pro Phe Ala Leu Asn Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe 165 170 175 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 SI m HI i 555853 A7 B7 五、發明説明（92 )

Gin Ser Pro lie Leu Asp Lys Ser Val Asn Ser Thr Gin Gly Thr Trp 180 185 190

Tyr Val Ala lie Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly Pro Cys Gin Phe 195 200 205

Leu Tyr Arg Gin Asn Asp Ala Asp Phe Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly 210 215 220

Gin Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Thr Thr Trp Gly Lys Gly Asp Trp 225 230 235 240

Ala Gly Gly Trp Gly Phe Asn Phe Glu Val Gly Asn Val Phe Ser Leu 245 250 255

Asn Ala Glu Gly Tyr Ser Glu Asp Gly Glu lie Phe lie Thr Leu Gly 260 265 270

Ala Glu Gly Ser Gly Leu Pro lie Val Pro Gin Val Ser Ser lie Arg 275 280 285

Asp Met Leu Trp Val Thr Gly Asn Val Thr Asn Asp Gly Ser Val Thr 290 295 300

Phe Lys Pro Thr Met Ala Gly Val Leu Asp Trp Gly Val Ser Ala Tyr 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 305 310 315 320

Ala Ala Ala Gly Lys lie Leu Pro Ala Ser Ser Gin Ala Ser Thr Lys 325 330 335

Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe lie Ser Tyr Val Trp Leu Thr Gly Asp 340 345 350

Leu Phe Glu Gin Val Lys Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Asn Trp Thr 355 360 365 一 95 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 555853 A7 B7 五、發明説明（93 )

Gly Ala Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Asn Val Arg Thr lie Ser Asn 370 375 380

Val Val Asp Asn Glu Leu Ser Arg Glu Ser Leu Thr Ser Trp Arg Val 385 390 395 400

Ala Arg Glu Asp Ser Gly Gin lie Asp Leu Glu Thr Met Gly lie Ser 405 410 415 lie Ser Arg Glu Thr Tyr Ser Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Phe Val 420 425 430

Glu Ser Gly Lys Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ala Val Pro Phe Asn Thr 435 440 445

Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr Ala Asn lie Ser Phe Pro 450 455 460

Thr Ser Ala Arg Asp Ser Gly lie Gin Ala Gly Phe Gin Val Leu Ser 465 470 475 480

Ser Ser Leu Glu Ser Thr Thr lie Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser 485 490 495 lie lie Val Asp Arg Ser Asn Thr Ser Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ala 500 505 510 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Gly lie Leu Ser Asp Asn Glu Ala Gly Arg Leu Arg Leu Phe Asp Val 515 520 525

Leu Arg Asn Gly Lys Glu Gin Val Glu Thr Leu Glu Leu Thr lie Val 530 535 540

Val Asp Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu 545 550 555 560 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 555853 A7 B7 五、發明説明（94 )

Gly Thr Trp Ala Arg 號度型 編長類 列列列 序序序

5 9 2 6 1X 酸 核 A 狀 N 鏈 D 股直： 雙：類 ••學種 數蹼列源 股拓序起 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 生物名：Penicillium roqueforti IAM7254 序列特徵 表示特徵之記號：mat peptide 存在位置·· 1 · · 1 6 9 5 決定特徵之方法：E 序列 GTTGATTTCC ATACCCCGAT TGACTATAAC TCGGCTCCGC CAAACCTTTC TACCCTGGCA 60 AACGCATCTC TTTTCAAGAC ATGGAGACCC AGAGCCCATC TTCTCCCTCC ATCTGGGAAC 120 ATAGGCGACC CGTGCGGGCA CTATACCGAT CCCAAGACTG GTCTCTTCCA CGTGGGTTGG 180 CTTTACAGTG GGATTTCGGG AGCGACAACC GACGATCTCG TTACCTATAA AGACCTCAAT 240 CCCGATGGAG CCCCGTCAAT TGTTGCAGGA GGAAAGAACG ACCCTCTTTC TGTCTTCGAT 300 GGCTCGGTCA TTCCAAGCGG TATAGACGGC ATGCCAACTC TTCTGTATAC CTCTGTATCA 360 TACCTCCCAA TCCACTGGTC CATCCCCTAC ACCCGGGGAA GCGAGACACA ATCCTTGGCC 420 GTTTCCTATG ACGGTGGTCA CAACTTCACC AAGCTCAACC AAGGGCCCGT GATCCCTACG 480 CCTCCGTTTG CTCTCAATGT CACCGCTTTC CGTGACCCCT ACGTTTTCCA AAGCCCAATT 540 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS)A4規格（2!〇X297公釐）一 _ 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 555853 A7 B7 五、發明説明（95 ) CTGGACAAAT CTGTCAATAG TACCCAAGGA ACATGGTATG TCGCCATATC TGGCGGTGTC 600 CACGGTGTCG GACCTTGTCA GTTCCTCTAC CGTCAGAACG ACGCAGATTT TCAATATTGG 660 GAATATCTCG GGCAATGGTG GAAGGAGCCC CTTAATACCA CTTGGGGAAA GGGTGACTGG 720 GCCGGGGGTT GGGGCTTCAA CTTTGAGGTT GGCAACGTCT TTAGTCTGAA TGCAGAGGGG 780 TATAGTGAAG ACGGCGAGAT ATTCATAACC CTCGGTGCTG AGGGTTCGGG ACTTCCCATC 840 GTTCCTCAAG TCTCCTCTAT TCGCGATATG CTGTGGGTGA CCGGCAATGT CACAAATGAC 900 GGCTCTGTCA CTTTCAAGCC AACCATGGCG GGTGTGCTTG ACTGGGGCGT GTCGGCATAT 960 GCTGCTGCAG GCAAGATCTT GCCGGCCAGC TCTCAGGCAT CCACAAAGAG CGGTGCCCCC 1020 GATCGGTTCA TTTCCTATGT CTGGCTCACT GGAGATCTAT TCGAGCAAGT GAAAGGATTC 1080 CCTACCGCTC AACAAAACTG GACCGGGGCC CTCTTACTGC CGCGAGAGCT GAATGTCCGC 1140 ACTATCTCTA ACGTGGTGGA TAACGAACTT TCGCGTGAGT CCTTGACATC GTGGCGCGTG 1200 GCCCGCGAAG ACTCTGGTCA GATCGACCTT GAAACAATGG GAATCTCAAT TTCCAGGGAG 1260 ACTTACAGCG CTCTCACATC CGGCTCATCT TTTGTCGAGT CTGGTAAAAC GTTGTCGAAT 1320 GCTGGAGCAG TGCCCTTCAA TACCTCACCC TCAAGCAAGT TCTTCGTGCT GACAGCAAAT 1380 ATATCTTTCC CGACCTCTGC CCGTGACTCT GGCATCCAGG CTGGTTTCCA GGTTTTATCC 1440 TCTAGTCTTG AGTCTACAAC TATCTACTAC CAATTCTCCA ACGAGTCCAT CATCGTCGAC 1500 CGCAGCAACA CGAGTGCTGC GGCGAGAACA ACTGCTGGGA TCCTCAGTGA TAACGAGGCG 1560 GGACGTCTGC GCCTCTTCGA CGTGTTGCGA AATGGAAAAG AACAGGTTGA AACTTTGGAG 1620 CTCACTATCG TGGTGGATAA TAGTGTACTG GAAGTATATG CCAATGGACG CTTTGCTCTA 1680 GGCACTTGGG CTCGG 1695 序列編號：1 3 序列長度：5 7 4 序列類型：胺基酸 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -98 - 555853 A7

經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（96 ) 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：蛋白質 起源 生物名：短尾帚霉 IF04843 序列特徵 表示特徵之記號：mat peptide 存在位置：1·· 574 決定特徵之方法：Ε 序列

Gin Pro Thr Ser Leu Ser lie Asp Asn Ser Thr Tyr Pro Ser He Asp 15 10 15

Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu Ser Thr Leu Ala Asn Asn Ser Leu 20 25 30

Phe Glu Thr Trp Arg Pro Arg Ala His Val Leu Pro Pro Gin Asn Gin 35 40 45 lie Gly Asp Pro Cys Met His Tyr Thr Asp Pro Glu Thr Gly lie Phe 5〇 55 60

