TW520375B

TW520375B - Proteinase K resistant surface protein of neisseria meningitidis

Info

Publication number: TW520375B
Application number: TW085105599A
Authority: TW
Inventors: Bernard Brodeur; Josee Hamel; Denis Martin; Clement Rioux
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1996-05-11
Publication date: 2003-02-11
Also published as: JP4271231B2; AR002970A1; EP2241625A1; PL184373B1; MX9707061A; KR100361562B1; JP2007159583A; NO974264D0; RO117924B1; IL117483A0; SK287456B6; AU716225B2; OA10742A; PL322363A1; CZ298052B6; EA001789B1; JPH11500624A; BR9607651B8; CA2215161C; BR9607651B1

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 at B7 五、發明説明（/ ) 昍夕抟術領域本發明傺有關一種位在腦膜炎奈瑟氏球菌生物體之表面處的高度守恆的、免疫學上易接近的抗原。此獨特的抗原提供有關可用於腦膜炎奈瑟氏球菌疾病之治療、預防以及撿驗之新的免疫治療用、預防用以及檢驗用試劑的基礎。更特別地，本發明傺有關一種具一表觀分子量為22 kDa 的抗蛋白酶K的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，其對應的核 ί 苷酸序列以及推衍的胺基酸序列（序列辨識編號：1至序列辨識編號：26)，用於生成該腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之重組DNA方法，其會結合該腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa 表面蛋白之抗體，以及供用於腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的撿驗、治療與預防的方法與組成物。 g»明夕费署腦膜炎奈瑟氏球_是世界上五大死亡與罹病率的一大主要原因。腦膜炎奈瑟氏球菌會引起地方性與流行性疾病，主要為腦膜炎及腦膜炎球_血疾[Gold, Evolution οί meningococcal disease· p. 69, Vedros N. A. , CRC Press (1987)； Schwartz et al., CIin> Microbiol. R._e_y ·., 2_, f>. SI 18 (1989)]。事實上在美國，此微生物是在 B 型流感喃血桿 _ (Haemophilus influenzas t y p e B )之後，最常見引起細菌性腦膜炎的原因之一，佔所有病例約 20¾。已有相當多的檔案證實，血清殺菌的活性是對抗腦膜炎奈瑟氏球菌的主要防禦機制，而且防禦細菌的侵襲與血清中抗腦膜炎抗體的出現有關連（Goldschneider et al., 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 HIJII.----%丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 J, 520375 A7 B7 五、發明説明（2 ) L·__Exp. Mfid. . 129:1307, 1969 ； Goldschneider et al.,

Exp. Med.· 129:1327. 1969)。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 腦膜炎奈瑟氏球菌根據本狀抗原的出現而再分為血清學群。目前，有12個血清群被確認，但血清群A、B、C、Y 及W-135是最常被發現。在血清群中，可於外膜蛋白質及脂多醣上鑑定出血清型、亞型及免疫型（Frasch et al ., Infect. ί)ι、‘· L：504, 1985) ° 目前已有使用的莢膜多醣疫苗不能有效地對抗所有的腦膜炎奈瑟氏球菌分離物，且在年幼的嬰兒體内不能有效地誘發防禦性的抗體産生[Frasch, Chin, HicrobioK 2_, ρ· S134, 1989; Reingold et al·，Lancet, p . 114, 1 985; Zollinger, in Voodrov and Levine, New G e ή e r a t i on a c c i n e · p. 325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (1990)] ° 血清群A、C、Y及W-l 35的莢膜多醣目前被使用在抗此微生物之疫苗。這些多醣疫苗短期是有效的，然而接種過疫苗的個體不會發展出一免疫學的記億，所以他們必須在一為三年之期間内再行接種俾以維持其等之抗性位準。再者，經濟部中央標準局員工消費合作社印製這些多醣疫苗在兩歳以下的小孩體内無法誘發出足夠量的殺菌性抗體以維持所需的防禦。兩歲以下的小孩是這疾病的主要受害者。目前沒有對抗血清群B分離物之可利用的有效疫苗，g卩使這些微生物是開發國家中腦膜炎疾病的主要原因之一。確實地，血清群BS _不是一個好的免疫原，其只誘發出一具低專一性之極差的IgΜ反應，該反應沒有保護性 ϋ [Gotschlich et al·, J. Exp」—_Med», 129, p . 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 ___B7___ 五、發明説明（）） 1349 (1969); Skevakis et al·, JL_I n f e c _D i s—_·.，14..9_> P· 3 8 7 (1984)·，Zollinger e t al·，J，C h i. n. ·_I ·， p · 8 3 6 (1 9 7 9)]。再者，在人類新生兒腦組織内所出現之極為相似的交叉反應性構造可能會使要嘗試改善血清群B多醣的免疫生成性之念頭不受到鼓勵。為了得到一更有效的疫苗，其它腦膜炎奈瑟氏議表面抗原如脂多醣，鞭毛蛋白質與出現在外膜的蛋白質正被研究中。在免疫過的自願者及復原的病人血清中所出現的人類免疫反應以及對抗某些此等蛋白質表面抗原的殺菌性抗营豊，已被證實之[Mandrell and Zollinger, Infect·__Lulhil^， 5 7 · ρ· 1590 (1989) ； Poo 1 man e t a 1 . , Infect. Immun 40· p. 398 (1983)； Rosenquist et al., J > Ch i n > Microbiol·· 26, p. 1543 (1988)； Wedege and Froholm, Infect, I mmu n. « 51, p. 571 (1986) ； Wedege and Michaelsen, J. Chin· Microbiol·, 25, p· 1349 (1986)]° 再者，諸如第1、2/3及5類之直接對抗外膜蛋白質的單株抗體，亦已被報導在動物體内實驗性感染具殺菌性及防禦力。[Brodeur et al·, Tnfec· Immun·· 5 0, p · 510 (1985) , Fraseh et al. Chin. Invest. MedL· 9, p. 101 (19 8 6) ； Saukkonen et a 1. , Microb. Pathogen, , 3, p. 261 (1987)； Saukkonen et al., Vaccine. 7,325(1989)]0 以腦膜炎奈瑟氏球菌為基礎的抗原的製品在動物體内及人類體内已證明有免疫的效果而且一些抗原製品已在臨床試驗中測試過了 [ B j u n e e t a 1 · , Lancet, p. 1093 (1991)；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) • 衣.

、1T 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（孕） t

Costa et a 1 . , NIPH Annals. 14, p. 215 (1991) ； Frasch e ^ 3 1 . , M_e d , T r 〇 p . , 43, p. 177 (1982)； Frasch et al., J^__C lin. Microbiol.. 4, p. 533 (1985) ； Frasch et al·， In Robbins, Bacterial Vaccines* p. 262, Praeter Publications, N.Y. (1987)； Frasch et al, J « Inf 9. c.t . D_Ls_^_，158，p· 710 (1988); Moreno et al, Infec. Tmninn , 47, p. 527 (1985)； Rosenqvist et al., J > Clin. MXcrobioI^., 26, p· 1543 (1988) ; Sierra et al . , NIPH Anna 1 s,, 14, p. 195 (1991)； Wedege and Froholm, Inf firt r I. m m u n . , 51, p. 571 (1986)； Wedege and Michaelsen, !·_—Cl in—· Microbiol . , 25, p. 1349 (1987) ； Zol 1 inger θt a 1 ·，J. Clin. Invent…63, ρ· 836 (1979)；

Zollinger et al., NIPH Annals· 14, p. 211 (1991)] 。然而，外膜蛋白質中所存在之極大的菌種間抗原性變異性可能會限制其等在疫苗上的用途[Frasch , Clin. Microh.. Rev· 2, p. SI 34 (1989)]。確實地，大部分的此等製品所誘發殺菌性的抗體被局限於相同或相關於用於該抗原之萃取的血清型 Q [Zollinger, in Woodrow andLevine，New Generation Vacc i nes. p. 3 2 5 Marcel Dekker Inc. N.Y. (1990)〕再者，在年幼小孩體内由這些疫苗所賦予的防禦尚待清楚地被確定。高度守恆的腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白質，諸如第 4類（Munkley et al，Μ i c r o b, Pathogen., II, Ρ· 447, 1991 )及 lip 蛋白質（亦稱為 H.8)(Woods et a 1. , Tnfect. Immun· , 55, p. 1 927 , 1987)不是令人感本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 7 I ίι 0 - 1== f -I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 _ 五、發明説明（夕）興趣的疫苗候選者，因為它們不會誘出殺菌性抗體的産生。為了改進這些疫苗製品，有需要高度守恆的蛋白質，其出現在所有腦膜炎奈瑟氏球__株的表面而且能夠誘出殺菌性抗體以使發展一廣範圍的疫苗。目前腦膜炎奈瑟氏球菌的實驗室的撿驗通常以塗抹標本的革蘭氏染色，膠乳凝集試驗或同族凝集與在加強的及篩選的培養基中做培養及分離的技術來完成。[Morel lo et a 1. , ί η Β a 1 ο ws, Manual of Clinical Microbiology· p . 258, American Society for Microbiology, Washington (1991)]。通常要執行磺水化合物降解測試，俾以證實腦 * 膜炎奈瑟氏球«分離物的鑑定。大部分被描述的方法是費時之程序，需要受過訓練的人員。含有直接對抗為最普遍的血清群所表現之莢膜抗原的多價血清之市售的凝集試驗或共凝集試劑套組被用來作為腦膜炎奈瑟氏菌之快速鑑定。然而這些多價血清通常會非專一性地與其他_種産生交叉反應，而因為這個原因，總是必須連同革蘭氏染色及培養一起使用之。於是，關於此等檢驗試驗，需要有效率的替代的方式來改善撿驗的快速性及可靠性。發明的提霡肉容本發明藉由提供一位在腦膜炎奈瑟氏_生物體表面上之高度守恆的、免疫學上易接近的抗原來解決上述的問題。本發明亦有提供的是，編碼前述抗原之重組型DNA分子，被那些DNA分子所轉形的單細胞宿主以及製造實質上純質的、重組型抗原的方法。亦提供抗前述腦膜炎奈瑟氏菌本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 520375 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（6 ) 抗原的專一性抗體。本發明的抗原與抗體提供了用於偵測、預防及治療腦膜炎奈瑟氏菌疾病之獨待的方法及藥學組成物的基礎。較佳的抗原是腦膜炎奈瑟氏a 22 kDa表面蛋白，包括其片段、類似物及衍生物。較佳的抗體是對腦膜炎奈瑟氏鋪22 kDa表面蛋白具專一性之單株抗體Me-1及Me-7。這些抗體對腦膜炎奈瑟氏菌具高度的溶_力，且被動地保護老鼠對抗實驗性感染。本發明更提供分離新穎的腦膜炎奈瑟氏菌表面抗原及其專一性抗體的方法。圖忒夕槪要説明第1圖描寫腦膜炎奈瑟氏菌菌株608B的22kDa表面蛋白之核苷酸及推衍的胺基酸（序列辨識編號：1 ;序列辨識編號；2)。使用傳統的三個字母符號來表示胺基酸殘基。開放解讀架構從位在第143個鹼基的起始密碼子延伸至位在第667個鹼基的終止密碼子。方框表示推衍的核糖體結合址，而推衍的-10啓動子序列被畫線之。一個為19個胺基酸之訊號胜肽亦被畫線之。第2圖偽為一展示出腦膜炎奈瑟氏球菌菌株608B (B: 2 a: P 1.2)外膜製品的α -胰凝乳蛋白酶與胰蛋白酶消化物之庫馬西藍（Coomassie Blue)染色的SDS-PAGE凝膠照片ϋ 第1行含有下列分子量標記：磷酸化酶b (97, 400);牛血清白蛋白（66,200);卵白蛋白（45,000);磺酸酐酶（31,000) ;大豆胰蛋白酶抑制素（21 ,500)以及溶菌酵素（14,400)。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —-

