JP2003189879A - 髄膜炎菌（ＮｅｉｓｓｅｒｉａＭｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のプロテイナーゼＫ抵抗性表面蛋白質 - Google Patents

髄膜炎菌（ＮｅｉｓｓｅｒｉａＭｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のプロテイナーゼＫ抵抗性表面蛋白質

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】髄膜炎菌の表面に存在する、高度に保存され
た、免疫学的に結合可能な抗原、髄膜炎病の治療、防止
および診断において有用な、免疫療法的、予防的かつ診
断的な組成物の提供。 【解決手段】髄膜炎菌の表面に存在する、高度に保存さ
れた、免疫学的に結合可能な抗原について開示する。ま
た、髄膜炎病の治療、防止および診断において有用な、
免疫療法的、予防的かつ診断的な組成物および方法につ
いても開示する。さらに、外見上の分子量が22 kDaであ
る、プロテイナーゼK抵抗性の髄膜炎菌表面蛋白質、そ
れに対応する塩基配列および推定アミノ酸配列、髄膜炎
菌の22 kDa表面蛋白質を産生するための組換えDNA技
術、ならびに髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質に結合する抗
体についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、髄膜炎菌の表面に
ある、高度に保存された、免疫学的に結合しうる抗原に
関する。この独特な抗原により、髄膜炎病を治療、防止
または診断する上で有用な、免疫療法的、予防的かつ診
断的な新しい薬剤のための基礎が提供される。より特異
的には、本発明は、外見上の分子量が22 kDaである、プ
ロテイナーゼK抵抗性の髄膜炎菌表面蛋白質、それに対
応する塩基配列および推定アミノ酸配列（配列番号：１
から配列番号：26）、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質を産
生するための組換えDNA技術、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋
白質に結合する抗体、ならびに髄膜炎病を診断、治療ま
たは予防するための方法および組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術分野】髄膜炎菌は、全世界で、死亡および
罹病の主な原因となっている。髄膜炎菌は、主に、髄膜
炎および髄膜炎血症などの、風土病および流行病の原因
となる［Gold, 髄膜炎血症病の進化、p. 69, Vodros N.
A., CRC Press (1987)；Schwartzら、Clin. Microbiol.
Rev., 2, p. S118 (1989)］。実際、この生物は、米国
における細菌性髄膜炎の最も普遍的な原因菌の一つで、
ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Haemophilusinf
luenzae）に次いで多く、すべての病因の約20％を占め
る。血清の殺菌活性が、髄膜炎菌に対する主要な防御機
構であるため、細菌による侵入からの防御は、血清中の
抗髄膜炎菌抗体の存在に相関する［Goldschneiderら、
J. Exp. Med. 129, p. 1307 (1969); Goldschneider
ら、J. Exp. Med. 129, p.1327 (1969)］。
【０００３】髄膜炎菌は、莢膜抗原の存在によって、血
清グループに下位分類される。目下、12の血清グループ
が認知されているが、血清グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｙおよ
びW-135が最も普通に見られる。血清グループの中で、
血清型、サブタイプおよび免疫型は、外膜蛋白質とリポ
多糖によって同定することができる［Fraschら、Rev.In
fect. Dis. 7, p.504 (1985) ］。
【０００４】現在利用できる莢膜多糖ワクチンは、すべ
ての髄膜炎菌株に対して効果的なわけではなく、幼若な
乳児において、防御抗体の産生を効果的には誘導しない
［Frasch , Clin. Microbiol. Rev. 2, p. S134 (198
9); Reingoldら、Lancet, p. 114(1985); Zolliger, in
Woodrow and Levine, 「新世代ワクチン(New generati
on vaccines)」、p.325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (19
90) ］。この生物に対するワクチンにおいて、現在、血
清グループＡ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびW-135の莢膜多糖が用
いられている。これらの多糖ワクチンは、短期間では有
効であるが、ワクチンを投与された患者が、免疫学的記
憶を発達させることがないため、抵抗性の程度を維持す
るためには、３年以内の間隔でワクチンを再接種しなけ
ればならない。
【０００５】さらに、これらの多糖ワクチンは、この病
気の主な犠牲者である、２才未満の幼児において必要と
される防御を行うのに十分な量の殺菌性抗体を誘導しな
い。血清グループＢの菌株は、先進国における髄膜炎菌
病の一次的な原因菌であるが、現在のところ、この生物
に対して効果的なワクチンで利用可能なものはない。実
際、血清グループＢの多糖は、防御効果もなく特異性の
低い、IgMの弱い応答しか誘導しないため、よい免疫原
ではない［Goldschneiderら、J. Exp. Med. 129, p.132
7 (1969); Skevakisら、J. Infect. Dis., 149, p.387
(1984); Zollingerら、J. Clin. Invest., 63, p.836
(1979)］。さらに、非常によく似た、交差反応性の構造
物が、ヒト新生児の脳組織の糖蛋白質の中に存在するた
め［Finneら、Lancet, p.355 (1983)］、血清グループ
Ｂの多糖類の免疫原性を増強しようという試みはうまく
行かないかもしれない。
【０００６】より効果的なワクチンを得るために、リポ
多糖などの別の髄膜炎菌表面抗原、ピリ線毛蛋白質、外
膜に存在する蛋白質が調べられている。これらの蛋白質
性表面抗原のいくつかに対する、ヒトの免疫応答と殺菌
性抗体が、自発的被験者と回復期患者の血清中に存在す
ることが明らかにされた［MandrellおよびZollinger,In
fect. Immun., 57, p. 1590 (1989); Poolmanら、Infec
t. Immun., 40, p.398 (1983);Rosenquistら、J. Clin.
Microbiol., 26, p. 1543 (1988); WedegeおよびFroho
lm, Infect. Immun., 51, p. 571 (1986); Wedegeおよ
びMichaelsen,J. Clin.Microbiol., 25, p.1349 (198
7)］。
【０００７】さらに、クラス１、2/3および５などの、
外膜蛋白質に対して作成されたモノクローナル抗体も、
殺菌性があり、動物では実験的な感染に対して防御効果
があった［Brodeurら、Infect. Immun., 50, p. 510 (1
985); Fraschら、Clin. Invest.Med. 9, p. 101 (198
6); Saukkonenら、Microb. Pathogen., 3, p. 261,(198
7); Saukkonenら、Vaccine, 7, p. 325, (1989)］。
【０００８】髄膜炎菌の外膜蛋白質に基づく抗原調製物
が、動物とヒトの体内で免疫原効果を有することが明ら
かになり、それらのうちのいくつかは、臨床試験で調べ
られてきた［Bjuneら、Lancet, p. 1093 (1991); Costa
ら、NIPH Annals, 14, p. 215(1991); Fraschら、Med.
Trop., 43, p. 177 (1982); Fraschら、Eur.J. Clin.Mi
crobiol., 4, p. 533 (1985); Fraschら、in Robbins,
Bacterial Vaccines,p. 262, Praeger Publications,
N. Y. (1987); Frasch, J. Infect.Dis., 158, p. 710
(1988); Morenoら、Infect. Immun., 47, p. 527 (198
5);Rosenquistら、J. Clin. Microbiol., 26, p. 1543
(1988); Sierraら、NIPH Annals, 14,p. 195 (1991); W
edegeおよびFroholm, Infect. Immun., 51, p.571 (198
6); WedegeおよびMichaelsen, J. Clin. Microbiol., 2
5, p. 1349 (1987);Zollingerら、J. Clin. Invest., 6
3, p. 836 (1979); Zollingerら、NIPH Annals, 14, p.
211 (1991)］。しかし、外膜蛋白質には、菌株間で大
きな抗原多様性があるため、これらをワクチンに用いる
ことには限界がある［Frasch、Clin. Microbiol.Rev.
2, p. S134 (1989)］。実際、これらの調製物の殆ど
が、抗原を抽出したのと同じか、それに関連した血清型
だけに限定される殺菌性抗体を誘導した［Zolliger, in
Woodrow and Levine, New generation vaccines（新世
代ワクチン）,p. 325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (199
0) ］。さらに、幼児において、これらのワクチンによ
って付与される防御力は、まだ、明確に立証されてはい
ない。クラス４のように、高度に保存されている髄膜炎
菌外膜蛋白質［Munkleyら、Microb. Pathogen., 11, p.
447 (1991)］と、リップ（lip）蛋白質（H.8とも呼ば
れる）［Woodsら、Infect. Immun., 55, p. 1927 (198
7)］は、有望なワクチン候補とはいえない。なぜなら、
これらの蛋白質は、殺菌性抗体の産生を誘導しないから
である。これらのワクチン調製物を改良するためには、
すべての髄膜炎菌の菌株の表面に存在し、広域スペクト
ルを有するワクチンを作製するための殺菌性抗体を誘導
できる、高度に保存された蛋白質が必要である。
【０００９】髄膜炎菌の最近の検査室診断は、塗沫調製
物のグラム染色、ラテックス凝集もしくは共同凝集、ま
たは、養分に富んだ選択培地での培養と単離などの技術
を用いて行われる［Morelloら、in Balows, 「臨床微生
物学マニュアル(Manual of Clinical Microbiology)」,
p. 258, 米国微生物学協会(American Society for Mic
robiology), Washington (1991)］。髄膜炎菌の単離株
を同定するためには、通常、炭水化物分解試験が行われ
る。説明されている手順の殆どは、熟練者を必要とす
る、時間のかかる処理過程である。髄膜炎菌の迅速な同
定には、有病率が最も高い血清グループによって発現さ
れている莢膜抗原に対して作製された多価血清を含む、
市販の凝集キットおよび共同凝集キットが用いられる。
しかし、これらの多価血清は、しばしば、別種の細菌と
非特異的に交差反応するため、常に、グラム染色および
培養とともに用いられなければならない。したがって、
このような診断解析法に代わる効果的な方法で、診断の
迅速性と信頼性を向上させる方法が必要とされている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、髄膜炎菌体
の表面にある、高度に保存された、免疫学的に結合しう
る抗原を提供することによって、上記の課題を解決す
る。また、上記の抗原をコードする組換えDNA分子、こ
れらのDNA分子で形質転換された単細胞宿主、および、
実質的に純粋な組換え抗原を作製するための処理方法も
提供される。また、上記髄膜炎菌抗原に特異的な抗体も
提供される。本発明に係る抗原および抗体は、髄膜炎菌
病の検出、予防および治療のための独自の方法と医薬組
成物を提供する。
【００１１】好ましい抗原は、髄膜炎菌の22 kDaの表面
蛋白質であり、その断片、相同体および誘導体も含まれ
る。好ましい抗体は、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質に
特異的なMe-1およびMe-7モノクローナル抗体である。こ
れらの抗体は、髄膜炎菌に対して非常に溶菌性があり、
実験感染に対し、マウスを受動的に防御する。
【００１２】本発明は、さらに、新しい髄膜炎菌表面抗
原と、それに対し特異的な抗体を単離するための方法を
提供する。
【００１３】
【課題を解決する手段】髄膜炎菌の外膜の超構造を研究
する過程で、本発明者らは、非常に変わった性質を有す
る、22 kDaという低分子量の新しい蛋白質を同定した。
この外膜蛋白質は、糸状菌のトリティラキウム・アルバ
ム・リンバー（Tritirachium album limber）に由来す
るセリンプロテイナーゼのプロテイナーゼＫなどの蛋白
質分解酵素による広範な処理に対して強い抵抗性を有す
る。これは非常に驚くべきことである。なぜなら、プロ
テイナーゼＫの効力、至適pH範囲の広さ、およびペプチ
ド結合特異性の低さのために、この酵素に対して抵抗性
を有する蛋白質は、自然界では非常に稀だからである
［Barrett, A.J.およびN.D. Rawlings, Biochem. Soc.
Transactions (1991) 19: 707〜715］。僅かな数の報告
だけが、プロテイナーゼＫの酵素的分解に対して抵抗性
を有する、原核生物起源の蛋白質について説明してい
る。レプトスピラ属（Leptospira）の種［Nicholson,
V.M.およびJ.F. Prescott, Veterinary Microbiol. (19
93) 36: 123〜138］。マイコプラズマ属（Mycoplasma）
の種［Butler, G.H.ら、Infect. Immun. (1991) 59: 10
37〜1042］、スピロプラズマ・ミラム（Spiroplasma mi
rum）［Bastian, F.O.ら、J. Clin.Microbiol. (1987)
25: 2430〜2431］、ならびに、ウイルスおよびプリオン
［Onodera,T.ら、Microbiol. Immunol. (1993) 37: 311
〜316; Prusiner, S.B.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 90: (1993) 2793〜2797］において、プロテイナーゼ
Ｋ抵抗性蛋白質が発見されている。本明細書において、
本発明者らは、髄膜炎菌感染の予防および治療、診断を
改良するための方法として、この蛋白質を利用すること
を説明している。
【００１４】このように、本発明の局面の一つによっ
て、本発明者らは、高度に保存された、免疫学的に結合
しうる髄膜炎菌の表面蛋白質、および、その断片、相同
蛋白質、または誘導蛋白質を提供する。本明細書におい
て用いられるとき、「髄膜炎菌表面蛋白質」とは、天然
に存在する髄膜炎菌遺伝子によってコードされている、
髄膜炎菌の、いずれかの表面蛋白質を意味する。本発明
による髄膜炎菌蛋白質は、天然に生じたものでもよい
し、組換え蛋白質、または、その断片を産生するという
目的をもって、分子生物学を応用して得られたものでも
よい。
【００１５】本明細書で用いるとき、「高度に保存され
た」とは、髄膜炎菌表面蛋白質の遺伝子と、その蛋白質
自体が、既知の髄膜炎菌菌株の50％以上に存在すること
を意味する。好ましくは、遺伝子と、その蛋白質は、既
知の髄膜炎菌菌株の99％以上に存在する。さまざまな髄
膜炎菌の異なった表面蛋白質が、「高度に保存されてい
る」か否かを判定するために、当業者がそれらを試験す
ることができる方法を、実施例２および４に示す。
【００１６】本明細書で用いるとき、「免疫学的に結合
しうる」とは、髄膜炎菌の表面蛋白質が菌体の表面に存
在し、抗体に結合できることを意味する。実施例２に、
「免疫学的に結合しうる」か否かを判定するために、当
業者が、さまざまに異なる髄膜炎菌表面蛋白質を検査し
うる方法を示す。免疫学的な結合可能性は、凝集アッセ
イやELISA法、RIA法、イムノブロッティング法、ドット
・エンザイム法、表面結合アッセイ、電子顕微鏡、また
は、これらのアッセイ法を組み合わせた方法を含む、そ
の他の方法によって判定してもよい。
【００１７】本明細書で用いるとき、髄膜炎菌の表面蛋
白質の「断片」には、少なくとも１個のペプチド・エピ
トープを有するポリペプチド、または、その相同体およ
び誘導体が含まれる。この型のペプチドは、分子生物学
の応用によって作製するか、または従来の液相もしくは
固相ペプチド合成技術を用いて合成することができる。
【００１８】本明細書で用いる、髄膜炎菌の表面蛋白質
の「相同体」には、この蛋白質の全体的な機能性と防御
的特性が保持されるように、天然に存在する配列中のア
ミノ酸残基の１個以上を別のアミノ酸残基で置換した蛋
白質、または、その断片が含まれる。このような相同体
は、組換えDNA技術、例えば、天然に存在する髄膜炎菌
表面蛋白質の突然変異誘発などによって、合成されて作
出される。このような処理手順については、当業におい
てよく知られている。
【００１９】例えば、このような相同体の一つとして、
図10に示した髄膜炎菌株b2に由来する22kDaの蛋白質の
遺伝子から作製される組換え蛋白質が選ばれている。ナ
イセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）から採
取した関連遺伝子を単離して、さらに別の相同体を得る
こともできる。
【００２０】本明細書で用いるとき、髄膜炎菌の表面蛋
白質の「誘導体」とは、ヒトに免疫原性を付与するため
に、例えば、ジニトロフェノールによって、共有結合的
に修飾した蛋白質またはその断片を意味する。また、本
発明に係る誘導体には、本発明に係るアミノ酸の相同体
の誘導体が含まれる。
【００２１】当業者は、本発明の実施例に従い、過度な
実験をせずに、特定の断片、相同体または誘導体が、髄
膜炎菌病の診断、予防または治療に有効であるか否かを
判定できるようになることは明らかであると思われる。
【００２２】また、本発明には、髄膜炎菌の表面蛋白
質、断片、相同体または誘導体を重合させたものも含ま