His Val Gly Trp Leu Tyr Asn Gly Asn Gly Ala Ser Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80

Glu Asp Leu Val Thr Tyr Gin Asp Leu Asn Pro Asp Gly Ala Gin Met 85 90 95 lie Leu Pro Gly Gly Val Asn Asp Pro lie Ala Val Phe Asp Gly Ala 100 105 110

Val lie Pro Ser Gly lie Asp Gly Lys Pro Thr Met Met Tyr Thr Ser —--------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 115 120 125 本紙張尺度逋用中國國家榡準（CNS)A4規格（ 210X 297公釐）_ 9 一 555853 經濟部中央橾準局員工消费合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（97 )

Val Ser Tyr Met Pro lie Ser Trp Ser lie Ala Tyr Thr Arg Gly Ser 130 135 140

Glu Thr His Ser Leu Ala Val Ser Ser Asp Gly Gly Lys Asn Phe Thr 145 150 155 160

Lys Leu Val Gin Gly Pro Val lie Pro Ser Pro Pro Phe Gly Ala Asn 165 170 175

Val Thr Ser Trp Arg Asp Pro Phe Leu Phe Gin Asn Pro Gin Phe Asp 180 185 190

Ser Leu Leu Glu Ser Glu Asn Gly Thr Trp Tyr Thr Val lie Ser Gly 195 200 205

Gly lie His Gly Asp Gly Pro Ser Ala Phe Leu Tyr Arg Gin His Asp 210 215 220

Pro Asp Phe Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Pro Trp Trp Asn Glu Glu 225 230 235 240

Gly Asn Ser Thr Trp Gly Ser Gly Asp Trp Ala Gly Arg Trp Gly Tyr 245 250 255

Asn Phe Glu Val lie Asn lie Val Gly Leu Asp Asp Asp Gly Tyr Asn 260 265 270

Pro Asp Gly Glu lie Phe Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Ser Phe Asp 275 280 285

Pro lie Lys Pro Gin Ala Ser Asp Asn Arg Glu Met Leu Trp Ala Ala 290 295 300

Gly Asn Met Thr Leu Glu Asp Gly Asp lie Lys Phe Thr Pro Ser Met 305 310 315 320 本紙張尺度適用令國固家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

555853 A7 __ B7 五、發明説明（98 )

Ala Gly Tyr Leu Asp Trp Gly Leu Ser Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Lys 325 330 335

Glu Leu Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ser Gin Lys Ser Gly Ala Pro Asp 340 345 350

Arg Phe Val Ser Tyr Leu Trp Leu Thr Gly Asp Tyr Phe Glu Gly His 355 360 365

Asp Phe Pro Thr Pro Gin Gin Asn Trp Thr Gly Ser Leu Leu Leu Pro 370 375 380

Arg Glu Leu Ser Val Gly Thr lie Pro Asn Val Val Asp Asn Glu Leu 385 390 395 400

Ala Arg Glu Thr Gly Ser Trp Arg Val Gly Thr Asn Asp Thr Gly Val 405 410 415

Leu Glu Leu Val Thr Leu Lys Gin Glu lie Ala Arg Glu Thr Leu Ala 420 425 430

Glu Met Thr Ser Gly Asn Ser Phe Thr Glu Ala Ser Arg Asn Val Ser 435 440 445

Ser Pro Gly Ser Thr Ala Phe Gin Gin Ser Leu Asp Ser Lys Phe Phe 450 455 460 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Val Leu Thr Ala Ser Leu Ser Phe Pro Ser Ser Ala Arg Asp Ser Asp 465 470 475 480

Leu Lys Ala Gly Phe Glu lie Leu Ser Ser Glu Phe Glu Ser Thr Thr 485 490 495

Val Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser lie He He Asp Arg Ser Asn 500 505 510 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -101 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 555853 A7 ____B7 五、發明説明（99 )

Ser Ser Ala Ala Ala Leu Thr Thr Asp Gly lie Asp Thr Arg Asn Glu 515 520 525

Phe Gly Lys Met Arg Leu Phe Asp Val Val Glu Gly Asp Gin Glu Arg 530 535 540 lie Glu Thr Leu Asp Leu Thr lie Val Val Asp Asn Ser lie Val Glu 545 550 555 560

Val His Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu Ser Thr Trp Val Arg 565 570 序列編號：1 4 序列長度：1 7 2 2 序列類型：核酸 股數’·雙股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：D N A 起源 生物名：短尾帚霉IF04843 序列特徵 表示特徵之記號：mat peptide 存在位置：1..1722 決定特徵之方法：E 序列 CAACCTACGT CTCTGTCAAT CGACAATTCC ACGTATCCTT CTATCGACTA CAACTCCGCC 60 CCTCCAAACC TCTCGACTCT TGCCAACAAC AGCCTCTTCG AGACATGGAG GCCGAGGGCA 120 CACGTCCTTC CGCCCCAGAA CCAGATCGGC GATCCGTGTA TGCACTACAC CGACCCCGAG 180 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -102 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 555853 A7 B7___ 五、發明説明（100) ACAGGAATCT TCCACGTCGG CTGGCTGTAC AACGGCAATG GCGCTTCCGG CGCCACGACC 240 GAGGATCTCG TCACCTATCA GGATCTCAAC CCCGACGGAG CGCAGATGAT CCTTCCGGGT 300 GGTGTGAATG ACCCCATTGC TGTCTTTGAC GGCGCGGTTA TTCCCAGTGG CATTGATGGG 360 AAACCCACCA TGATGTATAC CTCGGTGTCA TACATGCCCA TCTCCTGGAG CATCGCTTAC 420 ACCAGGGGAA GCGAGACCCA CTCTCTCGCA GTGTCGTCCG ACGGCGGTAA GAACTTCACC 480 AAGCTGGTGC AGGGCCCCGT CATTCCTTCG CCTCCCTTCG GCGCCAACGT GACCAGCTGG 540 CGTGACCCCT TCCTGTTCCA AAACCCCCAG TTCGACTCTC TCCTCGAAAG CGAGAACGGC 600 ACGTGGTACA CCGTTATCTC TGGTGGCATC CACGGTGACG GCCCCTCCGC GTTCCTCTAC 660 CGTCAGCACG ACCCCGACTT CCAGTACTGG GAGTACCTTG GACCGTGGTG GAACGAGGAA 720 GGGAACTCGA CCTGGGGCAG CGGTGACTGG GCTGGCCGGT GGGGCTACAA CTTCGAGGTC 780 ATCAACATTG TCGGTCTTGA CGATGATGGC TACAACCCCG ACGGTGAAAT CTTTGCCACG 840 GTAGGTACCG AATGGTCGTT TGACCCCATC AAACCGCAGG CCTCGGACAA CAGGGAGATG 900 CTCTGGGCCG CGGGCAACAT GACTCTCGAG GACGGCGATA TCAAGTTCAC GCCAAGCATG 960 GCGGGCTACC TCGACTGGGG TCTATCGGCG TATGCCGCCG CTGGCAAGGA GCTGCCCGCT 1020 TCTTCAAAGC CTTCGCAGAA GAGCGGTGCG CCGGACCGGT TCGTGTCGTA CCTGTGGCTC 1080 ACCGGTGACT ACTTCGAGGG CCACGACTTC CCCACCCCGC AGCAGAATTG GACCGGCTCG 1140 CTTTTGCTTC CGCGTGAGCT GAGCGTCGGG ACGATTCCCA ACGTTGTCGA CAACGAGCTT 1200 GCTCGCGAGA CGGGCTCTTG GAGGGTTGGC ACCAACGACA CTGGCGTGCT TGAGCTGGTC 1260 ACTCTGAAGC AGGAGATTGC TCGCGAGACG CTGGCTGAAA TGACCAGCGG CAACTCCTTC 1320 ACCGAGGCGA GCAGGAATGT CAGCTCGCCC GGATCTACCG CCTTCCAGCA GTCCCTGGAT 1380 TCCAAGTTCT TCGTCCTGAC CGCCTCGCTC TCCTTCCCTT CGTCGGCTCG CGACTCCGAC 1440 CTCAAGGCTG GTTTCGAGAT CCTGTCGTCC GAGTTTGAGT CGACCACGGT CTACTACCAG 1500 TTTTCCAACG AGTCCATCAT CATTGACCGG AGCAACTCGA GTGCTGCCGC CTTGACTACC 1560 GATGGAATCG ACACCCGCAA CGAGTTTGGC AAGATGCGCC TGTTTGATGT TGTCGAGGGT 1620 GACCAGGAGC GTATCGAGAC GCTCGATCTC ACTATTGTGG TTGATAACTC GATCGTTGAG 1680 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS)A4規格（210X297公釐）一 j⑽一