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 9 520375 A7 B7 五、發明説明（7 ) 第2行含有未消化分解的對照組外膜製品°第3行含有α _ 胰凝乳蛋白酶處理過的製品（2 mg酵素/mg蛋白質）。第4行含有胰蛋白酶處理過的製品。第3a圖是展示蛋白酶K消化分解腦膜炎奈瑟氏球菌菌株608B (B:2a: Pl,2)外膜製品的庫馬西藍染色的14¾ SDS- PAGE凝膠的照片。第1、3、5與7行含有未消化分解的對照組。第2、4、6、8行含有以蛋白酶K消化分解過的外膜製品。第1至4行含有以pH 7 .2處理過的製品。第5行至8含有以PH9.0處理過的製品。第1、2、5與6行含有尚未以SDS處理的製品。第3、4、7與8行含有以SDS處理的過的製品。分子量標記是顯示在左邊（以kDa為單位）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製第3b圖是展示親和力純化的重組型22 kDa蛋白質的移動圖形之庫馬西藍染色的14% SDS-PAGE凝膠的照片。第1 行含有分子量標記：磷酸化酶b (97,400);牛血清白蛋白 (66,200);卵白蛋白（45,000);磺酸酐酶（31,000);大豆胰蛋白酶抑制素（2 1,500)以及溶菌酵素（14,400)。第2行含有5Mg的對照組親和力純化的重組型22 kDa蛋白質。第3 行含有在100 °C下被加熱達5分鐘的5iig的親和力純化的重組型22 kDa蛋白質。第4行含有在100 °C下被加熱達10分鐘的5/ig的親和力純化的重組型22 kDa蛋白質。第5行含有在 l〇〇°C下被加熱達15分鐘的5ug的親和力純化的重組型22kDa 蛋白質。第4圖是庫馬西藍染色的14% SDS-PAGE凝膠與其相對應的西方免疫沾移法其顯示單株抗體對腦膜炎奈瑟氏球菌 10 .----%II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 五、發明説明（(P ) 22 kDa表面蛋白專一性的反應性的照片。源自腦膜炎奈瑟氏球__株60別（B:2a:P1.2)的外膜製品，（A)未處理過的，（B)蛋白酶K處理過的（2 IU/mg的蛋白質）。第1行包括分子量標記與外膜製品於14¾ SDS-PAGE凝膠上的特徵移動圖。第2行含有Me-2。第3行含有Me-3。第4行含有Me-5。第5行含Me-7，第6行含有一不相關的對照組單株抗體。分子量標記是磷酸化酶b (97,400)、牛血清白蛋白（66, 200) 、卵白蛋白（45,000)、碳酸酐酶（31,000)、大豆胰蛋白酶抑制素（21, 500)以及溶菌酶（14,400)。該免疫沾移的結果顯示在第4圖，Me-2、Me-3、Me-5、Me-6與Me-7的免疫沾移結果與Me - 1所獲得的結果一致。第5圖是單株抗體對完整細菌細胞結合能力的圖表的描繪。代表的單株抗體Me-5與Me-7的結果以“CPM”表示在縱軸。使用在鑑定的許多細菌菌株顯示在橫軸。一種流感嘻血桿菌（Haemophilus influenzae)造孔蛋白（porin) 專一性單株抗體被用來作為一負對照組。記錄下低於500 CPM之背景計數，並將之從結合值中扣除。第6圖是染過的SDS-PAGE凝膠與其相對應的西方沾移法的照片，其證明源自濃縮的培養的大腸桿菌菌株BL21 (DE3)上澄液的重組型22 kDa腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的純化。第6(A)圖是一庫馬西藍及銀染色的1«SDS-P AGE 凝膠的照片。第1行含有以下的分子量標記：磷酸化酶b (97,400 )、牛血清白蛋白（66,200 )、卵白蛋白（45, 000 )、磺酸酐酶（31 , 000)、大豆胰蛋白酶抑制素（21 , 500)與溶菌本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7) 酵素（14,400)。第2行含有抽取自腦膜炎奈瑟氏球_菌株 608B (血清型B:2a:P1.2)的外膜製品（10mg)。第3行含有濃縮的培養的大腸桿菌BL21 (DE3) (10mg)的上澄液。第4行含有經親合純化的重組型22 kDa腦膜炎奈瑟氏球鐘表面蛋白（1 mg)。第6 (B)圖是以α -胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶Κ予以消化分解之親合力純化的重組型22 kDa腦膜炎奈瑟氏球®表面蛋白之庫馬西藍染的14% SDS-PAGE凝膠的照片。第1行含有下列分子量標記：磷酸化酶b (97,400) 、牛血清白蛋白（66,200)、卵白蛋白（45,000)、碳酸酐酶 (31,000)、大豆胰蛋白酶抑制素（21,500)與溶菌酵素（14, 400)。第2行至5含有純化過的重組型22 kDa腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白（2mg)。第7行至10行含有牛血清白蛋白（2ms) 。第2行與第7行含有未消化分解的蛋白質（”MT”）。第3與第8行含α -胰凝乳蛋白（”C”）處理過的蛋白質（2mg酵素/mg 蛋白質）。第4行與第9行含胰蛋白酶（”T”）處理過的蛋白質 (2mg酵素/mg蛋白質）、第5行與第10行含蛋白酵素Κ ΓΚ”）處理過的蛋白質（2 IU/mg蛋白質）。第6(C)圖是一使用單株抗體Me-5之重複的凝膠之西方免疫沾移圔片。第7圖是蛋白質A-純化的抗腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa 表面蛋白單株抗體對抗腦炎奈瑟氏球菌菌株608B (B :2a: P 1 . 2)的殺菌的能力的圔表描繪。圖的縱軸顯示，在暴露於不同濃度的單株抗體（顯示於圖的橫軸）後，腦膜炎奈瑟氏球菌之存活百分比。第8圖描述腦膜炎奈瑟氏球_鋪株MCH88的22 kDa表面本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 12 ---；— ·------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（/^) 蛋白之核苷酸以及推衍的胺基酸序列（序列辨識編號：3 ; 序列辨識編號：4)。使用傳統的三個字母符號來表示胺基酸殘基。開放解讀架構從位在第116個鹼基的起始密碼子延伸至位在第643個鹼基的終止密碼子。第9圔描述腦膜炎奈瑟氏球菌菌株Z4063的22 kDa表面蛋白之核苷酸以及推衍的胺基酸序列（序列辨識編號：5 ; 序列辨識編號：6 )。使用傳統的三個字母符號來表示胺基酸殘基。開放解讀架構從位在第208個鹼基的起始密碼子延伸至位在第732個鹼基的終止密碼子。第10圖描述腦膜炎奈瑟氏球菌菌株b2的22 kDa表面蛋白之核苷酸以及推衍的胺基酸序列（序列辨識編號：7 ;序列辨識編號：8)。使用傳統的三個字母符號來表示胺基酸殘基。開放解讀架構從位在第241値鹼基的起始密碼子延伸至位在第765個鹼基的終止密碼子。第11圖描述從奈瑟氏球菌之4値菌株的DNA序列所建立之守恆序列，並旦示出各個菌株所特有之核苷酸取代或插入。第12圖描述從奈瑟氏球菌之4個菌株的DNA序列所建立之守恆序列，並且示出各個菌株所特有之胺基酸取代或插入。第13圖傺為以交互式ELISA效價來表示的，兔子對該重組型22 kDa蛋白質之免疫反應的時間流程。兔子被注射以源自於帶有質體pN2202或對照組質體pWKS30之大腸捍菌 _株JM109的外膜製品。利用ELISA使用得自於腦膜炎奈瑟 ----g--m------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 - --Γ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 13 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 五、發明説明（// ) 氏球菌菌株608B (B :2a: P1* 2)之外膜製品作為塗覆抗原，來分析具專一性的體液性反應之發展。第14圖是傺為以交互式ELISA效價來表示的，M^naca £_a s c ί c u 1. a r ί s (cynomolgus)猴對該重組型 22 kDa蛋白質之免疫反應的時間流程。兩隻猴分別以每次注射為1 OOiiig (K28)與200ms ( 1276)的親和力純化的22 kDa蛋白質予以免疫之。對照組猴U65)依據相同之程續，被免疫以15〇Mg 之不相關的重組型蛋白質。利用EL IS A使用得自於腦膜炎奈瑟氏球鐘舖株608B (B :2a: P 1.2)之外膜製品作為塗覆抗原，來分析具專一性的體液性反應之發展。第15圖圖示出本發明之合成胜肽及其等在腦膜炎奈瑟氏球_菌株608B (B:2a:P1.2)之22 kDa蛋白質的全長内之各別位置。第16圖俗為質體PMP2204之圖譜，該質體含有編碼該腦膜炎奈瑟氏球菌之22 kDa表面蛋白的基因；Anipf，安比西林抗性編碼區域；ColEl，複製之起點；CI857，噬菌體λ cI857溫度-敏感的抑制子基因。λ PL，噬菌體λ轉錄啓動子；Τ1轉錄終止子。轉錄之方向係以箭號表示。Bgl I 與BamHl俗為被用於位在p629質體内的22 kDa基因之插入的限制址。發明的詳細説明在我們研究腦膜炎奈瑟氏球菌外膜的超微結構時的當中，我們確認一 22 kDa新的低分子量的蛋白質，其有一非常獨一的特性。此外膜蛋白對於蛋白質分解酵素之大量處本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14 - —4—, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --1 . 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/2) 理（如蛋白酶 K，一源自黴菌 Tr i t f rach i um albuHL limber 的絲氨酸蛋白酶）具有高度抗性。這是非常令人驚訝的’ 因為是由於蛋白質分解酵素的效能，廣大的最適宜的pH值範圍與低胜肽鍵的專一性，使得抗蛋白酶K的蛋白質在自然界中非常稀少。[Barretl, A.J. and N.D· Rawlings， Biochem. Son. Transactions (1991), 19:707-715]只有一些報導已描述原核生物來源之蛋白質能對抗蛋白酶K之酵素分解。抗蛋白酶Κ的蛋白質已被發現存在於鉤端螺旋體屬物種（Leptospira) [Nicholson, V*M. and J.F, Prescott, Veterinary Microbiol. (19 9 3) , 3_£_: 1 23-138] 黴漿菌物種[Butler, G.H. et al · Infec. InuuilL^ (1991) 5 9 »1037-1042] ， Spiroplasma m i r u m [ B a s t i a n, F.0 i et a 1 . , J . Clin. Microbiol. (1 9 8 7 ) , 2 4 3 0 - 2 4 3 1 ]以及病毒與蛋白質顆粒體（pr ions) [Onodera , Τ·， et a 1 ., Microbiol. Ttnmunol· (1993) 3_L: 311-316； Prusiner, S.B.，et al·, Proc^Nat. Acad. Sci, US/L (19 9 3) , 2793-2797]。在此，我們描述使用這蛋白質做為改進預防，治療及撿驗腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法° 因此，根據本發明的一方向，我們提供一種高度守恆的、免疫學上易接近的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白以及片段、類似物與衍生物。在此所使用的“腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白”指的是由一自然界發生的腦膜炎奈瑟氏球菌基因所編碼出的任何腦膜炎奈瑟氏球《表面蛋白。根據本發明而言的腦膜炎奈瑟氏球_蛋白質可能是來自自然的來源本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 15 —--«---»------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/3) 或可能是經由分子生物學的應用以産生一重組型蛋白質或片段為目的而獲得的。在此所使用的“高度守恆的”指腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白質的基因與其本身的蛋白質存在於50¾以上己知的腦膜炎奈瑟氏球菌謹株中。較佳的是該基因與其蛋白質存在於99¾以上已知的腦膜炎奈瑟氏球_菌株。實施例2與4 陳述方法，藉此方法習知技藝者能夠測試許多不同的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白以決定他們是否為高度守恆的。在此所使用的“免疫學上可接近的”指腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白呈現在微生物的表面而且抗可為抗體接近。實施例2陳述方法，藉此方法習知技藝者能夠測試許多不同的腦膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白以決定他們是否為“免疫學上可接近的”。免疫學的可接近性可以由其它方法決定，包括凝集試驗、ELISA、RIA、免疫沾移分析、墨點酵素分析、表面可接近性分析、電子顯微鏡法或這些分析的組合。在此所使用的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的“片段” 包括含有至少一個胜肽抗原決定部位的多胜肽或類似物與衍生物。這類型的胜肽可能經由分子生物學的應用或利用傳統的液體或固相胜肽合成技術獲得之。在此所使用的腦膜炎奈瑟氏球«表面蛋白的“類似物 ”包括那些蛋白質或其片段。在此於自然發生的序列中之一或多個胺基酸殘基由其它的胺基酸殘基所取代，假設這蛋白質整體功能與防禦的待質尚保存著。這樣的類似物可本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 16 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（/名）以被合成製造出來或經由重組型DNA技術製造，例如一自然發生的腦膜炎奈瑟氏表面蛋白的突變。這樣的方法在習知技藝中是相當熟知的ϋ 例如，這樣一種類似物#擇自於可生産自於，如第1 〇圖所描述的，有關於源自於腦膜炎奈瑟氏球菌菌株b2之22 kDa蛋白質的基因之重組型蛋白質。另一類似物可以得自於有關於Neisseria 1 a c t a m i c a的對應基因之分離物。在此所使用的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的“衍生物 ”是一蛋白質或片段其已被共價修飾過了，（例如以二硝基苯酚修飾）以便使之在人體内能産生免疫性。本發明的衍生物亦包括本發明的胺基酸類似物之衍生物。可以瞭解得到，藉由以下本發明的實施例，一熟習此藝者在毋需經過過多不當的實驗下，即可判定一特定的片段、類似物或衍生物是否可供用於腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的撿驗、預防或治療。本發明亦包括腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白、片段類似物與衍生物之聚合物形式。這些聚合物形式包括’例如’ 已被交聯劑（諸如抗生物素/生物素、戊二醛或二甲基辛二亞胺酸）所交聯之一或多個多胜肽。該等聚合物形式亦包括含有兩個或多個以口串聯的或翻[轉之緊鄰的腦膜炎奈瑟氏球菌序列的多胜肽，此傺從藉由重組型DNA技術而生成的多作用子mRNA而産生的。本發明提供實質上純的腦膜炎奈瑟氏球Μ表面蛋白° “實質上純的” 一詞表示根據本發明得到的腦膜炎奈瑟氏本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） Γ—1--.---碰丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?! 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/孓）球菌蛋白是不摻雜其腦膜炎奈瑟氏球菌的其它蛋白質。實質上純的腦膜炎奈瑟氏球顏表面蛋白的製品可由許多傳純的方法獲得，例如在實施例3與11中所描述方法。更進一步，本發明特別提供具有第1圔之胺基酸序列 (序列辨識編號：2)的腦膜炎奈瑟氏球菌22· kDa表面蛋白，或其一片段、類似物或衍生物。再一方面，本發明待別提供腦膜炎奈瑟氏球鍾之一種 22 kDa表面蛋白，該蛋白質具有第8圖所示之胺基酸序列 (序列辨識編號：4)，第9圖所示之胺基酸序列（序列辨識編號：2)或其等之一片段、類似物或衍生物。該一片段可擇自於第15圖中所列出的胜肽（序列辨識編號：9至序列辨識編號：26)。又一方面，本發明提供腦膜炎奈瑟氏球菌之一 22 kDa 表面蛋白，該蛋白質具有第10圖所示之胺基酸序列（序列辨識編號：8)，或其之一片段、類似物或衍生物。由前述明顯可知，任何針對腦膜炎奈瑟氏球菌的22 kDa蛋白質之引述亦會涵括從奈瑟氏球菌屬之其他物種[諸如淋病奈瑟氏球鋪（N ^ i s e r i a gonorrhoeae)或 Neisseria 1 a c t a m i ca ] 所分離出的22 kDa蛋白質或由該等物種所分離出的基因所産生之22 kDa蛋白質。一根據本發明之腦膜炎奈瑟氏球鍾的22 kDa表面蛋白質，可進一步以一種或一種以上的下列特徵來確認： ⑴在SDS-PAGE凝膠上評估，其具有一約為22 kDa的分子量；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）；-------------衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7__ 五、發明説明（/ό) ⑵其在SDS-PAGE凝膠上的電泳遷移率，不會受到還原試劑處理之修飾； ⑶其等電點（pi)的範圍在ρΐ δ至pI 10之間； ⑷其對諸如α -胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K之蛋白質分解酵素的降降分解具高度抗性； (5)過碘酸鹽的氧化作用不會廢除抗體直接對抗腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的專一性結合； ⑹其為一高度守恆的抗原； ⑺其在完整的腦膜炎奈瑟氏球菌生物髏之表面上為抗體易接近的； ⑻其可以誘發殺菌性抗體的生成·， ⑼其可以誘發會對抗實驗性感染的抗體之生成； ⑽當被注射入一動物宿主體内時，其能誘發一對抗腦膜炎奈瑟氏球菌的感染之免疫反應的發展。本發明亦首先提供一種編碼一有關於腦膜炎奈瑟氏球菌的22 kDa表面蛋白之DNA序列（序列辨識編號：1、編號：3 、編號·· 5以及編號：7)。本發明之較佳的DNA序列偽擇自於下列群中： (a) 第1圖的DNA序列（序列辨識編號：1); (b) 第8圖的DNA序列（序列辨識編號：3); (c) 第9圖的DNA序列（序列辨識編號：5); (d) 第10圔的DNA序列（序列辨識編號：7); (e) 前述的DNA序列的類似物或衍生物； (f) 前述DNA序列之任一者的簡併性DNA序列；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） T----------^-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/7) (g)前述DNA序列之任一者的片段；其中該等序列編碼一會展現出腦膜炎奈瑟氏球菌的22 k D a表面蛋白之免疫活性之産物。該等片段較佳為如第15圖中所描述的胜肽（序列辨識編號：9至序列辨識編號：26)。較佳地，本發明亦是第一次提供一個編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22k Da表面蛋白的DN A序列（序列辨識編號：1)。本發明之更佳的DNA序列是擇自於下列所組成之群中： U)第1圖的DNA序列（序列辨識編號：1) (b) 前述的DNA序列之類似物或衍生物； (c) 前述DNA序列之簡併性DNA序列； (d) 前述DNA序列之任一者的片段；其中該序列編碼一會展示腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的免疫活性之産物。腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白編碼基因的類似物及衍生物在實施例4中描述的條件下，可與22 kDa表面蛋編碼基因雜交。為了本發明的目的，當腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的片段、類似物及衍生物被注射至一動物宿主體内時，如果其能誘發一免疫反應的發展以防禦腦膜炎奈瑟氏球菌的感染，就具有腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的免疫能力。一個具備習知技藝的人，可藉由在下列實施例6 中所述的方法來決定，一特定的DNA序列是否編碼一會展示腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的免疫能力之産物。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -·--Γ--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 A7 B7__ 五、發明説明（AP) 本發明中的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，可藉由包含下列步驟的方法予以分離出： (a)分離腦膜炎奈瑟氏球_細菌之一培養物； (b )分離出細菌培養物的外膜部分；以及 (c)從該外膜部分分離出該抗原。待別是，前述的步驟（b )可含有以蛋白酶K來處理腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白萃取物，再以諸如離子交換與凝膠層析與電泳法傳統的分離技術來作蛋白質部分分離的額外步驟。任擇地且較佳地，本發明的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白質可藉由使用分子生物學的技術來製造，特別是描述在此處的實施例3中者。使用分子生物學的技術持別地適合於製備實質上純質的重組型腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，根據本發明的進一步方面，我們提供一方法以産生重組型腦膜炎奈瑟氏球_ 22 kDa表面蛋白，包括其片段、類似物與衍生物。該方法包括下列步驟：⑴培養一為一重組型DNA分子所轉形的單一細胞宿主微生物，該重組型DN A分子包括一編碼該蛋白質、片段、類似物或衍生物之DNA序列以及一個或多個被可操作地連接至該DNA序列之表現調節序列，以及⑵回收一實質上純質的蛋白質、片段、類似物或衍生物。在習知技藝中已相當知曉的，為了在宿主中得到一感染基因的高表現量，該基因必須可操作地連接到轉錄用及本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 520375 Α7 Β7 五、發明説明（Π) 轉譯用表現調節序列，這些序列在所選定的表現宿主中是具功能的。較佳地，表現調節序列與感興趣的基因被包含在一表現載體内，該載體更含有一個細菌篩選標記與複製起源。如果表現宿主是一真核細胞，該表現載體更應包括一個在宿主之表現中有作用的表現標記。許多表現宿主/載體的組合可使用在表現本發明的DNA 序列。對真核宿主有用的表現載體包括，例如含有源自SV 40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒與細胞巨化病毒表現調節序列的載體。可供細菌宿主之用的表現載體包括已知的細菌質體，例如源自大腸桿菌的質體（包括col El , pCRl , PBR322, PMB9及其衍生物），宿主範圍較廣的質體（如RP4)，噬菌體 DNAs (例如λ噬菌體的許多衍生物，例如NM989，以及其他的DNΑ噬菌體，如Ml3及絲狀單股DNΑ噬菌體）。對酵母菌細胞有用的表現載體包括2ιπμ質體及其衍生物。對毘蟲細胞有用的載體包括PVL 941。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此外，任何各色各樣的表現調節序列可以使用在這些載體以表現本發明的DNA序列。這種有用的表現調節序列包括與前述表現載體的結構基團結合在一起的表現調節序列。有用的表現調節序列的例子包括，例如，SV40或腺病毒的早與晚啓動子、k条統、trp备統、TAC或TRC条統，入噬_體的主要操縱基因與啓動子的區域，fd外套蛋白的控制區域，3 -磷酸甘油酸激酶或其它糖解酶的啓動子，酸磷酸鹽酵素的啓動子（如P h 〇 5 )，酵母_ α -交配条統的啓動子與其它已知可控制原核與真核細胞或其病毒基因表現本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ：297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 _ 五、發明説明（〆）的序列，以及各種不同的組合。腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa 表面蛋白的表現調節序列特別是使用在大腸桿菌中（實施例3)腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的表現。以前述載體轉形的宿主細胞形成本發明的另一面。各式各樣的單細胞宿主細胞可使用在表現本發明的DNA序列。這些宿主可能包括已知的真核與原核的宿主，如大腸桿菌_種、假單胞菌屬、桿菌屬、鏈黴菌屬、真《、酵母菌、昆蟲細胞（如 Spodoptera frugiperda. S F 9 )、動物細胞 (如CH0及小白鼠細胞）、非洲綠色猴子細胞（如C0S1，C0S7 、BSC1、BSC40與BMT10)，以及被組織培養的人類與植物細胞較佳的宿主微生物包括細_如大腸桿菌與祜草桿_ ，與被組織培養的哺乳類動物細胞。不是所有的載體與表現調節序列可作用均等地表現本發明的DNA序列應該當然地被理解。也不是所有的宿主在相同的表現条統下會作用均等。然而熟習該項技術的人可以在這些載體，表現調節序列及宿主中挑選，而不會有不適當的嘗試且不會偏離本發明的範圍。例如，在挑選一載體時，必須考慮宿主，因為該載體要在宿主内複製。載體的複製數目，控制該複製數目的能力以及由該載體編碼的任何其它蛋白質的表現如抗生素標記，都應該考慮。在挑選一表現調節序列時，許多的因素亦都應該考慮。這些因素包括，例如序列的相對強度，其可控制的能力，以及與本發明DNA序#列的相容性，特別是有關潛在的二次結構。單細胞宿主的挑選應該考慮其與所選擇載體的相本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） H ....... .....Λ- n τι —I - -- Is — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7____ 五、發明説明（1丨）容性，由本發明的DNA序列編碼出的産物的毒性，其分泌的特性，其正確地摺疊蛋白質的能力，其發酵或培養的需求以及從宿主中純化本發明DMA序列所編碼的産物的容易度。在這些參數之中，一熟習此藝者可以挑選不同的載體 /表現控制序列/宿主組合，這些組合在發酵作用中或大量動物培養中會表現出本發明的DNA序列。由本發明的DNA序列編碼出的多胜呔可從發酵或細胞培養物中分離出，而且利用諸多傳統方法之一來純化。熟習該項技藝的人可以挑選最適當的分離及純化技術，而不會偏離本發明的範圍。本發明的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白在有關預防’、治療及撿驗由腦膜炎奈瑟氏球菌感染所引起的疾病上可供作為預防用、治療用及檢驗用組成物。本發明的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白在有關預防、治療及撿驗由淋病奈瑟氏球菌或Neisseria 1 ae tam i ca感染所引起的疾病上可供作為預防用、治療用及撿驗用組成物 Ο 根據本發明的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白是特別地適合有關於對抗腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的抗體之生成以及一保護性反應之發展。根據本發明的腦膜炎奈瑟氏球鋪表面蛋白是特別地適合有關於對抗淋病奈瑟氏球菌或Neisseria lactam 病的抗體之生成以及一保護性反應之發展。本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 __B7__ 五、發明説明（^ ) 特別是，本案提供一具有第1圖（序列辨識編號：2)胺基酸序列的腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白，或其一片段、類似物或衍生物，以供用作為一免疫原及一疫苗。特別是，本案提供一具有第1圖（序列辨識編號：2)、第8圖（序列辨識編號：4)、第9圖（序列辨識編號·· 6)或第1〇圖（序列辨識編號·· 8)之胺基酸序列的腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白，或其一片段、類似物或衍生物，以供用作為一免疫原及一疫苗。標準的免疫學的技術可作用在腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，以便使用它們來作為免疫原及疫苗。特別的是，任何合適的宿主可以注射-藥學上有效量的腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白以産生抗腦膜炎奈瑟氏球菌的單株或多價抗體或以誘發發展抗腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的防禦的免疫反應。注射宿主之前，腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白可配製在一合適的賦形劑内，因此我們提供一藥學上的組成其包括一種或多種的腦膜炎奈瑟氏球菌的表面抗原或片段Q 較佳的是抗原是腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白或片段，類似物或衍生物連同一種或多種藥學上可接受的賦形藥。在此所使用的“藥學上有效量”是指一定量的一種或多種的腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原或片段，能誘發一足夠的抗腦膜炎奈瑟氏球菌抗體的效價以治療或預防腦膜炎奈瑟氏球菌的感染。本發明的腦膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白亦可形成檢驗測試腦膜炎奈瑟氏球菌感染的基礎°很多的撿驗方法是可本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（〇 ) 能的。例如，本發明提供方法以偵測一含有或疑似含有腦膜炎奈瑟氏球鍵抗原的生物樣本中的腦膜炎奈瑟氏球菌抗原。該方法包括： (a) 從病人身上分離出一生物樣本， (b) 將該生物樣本與一對抗腦膜炎奈瑟氏球鋪22 kDa表面蛋白的抗體一起培育以形成一混合物，以及 (c) 偵測位在該混合物内之專一性結合的抗體或片段，這顯示出腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的存在。在前述的檢驗方法中較佳的抗體是Me-Ι及Me-7。任擇地，本發明提供一方法以偵測含有或疑似含該抗體的生物樣本中專一於腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的抗體，該方法包括： (a) 從病人身上分離一生物樣本， (b) 將該生物樣本與本發明的抗腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白或其片段一起培育以形成一混合物，以及 (c) 偵測位在該混合物内之專一性結合的抗原或片段，這顯示對腦膜炎奈瑟氏球菌抗原具專一性的抗體之存在。熟習於該項技藝的人將認知到這撿驗測試有很多形式，包括一免疫學的測試[如酵素聯結的免疫吸附分析法（ELISA) 放射免疫分析或一乳膠凝集試驗]，對於決定對該蛋白具專一性的抗體是否存在於一生物體内，是必要的。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、言 520375 A7 B7 五、發明説明（vf ) 本發明的DMA序列亦可供用於設計作為偵測一被懷疑含有腦膜炎奈瑟氏球菌之生物樣本中所存在的腦膜炎奈瑟氏球_之核苷酸的DNA探針。本發明之方法包括如下步驟： (a) 從一病人體内分離出生物樣品； (b) 以一具有本發明之一DNA序列的DNA探針來培育該生物樣品俾以形成一混合物；以及 (c) 測定該混合物中被專一®地結合之DNA，這表示存在有奈瑟氏球_細_。較佳的DNA探針具有第1圖（序列辨識編號：1)、第8圖 (序列辨識編號：3)、第9圖（序列辨識編號：5)或第10圖（序列辨識編號：7)之鹼基對序列，或第11圖（序列辨識編號：9) 之守恆序列。一更佳的DNA探針具有第1圖（序列辨識編號：1)之525 個鹼基對序列。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 本發明之DN A探針亦可供用於偵測一樣品内之循環性腦膜炎奈瑟氏球菌核酸，例如使用一聚合酶鏈反應，以作為偵測腦膜炎奈瑟氏球«感染的方法。該探針可利用傳統的技術來合成而且可被固定一固相上或以一可偵測的檫記來標記該探針。有關此一應用之較佳的DN A探針是一寡聚物，其具有與第1圖（序列辨識編號：1)、第8圖（序列辨識編號：3)、第 9圖（序列辨識編號：5)或第10圖（序列辨識編號：7)之腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白基因，或第11圖（序列辨識本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 3 20 5 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7 五、發明説明（〇編號：9 )之守恆序列，的至少約6個連續的核苷酸相互補之序列。有關此一應用之一更佳的DNΑ探針是一寡聚物，其具有與第1圖（序列辨識編號：1)之腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa 表面蛋白基因的至少約6個連續的核苷酸相互補之序列。偵測病人體内的腦膜炎奈瑟氏球_的其它偵測方法包括步驟： (a) 以一可偵測的標記來標識本發明的一抗體或片段 (b) 將該經標識的抗體或片段投藥至一病人，以及 (c) 偵測該病人體内專一性結合的經標識之抗體或Η 段，這顯示腦膜炎奈瑟氏球菌的存在。為純化任何的抗腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的抗'體，可使用由一被固定的腦膜炎奈瑟氏球®表面蛋白以作為親和力基質所製成的親和層析法來純化之。因此根據本發明的另一面，本案提供一被共價地結合至一不溶性支撑物上之腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白或其部分或一類似物，該表面蛋白之胺基酸序列含有第1圖（序列辨識編號：2)、第8圖（序列辨識編號：3)、第9圖（序列辨識編號：5)或第10圖（序列辨識編號：8)之序列。因此根據本發明之一較佳的方面，本案提供一被共價地結合至一不溶性支撑物上之腦膜炎奈瑟氏球_表面蛋白或其部分或一類似物，該表面蛋白之胺基酸序列含有第1 圖（序列辨識編號：2)之序列。本發明的進一步特徵是使用本發明的腦膜炎奈瑟氏球本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) •裝- 訂五、發明説明（乂）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 0表面蛋白作為免疫原，以製造專一抗體來供撿驗，待別是以治療腦膜炎奈瑟氏球菌的感染。利用適當的篩選方法可以決定合適的抗體，例如在一測試的模型申測量一特別的抗體被動地防禦腦膜炎奈瑟氏球菌感染的能力。動物模型的一値例子是小白鼠模型，其描述在此處的實施例中。抗體可以是整個的抗體或一抗原結合的片段而且通常屬於任何的免疫球蛋白類。抗體或片段可以是動物的來源，特別是哺乳動物的來源而且更專一的是鼠類、大白鼠或人類的來源。抗體可以是一自然的抗體或一片段，或者如果需要’可以是一重組型的抗體或抗體片段。重組型抗體或抗體片段指的是利用分子生物學的技術産生的抗體或抗體片段。該抗體或抗體片段可以是多株的或較佳的是單株的來源。該抗體可以是專一於與腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白有關的許多抗原決定部位，但較佳的是專一於一個抗原決定位。較佳地，該抗體或片段專一於與腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白有關的一或多個抗原決定部位。亦較佳的是在此所描述的單株抗體Me-Ι與Me-7。窨旆例為了使本發明可以容易地被瞭解，陳述下列的實施例。這些實施例是只有例式的目的而且將不以任何的方式來被解釋為限制本發明的範圍。實施例1描述以蛋白質分解酵素處理腦膜炎奈瑟氏球菌外膜製品與隨後的腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的確認。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