れる。これらの重合体には、例えば、アビジン/ビオチ
ン、グルタルアルデヒド、ジメチルスベルミデート(dim
ethylsubermidate)などの架橋剤とクロスリンクした１
個以上のポリペプチドが含まれる。また、このような重
合体には、組換えDNA技術によって作製されたポリシス
トロニックなmRNAから産生される、髄膜炎菌の配列で、
直列または逆向きに続く２個以上の連続的な配列を含む
ポリペプチドが含まれる。
【００２３】本発明は、実質的に純粋な髄膜炎菌の表面
蛋白質を提供する。「実質的に純粋な」という語は、本
発明に係る髄膜炎菌表面蛋白質が、髄膜炎菌に由来する
他の蛋白質から分離されていることを意味する。例え
ば、実施例３および11で説明されている実験手順など、
さまざまな常法によって、実質的に純粋な髄膜炎菌の表
面蛋白質の調製物を得ることができる。
【００２４】更なる局面において、本発明は、特に、図
１のアミノ酸配列（配列番号：２）もしくはその断片、
またはその相同体もしくは誘導体のアミノ酸配列を有す
る髄膜炎菌の22kDaの表面蛋白質を提供する。
【００２５】更なる局面において、本発明は、特に、図
８のアミノ酸配列（配列番号：４）および図９のアミノ
酸配列（配列番号：６）もしくはその断片、またはその
相同体もしくは誘導体のアミノ酸配列を有する髄膜炎菌
の22 kDaの表面蛋白質を提供する。このような断片は、
図15に列挙されているペプチド（配列番号：９から26）
から選択してもよい。
【００２６】更なる局面において、本発明は、図10のア
ミノ酸配列（配列番号：２）もしくはその断片、または
その相同体もしくは誘導体の配列を有する淋菌の22 kDa
の表面蛋白質を提供する。上記したところから明らかに
なるように、髄膜炎菌の22 kDaの蛋白質というときに
は、例えば、淋菌、ナイセリア・ラクタミカなどの、他
のナイセリア属の種から単離した遺伝子から単離された
または作製された22 kDaの蛋白質も含まれる。
【００２７】本発明に係る、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋
白質は、さらに、以下の性質の１つ以上によって特徴づ
けられる。 （１）SDS-PAGEゲルで測ると、約22 kDaの分子量を有す
る、（２）還元剤で処理しても、SDS-PAGEゲル上での電
気泳動度が変化しない、（３）等電点（pI）が、約pI８
からpI10の範囲内にある、（４）α-キモトリプシン、
トリプシン、プロテイナーゼＫなどの蛋白質分解酵素に
よる分解に対して強度の抵抗性を有する、（５）過ヨウ
素酸酸化によって、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質に対
して作製された抗体の特異的結合が損なわれない、
（６）高度に保存された抗原である、（７）無処理の髄
膜炎菌体の表面で抗体と結合できる、（８）殺菌性抗体
の産生を誘導できる、（９）実験感染に対し防御するこ
とができる抗体の産生を誘導することができる、（10）
動物宿主に注射すると、髄膜炎菌感染に対し防御できる
ような免疫反応の開始を誘導することができる。
【００２８】本発明は、また、髄膜炎菌の22 kDaの表面
蛋白質をコードするDNA配列（配列番号：１、配列番
号：３、配列番号：５および配列番号：７）を初めて提
供している。本発明の好ましいDNA配列は、（ａ）図１
のDNA配列（配列番号：１）、（ｂ）図８のDNA配列（配
列番号：３）、（ｃ）図９のDNA配列（配列番号：
５）、（ｄ）図10のDNA配列（配列番号：７）、（ｅ）
上記のDNA配列の相同配列または誘導配列、（ｆ）上記
のDNA配列のいずれかと縮重するDNA配列、および、
（ｇ）上記のDNA配列のいずれかの断片からなる群より
選択されたものであるが、ここで、該配列は、髄膜炎菌
22 kDa表面蛋白質の免疫活性を示す産物をコードしてい
る。このような断片は、好ましくは、図15に示されてい
るようなペプチド（配列番号：９から配列番号：26ま
で）である。
【００２９】また、好ましくは、本発明により、髄膜炎
菌の22 kDaの表面蛋白質をコードするDNA配列が初めて
提供される。本発明に係る、より好ましいDNA配列は、
（ａ）図１のDNA配列（配列番号：１）、（ｂ）上記のD
NA配列の相同配列または誘導配列、（ｃ）上記のDNA配
列のいずれかと縮重するDNA配列、および、（ｄ）上記
のDNA配列のいずれかの断片からなる群より選択される
が、ここで、該配列は、髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質の免
疫活性を示す産物をコードしている。
【００３０】髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質の相同体または
誘導体をコードする遺伝子は、実施例４で説明されてい
る条件の下で、22 kDaの表面蛋白質をコードする遺伝子
とハイブリダイズする。
【００３１】本発明の目的にとっては、髄膜炎菌の22 k
Da表面蛋白質の断片、相同体および誘導体が、動物宿主
に注射されたときに、髄膜炎菌感染を防ぐことができる
免疫反応の開始を誘導することができれば、これらは、
髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質の「免疫活性」を有すると
いえる。当業者は、本明細書の実施例６に示されている
手順に従って、特定のDNA配列が、髄膜炎菌の22 kDa表
面蛋白質の免疫活性を示す産物をコードしているか否か
を判定してもよい。
【００３２】本発明に係る髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質
を、以下の段階を含む方法によって単離してもよい。 ａ）髄膜炎菌バクテリアの培養物を分離し、 ｂ）バクテリア培養物から外膜部分を分離し、および、 ｃ）この外膜部分から該抗原を分離すること。 特に、上記の段階（ｃ）は、髄膜炎菌の外膜蛋白質抽出
物をプロテイナーゼＫで処理した後、イオン交換、ゲル
クロマトグラフィーおよび電気泳動など、従来からの単
離技術を用いて、蛋白質分画を行うという付加的な段階
を含む。
【００３３】これに代わるもので、好ましいのは、本明
細書においては実施例３により詳細に説明されているよ
うに、分子生物学的技術を用いて、本発明に係る髄膜炎
菌の表面蛋白質を産生させてもよい。分子生物学的技術
の使用は、実質的に純粋な、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋
白質の組換え蛋白質を調製するのに、特に適している。
【００３４】このように、本発明の更なる局面によっ
て、本発明者らは、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質と、そ
の断片、相同体および誘導体を含む組換え蛋白質を産生
するための過程で、（１）該蛋白質、断片、相同体また
は誘導体をコードするDNA配列と、このDNA配列に機能的
に結合した、１個以上の発現調節配列とを含む組換えDN
A分子で形質転換された単細胞宿主生物を培養すること
と、（２）実質的に純粋な蛋白質、断片、相同体または
誘導体を回収する段階を含む過程を提供する。
【００３５】当業において周知のように、宿主の中で
の、形質転換遺伝子の高い発現レベルを得るためには、
この遺伝子を、選択した発現宿主の中で機能する、転写
および翻訳の発現調節配列に機能的に結合させなければ
ならない。好ましくは、配列調節配列と、目的の遺伝子
とが、さらにバクテリア選抜マーカーと複製開始点とを
含む配列ベクターの中に含まれている。発現宿主が真核
細胞であるときは、さらに、発現ベクターは、発現宿主
で有用な発現マーカーを含んでいなければならない。
【００３６】広い範囲の多様な発現宿主／ベクターの組
み合わせが、本発明に係るDNAを発現させる上で用いら
れうる。真核生物宿主にとって有用な発現ベクターに
は、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウ
イルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現調節配列
を含むベクターが含まれる。バクテリア宿主にとって有
用な発現ベクターには、col E1, pCR1, pBR322, pMB9、
および、それらの誘導体を含む、大腸菌由来のプラスミ
ド、ならびに、RP4など、より宿主範囲が広いプラスミ
ド、また、NM989などのラムダファージの多くの誘導体
などのファージDNA、または、M13および繊維状の単鎖DN
Aファージなど、既知のバクテリアのプラスミドが含ま
れる。酵母細胞にとって有用な発現ベクターには、２ミ
ュー（mu）プラスミドおよびその誘導体が含まれる。昆
虫細胞にとって有用なベクターには、pVL941が含まれ
る。
【００３７】さらに、本発明に係るDNA発現を発現させ
るために、これらのベクターにおいて、広く多様な発現
調節配列のいずれかが用いられうる。このような、有用
な配列調節配列には、上記の発現ベクターの構造遺伝子
と結合した発現調節配列が含まれる。有用な発現調節配
列の実例には、例えば、SV40とアデノウイルスの初期と
後期のプロモーター、lacシステム、trpシステム、TAC
またはTRCシステム、ラムダファージの主要オペレータ
ーとプロモーター領域、fdコート蛋白質の調節領域、3-
ホスホグリセリン酸キナーゼ、その他の糖分解酵素のプ
ロモーター、例えば、Pho5など、酸性ホスファターゼの
プロモーター、酵母のアルファ接合システムのプロモー
ター、原核細胞と真核細胞またはそのウイルスの遺伝子
の発現を調節することが知られているその他の配列、お
よび、これらの配列のさまざまな組み合わせが含まれ
る。大腸菌の中で、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質を発現
させる上では、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質の発現調節
配列が特に有用である（実施例３）。
【００３８】上記のベクターで形質転換した宿主細胞
が、本発明のさらなる局面を形成する。さまざまな単細
胞宿主が、本発明に係るDNA配列を発現させる上で有用
である。これらの宿主には、大腸菌、シュードモナス
（Pseudomonas）、バチルス（Bacillus）、ストレプト
マイセス（Streptomyces）、菌類、酵母、スポドプテラ
フルギペルダ（Spodoptera frugiperda（SF9）)などの
昆虫細胞、CHOおよびマウス細胞などの動物細胞、COS
1、COS7、BSC1、BSC40およびBMT10などのアフリカミド
リザルの細胞、また、組織培養したヒト細胞および植物
細胞が含まれる。好ましい宿主生物には、大腸菌もしく
は枯草菌（Bacillus subtilis）などのバクテリア、お
よび組織培養した哺乳動物細胞が含まれる。
【００３９】すべてのベクターと発現調節配列のすべて
が、本発明のDNA配列を発現させるために、同じように
充分に機能するわけではないことは、当然ながら、理解
されると思われる。また、すべての宿主が、同じ発現シ
ステムで、同じようにうまく機能するわけではない。し
かし、当業者は、過度な実験を行うことなく、また、本
発明の範囲から逸脱することなく、これらのベクター、
発現調節配列、および宿主を選択することができると考
えられる。例えば、ベクターの選択においては、ベクタ
ーを複製させなければならないため、宿主を考慮する必
要がある。ベクターのコピー数、このコピー数を調節す
る能力、または、抗生物質耐性マーカーなど、ベクター
によってコードされているその他の蛋白質の発現につい
ても考慮すべきである。
【００４０】発現調節配列の選択においても、さまざま
な要素を考慮すべきである。これらの要素には、例え
ば、配列の相対的な強度、調節可能性、また、本発明に
係るDNA配列との親和性、特に、二次構造を形成する可
能性が含まれる。単細胞宿主は、選択したベクターとの
親和性、本発明に係るDNA配列がコードする産物の毒
性、分泌特性、蛋白質を正確に組み立てる能力、発酵ま
たは培養要求性、および、本発明に係るDNA配列によっ
てコードされる産物の精製の容易さなどを考慮して選択
すべきである。これらのパラメータの中で、当業者は、
本発明に係るDNA配列を、発酵によって、または、動物
細胞の大規模培養によって発現させる、さまざまなベク
ター／発現調節配列／宿主の組み合わせを選択すること
ができる。
【００４１】本発明に係るDNA配列によってコードされ
るポリペプチドを、さまざまな常法を用いて、発酵物ま
たは細胞培養液から単離して精製することができる。当
業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、最も適切
な単離精製技術を選択することができる。
【００４２】本発明に係る、髄膜炎菌の表面蛋白質は、
髄膜炎菌感染によって起こる病気を予防、治療および診
断するための予防薬、治療薬、または、診断薬組成物に
おいて有用である。
【００４３】本発明に係る、髄膜炎菌の表面蛋白質は、
淋菌またはナイセリア・ラクタミカの感染によって起こ
る病気を予防、治療および診断するための予防薬、治療
薬、または、診断薬組成物において有用である。
【００４４】髄膜炎菌病に対する抗体を作製したり、防
御反応を発生させるためには、本発明による髄膜炎菌の
表面蛋白質が特に適している。
【００４５】淋病またはナイセリア・ラクタミカ病に対
する抗体を作製したり、防御反応を発生させるために
は、本発明による髄膜炎菌の表面蛋白質が特に適してい
る。
【００４６】特に、本発明者らは、免疫原またはワクチ
ンとして使用するために、図１のアミノ酸配列（配列番
号：２）、その断片、相同体または誘導体のアミノ酸配
列を有する髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質を提供する。
【００４７】特に、本発明者らは、免疫原またはワクチ
ンとして使用するために、図１のアミノ酸配列（配列番
号：２）、図８のアミノ酸配列（配列番号：４）、図９
のアミノ酸配列（配列番号：６）、または、図10のアミ
ノ酸配列（配列番号：８）、または、その断片、相同体
もしくは誘導体のアミノ酸配列を有する髄膜炎菌の22kD
a表面蛋白質を提供する。
【００４８】標準的な免疫学的技術において、免疫原ま
たはワクチンとして使用するために、髄膜炎菌の表面蛋
白質が用いられる。特に、モノクローナル抗体および多
価抗髄膜炎菌抗体を作製したり、髄膜炎菌病に対する防
御的な免疫反応の発生を誘導するために、適当な宿主
に、薬学的有効量の髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質を注射す
ることができる。宿主に注射する前に、髄膜炎菌の表面
蛋白質を適当な賦形剤の中に処方することができるた
め、本発明者らは、１個以上の髄膜炎菌の表面抗原また
は、その断片を含む薬学的組成物を提供する。好ましく
は、この抗原は、１種以上の薬学的に許容される補形薬
を一緒に入れた、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質か、その
断片または、その相同体もしくは誘導体である。本明細
書で用いられるとき、「薬学的有効量」とは、髄膜炎菌
感染を治療または予防するのに充分な力価を誘導する、
髄膜炎菌の、１種類以上の表面抗原または、その断片の
用量を意味する。
【００４９】本発明に係る髄膜炎菌の表面蛋白質は、ま
た、髄膜炎菌感染に関する診断試験の基礎を構成する。
いくつかの診断方法が可能である。例えば、本発明は、
髄膜炎菌抗原を含むかまたは含むと思われる生物試料に
おいて、髄膜炎菌抗原を検出するための方法で、 ａ）患者から生物試料を分離すること、 ｂ）抗髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質抗体、または、その断
片を、生物試料とともにインキュベートして、混合液を
作ること、および、 ｃ）髄膜炎菌抗原の存在を示唆する、特異的な結合抗体
または結合断片を、混合液の中で検出することを含む方
法を提供する。上記の診断法において好ましい抗体は、
Me-1およびMe-7である。
【００５０】または、本発明は、髄膜炎菌抗原に特異的
な抗体を含むかまたは含むと思われる生物試料におい
て、該抗体を検出するための方法において、 ａ）患者から生物試料を分離すること、 ｂ）本発明に係る抗髄膜炎菌表面蛋白質抗体、または、
その断片を、生物試料とともにインキュベートして、混
合液を作ること、および、 ｃ）髄膜炎菌抗原に特異的な抗体の存在を示唆する、特
異的な結合抗原または結合断片を、混合液の中で検出す
ることを含む方法を提供する。当業者は、蛋白質に特異
的な抗体が生物の中に存在しているか否かを、主に判定
するために、この診断試験が、固相酵素免疫測定法（EL
ISA）、放射性免疫測定法、またはラテックス凝集測定
法などの免疫学的試験を含む、いくつかの形を取りうる
ことが分かると思われる。
【００５１】また、本発明に係るDNA配列を、病原性の
ナイセリア菌を有すると思われる生物試料の中に、この
菌が存在することを検出するのに使用するDNAプローブ
を設計するために用いてもよい。本発明に係る検出方法
は、 ａ）患者から生物試料を分離する段階、 ｂ）本発明に係るDNA配列を有するDNAプローブを、生物
試料とともにインキュベートして混合液を作る段階、お
よび、 ｃ）ナイセリア菌が存在することを示唆する、特異的な
結合DNAプローブを、混合液の中で検出する段階を含
む。 好ましいDNAプローブは、図１（配列番号：１）、図８
（配列番号：３）、図９（配列番号：５）、もしくは図
10（配列番号：７）の塩基対配列、または、図11の保存
配列（配列番号：２９）を有する。より好ましいDNAプ
ローブには、図１（配列番号：１）の525塩基対の配列
が含まれる。
【００５２】本発明に係るDNAプローブは、髄膜炎菌感
染を診断する方法として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反
応を用いて、試料中に髄膜炎菌の核酸が広がっているこ
とを検出するためにも用いることができる。プローブ
は、従来の技術を用いて合成され、固相に固定したり、
検出可能な標識で標識付けしてもよい。
【００５３】このような応用において好ましいDNAプロ
ーブは、髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質遺伝子の、図１（配
列番号：１）、図８（配列番号：３）、図９（配列番
号：５）、もしくは図10（配列番号：７）の塩基対配
列、または、図11の保存配列（配列番号：２９）の少な
くとも約６個以上連続した塩基に相補的な配列を有する
オリゴマーである。
【００５４】このような応用において、より好ましいDN
Aプローブは、図１（配列番号：１）の、髄膜炎菌22 kD
a表面蛋白質遺伝子の、少なくとも約６個以上連続した
塩基に相補的な配列を有するオリゴマーである。
【００５５】患者の中で、髄膜炎菌を検出するための、