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 555853 A7 B7 五、發明説明（ιοί) GTTCATGCCA ACGGGCGATT CGCTCTGAGC ACTTGGGTTC GG 1722 序列編號：1 5 序列長度：2 8 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他核酸 合成DNA 序列 GCGAATTCCA ATGAAGCTCA CCACTACC 28 序列編號：1 6 序列長度：2 4 序列類型=核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他核酸 合成DNA 序列 GCGGATCCCG GTCAATTTCT CTCC 24 序列編號：1 7 序列長度：1 9 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

GACTGACCGG TGTTCATCC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-104 - 555853 A7 B7 五、發明説明（1〇2) 序列編號：18 序列長度：2 0 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

CTCGGTTGTC ATAGATGTGG 序列編號：1 9 序列長度：2 4 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

CAATCCAGGA GGATCCCAAT GAAG 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列編號：2 0 序列長度：2 2 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

TGACCGGGAT CCGGGCATGC AG 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）1Λ|Τ -l(J5 - 555853 A7 B7 五、發明説明（103) 序列編號：2 1 序列長度：2 4 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

CGCGTCGTCT AGAGGTTGTC ACTT 序列編號：2 2 序列長度：2 1 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

CCCTATTGGG GTCCATGGCC C 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列編號：2 3 序列長度：2 2 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

CAACTGCTGG CATCCTCAGT GA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)鐵格（脆2贈）6 _ 555853 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝

五、發明説明（104) 序列編號：2 4 序列長度：3 0 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列 GCGGATCCAT GAAGCTATCA AATGCAATCA 序列編號：2 5 序列長度：2 6 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列 GCGGATCCTT ACCGAGCCCA AGTGCC 序列編號：2 6 序列長度：2 7 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列 GCGGATCCAA TGAAGCTCAC CACTACC (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 107 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 555853 A7 B7 五、發明説明（105) 序列編號：2 7 序列長度：2 4 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

GCGGATCCCG GTCAATTTCT CTCC 序列編號：2 8 序列長度：2 1 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

GTCACCGCCT GGCGCGATCC G 序列編號· 2 9 序列長度：19 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

GGCACGGAGT GGTCTGGCC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-108 _ 555853 A7 五、發明説明（1〇6) 序列編號：3 0 序列長度：2 4 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

CTCCAGTATC AAGGATATGC TGTG 序列編號：3 1 序列長度：2 0 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

CGACCAGTAC AAGCAGGCGG 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列編號：3 2 序列長度：2 1 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列

TCCAGTATCC GCGATATGCT G 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）1ΛΛ -luy - 555853 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製

五、發明説明（Η) 序列編號：3 3 序列長度：2 3 序列類型=核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列 CGGCACGGAG GTTTCTGGCC TGC 序列編號：3 4 序列長度：2 3 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列 CGGCACGGAG GAGTCTGGCC TGC 序列編號：3 5 序列長度：2 3 序列類型：核酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸 合成DNA 序列 CGGCACGGAG GATTCTGGCC TGC (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-j | - 555853 A7 B7 五、發明説明（108) 〔圖面之簡單說明〕 圖1爲示出依據本發明之yS -呋喃果糖苷酶基因被重 組入表現載體PAW2 0 - Hy g之圖。 圖2爲示出依據本發明第二態樣之方法所單離之$ ~ 呋喃果糖苷酶基因被重組入表現載體P PRS Ο 1 -H y g之圖。 圖3爲含有來自黑曲霉NRRL 4 3 3 4株之 n i aD基因的DNA斷片之限制酶輿圖。 圖4爲示出質體PAN2 0 3製作方法之圖示。 圖5爲示出質體PAN5 7 2製作方法之圖示。 圖6爲示出質體PAN120限制酶輿圖之圖示。 圖7爲示出質體PY2 8 3 1製作方法之圖示。 圖8爲示出質體PYSUC (F170W)製作方法 之圖示。 圖9爲示出質體PAN5 3 1製作方法之圖示。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -Μνι. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 55585： 修正i 補充I

   六、申請專利範圍 第86 1 02990號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國92年8月5日修正 1 . 一種D N A片段，其特徵爲由編碼序列表之序歹 編號1所示之胺基酸之D N A序列所成者。 序列編號：1 Ser Tyr His Leu Asp Thr Thr Ala Pro Pro Pro Thr Asn Leu Ser Thr 1 5 10 ' 15 Leu Pro Asn Asn Thr Leu Phe His Val Trp Arg Pro Arg Ala His He 20 25 30 Leu Pro Ala Glu Gly Gin He Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Thr Asp 35 40 45 Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asp Gly Asp Gly 5〇 55 60 lie A]a G】y Ala 丁hr 丁hr Ala Asn Leu Ala Thr Tyr Thr Asp Thr Ser 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ser Phe Leu lie Gin Pro Gly Gly Lys Asn Asp Pro Val 85 90 95 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 -- 本K) 、言 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 555853 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 Ala Val Phe Asp Gly Ala Val lie Pro Val Gly Val Asn Asn Thr Pro 100 105 110 Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu Pro He His Trp Ser lie 115 120 125 Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gin Ser Leu Ala Val Ala Arg Asp 130 135 140 Gly Gly Arg Arg Phe Asp Lys Leu Asp Gin Gly Pro Υεΐ lie Ala Asp 145 150 155 160 His Pro Phe Ala Ysl Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe 165 170 175 Arg Ser Ala Lys Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Glu Glu Yal Ala 180 185 190 Arg Asn Glu Thr Ala Val Gin Gin Ala Val Asp Gly Trp Thr Glu Lys 1S5 200 205 Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly 210 215 220 Pro Ala Gin Phe Leu Tyr Arg Gin Asn Gly Gly Asn Ala Ser Glu Phe 225 230 235 240 Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gin Glu Ala Thr Asn Ser 245 250 255 Ser Trp Gly Asp Glu G】y Thr Trp Ala G]y Arg Trp Gly Phe Asn Phe 260 265 270 Glu Thr Gly Asn Val Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His Asp Pro Gin 275 280 285 ^ 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4現格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 ^^裝丨 本頁 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -2 - 555853 經濟部智慧財產局員工消黄合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 丁hr Gly Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Thr GIu Gly Ser G])，Leu Pro 290 295 300 lie Val Pro Gin Val Ser Ser He His Asp Met Leu Trp Ala Ala Gly 305 310 315 320 Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Gin Glu Gly Ala Lys Val Glu Phe Ser 325 330 335 Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser Ala Tyr Ala Ala 340 345 350 Ala G】y Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Val Ser Lys Thr Ser Gly 355 360 365 Val Glu Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr Gly Asp Gin 370 375 380 Tyr Glu Gin ΑΙδ Asp Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Gly Trp Thr Gly :385 3*80 395 400 I Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gin Thr Val Glu Asn Val 405 410 415 Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu Gly Val Ser Trp Val Val Gly 420 425 430 Glu Ser Asp Asn Gin Thr Ala Arg Leu Arg Thr Leu Gly lie Thr lie 435 440 445 Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala Leu Leu Ala Asn Gly Ser Val Thr Ala 450 455 460 Glu Glu Asp Arg Thr Leu Gin Thr Ala Ala Val Val Pro Phe Ala Gin 465 470 475 480 請 先 閲 讀 背 之 注 I 旁 裝 訂