29 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 實施例2描述專一於腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的單株抗體的配製。實施例3描述腦膜炎奈瑟氏球菌重組型22 kDa表面蛋白的配製。實施例4描述利用DNA探針來確認表現腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的微生物。實施例5描述利用一抗腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的單株抗體來保護小白鼠免於受腦膜炎奈瑟氏球菌的感染。實施例6描述利用經純化的重組型22 kDa表面蛋白來誘發一對抗腦膜炎奈瑟氏球菌感染之保護性反應。 ' 實施例7描述有關於腦膜炎奈瑟氏球菌之其他的菌株 (MCH88以及Z2063)與淋病奈瑟氏球菌之一菌株的22 kDa蛋白和蛋白質-編碼基因的序列之鑑定。實施例8描述兔子與猴對腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白 22 kDa之免疫反應。實施例9描述被用來標圖出腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白22 kDa之不同的免疫學性抗原決定位之方法。實施例10描述藉由加熱來誘發一表現載體俾以供該22 kDa表面蛋白之大規模生産。實施例11描述當該22 kDa表面蛋白藉由重組DNA技術被生成時，一用於純化該22 kDa表面蛋白之方法。實施例12描述該22 kDa表面蛋白作為一個人類疫苗之用途。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（β ) 實施—11 :'以蛋白水解酵素予以處理的腦膜炎奈瑟氏球菌外膜製品以及隨後的一種抗酵素的腦膜炎奈瑟氐球蘭2 2 k D a砉而蛋白夕鑑宏_ 許多源自於整個細胞，氛化鋰或N -月桂醯胺氨酸萃取物被使用作為研究腦膜炎奈瑟氏球舖外細胞的超微結構。革蘭氏陰性細鐘的外膜作為環境與細胞内部的一交接面而且含有大部份的抗原其自由地暴露在宿主的免疫防禦条統。本研究的主要目的是確認新的抗原其能誘發一抗腦膜炎奈瑟氏球菌的防禦性反應。被本發明者確認這樣的抗原的一個方法是以蛋白質分解酵素部份地分裂上述的抗原製品。由酵素處理所産生的抗原決定區再以隨後的免疫學的分析與這些處理過的抗原製品的防禦特性來確認。令我們驚訝的/我們觀察到腦膜炎奈瑟氏球菌氯化鋰外膜萃取物經電泳鑑別後，一低分子量帶，其經庫馬西亮藍（Coomassie Birlliant Blue)R-250染色，沒有受到蛋白質分解酵素處理的破壞。庫馬西藍是被使用來染蛋白質與胜肽的對多糖或脂類的親和性極低或沒有親和性。多糖或脂亦是外膜主要的成份。這低分子量抗被染上庫馬西藍的事實暗示至少部份的低分子量是由聚胜肽組成的而該聚胜肽沒有被蛋白質分解酵素分解，或者是該聚胜肽被其它表面結構保護而免於該酵素的作用。再者，如下面所證明的’非常有效的酵素蛋白酶K不會分解這低分子量抗原，甚至經過大量處理後。氯化鋰萃取物被使用作為從不同的腦膜炎奈瑟氏球鐘本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 31 HJm 0 —11 111^- - - 1 · - - 1-1 - - --- I IP (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ________B7____ 五、發明説明（巧） &勺S株來獲得外膜製品而且以本發明者先前描述的方法來貝行。[Brodeur et al,, Infect. I m m u η . · 5 0, p. 510 (1985)]。這些製品的蛋白質内容物利用適合於細胞膜部分的羅瑞方法（Lowry method)來確定[Lowry et al·, JL· BdoJ , XiLeiu., 193, p. 265 (1951 )]。源自於腦膜炎奈瑟氏球菌菌株608B(B:2a:P1.2)的外膜製品處理以37°C，24 小時而且與源自牛胰臓（E.C, 3.4.21.1)(SigmaW9a·^ 凝乳蛋白酶或源自於牛胰臓（E,C. 3.4.21.4) (Sigma)的胰蛋白酶第1型一起連續振盪。酵素的濃度調整在每mg的要被處理的蛋白質含有2mg的酵素。相同的外膜製品亦以源自於 Tr i t i r a (- h i π m album limber 的不同濃度（0.5-24mg/mg 蛋白質）之蛋白酶K (Sigma或 Boehringer Mannheim, Laval， Canada) (E. C. 3.4.21 . 14)處理。為了促進蛋白質被蛋白酶 K分解，使用不同的實驗條件。樣本於37 °C或56 °C下，振鹽或不振邊下培育1小時、2小時、2 4小時或4 8小時。混合物樣本的pH調整在pH7.2或ρΗ9.0)。1%(ν/ν)的SDS亦加進某樣本中。樣本處理後，緊接著以SDS-PAGE凝膠電泳來分析。SDS-PAGE凝膠電泳傺利用 MiniProteanll™ (Bio-Rad, Hississauga，Ontario, Canada)的条統使用 14¾ (wt/vol) 的凝膠用法根據製造商之指示。蛋白質在2-巯基乙醇與SDS 下，於100 °C加熱5分鐘，於14¾ SDS凝分離並以庫馬西亮藍R-250染色。第2圖表示源自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株608B (B :2a :P1.2) 的外膜製品中的蛋白質於37 °C以α -胰凝乳蛋白酶與胰蛋本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 _B7_ 五、發明説明（，）白酶處理24小時後，該蛋白質在14%SDS-PAGE凝膠上的移動圖。比較處理過的樣本（第2圖，第3與第4行）與未經處理的控制組（第2圖，第2行），可以觀察到處理過的樣本其高分子量蛋白質與許多主要的外膜蛋白質大量地被蛋白質分解酵素分解。反之，一為22 kDa之表觀分子量的蛋白質帶，即使24小時與蛋白質分解酵素接觸，其不受影響° 這獨特的蛋白質以蛋白酶K用更具效力的蛋白質分解酵素處理來做進一步的研究（第3圖）°蛋白酶κ是最強的蛋白質分解酵素之一，因為它胜肽鍵結的專一性低及具寬廣的合適的pH。令人驚訝的’該22 kDa蛋白質對2 IU的蛋白酶K於56 °C下處理24小時，具抗性^這種處理在我們的實驗室裡，常常用來製造脂多糖或DNA ’它們幾乎沒有蛋白質。實在的，在這樣具效力的蛋白質分解酵素處理外膜製品之後，只有小的聚胜肽可以被看見。再者’再長時間的處理，長達48小時，或高一點的酵素濃度（高達24 ΠΓ) 不會改變22 kDa蛋白質的量ϋ當反應混合物的pH增加至pH 9.0或加入1.0¾的SDS (—強力的蛋白質變性劑）’該22 kDa 蛋白質在SDS-PAGE凝膠上的量與移動沒有受到影響。（第3 圔，第4、6與8行）。這兩種變性的條件合併使用，正常情形會導致存在於外膜製品的蛋白質完全分解，只留下胺基酸殘基。低分子量的聚胜肽在分解液中常常會被觀察到，而且被以為是敏感的蛋白質的片段，其在酵素的處理過程中沒有被有效地分解。這些片段大部份受到存在於外膜的磺水化合物與脂類的保護，而免於受到進一步的遞降分解本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（^/ ) 。存在於處理過的樣本中，具28 kDa與34 kDa之表觀分子量的蛋白質帶，各別是殘留的酵素與存在於所有酵素製品測試的一污染的蛋白質。有趣地，這値有關於22 kDa蛋白質對蛋白酶的抗性之研究顯示出，另一個帶有表觀分子量為18 kDa分子量的蛋白質帶似乎亦對酵素分解作用具有抗性（第3a圖）。當分析親和力純化的重組型22 kDa蛋白質在SDS-PAGE上之移動圖形時，得到有關於此18 kDa蛋白質之解答（第3b圖）。僅有在該親和力純化的重組型22 kDa蛋白質被施加至凝膠上之前，於含有清潔劑SDS之樣品緩衝液内被加熱達一延長的時間後，該18 kDa蛋白質帶才會變得明顯。使用Edinan分解之N-端胺基酸分析（實施例3 )清楚地建立：於該18' kDa 蛋白質帶上所鑑定出的胺基酸殘基（E-G-A-S-G-F-Y-V-Q) 對應於第1至9個胺基酸（序列辨識編號：1)。這些結果顯示出，於SDS-PAGE上所看到的18 kDa與22 kDa蛋白質帶事實上衍生自相同的蛋白質。這最後的結果亦顯示，引導序列從成熟的18 kDa蛋白質被切除掉。進一步的研究會被進行，俾以鑑定能解釋此表分子量之漂移的分子修飾以及評估其對該蛋白質的抗原性與保護性質之衝擊。總結地，帶有非常少見的對蛋白質分解酵素的分解具抗性特性的腦膜炎奈瑟氏球«外細胞蛋白的發現，肯定了對其分子的與免疫學的特性做進一步研究的必要。由實施例3的大腸桿菌産生的純化的重組型22 kDa表面蛋白亦對蛋白酶K的分解具高度抗性。我們目前正嚐試去瞭解賦予本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 34 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 、V5. 520375 A7 B7 五、發明説明（只）腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白對蛋白質分解酵素不尋常的抗性的機制。复I例又:對22 kDa腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白具專一性的虽ft杭體^生成_ 此處所述之單株抗體僳得自於3値不同的融合實驗。以得自於分別被區分為血清群A、B與C之腦膜炎奈瑟氏球菌菌株604A、608B與2241C的外膜製品來免疫雌性Balb/c 小白鼠(Charles River Laboratory, St-Constant, 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Quebec, Canada)。被用於獲得此等外膜製品之氯化鋰萃取，係以本案發明人先前所述之一種方式予以進行之 (B r 〇 d e u r e t a 1. , Infect · I mmu n . · 5 0: 510， 1 995) ° 此等製品之蛋白質含量的測定係利用被設計成用於膜分離部分的羅瑞法（Lowry method, Lowry et al., J , Biol. C-h^in. , m_:265, 1951 )。各組之小白鼠於3周之期間内被兩次地腹膜腔内或皮下注射以10mg之如上所述的不同組合之外膜製品。視各組之小白鼠而定，用於免疫之佐劑為弗倫氏（Freund's)完全或不完全佐劑（Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.)或 QuilA (Cedarlane Laborator i es , Hornby, Ont., Canada)。在融合程序之前3天，經免疫的小白鼠接受最後一次的10mg之上述外膜製品之一者的靜脈内注射。被用來生成會分泌出所欲的單株抗體之融合瘤細胞株的融合程序偽如本案發明人先前所述者（Hamel et a 1., J. Med· Microbiol·, 2434 , 1987 )。單株抗體 Me - 1、 Me-2、Me-3、Me-5、Me-6與Me-7之類型、亞型以及輕鐽類 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - Γ 、τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 520375 A7 B7 五、發明説明（β ) 型傜如先前所報導的，利用EL ISΑ予以測定之（Mart in et al . , Cl in· J—L_c—r.obi—ol . · 2A: 1720 , 1990)，並出示於表1中。參照本案發明人先前所述之方法（Martin et al·，Lu.r · J. Immunol . · IS_: 6 0 1 , 1 9 8 8 )，並加以下列修飾，使用西向免疫沾移法來建立本案單株抗體之專一性。在14¾ SDS-PAGE凝膠上解析從不同的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株所獲得之外膜製品。使用一種半乾式裝置（Bio-Rad)將該等蛋白質從凝膠轉移至硝基纖維素膜上。一為60mA/凝膠（6x1 0cm) 之電流被施加至電沾移緩衝液（由25mM Tris-HCl、192πιΜ 甘胺酸以及20¾ (ν/ν)甲醇所構成，pH 8. 3)歷時10分鐘。經濟部中央標準局員工消費合作社印製該等西向免疫沾移法實驗清楚地顯示，本案單株抗體Me-1 、Me-2、Me-3、Me-5、Me-6與Me-7能夠辨識其位在腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDA蛋白質上之專一性抗原決定位（第4A圖）。該等SDS-PAGE凝之分析以及對應的西向免疫沾移物亦顯示出，此蛋白質之表觀分子量在各個菌株之間並無變化。但是，存在於外膜製品内之蛋白質的數量於各菌株互不相同，且與®株之血清群無涉。更甚者，此等單株抗體於該等外膜製品以每毫克的蛋白質使用2 IU的蛋白酶K予以處理（實施例1中所述之處理，如上述）之後，仍能夠辨識其位在腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDA蛋白質上之抗原決定位。令人感興趣地，該等抗原決定位在酵素處理後仍維持完整，因而確證即令其等在膜製備中對於抗體而言傺易於接近的，該等抗原決定位亦不會為酵素處理所破壞。後者之結 36 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（冰）果暗示，其能說明所觀察到的蛋白酶K抗性之機制，與會阻遏該酵素與該蛋白質之接近的表面結構，或者與胞膜對被深深地包埋之蛋白質所提供之保護作用，非常有可能地是無關的。雖然未示於第4圖中，Me - 1之免疫沾移物的結果與其他5種單株抗體之結果是相一致的。進行~"条列的實驗，俾以部分地特徵鑑疋腦膜炎奈瑟氏球_ 22 kDa表面蛋白，以及將之與其他已知的腦膜炎球菌之表面蛋白作區別。當外膜製品在無或加有2 -巯基乙醇之電泳樣品緩衝液内，於100 °C下被加熱5分鐘或於37 °C與 5 6 °C下被加熱30分鐘時，發現到位在腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之SDS-PAGE凝膠上的表觀分子量沒有漂移。這顯示，當存在於外膜内，該22 kDa表面蛋白之移動非為熱或2 -巯基乙醇可改變的。使用高碘酸鈉來偵測本案單株抗體是否會與存在於由腦膜炎奈瑟氏球菌生物體所萃取出的外膜製品内之磺水化物抗原決定位起反應。被用來進行此實驗之方法偽為本案發明人先前所述者（（Martin et al., Infect. Immun., Si:2718-2725, 1992)。在室溫下以ΙΟΟηιΜ的高碘酸納來處理外膜製品不會改變本案單株抗體對該腦膜炎奈瑟氏球_ 22 kDa表面蛋白之反應力。此種處理通常只會廢除對磺水化物具專一性的抗體之結合力。 (由美國華盛頓特區的Walter Reed Army Institute of Research之A· Bhattacharjee博士所提供的）單株抗體 2-1-0纟2對於1丨9蛋白（亦稱為[1.8，一種在所有致病性奈瑟本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 37 II —-I j"]n I —J —II -I I I I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（ΛΠ 氏球菌物種所常見的表面蛋白）具有專一性。此單株抗體對外膜製品的反應力與單株抗體Me-5之反應力作比較。該 1 ip-專一性單株抗體與一具有一表觀分子量為30 kDa的蛋白質帶起反應，而單株抗體M e - 5則與具2 2 k D a的蛋白質帶起反應。此結果清楚地顯不’該腦膜炎奈瑟氏球_ 2 2 k D a 表面蛋白與該1 i P蛋白（另一種高度守恆的外膜蛋白）之間沒有任何關傺。為了確證實22 kDa蛋白在完整的腦膜炎奈瑟氏球菌細菌細胞之表面處的暴露，進行一種如本案發明人先前所述之放射免疫分析法（Proulx et al., Infects Tirimun , , 5 9 : 963, 1991 )。6-小時的以及18-小時的細菌培養物被拿來供此分析之用。令本案6個單株抗體與9種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株（菌株之血清群示於第5圖上之括弧内）、2種Neisseria gonorrhoeae囷株（” M G ”）、2 種 Η o r a x ^1 la catarrhal is 菌株（” M C ”）以及 2 種 Ne_i sser i a lactam ica 蘭株（fT N L ”）起反應。該放射免疫分析法確認了為本案單株抗體所辨識之抗原決定位被暴露於具不同的血清群與血清型之腦膜炎奈瑟氏球菌分離物的表面處，且對於蛋白水解酶而言亦應為易於接近的（第5圖）。本案單株抗體有力地結合至其位在所有經測試的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株之表面上的標的抗原決定位。所記錄之結合值（在3,000至35,000 CPM之間），各菌株之間有所不同，且隨細菌之生理狀態亦會變化。對於每一菌株，使用一種流感嘻血桿菌造孔蛋白（P〇r in)專一性單株抗體作為負對照組。獲得低於500CPM之計數，並接本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —- 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（) 而將之從各個結合值中扣除。對於此試驗中之腦膜炎奈瑟氏球菌_株而言，在第5圖中對單株抗體Me-5與Me-7所示之結果係為使用單株抗體Me-1、Me-2、Me-3與Me-6所得的結果之代表。就其他的測試菌株而言，對單株抗體Me-7所示之結合活性傜為使用會辨識該相同的細菌菌株之其他單株抗體所得之結合活性的代表。為本案單株抗體所辨識之抗原決定位的抗原性守恆亦被評估之。使用一種墨點酵素免疫分析法以供本案單株抗體對許多細菌菌株之快速的篩析。此分析之進行係如本案發明人先前所述者（Lussier et al., J. Immunoa s sax， 11:373，1989)。在此分析中使用一含71種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株之收集。該樣品含有19種血清群A之分離物、23 種血清群B之分離物、13種血清群C之分離物、1種血清群 29E之分離物、6種血清群135之分離物、1種血清群X之分離物、2種血清群Y之分離物、2種血清型Z之分離物以及 4種未被血清分型的分離物（” NS ”）。這些分離物偽得自於 Caribbean Epidemiology Centre, Port of Spain, Trinidad； Childrenrs Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Canada； Department of Saskatchewan Health, Regina, Canada» Laboratoire de Sante Publique fur Molekulare Genetik, Berlin, FRG； Montreal Children Hospital, Montreal, Canada； Victoria General Hospital, Halifax, Canada;以及我們自己的菌株收集品。以下之細菌菌株亦被測試之·· 16種1L gonorrhoeae、4種!L c i nerea、5種 iL 1 actam ig.g,、1 種 Μ_· 本纸痕尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 39 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