別の診断方法は、 ａ）本発明に係る抗体またはその断片を、検出可能な標
識で標識付けする段階、 ｂ）標識した抗体または標識した断片を患者に投与する
段階、および、 ｃ）ナイセリア菌が存在することを示唆する、特異的に
結合する標識抗体または標識断片を、患者の体内で検出
する段階を含む。
【００５６】抗髄膜炎菌表面蛋白質抗体のいずれを精製
するためにも、親和性媒体に、固定化した髄膜炎菌の表
面蛋白質を用いたアフィニティー・クロマトグラフィー
を行なってもよい。
【００５７】このように、本発明の別の局面により、本
発明者らは、図１（配列番号：２）、図８（配列番号：
４）、図９（配列番号：６）、もしくは図10（配列番
号：８）の配列を含むアミノ酸配列もしくはその一部、
またはその相同配列を有する不溶性の支持体に共有結合
した髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質を提供する。
【００５８】このように、本発明の別の局面により、本
発明者らは、図１（配列番号：２）の配列を含むアミノ
酸配列、またはその一部もしくはその相同配列を有する
不溶性の支持体に共有結合した髄膜炎菌の22 kDaの表面
蛋白質を提供する。
【００５９】本発明のさらに別の特徴は、本発明に係る
髄膜炎菌の表面蛋白質を、髄膜炎菌感染の診断と、特に
治療のための特異的な抗体を産生するための免疫原とし
て用いることである。適当なスクリーニング法を用い
て、例えば、試験モデルにおける髄膜炎菌感染に対す
る、特定の抗体の受動的な防御能力を測定することによ
って、適切な抗体が決定されうる。動物モデルの実例の
一つが、本明細書の実施例において説明されている。抗
体は、全抗体であってもよいし、抗原に結合する抗体の
断片であってもよく、一般的には、免疫グロブリンのい
ずれかのクラスに属する。抗体または断片は、動物に由
来するもので、特異的には、哺乳動物由来で、より特異
的には、マウス、ラット、または、ヒトに由来するもの
である。それは、天然の抗体またはその断片であり、必
要に応じて、組換え抗体または抗体断片であってもよ
い。組換え抗体または抗体断片という語は、分子生物学
的な技術を用いて産生された抗体または抗体断片を意味
する。抗体または抗体断片は、ポリクローナル抗体であ
ってもよいが、選択すべきは、モノクローナル抗体に由
来するものである。それは、髄膜炎菌の表面蛋白質に関
連した、いくつかのエピトープに特異的であるが、好ま
しくは、一つのエピトープに特異的なものである。好ま
しくは、抗体およびその断片は、髄膜炎菌の22 kDa表面
蛋白質に関する、１個以上のエピトープに特異的なもの
である。本明細書において説明されているモノクローナ
ル抗体Me-1およびMe-7も好ましい。
【００６０】
【実施例】本発明をよりよく理解するために、以下の実
施例を示す。これらの実施例は、例示のためだけのもの
であり、いかなる態様においても、本発明の範囲を制限
するものと解釈されるべきではない。実施例１は、髄膜
炎菌の外膜調製物を、蛋白質分解酵素で処理し、その
後、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質を同定することを説
明している。実施例２は、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体調製物の説明をしてい
る。実施例３は、髄膜炎菌の組換え22 kDa表面蛋白質の
調製物の説明をしている。実施例４は、髄膜炎菌の22 k
Da表面蛋白質を発現している生物を同定するためのDNA
プローブの使用について説明している。実施例５は、髄
膜炎菌感染からマウスを守るための抗髄膜炎菌22 kDa表
面蛋白質のモノクローナル抗体の使用について説明して
いる。実施例６は、髄膜炎菌感染に対する防御反応を誘
導するために、精製された組換え22kDa表面蛋白質を使
用することを説明している。実施例７は、22 kDaの蛋白
質の配列を同定することと、髄膜炎菌の別の菌株（MCH8
8とz4063）および淋菌の一つの菌株で、この蛋白質をコ
ードする遺伝子を同定することとを説明している。実施
例８は、22 kDaの、髄膜炎菌の表面蛋白質に対する、ウ
サギとサルの免疫反応について説明している。実施例９
は、22 kDaの髄膜炎菌表面蛋白質の、異なる免疫エピト
ープをマップするために用いた処理法について説明して
いる。実施例10は、22 kDaの表面蛋白質を大規模に生産
するため、熱によって、発現ベクターを誘導することを
説明している。実施例11は、組換え技術によって産生さ
れたとき、22 kDaの表面蛋白質の精製方法について説明
している。実施例12は、22 kDaの表面蛋白質を、ヒトの
ワクチンとして利用することを説明している。
【００６１】実施例１ 蛋白質分解酵素で髄膜炎菌の外
膜調製物を処理し、その後、酵素抵抗性の、髄膜炎菌の
22 kDaの表面蛋白質を同定すること 全細胞、塩化リチウム抽出物、または、サルコシル抽出
物由来の、いくつかの抗原調製物が、髄膜炎菌の外膜の
超構造を調べるために用いられた。グラム陰性菌の外膜
は、外部環境と細胞内部との間にある中間面であり、宿
主の免疫防御に自由に曝される抗原の殆どを含む。本研
究の主要目的は、髄膜炎菌に対する防御反応を誘導する
ことができる新しい抗原を同定することであった。この
ような抗原を同定するために、本発明者らによって用い
られた研究方法は、上記の抗原調製物を、蛋白質分解酵
素で部分的に分解することであった。そして、酵素処理
によって生じた抗原決定基を、その後、これらの処理済
み抗原調製物の免疫学的な防御特性を解析することによ
って同定することができた。驚いたことに、本発明者ら
は、髄膜炎菌の外膜のリチウム抽出物を電気泳動で分離
した後、クマシーブリリアントブルーR-250で染色され
た低分子量のバンドを１本観察した。クマシーブルー
は、蛋白質およびペプチドを染色するために用いられ、
これも外膜の主要構成物である多糖類または脂質に対し
ては全く親和性がないか、僅かな親和性しかない。この
低分子量抗原がクマシーブルーで染色されたという事実
は、少なくともその一部が、蛋白質分解酵素では分解さ
れないポリペプチド、または、別の表面構造によって、
酵素の作用から守られているポリペプチドから出来てい
ることを示唆している。さらに、後述されるように、非
常に強力な酵素であるプロテイナーゼＫは、大量の酵素
で処理しても、この低分子量抗原を分解しなかった。
【００６２】髄膜炎菌の異なった菌株から外膜調製物を
得るために、塩化リチウム抽出物が用いられ、本発明者
らが以前説明していた［Brodeurら、Infect. Immun., 5
0, p. 510 (1985)］ようにして塩化リチウム抽出を行な
った。膜分画に適合させたローリー法［Lowryら、J. Bi
ol. Chem. 193, p.265 (1951)］によって、これらの調
製物の蛋白質含有量を判定した。髄膜炎菌菌株608B（B:
2a:P1.2）に由来する外膜調製物を、ウシ膵臓由来のα-
キモトリプシン（E.C. 3.4.21.1）（Sigma社）か、ウシ
膵臓由来の１型トリプシン（E.C. 3.4.21.4）（Sigma
社）で、連続的に振とうしながら、37℃で24時間処理し
た。酵素の濃度は、処理される蛋白質1mg当たり2 mgと
なるように調整した。また、同じ外膜調製物を、トリテ
ィラキウム・アルバム・リンバー（Tritirachium album
limber）に由来するプロテイナーゼＫ（Sigma社または
ベーリンガー・マンハイム社、カナダ国ラヴァル）（E.
C. 3.4.21.14）で、酵素の濃度を変えて処理した。プロ
テイナーゼＫによる蛋白質の分解を促進させるため、異
なった実験条件を用いた。試料は、１時間、２時間、24
時間または48時間、37℃または56℃で、振とうするか、
しないかにしてインキュベートした。混合試料のpHは、
pH 7.2またはpH 9.0に調整した。一定の試料には、１％
（容量／容量）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）も加
えた。処理直後に、ミニプロテーンII（MiniProteanI
I）（バイオラド社、カナダ国オンタリオ州ミシソー
ガ）を、製造業者の指示に従って用いて、14％（重量／
容量）ゲルでSDS-PAGE電気泳動して、試料を解析した。
蛋白質は、2-メルカプトエタノールとSDSとともに、５
分間、100℃に加熱し、14％SDSゲルで分離して、クマシ
ー・ブリリアント・ブルーR-250で染色した。
【００６３】図２は、髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.2）に
由来する外膜調製物中に存在する蛋白質を、α-キモト
リプシンおよびトリプシンで24時間、37℃で処理したも
のの、14％SDS-PAGEゲルにおける電気泳動プロフィール
を示している。無処理の対照（図２、レーン２）と比較
すると、処理した試料（図２、レーン３と４）では、高
分子量蛋白質と主要な外膜蛋白質の広範な蛋白質分解を
見ることができる。これに対して、外見上22 kDaの分子
量を有する蛋白質のバンドは、２つの酵素のいずれで24
時間処理しても、変化しなかった。
【００６４】プロテイナーゼＫによる、より強力な分解
処理を用いて、この珍しい蛋白質について、さらに調査
した（図３）。プロテイナーゼＫは、ペプチド結合特異
性が低く、至適pH範囲が広いため、最も強力な蛋白質分
解酵素一つである。驚いたことに、この22 kDaの蛋白質
は、２国際単位（IU）のプロテイナーゼＫによる、24時
間56℃の消化に対しても抵抗性であった（図３、レーン
２）。この処理は、本発明者らの実験室で、蛋白質を殆
ど含まないリポ多糖またはDNAを作製するときに、しば
しば用いられる。実際、このように強力な蛋白質分解処
理を外膜調製物に行うと、小さなポリペプチドだけが見
られようになる。さらに、処理時間を48時間まで延ば
し、酵素濃度を上げて（24IUまで）も、22kDaの蛋白質
の量は変化しなかった。反応混合液のpHをpH 9.0まで上
昇させても、強力な蛋白質変性剤である1％SDSを加えて
も、SDS-PAGEゲル上での22 kDaの蛋白質の量と移動度は
変化しなかった（図３、レーン３、レーン４、６、
８）。これら２つの変性条件を組み合わせて用いると、
通常は、外膜調製物中に存在する蛋白質は完全に分解さ
れて、アミノ酸残基だけになるはずである。分解物中に
は、低分子量のポリペプチドがしばしば観察されたが、
これらは、酵素処理の過程で充分に分解されなかった感
受性蛋白質の断片であると考えられた。これらの断片
は、外膜に存在する糖と脂質によって、さらに分解され
ることから保護された可能性が最も高い。処理した試料
に現れる、外見上28 kDaと34 kDaの分子量を有する蛋白
質のバンドは、それぞれ、残存酵素と調べた酵素調製物
のすべてに混入していた蛋白質である。
【００６５】興味深いことに、プロテイナーゼに対する
22 kDaの蛋白質の抵抗性に関するこの研究によって、外
見上18 kDaの分子量のものも、酵素分解に対して抵抗性
に見える（図３ａ）。アフィニティー精製した組換え22
kDa蛋白質を、SDS-PAGEゲルでの電気泳動プロフィール
解析したとき（図３ｂ）に、この18 kDaの蛋白質のバン
ドに関する糸口が得られた。18 kDaのバンドは、アフィ
ニティー精製した組換え22 kDa蛋白質を、ゲルにのせる
前に、界面活性剤SDSを含むサンプルバッファーに入れ
て、時間を延長して加熱したときにだけ現れた。エドマ
ン（Edman）分解を用いたアミノ酸のＮ末端解析（実施
例３）によって、18 kDaのバンドで同定されたアミノ酸
残基（E-G-A-S-G-F-Y-V-Q）が、アミノ酸1-9（配列番
号：１）に対応することが明らかに示された。この結果
は、SDS-PAGEゲルに現れる18 kDaと22 kDaのバンドは、
実は、同じ蛋白質に由来することを示している。この最
後の結果は、また、18 kDaの成熟蛋白質からリーダー配
列が切り出されることを示している。この外見上の分子
量の変化を説明する分子修飾を確認し、この蛋白質の抗
原性と防御特性に与える影響を評価するための実験をさ
らに行なうつもりである。
【００６６】結論として、蛋白質分解消化に対し抵抗性
を示すという非常に珍しい性質を有する、髄膜炎菌の外
膜蛋白質を発見したことによって、この蛋白質の分子的
性質と免疫学的性質をさらに調べる必要が出てきた。実
施例３で、大腸菌によって産生された精製組換え22 kDa
表面蛋白質も、プロテイナーゼＫによる分解に対して高
度に抵抗性である。本発明者らは、現在、この蛋白質分
解酵素に対する並外れた抵抗性を髄膜炎菌の22 kDa表面
蛋白質に付与しているメカニズムを解明しようとしてい
るところである。
【００６７】実施例２ 22 kDaの髄膜炎菌表面蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体の作製 本明細書で説明されているモノクローナル抗体を、３回
の独立した融合実験から得た。それぞれ血清グループ
Ａ、ＢおよびＣに属する髄膜炎菌菌株604A、606Bおよび
2241Cから採取した外膜調製物で、メスのBalb/cマウス
（チャールスリバー研究所、カナダ国ケベック州サンコ
ンスタン）を免疫した。これらの外膜調製物を得るため
に、本発明者らが以前説明したところ［Brodeurら、Inf
ect. Immun. 50, p.510 (1985)］に従って、塩化リチウ
ム抽出を行なった。膜画分に適合させたローリー法［Lo
wryら、J. Biol. Chem. 193, p. 265 (1951)］によっ
て、これらの調製物の蛋白質含量を判定した。マウスの
グループに、３週間の間隔で、上記の外膜調製物を異な
った組み合わせで10 mgずつ、腹腔内または皮下から２
回注射した。マウスグループによって、免疫するのに用
いられたアジュバントは、フロイントの完全アジュバン
トか不完全アジュバント（Gibco Laboratories,Grand I
sland, N.Y.）、または、QuilA（Dedarlane Laboratori
es, Hornby, Ont., Canada）であった。融合処理を行う
３日前に、免疫されたマウスに、上記の外膜調製物の一
つを最後に10 mg静脈注射した。望ましいモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を作製するため
に用いられた融合プロトコールは、以前、本発明者らが
説明している［Hamelら、J. Med. Microbiol., 25, p.2
434 (1987)］。以前、報告されたELISA法［Martinら、
J. Clin. Microbiol., 28,p. 1720 (1990)］によって、
モノクローナル抗体Me-1、Me-2、Me-3、Me-5、Me-6およ
びMe-7の分類、下位分類および軽鎖型を判定し、結果を
表１に示す。
【００６８】本発明者らが以前説明した方法［Martin
ら、Eur. J. Immunol. 18, p.601 (1988)］に次の修正
を加えたウェスタン・免疫ブロッティングを用いて、モ
ノクローナル抗体の特異性を明らかにした。髄膜炎菌の
異なる菌株から得た外膜調製物を、14％SDS-PAGEゲルで
解析した。蛋白質は、セミドライ装置（Biorad社）を用
いて、ゲルからニトロセルロース膜に移した。25 mMの
トリス塩酸、192 mMのグリシンと20％（容量／容量）メ
タノール、pH 8.3を成分とする電気ブロットバッファー
に入れて、ゲル１枚（6X10 cm）当たり60 mAの電流を10
分間流した。ウェスタン免疫ブロッティング実験によっ
て、モノクローナル抗体Me-1、Me-2、Me-3、Me-5、Me-6
およびMe-7が、髄膜炎菌の22 kDaの蛋白質の特異的なエ
ピトープを認識したことが明らかになった（図４Ａ）。
SDS-PAGEゲルと、これに対応するウェスタン免疫ブロッ
ティングの解析によっても、この蛋白質の外見上の分子
量は、菌株の違いによって変化しないことが示された。
しかし、外膜調製物中に存在する蛋白質の量は菌株毎に
異なり、菌株の血清グループとの関連はなかった。しか
も、蛋白質1 mgあたり2 IUのプロテイナーゼＫで外膜調
製物を処理した後でも、これらのモノクローナル抗体
は、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質上のエピトープを認識
した（実施例１で説明された処理、前掲）（図４Ｂ）。
興味深いことに、酵素消化した後もエピトープは無傷の
ままであったことから、これらが膜調製物中で、抗体と
結合可能であっても、酵素処理によって分解さないこと
が確認された。この後者の結果は、観察されたプロテイ
ナーゼＫ抵抗性が、酵素の蛋白質への結合を妨害するよ
うな表面構造または、膜の中に蛋白質を深く包埋して保
護することには関係している可能性がないことを示して
いる。図４には示さなかったが、Me-1に関する免疫ブロ
ットの結果も、他の５つのモノクローナル抗体について
の結果と一致していた。
【００６９】髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質の部分的な
特徴を調べ、その他の既知の髄膜炎菌の表面蛋白質と区
別するために、一連の実験を行なった。外膜調製物を電
気泳動用サンプル・バッファー中で、2-メルカプトエタ
ノールを入れたり、入れなかったりして、100℃で５分
間加熱するか、37℃もしくは56℃で30分間加熱しても、
髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質のSDS-PAGEゲルでの外見
上の分子量に変化がないことが分かった。これは、外膜
に存在するとき、22 kDa表面蛋白質の移動度は、熱また
は2-メルカプトエタノールでは変更されないことを示し
ていた。
【００７０】過ヨウ素酸ナトリウム酸化を用いて、モノ
クローナル抗体が、髄膜炎菌から抽出した外膜調製物に
存在する糖エピトープと反応するか否かを判定した。こ
の実験を行うために用いられた方法は、以前、本発明者
らが説明している［Martinら、Infect. Immun., 60, p
p. 2718〜2725 (1992)］。外膜調製物を100 mMの過ヨウ
素酸ナトリウムで、室温で１時間処理しても、髄膜炎菌
の22 kDaの表面蛋白質に対するモノクローナル抗体の反
応性に変化はなかった。この処理によって、通常、糖特
異的な抗体の結合は失われる。
【００７１】モノクローナル抗体2-1-CA2（ワシントン
D.C.にあるウォルターリード陸軍研究所のBhattacharje
e博士によって提供された）は、すべての病原性髄膜炎
菌種に共通の表面抗原であるlip蛋白質（H.8とも呼ばれ
る）に特異的である。このモノクローナル抗体の、外膜
調製物との反応性を、モノクローナル抗体Me-5の反応性
と比較した。モノクローナル抗体Me-5は、22 kDaの蛋白
質バンドと反応したのに対し、lip特異的なモノクロー
ナル抗体は、外見上30 kDaの分子量を有する蛋白質バン