   線 本纸張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3- 555853 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 Ser Pro Ser Ser Lvs Phe Phe Val Leu Thr Ala Gin Leu Glu Phe Pro 485 490 4S5 Ala Ser Ala Arg Ser Ser Pro Leu Gin Ser Gly Phe Glu He Leu Ala 500 505 510 Ser Glu Leu Glu Arg Thr Ala He Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser 515 520 525 Leu Val Val Asp Arg Ser Gin Thr Ser Aia Ala Ala Pro Thr Asn Pro 530 535 540 Gly Leu Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val 545 550 555 560 lie Glu Asn Gly Gin Glu Gin Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Val 565 570 575 Val Asp Asn Ala Va] Ya] Glu V2I Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu 580 585 590 Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Asp Asn Ser Thr Gin lie Arg Phe 595 600 605 Phe His Asn Gly Glu Gly Glu Va] Gin Phe Arg Asn Val Ser Val Ser 610 615 620 Glu Gly Leu Tyr Asn Ala Trp Pro Glu Arg Asn 625 630 6352 ·如申請專利範圍第1項之D N A片段，其爲由序 列表之序列編號2所示之鹼基序列所成者。序列編號：2 (請先閲讀背面之注意事項 裝丨. 本頁 *1Τ

   本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉Α4洗格（210Χ297公釐） -4 - 555853 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消贲合作社印製 六、申請專利範圍 TCATACCACC TGGACACCAC GGCCCCGCCG CCGACCAACC TCAGCACCCT CCCCAACAAC 60 ACCCTCTTCC ACGTGTGGCG GCCGCGCGCG CACATCCTGC CCGCCGAGGG CCAGATCGGC 120 GACCCCTGCG CGCACTACAC CGACCCATCC ACCGGCCTCT TCCACGTGGG GTTCCTGCAC 180 GACGGGGACG GCATCGCGGG CGCCACCACG GCCAACCTGG CCACCTACAC CGATACCTCC 240： GATAACGGGA GCTTCCTGAT CCAGCCGGGC GGGAAGAACG ACCCCGTCGC CGTGTTCGAC 300 1 GGCGCCGTCA TCCCCGTCGG CGTCAACAAC ACCCCCACCT TACTCTACAC CTCCGTCTCC 360 TTCCTGCCCA TCCACTGGTC CATCCCCTAC ACCCGCGGCA GCGAGACGCA GTCGTTGGCC 420 GTCGCGCGCG ACGGCGGCCG CCGCTTCGAC AAGCTCGACC AGGGCCCCGT CATCGCCGAC 480 i CACCCCTTCG CCGTCGACGT CACCGCCTTC CGCGATCCGT TTGTCT7CCG CAGTGCCAAG 540 | TTGGATGTGC TGCTGTCGTT GGATGAGGAG GTGGCGCGGA ATGAGACGGC CGTGCAGCAG 600 GCCGTCGATG GCTGGACCGA GAAGAACGCC CCCTGGTATG TCGCGGTCTC TGGCGGGGTG 660 CACGGCGTCG GGCCCGCGCA GTTCCTCTAC CGCCAGAACG GCGGGAACGC TTCCGAGTTC 720 .CAGTACTGGG AGTACCTCGG GGAGTGGTGG CAGGAGGCGA CCAACTCCAG CTGGGGCGAC 780 | I GAGGGCACCT GGGCCGGGCG CTGGGGGTTC AACTTCGAGA CGGGGAATGT GCTCTTCCTC 840 ACCGAGGAGG GCCATGACCC CCAGACGGGC GAGGTGTTCG TCACCCTCGG GACGGAGGGG 900 TCTGGCCTGC CAATCGTGCC GCAGGTCTCC AGTATCCACG ATATGCTGTG GGCGGCGGGT 960 GAGGTCGGGG TGGGCAGTGA GCAGGAGGGT GCCAAGGTCG AGTTCTCCCC CTCCATGGCC 1020 GGGTTTCTGG ACTGGGGGTT CAGCGCCTAC GCTGCGGCGG GCAAGGTGCT GCCGGCCAGC 1080 TCGGCGGTGT CGAAGACCAG CGGCGTGGAG GTGGATCGGT ATGTCTCGTT CGTCTGGTTG 1140 ACGGGCGACC AGTACGAGCA GGCGGACGGG TTCCCCACGG CCCAGCAGGG GTGGACGGGG 1200 TCGCTGCTGC TGCCGCGCCA GCTGAAGGTG CAGACGGTGG AGAACGTCGT CGACAACGAG 1260 CTGGTGCGCG AGGAGGGCGT GTCGTGGGTG GTGGGGGAGT CGGACAACCA GACGGCCAGG 1320 CTGCGCACGC TGGGGATCAC GATCGCCCGG GAGACCAAGG CGGCCCTGCT GGCCAACGGC 1380 TCGGTGACCG CGGAGGAGGA CCGCACGCTG CAGACGGCGG CCGTCGTGCC GTTCGCGCAA 1440 TCGCCGAGCT CCAAGTTCTT CGTGCTGACG GCCCAGCTGG AGTTCCCCGC GAGCGCGCGC 1500 (請先閲讀背面之注意事項 --裝-- 本 κ) 訂

   本紙浪尺度逋用中國國家標率（CMS ) A4洗格（210 X 297公釐） -5 · 555853 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 TCGTCCCCGC TCCAGTCCGG GTTCGAAATC CTGGCGTCGG AGCTGGAGCG CACGGCCATC 1560 TACTACCAGT TCAGCAACGA GTCGCTGGTC GTCGACCGCA GCCAGACTAG TGCGGCGGCG 1620 (請先閲讀背面之注意事項本頁) CCCACGAACC CCGGGCTGGA TAGCTTTACT GAGTCCGGCA AGTTGCGGTT GTTCGACGTG 1680 ATCGAGAACG GCCAGGAGCA GGTCGAGACG TTGGATCTCA CTGTCGTCGT GGATAACGCG 1740 GTTGTCGAGG TGTATGCCAA CGGGeGCTTT GC6TTGAGCA CCTGGGCGAG ATCGTGGTAC 1800 GACAACTCCA CCCAGATCCG CTTCTTCCAC AACGGCGAGG GCGAGGTGCA GTTCAGGAAT I860 GTCTCCGTGT CGGAGGGGCT CTATAACGCC TGGCCGGAGA GAAAT 1905 3 · —種多肽，其特徵爲由下述（1 )的胺基酸序歹ij 所成者： (1 )序列編號1所示的胺基酸序列 序列編號：1 Ser Tyr His Leu Asp Thr Thr Ala Pro Pro Pro Thr Asn Leu Ser Thr 15 10 15 Leu Pro Asn Asn Thr Leu Phe His Val Trp Arg Pro Arg Ala His He 20 25 30 Leu Pro Ala Glu Gly Gin lie Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Thr Asp 35 40 45 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Va] Gly Phe Leu His Asp Gly Asp Gly 5〇 55 60 lie AJa Gly Ala Thr Thr Ala Asn Leu Ala Thr Tyr Thr Asp Thr Ser 65 70 75 80 -6- 本紙張尺度速用中國國家棣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 555853 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消骨合作社印製 六、申請專利範圍 Asp Asn Gly Ser Phe Leu lie Gin Pro Gly Gly Lys Asn Asp Pro Va] 85 SO 95 Ala Va] Phe Asp Gly Ala Val He Pro Val Gly Val Asn Asn Thr Pro 100 105 110 Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu Pro lie His Trp Ser He 115 120 125 Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gin Ser Leu Ala Val Ala Arg Asp 130 135 140 Gly Gly Arg Arg Phe Asp Lys Leu Asp Gin Gly Pro Val He Ala Asp 145 150 155 160 His Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe 165 170 175 Arg Ser Ala Lys Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Glu Glu Val Ala 180 185 ISO Arg Asn Glu Thr Ala Val Gin Gin Ala Val Asp G]y Trp Thr Glu Lys 195 200 205 Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly 210 215 220 Pro Ala Gin Phe Leu Tyr Arg Gin Asn Gly Gly Asn Ala Ser Glu Phe 225 230 235 240 Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gin Glu Ala Thr Asn Ser 245 250 255 Ser Trp Gly Asp Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly Phe Asn Phe 260 265 270 Glu Thr Gly Asn Va] Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His Asp Pro Gin 275 280 285 * *· (請先閲讀背面之注意事項