520375 A7 B7 五、發明説明（乃） f 1 a va、1 種 1L flavescens 、 3 種 1· mucosa、4 種 R_. peril ava /sicca、4 種 ϋ· perf 1 a va、1 種 1L s, j .oiLa、1 種 IL s.u.b.f. 1 a v a 以及 5 種 Moraxe 11 a catarrhal is、1種 A 1ca1i Renes feaca I is (ATCC 8750)、1 種 C i t r obact er__ freund LKATCC 2080)、1 種 Rdv/arsiel la tarda (ATCC 15947)、1M Enter obacter cloaca (ATCC 23355)、1種 Enterobacter aeros enes (ATCC 13048)、1種大腸 ί旱菌、1種 F 1 a vobacter i um odoratum、1種b型流感嗜血捍菌（Eagan菌株）、1種He—b..S』經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 01 a pneumoniae (ATCC 13883)、1種 Proteus rettger i (AT CC 25932)、1種 Proteus vu 1 garis (ATCC 13315)、1種 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)、1種 Salroonel la t yph i mur i um (ATCC 14028)、1 種 Serrat i. marcescens.( ATC C 8100)、1種 Sh igfil la f 1 exneri (ATCC 12022)、1種 Shigella sonne i (ATCC 9290)。其等像得自於美國類型培養物收集中心或一保存於Laboratory Centre for Disease Control, Ottawa，Canada之收集品。本案單株抗體與最相關的奈瑟氏球® _株之反應力展不於表1中。一單株抗體Me-7辨識出其位在所測試的71種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株之專一性抗原決定位達100%。此單株抗體以及Me-2、Me-3 、Me-5與Me-6亦與某些屬於其它奈瑟氏球_物種之菌株起反應，這顯示其等之專一性抗原決定位亦為其他密切相關的奈瑟氏球菌屬所表現之。除了與1種H_· Lg_g_—t』j_ia.gL菌株有一微弱的反應外，單株抗體Me-1只與腦膜炎奈瑟氏球菌分離物起反應。Me-1進一步以另一由177種腦膜炎奈瑟氏本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/ί ) 球菌分離物所構成之樣品予以測試之，且其能夠正確地鑑定出高於99¾之所有被測試的腦膜炎奈瑟氏球菌分離物。除了表1中所示的奈瑟氏球菌菌株，本案單株抗體不與以上所述之其他細菌物種起反應。總而言之，本案發明人建立了 6種能專一性地與腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白起反應之單株抗體。使用此等單株抗體，我們可以證實其專一性抗原決定位像為：1) 坐落在一存在於腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜内之抗蛋白酶K 的22 kDa蛋白質上，2)在腦膜炎奈瑟氏球菌分離物之間偽為守恆的，3)被暴露在完整的腦膜炎奈瑟氏球菌細胞之表面處且為抗體易於接近的，以及4)此等單株抗體與該腦膜炎奈瑟氏球® 22 kDa表面蛋白之反應力不會為一利用高碘酸鈉之處理所改變，此暗示其等之專一性抗原決定位不是坐落在碳水化物上。雖然我們發現到，當於嚴苛的條件下被加熱時，腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa蛋白質之移動被移向一為18 kDa的表觀分子量，我們觀察到該移動是不為2-魏基乙醇處理所改變的。我們亦證實該腦膜炎奈瑟氏球_ 22 kDa表面蛋白對於 1 ip蛋白（另一種存在於腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜内之低分子量且高度守恆的蛋白質）不具有抗原性相似性。如實施例3中將會展現的，此等單株抗體亦會與在以一含有編碼該腦膜炎奈瑟氏球0 22 kDa表面蛋白之基因的質體PNP2202轉形大腸桿菌菌株BL21 (DE3)之後所生成的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 41 I- n 丨Ϊ---- ---n 丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 A7 7 Β 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（^ ) 經純化的重組型22 kDa表面蛋白起反應 «ill^-N蓉_φίϊ®^出龌掂齑雛奪褰蒯二術 • . .::: % β η ϊ 3 ίΓ ^ U W 1 S % Μ rH O o 搬《 G - m « 〇 r<J (N CN CN «瑱 •ή j3 S tj -S 5 〇〇〇〇〇 in .nn l ::::溢丨:: ! -N !：; :阐 :：:^ !：: ;丨;£ m ::: 丨_ 賴七：纪：:：：·：· «m ：·：細 ::::敗：:： ::::欺： ::::咬：:： ·：：： :；：㈣ 1網: :::: ctnL ::: :::: Dfflf ::: g: • · · 1 ·:. . :ί 剷伽 Η m m m 親S m - σ\ 〇\ VO o rH 卜 s S m 寸 ΓΟ m Γ0 μ n <N (N (N <N CN <N CN <N (N CN CN CN K H rH 〇 H tH τΗ rH jq 一 2 ό U w KD y〇 VO VO vo VD S H n 一 r-i rH tH vH H tH ϋ 3 ro ΓΟ ΓΟ m CO ΓΟ « § CN oq O CN CN CN CN (N m (N Γ0 Oi -ί § σ\ (J\ cr» σ\ Oj 2 ·:·: ΣφΙΠ iS 到 αί CN o D) r—< 2 (¾ Oi o D) n 〇 Ό) 03 οα Ο D) ί-Η 2 tH o D) (XJ CN o T—< H 1 OJ t cn LO .··..「·_ i U> •·_Γ· i (請先閱讀背面之注意事項再驾舄本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 520375 A7 B7 i、發明説明（P) 蔓m腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的分子選殖、某闵夕席列分析、高産銮恙現以及純化 A .分孑潠歹苜依據製造商（Promega Co.，Madison, WI)之建議，從腦膜炎奈瑟氏球_菌株608B (B:2a:P1.2)建立出一 lambda GEM-11基因群DNA存庫。主要地，該608B菌株之基因群DNA 被Sau 3A I部分地消化之，於瓊脂糖凝膠上純化落於9至23 Kb之範圍内的片段，再將之連接至lambdaGEM-11臂之BamHI 址。所形成之重組型噬菌體被甩來感染大腸桿菌0株LE392 (Proniega)，該菌株接而被平面培養於LB瓊膠平面皿上。在使用以下之程序以實施例2之腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa 表面蛋白專一性單株抗體來篩選該存庫後，有19痼陽性_ 斑被鑑定出。將該等平面皿培育於-20 °C下歴時15分鐘俾以使上方瓊膠變硬。在4 °C下溫和地將硝基纖維素濾紙施放至該等平面皿之表面上歷時30分鐘俾以吸收由重組型病毒株所生成之蛋白質。接而如先前所述的（L u s s i e r e t a 1 ·， J. Immunoassay, 10 ·· 373，1989)於 PBS-Tween 0·02% 内清洗該等濾紙並予以免疫沾移之。在擴增及DNA純化之後’ 一個具有一個13Kb插入物且被命名為第8株之病毒株被選來作為次選殖實驗。在以Sac I消化此純株後’得到兩個各為5Kb與8Kb之片段。於瓊脂糖凝膠上純化此等片段並將之連接至低複製數目的質體PWKS30 (Wang and Kushner， Gene. 100 ： 19 5, 1 9 9 1 )之S a c I限制址。參照製造商之建議，藉由電穿透法（Bio-Rad, Mississauga, Ont·，Canada) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) |裝· 太訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（W ) 3 寸σΑ等重通型質拳來轉形大腸桿菌_株j μ 1 〇 9 ( p「〇 ffl e容a ’而所形成的菌落以實施例2之腦膜炎奈瑟氏球_ 22 kDa 表面蛋白專一性單株抗體予以篩選之。只有在該等細菌傺被帶有8Kb插入物之質體所轉形時，才有觀察到陽性菌落。陽性純株之西向沾移法分析（實施例2中有敘述此方法）顯示出’為大腸捍菌所表現之蛋白質傺為完整的，且如同該腦膜炎奈瑟氏球_22 kDa表面蛋白般，在SDS-PAGE上移動。為進一步減小該8Kb插入物之尺寸，以C la I來消化一含有該8Kb片段之純株，而一為2 . 75Kb之片段接而被連接至質體PWKS30之Cla I址。所形成的純株之西向沾移法分析再次清楚地顯示，為大腸桿菌所表現之蛋白質傺為完整的，且如同天然的腦膜炎奈瑟氏球_ 22 kDa表面蛋白般，在SDS-PAGE上移動。在限制分析之後，兩個被命名為PNP2202與PNP2203純株被顯示像各帶有呈相反方向之該2.75Kb插入物，且被選來進行編碼該腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的基因之序列分析° 使用得自於 Pharmacia Biotech Inc· (Pisca-taway, NJ)之”Double Stranded Nested Deletion Kit”，依據製造商之指示，從該二純株建立出一条列的nested刪除株。所形成之經截頭的插入物接而使用一種由A p p 1 i e d Biosystems Inc. (Foster City, CA)所出品之自動化序列分析儀Model 373A，依據製造商之建議，從位在該質體 P WKS30上的Μ1 3前向引子予以序列分析之。 Β ·席邡分析本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（以）在該插入物於兩個方向皆被序列分析後，其核苷酸序列顯示一値由525個核苷酸（包括终止密碼子在内）所構成之開放解讀架構，其編碼一値由174個胺基酸殘基所搆成的蛋白質，該蛋白質具一為18, 000之預測的分子量以及一為9 . 93之ρ I值。該核苷酸序列以及推衍的胺基酸序列出示於第1圖中（（序列辨識編號：1 ;序列辨識編號：2)。為確認所選殖的基因之正確的表現，測定源自於腦膜炎奈瑟氏球菌菌株608之天然的22 kDa蛋白質的端胺基酸序列，俾以與由該核苷酸序列數據所推衍出之胺基酸序列作比較。藉由電泳在一 14¾ SDS-PAGE上解析衍生自腦膜炎奈瑟氏球_菌株60δΒ之外膜蛋白製品，並依據一種先前戸斤述之方法（Sambrook e t al., Molecular Cloning「A La bo r a t o r y Manual* Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)將之轉移至一種聚二氟乙烯（polyvinylidine difluoride))膜（Millipore Products, Bedford, ΜΑ)上。從該凝膠切割出該22 kDA蛋白質帶，並接而使用AppI ied Biosystems Inc. (Foster City, CA)所出品之自動化序列蛋白質分析儀Model 473A，參照製造商之建議，將之引至Edman降解。胺基酸序列E-G-A-S-G-F-Y-V-Q-A相應於該該放解讀架構之胺基酸1至10 (序列辨識編號：2)，這顯示該腦膜炎奈瑟氏球_ 22 kDa表面蛋白具有一個含19値胺基酸之引導胜呔（序列辨識編號·· 2之胺基酸殘基-19至-1)。從已建立的資料庫所作之一查詢證實了先前未曾有人述及本案之腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白（序列辨識本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 45 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 、發明説明（f〉）編號·· 2 )或其基因（序列辨識編號：1)。 C.本案重組型腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之高産率表現以及紳化____ 發展以下之方法俾以使在大腸桿_内表現的本案重組型腦膜炎奈瑟氏球_ 22 kDa表面蛋白之生成與純化增至最高。此方法傺依據此一觀察··由帶有賢體PNP2202的大腸桿菌菌株 BL21 (DE3) (Studier and Hoffer , J . Mo 1 . B i 〇_1 . · 189：1 13. 1986)所生成的該重組型22 kDa表面蛋白被發現可呈一高數量存在於外膜内，但亦可從細胞培養物上澄液中獲得之，且其在該上澄液中是為最豐富的蛋白質。該上澄液因此成為被用於使用親和力色層分析（第6A圖）以純化該重組型22 kDa蛋白質之材料。為了生成一親和力色層分析基質，依據製造商之指示，將（實施例2中所述的）單株抗體Me-2、Me-3與Me-5固箸至 CNBr-活化的Sepharose 4B (Pharmacia Biotech Inc·, Piscatavay, NJ)上 0 為了製備細胞培養物上澄液，將其帶有質體PNP2202 的大腸桿_菌株BL21 (DE3)之一過夜的培養物接種至含有 25/Ug/ml的安比西林（Sigma)之 LB 肉汁（Gibco Laboratories, Grand Island，N.Y.)内，並於37下°0予以攪拌培育歴時4 小時。藉由在4 °C下以10，0 0 0 X g離心兩次將該等細菌細胞從細胞培養培養基移出°在一個〇 · 2 2 μ m的濾膜（M i 1 1 i ρ 〇 r e , Bedfords, MA)上過濾細胞培養物上澄液，其接而使用一値具一分子量截留值為10, 000之超過濾膜（Am icon Co·，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

i % 7 03 2 5 A7 _____ B7 五、發明説明（衫6) 請閱讀背之注意事項再

Bevenly，MA)予以濃縮大約1〇〇倍。為了完全地溶解膜囊泡’對該經濃縮的細胞培養物上澄液加入以Emp丨ger} BB (Calbiochem c〇.，Lajolla, CA)直至一最終濃度為 1%(ν/ν) 。在室溫下培育該上澄液歷時1小時，以含有〇. 05% (v/v) 已1^丨8^88之數公升的1〇111丨彳1>丨3-[1(：1緩衝液（卩}]7.3)予以透析過夜，並於4。<0下以1〇, 〇〇〇予以離心歴時20分鐘。將該抗原製品加入至親和力基質内並於4°C下以恆定的攪拌予以培育過夜。將凝膠漿傾倒至一個色層分析管柱内，並以含有 0.05%(v/v) Empigen BB 之 lOmM Tris-HCl緩衝液（pH 7.3)予以大量地清洗之。接而以配於1〇—1>丨51(：1緩衝液（PH7.3)内之1M LiCl從該管柱中洗提出該重組型22 kDa 蛋白質。以含有0.05¾ Empigen BB之數公升的l〇mM Tris-HC1緩衝液（pH 7. 3)來大量地透析含有該洗提出的蛋白質之溶液。SDS-PAGE凝膠之經庫馬西藍及銀染色的SDS-PAGE 凝膠（Tsai and Frasch，A n a 1 y t i r』丨 B i o c h e m，，1 9 , 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 982 )被用來評估處於該純化方法之各個步驟中的重組型 22 kDa表面蛋白之純度，而其代表性結果展示於第6A圖中。該等凝膠之銀染色清楚地證實本案純化方法生成一種僅帶有一極為少量的大腸桿菌脂多醣之相當純質的重組型22 kDa蛋白質。該經純化的重組型22 kDa表面蛋白對蛋白水解分解之抗性亦被證實，而所得之結果出示於第6B圖中。如實施例 1中所述的，對經純化的重組型22 kDa表面蛋白’使用每毫克的蛋白質加以2mg的α -胰凝乳蛋白和胰蛋白酶以及2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（β) IU的蛋白酶κ，於37 °C下予以處理歴時1小時並加以恆定的攪拌。在任一種此等處理之後，未觀察到蛋白質數量之減少。作為比較，視所選擇的酵素而定，於對照組蛋白質 [在此例傺為牛血清白蛋白（β s A，S i g m a )]觀察到部分或完全的消化。更甚者，較長的處理期間不會造成本案蛋白質之任何的改變。此等較後面之結果證實了經轉形的大腸捍菌細胞可以表現該完整的重組型22 kDa表面蛋白’並且如同於腦膜炎奈瑟氏球菌内所發現的天然蛋白質，此重組型蛋白質對於這3種蛋白水解酶之作用亦為具高度抗性的。此外，未被包埋於大腸桿《之外膜内的該經純化的重組型 22 kDa表面蛋白對於該等蛋白水解酶之作用仍然為具高度抗性的。我們亦證實該等酵素處理對於位在該重組型22 kDa蛋白質上的抗原性性質之作用。如藉由EL IS A與西向沾移法所測定的，實施例2中所述之單株抗體可容易地辨識依據上述方法而被純化的該重組型22 kDa表面蛋白（第6C圖）。更甚者，單株抗體Me-5，以及其他的22 kDa蛋白質專一性單株抗體，對該經純化的重組型22 kDa表面蛋白之反應力，不受任何的酵素處理所影響。因此確證了該該重組型22 kDa蛋白質之抗原性性質似乎類似於對該天然的蛋白質所述者。重要的實驗數據被展示於實施例3中，並可予以歸納如下： 1)獲得了該腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之完整本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） t請先閱尊面之事項再m本百〇燊· 、τ, 520375 A7 __ _B7__ 五、發明説明（作）的核苷酸序列與胺基酸序列； 2) 天然的蛋白質之N-端序列分析確證了腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa基因確實被選殖出； . 3) 此蛋白質先前未曾被敘述過； 4) 要轉形一諸如大腸桿_之宿主並獲得該重組型腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之高産率的表現，是為可能的； 5) 要獲得不含其他的腦膜炎奈瑟氏球菌分子以及幾乎不含由大腸桿0所生成的組份之重组型蛋白質，是為可能的； 6) 該經純化的重組型22 kDa表面蛋白對於蛋白水解酶 (諸如α _胰凝乳蛋白、胰蛋白酶以及蛋白酶K)之作用維持著高度抗性；以及 7) 該重組型22 kDa蛋白質之抗原性性質相當於對天然，的腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白所述者。實施例4 ：編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之基因的分芊守衔袢 _ — 經濟部中央標準局員工消費合作社印製為了證實編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白在腦膜炎奈瑟氏球菌分離物中的分子守恆性，使用一種DNA墨點沾移雜交分析來測試各種不同的腦膜炎奈瑟氏球_以及其他的細菌物種。首先，藉由聚合酶鏈反應法（PCR)來擴增編碼該腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的525鹼基對，於瓊脂糖凝_進行純化，並參照製造商之指示，藉由隨機起引（r a n d 〇 m p r i m i n g )，使用無放射活性的D IG D N A標識本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7 五、發明説明（巧）以及偵測糸統 Boehringer Mannheim, Laval, Canada)將其標識之。依據製造商之指示（Boehringer Mannheim)來進行DNA 墨點沾移分析。主要地，將要處理的細菌細胞點墨至一為正電荷的尼龍膜（B 〇 e h r i n g e r M a n n h e i m)上，予以乾燥並接而如DIG System's user’s Guide for Colony Lifts 中所述的予以處理之。在42 °C下使用含有50%甲醯胺（Sigma) 之溶液來進行預雜交以及雜交。該預雜交溶液亦含有1 00 ug/ml之經變性的緋魚精子DMA (Boehringer Mannheim)以作為一額外的阻遏劑，俾防止DNA探針之非專一性的雜交。亦如該DIG Systems user’s Guide中所述的，進行嚴苛性清洗以及使用化學發光的發光原PPD基質之偵測步驟〇對於所測試的71種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株’使用單株抗體Me-7以及該525鹼基對DNA探針所得之結果傺呈完美相符的。依據該等結果，所有經測試的腦膜炎奈瑟氏球菌麵株由於其全部都為該單株抗體所辨識，其等皆具有該腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白基因，且其等會表現該蛋白質，因而確證了此蛋白質在腦膜炎奈瑟氏球菌分離物中是為高度守恆的（表2)。該DNA探針亦會偵測編碼位於所有經測試的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株内之腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的基因。相對地，單株抗體Me-7僅與16種所測試的腦膜炎奈瑟本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) —裝· 木訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 __五、發明説明（4 ) 氏球__株中之2者起反應，這顯示位在腦膜炎奈瑟氏球菌菌株内的該專一性抗原決定位不知怎麼地變成不存在的、不易接近的或被改變的，或者即令大多數的腦膜炎奈瑟氏球a _株於其基因群内具有該編碼序列亦不會表現該蛋白質（表2)。該2種偵測方法間之一良好的相關性亦於H e„ls^_eiLia lactamica 上觀察到，因為只有一個 Neisseria— l...a.c_tani i.c.a 菌株被發現具有該基因但不會表現該蛋白質（表2)。此結果亦可以上面段落所展示之原因予以解釋之。這可能顯示，雖然該22 kDa未被基因表現，或在腦膜炎奈瑟氏球菌菌株之表面上不是可接近的，淋病奈瑟氏球菌與Η ^ 1 s 0 r i a 1 a c t a m i c aM株之2 2 k D a蛋白質-編碼基因可被用於構建用來生産該22 kDa表面蛋白或類似物之重組型質體。所有該等蛋白質或類似物可被用於奈瑟氏球菌感染之預防、偵測或檢驗。甚言之，該等感染可擇自於由腦膜炎奈瑟氏球Μ、淋病奈瑟氏球菌與Neisaer-La. La-Ctamica 所引起之感染。因此，該22 kDa表面蛋白或類似物可被用於製造一對抗該等感染之疫苗。更甚者，該22 kDa表面蛋白或類似物可被用於製造一用來偵測或檢驗該等感染之檢驗套組。使用Μ 〇 r a y ^ 1 la catarrhalisiM株所得之結果顯7Π出在所測試的5種菌株中，有3種會與單株抗體Me-7起反應，但無一者與該DNA探針起反應，這顯示編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白的基因不存在於這些菌株之基因群内 (請先閱讀背面之注意事項 --裝再 π本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 OX 297公釐） 51 520375