ドと反応した。この結果は、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋
白質と、もう一つの高度に保存された蛋白質であるlip
蛋白質との間には、何の関係もないことを示している。
【００７２】本来の髄膜炎菌の細菌細胞の表面における
22 kDa蛋白質の露出を明らかにするために、本発明者ら
が以前説明したところ［Proulxら、Infect. Immun.. 5
9, p.963 (1991)］にしたがって、放射性免疫測定法を
行なった。この測定を行うために、６時間および18時間
培養した菌液を用いた。６種類のモノクローナル抗体
が、９種の髄膜炎菌株（菌株の血清グループを、図５の
括弧の中に示す）、２種の淋菌株（「NG」）、２種のモ
ラクセラ・カタリス（Moraxella catarrhalis）菌株
（「MC」）、および、２種のナイセリア・ラクタミカ菌
株（「NL」）と反応した。放射性免疫測定法によって、
モノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、
異なった血清型および血清グループの髄膜炎菌で無処理
の単離菌株の表面に露出していて、蛋白質分解酵素とも
接触可能であることが確認された（図５）。これらのモ
ノクローナル抗体は、調査したすべての髄膜炎菌株の表
面にあるエピトープに強く結合した。記録された結合値
は（3,000CPMから35,000 CPM）は、菌株によって異な
り、また、バクテリアの生理学的状態によっても異なっ
ていた。ヘモフィルス・インフルエンザ菌のポーリン特
異的モノクローナル抗体を、陰性対照として用いた。50
0 CPMより低いカウントが得られたので、その後、各結
合値から引き算した。図５に示されたMe-5とMe-7につい
ての結果は、モノクローナル抗体Me-1、Me-2、Me-3およ
びMe-6で得られた結果を代表するものである。調査した
他の細菌の菌株に関して、Me-7について示された結合活
性は、同じ細菌株を認識したモノクローナル抗体に関し
て得られた結合活性を代表するものである。
【００７３】モノクローナル抗体によって認識される、
エピトープの抗原保存性も評価された。多数のバクテリ
ア菌株に対して、モノクローナル抗体を迅速にスクリー
ニングするために、ドット酵素免疫測定法を用いた。本
発明者らが以前説明したところ［Lussierら、J. Immuno
assay, 10, p.373 (1989)］にしたがって、この測定法
を行なった。この研究には、71の髄膜炎菌が用いられ
た。サンプルには、血清グループＡの菌株が19菌株、血
清グループＢの菌株が23菌株、血清グループＣの菌株が
13菌株、血清グループ29Eの菌株が１菌株、血清グルー
プW-135の菌株が６菌株、血清グループＸの菌株が１菌
株、血清グループＹの菌株が２菌株、血清グループＺの
菌株が２菌株、そして、血清グループに分けられない菌
株（「NS」）が４菌株含まれていた。これらの菌株は、
トリニダードのポートオブスペインにあるカリブ疫学セ
ンター（Caribbean Epidemiology）；カナダ、オタワに
ある東オンタリオ子供病院（Children's Hospital of E
astern Ontario）；カナダ、レジナにあるサスカチェワ
ン厚生部（Department of Saskatchewan Health）；カ
ナダ、モントリオールにあるセントパブリックラボラト
リー（Laboratoire de Sante Publique du Quebec）；
ドイツ連邦、ベルリンにあるマックスプランク分子遺伝
学研究所（Max-Planck Institute fur Molekulare Gene
tik）；カナダ、モントリオールにあるモントリオール
子供病院（Montreal ChildrenHospital）；カナダ、ハ
リファックスにあるビクトリア総合病院（Victoria Gen
eralHospital）；および、本発明者ら自身が収集した菌
株から入手した。次の細菌種も調べた。淋菌16菌株、ナ
イセリア・シネレア（Neisseria cinerea）４菌株、ナ
イセリア・ラクタミカ５菌株、ナイセリア・フラバ（Ne
isseria flava）１菌株、ナイセリア・フラバセンス（N
eisseria flavescens）１菌株、ナイセリア・ムコサ（N
eisseria micosa）３菌株、ナイセリア・パーフラバ／
シッカ（Neisseria perflava/sicca）４菌株、ナイセリ
ア・パーフラバ（Neisseria perflava）４菌株、ナイセ
リア・シッカ（Neisseria sicca）１菌株、ナイセリア
・サブフラバ（Neisseria subflava）１菌株、および、
モラクセラ・カタリス５菌株、アルカリゲネス・フェカ
リス（Alcaligenes feacalis）（ATCC 8750）１菌株、
シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundi
i）（ATCC 2080）１菌株、エドワードシエラ・タルダ
（Edwardsiella tarda）（ATCC 15947）１菌株、エンテ
ロバクター・クロアセア（Enterobacter cloacea）（AT
CC 23355）１菌株、エンテロバクター・アエロゲネス
（Enterobacter aerogenes）（ATCC 13048）１菌株、大
腸菌１菌株、フラボバクテリウム・オドラタム（Flavob
acterium odoratum）１菌株、ｂ型ヘモフィルス・イン
フルエンザ（イーガン（Eagan）株）１菌株、肺炎杆菌
（Klebsiella pneumoniae ）（ATCC 13883）１菌株、プ
ロテウス・レットゲリ（Proteus rettgeri）（ATCC 259
32）１菌株、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgar
is）（ATCC 13315）１菌株、シュードモナス・アエルギ
ノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（ATCC 9027）１菌
株、ネズミチフス菌（Salmonellatyphimurium）（ATCC
14028）１菌株、霊菌（Serratia marcescens）（ATCC 8
100）１菌株、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexner
i）（ATCC 12022）１菌株、ソネ赤痢菌（Shigella sonn
ei）（ATCC 9290）１菌株。これらは、米国培養細胞コ
レクション（American Type Culture Collection）か
ら、またはカナダ、オタワにある疾病防御研究センター
（Laboratory Center for Disease Control）が保存し
ているコレクションから入手した。モノクローナル抗体
と、最も関連のあるナイセリア菌株との反応を表１に示
す。モノクローナル抗体の一つ、Me-7は、調査した髄膜
炎菌の71菌株の100％で、それに特異的なエピトープを
認識した。このモノクローナル抗体は、Me-2、Me-3、Me
-5、およびMe-6と同様に、他のナイセリア属の種に属す
る一定の菌株とも反応したが、これは、これらの特異的
なエピトープが、近縁のナイセリア属によっても発現さ
れていることを示している。ナイセリア・ラクタミカの
１菌株と僅かに反応したことを除いけば、モノクローナ
ル抗体Me-1は、髄膜炎菌の菌株としか反応しなかった。
さらに、別のサンプルである髄膜炎菌の単離株177株を
用いて、Me-1を試験したところ、試験に用いた全髄膜炎
菌株の99％以上を正確に認識することができた。表１に
示したナイセリア菌株の他は、別のバクテリア種で上記
したいずれの菌株とも反応しなかった。
【００７４】結論として、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白
質と、特異的に反応した６種類の抗体が本発明者らによ
って作製された。これらのモノクローナル抗体を用い
て、本発明者らは、それらの特異的なエピトープが、
１）髄膜炎菌の外膜に存在する、プロテイナーゼＫに抵
抗性の22 kDaの蛋白質に局在し、２）髄膜炎菌の単離株
間で保存されており、３）本来の髄膜炎菌の表面に露出
していて、抗体と結合することができ、さらに、４）こ
れらの抗体の、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質との反応
性は、過ヨウ素酸ナトリウムで処理しても変化しなかっ
たが、このことは、これらの特異的エピトープが、糖の
上には局在していないことを示唆している。
【００７５】本発明者らは、髄膜炎菌の22 kDa蛋白質の
移動度は、厳密度の高い条件下で加熱すると、外見上約
18 kDaの分子量のところに動くことを発見したが、2-メ
ルカプトエタノール処理によっては、移動度に変化がな
いことを観察した。
【００７６】本発明者らは、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋
白質が、髄膜炎菌の外膜に存在する別の低分子量蛋白質
で、高度に保存された蛋白質であるlip蛋白質とは、抗
原類似性をもっていないことも明らかにした。
【００７７】実施例３で示すように、これらのモノクロ
ーナル抗体は、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質をコード
している遺伝子を有するプラスミドベクターpNP2202
で、大腸菌株BL21（DE3）を形質転換して産生された、
組換え22 kDa表面蛋白質を精製したものとも反応した。
【００７８】
【表１】 -血清グループに属さない菌株
【００７９】実施例３ 髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質
の分子クローニング、遺伝子の配列決定、高発現および
精製 Ａ．分子クローニング 製造業者（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）
の推奨するところに従って、髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.
2）に由来するLambdaGEM-11ゲノミックライブラリーを
構築した。簡単にいうと、608B菌株のゲノムDNAをSau3A
で部分消化し、LambdaGEM-11のアームのBamHI部位にラ
イゲーションする前に、9 Kbから23 Kbの大きさの断片
をアガロースゲルで精製した。この結果できた組換えフ
ァージを用いて、大腸菌の菌株LE392（プロメガ社）を
形質転換して、次に、LB寒天培地で培養した。髄膜炎菌
の22 kDa表面蛋白質に特異的な、実施例２のモノクロー
ナル抗体によって、以下のプロトコールを用いて、ライ
ブラリーの免疫スクリーニングをして、19個の陽性プラ
ークを同定した。トップアガーを固まらせるために、-2
0℃で15分間プレートをインキュベートした。組換えウ
イルスクローンによって産生された蛋白質を吸着させる
ために、プレートの表面にニトロセルロースフィルター
をゆっくりと載せて、４℃に30分間置いた。そして、PB
S-Tween 0.02%（容量／容量）で洗浄し、以前に説明し
たところ［Lussierら、J. Immunoassay,10, p.373 (198
9)］にしたがって免疫ブロットを行なった。増幅してDN
A精製した後、サブクローニング実験のために、クロー
ン８と名付けた、13 Kbの挿入配列を有するウイルスク
ローンを１個選んだ。このクローンをSacIで消化したと
ころ、5 Kbと8 Kbの断片が得られた。これらの断片をア
ガロースゲルで精製して、低コピー数プラスミドpWKS30
のSacI制限酵素部位の中にライゲイションした［Wangお
よびKusher, Gene, 100, p. 195 (1991)］。組換えプラ
スミドを用い、製造業者の推奨するところにしたがっ
て、エレクトロポレーション（バイオラド社、カナダ、
オンタリオ州ミシソーガ）によって、大腸菌株JM109
（プロメガ社）を形質転換した。そして、この結果でき
たコロニーを、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質特異的な、
実施例２のモノクローナル抗体を用いてスクリーニング
した。8 Kbの挿入配列を有するプラスミドでバクテリア
を形質転換したときだけ、陽性のコロニーが観察され
た。陽性コロニーのウェスタンブロット解析（方法は実
施例２で説明されている）によって、大腸菌によって発
現される蛋白質は、完全で、SDS-PAGEゲル上でも髄膜炎
菌の22 kDaの表面蛋白質と同じように移動した。挿入配
列の長さをさらに短くするために、8 Kbの断片を有する
クローンをClaIで制限酵素消化して、2.75 Kbの断片をp
WKS30プラスミドのClaI部位にライゲーションした。こ
の結果できたクローンのウェスタンブロット解析によっ
て、大腸菌によって発現される蛋白質が、完全であり、
SDS-PAGEゲルでも本来の髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質
と同じように移動することが再び明らかになった。制限
酵素解析の後、pNP2202とpNP2203と名付けられた、２つ
のクローンが、2.75 Kbの挿入配列を逆向きに有するこ
とが分かり、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質をコードして
いる遺伝子の配列決定に続けるためにこれらを選んだ。
ファルマシア・バイオテク社（ニュージャージー州ピス
カタウエイ）の「二本鎖ネスティド・デリーションキッ
ト」を、製造業者の指示に従って用いて、２つのクロー
ンから連続的なネスティド・デリーションを作製した。
そして、この結果できた欠削挿入配列を、製造業者の推
奨するところにしたがって、アプライド・バイオシステ
ムズ社（カリフォルニア州フォスターシティ）の自動シ
ークエンサーモデル373Aを用いて、「タック（Taq）ダ
イ・デオキシターミネーター・サイクルシークエンシン
グキット」によって、pWKS30ベクター上にあるM13前向
きプライマーから配列決定を行なった。
【００８０】Ｂ．配列解析 挿入配列を両方向に配列決定すると、この塩基配列に
は、推定分子量18,000ダルトンで、pI 9.93の蛋白質
で、174アミノ酸を含む蛋白質をコードする、525塩基の
（終止コドンを含む）読み枠があることが明らかになっ
た。塩基配列と推定アミノ酸配列を図１に示す（配列番
号：１；配列番号：２）。クローン化した遺伝子の正確
な発現を確認するため、塩基配列データから推定したア
ミノ酸配列と比較するために、髄膜炎菌株608Bに由来す
る本来の22 kDa表面蛋白質のＮ末側のアミノ酸配列を決
定した。髄膜炎菌株608Bに由来する外膜調製物を、14％
SDS-PAGEゲルで電気泳動して解析し、以前説明された方
法［Shambrookら、「分子クローニング；実験マニュア
ル(Molecular Cloning; A Laboratory Mannual)」、コ
ールドスプリングハーバー研究所出版（1989）］にした
がって、ポリビニルイジン・ジフルオリド（polyvinyli
dine difluoride）膜（ミリポア・プロダクツ社、マサ
チューセッツ州ベドフォード）の上に移した。ゲルから
22 kDaの蛋白質のバンドを切り出して、製造業者の推奨
するところにしたがって、アプライド・バイオシステム
ズ社（カリフォルニア州フォスターシティ）の自動蛋白
質シークエンサーモデル473Aを用いて、エドマン分解を
行なった。アミノ酸配列、E-G-A-S-G-F-Y-V-Qは、読み
枠のアミノ酸1〜10（配列番号：２）に対応していて、
髄膜炎菌株608Bの22 kDa表面蛋白質には、19アミノ酸の
リーダーペプチド（配列番号：２の-19から-1のアミノ
酸残基）があることを示していた。確立したデータベー
スを検索したところ、髄膜炎菌株608Bの22 kDa表面蛋白
質（配列番号：２）とその遺伝子（配列番号：１）は、
既に記述されていることが確認された。
【００８１】Ｃ．髄膜炎菌の組換え22 kDa表面蛋白質の
高収量発現と精製 大腸菌で発現される、髄膜炎菌の組換え22 kDa表面蛋白
質の産生と精製を最大にするために、以下の処理方法を
開発した。この処理方法は、プラスミドpNP2202を有す
る大腸菌株BL21（DE3）［StudierおよびMoffat, J. Mo
l. Biol., 189, p.113 (1986)］によって産生される組
換え22 kDa表面蛋白質は、外膜に大量に見られるが、培
養上清からも得ることができ、培養上清の中では、これ
が最も豊富な蛋白質であるという観察に基づいている。
このため、培養上清を材料にして、アフィニティー・ク
ロマトグラフィーを用いて組換え22 kDa蛋白質の精製を
行なった（図６Ａ）。アフィニティー・クロマトグラフ
ィーの基質を作製するために、モノクローナル抗体Me-
2、Me-3およびMe-5（実施例２で説明した）を、製造業
者の指示に従って、CNBrで活性化したセファロース4B
（ファルマシア・バイオテク社、ニュージャージー州ピ
スカタウエイ）に固定した。培養上清を調製するため
に、プラスミドpNP2202を有する大腸菌株BL21（DE3）を
一晩培養したものを、25 mg/mlのアンピシリン（シグマ
社）を含むLB培地（ギブコ研究所、ニューヨーク、グラ
ンドアイランド）に接種し、振とうしながら、37℃で４
時間インキュベートした。４℃で10分間、10,000 X gで
２回遠心分離して、培養培地からバクテリアの細胞を取
り除いた。培養上清は、0.22 mmのメンブレン（ミリポ
ア・プロダクツ社、マサチューセッツ州ベドフォード）
で濾過し、次に、10,000ダルトン以下の分子を切り捨て
る限外濾過膜（アミコン社、マサチューセッツ州ビバリ
ー）を用いて、約100倍に濃縮した。膜小胞体を完全に
可溶化するために、最終濃度が１％（容量／容量）とな
るように、濃縮された培養上清にエンピジェンBB（Empi
gen BB）（カルバイオケム社、カリフォルニア州ラホ
ヤ）を加えた。この懸濁液を室温で１時間インキュベー
トし、0.05％エンピジェンBB（容量／容量）を含む、数
リットルの10 mMのトリス塩酸バッファー、pH7.3に対し
て透析を行なってから、４℃で20分間、10,000 X gで遠
心分離した。アフィニティー基質に抗原調製物を加え
て、定常的に振とうしながら、４℃で一晩インキュベー
トした。ゲルの懸濁液をクロマトグラフィーカラムに注
ぎ込んで、0.05％エンピジェンBB（容量／容量）を含む
10 mMのトリス塩酸バッファー、pH 7.3で念入りに洗浄
した。そして、1 Mの塩酸リチウム入りの10 mMトリス塩
酸バッファー、pH 7.3によって、カラムから組換え22 k
Da蛋白質を溶出した。溶出した蛋白質を含む溶液を、0.