   本瓦) 、vd 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4洗格（210X297公釐） 555853 經濟部智慧財產局員工消肯合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 Thr Gly Glu Ya] Phe Va] 丁hr Leu Gly Thr GIu Giy Ser Gly Leu Pro 290 295 300 lie Ysl Pro Gin Val Ser Ser lie His Asp Met Leu Trp Ala Ala Gly 305 310 315 320 Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Gin Glu Gly Ala Lys Val Glu Phe Ser 325 S30 335 Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp 丁rp G]y Phe Ser Ala Tyr A]a Ala 340 345 350 Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Val Ser Lys Thr Ser G】y 355 360 365 Val Glu Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr Gly Asp Gin 370 375 380 I Tyr Glu Gin Aia Asp Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Gly Trp Thr Gly 385 390 395 400 Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gin Thr Val Glu Asn Val 405 410 415 Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu Gly Val Ser Trp Val Val Gly 420 425 430 Glu Ser Asp Asn Gin Thr Ala Arg Leu Arg Thr Leu Gly lie Thr lie 435 440 445 Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala Leu Leu Ala Asn Gly Ser Val Thr Ala 450 455 460 Glu Glu Asp Arg Thr Leu Gin Thr Ala Ala Val Val Pro Phe Ala Gin 465 470 475 480 (請先閲讀背面之注意事項

   本瓦) 、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4说格（210X 297公釐） -8- 555853 A8 B8 C8 D8 ~、申請專利範圍 Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Vsl Leu Thr Ala Gin Leu Glu Phe Pro 485 490 495 Ala Ser Ala Arg Ser Ser Pro Leu Gin Ser Gly Phe Glu lie Leu Ala 500 505 510 Ser Glu Leu Glu Arg Thr Ala He Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser 515 520 525 Leu Val Val Asp Arg Ser Gin Thr Ser Ala Ala Ala Pro 丁hr Asn Pro 530 535 540 Gly Leu Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val 545 550 555 560 lie Glu Asn Gly Gin Glu Gin Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Val 565 570 575 Val Asp Asn Ala Val Val Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu 580 585 590 Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Asp Asn Ser Thr Gin lie Arg Phe 595 600 605 Phe His Asn Gly Glu Gly Glu Val Gin Phe Arg Asn Val Ser Val Ser 610 615 620 Glu Gly Leu Tyr Asn Ala Trp Pro Glu Arg Asn 625 630 635 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS ) A4洗格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項v Γ本瓦)

   經濟部智慧財產局員工消贲合作社印製 555853 經濟部智慧財產局員工消肯合作社印製 A8 B8 C8 D8 __六、申請專利範圍4 · 一種多肽，其特徵爲由序列表之序列編號1 1 記載之胺基酸序列所成者。序列編號· 1 1 Val Asp Phe His 丁hr Pro lie Asp Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu 1 5 ]〇 15 Ser Thr Leu Ala Asn Ala Ser Leu Phe Lys Thr Trp Arg Pro Arg Ala 2〇 25 30 Kis Leu Leu Pro Pro Ser Gly Asn He Glv Asp Pro Cys Glv His Tyr 35 40 45 Thr Asp Pro Lys Thr Gly Leu Phe His Υεΐ Gly Trp Leu Tyr Ser Gly 5〇 55 60 lie Ser Gly Ala Thr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Lys Asp Leu Asn 70 75 80 Pro Asp Gly Ala Pro Ser He Val Ala Gly Gly Lys Asn Asp Pro Leu 85 90 95 Ser Val Phe Asp Gly Ser Val lie Pro Ser Gly lie Asp Gly Met Pro 100 105 HO 螫 Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Tyr Leu Pro He His Trp Ser He 115 120 125 Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gin Ser Leu Ala Va] Ser Tyr Asp 130 135 140 Gly Gly His Asn Phe Thr Lys Leu Asn Gin Gly Pro Val I]e Pro Thr ⑽ 150 155 160 Pro Pro Phe Ala Leu Asn Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe 165 170 175 (請先閲讀背面之注意事項

   本瓦) 訂

   本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4洗格（210X 297公釐） -10- 555853 經濟部智慧財產局員工消黄合作社印製 A8 B8 C8 D8申請專利範圍 Gin Ser Pro lie Leu Asp Lys Ser Val Asn Ser Thr Gin Gly Thr TA-p 180 185 190 Tyr Val Ala Ιΐς Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly Pro Cys Gin Phe 1S5 200 205 ' Leu Tyr Arg Gin Asn Asp Ala Asp Phe Gin Tyr Trp Glu Tvr Leu Gly 210 215 220 Gin Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Thr Thr Trp Gly Lys Gly Asp Trp 225 230 235 240 Ala Gly Gly Trp Gly Phe Asn Phe Glu Val Gly Asn Vai Phe Ser Leu 245 250 255 Asn Ala Glu Gly Tyr Ser Glu Asp Gly Glu He Phe He Thr Leu Gly 260 265 270 Ala Glu Gly Ser Gly Leu Pro lie Val Pro Gin Val Ser Ser He Arg 275 280 285 I Asp Met Leu Trp Val Thr Gly Asn Val Thr Asn Asp Gly Ser Val Thr , 290 295 300 I 1 Phe Lys Pro Thr Met Ala Gly Val Leu Asp Trp Gly Val Ser Ala Tyr 305 310 315 320 Ala Ala Ala Gly Lys lie Leu Pro Ala Ser Ser Gin Ala Ser Thr Lys 325 330 335 ；Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe lie Ser Tyr Val Trp Leu Thr Gly Asp 340 345 350 1 Leu Phe Glu Gin Val Lys Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Asn Trp Thr 355 360 365 請 先 閲 讀 背 面 之 注

   頁

   本紙张尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4現格（210X297公釐） -11 - 555853 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 Gly Ala Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Asn Val Arg Thr He Ser Asn 370 375 380 Val Val Asp Asn Glu Leu Ser Arg Glu Ser Leu Thr Ser Trp Arg Val 385 390 395 400 Ala Arg Glu Asp Ser Gly Gin He Asp Leu Glu Thr Ket Gly lie Ser 405 410 415 lie Ser Arg Glu Thr Tyr Ser Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Phe Val 420 425 430 Glu Ser Gly Lys Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ala Val Pro Phe Asn Thr 435 440 445 Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr Ala Asn lie Ser Phe Pro 450 455 460 Thr Ser Ala Arg Asp-.Ser Gly He Gin Ala Gly Phe Gin Val Leu Ser 465 470 475 480 Ser Ser Leu Giu Ser Thr Thr He Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser 485 490 495 He He Val Asp Arg Ser Asn Thr Ser Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ala 500 505 510 Gly He Leu Ser Asp Asn Glu Ala Gly Arg Leu Arg Leu Phe Asp Val 515 520 525 Leu Arg Asn Gly Lys Glu Gin Val Glu Thr Leu Glu Leu Thr lie Val 530 535 540 Val Asp Asn Ser Val leu Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu 545 550 555 560 Gly Thr Trp Ala Arg 565 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

   訂 經濟部智慧財產局員工消贲合作社印製 -12- 555853 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消骨合作社印製 六、申請專利範圍 5 . —種D N A，其特徵爲編碼如申請專利範圍第4 項所述之多肽。 6 ·如申請專利範圍第5項之D N A，其爲由序列表 之序列編號1 2記載之鹼基序列所成者。 序列編號：1 2 GTTGATTTCC ATACCCCGAT TGACTATAAC TCGGCTCCGC CAAACCTTTC TACCCTGGCA 60 AACGCATCTC TTTTCAAGAC ATGGAGACCC AGAGCCCATC TTCTCCCTCC ATCTGGGAAC 120 ATAGGCGACC CGTGCGGGCA CTATACCGAT CCCAAGACTG GTCTCTTCCA CGTGGGTTGG 180 CTTTACAGTG GGATTTCGGG AGCGACAACC GACGATCTCG TTACCTATAA AGACCTCAAT 240 CCCGATGGAG CCCCGTCAAT TGTTGCAGGA GGAAAGAACG ACCCTCTTTC TGTCTTCGAT 300 GGCTCGGTCA TTCCAAGCGG TATAGACGGC ATGCCAACTC TTCTGTATAC CTCTGTATCA 360 TACCTCCCAA TCCACTGGTC CATCCCCTAC ACCCGGGGAA GCGAGACACA ATCCTTGGCC 420 GTTTCCTATG ACGGTGGTCA CAACTTCACC AAGCTCAACC AAGGGCCCGT GATCCCTACG 480 CCTCCGTTTG CTCTCAATGT CACCGCTTTC CGTGACCCCT ACGTTTTCCA AAGCCCAATT 540 CTGGACAAAT CTGTCAATAG TACCCAAGGA ACATGGTATG TCGCCATATC TGGCGGTGTC 600 CACGGTGTCG GACCTTGTCA GTTCCTCTAC CGTCAGAACG ACGCAGATTT TCAATATTGG 660 GAATATCTCG GGCAATGGTG GAAGGAGCCC CTTAATACCA CTTGGGGAAA GGGTGACTGG 720 GCCGGGGGTT GGGGCTTCAA CTTTGAGGTT GGCAACGTCT TTAGTCTGAA TGCAGAGGGG 780 TATAGTGAAG ACGGCGAGAT ATTCATAACC CTCGGTGCTG AGGGTTCGGG ACTTCCCATC 840 GTTCCTCAAG TCTCCTCTAT TCGCGATATG CTGTGGGTGA CCGGCAATGT CACAAATGAC 900 GGCTCTGTCA CTTTCAAGCC AACCATGGCG GGtGTGCTTG ACTGGGGCGT GTCGGCATAT 960 GCTGCTGCAG GCAAGATCTT GCCGGCCAGC TCTCAGGCAT CCACAAAGAG CGGTGCCCCC 1020 GATCGGTTCA TTTCCTATGT CTGGCTCACT GGAGATCTAT TCGAGCAAGT GAAAGGATTC 1080 CCTACCGCTC AACAAAACTG GACCGGGGCC CTCTTACTGC CGCGAGAGCT GAATGTCCGC 1140 (請先閲讀背面之注意事項再 頁)