A B 五、發明説明) (表 2) ° 數種其他的腦膜炎奈瑟氏球鐘物種以及其他的細菌物種（參照表2之註腳）被測試’而其等無一者被發現對該二測試之任一者俗為陽性反應的°此後面之結果似乎在顯示有關於該22 kDa表面蛋白的基因彳堇為奈瑟氏球中密切相關的物種所共有ϋ 表2.本案525鹼基對DNA探針以及單株抗體Me-7對各種不同的奈琵庄球蘭物種之反應力_ 被鑑定的菌株數目奈瑟氏球菌物種 (被測試的菌株數目）1 單株抗體Me-7 DNA探針腦膜炎奈瑟氏球菌（71) 71 71 Moraxella catharallis (5) 3 0 淋病奈瑟氏球菌（16) 2 16 Neisseria 1 a c t a m i c a (5) 4 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以下之奈瑟氏球菌物種以及其他的細菌物種亦以該二分析予以測試之並且得到陰性反應結果：1種M_· oloerea、1種N.f lava、1種i. f 1 avescens、2種 H_· mucosa、4¾ L· per f I a va/^ ? 、1 種【· perf 1 a va 、1 種 H_· sicca、1 種 1L subf 1 ava、1 種 A—lcaligenM f eaca 1 i s (ATCC 87 、1 種 Bordete 1 1 a pertussis (9430)、lSBordfitpl bronchis；ppf.ip^、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520375 A7 B7 五、發明説明 1種 ditrobacter f reund i i (ATCC 2080)、1種 Edwarsie11 a tarda (ATCC 、l^Entftrohantfir cloaca (ATCC 23355)、l^Entfirobacter aerogene 15947) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (ATCC 13048)、1種大腸桿菌、1種 F 1 a vobacter i um odor a turn、1 種 b型流喃血捍菌（Eagan 菌株）、1 種 K1 e_b_s i e la_ Pneumoniae (ATCC 13883)、1種 E r e 11 r e r i (ATCC 25932)、1種 Proteus vulgaris (ATCC 13315)、1種 Pse aeruginosa (ATCC 9027)、iMSalmonella ty ph i mur i um (ATCC 14028)、 Serrat i marcfiscens (ATCC 8100)、IS Shigella f1fixner i (ATCC 1202 1M Shigella sonne i (ATCC 9290)以及 1種 Xanthomonas ma]t〇phila 0 總而言之，該DNA雜交分析清楚地顯示，編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之基因在4致病性奈瑟氏球菌中傺為高度守恆的。更甚者，所得之結果清楚地顯示出，此 DN A探針可變成供用於位於臨床檢體内的致病性奈瑟氏球 _之快速且直接的偵測之一有價值的工具。此探針甚而可被改善俾供用於區分腦膜炎奈瑟氏球菌以及淋病奈瑟氏球菌° 實施例5 ：本案菫株抗騁的溶蘭袢以及保講桦桦暫依據一種先前所述之方法（Brodeur et al., I n f e c ·— Immun, · 5 0 ： 510, 1985； Martin et al., Inf ec. T m mu n ,, ^:2718, 1992)，於活體外評估經純化的腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白專一性單株抗體之溶菌性性質。在一種天竺鼠血清補體之存在下，經純化的單株抗體Me-1與Me-7 有效地殺死腦膜炎奈瑟氏球菌菌株608B。極低濃度的各個此等單株抗體會減少50%以上之存活的細_之數目◦較高 ^請先^:讀^^之；堂思事項再填寫本頁)

訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2.10X297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（d ) 濃度之經純化的單株抗體Me-1與Me-7之應用造成細_菌落形成單位數目之一激烈的下降(高達99%)。很重要地，此等單株抗體之溶菌性活性像為補體依賴性的，因為該天竺鼠血清於56 °C下予以熱去活性歷時30分鐘後即完全地廢除掉該殺死活性。其他的單株抗體不會對相同的菌株展現顯著的溶菌性活性。數個實驗之合併的代表性結果被出示於第7圖中，其中對Me-7所示之結果傜為Me-1所得結果之代表且與之相一致。對Me-2所示之結果係為其他的單株抗體 Me-3、Me-5與Me-6所得結果之代表且與之相一致。一種本案發明人先前所述之小白鼠感染模型（Br ode nr e t a 1 . , Inf ec· Immun· · 5 0 »510, 1985；Brodeur et al., Can..,_.J, Microbiol . , H 33 , 1986)被用來評估各個單株抗體之保護性活性。主要地，在細菌挑戰之前1 8個小時， Balb/c小白鼠被腹膜腔内地注射以600/xl的含有單株抗體之腹水。接而以lml之一懸浮液[含有100個菌落形成單位之腦膜炎奈瑟氏球菌菌株608B、《的黏蛋白（Sigma)以及 1 . 6¾的血紅素（Sigma)]來挑戰小白鼠。數個實驗之合併的結果被出示於表3中。須予以注意的是，只有該等溶_性單株抗體Me-Ι與Me-7會保護小白鼠免於實驗性腦膜炎奈瑟氏球菌感染。確實地，相較於在接受600iul之Sp2/0誘發的腹水或者600m 1之含有不相關的單株抗體之腹水的對照組所觀察到的9¾存活率，在細菌挑戰之前，含有此二種單株抗體之腹水的注射，將Ba 1 b/c小白鼠之存活率顯著地提高至7 0%或以上。結果亦顯示出，若在細菌挑戰之前18個小本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

，1T 520375

7 7 A B 五、發明説明（J^) 時，其曽先被注射以400mg的蛋白質A純化的Me-7，有80% 的小白鼠會從感染中存活下來。後續的實驗目前正在進行中，俾以定出要保護50¾的小白鼠所需要之最低抗體濃度。於其他的腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白專一性單株抗體上觀察到落在20¾至40%之間之較低的存活率° 表3·本案之22 kDa表面蛋白專一性單株抗體對腦膜炎奈瑟氏球菌_株6088 (B:2a:P1.2)之免疫保 __ pM Rh ~h ffi---------- 單株抗體挑戰後存活的小白鼠之數目存活率百分比 24h 72h Me-1 29/30 23/30 76 M e - 2 17/20 3/20 25 M e ~ 3 5/10 2/10 20 Μ e ~ 4 11/20 8/20 40 Me-5 10/10 7/10 70 Μ e - 6 13/15 12/15 80 Me-7 31/100 9/100 9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 總而言之，該等結果清楚地顯示出，一種對腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白具專一性之抗體可以有效地保護小白鼠對抗一實驗性致命的挑戰。藉由一抗原之保護性抗準標家國國 I中用 I適尺張 -紙 I本

S N 一格一讀 520375 A7 B7 五、發明説明（r)) 體的誘發傺為用以評斷有潛力的疫苗候選物之進一步研究的最重要標準中之一者。竄利用經純化的重組型22 kDa表面蛋白之免疫反應對隨後的紬_祧戰提供保藍__ 依據實施例3中所述之程序來製備經純化的重組型22 kDa表面蛋白，並將之用來免疫Balb/c小白鼠以決定其對抗使用一致命劑量的腦膜炎奈瑟氏球菌608B (B :2a: P1· 2) 之挑戰的保護性作用。決定使用經純化的重組型蛋白質而非天然的腦膜炎球菌蛋白質，俾以確保在此等實驗期間中所用的疫苗製品中不含有其他的腦膜炎球菌蛋白質。此等實驗中所用的小白鼠感染模型偽如本案之一發明人先前所述者（Brodeur e t a 1 . , Inf ec « Immun . · 5 0 ·· 5 1 0, 1 985; Brodeur e t a 1 . , Can. J > Microbiol., 3 2 : 3 3，1986) ° 各値該等小白鼠於3週之期間内被三次地皮下注射以每一隻小白鼠為IOOmI之含有1〇或20/ig之經純化的重組型22kDa 表面蛋白。Qu Π A傺為此等實驗中所用之佐劑，其濃度為每一注射含25/ig之量。對照組中之小白鼠依據相同的程序被注射以10或20“的BSA、20wg的大腸桿菌BL21 (D30)之經濃縮的細胞培養物上澄液，該大腸桿菌帶有質體pliKS30但是不含有關於依實施例3之敘述而製備的腦膜炎球菌蛋白質之插入基因，或是被注射以磷酸鹽緩衝的生理鹽水。在各次注射之前從各個小白鼠取得血清樣品，俾以分析對抗該重組型蛋白質的免疫反應之發展。在第3次免疫之後兩週，所有組中之小白鼠被腹腔内地注射以1 ro 1之一懸浮液本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 私本.

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 _ 五、發明説明（冰） [含有100個_落形成單位之腦膜炎奈瑟氏球菌®株608B、 4 %的黏蛋白（S ί g m a )以及1 · 6 %的血紅素（S i g ffl a )]。此等實驗之結果被出示於表4中。相較於對照組之〇至 40¾，被經純化的重組型22 kDa表面蛋白所免疫之小白鼠中有80¾從細Μ挑戰存活下來。很重要地，被注射以濃縮的大腸桿菌細胞培養物上澄液之對照組中的小白鼠沒有獲得對抗該細菌挑戰之保護。此後面之結果清楚地證實，於純化後可能以少量存在之存在於細胞培養物培養基内之組份以及大腸桿菌之抗原，不會對所觀察到的對抗腦膜炎奈瑟氏球菌之保護作用産生助益。表4.利用經純化的重組型22 kDa表面蛋白之免疫反應對使用腦膜炎奈瑟氏球菌«株608B (B:2a:P1.2) ___ 夕_後的紬_桃戰提供保講 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製實驗組別挑戰後存活的小白鼠之數目存活率百分比 24h 48h 72h 1 l〇Mg之經純化的22 kDa 20/20 16/20 80 10狀之BSA 17/19 8/19 42 2 2〇Mg之經純化的22 kDa蛋白 9/10 8/10 8/10 80 20ug之經純化的大腸桿菌上澄液 7/10 5/10 2/10 20 20狀之BSA 6/10 4/10 2/10 20 磷酸鹽緩衝的生理鹽液 8/10 0/10 0/10 0 57 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇><297公慶） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___ B7 五、發明説明（冗）經純化的重組型22 kDa表面蛋白之注射大大地保護經免疫之小白鼠對抗一由腦膜炎奈瑟氏球菌所致之致命性感染的發展。依據本發明之抗體係藉由在1 995.7.2 1.被寄存於位在美國馬利蘭州•羅克菲里（Rockvi 1 U)的美國類型細胞培養物收集中心，會生成單株抗體Me-1與Me-7的小白鼠融合瘤細胞株，予以例證之。該等寄存物之寄存編號為HB 11959 (Me-Ι)與 HB 1 1958 (Me-7)。 Γ .Λ— 富施例7 :腦膜炎奈瑟氏球菌之其他菌株與淋病奈瑟氏球蘭的序列分析_ 如實施例3中所述的，從腦膜炎奈瑟氏球菌與淋病奈瑟氏球菌之不同菌株的基因群DN A中，分離出含有編碼該 22 kDa表面蛋白之基因的2,75kb clalv消化的DNA片段。 a) MCH88菌株：MCH88菌株（臨床分離物）之核苷酸序列示於第8圖（序列辨識編號：3)中。從608B菌株所獲得的實驗證據，推衍出一個對應於胺基酸-19至-1 (Mm-L-A-A-L-I-A-LU-P-A-A-A-L-A)之推衍的引導序列。從一自已建立的資料庫之査詢確認，源自於腦膜炎奈瑟氏球菌菌株MCH88之22 kDa表面蛋白（序列辨識編號：4)或其基因（序列辨識編號：3)是之前未曽被描述過者。 b) Z4063菌株：Z4063菌株（J，F· Wanget al·, Infect· T m m υ η ο I . , 6 0 : 5 2 6 7，1 9 9 2 )之核苦酸序列不於第9圖（序列辨識編號·· 5)中。從608B菌株所獲得的實驗證據，推衍出本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 ___ B7__ 五、發明説明（β) 一個對應於胺基酸-19至-1 (M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-A-匕-？414^)之推衍的引導序列°從一自已建立的資料庫之査詢確認，源自於腦膜炎奈瑟氏球_菌株Z2063之22 kDa表面蛋白（序列辨識編號：6)或其基因（序列辨識編號·*5) 是之前未曽被描述過者。 c)淋病奈瑟氏球菌b2 :淋病奈瑟氏球菌b2 (血清型1，加拿大·渥太華· L C D C之國家奈瑟氏球菌標準中心）之核苷酸序列示於第10圖（序列辨識編號·· 7)中。從608B®株所獲得的實驗證據，推衍出一個對應於胺基酸-19至-1 (M-f(-K-Amm-L-AU-A-Am)之推衍的引導序列。從一自己建立的資料庫之查詢確認，源自於淋病奈瑟氏球_菌株b2之22 kDa表面蛋白（序列辨識編號：8)或其基因 (序列辨識編號·· 7 )是之前未曽被描述過者。第11圖顯示，從所有4個測試的菌株之DHA序列所建立之守恆序列。MCΗ88鐘株在核苷酸2 17處顯示出一値密碼子 (TCA)之插入，但一般而言該4個菌株顯示出極高的同源性 Ο 第12圖描述從該4個菌株所獲得之推衍的胺基酸序列之間的同源性。所有4個菌株之間存在有一個大於90%之相同性。窨施例8 ：兔子與猴對腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白22 kDa 夕劳疼反應___ 兔子與猴被免疫以重組型22 kDa蛋白質俾以評估除了小白鼠之外的物種體内之抗體反應。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐）-59 一 I . 遂—丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 520375 A7 B7___ 五、發明説明（# ) a)兔子雄性紐西蘭兔子被免疫以獲自於帶有質體PN2202或對照組質體PMS30之大腸捍菌Μ株JM109的外膜製品（該菌瀦與該等質體傺實施例3中所述的）。被使用以獲得此等外膜製品之氛化鋰萃取，係以本案發明人先前所述之一種方式 [Brodeur e t a 1 . , T n f e c t . Immunol.· 5 0 >5 10, 1 985]予以進行的。此等製品之蛋白質含量像以適用於膜分離部分的 Lowry 法（Lowry e t a 1 . , J . Biol* Chenu，1 9·.3_: 2 6 5，經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1951)予以測定的。該等兔子在數値部位處被皮下地以及肌内地注射以15(^g的前述外膜製品之一者，隔3週注射兩次。對於這些免疫作用，使用最終濃度為20¾ U/v)的Qui 1A (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont·, Canada)作為佐劑。專一性體液性反應之發展的測定傺藉由使用萃取自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株608B (B :2a: pi .2)之外膜製品以作為塗覆抗原的ELIS A以及藉由本案發明人已敘述之免疫沾移隨行方法[Brodeur et al·, Infect ·— Immunol., 50_: 510, 1985; Martin et al·, Eur· J· Iffliniinol·，18:601，1988] 。對於這些分析，使用鹼性磷酸酶或過氧化酶-標識的驢抗-兔子免疫球蛋白（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Grove, PA) 0 含有該22 kDa重組型蛋白質的大腸桿鐘外膜製品以及 Qu i 1 A佐劑之組合注射會於兔子體内誘發一強力的專一性體液性反應，以ELISA測定之值為1/32,000 (第13圔）。在該22 kDa蛋白質之注射後被誘發的抗體會與經純化的重組本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） -60 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 五、發明説明（炫）型22 kDa蛋白質起反應，但更重要的是，該等抗體亦會辨識被基因表現、褶疊及包埋在腦膜炎奈瑟氏球菌之外膜内之天然蛋白質。西向免疫轉印法實驗清楚地出示，在第二次免疫後存在的抗體，於硝基纖維素膜上會辨識為單株抗體Me-2 (如實施例2中所述的）所示出之相同的蛋白質帶，該單株抗體Me-2對該22 kDa蛋白質具有專一性。 b)猴