05％エンピジェンBBを含む数リットルの10 mMトリス塩
酸バッファー、pH 7.3に対して何回も透析した。クマシ
ーブルーと銀で染色したSDS-PAGEゲル［TsaiおよびFras
ch, Analytical Biochem., 119, pp. 19 (1982)］を用
いて、精製処理の各段階で、組換え22 kDa蛋白質の精製
度を評価した。代表的な結果が、図６Ａに示されてい
る。精製処理によって、大腸菌のリポ多糖を少量含むだ
けの、かなり純粋な組換え22 kDa蛋白質が作製されたこ
とが、ゲルの銀染色によって明らかに示された。精製さ
れた組換え22 kDa表面蛋白質の、蛋白質分解性切断に対
する抵抗性も明らかになり、この結果は、図６Ｂに示さ
れている。精製された組換え22 kDa表面蛋白質を、実施
例１で説明したように、蛋白質1 mg当たり2 mgのα-キ
モトリプシンとトリプシン、および、蛋白質1 mg当たり
2 IUのプロテイナーゼＫで処理して、37℃で１時間、定
常的に振とうしながらインキュベートした。これらの処
理の何れの後にも、蛋白質の量の減少は見られなかっ
た。比較すると、選択した酵素に依存した部分消化また
は完全消化が、対照蛋白質では観察された。ここで、こ
の場合には、対照蛋白質はウシ血清アルブミン（BSA、
シグマ社）であった。さらに、処理時間を長くしても、
蛋白質に変化をもたらさなかった。これら後者の結果
は、形質転換された大腸菌が、完全な組換え22 kDa表面
蛋白質を発現できることを示しており、この蛋白質はま
た、髄膜炎菌の中に見られる本来の蛋白質と同じよう
に、これら３つの蛋白質分解酵素の作用に対して、強い
抵抗性を有することも示している。さらに、大腸菌の外
膜に包埋されない、精製した組換え22kDa表面蛋白質
も、やはり、蛋白質分解酵素の作用に対して強い抵抗性
を示す。
【００８２】本発明者らは、また、組換え22 kDa蛋白質
の抗原特性に対する、酵素処理の効果を明らかにした。
ELISAとウェスタン免疫ブロッティングによって判定さ
れたところによると、実施例２で説明されたモノクロー
ナル抗体は、上記の処理方法にしたがって精製された組
換え22 kDa表面蛋白質を容易に認識した（図６Ｃ）。そ
の上、モノクローナル抗体Me-5の、精製された組換え22
kDa表面蛋白質との反応性は、その他の22 kDa蛋白質特
異的なモノクローナル抗体の反応性も同様であるが、い
ずれの酵素によっても変わらなかったため、組換え22 k
Da蛋白質の抗原特性は、もとの蛋白質について説明され
た特性と同じだと考えられることが確認された。
【００８３】実施例３では、重要なデータが示された
が、次のように要約される、すなわち、 １）髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質の完全な塩基配列と
アミノ酸配列が得られ（配列番号：１；配列番号：
２）、 ２）もとの蛋白質のＮ末の配列決定によって、髄膜炎菌
の22 kDa遺伝子が本当にクローン化されたことが確認さ
れ、 ３）この蛋白質は、以前に説明されておらず、 ４）大腸菌などの宿主を形質転換して、髄膜炎菌の組換
え22 kDa表面蛋白質を高収率で発現させることができ、 ５）髄膜炎菌の別の分子を含まず、大腸菌が産生する成
分をほとんど含まない組換え蛋白質を得ることができ、 ６）精製された組換え22 kDa表面蛋白質は、α-キモト
リプシン、トリプシン、およびプロテイナーゼＫなどの
蛋白質分解酵素の作用に対して、依然として強い抵抗性
をもち、また、 ７）組換え22 kDa蛋白質の抗原特性は、もとの髄膜炎菌
22 kDa蛋白質について説明された特性に匹敵する。
【００８４】実施例４ 髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質
をコードする遺伝子の分子的な保存性 髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質をコードしている遺伝子
の、髄膜炎菌の単離株間における分子的な保存性を明ら
かにするために、DNAドットブロット・ハイブリダイゼ
ーション・アッセイ法を用いて、異なった髄膜炎菌種
と、その他のバクテリア種を調べた。まず、髄膜炎菌の
22 kDaの表面蛋白質をコードする525塩基対の遺伝子
を、PCRによって増幅し、アガロースゲルで精製して、
製造業者の指示にしたがって、非放射性のDIG DNA標識
および検出システム（ベーリンガー・マンハイム社、カ
ナダ、ラバル）を用いたランダムプライミングによって
標識した。DNAドットブロットアッセイ法は、製造業者
（ベーリンガー・マンハイム社）の指示にしたがって行
われた。簡単に説明すると、調べようとしているバクテ
リアの菌株を、正に荷電したナイロン膜（ベーリンガー
・マンハイム社）の上にドットし、乾燥させてから、DI
Gシステムの使用手引きの中でコロニーのつり上げにつ
いて説明されているところにしたがって処理した。プレ
ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションは、
50％ホルムアミド（シグマ社）を含む溶液を用いて、42
℃で行なった。また、プレハイブリダイゼーション溶液
には、DNAプローブが非特異的にハイブリダイゼーショ
ンするのを防止するための付加的な遮断剤として、100
mg/mlの変性ニシン精子DNA（ベーリンガー・マンハイム
社）が含まれていた。DIGシステムの使用手引きの中で
説明されているところにしたがって、厳密な洗滌と、化
学発光するルミゲンPPD基質を用いて検出段階も行なっ
た。試験した71種の髄膜炎菌株について、モノクローナ
ル抗体Me-7と525塩基対のDNAプローブを用いて得られた
結果は、完全に一致していた。この結果によれば、調べ
た髄膜炎菌株のすべては、モノクローナル抗体によって
認識されるため、それらはすべて、髄膜炎菌の22 kDa表
面蛋白質遺伝子をもち、その蛋白質を発現している。つ
まろ、髄膜炎菌の単離株の間で、この蛋白質が高度に保
存されていることが確認されたことになる（表２）。試
験した淋菌株のすべてでも、DNAプローブによって、髄
膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質をコードしている遺伝子が
検出された。
【００８５】これに対して、モノクローナル抗体Me-7
は、淋菌の16菌株のうち２菌株とだけ反応したが、これ
は、どういうわけか、淋菌株では、特異的なエピトープ
が存在しないか、結合不可能か変化していることを示し
ている。または、淋病菌株のほとんどは、ゲノムの中に
コーディング配列を有するにも拘わらず、この蛋白質を
発現させないことを示している（表２）。ナイセリア・
ラクタミカの１菌株だけが蛋白質を発現させない遺伝子
を有することが分かったため、２つの検出方法の間によ
い相関関係があることが、ナイセリア・ラクタミカにつ
いても観察された（表２）。この結果は、最後の段落で
提示されているのと同じ理由で説明することができると
考えられる。これは、淋菌株の表面では22 kDaは発現さ
れないか、結合不可能であるが、淋病菌株とナイセリア
・ラクタミカ菌株の22 kDa蛋白質をコードする遺伝子
は、22kDa表面蛋白質または、その相同体を産生するた
めに用いられる組換えプラスミドを構築するために用い
ることができることを示しているかもしれない。このよ
うな蛋白質または相同体は、すべて、ナイセリア菌感染
を予防、検出または診断するために用いることができ
る。より特定すれば、この感染は、髄膜炎菌、淋菌、お
よびナイセリア・ラクタミカによる感染から選択される
ものである。したがって、22 kDa表面蛋白質、または、
その相同体は、このような感染に対するワクチンを製造
するために用いてもよい。さらに、22 kDa表面蛋白質、
または、その相同体は、このような感染を検出または診
断するためのキットを製造するために用いてもよい。モ
ラクセラ・カタリスの菌株で得られた結果は、調査した
５菌株のうち、３つがモノクローナル抗体Me-7とは反応
したが、DNAプローブと反応した株はないことを明らか
にした。このことは、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質を
コードする遺伝子が、これらの菌株のゲノムには存在し
ないことを示している（表２）。いくつかの他のナイセ
リア種と、その他のバクテリア種（表２の脚注を参照の
こと）を調べたが、２つの試験のいずれによっても陽性
のものは見つからなかった。この後者の結果は、22 kDa
の表面蛋白質をコードする遺伝子は、ナイセリア属の近
縁種だけに共通していることを示していると考えられ
る。
【００８６】
【表２】
【００８７】以下のナイセリア菌種と、その他のバクテ
リア種も、２つのアッセイ法で調べられたが、ネガティ
ブな結果となった。ナイセリア・シネレア（Neisseria
cinerea）１菌株、ナイセリア・フラバ（Neisseria fla
va）１菌株、ナイセリア・フラバセンス（Neisseria fl
avescens）１菌株、ナイセリア・ムコサ（Neisseriamic
osa）２菌株、ナイセリア・パーフラバ／シッカ（Neiss
eria perflava/sicca）４菌株、ナイセリア・パーフラ
バ（Neisseria perflava）１菌株、ナイセリア・シッカ
（Neisseria sicca）１菌株、ナイセリア・サブフラバ
（Neisseria subflava）１菌株、アルカリゲネス・フェ
カリス（Alcaligenes feacalis）（ATCC8750）１菌株、
百日咳菌（Bordetella pertussis）（9340）１菌株、気
管支肺血症（Bordetella bronchiseptica）１菌株、シ
トロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）
（ATCC 2080）１菌株、エドワードシエラ・タルダ（Edw
ardsiella tarda）（ATCC 15947）１菌株、エンテロバ
クター・クロアセア（Enterobacter cloacea）（ATCC 2
3355）１菌株、エンテロバクター・アエロゲネス（Ente
robacter aerogenes）（ATCC 13048）１菌株、大腸菌１
菌株、フラボバクテリウム・オドラタム（Flavobacteri
um odoratum）１菌株、ｂ型ヘモフィルス・インフルエ
ンザ（イーガン（Eagan）株）１菌株、肺炎杆菌（Klebs
iella pneumoniae ）（ATCC 13883）１菌株、プロテウ
ス・レットゲリ（Proteus rettgeri）（ATCC 25932）１
菌株、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）
（ATCC 13315）１菌株、シュードモナス・アエルギノー
サ（Pseudomonas aeruginosa）（ATCC 9027）１菌株、
ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）（ATCC 140
28）１菌株、霊菌（Serratia marcescens）（ATCC 810
0）１菌株、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）
（ATCC 12022）１菌株、ソネ赤痢菌（Shigella sonne
i）（ATCC 9290）１菌株、および、ザンソモナス・マル
トフィラ（Xanthomonas maltophile）１菌株。
【００８８】結論として、DNAハイブリダイゼーション
アッセイ法は、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質をコード
する遺伝子が、病原性ナイセリア菌の間で高度に保存さ
れていることを明確に示した。さらに、得られた結果
は、このDNAプローブが、臨床試料の中の病原性ナイセ
リア菌を迅速に、また、直接的に検出するための貴重な
ツールとなりうることを明確に示した。このプローブ
は、髄膜炎菌と淋菌を区別できるように、さらに工夫す
ることもできる。
【００８９】実施例５ モノクローナル抗体のバクテリ
ア分解特性と防御特性 精製された、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質特異的なモ
ノクローナル抗体のバクテリア分解活性を、以前から説
明されている方法［Broederら、Infect. Immun. 50, p.
510 (1985); Martinら、Infect. Immun. 60, p.2718 (1
992)］にしたがって、インビトロで評価した。モルモッ
トの血清補体存在下で、精製モノクローナル抗体Me-1お
よびMe-7は、髄膜炎菌株608Bを効率的に殺菌した。これ
らのモノクローナル抗体のいずれも、比較的低い濃度
で、バクテリアの生存数を50以上減少させる。精製モノ
クローナル抗体Me-1およびMe-7を高い濃度で利用する
と、バクテリアのコロニー形成単位数を急激に低下させ
る（99％まで）結果となった。モルモットの血清を30分
間、56℃で加熱して不活性化すると、殺菌活性がなくな
ることから、重要なのは、これらのモノクローナル抗体
のバクテリア分解活性は、補体依存的だということであ
る。これ以外のモノクローナル抗体は、これと同じ菌株
に対して有意なバクテリア分解活性を示さなかった。い
くつかの実験を組み合わせた代表的な結果が図７に示さ
れているが、ここで、Me-7について示された結果は、代
表的なものであり、Me-1について得られた結果と一致し
ている。Me-2に関する結果も代表的なものであり、他の
モノクローナル抗体Me-3、Me-5およびMe-6について得ら
れた結果と一致している。本発明者らの一人によって既
に説明されている［Brodeurら、Infect. Immun.,50, p.