   4 本纸張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 555853 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消骨合作社印製 々、申請專利範圍 AC丁ATCTCTA ACGTGGTGGA TAACGAACTT TCGCGTGAGT CCTTGACATC GTGGCGCGTG 1200 GCCCGCGAAG ACTCTGGTCA GATCGACCTT GAAACAATGG GAATCTCAAT TTCCAGGGAG 1260 ACTTACAGCG CTCTCACATC CGGCT'CATCT TTTGTCGAGT CTGGTAAAAC GTTGTCGAAT 1329 GCTGGAGCAG TGCCCTTCAA TACCTCACCC TCAAGCAAGT TCTTCGTGCT GACAGCAAAT 1380 ATATCTTTCC CGACCTCTGC CCGTGACTCT GGCATCCAGG CTGGTTTCCA GGTTTTATCC 1440 TCTAGTCTTG AGTCTACAAC TATCTACTAC CAATTCTCCA ACGAGTCCAT CATCGTCGAC 1500 CGCAGCAACA CGAGTGCTGC GGCGAGAACA ACTGCTGGGA TCCTCAGTGA TAACGAGGCG 1560 GGACGTCTGC GCCTCTTCGA CGTGTTGCGA AATGGAAAAG AACAGGTTGA AACTTTGGAG 1620 CTCACTATCG TGGTGGATAA TAGTGTACTG GAAGTATATG CCAATGGACG CTTTGCTCTA 1680 GGCACTTGGG CTCGG 1695 7 · —種多肽，其特徵爲由序列表之序列編號1 3記 載之胺基酸序列所成者。 序列編號：1 3 Gin Pro Thr Ser Leu Ser lie Asp Asn Ser Thr Tyr Pro Ser lie Asp 1 5 10 15 Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu Ser Thr Leu Ala Asn Asn Ser Leu 20 25 30 Phe Glu Thr Trp Arg Pro Arg Ala His Val Leu Pro Pro Gin Asn Gin 35 40 45 lie Gly Asp Pro Cys Met His Tyr Thr Asp Pro Glu Thr Gly lie Phe 50 55 60 (請先閲讀背面之注意事項

   本瓦) 訂

   本紙涞尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4洗格（210X297公釐） -14- 555853 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 His Val Gly Trp Leu Tyr Asn Gly Asn Gly Ala Ser Gly Ala Thr Thr 7〇 75 80 Glu Asp Leu Va] Thr Tyr Gin Asp Leu Asn Pro Asp Gly Ala Gin Met 85 90 95 He Leu Pro Gly Gly Yal Asn Asp Pro lie Ala Yal Phe Asp Gly Ala ICO 105 HO He Pro Ser Gly He Asp Gly Lys Pro Thr Met Het Tyr ThrSer 115 120 125 Val Ser Tyr Met Pro lie Ser Trp Ser lie Ala Tyr Thr /‘rg G】y Ser 130 135 140 Glu Thr His Ser Leu A]a Val Ser Ser Asp Gly Gly Lys Asn Phe Thr 145 150 155 160 Lys Leu Val Gin Gly Pro Val He Pro Ser Pro Pro Phe Gly Ala Asn 165 170 175 Val Thr Ser Trp Arg Asp Pro Phe Leu Phe Gin Asn Pro Gin Phe Asp 180 185 ISO Ser Leu Leu Glu Ser Glu Asn Gly Thr Trp Tyr Thr Val lie Ser Gly 195 200 205 G]y He His Gly Asp Gly Pro Ser Ala Phe Leu Tyr Arg Gin His Asp 210 215 220 Pro Asp Phe Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Pro Trp Trp Asn Glu Glu 225 230 235 240 Gly Asn Ser Thr Trp Gly Ser Gly Asp Trp Ala Gly Arg Trp Gly Tyr 245 ' 250 255 (請先閲讀背面之注意事項 裝-- 項本頁)

   經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS〉A4此格（210X 297公釐） -5 - 555853 經濟部智慧財產局員工消黄合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 Asn Phe Glu Val He Asn lie Va] Gly Leu Asp Asp Asp Gly Tyr Asn 260 265 270 Pro Asp G】>，Glu lie Phe Ala Thr Val GI)，丁hr Glu Trp Ser Phe Asp 275 280 285 Pro lie Lys Pro Gin Ala Ser Asp Asn Arg GIu Ket Leu Trp Ala A1 召 290 295 300 G]y Asn Ket Thr Leu GIu Asp Gly Asp He Lys Phe Thr Pro Ser Met 305 310 315 '..320 Ala Gly Tyr Leu Asp Trp Gly Leu Ser Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Lys 325 330 335 Glu Leu Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ser Gin Lys Ser Gly Ala Pro Asp 340 345 350 Arg Phe Val Ser Tyr Leu Trp Leu Thr Gly Asp Tyr Phe Glu Gly His 355 360 365 Asp Phe Pro Thr Pro Gin Gin Asn Trp Thr Gly Ser Leu Leu Leu Pro 370 375 380 Arg Glu Leu Ser Val Gly Thr lie Pro Asn Val Val Asp Asn Glu Leu 385 390 395 400 Ala Arg Glu Thr Gly Ser Trp Arg Val Gly Thr Asn Asp Thr Gly Val 405 410 415 Leu Glu Leu Val Thr Leu Lys Gin Glu lie Ala Arg Glu Thr Leu Ala 420 425 430 ' (請先閲讀背面之注意事項 I ^ϋ» 士^ϋ^— If ) 訂

   本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4洗格（210X297公釐） -16- 555853 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消骨合作社印製 六、申請專利範圍 Glu Ket Thr Ser Gly Asn Ser Phe Thr Glu Ala Ser Arg Asn Val Ser 435 440 445 Ser Pro Gly Ser Thr Ala Phe Gin Gin Ser Leu Asp Ser Lys Phe Phe 450 455 460 Vsl Leu Thr Ala Ser Leu Ser Phe Pro Ser Ser Aia Arg Asp Ser Asp 465 470 475 480 Leu Lys Ala Gly Phe Glu lie Leu Ser Ser Glu Phe Glu Ser Thr Thr 485 490 495 Val Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser He lie lie Asp Arg Ser Asn 500 505 510.. Ser Ser Ala Ala Ala Leu 丁hr 丁hr Asp Gly lie Asp 丁hr Arg Asn Glu 515 520 525 Phe Gly Lys Met Arg Leu Phe Asp Val Val Glu Giy Asp Gin Glu Arg 530 535 540 lie Glu Thr Leu Asp Leu Thr lie Val Val Asp Asn Ser lie Val Glu .545 550 555 560 Val His Ala Asn Gly Arg Fhe Ala Leu Ser Thr Trp Val Arg . 565 570 (請先閲讀背面之注意事項