Ma c a c a f a s。i c u 1 a r (cynomolgus)猴分別被免疫以 10〇Mg (K28)以及200/ig (1276 )之親和力純化的重組型22 kDa蛋白質，注射兩次。用於生産及純化源自於大腸桿菌 _株BL21DE3的方法傺描述於實施例3中。對於這些免疫作用，使用最終濃度為 20% (v/v)的 Alhydrogel (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont·，Canada)作為佐劑 ϋ 該等 .猴隔3週之間期接受兩次的肌内注射。一對照組猴（Κ65)參照相同的方法被免疫以一不相關的重組型蛋白質。如前述方式來分析血清。對於這些分析，使用鹼性磷酸酶或過氣化酶-標識的山羊抗-人類免疫球蛋白（Jackson ImmunoRe-search Laboratories, Grove, PA) 0 每次注射被免疫以lOOug的純化蛋白質之猴fC28的專一性抗體反應，較諸被免疫以20〇Mg的猴1276，出現較快且較強（第14圖）。當以西向免疫轉印法來測定時，對天然的 22 kDa蛋白質具專一性之抗體，於第1次注射後21天即已存在於血清内，但是在經兩次的對照組抗原注射之對照組猴的血清内則無。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· •% 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 __B7_ 五、發明説明) 矣吉各命 ♦ 於實施例2與5中所展現的實驗數據清楚地顯示，該重組型22 kDa蛋白質之注射於小白鼠體内可以誘發一針對腦膜炎奈瑟氏球菌菌株之保護性體液性反應。更重要地，在此實施例中所展現的結果證實了此免疫反應不限於只有一個物種，而是此重組型表面蛋白亦可激活諸如兔子或猴之其它物種的免疫条統。窨旆例9 ：腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa蛋白質之抗原決定位的標圖使用一種本案發明人之一所述的方法（Martin et al·, Infect. Immunol·· 5 9 : 1457-1464，1991)來標圖腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之抗原決定位。使用18個涵蓋衍生自菌株608B之整個腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa蛋白質序列之重疊的合成胜肽以（第15圖）及在此蛋白質之免疫後所獲得的高免疫血清來完成線形抗原決定位之鑑定。位在該 22 kDa蛋白質上之免疫顯性部分的鑑定可有助於設計新且有效之疫苗。更甚者，此等B-細胞抗原決定位亦提供有關於該蛋白質在腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜内之結構構形的有價值資料。所有胜肽係為BioChem Immunosysteins Inc.(蒙特羅，加拿大）使用 Applied Biosystems (Foster City，CA) 自動胜呔合成儀予以合成的。藉由逆向高壓液相層析來純化該等合成胜肽。胜肽CS-845、CS-847、CS-848、CS-851 、CS-852與CS-856 (第15圖）被溶解於一少量的6M胍-HC1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 d 520375 A7 B7 五、發明説明（0) (J.T. Baker, 〇nt· Canada)或二甲基亞風（J.T. Baker) 内。這些胜肽接而以蒸餾水予以調整為lmg/mg。所有其他的胜肽可完全地溶於蒸餾水内且亦被調整為1 nig/i〇g ° 胜肽酵素-聯結的免疫吸附分析（EL ISA)之進行傺藉由將合成胜肽以一為5〇Mg/ffll (配於50mM碩酸鹽缓衝液，pH 9·6内）之濃度塗覆至微滴定盤（Immiilon 4, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA)上。在室溫下過议培育後，以含有0.05¾ (vt/vol) Tween 20 (Sigma Chem-ical Co., St,-Louis, Mo.)之磷酸鹽緩衝的生理鹽液（PBS) 清喜該等盤，並以含有0.5 % (wt/vol)牛血清白蛋白（Sigma) 的PBS予以堵塞之。將得自被免疫以親和力純化的重組型 22 kDa表面蛋白之小白鼠與猴的血清予以稀釋，並將100 Ml的各稀釋液加至該ELIS A盤之每井内，且於37 °C下培育歴時1小時。該等盤被清洗3次，並加入以1 00m 1的依製造商之建議稀釋的鹼性磷酸酶-綴合的山羊抗-小白鼠或抗-人類免疫球蛋白（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Grove, PA)。在37 °C下培育歴時1小時之後，清洗該等盤並加入以 100m1的含有lmg/ml P-硝基苯機磷酸酯（Sigma)之二乙醇胺（10% (v/v) , pH 9.8)。在60分鐘後，以一微滴定盤讀取機來讀取光譜計量反應（λ=41 On in)。在以親和力純化的重組型22 kDa蛋白質（實施例8)免疫的小白鼠與猴抗血清與1 8個重疊合成胜呔之合用被成功地用於定位位在該蛋白質上之B-細胞抗原決定位。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） II 蜷丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟、那中央標準局舅工消費合作社印製 -Ill I Hr · 520375 A7 B7 五、發明説明（6/ ) 第一個區域傺坐落在胺基酸5 1與86之間。使用不同的數學式之電腦分析暗示這個區域之免疫重要性是具有最高的可能性者，因為其為親水性且露出表面的。更甚者，被示於第12圖中的4個蛋白質序列之比較顯示出，其像為在胺基酸殘基73處之一插入的一個主要差異即坐落在此區域内0 該等抗血清鑑定出一個坐落在胺基酸Π 〇與1 40之間的第二抗原性區域。令人感興趣地，序列分析顯示出在該4 値蛋白質序列之中非為守恆的1 4個胺基酸中有7値簇集在該蛋白質的這個區域之中。僅從猴血清辨識出一個坐落在該蛋白質之一高度守恆的區域（介於胺基酸31與55之間）内的第三抗原性區域。實施例10_:用於22 kDa表面蛋白之大規模生産的熱-誘發的耒現載體_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白之基因插入至質體 p629 (George et al·，Bio/technology 600-603, 1987)。該質體p629帶有一由噬菌體λ cI857溫度敏感的抑制子基因的卡匣（其中已刪除掉有功能的Pr啓動子），並使用PL啓動子來控制該22 kDa表面蛋白之合成。該cI857抑制子藉由一從30 °C至38 °C之漂移的去活化，造成為該質體所編碼的蛋白質之生成。在大腸捍菌細胞内之基因表現藉由一種溫度漂移來誘發，對於大規模醱酵而言是有利的，因為其可融易地現代的醱酵器來完成之。其他的誘發型基因表現載體通常需要在培養基内加入例如乳糖、異丙基硫本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（β) 基—D-半乳糖（IPTG)之特定的分子，俾以誘發所欲的基因之表現。使用以下兩値寡核苷酸引子（0CRR8: 5 ^TAATAGATCTA TGAAi\AAAGCACTTGCCAO3fU&0CRR9:3，-CACGCGCAGTTTAA GACTTCTAGATTAH，藉由PCR從腦膜炎奈瑟氏球菌菌株60 8B的基因群DNA擴增出一個540核苷酸片段。這些引子對應於在該22 kDa基因的兩端所發現的核苷酸序列。為簡化該 PCR産物之植入，一個Bgll (AGATCT)限制址被併入至此等引子之核苷酸序列内。該PCR産物在為Bgl I所消化之前於瓊脂糖凝膠上予以純化之。此約為525個鹼基對之Bg 1 E 片段接而被插入至質體P629的Bgl E與BamHI址内。含有該 PCR産物插入物之質體被命名為PNP2204，並被用來轉形大腸桿菌菌株DH5 a F f IQ。質體PHP2204之一部分圖譜示於第 16圖中。所形成的_落以如實施例2中所述的，對腦膜炎奈瑟氏球® 22 kDa表面蛋白具專一性之單株抗體來篩選之。所形成的純株之西向免疫轉印法分析清楚地顯示出，為大腸捍菌所合成之蛋白質是完整的，且在SDS-PAGGE上之移動係類似於天然的腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白。從所選擇的純鵪純化出質體DNA，並予以序列分析之。存在於該質體内的插入物之核苷酸序列與編碼第1圖中所示的腦膜炎奈瑟氏球顏22 kDa蛋白質之基因完美地相合。為研究該22 kDa表面蛋白之合成位準，該溫度-敏感的質體PHP2204被用來轉形大腸捍菌_株W3110、JM195、 BL21、T0PP1、T0PP2與T0PP3。就各菌株而言，決定該22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） --?------ml衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 65 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7__ 五、發明説明（6)) kDa表面蛋白之合成位準與該蛋白質在不同的細胞分離部分内之坐落處。於肉湯（Gibco BRL, Life Technologies, G r a n d I s 1 a n s , N Y)内的震燒瓶培養顯示出，一値從3 0 °C至39 °C的溫度漂移有效地誘發該基因之表現。合成位準之時間流程的評估顯示出，如在SDS-PAGE上所測定的，該蛋白質在誘發後30分鐘即出現，而且蛋白質之數量於誘發之期間中恆定的增加。於大腸捍菌菌株W3 100與T0PP1測定到每公升介於8-1 Omg的22 kDa蛋白質之表現位準。對此二菌株，大部分的22 kDa蛋白質傺被併入至細菌的外膜。窨施例11 ：腦膜炎奈頹氐球蘭22 kh蒂白質夕純化由於大量的22 kDa蛋白質被發現偽被包埋在大腸桿菌菌株之外膜内，此實施例所展示之純化流程不同於實施例 3中已敘述者（其中一大量的蛋白質被釋出至細胞培養上澄液内）。一在30°C下培育之帶有質體PNP2204的大腸捍菌菌株W3100或T0PP1之過夜細胞培養物被培育於含有50ug/ml 的安比西林（Sigma)之LB肉湯内，並於30 °C下攪拌（250 r Pm) 生長，直至達到一為0. 6之細胞密度（λ =600nin)，於該點時將培育溫度轉移至39 °C歴時3-5小時俾以誘發該蛋白質之生成。藉由在4°C下於8, 000xg離心15分鐘來收獲細菌細胞，並以磷酸鹽緩衝的生理鹽液（PBS, pH 7. 3)予以清洗兩次。聲波性分解或機械性分解或使用一個French壓器將細菌細胞予以超音波震破。未破的細胞藉由在5,000xg離心5分鐘而將之移除並丟棄。藉由在1〇 °C下於100, OOOxg離心1小時而將外膜與細胞質組份分開。將含胞膜之沉澱九本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） m- am S«1 tii_i— —.Mk·— tfMmMme Half ml mmmm (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -I-— 1·— - 0J! · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 五、發明説明（6弘）再散浮於一少量的PBS (pH 7. 3)内。為了從膜中溶出該22 kDa表面蛋白，使用清潔劑，例如Empigen BB (Calbiochem Co., LaJolla, CA) ^ Zwi11eergent-3,14 (Calbiochem Co .)或、-庚基糖苷（S igma)。將清潔劑加至膜分離部分内達最終濃度為3%，並於20 t下塔育1小時。藉由該3種清潔劑來有效地溶解該22 kDa蛋白質，但是/3 -庚基糖苷具有可容易地移除不要的膜蛋白之優點，因為該等蛋白質是不溶的而可藉由離心自上澄液内被分開。為移除清潔劑，將含該22 kDa之上澄液對PBS缓衝液作大量的透析數次。蛋白酶K處理（如實施例1中所述）可被進一*步用來將該22 kDa表面蛋白製品中不要的蛋白質予以移除。使用硫酸銨或有機溶劑之分级沉澱以及超過濾偽為在凝膠過濾之前，將該蛋白質中之不要的核酸和脂多酷污染物予以移除的兩値可用額外步驟，而離子交換層析可被有效地用於獲得純化的22 kDa蛋白質。如實施例3中所述的，親和力層析法亦可被用來純化該22 kDa蛋白質。審旆例1 2 ：該22 kt)a耒而蒂白作為一個人類疼Μ ：>用徐為配製一供人類使用的疫苗，可從此處所述之多胜肽中選出適當的22 kDa表面蛋白抗原。例如，一熟習此藝者會從該22 kDa多胜呔或其含有一個免疫原性抗原決定位的片段設計出一種疫苗。分子生物技術之使用是特別適於實質上純質的重組型抗原之製備。該疫苗組成物可呈各種不同的形式。這些包括，例如固體、半固體和液體劑量型式，如粉末、液體溶液或懸浮本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _______B7____ 五、發明説明（^r) 液以及脂質體。依本案發明人所認為的，本發明之22 kDa 表面蛋白抗原，當被投藥至一人類體内時，可激發一保護性免疫反應，本發明之組成物會類似於那些使用其他的蛋白質與多胜肽（例如破傷風及白喉）而用於人類之免疫者。因此’本案之組成物較佳地包含有一種藥學上可接受的佐劑’諸如弗倫氏（Freund fs)不完全佐劑、氫氣化鋁、一種 mu r a my 1胜肽、一種油包水乳劑、一種脂質體、一種ISCO Μ 或CTB，或一種非毒性的β次單位型式霍亂毒素。更佳地，本案組成物可包含一種油包水乳劑或氫氧化鋁以作為佐劑〇本案組成物可以多種藥學上可接受的型式之任一種而被投藥至病人，這包括肌内地、真皮内地、皮下地或局部地投藥。較佳帝地，本案疫苗僳被肌内地投藥。通常，劑量傺由一為每個病人約O.Ol-lOmg (較佳為 0.卜l.Oing)的22 kDa表面蛋白之初始的注射所構成，且非常有可能加有佐劑，並即有可能之後追加1至2次的注射。較佳地，追加注射傺在初始注射之後大約1個月以及6値月時為之。一有關於疫苗發展之考量是黏膜免疫力的問題。理想的黏膜性疫苗可以一次或數次劑量而被安全地口服呑服或鼻内地投藥，且會與全身性免疫在適當的表面處激發保護性抗體。本案黏膜性疫苗可包含有佐劑、惰性穎粒載劑或重組型活載體。本發明之抗-22 kDa表面蛋白抗體可用於感染有腦膜本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 A7 B7 五、發明説明（π ) 席列恙 (1) 一般資訊： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (ί)申請人：伯納爾德•布魯杜爾喬斯·漢米爾丹尼斯馬丁克里門•力奧克斯 (i ί)發明名稱：抗蛋白酶κ的腦膜炎奈瑟氏球菌之表面蛋白質 (iii)序列數：26 (i v)通信住址： (A) 聯絡對象：勾錐給吉杜布克&馬提尼華克 (B) 街道：800裴雷斯維多利亞，3400室，圖地拉包斯 (C) 城市··蒙特羅 (D) 州：魁北克 (E) 國：加拿大 (F) 郵遞區號：H4Z 1E9 (v)電腦可讀型式： (A) 媒體型式：磁碟片經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (B) 電腦：IBM PC可相容的.

(C) 操作条統：PODOS/MS-DOS (D) 軟體·♦ Patentln Release #1.0，

Version tfl.25 (vi)目前申請資料·· (Α)申請案號：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 五、發明説明（w) (B) 申請日期： (C) 分類： (v i i)先前申請資料： (A) 申請案號：US 08/406, 362 (B) 申請日期：1995· 3· 17· (v i i)先前申請資料： (A) 申請案號：US (PR0VIS) 60/001,983 (B) 申請日期：1995·8·4· (ν i i i)代理人資料： (A) 姓名：雷克爾/杜布克/普林斯，阿蘭/吉恩/蓋田 (B) 檔案編號·· BI0VAC-1 PCT (ix)電信聯絡資訊： (A) 電話號碼·· 514-397-7400 (B) 傳真號碼：514-397-4382 (2)序列辨識編號之資料： (i)序列待徵： (A) 長度：830個鹼基對 (B) 類型··核酸 (C) 股型：雙股的 (D) 型態：線性 (i i)分子型式：DNA (基因群的） (i i i)假定的··無 (i ν )反訊息的：無 (v i)原始來源：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ϋϋ' mi ^ϋϋ —nil In -ϋ^ mu In-— 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT | - - - 11 - 520375 A7 B7 (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌 (B) _ 株：608B (ίχ)特徵： U)名稱/索引：CDS (B)位置：143· · 667 (ix)特徽：(A) 名稱/索引：Sig_胜肽 (B) 位置：143. · 199 (i X)特徵：U)名稱/索引：inati肽 (B)位置：200. · 667 (X i)序列説明：序列辨識編號：1 TCGGCAAAGC AGCCGGATAC CGCTACGTAT CTTGAAGTAT TGAAAATATT ACGATGCAAA 60 AAAGAAAATT TAAGTATAAT ACAGCAGGAT TCTTTAACGG ATTCTTAACA ATTTTTCTAA 120 CTGACCATAA AGGAACCAAA AT ATG AAA AAA GCA CTT GCC ACA CTG ATT GCC 172 Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala -19 •15 一 10 — : ....... |1¥| - - ϋϋ - I ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CTC GCT CTC CCG GCC GCC GCA CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr -5 15 GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC GCA AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT Val Gin Ala Asp Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser 10 15 20 GCC AAA GGC TTC AGC CCG CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp 25 30 35 CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA GCC CCA Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro 40 45 50 55 TCC ACC GAT TTC AAA CTT TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT TAC GAC Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp 60 65 70 TTC GAC ACC CAA TCG CCC GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC TTG AGC Phe Asp Thr Gin Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser 75 80 85 220 268 316 3 64 412 460 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 72 520375 A7 B7 五、發明説明（ CTC AAC CGC GCC TCC GTC GAC TTG GGC GGC AGC GAC AGC TTC AGC CAA 508 Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin 90 95 100 ACC TCC ATC GGC CTC GGC GTA TTG ACG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC Thr Ser lie Gly Leu Gly Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr 105 110 115 556 CCG AAT GTC GAT TTG GAT GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC GGC AAA 604 Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie Gly Lys 120 125 130 135 GTC AAC ACT GTC AAA AAC GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GTC GGC GTG 652 Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val 140 145 150 CGC GTC AAA TTC TGATATGCGC CTTATTCTGC AAACCGCCGA GCCTTCGGCG Arg Val Lys Phe 155 704 GTTTTGTTTT CTGCCACCGC AACTACACAA GCCGGCGGTT TTGTACGATA ATCCCGAATG 764

CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA TTTTTTGAGG AATCCGAAAT GTCCAAAACC ATCATCCACA 824 ACA 830 請先閱讀背 5 意事項 f_l ί裝頁 Χ2)H辨、識編號:2之資料 (ί)序列待徵： (Α)長度 (Β)類型 (D)型態 (i i)分子型式 (xi)序列說明 174個胺基酸胺基酸線性蛋白質序列辨識編號訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -19 -15 -10 -5 Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala 15 10 His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 15 20 25 Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 30 35 40 45 Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 50 55 60 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 7 3 520375 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（7/ ) Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro 65 70 75 Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val 80 85 90 Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser He Gly Leu Gly 95 100 105 Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp 110 115 120 125 Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn 130 135 140 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe 145 150 155 (2)序列辨識編號：3之資 '料： (i)序列特徵： (A) 長度：710個鹼基對 (B) 類型··核酸 (C) 股型：雙股的 (D) 型態：線性 (Π )分子型式：D N A (基因群的） (Π i )假定的：無 (i v )反訊息的：無 (v i)原始來源： (A)生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌 (B ) B 株：M C Η 8 8 (i χ )特徵： (A) 名稱/索引：CDS (B) 位置：116· ·δ43 ' (i χ )特徵： U )名稱/索引·· s i g _J生肽 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 297公慶） 520375 A7 B7 五、發明説明（β ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (Β)位置：11δ··172 Πχ)特徵： U)名稱/索引：mat_J生肽 (B)位置：173· · 643 (X ί)序列說明：序列辨識编號：3 GTATCTTGAG GCATTGAAAA TATTACAATG CAAAAAGAAA ATTTCAGTAT AATACGGCAG 60 | GATTCTTTAA CGGATTCTTA ACCATTTTTC TCCCTGACCA TAAAGGAATC AAGAT ATG 118 Met -19 AAA AAA GCA CTT GCC GCA CTG ATT GCC CTC GCC CTC CCG GCC GCC GCA 166 Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala -15 -10 -5 CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC 214 Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala His 15 10 GCC AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG CGC 262 Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg 15 20 25 30 I I ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC 310 lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr 35 40 45 ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA CAA GTC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT 358 Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Gin Val Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 50 55 60 TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCC CCC 406 Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro 65 70 _ 75 GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC TTG AGC CTC AAC CGC GCC TCC GTC 454 Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val 80 85 90 GAC TTT AAC GGC AGC GAC AGC TTC AGC CAA ACC TCC ACC GGC CTC GGC 502 Asp Phe Asn Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser Thr Gly Leu Gly 95 100 105 110 GTA TTG GCG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT 550 Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp 115 120 125 GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAT 598 Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn 130 135 140 GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GCC GGC GTA CGC GTC AAA TTC TGATATACGC 650 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe 145 150 155 GTTATTCCGC AAACCGCCGA GCCTTTCGGC GGTTTTGTTT TCCGCCGCCG CAACTACACA 710 ,--.----裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 it 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 75 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 A7 B7 五、發明説明（β) (2)序列辨識編號·· 4之資料： (ί)序列特徵： U)長度：175個胺基酸 (Β)類型··胺基酸 (D)型態：線性 (i i)分子型式：蛋白質 (X i)序列說明：序列辨識編號：4