510 (1985); Brodeurら、Can. J. Microbiol., 32, p.3
3 (1986)］、マウスの感染モデルを用いて、各モノクロ
ーナル抗体の防御活性を測定した。簡単に説明すると、
Balb/cマウスに、バクテリア抗原投与を行う18時間前
に、モノクローナル抗体を含む腹水液600 mlを腹腔内か
ら注射した。そして、1000コロニー形成単位の髄膜炎菌
株608Bと４％ムチン（シグマ社）および1.6％ヘモグロ
ビン（シグマ社）を含む懸濁液１mlを、これらのマウス
に抗原投与した。いくつかの実験を組み合わせた結果
が、表３に示されている。バクテリア分解性モノクロー
ナル抗体Me-1およびMe-7だけが、髄膜炎菌の実験感染か
らマウスを防御したことに留意することが重要である。
実際、バクテリアを抗原投与する前に、これら２つのモ
ノクローナル抗体を含む腹水液注射すると、Balb/cマウ
スの生存率が70％以上に上昇した。これに対し、Sp2/0
に誘導された腹水液600 mlを注射するか、無関係のモノ
クローナル抗体を含む腹水液を600 ml注射したグループ
では、生存率は９％であった。これらの結果は、また、
バクテリア抗原投与を行う18時間前に、プロテインＡで
精製したMe-7を400μg、予め注射しておけば、80％のマ
ウスが感染を生き延びることも示した。50％のマウスを
防御するのに必要な抗体最低濃度を決定するために、こ
れに続く実験が現在行われているところである。20％か
ら40％という低い生存率は、髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質
特異的な、他のモノクローナル抗体でも観察された。
【００９０】
【表３】
【００９１】結論として、これらの結果は、髄膜炎菌の
22 kDaの表面蛋白質に対して特異的な抗体は、実験的な
致死的抗原投与から、マウスを有効に防御した。抗原に
よる防御抗体の誘導は、ワクチン候補となりうるものを
さらに研究する上で、最も重要な基準の一つである。
【００９２】実施例６ 精製された組換え22 kDa表面蛋
白質による免疫化により、その後のバクテリア抗原投与
に対する防御力が付与される。 実施例３に示されているプロトコールにしたがって、精
製された組換え22 kDa表面蛋白質を調製し、これを用い
て、致死的用量の髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.2）抗原投
与に対する防御効果を測定するために、Balb/cマウスを
免疫した。これらの実験過程で用いるワクチン調製物の
中に、別の髄膜炎菌抗原が確実に存在しないようにする
ために、本来の髄膜炎菌蛋白質の代わりに精製された組
換え蛋白質を用いることにした。これらの実験で用いた
マウスの感染モデルは、本発明者らの一人によって既に
説明されている［Brodeurら、Infect. Immun., 50, p.5
10(1985); Brodeurら、Can. J. Microbiol., 32, p.33
(1986)］。３週間間隔で３回、マウス１頭につき、10μ
gまたは20μgの精製された組換え22 kDa表面蛋白質を含
む抗原調製物を100 mg、各マウスに皮下注射した。これ
らの実験において、QuilAを、注射１回あたり25μgの濃
度で、アジュバントとして用いた。対照グループのマウ
スには、同じ処理手順にしたがって、10μgまたは20μg
のBSAか、実施例３で説明されているようにして調製し
た、髄膜炎菌蛋白質をコードする遺伝子を挿入していな
いプラスミドpWKS30を有する大腸菌株BL21(DE3)の濃縮
培養上清またはリン酸緩衝食塩水を20μg注射した。組
換え蛋白質に対する免疫応答の発生を解析するために、
注射を打つ前毎に、各マウスから血清サンプルを採取し
た。３回目の免疫の２週間後に、すべてのグループのマ
ウスへ、４％ムチン（シグマ社）および1.6％ヘモグロ
ビン（シグマ社）の中に1000コロニー形成単位の髄膜炎
菌株608Bを含む懸濁液１mlを、腹腔内注射した。
【００９３】これらの実験の結果は、表４に示されてい
る。精製された組換え22 kDa表面蛋白質で免疫したマウ
スの80％は、バクテリア抗原を投与しても死ななかった
が、これに対して、対照グループでの生存率は、０〜42
％であった。重要なのは、大腸菌の濃縮培養上清を注射
した対照グループのマウスは、バクテリア抗原投与から
防御されなかったということである。この最後の結果に
よって、培養基の中に存在している成分も、精製後も僅
かな量存在していると思われる大腸菌抗原も、髄膜炎菌
に対して観察された防御には全く寄与していないことが
明確に示された。
【００９４】
【表４】
【００９５】結論 精製された組換え22 kDa表面蛋白質の注射により、免疫
されたマウスは、髄膜炎菌の致死的な感染の進行から、
非常に強く防御された。本発明による抗体の例は、モノ
クローナル抗体Me-1およびMe-7を産生するマウスハイブ
リドーマ細胞株であるが、これらは、1995年７月21日
に、米国メリーランド州ロックビルにある米国基準培養
株コレクション（American Type CultureCollection ）
に寄託された。
【００９６】実施例７ 髄膜炎菌の他の菌株と淋菌の配
列解析 実施例３で説明したようにして、髄膜炎菌の異なった菌
株と淋菌のゲノムDNAから、22 kDaの表面蛋白質をコー
ドしている遺伝子を含む2.75 KbのClaI消化したDNA断片
を単離した。 ａ）MCH88菌株：菌株MCH88（臨床単離株）の塩基配列
が、図８に示されている（配列番号：３）。菌株608Bか
ら得られた実験的な証拠（実施例３）から、アミノ酸配
列の-19から-1に相当する推定リーダー配列（M-K-K-A-L
-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A）を導き出した。確立し
たデータベースを検索したところ、髄膜炎菌株MCH88に
由来する22 kDaの表面蛋白質（配列番号：４）も、その
遺伝子（配列番号：３）も、以前には報告されていない
ことが確認された。 ｂ）Z4063菌株：菌株Z4063（Wang J.-F.ら、Infect. Im
mun., 60, p.5267 (1992)）の塩基配列は、図９に示さ
れている（配列番号：５）。菌株608Bから得られた実験
的な証拠（実施例３）から、アミノ酸配列の-19から-1
に相当する推定リーダー配列（M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-
A-L-P-A-A-A-L-A）を導き出した。確立したデータベー
スを検索したところ、髄膜炎菌株Z4063に由来する22 kD
aの表面蛋白質（配列番号：６）も、その遺伝子（配列
番号：５）も、以前には報告されていないことが確認さ
れた。 ｃ）淋菌株b2：淋菌株b2（血清型１、Nat. Ref. Center
for Neisseria, LCDC,Ottawa, Canada）の塩基配列
は、図10に示されている（配列番号：７）。菌株608Bか
ら得られた実験的な証拠（実施例３）から、アミノ酸配
列の-19から-1に相当する推定リーダー配列（M-K-K-A-L
-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A）を導き出した。確立し
たデータベースを検索したところ、淋菌株b2に由来する
22 kDaの表面蛋白質（配列番号：８）も、その遺伝子
（配列番号：７）も、以前には報告されていないことが
確認された。図11は、調べられた４つの菌株すべてのDN
A配列で確認された保存配列を示している。MCH88菌株で
は、217番目の塩基のところに、１コドン（TCA）の挿入
があることが分かったが、一般的に、これら４つの菌株
は著しい相同性を示していた。図12は、４つの菌株から
得た推定アミノ酸配列の間に見られる相同性を示したも
のである。４つの菌株すべての間で、90％以上の一致が
見られる。
【００９７】実施例８ 22 kDaの髄膜炎菌表面蛋白質に
対するウサギおよびサルの免疫応答 マウス以外の生物種での抗体の応答を測定するために、
組換え22 kDa蛋白質で、ウサギおよびサルを免疫した。 ａ）ウサギ プラスミドpN2202または対照用プラスミドpWKS30を有す
る大腸菌株JM109から得た外膜調製物（菌株およびプラ
スミドは、実施例３で説明されている）で、オスのニュ
ージーランド・ラビット（New Zealand rabbit）を免疫
した。本発明者らが以前述べた［Brodeurら、Infect. I
mmun., 50, p.510 (1985)］ようにして、これらの外膜
調製物を得るために用いた塩化リチウム抽出を行った。
これらの調製物の蛋白質含有量を、膜画分に適合させた
ローリー法［Lowryら、J. Biol.Chem.193, 265 (195
1)］によって測定した。ウサギには、上記の外膜調製物
の一つを150μg、３週間の間隔で２回、いくつかの部位
に皮下注射または筋肉内注射をした。QuilAを、最終濃
度20％（用量／用量）（シーダーレーン研究所、カナ
ダ、オンタリオ州ホーンバイ）で、アジュバントとし
て、これらの免疫に用いた。髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.
2）から抽出した外膜調製物を、被覆抗原として用いたE
LISAと、本発明者らによって既に説明された方法［Broe
derら、Infect. Immun. 50, p.510 (1985); Martinら、
Eur. J. Immunol. 18, p.601 (1988)］に従うウェスタ
ン免疫ブロッティングによって、特異的な液性応答の発
生を解析した。アルカリホスファターゼまたはパーオキ
シダーゼで標識したロバ抗ウサギ免疫グロブリン（ジャ
クソン免疫研究所（Jackson ImmunoResearch Laborator
ies）、ペンシルバニア州グローブ）をこれらの測定法
で用いた。22 kDaの組換え蛋白質を含む大腸菌の外膜調
製物を、QuilAアジュバントと組み合わせて注射する
と、ELISAで測定したところ、1/32,000の特異的な強い
液性応答がウサギで誘導された（図13）。組換え22 kDa
蛋白質を注射して誘導された抗体は、精製された組換え
22 kDa蛋白質と反応したが、さらに重要なことに、それ
らは、髄膜炎菌の外膜の中で発現し、折り畳まれ、包埋
している本来の蛋白質を認識した。ウェスタン免疫ブロ
ッティング実験によって、第二回目の注射の後で現れた
抗体が、22 kDa蛋白質に特異的なMab Me-2（実施例２で
説明されている）によって明らかにされたバンドと同じ
蛋白質バンドを、ニトロセルロース膜上で認識したこと
が明確に示された。
【００９８】ｂ）サル ２頭のマカカ・ファシキュラリス（Macaca fasciculari
s）（カニクイザル）に、１回の注射につき、アフィニ
ティー精製した組換え22 kDa蛋白質を、それぞれ、100
μg（K28）および200μg（I276）ずつ、２回注射して免
疫した。大腸菌株BL21(DE3)に蛋白質を産生させ、それ
から蛋白質を精製するために用いた方法は、実施例３に
おいて説明した。最終濃度20％（用量／用量）（シーダ
ーレーン研究所、カナダ、オンタリオ州ホーンバイ）の
アルヒドロゲル（Alhydrogel）をアジュバントとして、
これらの免疫に用いた。このサルたちに、３週間間隔で
筋肉内注射を行なった。同じ処理手順に従って、無関係
な組換え蛋白質調製物で、対照用のサル（K65）を免疫
した。上述したところにしたがって、血清を解析した。
これらの測定法では、アルカリホスファターゼまたはパ
ーオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒト免疫グロブリン（ジ
ャクソン免疫研究所（Jackson ImmunoResearch Laborat
ories）、ペンシルバニア州グローブ）を用いた。１回
の注射につき100μgの精製蛋白質で免疫したサルにおい
て、K28の特異的な抗体反応は、200μgの蛋白質を注射
したサル、I276で観察された免疫反応よりも急速で強力
であるように示された（図14）。ウェスタン免疫ブロッ
ティングによって検出されたところによると、天然の22
kDa蛋白質に特異的な抗体は、最初の注射の後21日目
の、免疫したサルの血清の中に既に現れていたが、対照
用の抗原を２回注射した後の対照用のサルの中にはなか
った。
【００９９】結論 実施例２および５に示されたデータは、組換え22 kDa蛋
白質の注射によって、髄膜炎菌株に対する防御液性反応
をマウスで誘導することができることを明確に示した。
さらに重要なことは、本実施例で示されている結果か
ら、この免疫学的応答が、一つの生物種のみに限られる
ことなく、この組換え表面蛋白質が、ウサギおよびサル
などの別の生物種の免疫システムを刺激することもでき
ることが明らかにされたことである。
【０１００】実施例９ 22 kDaの髄膜炎菌蛋白質のエピ
トープマッピング 本発明者らの一人によって説明された方法［Martinら、
Infect. Immun. (1992): 59: 1457〜1464］を用いて、
髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質をエピトープマッピングし
た。菌株608Bに由来する髄膜炎菌の22 kDa蛋白質の全長
配列をカバーずる18個の重複した合成ペプチドを用い
て、直線的に位置するエピトープ同定を行ない（図1
5）、この蛋白質で免疫することにより過免疫血清を得
た。22 kDa蛋白質上の免疫優性な部位の同定は、新しい
有効ワクチンの設計を行なう上で有用であると考えられ
る。さらに、これらのＢ細胞エピトープの位置づけによ
り、髄膜炎菌の外膜における、この蛋白質の構造的配置
に関する貴重な情報も提供される。すべてのペプチド
は、アプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州
フォスターシティ）を用いて、バイオケム・イムノシス
テムズ社（カナダ、モントリオール）によって合成され
た。合成ペプチドは、逆相高圧液体クロマトグラフィー
によって精製した。ペプチドCS-845、CS-847、CS-848、
CS-851、CS-852およびCS-856（図15）を、少量の6Mグア
ニジン塩酸（J. T. Baker, Ontario, Canada）またはジ
メチルスルホキシド（J. T. Baker）の中で可溶化し
た。そして、これらのペプチドを蒸留水で1 mg/mlに調
整した。この他のペプチドはすべて、蒸留水中でそのま
まで可溶性であったので、これらも1 mg/mlに調整し
た。50 mMの炭酸バッファー、pH 9.6の中に50μg/mlの
濃度で、合成ペプチドで微量滴定用プレート（Immulon
4, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA）を覆
って、ペプチドの固相酵素免疫測定法（ELISA）を行な
った。室温で一晩インキュベートした後、0.05％（重量
／容量）Tween 20（Sigma Chemichal Co., St.-Louis,
MO）入りのリン酸緩衝食塩水（PBS）でプレートを洗浄
して、0.5％（重量／容量）ウシ血清アルブミン（シグ
マ社）入りのPBSでブロックした。アフィニティー精製
した組換え22 kDa表面蛋白質で免疫したマウスおよびサ
ルから採取した血清を希釈して、この希釈液をウェル１
個に100μlずつELISAプレートに加えて、37℃で１時間
インキュベートした。このプレートを３回洗浄し、製造
業者が推奨するところにしたがって、アルカリホスファ
ターゼを結合したヤギ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブ
リン（ジャクソン免疫研究所（Jackson ImmunoResearch
Laboratories）、ペンシルバニア州グローブ）100μl
を希釈した。37℃で１時間インキュベートした後、プレ
ートを洗浄し、1 mg/mlのリン酸p-ニトロフェニル（シ
グマ社）を含むジエタノールアミンを100μl（10％（容
量／容量））加えた。60分後に、微量プレート読み取り
器を用いて、反応を分光光度計で読み取った（λ＝410
nm）。アフィニティー精製した組換え22 kDa表面蛋白質
で免疫して得た、マウスおよびサルの抗血清（実施例
８）を、18個の重複した合成ペプチドとうまく組み合わ
せて用い、蛋白質上のＢ細胞のエピトープの位置を決定
した。これらのエピトープは、蛋白質の３つの抗原ドメ
インに集中していた。第一の領域は、51番目から86番目
のアミノ酸残基の間に位置している。異なるアルゴリズ
ムを用いたコンピュータ解析により、この領域は疎水的
で表面に露出しているため、この領域が免疫学的に重要
である可能性が最も高いことが示唆された。さらに、図
12に示されている４つの蛋白質配列を比較することによ
り、73番目のアミノ酸に１アミノ酸残基の挿入があると
いう大きな変異も、この領域にあることが示される。11
0番目から140番目のアミノ酸残基の間にある第二の抗原
ドメインが、抗血清を用いて同定された。興味深いこと
に、配列解析によって、４つの蛋白質の配列の間で保存
されていない14のアミノ酸残基のうち７個が、蛋白質の
この領域に集中していることが明らかになった。31番目
から55番目のアミノ酸残基の間の、高度に保存された部
位に位置する第三の抗原ドメインは、サルの血清によっ
てのみ認識された。
【０１０１】実施例10 22 kDaの表面蛋白質を大量に生
産するための熱誘導発現ベクター 髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質をコードする遺伝子を、プ
ラスミドp629に挿入した［Georgeら、Bio/technology
5: 600〜603 (1987)］。バクテリオファージλのcI857
温度感受性リプレッサー遺伝子のカセットを用いて機能
的なPrプロモーターを削除したものが、22 kDaの表面蛋
白質の合成を調節するためにPLプロモーターを用いるプ
ラスミドp629に含まれている。温度を30℃から38℃以上
に変化させて、cI857リプレッサーを不活性化すること
により、プラスミドにコードされた蛋白質が産生され
る。大腸菌細胞における遺伝子発現を温度変化によって
誘導することは、近代的な発酵装置を用いて簡単に行え
るという点で、大量の発酵を行う上では利点がある。別
の誘導発現ベクターでは、望ましい遺伝子の発現を誘導
するためには、通常、ラクトースまたはイソプロピルチ
オ-β-D-ガラクトシド（IPTG）のような特異的な分子
を、培養培地の中に添加する必要がある。２つのヌクレ
オチドプライマー（配列番号：２７および２８）（OCRR
8：5'-TAATAGATCTATGAAAAAAGCACTTGCCAC-3'およびOCRR
9：3'-CACGCGCAGTTTAAGACTTCTAGATTA-5'）を用いて、髄
膜炎菌株608BのゲノムDNAから、PCRによって、540の塩
基断片を増幅した。これらのプライマーは、22kDa遺伝
子の両末端に見られる塩基配列に相当している。PCR産
物のクローニングを簡単にするために、これらのプライ
マーの塩基配列中にBgl II（AGATCT）制限酵素部位を取
り込ませた。PCR産物は、Bgl IIで制限酵素消化する前
に、アガロースゲルで精製した。次に、この約525塩基
対のBgl II断片を、プラスミドp629のBgl IIとBam HI部
位に挿入した。このPCR産物を含む、pNP2204と名付けら
れたプラスミドを用いて、大腸菌株DH5αF'IQを形質転
換した。pNP2204の部分的なマップを図16に示す。実施
例２で説明している、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質に特
異的なモノクローナル抗体を用いて、この結果生じたコ
ロニーをスクリーニングした。この結果選択されたクロ
ーンのウェスタンブロット解析によって、大腸菌によっ
て合成される蛋白質は、完全なもので、天然の髄膜炎菌
の22 kDa表面蛋白質と同じように、SDS-PAGEゲルを移動
することが明らかにされた。選択されたクローンからプ
ラスミドDNAを精製し配列決定した。プラスミドの中に
ある挿入配列の塩基配列は、図１に示されている髄膜炎
菌の22kDa蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列と完全
に一致した。22 kDaの表面蛋白質の合成レベルを調べる
ために、温度誘導プラスミドpNP2204を用いて、次の大
腸菌株を形質転換した。すなわち、W3110、JM105、BL2
1、TOPP1、TOPP2、および、TOPP3である。22 kDaの表面
蛋白質の合成レベルと、この蛋白質の異なる細胞分画中
での局在を、各菌株毎に判定した。LB培地（Gibco BRL,
Life Technologies, Grand Island, NY）のフラスコ振
とう培養により、温度を30℃から39℃に変化させると、
遺伝子の発現が効率的に誘導されることが示された。合
成レベルの時間的な経過を調べると、SDS-PAGEゲルで判
定することにより、誘導後30分で早くも蛋白質が出現す
ることが分かり、また、誘導している間中、蛋白質量は
定常的に増加することが分かった。大腸菌株W3110およ
びTOPP1について、１リットル当たり8 mgから10 mgの22
kDa蛋白質の発現レベルが測定された。両菌株におい
て、22 kDa蛋白質の大部分は、バクテリアの外膜に取り
込まれていた。
【０１０２】実施例11 髄膜炎菌の22 kDa蛋白質の精製 22 kDa蛋白質の大部分が大腸菌株の外膜に埋まっている
ことが示されたため、この実施例で示す精製プロトコー
ルは、大部分の蛋白質が培養上清に放出される実施例３
で説明されているプロトコールとは異なる。プラスミド
pNP2204を有する大腸菌株のW3110またはTOPP1のいずれ
かを30℃で一晩インキュベートした培養液を、50μg/ml
のアンピシリン（シグマ社）を含むLB培地に接種し、細
胞密度が0.6（λ＝600nm）に達するまで、振とうさせな
がら30℃で増殖させ、この時点で培養温度を39℃に変化
させ、蛋白質の産生を誘導するために、３時間から５時
間培養した。４℃、8,000 X gで15分間遠心分離して、
バクテリアの細胞を回収し、リン酸緩衝食塩水（PB
S）、pH7.3で２回洗浄した。バクテリアの細胞を超音波
で破砕した（衝撃による破砕、またはフレンチプレスに
よる機械的な破砕を用いてもよい）。破砕されなかった
細胞は、5,000 X gで5分間遠心分離して採集し除去し
た。10℃、100,000 X gで10分間遠心分離して、外膜を
細胞質成分から分離した。膜を含む沈殿物を、少量のPB
S、pH7.3で再懸濁した。膜から採取した22 kDa表面蛋白
質を可溶化するために、エンピジェンBB（Calbiochem C
o., LaJolla,CA）、ツウィッタージェント-3,14（Zwitt
ergent-3,14）（Calbiochem Co.）、ベータ-オクチルグ
リコシド（β-octylglycoside）（シグマ社）などの界
面活性剤を用いた。界面活性剤を、最終濃度３％で膜画
分に加え、この混合液を、20℃で１時間インキュベート
した。10℃、100,000 X gで10分間遠心分離して、不溶
物質を取り除いた。これらの３つの界面活性剤のいずれ
かによって、22 kDa蛋白質が効果的に可溶化されたが、
ベータ-オクチルグリコシドには、不必要な膜蛋白質の
いくつかを容易に取り除くことができるという利点があ
る。これらの蛋白質は可溶化しないため、遠心分離によ
って上清から分離することができるからである。界面活
性剤を取り除くために、22 kDaを含む上清を、PBS緩衝
液を何回か取り替えて念入りに透析した。22 kDaの表面
蛋白質調製物から不要な蛋白質を、さらに取り除くため
に、プロテイナーゼＫ処理（実施例１と同じ）を用いる
こともできる。ゲル浸透クロマトグラフィーまたはイオ
ン交換クロマトグラフィーを用いて、効率的に精製され
た22 kDa蛋白質を採集する前に、硫酸アンモニウムまた
は有機溶剤を用いた分画沈澱または限外濾過という付加
的な２つの段階を用いて、不要な核酸およびリポ多糖の
混入物を蛋白質から取り除くこともできる。実施例３で
説明されているように、アフィニティー・クロマトグラ