   本瓦) 訂

   本紙伕尺度適用中國囷家標準（CNS )六4規^格（210X297公釐） -17- 555853 Λ8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消骨合作社印製 六、申請專利範圍 8 . —種DNA，其特徵爲編碼如申請專利範圍第7 項之多肽。 9 .如申請專利範圍第8項之D N A，其爲由序列表 之序列編號1 4記載之鹼基序列所成者。 序列編號· 1 4 CAACCTACGT CTCTGTCAAT CGACAATTCC ACGTA7CCTT CTATCGACTA CAACTCCGCC 60 CCTCCAAACC TCTCGACTCT TGCCAACAAC AGCCTCTTCG AGACATGGAG GCCGAGGGCA 120 CACGTCCTTC CGCCCCAGAA CCAGATCGGC GATCCGTGTA TGCACTACAC CGACCgGAG 180 ACAGGAATCT TCCACGTCGG CTGGCTGTAC AACGGCAATG GCGCTTCCGG CGCCACGACC 240 GAGGATCTCG TCACCTATCA GGATCTCAAC CCCGACGGAG CGCAGATGAT CCTTCCGGGT 300 GGTGTGAATG ACCCCATTGC TGTCTTTGAC GGCGCGGTTA TTCCCAGTGG CATTGATGGG 360 AAACCCACCA TGATGTATAC CTCGGTGTCA TACATGCCCA TCTCCTGGAG CATCGCTTAC 420 ACCAGGGGAA GCGAGACCCA CTCTCTCGCA GTGTCGTCCG ACGGCGGTAA GAACTTCACC 480 AAGCTGGTGC AGGGCCCCGT CATTCCTTCG CCTCCCTTCG GCGCCAACGT GACCAGCTGG 540 CGTGACCCCT TCCTGTTCCA AAACCCCCAG TTCGACTCTC TCCTCGAAAG CGAGAACGGC 600 ACGTGGTACA CCGTTATCTC TGGTGGCATC CACGGTGACG GCCCCTCCGC GTTCCTCTAC 660 CGTCAGCACG ACCCCGACTT CCAGTACTGG GAGTACCTTG GACCGTGGTG GAACGAGGAA 720 ,GGGAACTCGA CCTGGGGCAG CGGTGACTGG GCTGGCCGGT GGGGCTACAA CTTCGAGGTC 780 ；ATCAACATTG TCGGTCTTGA CGATGATGGC TACAACCCCG ACGGTGAAAT CTTTGCCACG 840 GTAGGTACCG AATGGTCGTT TGACCCCATC AAACCGCAGG CCTCGGACAA CAGGGAGATG 900 CTCTGGGCCG CGGGCAACAT GACTCTCGAG GACGGCGATA TCAAGTTCAC GCCAAGCATG 960 GCGGGCTACC TCGACTGGGG TCTATCGGCG TATGCCGCCG CTGGCAAGGA GCTGCCCGCT 1020 TCTTCAAAGC CTTCGCAGAA GAGCGGTGCG CCGGACCGGT TCGTGTCGTA CCTGTGGCTC 1080 ACCGGTGACT ACTTCGAGGG CCACGACTTC CCCACCCCGC AGCAGAAHG GACCGGCTCG 1140 (請先閲讀背面之注意事項

   本I) 訂

   本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS > A4说格（ΜΟΧ297公釐） -18- 555853 經濟部智慧財產局員工消骨合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 CTTTTGCTTC CGCGTGAGCT GAGCGTCGGG ACGATTCCCA ACGTTGTCGA CAACGAGCTT 1200 GCTCGCGAGA CGGGCTCTTG GAGGGTTGGC ACCAACGACA CTGGCGTGCT TGAGCTGGTC 1260 ACTCTGAAGC AGGAGATTGC TCGCGAGACG CTGGCTGAAA TGACCAGCGG CAACTCCTTC 1320 ACCGAGGCGA GCAGGAATGT CAGCTCGCCC GGATCTACCG CCTTCCAGCA GTCCCTGGAT 1380 TCCAAGTTCT TCGTCCTGAC CGCCTCGCTC TCCTTCCCTT CGTCGGCTCG CGACTCCGAC 1440 CTCAAGGCTG GTTTCGAGAT CCTGTCGTCC GAGTTTGAGT CGACCACGGT CTACTACCAG 1500 TTTTCCAACG AGTCCATCAT CATTGACCGG AGCAACTCGA GTGCTGCCGC CTTGACTACC 1560 GATGGAATCG ACACCCGCAA CGAGTTTGGC AAGATGCGCC TGTTTGATGT TGTCGAGGGT 1620 GACCAGGAGC GTATCGAGAC GCTCGATCTC ACTATTGTGG TTGATAACTC GATCGTTGAG 1680 GTTCATGCCA ACGGGCGATT CGCTCTGAGC ACTTGGGTTC GG 1722 1 0 · —種/3 -呋喃果糖苷酶之製造方法，其特徵爲 包含 藉由含有編碼/3 -呋喃果糖苷酶之序列號碼2所記載 的D N A序列所組成之D N A構築物，轉形曲霉屬（ Aspergillus)、且不顯示；S -呋喃果糖苷酶活性之絲狀菌、 培養此轉形體、 由此轉形體和/或其培養物採集；S -呋喃果糖苷酶之. 步驟。 1 1 .如申請專利範圍第1 〇項yS -呋喃果糖苷酶之 製造方法，其中，絲狀菌爲藉由令母曲霉屬絲狀菌染色體 D NA上之-呋喃果糖苷酶基因之一部分或全部缺失， 而不顯示出/3 -呋喃果糖苷酶基因者。 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項所述之石一呋喃果糖 苷酶之製造方法，其中絲狀菌爲黑曲霉（Aspergillusniger (請先閲讀背面之注意事項本頁)

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   本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19- 555853 A8 B8 C8 ________ 08 六、申請專利範圍 )0 1 3 ，如申請專利範圍第1 2項所述之/3 -呋喃果糖 苷酶之製造方法，其中絲狀菌爲黑曲霉N I A 1 6 0 2株 〇 1 4 · 一種/3 -呋喃果糖苷酶變異體，其特徵爲/3 -呋喃果糖苷酶係由下述序列號碼1所示的胺基酸序列所成 之yS -呋喃果糖苷酶，且具有1或2個以上選自下述a ) 〜d )所成群之取代所成： a )第1 7 0號的胺基酸係由，選自色胺酸、苯基丙 胺酸、及酪胺酸所成群之芳香族胺基酸所取代、 b )第3 0 0號的胺基酸係由，選自色胺酸、纈胺酸 、谷胺酸、及天冬胺酸所成群之胺基酸所取代、 c )第3 1 3號的胺基酸係由，選自離胺酸、精胺酸 、及組胺酸所成群之胺基酸所取代、 d )第3 8 6號的胺基酸係由，選自離胺酸、精胺酸 、及組胺酸所成群之胺基酸所取代。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20 - 555853 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 序列編號· 1 Ser Tyr His Leu Asp Thr Thr Ala Pro Pro Pro Thr Asn Leu Ser Thr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asn Thr Leu Phe His Val 丁卬 Arg Pro Arg Ala His lie 20 25 30 Leu Pro Ala Glu Gly Gin lie Gly Asp Pro Cvs Ala His Tvr Thr Asp 35 40 45 Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asp Gly Asp Gly 50 55 60 lie Ala Gly Ala Thr 丁hr Ala Asn Leu A】a Thr Tyr Thr Asp Thr Ser 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ser Phe Leu lie Gin Pro Gly Gly Lys Asn Asp Pro Val 85 90 95 (請先閲讀背面之注意事項本頁) 項本 訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -21 - 555853 經濟部智慧財產局員工消骨合作社印製 A8 B8 C8 D8々、申請專利範圍 Ala V2] Phe Asp Gly Ala V2I He Pro Val Gly Val Asn Asn Thr Pro 100 105 110 Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu Pro lie His Trp Ser lie 115 120 125 Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Giu Thr Gin Ser Leu Ala Val Ala Arg Asp 130 135 140 Gly Gly Arg Arg Phe Asp Lvs Leu Asp Gin Gly Pro Val He Ala Asp 145 150 155 160 His Fro Phe Ala Y2I Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe 165 170 175 Arg Ser Ala Lys Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Glu Glu Val Ala 180 185 190 Arg Asn Glu Thr Ala Yal Gin Gin Ala Val Asp Gly Trp Thr Glu Lys 195 200 205 Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His Gly Va] Gly 210 215 220 Pro Ala Gin Phe Leu Tyr Arg Gin Asn Gly Gly Asn Ala Ser Glu Phe 225 230 235 240 Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gin Glu Ala Thr Asn Ser 245 250 255 Ser Trp Gly Asp Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly Phe Asn Phe 260 265 270 Glu Thr Gly Asn Va] Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His Asp Pro Gin 275 280 285 (請先閲讀背面之注意事項