Met Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu 工le Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -19 -15 -10 -5

Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala 1 5 10

His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 15 20 25

Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 30 35 40 45

Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Gin Val Pro Ser Thr Asp Phe Lys 50 55 60

Leu Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser 65 70 75

Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser 80 85 90

Val Asp Phe Asn Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser Thr Gly Leu 95 100 105

Gly Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu 110 115 120 125

Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie Gly Lys Val Asn Thr Val Lys 130 135 140

Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe 145 150 155 (2)序列辨識編號：5之資料： (i )序列特徵：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-76 - >§_1«1' mmtmmmai AVH ν^ϋ·— 1B_— —Bane HI— m·· emm— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 Μ _______Β7_ 五經濟部中央標準局員工消費合作社印製發明説明 (A) 長度：850値鹼基對 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (B) 類型：核酸 (c)股型··雙股的 (D )型態：線性 (i i )分子型式·· DNA (基因群的） (i丨丨）假定的：無 (Ί v )反訊息的：無 (vi)原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌 (B) 鋪株·· Z4063 (i x )持徵： (A) 名稱/索引：CDS ' (B) 位置：208. .732 (i X )特徵： (A) 名稱/索引：sig_J生肽 (B) 位置：208. · 264 (i X )特徵： (A) 名稱/索引： (B) 位置·· 265· ,732 (xi)序列說明：序列辨識編號：5 CACCCATCCG CCGCGTGATG CCGCCACCAC CATTTAAAGG CAACGCGCGG GTTAACGGCT 60 TTGCCGTCGG CAAAGCAGCC GGATACCGCT ACGTATCTTG AAGTATTAAA AATATTACGA 120 TGCAAAAAGA AAATTTAAGT ATAATAAAGC AGAATTCTTT AACGGATTCT TAACAATTTT 180 TCTAACTGAC CATAAAGGAA CCAAAAT ATG AAA AAA GCA CTT GCC ACA CTG 231

Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu -19 -15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 520375 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（fr) ATT GCC CTC GCT CTC CCG GCC GCC GCA CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC 279 lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly -10 -5 15 TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC GCA AAA GCC TCA AGC TCT TTA 327

Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu 10 15 20 GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC 375

Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie 25 30 35 AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA 423

Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys 40 45 50 · GCC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT 471

Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie 55 60 65 TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCG CCC GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC 519

Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg 70 75 80 85 TTG AGC CTC AAC CGC GCC TCC GTC GAC TTG GGC GGC AGC GAG AGC TTC 567

Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe 90 95 100 AGC CAA ACC TCC ACC GGC CTC GGC GTA TTG GCG GGC GTA AGC TAT GCC 615

Ser Gin Thr Ser Thr Gly Leu Gly Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala 105 110 115 GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC 663

Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie 120 125 130 ；GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAC GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GCC 711

Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala 135 140 145 GGT GTG CGC GTC AAA TTC TGATATGCGC CTTATTCTGC AAACCGCCGA 759

Gly Val Arg Val Lys Phe 150 155 GCCTTCGGCG GTTTTGTTTT CTGCCACCGC AACTACACAA GCCGGCGGTT TTGTACGATA 819 ATCCCGAATG CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA T 850 (2)序列辨識編號：6之i锌： (i)序列特徵： U)長度·· Γ74個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D :)型態··線性 (Π)分子型式：蛋白質本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7 五、發明説明（ (xi)序列說明：序列辨識編號·♦ 6

Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -19 -15 -10 -5

Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala 15 10

His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 15 20 25

Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 30 35 40 45

Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 50 55 60

Tyr Ser 工le Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro 65 70 75

Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val 80 85 90

Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser Thr Gly Leu Gly 95 100 105

Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp 110 115 120 125 |

I

Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr He Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn j 130 135 140 I

Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe 145 150 155 (2)序列辨識編號：7之資料： (i )序列待徵： U)長度：810個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股的 r*» -(D)型態：線性 1 (Π )分子型_式：撼A—〈基因群的） (i i」）—假定的：無 Η v )反訊息的··無 (v i)原始來源：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（2丨〇><297公董） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 .=V·· - - - !·- 520375 A7 _ΒΊ____五、發明説明（) (A )生物體··淋病奈瑟氏球菌 (B) _ 株：b2 (i X )特徵： (A) 名稱/索引：CDS (B) 位置：241· .765 (i X )特徵：U)名稱/索引·· sig_J生肽 (B)位置：241· ·297 (ix)特徵： (A) 名稱/索引：mat j肽 (B) 位置·· 298· .765 (X i)序列説明：序列辨識編號·· 7 ’ CCCCGCCTTT GCGGTTTTTT CCAAACCGTT TGCAAGTTTC ACGCATCCGC CGCGTGATGC 60 CGCCGTTTAA GGGCAACGCG CGGGTTAACG GATTTGCCGT CGGCAAAGCA GCCGGATGCC 120 ； GCCGCGTATC TTGAGGCATT GAAAATATTA CGATGCAAAA AGAAAATTTC AGTATAATAC 180 GGCAGGATTC TTTAACGGAT TATTAACAAT TTTTCTCCCT GACCATAAAG GAACCAAAAT 240 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ·€衣· 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印^ ATG AAA AAA GCA CTT GCC GCA CTG ATT GCC CTC GCA CTC CCG GCC GCC 288 Met -19 Lys Lys Ala Leu -15 Ala Ala Leu He Ala -10 Leu Ala Leu Pro Ala -5 Ala GCA CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA 336 Ala Leu Ala Glu Gly Ala 1 Ser Gly Phe 5 Tyr Val Gin Ala 10 Asp Ala Ala CAC GCC AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG 384 His Ala 15 Lys Ala Ser Ser Ser 20 Leu Gly Ser Ala Lys 25 Gly Phe Ser Pro CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT 432 Arg 30 lie Ser Ala Gly Tyr 35 Arg lie Asn Asp Leu 40 Arg Phe Ala Val Asp 45 TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA GCC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT 480 Tyr Thr Arg Tyr Lys 50 Asn Tyr Lys Ala Pro Ser 55 Thr Asp Phe Lys 60 Leu TAC AGC ATC GGC GCG TCC GTC ATT TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCG CCC 528 Tyr Ser lie Gly Ala 65 Ser Val lie Tyr Asp 70 Phe Asp Thr Gin 75 Ser Pro 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） __. 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) GTC AAA CCG TAT TTC GGC GCG CGC TTG AGC CTC AAC CGC GCT TCC GCC 576

Val Lys Pro Tyr Phe Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Ala 80 85 90 CAC TTG GGC GGC AGC pAC AGC TTC AGC AAA ACC TCC GCC GGC CTC GGC 624

His Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Lys Thr Ser Ala Gly Leu Gly 95 100 105 GTA TTG GCG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT 6Ί2

Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp 110 115 120 125 GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC GTC GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAC 720

Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Val Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn 130 135 140 GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GCC GGC GTG CGC GTC AAA TTC TGATATACGC 772 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe 145 150 155 GTTATTCCGC AAACCGCCGA GCCTTCGGCG GTTTTTTG 810 (2)序列辨識編號：8之資料： ’ (i )序列特徵： (A )長度：1 7 4個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D ,)型態··線性 π η分子型式：蛋白質 (X i)序列説明：序列辨識編號：2

Met Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -19 -15 -10 -5

Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala 15 10

His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 15 20 25

Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 30 35 40 45

Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 50 55 60

Tyr Ser lie Gly Ala Ser Val lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro 65 70 75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520375 Μ Β7 _ - —- ........ 五、發明説明)

Val Lys Pro Tyr Phe Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Ala 80 85 90

His Leu Gly Gly Ser Asp Ser Pbe Ser Lys Thr Ser Ala Gly Leu Gly 95 100 105

Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp 110 115 120 125

Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Val Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn 130 135 140

Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe 145 150 155 (2)序列辨識編號：9之資料： (i)序列待徵： (A) 長度：16個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)型態：線性 (Π)分子型式：蛋白質 (v Π原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌

(B) _ 株：608B U i )序列說明··序列辨識編號：9

Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala 1 5 l〇 15 η (2)序列辨識編號：i〇之資料： (i )序列待徵： U)長度：15個胺基酸 (B)類型··胺基酸 (D )型態：線性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、!! 520375 A7 B7 五、發明説明（W ) (i i)分子型式：蛋白質 (v i )原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌 (B) 菌株·· 608B (X i)序列説明：序列辨識編號：1 〇 Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe 15 10 15 (2)序列辨識編號：11之資料 (i)序列特徵： (A) 長度 (B) 類型 (D)型態 (i i)分子型式 (vi)原始來源： (A)生物體：腦膜炎奈瑟氏球Μ (Β) _ 株：608Β (X i)序列説明：序列辨識編號：11 15個胺基酸胺基酸線性蛋白質經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala His Ala Lys 1 5 l〇 15 (2)序列辨識編號：12之資料： (i)序列待徵： U)長度：15値胺基酸 (B)類型：胺基酸 (D )型態：線性 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 83 7 3ο 一 2 5 A7 B7 五、發明説明（？/ ) (ii)分子型式：蛋白質 (v i )原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球_

(B )菌株：6 0 8 B (X i)序列說明：序列辨識編號：12

Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly 1 5 l〇 15 (2)序列辨識編號：13之資料： (i)序列待徵： U)長度：15個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)型態··線性 ’ (i ί)分子型式：蛋白質 (ν ί )原始來源： (Α)生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌 ⑻菌株·· 6 0 8 Β (X ί)序列說明：序列辨識編號：1 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg 1 , 5 10 15 (2)序列辨識編號：14之資料： (i)序列持徵： U)長度：15個胺基酸 (B)類型：胺基酸 (D)型態：線性本紙蒗尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（弘） (i i )分子型式：蛋白質 (v i )原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌

(B) g 株：608B (X i)序列說明：序列辨識編號：14 Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr 1 5 i〇 is (2)序列辨識編號：15之資料： (i)序列特徵： (A) 長度·· 16個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D )型態：線性 (Π)分子型式：蛋白質 (v i)原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球®

(B ) _ 株：6 0 8 B (X i)序列說明：序列辨識編號：15

Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr 15 10 15 (2)序列辨識編號：16之資料： (i)序列特徵： U)長度：1 5個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (D )型態：線性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 A7 _B7__ 五、發明説明（幻） (i i )分子型式：蛋白質 Ui)原始來源： (A) 生物體··腦膜炎奈瑟氏球菌

(B) 菌株：608B (xi)序列説明：序列辨識編號：16

Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser lie Gly Ala 1 5 10 15 (2)序列辨識編號：17之資料： (i)序列特徵： (A)長度：15個胺基酸 (B :)類型：胺基酸 (D)型態··線性 ’ (Π )分子型式：蛋白質 (v i)原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌

(B) 菌株·· 608B (X i)序列說明：序列辨識編號：1 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala He Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser 15 10 15 (2)序列辨識編號：18之資料： (i )序列持徵： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)型態：線性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520375 A7 B7 五、發明説明（rf) (i U分子型式：蛋白質 (v i)原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌 (B) _ 株：608B (X i)序列説明：序列辨識編號：18 【he Asp Thr Gin ^er Pro Val Lys Pr〇 Leu Gly Ala A 印 5 10 15 (2)序列辨識編號：19之資料： (i)序列特徵： U)長度：15個胺基酸 (B)類型：胺基酸 (D)型態：線性 (Π)分子型式：蛋白質 (v i)原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌 (B) 菌株：608B (X i)序列說明：序列辨識編號：19 請閲、讀一背面，5 ί 事項本頁裝經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly 1 5 10 15 (2)序列辨識編號：20之資料·· (i)序列待徵： U)長度：15個胺基酸 (B .)類型：胺基酸 (D )型態：線性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（江） (i i)分子型式：蛋白質 (V i )原始來源： U)生物體··腦膜炎奈瑟氏球_

(B)菌株：608B (X i)序列說明：序列辨識編號：20

Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser lie 1 5 10 15 (2)序列辨識編號：21之資料： (i)序列持徵： U)長度：15個胺基酸 (B)類型··胺基酸 (D )型態··線性 ’ (ii)分子型式：蛋白質 (vi)原始來源：

(A)生物體：腦膜炎奈瑟氏球0 ⑻菌株·· 608B (X i)序列説明：序列辨識編號：21

Ser Gin Thr Ser lie Gly Leu Gly Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr 1 5 10: 15 (2)序列辨識編號：22之資料： (i)序列待歡： (A) 長度：15個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D )型態：線性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520375 A7 B7 五、發明説明（沁） (Π)分子型式：蛋白質 (v Π原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌

(B) @ 株：608B (X i)序列說明：序列辨識編號：2^

Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala 15 10 . 15 (2)序列辨識編號：23之資料： (i)序列特徵： (A)長度：15個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D)型態：線性 (i i)分子型式：蛋白質 (v i)原始來源：

(A)生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌 (B )菌株：6 0 8 B (xi)序列說明：序列辨識編號：23

Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn TVr lie Gly Lys Val 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 10 15 (2)序列辨識編號：24之資料： (i )序列持徵： (A)長度：15個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (D )型態··線性本紙張尺度適用中國®家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520375 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明説明（对） (i i)分子型式：蛋白質 (V i )原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌

(B) 菌株：608B (X i)序列説明：序列辨識編號：24

Tyr lie Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu 1 5 10 15 (2)序列辨識編號：25之資料： (i)序列持徵： (A) 長度·· 14個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)型態：線性 (ii)分子型式：蛋白質 (v i)原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌

(B) _ 株：608B (X i)序列説明：序列辨識編號：25

Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe 1 5 10 (2)序列辨識編號：26之資料： (i)序列持徵： U)長度：25個胺基酸 (B)類型：胺基酸 (D)型態：線性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) •裝· 520375 A7 B7 _ 五、發明説明（訪） (i i )分子型式：蛋白質 (v i)原始來源： (A) 生物體：腦膜炎奈瑟氏球菌

(B) 菌株：608B (X i)序列說明··序列辨識編號：26 fhe Ala Val Asp Thr Arg Tyr Lys Asn iyr Lys Ala Pro Ser Thr 1 5 l〇 15

Asp Phe Lys Leu Tyr Ser lie Gly Ala 2〇 25 (請先閱讀背面之注意事項\|^舄本百〇、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）

Claims

520375 L L1 A BCD 告公

六、申請專利範圍第085105 599號專利再審查案申請專利範圍修正本修正日期：91年11月 1. 一種可分離自奈瑟氏球菌物種的抗原性蛋白質或胜肽，該抗原性蛋白質或胜肽具有18至22 kDa之分子量，且與下列任一胺基酸序列具有至少90%之相同性，並保留下列任一胺基酸序列之免疫原性者： al Met Lye Lye Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -13 -15 -10 .5 Ala lieu A：La Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Aep Ala Ala 15 10 His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lye Gly Phe ser Pro 15 20 2£ Arg He Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 30 35 4Q 45 Tyr mr Arg Tyr Lya Aan Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Aap Phe Lys Leu SO £5 60 Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Aep Phe Asp Thr Gin ser Pro 65 70 75 Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val a〇 85 90 Asp Leu Gly Giy Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Sar 11« Gly Leu Gly 95 100 105 Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Aap HO 115 120 125 Ala Gly Tyr Arg Tyr Aen Tyr lie Oly Lye Val Asn Thr Val Lys Aan 130 135 140 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lye Phe, 145 150 155

b氏張尺度適用中關家標準（CNS) A4規格（21GX297公產） 520375 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 bj Met Lye Lys Ala Leu Ala Ala Leu He Ala Leu Ala Lmu Pro Ala Ala -19 -15 -10 -5 Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Qln Ala Asp Ala Ala _ > 1 5 10 Hie Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lye Gly Phe Ser Pro 15 20 25 Arg He Ser Ala Gly Tyr Arg lie Αβη Λβρ Lau Arg Fhe Ala Val Asp 30 3S 40 45 Tyr Thr Arg Tyr Lye Asn Tyr Lys Gin Val Pro Ser Thr Asp Phe Lys 50 55 60 Leu Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser 65 70 75 Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Θ0 85 90 Val Asp Phe Asn Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser Thr Gly Leu 95 100 105 Gly Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu 110 115 X20 125 Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie Gly Lys Val A日n Thr Val Lys 130 135 140 A曰ix Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe« 145 150 155 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •、可I 520375 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 c) Met Lye Lye Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -19 -IS -10 -5 Ala Leu Ala Qlu Gly Ala ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala 1 S 10, His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lye Gly Phe Ser Pro 15 20 25 Arg He Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 30 35 40 45 Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 50 55 60 Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gla Ser Pro 65 70 7B Val Lya Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Avg Ala Ser Val 80 as 90 Asp Leu Gly Gly Ser Aap Ser Phe Ser Gin Thr Ser Thr Gly Leu Gly 95 100 105 Val Leu Ala. Gly Val Sar Tyr ΛΙο. Val Thr Pro A0n Val Λβρ Leu Asp 110 115 120 125 Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie Gly Lys Val Asn Thr Val Lye Aen 130 135 140 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe# 145 ISO 155 d) Met Ijys Lys Ala Leu Ala Ala Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -19 -15 -l〇 -5 Aia Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Aap Ala Ala 1 5 l〇 His Ala Ly0 Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lye Gly Phe 3er Pro 15 20 25 Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Aap 30 35 40 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） A8 B8 C8 D8 520375 六、申請專利範圍 Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Aep phe Lye Leu 50 55 so (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Tyr Ser lie Gly Ala Ser Val lie Tyr Aep Phe Asp Thr Qln Ser Pro £S 70 75 Val hy〇 Pro Tyr Ρίιβ Giy Ala Arg lieu Ser Leu Aan Arg Ala Ser Ala BO 65 90 His Leu Oly Qly Ser Asp Ser Phe Ser Lye Thr Ser Ala Qly Leu Gly 9S 100 X〇S Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Aan Val Asp Leu Asp 110 115 120 125 Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Val Gly Lys Val Aen Thr Val Lye Asn 130 135 140 Val Arg Ser Gly Qlu Leu Ser Ala Gly Val Arg VaX Lys Phe, 145 150 155 «) lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie Aan Asp Leu Arg Phe Ala Val 31 35 40 45 Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro 45 50 55； f) Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser lie 51 55 60 Gly Ala Ser Ala He Tyr Aep Phe Asp Thr Gin Ser Pro Val 65 70 75 Lys Pro； Tyr Leu Gly Ala Arg Leu ; 80 9) Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Αβπ Val Aep 110 115 120 Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr lie Gly Lya Val Aen 125 130 135 Thr Val Lys 140. w 2.如申請專利範圍第1項之蛋白質或胜脒’其中該等免疫特徵之測定係藉由使用一種凝集分析法、酵素聯結免疫 -4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公«) 520375 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍吸附分析法（ELISA)、免疫沾移分析法、墨點-酵素分析法、表面易接近性分析法或此等分析法之一組合。 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 3·如申請專利範圍第1項之蛋白質或胜肽，其具有一為22 kDa之表觀分子量。 4. 如申請專利範圍第1項之蛋白質或胜肽，其具有一為18 kDa之表觀分子量，且可藉由熱降解而得自一具有一為 22 kDa之表觀分子量的奈瑟氏球菌蛋白質。 5. 如申請專利範圍第1項之蛋白質或胜肽，弟具有下列胺基酸序列，或具有胺基酸殘基1至155之片段： Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala -19 -15 -10 -5 Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala 1 5 10 Hie Ala Lya Ala Ser Ser ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 15 20 25 Arg He Ser Ala GXy Tyr Arg lie Aan Asp Leu Arg Phe Ala Val Aap 30 35 40 45 Tyr Thr Arg Tyr Lye Asn Tyr Lye Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 50 55 60 Tyr Ser lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro €S 70 75 Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Aen Arg Ala 曰er val Θ0 65 90 Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser He Gly Leu Gly 95 100 105 Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Aen Val Άορ Leu Aap 110 115 120 125 Ala Gly Tyx Arg Tyr Asii Tyr lie Gly Lys Val Asn Thr Val I*ye Asn 130 135 140 Val Arg 3er Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe 14S 150 155 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 520375 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之蛋白質或胜肽，其中該物種係為腦膜炎奈瑟氏球菌 meningitidis) 0 7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之蛋白質或胜肽，其中該物種係為淋病奈瑟氏球菌goworrAwae)。 8. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之蛋白質或胜肽，其中該物種係為一種奈瑟氏球菌物種 lactamica 〇 9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之蛋白質或胜肽，其係呈實質上純質的形式。 10. —種DNA序列，其編碼一如申請專利範圍第1至5項中任一項所界定之蛋白質或胜肽。 11. 一種DNA序列，其係選自於下列群中： ⑴ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) :線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210 X 297公釐) 520375 A8 B8 C8 D8