フィーを用いて、22 kDa蛋白質を精製してもよい。
【０１０３】実施例12 ヒト用ワクチンとしての22 kDa
の表面蛋白質の使用 ヒトに使用するためのワクチンを処方するために、適当
な22 kDa表面蛋白質抗原を、本明細書で説明されている
ポリペプチドから選択することができる。例えば、当業
者は、免疫原エピトープを含む22 kDaのポリペプチドま
たはその断片について、ワクチンを設計することができ
る。実質的に純粋な組換え抗原を調製するためには、分
子生物学的手法を使用するのが、特に適切である。ワク
チン組成物は、さまざまな形状をとりうる。これらに
は、例えば、固形状、半固形状、および、粉末などの、
流動投薬形態、液状溶液または懸濁液、および、リポソ
ームなどが含まれる。本発明に係る22 kDa表面蛋白質抗
原をヒトに投与した場合、防御的な免疫反応が誘導され
ると考えられる本発明者らの考察により、本発明に係る
組成物は、例えば、破傷風またはジフテリアなど、他の
蛋白質またはポリペプチドによってヒトを免疫するため
に用いられる組成物に類似しているはずである。このた
め、本発明に係る組成物には、好ましくは、フロイント
の不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、ムラミル
ペプチド、水中油型乳剤、リポソーム、ISCOMもしくはC
TB、または無毒Ｂサブユニット型コレラ毒素など、薬学
的に許容されるアジュバントが含まれる。最も好ましく
は、本組成物には、アジュバントとして、水中油型乳剤
または水酸化アルミニウムが含まれる。本組成物は、筋
肉内、皮内、皮下または局所からの投与を含む、数多く
ある薬学的に許容される形態のいずれかによって、患者
に投与される。好ましくは、本ワクチンは、筋肉内から
投与される。一般的に、投薬は、各患者について、通常
アジュバントと共に約0.01 mgから10 mgの、好ましくは
0.1 mgから10 mgの22 kDa表面蛋白質抗原の初回注射を
行ない、その後、通常１回以上の追加免疫を行なうこと
から構成される。好ましくは、追加免疫は、初回注射の
約１ヶ月から６ヶ月後に行われる。ワクチン開発につい
て考慮しなければならないことは、粘膜免疫の問題であ
る。理想的な粘膜ワクチンは、１回または数回分の投与
量を口腔または鼻腔から安全に摂取されて、全身性免疫
とともに適正な表面の上へ防御的抗体を誘導する。粘膜
ワクチン組成物には、アジュバント、不活性粒子担体、
または、組換え生ベクターが含まれうる。
【０１０４】本発明に係る抗22 kDa表面蛋白質抗体は、
髄膜炎菌、または淋菌もしくはナイセリア・ラクタミカ
などの関連バクテリアに感染したヒトの受動免疫療法お
よび免疫防御を行なうのに有用である。このような受動
免疫についての投薬形態および養生法は、他の受動免疫
療法の投薬形態および養生法と同じであると思われる。
【０１０５】本発明による抗体の実例は、1995年７月21
日に、米国メリーランド州ロックビルにある米国基準培
養株コレクション（American Type Culture Collection
）に寄託された、モノクローナル抗体Me-1またはMe-7
を産生するハイブリドーマで、それぞれ、マウスハイブ
リドーマ細胞株、Me-1およびMe-7として確認されてい
る。これらの寄託株には、寄託番号HB 11959（Me-1）お
よびHB 11958（Me-7）が付与されている。
【０１０６】本発明者らは、本明細書において、数多く
の本発明の態様を説明してきたが、基本的な態様を、本
発明に係る組成物および処理方法を利用する別の態様を
提供するために変更することができる。したがって、上
記の明細書および添付の請求の範囲によって定義される
代替的な態様および変更のすべてが、本発明の範囲に含
まれることが認識されると思われる。そして、本発明
は、本明細書において実施例のために提示した特異的な
態様によって制限されるものではない。
【０１０７】
【配列表】 (1) 一般情報： (i) 出願人： Broudeur, Bernard R Marin, Denis Hamel, Josee Rioux, Clement (ii) 発明の名称：髄膜炎菌（Neisseria Meningitidis）の プロテイナーゼK抵抗性表面蛋白質 (iii) 配列数： 26 (iv) 文書通信情報： (A) 宛名：Goudreau Gage Dubuc & Martineau Walker (B) 街路名：800 Place Victoria, Suite 3400, Tour de la Sourse (C) 市名：Montreal (D) 州名：Quebec (E) 国名：Canada (F) 郵便番号：H4Z 1E9 (v) コンピューター読み取りフォーム： (A) メディア形式：Floppy disk (B) コンピューター：IBM PC compatible (C) 運転システム：PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (vi) 現出願データ： (A) 出願番号： (B) 出願日： (C) 分類： (vii) 親出願データ： (A) 出願番号：US 08/406,362 (B) 出願日：17-MAR-1995 (viii) 弁理士／代理人情報： (A) 氏名：Leclerc/Dubuc/Prince, Alain/Jean/Gaetan (C) 参照／明細書番号：BIOVAC-1 PCT (ix) 電気通信情報： (A) 電話：514-397-7400 (B) ファックス：514-397-4382 (2) 配列番号：１の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：830塩基対 (B) 配列の型：核酸 (C) 鎖の数：二本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：DNA(genomic) (iii) ハイポセティカル：NO (iv) アンチセンス：NO (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：CDS (B) 存在位置：143..667 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：sig peptide (B) 存在位置：143..199 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：mat peptide (B) 存在位置：200..667 (xi) 配列の記載：配列番号：１： (2) 配列番号：２の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：174アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列の記載：配列番号：２： (2) 配列番号：３の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：710塩基対 (B) 配列の型：核酸 (C) 鎖の数：二本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：DNA(genomic) (iii) ハイポセティカル：NO (iv) アンチセンス：NO (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：MCH88 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：CDS (B) 存在位置：116..643 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：sig peptide (B) 存在位置：116..172 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：mat peptide (B) 存在位置：173..643 (xi) 配列の記載：配列番号：３： (2) 配列番号：４の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：175アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列の記載：配列番号：４： (2) 配列番号：５の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：850塩基対 (B) 配列の型：核酸 (C) 鎖の数：二本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：DNA(genomic) (iii) ハイポセティカル：NO (iv) アンチセンス：NO (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：Z4063 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：CDS (B) 存在位置：208..732 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：sig peptide (B) 存在位置：208..264 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：mat peptide (B) 存在位置：265..732 (xi) 配列の記載：配列番号：５： (2) 配列番号：６の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：174アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列の記載：配列番号：６： (2) 配列番号：７の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：810塩基対 (B) 配列の型：核酸 (C) 鎖の数：二本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：DNA(genomic) (iii) ハイポセティカル：NO (iv) アンチセンス：NO (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：b2 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：CDS (B) 存在位置：241..765 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：sig peptide (B) 存在位置：241..297 (ix) 配列の特徴： (A) 特徴を表す記号：mat peptide (B) 存在位置：298..765 (xi) 配列の記載：配列番号：７： (2) 配列番号：８の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：174アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (xi) 配列の記載：配列番号：８： (2) 配列番号：９の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：16アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：９： (2) 配列番号：１０の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１０： (2) 配列番号：１１の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１１： (2) 配列番号：１２の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１２： (2) 配列番号：１３の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１３： (2) 配列番号：１４の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１４： (2) 配列番号：１５の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：16アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１５： (2) 配列番号：１６の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１６： (2) 配列番号：１７の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１７： (2) 配列番号：１８の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１８： (2) 配列番号：１９の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：１９： (2) 配列番号：２０の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：２０： (2) 配列番号：２１の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：２１： (2) 配列番号：２２の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：２２： (2) 配列番号：２３の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：２３： (2) 配列番号：２４の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：15アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：２４： (2) 配列番号：２５の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：14アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：２５： (2) 配列番号：２６の情報： (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：25アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (vi) 起源： (A) 生物名：Neisseria meningitidis (B) 株名：608B (xi) 配列の記載：配列番号：２６：
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、髄膜炎菌株608Bの22 kDaの表面蛋白質
の塩基配列とアミノ酸配列を示したものである（配列番
号：１；配列番号：２）。アミノ酸残基は従来からの３
文字表記法を用いて示されている。オープン・リーディ
ング・フレーム（読み枠）は、143塩基目の開始コドン
から667塩基目の終止コドンまで続いている。リボソー
ム結合部位と推定される部位を四角で囲み、-10プロモ
ーター配列と推定される部位を下線で示した。19アミノ
酸を含むシグナルペプチドも下線で示した。
【図２】図２は、α-キモトリプシンとトリプシンで分
解した、髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.2）の外膜調製物を
示す、クマシーブルー染色した14％SDS-PAGEゲルの写真
である。レーン１は、次の分子量マーカーを含む。ホス
ホリラーゼｂ（97,400）；ウシ血清アルブミン（66,20
0）；オボアルブミン（45,000）；カルボニックアンヒ
ドラーゼ（31,000）；ダイズ・トリプシンインヒビター
（21,500）；リゾチーム（14,400）。レーン２は、未分
解の対照用外膜調製物である。レーン３は、α-キモト
リプシン処理した調製物（蛋白質1 mg当たり2 mgの酵
素）；レーン４は、トリプシン処理した調製物である。
【図３】図３ａは、プロテイナーゼＫで分解した、髄膜
炎菌株608B（B:2a:P1.2）の外膜調製物を示す、クマシ
ーブルー染色した14％SDS-PAGEゲルの写真である。レー
ン１、３、５、７は、未分解の対照である。レーン２、
４、６、８は、プロテイナーゼＫで分解した外膜調製物
（蛋白質1 mg当たり2 IU）；レーン１から４は、pH 7.2
で処理した調製物である。レーン５から８は、pH 9.0で
処理した調製物である。レーン１、２、５、６は、SDS
なしで処理した調製物である。レーン３、４、７、８
は、SDS存在下で処理した調製物である。分子量マーカ
ーを左側に（キロダルトンで）示す。図３ｂは、アフィ
ニティー精製した22 kDaの組換え蛋白質の電気泳動プロ
フィールを示す、クマシーブルー染色した14％SDS-PAGE
ゲルの写真である。レーン１は、次の分子量マーカーを
含む。ホスホリラーゼｂ（97,400）；ウシ血清アルブミ
ン（66,200）；オボアルブミン（45,000）；カルボニッ
クアンヒドラーゼ（31,000）；ダイズ・トリプシンイン
ヒビター（21,500）；リゾチーム（14,400）。レーン２
は、対照用の、5μgのアフィニティー精製した22 kDaの
組換え蛋白質である。レーン３は、100℃で5分間加熱し
た、5μgのアフィニティー精製した22 kDaの組換え蛋白
質である。レーン４は、100℃で10分間加熱した、5μg
のアフィニティー精製した22 kDaの組換え蛋白質であ
る。レーン５は、100℃で15分間加熱した、5μgのアフ
ィニティー精製した22 kDaの組換え蛋白質である。
【図４】図４は、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質に特異
的なモノクローナル抗体の反応性を示す、クマシーブル
ー染色した14％SDS-PAGEゲルと、それに対応するウェス
タン・イムノブロッティングの写真である。髄膜炎菌株
608B（B:2a:P1.2）の外膜調製物の、（A）は、無処理の
調製物、（B）は、プロテイナーゼＫで処理した調製物
（蛋白質1 mg当たり2 IU）である。レーン１は、分子量
マーカーと、外膜調製物の14％SDS-PAGEゲルでの特徴的
な電気泳動プロフィールを示す。レーン２はMe-2；レー
ン３はMe-3；レーン４はMe-5；レーン５はMe-7；レーン
６は、無関係の、対照用モノクローナル抗体である。分
子量マーカーは、ホスホリラーゼｂ（97,400）、ウシ血
清アルブミン（66,200）、オボアルブミン（45,000）、
カルボニックアンヒドラーゼ（31,000）、ダイズ・トリ
プシンインヒビター（21,500）、および、リゾチーム
（14,400）である。図４に示したイムノブロットの結果
のうち、Me-2、Me-3、Me-5、Me-6、Me-7については、Me
-1で得られたイムノブロットの結果と一致している。
【図５】図５は、無処理のバクテリア菌株に対する、モ
ノクローナル抗体の結合活性を図示したものである。典
型的なモノクローナル抗体であるMe-5とMe-7に関する結
果が、縦軸のカウント数／分（「CPM」）で示されてい
る。このアッセイに用いられたバクテリア菌株が横軸に
示されている。陰性対照には、ヘモフィルス・インフル
エンザ菌のポーリン特異的モノクローナル抗体が用いら
れた。500 CPM以下の、バックグラウンドのカウント数
を記録して、これを結合値から減じた。
【図６】図６は、大腸菌（E. coli）株BL21（DE3）の濃
縮培養上清から精製した髄膜炎菌の22 kDaの組換え表面
蛋白質を示す、クマシーブルー染色した14％SDS-PAGEゲ
ルと、それに対応するウェスタン・イムノブロッティン
グの写真である。図６（A）は、クマシーブルーと銀で
染色した14％SDS-PAGEゲルの写真である。レーン１に
は、次の分子量マーカーが含まれている。ホスホリラー
ゼｂ（97,400）；ウシ血清アルブミン（66,200）；オボ
アルブミン（45,000）；カルボニックアンヒドラーゼ
（31,000）；ダイズ・トリプシンインヒビター（21,50
0）；リゾチーム（14,400）。レーン２は、髄膜炎菌株6
08B（血清型B:2a:P1.2）から精製した外膜蛋白質調製物
（10 mg）である。レーン３は、大腸菌株BL21（DE3）の
濃縮培養上清（10 mg）である。レーン４は、アフィニ
ティー精製した、22 kDaの組換え髄膜炎菌表面蛋白質
（1 mg）である。図６（B）は、アフィニティー精製し
た22 kDaの組換え髄膜炎菌表面蛋白質をα-キモトリプ
シン、トリプシン、または、プロテイナーゼＫで分解し
たものをクマシーブルーで染色した、14％SDS-PAGEゲル
の写真である。レーン１には、次の分子量マーカーが含
まれている。ホスホリラーゼｂ（97,400）；ウシ血清ア
ルブミン（66,200）；オボアルブミン（45,000）；カル
ボニックアンヒドラーゼ（31,000）；ダイズ・トリプシ
ンインヒビター（21,500）；リゾチーム（14,400）。レ
ーン２から５は、精製した22 kDaの組換え髄膜炎菌表面
蛋白質（2 mg）である。レーン７から10は、ウシ血清ア
ルブミン（2 mg）である。レーン２と７は、未分解蛋白
質（「NT」）である。レーン３と８は、α-キモトリプ
シン（「C」）で処理した蛋白質（蛋白質1 mg当たり2 m
gの酵素）。レーン４と９は、トリプシン（「T」）で処
理した蛋白質（蛋白質1 mg当たり2 mgの酵素）。レーン
５と10は、プロテイナーゼＫ（「K」）で処理した蛋白
質（蛋白質1 mg当たり2 IU）。図６（C）は、モノクロ
ーナル抗体Me-5を用いた、複製ゲルのウェスタン・イム
ノブロッティングの写真である。
【図７】図７は、髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.2）に対す
る、プロテインA精製した抗髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質
モノクローナル抗体の殺菌活性をグラフで示したもので
ある。グラフの縦軸は、さまざまな濃度（グラフの横軸
に示されている）のモノクローナル抗体に接触させた後
の、髄膜炎菌バクテリアの生存率を示している。
【図８】図８は、髄膜炎菌株MCH88の22 kDaの表面蛋白
質の塩基配列とアミノ酸配列を示したものである（配列
番号：３；配列番号：４）。アミノ酸残基は従来からの
３文字表記法を用いて示されている。オープン・リーデ
ィング・フレーム（読み枠）は、116塩基目の開始コド
ンから643塩基目の終止コドンにまで続いている。
【図９】図９は、髄膜炎菌株Z4063の22 kDaの表面蛋白
質の塩基配列とアミノ酸配列を示したものである（配列
番号：５；配列番号：６）。アミノ酸残基は従来からの
３文字表記法を用いて示されている。オープン・リーデ
ィング・フレーム（読み枠）は、208塩基目の開始コド
ンから732塩基目の終止コドンにまで続いている。
【図１０】図10は、淋病菌（Neisseria gonorrhoeae）
株b2の22 kDaの表面蛋白質の塩基配列とアミノ酸配列を
示したものである（配列番号：７；配列番号：８）。ア
ミノ酸残基は従来からの３文字表記法を用いて示されて
いる。オープン・リーディング・フレーム（読み枠）
は、241塩基目の開始コドンから765塩基目の終止コドン
にまで続いている。
【図１１】図11は、ナイセリア属の４つの菌株のDNA配
列（配列番号：２９）から確定された保存配列を表し、
各菌株に特異的なヌクレオチドの置換または挿入を示し
ている。
【図１２】図12は、ナイセリア属の４つの菌株の蛋白質
配列（配列番号：３０）から確定された保存配列を表
し、各菌株に特異的なアミノ酸残基の置換または挿入を
示している。
【図１３】図13は、ウサギにおける、組換え22 kDa蛋白
質に対する免疫反応の時間的な変化を、交互ELISA力価
で表したものである。ウサギには、プラスミドpN2202ま
たは対照用プラスミドpWKS30を有する大腸菌株JM109か
ら調製した外膜を注射した。髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.