   本育) 訂

   本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22- 555853 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 Thr G]y Glu Val Phe V2I Thr Leu Gly Thr Glu G]y Ser Gly Leu Pro 290 2S5 300 He Val Pro Gin Yal Ser Ser lie His Asp Met Leu Trp Ala Ala Gly 305 310 315 320 Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Gin Glu Gly Ala Lys Val Glu Phe Ser 325 330 335 Pro Ser Met Ala G]y Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser Ala Tyr Ala Ala 340 345 350 Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Yal Ser Lys Thr Ser Gly 355 360 365 Val Glu Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr Gly Asp Gin 370 375 380 丁)τ Glu Gin A]a Asp Gly Phe Pro 丁hr Ala Gin Gin G]y Trp Thr Gly 385 390 385 400 Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gin Thr Val Glu Asn Val 405 410 415 Val Asp Asn Glu Leu Yal Arg Glu Glu Gly Val Ser Trp Val Val Gly 420 425 430 Glu Ser Asp Asn Gin Thr Ala Arg Leu Arg Thr Leu Gly He Thr lie 435 440 445 Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala Leu Leu Ala Asn Gly Ser Val Thr Ala 450 455 460 Glu Glu Asp Arg Thr Leu Gin Thr Ala Ala Val Val Pro Phe Ala Gin 465 470 475 480 (請先閲讀背面之注意事項

   本I) 訂 本紙浪尺度逍用中國國家標準（CNS〉A4現格（210X297公釐） -23- 555853 8 8 8 8 ABCD 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項 Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Vsl Leu Thr Ala Gin Leu Glu Phe Pro 485 490 495 Ala Ser Ala Arg Ser Ser Pro Leu Gin Ser Gly Phe Glu lie Leu Ala 500 5C5 510 Ser Glu Leu Glu Arg Thr Ala lie Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser 515 520 525 Leu Val Val Asp Arg Ser Gin Thr Ser Ala Ala Ala Pro Thr Asn Pro 530 535 540 Gly Leu Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val ;545 550 555 560 He Glu Asn Gly Gin Glu Gin Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Val 565 570 575 Val Asp Asn Ala Val Yal Giu Vcl Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu 580 585 590 Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Asp Asn Ser Thr Gin lie Arg Phe 5S5 600 605 i 經濟部智慧財產局員工消黄合作社印製 I Phe His Asn Gly Glu Gly Glu Val Gin Phe Arg Asn Val Ser Val Ser 610 615 620 Glu Gly Leu Tyr Asn Ala Trp Pro Glu Arg Asn 625 630 635 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) ( 210Χ297公釐） -24- 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 555853 A8 B8 C8 ___ D8 六、申請專利範圍 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項之y5 -呋喃果糖苷酶 變異體’其爲於序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中 的第1 7 〇個胺基酸或其相當位置之胺基酸爲被色胺酸、 苯基丙胺酸、及酪胺酸所組成之群中所選出之芳香族胺基 酸所取代。 1 6 ·如申請專利範圍第1 4項之Θ -呋喃果糖苷酶 變異體’其爲於序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中 的第3 〇 〇個胺基酸或其相當位置之胺基酸爲被色胺酸、 纈胺酸、谷胺酸、及天冬胺酸所組成之群中所選出之胺基 酸所取代。 1 7 .如申請專利範圍第1 4項之/3 -呋喃果糖苷酶 變異體，其爲於序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中 的第3 1 3個胺基酸或其相當位置之胺基酸爲被離胺酸、 精胺酸、及組胺酸所組成之群中所選出之鹼基性胺基酸所 取代。 1 8 .如申請專利範圍第1 4項之/3 -呋喃果糖苷酶 變異體，其爲於序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中 的第3 8 6個胺基酸被離胺酸、精胺酸、及組胺酸所組成 之群中所選出之鹼基性胺基酸所取代。 1 9 .如申請專利範圍第1 4項之-呋喃果糖苷酶 變異體，其爲於序列表之序列編號1記載之各胺基酸序列 中第1 7 0個胺基酸爲被色胺酸所取代，第3 0 0個胺基 酸爲被色胺酸所取代、及第3 1 3個胺基酸爲被離胺酸所 取代者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 25 - 555853 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 _____D8々、申請專利範圍 2 0 _如申請專利範圍第1 4項之yg 一呋喃果糖苷酶 變異體’其爲於序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中 之第1 7 0、3 0 0、及3 1 3個胺基酸爲分別被色胺酸 、纈胺酸、及離胺酸所取代。 2 1 · —種D N A，其特徵爲編碼如申請專利範圍第 1 4至2 0項中任一項之々一呋喃果糖苷酶變異體。 2 2 · —種/3 -呋喃果糖苷酶變異體之製造方法，其 特徵爲如申請專利範圍第1 4至2 0項中任一項所述之石 一呋喃果糖苷酶變異體之製造方法，其爲包含 藉由如申請專利範圍第2 1項之D N A或含有此 DNA之表現載體而將曲霉屬（Aspefgilus )，且爲無顯示 冷-呋喃果糖苷酶活性之絲狀菌的宿主細胞進行轉形、 培養此轉形體、 並由此轉形體和/或其培養物採集^ 一呋喃果糖苷酶 之步驟。 2 3 ·如申請專利範圍第2 2項之/3 -呋喃果糖苷酶 變異體的製造方法，其中該絲狀菌爲黑曲霉 (Aspergillusniger ) 〇 2 4 ·如申請專利範圍第2 3項之沒-呋喃果糖苷酶 變異體的製造方法，其中該絲狀菌爲黑曲霉（ Aspergillusniger)爲黑曲霉 N I A 1 6 0 2 株。 2 5 · —種果寡糖之製造方法，其特徵爲包含令如申 請專利範圍第1 4至2 0項中任一項之；3 -呋喃果糖苷酶 變異體，與蔗糖接觸之步驟。 (請先閲讀背面之注意事項再$本頁) 太 訂-

   本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26- 555853 A8 B8 C8 D8 _____ 六、申請專利範圍 2 6 · —種/3 -呋喃果糖苷酶變異體的製造方法，其 特徵爲含有以如申請專利範圍第1項或第2項之D N A片 段或D N A，轉形屬於曲霉屬且無顯示/3 -喃果糖活性之 絲狀菌，再培養該絲狀菌，由此絲狀菌及/或其培養物中 採集/3 —呋喃果糖苷酶的步驟。 2 7 ·如申請專利範圍第2 6項之/5 -呋喃果糖苷酶 變異體的製造方法，其中該絲狀菌黑曲霉（ Aspergillusniger ) ° 2 8 .如申請專利範圍第2 7項之Θ -呋喃果糖苷酶 變異體的製造方法，其中該黑曲霉（Aspergillus niger)爲黑 曲霉NIA1602株。 2 9 · —種/9 -呋喃果糖苷酶變異體的製造方法，其 特徵爲含有以如申請專利範圍第5項或第8項之D N A， 轉形屬於曲霉屬（Aspergillus)且無顯示冷一呋喃果糖脊 酶活性之絲狀菌，再培養該絲狀菌，由此絲狀菌及/或其 培養物中採集/3 -呋喃果糖苷酶的步驟。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 0 ·如申請專利範圍第2 9項之Θ -呋喃果糖苷.酶 變異體的製造方法，其中該絲狀菌黑曲霉（ Aspergillusniger ) 〇 3 1 ·如申請專利範圍第3 0項之Θ -呋喃果糖苷酶 變異體的製造方法，其中該黑曲霉（Aspergillus niger)爲黑 曲霉NIA1602株。 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）