520375 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 TCC ACC GAT TTC λλλ CTT TAG AGC ATC GGC OCQ TCC GCC ATT TAC QAC 412 Ser Thr Aep Phe ；Lye Ιλιι Tyr lie Gly Ala Ser Ala lie Tyr Aep ¢0 6B 70 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) TTC GAC ACC CAA TCQ CCC GTC Λλλ CCG ΤλΤ CTC GGC QCG CQC TTQ AGC 460 Phe Aap Thr Glxi Ser Pro Val Lya Pro Tyr X.9U Qly Ala Arg l»eu ser . * i 75 80 85 CTC AAC CGC QCC TCC GTC OAC TTG GkSC GQC AGC QAC AGC TTC AGC OVA 508 Leu Aon Arg Ala Ser Val Asp Leu Qly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin 90 穸5 100 ACC TCC ATC GGC CTC GQC OTA TTG ACQ GGC GTA AGC ΤΛΤ GCC GT7 ACC Thr Ser lie Gly Leu Oly Val Leu Thr Oly Val Ser Tyr Ala Val Thr 105 110 115 CCQ ΛΧ7 GTC GAT TTG (3ΛΤ GCC GGC TAX： CGC TAG AAC TAC ATC QGC Λλλ 604 Pro λβη Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Λβη Tyr lie Gly Lys 120 125 130 135 OTC AXC ACT GTC λλλ AAC GTC COT TCC GGC 0ΛΛ CTG TCC GTC GGC QTG 6S2 val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val 140 X45 150 CGC GTC AAA TTC TGATATGCQC CTTATTCTGC AAACCGCCC3A GCCTTCGGCG 704 Arg Val hya Phe 155 ατττταττττ ctgccaccgc arctacacaa gccggcggtt ttgtacoata atcccqaatg isa CTGCOGCTTC TGCCGCCCTA TTTTTTQAQQ AATCCOAAAT OTCCAAAACC ATCATCCACA Θ24 ACA 830? GTATCTTGAQ ΰΟλΤΤΟΑλλλ TATTACAATG CAAJUAGAAA λΤΤΤΟλΟΤλΤ AATACGGCAG 60 OATTCTTTAJl CGOATTCTTA ACCATTTTTC TCCCTGACCA TAAAGQAATC AAOAT ATG 110 Met -13 λλλ AAA GCA CTT GCC OCA CTQ ΛΤΤ GCC CTC GCC CTC CCQ GCC QCC GCA 1S6 Lye Lys Ala Leu Ala Ala Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala -15 -10 -5 CTG QCQ QUA GGC GCA TCC GGC TTT TAC OTC CAA GCC OAT QCC GCA CAC 214 Leu Ala Qlu Gly Ala fier Gly Phe Tyr Val Gin Ala Asp Ala Ala Hie 15 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 520375 A8 B8 C8 D8 c) CACCCATCCG TTGccGTcaa QTC CQT TCC GGC QAA CTQ TCC QCC OGC QTA CGC GTC ΛΑΛ TTC TGATATACGC 650 Val Arg Smr Gly Qlu Leu Ser Ala Gly VaX Arg Val Uya Fhe 145 150 15S OTTATTCCaC AAACCGCCGA GCCTTTCGGC GGTTTTGTTT TCCQCCGCCG CAACTACACA 710; TO CCGCCACCAC CATTTAAAGG CWCaCGCQG GTTAACGGCT €0 ICC GGATACCOCT ACGTATCTTG AAGTATTAAA AATATTACGA 120 ATAATAAAGC AGAATTCTTT AACQGATTCT TAACAXTTTT 1B0 ΟΩΜΆΧΊ λτα Αλλ ΑΑλ GCA CTT OCC ΑΟλ CTG 231 Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu -19 -15 申請專利範園 QCC ΑΆλ 6CC TCA AQC TCT ΤΤλ OGT Ala Sex Ser Ser Ii黴u Gly IB 20 ATC TCC GCA GGC TAC CQC ATC AAC lie Ser Ala Gly Tyr Arg He Aon 35 ACS CGC TAC ΑΆλ ΑλΟ ΤΛ7 MX CM Thr Arg ?yr l#ye A«n Tyr Lya Gin SO TAC AGC ATC QGC 6CQ TCC QCC ATT Tyr Ser lie Qly ΛΙα der Ala lie ¢5 70 GTC Λλλ CCG TAT CTC GflC GM CCC Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg 80 85 QAC TTT AAC aac AOC gac AGC ttc λβρ PhA A»n Gly Bcr Λβρ Ser Fhfi 95 ioa GTA TTQ GCQ QGC 6TA AGC TAT GCC Val Leu Ala. Gly Val Ser Tyr Ala 1X5 GCC GGC TAC CQC TAC AAC TAC ATC Ala Gly Tyr Arg Tyr Aen Tyr lie X30 CCGCQTGA1 CAUVGCAGI ICAAAAAGA AAATTT. ITAACTGAC CATAAAl tct gcc λλλ aac ttc agc cca cac 262 Ser Ala bya Gly Phe Ser Pro Arg 25 30 OAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC 310 Asp Leu Urg Pha Ala val λβρ Tyr 40 45 OTC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT 356 Val Pro Ser Thr Aap Phe Lys Leu 55 60 TAC GXC TTC OAC ACC CAA TCC MC 4OS Tyx Λβρ Phe Aep Thr Gin Ser Pro 75 TTQ AQC CTC AAC CGC GCC TCC GTC 454 Leu Ser Leu Aen Arg Ala Ser Val do AGC CAA ACC TCC ACC GOC CTC OGC 502 Ser Gin Thr Ser Thr Gly Leu Gly 105 no OTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT 550 Val Thr Pro λβη Val Λβρ Leu Aap 120 125 QQC AM. GTC MC ACT OTC λλλ λλΤ 59Θ Gly Lye Val λβη Thr V%1 liye Asn 135 140 -9- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X297公釐） 520375 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 ATT GCC CTC GCT CTC CCG GCC GCC OCA CTG GCG CUUL OQC (3CA TCC GK1C 273 He Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Qly -10 -5 15 TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC GCA AAA GCC TCA AGC TCT TTA 327 Phe Tyr Val Gin Ala Λβρ Ala aIa Hie λία Lyo Ala Ser 3er ser Leu 10 15 20 QQT TCT OCC Άλλ GOC TTC AOC CCQ CGC ATC TCC QCA GQC TAG CQC ATC 375 Oly Ser Al4 Lye Gly Phe Ser Pro Arg lie Ser Ala Gly Tyr Arg lie 25 30 35 AAC GAC CTC CQC TTC 6CC GTC GAT TAT MCQ CCC TAX； ΑΛΛ ΑλΟ TAT \AX 423 Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Aap Tyr Thr Arg Tyr Lye Asn Tyr Lye 40 45 50 acc CCA TCC ACC QAT TTC AAA CTT TAC AGC ATC QOC GC6 TCC GCC ATT 471 Ala*Pro Ser Thr λβρ Phe Lya Leu Tyr Ser lie Qly Ala Ser Ala He 55 60 GS TAC QAC TTC GAC ACC CAA TCG CCC GTC AAA CCG TAT CTC OGC GCG COC 519 Tyr Aap Phe Aap Thx Gin Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg 70 7S 60 B5 TTG AQC CTC AAC CGC QCC TCC QTC GAC TTG GGC GQC AGC OAC AGC TTC 5G7 Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Aap Lou Qly Gly 9er λβρ Ser Phe 90 95 100 AGC CAA ACC TCC ACC GGC CTC GGC OTA TTG QCQ GGC OTA AGC TAT GCC 615 Ser Qln Thr Ser Thr Oly Leu aly Val L«u Ala QLy VaX 3er Tyr Ala 105 110 115 OTT ACC CCG AAT GTC GAT TTQ GAT GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC 663 Val Thr Pro Aan Val Asp hen Λβρ Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr He 120 125 130 GQC λλλ GTC AAC ACT flTC AAA AAC GTC CGT TCC QQC GAA CTQ TCC QCC 711 (31y Lye Val Aen Thr Val Lya Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Sar Ala 135 140 145 αατ otq cgc qtc aaa ttc tgatatqcgc CTTArrcTGC axaccgccqa 759 Gly Val Arg Val Lya Phe 150 155 GCCTTCGGCO OTTrrGTTTT CTGCCACCGC AACTACACAA QCCGGCGGTT TTGTACGATA 019 ATCCCGAATQ CTaCGGCTTC TGCCQCCCTA T Θ50; -10. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公發〉 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— •線· 520375 A8B8 C8 D8 申請專利範圍 d) CCCCQCCTTT QCQGTTTTTT CCAAACCGTT TQCAAQTTTC ACCCATCCGC CflCaTOATGC CO CGCCGTTTAA QQQCAACQCQ CGGQTTAACG GATTTQCCOT CQGCAAAGCA GCCQGATQCC 120 GCCGCQTATC TTGAGGCATT GAAAATATTA CGATGCAAAA AQAAAATTTC MTATAATAC 180 QGCAGGATTC TTTAACQQAT TATTAACAAT TTTTCTCCCT QACCATAAAG GAACCAAAAT 240 ATG ΑΆλ ΑΑλ QCA CTT OCC GCA CTG ATT QCC CTC GCA CTC CCG OCC QCC 2flfi Met hys Lys Ala Leu Ala Ala Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala •13 -15 -10 -5 GCA CTG GCQ GM GQC GCA TCC GGC TTT TAC GTC CAA GCC Ala Leu Ala Olu Qly Ala 6er Gly Phe Tyr Val Gin Ala 15 10 CAC GCC AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT GCC AM GQC Hie Ala. Lye Ala ser sex ser Leu Gly Ser Ala Lya Gly 15 20 2S COC ATC TCC QCA GOC TAC CQC ATC AAC GAC CTC CGC TTC Arg lie Ser Λ1^ Gly Tyr Arg He Asn Aep Leu Arg Phe 30 35 40 TAC ACG CQC TJLC AM A2VC TAT AM QCC CCA TCC ACC OKI Tyr Thr Arg Tyr Lye Aen Tyr Lye Ala Pro Ser Tbr Aap 50 55 TAC AQC ATC QGC OCG TCC QTC ATT TAC GAC TTC OAC ACC Tyr a〇r zie QXy Ala ser val He Tyr hap Phe Asp Thr 6S 70 QTC AAA CCG TAT TTC GQC OCG CGC TTG AGC CTC AAC CGC Val Lya Pro Tyr Phe Gly Ala Arg Leu ser Leu Asa Arg bo 85 d〇 CAC TTG GGC OCC AQG OAC AOC TTC MC ΑΑΛ ACC TCC QCC Bis Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Lys Thr Ser Ala 9S 100 105 6TA TTQ GCG QGC GTA AGC TAT OCC 6TT ACC CCG ΑΛΤ GTC Val Leu Ala Cly val 3er Tyr Ala Val Thr Pro Aen Val 110 115 130 QCC GGC TAC CGC TAC ΛλΟ TAC GTC GOC AAA QTC AAC ACT Ala Gly Tyr Arg Tyr Aan Tyr Val Qly Lys Val Aan Thr 130 135 0TC CGT TCC GGC OAX CTC TCC GCC QGC GTG COO QTC Λλλ Val Arg Ser Gly Olu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lya X4S X50 GTTATTCCGC AAACCOCCGA QCCTTCGGCG OTTTTTTQ 0ΛΤ GCC GCA Aap Ala JU.& TTC AQC CCQ Phe Ser Pro GCC GTC QAT Ala Val Asp 45 TTC AAA CTT Phe Lye Leu 60 CAA TCG CCC Gin Ser Pro 75 QCT TCC GCC Ala Ser Ala 336 3B4 432 480 528 57^ GQC CTC GQC 624 Gly Leu Gly GAT TTG GAT 672 λορ Leu Aap 125 QTC AAA AAC 720 val Lys Aen 140 TTC TGATATACGC 772 Phe 1SS B10. (請先閲讀背面之注意事項再_本頁) 、可I

-11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 520375 as B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (ii) 一個完全互補於（i)中所列的任一核苷酸序列之核苷酸序列；以及 (iii) 一個為（i)或（ii)中所列的核苷酸序列之簡併性核苷酸序列。 12. 如申請專利範圍第11項之DNA序列，其係得自於腦膜炎奈瑟氏球菌之DNA 〇 13. 如申請專利範圍第11項之DNA序列，其係得自於腦膜炎奈瑟氏球菌mewhgiiii/以）之DNA 〇 14. 如申請專利範圍第11項之DNA序列，其係得自於一種奈瑟氏球菌物種/aciam/ca之DNA。 15·如申請專利範圍第11項之DNA序列，其具有下列任一者之核苷酸序列：具有DNA序列a)之鹼基143延伸至鹼基667的核苷酸序列；具有DNA序列a)之鹼基200延伸至鹼基667的核苷酸序列；具有DNA序列b)之鹼基116延伸至鹼基643的核苷酸序列；具有DNA序列b)之鹼基173延伸至鹼基643的核苷酸序列；具有DNA序列c)之鹼基208延伸至鹼基732的核苷酸序列；具有DNA序列c)之鹼基265延伸至鹼基732的核苷酸序列； -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格U10X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂| :線丨 52〇375 A8 B8 C8 _ D8· _ 六、申請專利範圍具有DNA序列d)之鹼基241延伸至鹼基765的核苷酸序列；以及具有DNA序列d)之鹼基298延伸至鹼基765的核苷酸序列。 ^ 1δ·—種DNA沣列，其編碼下列胜版中之任一者：一具有由如申請專利範圍第1項中之序列a)的第31 個胺基酸延伸至第55個胺基酸的胜版；一具有由如申請專利範圍第1項中之序列a)的第51 個胺基酸延伸至第86個胺基酸的胜肽；一具有由如申請專利範圍第1項中之序列a)的第 110個胺基酸延伸至第140個胺基酸的胜肽。 17·—種用於腦膜炎或腦膜炎球菌血疾之疫苗接種之藥學組成物，其包含有一如申請專利範圍第1至5項中任一項所界定之蛋白質或胜肽。 18.—種用於腦膜炎或腦膜炎球菌血疾之疫苗接種之藥學組成物，其包含有一如申請專利範圍第6項所界定之蛋白質或胜肽、 19·一種用以測定一含有或被懷疑含有一對於腦膜炎奈瑟氏球菌抗原具專一性之抗體的生物樣品之方法，其包括： a) 從一病人體内分離出該生物樣品； b) 以該生物樣品來培育如申請專利範圍第$項所界定之蛋白質或胜肽，俾以形成一個混合物；及 c) 偵測該混合物内被專一性地結合之蛋白質或胜 ______-13- 本紙張尺度適财家標準Μ規格'' - 520375 A8 B8 C8 __D8 六、申請專利範園狀’這顯示存在有對於腦膜炎奈瑟氏球菌抗原具專一性之抗體。 20. —種用以測定一含有或被懷疑含有一對於腦膜炎奈瑟氏球菌抗原具專一性之抗體的生物樣品之方法，其包括： a) 從一病人體内分離出該生物樣品； b) 以該生物樣品來培育如申請專利範圍第6項所界定之蛋白質或胜肽，俾以形成一個混合物；及 c) 1貞測該混合物内被專一性地結合之蛋白質或胜肷’這顯示存在有對於腦膜炎奈瑟氏球菌抗原具專一性之抗體。 21 · —種用以偵測位在一含有或被懷疑含有致病性奈瑟氏球菌細菌之生物樣品内的致病性奈瑟氏球菌細菌之方法，其包括： a) 從一病人體内分離出該生物樣品； b) 以該生物樣品來培育一個具有如申請專利範圍第 10項之DNA序列的DNA探針，俾以形成一個混合物；及 c) 偵測該混合物内被專一性地結合之DNA探針，這顯示存在有奈瑟氏球菌細菌。 22· —種用以偵測位在一含有或被懷疑含有致病性奈瑟氏球菌細菌之生物樣品内的致病性奈瑟氏球菌細菌之方法，其包括： a)從一病人體内分離出該生物樣品； -___-14-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ •線_ 520375 A8 B8 C8 D8

b) 以該生物樣品來培育一個具有如申請專利範圍第 11項之DNA序列a)、b)、c)或d)中之一者之至少1〇個連續核苷酸的DNA探針，俾以形成一個雜交分子’其中該探針結合至一個奈瑟氏球菌基因標的區域；及 c) 偵測該混合物内被專一性地結合之DNA探針，這顯示存在有奈瑟氏球菌細菌。 23·如申請專利範圍第22項之方法，其中該DNA探針具有該序列a)之一全長或525個鹼基對之編碼區域。 24·如申請專利範圍第22項之方法，其中該DNA探針具有該序列b)之一全長或528個鹼基對之編碼區域。 25.如申請專利範圍第22項之方法，其中該DNA探針具有該序列c)之一全長或525個鹼基對之編碼區域。 26·如申請專利範圍第22項之方法，其中該DNA探針具有該序列d)之一全長或525個鹼基對之編碼區域。 27. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該DNA探針係為一個寡聚物，該寡聚物具有一互補於具有該序列a)之腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白基因的至少6個連續核苷酸之序列。 28. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該DNA探針係為一個寡聚物，該寡聚物具有一互補於具有該序列b)、c)或 d)之腦膜炎奈瑟氏球菌22 kDa表面蛋白基因的至少6個連續核苷酸之序列。 29·如申請專利範圍第27或28項之方法，其進一步包括： __ -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐）請閲面之注意事

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520375 . A8 B8 C8 乂‘ -Γ: D8 '_.___；_ 六、申請專利範爾 a) 提供一組寡聚物，該等寡聚物係為供用於一聚合酶鏈反應法之引子且係位於該標的區域之旁側； b) 經由聚合酶鏈反應法來擴增該標的區域。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、可| :線丨本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 520373^ -f Φΐτ-jr. 90. I：

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