2）から採取した外膜調製物を被覆抗体として用いたELI
SAによって、特異的な液性反応の進行を解析した。
【図１４】図14は、カニクイザル（Macaca fasciculari
s）における、組換え22 kDa蛋白質に対する免疫反応の
時間的な変化を、交互ELISA力価で表したものである。
２匹のサルを、それぞれ、一回の注射につき、100μg
（R28）と200μg（I276）の、アフィニティー精製した2
2 kDa蛋白質で免疫した。対照に用いたサル（R65）は、
同じ処理方法に従って得た、150μgの無関係な組換え蛋
白質で免疫した。髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.2）から採
取した外膜調製物を被覆抗体として用いたELISAによっ
て、特異的な液性反応の進行を解析した。
【図１５】図15は、本発明に係る合成ペプチド（配列番
号：２）と、髄膜炎菌株608B（B:2a:P1.2）の全長22 kD
a蛋白質における、それぞれの合成ペプチドの位置を図
示したものである。
【図１６】図16は、髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質をコ
ードする遺伝子を有するプラスミドpNP2204のマップで
ある。22 kDa、髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質遺伝子；Am
piR、アンピシリン抵抗性をコードする領域；ColE1、複
製開始点；cI857、バクテリオファージλcI857温度感受
性リプレッサー遺伝子；λPL、バクテリオファージλ転
写プロモーター；T1、転写終結因子。転写の方向を矢印
で示す。BglIIとBamHIが、22 kDa遺伝子をp629プラスミ
ドに挿入するために用いられた制限酵素部位である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ０７Ｋ 16/12 ４Ｈ０４５ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ 15/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｆ 33/566 33/577 Ｂ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:36 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:36） (72)発明者 ブロデゥール バーナード アール. カナダ国 ケベック州 シラリー マリタ ン ストリート 2401 (72)発明者 マーティン デニス カナダ国 ケベック州 セイント−オーガ スティン−デゥ−デ−モーレス ガボリー ストリート 4728−ジー (72)発明者 ハメル ジョゼ カナダ国 ケベック州 シラリー マリタ ン ストリート 2401 (72)発明者 リオックス クレモント カナダ国 ケベック州 ビル−デゥ−カプ −ルージュ ジーン チャールズ キャン ティン 1012 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 BA50 CA03 DA06 EA04 GA14 HA01 HA15 4B063 QA01 QA05 QA18 QA19 QQ03 QQ42 QQ79 QQ91 QR48 QR51 QR56 QS33 QS34 QS36 QX02 QX07 4B064 AG27 AG31 CA02 CA19 CC15 CC24 CE06 CE12 DA01 DA13 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA02 BA03 BB37 BC03 CA24 CA44 CA46 4C085 AA03 AA14 BA16 CC07 CC21 DD62 EE01 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA11 DA76 DA86 EA20 EA50 FA74 GA10 GA26

Claims (90)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)の既
    知の菌株の50％以上に対して免疫学的に結合可能な、単
    離された抗原またはその断片。
  2. 【請求項２】 髄膜炎菌の既知の菌株の約99％に対して
    免疫学的に結合可能な、請求項１記載の単離された抗原
    またはその断片。
  3. 【請求項３】 免疫学的な結合性が、凝集アッセイ、EL
    ISA法、RIA法、イムノブロッティング解析、ドット・エ
    ンザイム解析、表面結合解析、またはこれらの解析法を
    組み合わせた方法を用いて判定される、請求項１記載の
    単離された抗原またはその断片。
  4. 【請求項４】 蛋白質である、請求項１記載の単離され
    た抗原またはその断片。
  5. 【請求項５】 約22キロダルトンの分子量を有する、請
    求項４記載の蛋白質。
  6. 【請求項６】 約18キロダルトンの分子量を有する、請
    求項４記載の蛋白質。
  7. 【請求項７】 図１（配列番号：２）、図８（配列番
    号：４）、図９（配列番号：６）および、図10（配列番
    号：８）の配列から選択されるアミノ酸配列を有する、
    請求項５記載の蛋白質。
  8. 【請求項８】 図１（配列番号：２）のアミノ酸配列を
    有する、請求項５記載の蛋白質。
  9. 【請求項９】 実質的に純粋な形状の、請求項５記載の
    蛋白質。
  10. 【請求項１０】 実質的に純粋な形状が、 ａ）髄膜炎菌バクテリアの培養物を分離し、 ｂ）バクテリア培養物から外膜部分を分離し、および、 ｃ）この外膜部分から該抗原を分離すること、という段
    階によって得られる、請求項９記載の蛋白質。
  11. 【請求項１１】 段階（ｃ）に、外膜部分をプロテイナ
    ーゼＫで処理してた後蛋白質分画を行うという段階がさ
    らに含まれる、請求項１０記載の蛋白質。
  12. 【請求項１２】 髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質の少な
    くとも１つの抗原の少なくとも１つの部位をコードする
    DNA配列で、該配列が、 ａ）図１のDNA配列（配列番号：１）、 ｂ）図８のDNA配列（配列番号：３）、 ｃ）図９のDNA配列（配列番号：５）、 ｄ）図10のDNA配列（配列番号：７）、 ｅ）上記のDNA配列の相同配列または誘導配列、 ｆ）上記のDNA配列のいずれかと縮重するDNA配列、およ
    び、 ｇ）上記のDNA配列のいずれかの断片 からなる群より選択され、該配列が、髄膜炎菌22 kDa表
    面蛋白質の免疫活性を示す産物をコードしている、DNA
    配列。
  13. 【請求項１３】 髄膜炎菌の22 kDaの表面蛋白質の少な
    くとも１つの抗原の少なくとも１つの部位をコードする
    DNA配列で、該配列が、 ａ）図１のDNA配列（配列番号：１）、 ｂ）上記DNA配列の相同配列または誘導配列、 ｃ）上記DNA配列のいずれかと縮重するDNA配列、およ
    び、 ｅ）上記DNA配列のいずれかの断片 からなる群より選択され、該配列が、髄膜炎菌22 kDa表
    面蛋白質の免疫活性を示す産物をコードしている、DNA
    配列。
  14. 【請求項１４】 相同配列が、淋菌(Neisseria gonorrh
    oeae)のDNAから選択される、請求項１２記載のDNA配
    列。
  15. 【請求項１５】 相同配列が、ナイセリア・ラクタミカ
    (Neisseria lactamica)のDNAから選択される、請求項１
    ２記載のDNA配列。
  16. 【請求項１６】 図１（配列番号：１）の式の143塩基
    目から667塩基目までのDNA配列。
  17. 【請求項１７】 図１（配列番号：１）の式の200塩基
    目から667塩基目までのDNA配列。
  18. 【請求項１８】 図８（配列番号：３）の式の116塩基
    目から643塩基目までのDNA配列。
  19. 【請求項１９】 図８（配列番号：３）の式の173塩基
    目から643塩基目までのDNA配列。
  20. 【請求項２０】 図９（配列番号：５）の式の208塩基
    目から732塩基目までのDNA配列。
  21. 【請求項２１】 図９（配列番号：５）の式の265塩基
    目から732塩基目までのDNA配列。
  22. 【請求項２２】 図１０（配列番号：７）の式の241塩
    基目から765塩基目までのDNA配列。
  23. 【請求項２３】 図１０（配列番号：７）の式の298塩
    基目から765塩基目までのDNA配列。
  24. 【請求項２４】 断片が、図１５に示されているペプチ
    ドの一つ（配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：
    １１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１
    ４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１
    ７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２
    ０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２
    ３、配列番号：２４、配列番号：２５、および配列番
    号：２６）からなる群より選択される、請求項１３記載
    のDNA配列の断片。
  25. 【請求項２５】 図１（配列番号：１）の３１番目のア
    ミノ酸から５５番目のアミノ酸までを含むDNA配列の断
    片。
  26. 【請求項２６】 図１（配列番号：１）の５１番目のア
    ミノ酸から８６番目のアミノ酸までを含むDNA配列の断
    片。
  27. 【請求項２７】 図１（配列番号：１）の１１０番目の
    アミノ酸から１４０番目のアミノ酸までを含むDNA配列
    の断片。
  28. 【請求項２８】 請求項１３、１６または１７記載のDN
    A配列からなる群より選択されるDNA配列と、このDNA配
    列に機能的に結合された１個以上の発現調節配列とを含
    む、組換えDNA分子。
  29. 【請求項２９】 請求項１４、１５記載のDNA配列また
    は請求項１８から２７のいずれか一項に記載のDNA配列
    からなる群より選択されるDNA配列と、このDNA配列に機
    能的に結合された１個以上の発現調節配列とを含む、組
    換えDNA分子。
  30. 【請求項３０】 発現調節配列が、発現誘導できるベク
    ターである、請求項２８記載の組換えDNA分子。
  31. 【請求項３１】 発現調節配列が、発現誘導できるベク
    ターである、請求項２９記載の組換えDNA分子。
  32. 【請求項３２】 ベクターが、熱、ラクトースの存在、
    および、IPTGの存在から選択される刺激によって誘導さ
    れる、請求項３０または３１記載の組換えDNA分子。
  33. 【請求項３３】 ベクターが、λPL、λPR、TAC、T7、T
    3、LACおよびTRPプロモーターから選択される、請求項
    ３２記載の組換えDNA分子。
  34. 【請求項３４】 pNP2202、pNP2203およびpNP2204から
    なる群より選択されるプラスミド。
  35. 【請求項３５】 請求項２８記載の組換えDNA分子で形
    質転換された単細胞宿主。
  36. 【請求項３６】 請求項２９記載の組換えDNA分子で形
    質転換された単細胞宿主。
  37. 【請求項３７】 宿主が、大腸菌JM109、大腸菌BL21(DE
    3)、大腸菌DH5αF'IQ、大腸菌W3110、大腸菌JM105、大
    腸菌BL21、大腸菌TOPP1、大腸菌TOPP2、および、大腸菌
    TOPP3からなる群より選択される、請求項３５または３
    ６記載の単細胞宿主。
  38. 【請求項３８】 宿主が、大腸菌JM109および大腸菌BL2
    1(DE3)からなる群より選択される、請求項３５または３
    ６記載の単細胞宿主。
  39. 【請求項３９】 請求項３５または３６記載の単細胞宿
    主を培養することおよび該蛋白質を単離することによっ
    て得られる、実質的に純粋な形状の髄膜炎菌の22kDa表
    面蛋白質。
  40. 【請求項４０】 請求項１３、１６および１７のいずれ
    か一項に記載のDNA配列によってコードされるポリペプ
    チド。
  41. 【請求項４１】 請求項１４、１５および１８から２７
    のいずれか一項に記載のDNA配列によってコードされる
    ポリペプチド。
  42. 【請求項４２】 請求項３５または３６記載の単細胞宿
    主を培養する段階と、該DNA配列を単離する段階とを含
    む、DNA配列を作製するための方法。
  43. 【請求項４３】 請求項３５または３６記載の単細胞宿
    主を培養する段階と、該ポリペプチドを単離する段階と
    を含む、ポリペプチドを作製するための方法。
  44. 【請求項４４】 請求項４３記載の方法によって得られ
    る、実質的に純粋な形状のポリペプチド。
  45. 【請求項４５】 ａ）髄膜炎菌バクテリアの培養物の分
    離、ｂ）バクテリア培養物からの外膜部分の分離、およ
    び、ｃ）この外膜部分からの抗原の分離、を含む、請求
    項１記載の抗原を単離するための方法。
  46. 【請求項４６】 段階（ｃ）に、外膜部分をプロテイナ
    ーゼＫで処理した後蛋白質分画を行うという段階がさら
    に含まれる、請求項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 請求項１から５、８、１３、１６およ
    び１７のいずれか一項に記載の１個以上の抗原またはそ
    の断片を含む薬学的成物。
  48. 【請求項４８】 請求項４０記載の１個以上の抗原また
    はその断片を含む、薬学的組成物。
  49. 【請求項４９】 請求項４１記載の１個以上の抗原また
    はその断片を含む、薬学的組成物。
  50. 【請求項５０】 請求項６、７、９、１２、１４、１
    ５、および１８から２７のいずれか一項に記載の１個以
    上の抗原またはその断片を含む、薬学的組成物。
  51. 【請求項５１】 ワクチンである、請求項４９記載の薬
    学的組成物。
  52. 【請求項５２】 ワクチンである、請求項５０記載の薬
    学的組成物。
  53. 【請求項５３】 薬学的に許容される一つ以上の賦形剤
    をさらに含む、請求項４９記載の薬学的組成物。
  54. 【請求項５４】 薬学的に許容される一つ以上の賦形剤
    をさらに含む、請求項５０記載の薬学的組成物。
  55. 【請求項５５】 請求項５１または５２記載のワクチン
    を薬学的有効量投与することを含む、患者の髄膜炎菌に
    よる感染を予防するための方法。
  56. 【請求項５６】 ヒトにおいて髄膜炎菌感染を予防する
    ための、髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質またはその断片、相
    同体もしくは誘導体の、薬学的有効量の使用。
  57. 【請求項５７】 ヒトにおいて淋菌感染を予防するため
    の、髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質またはその断片、相同体
    もしくは誘導体の、薬学的有効量の使用。
  58. 【請求項５８】 ヒトにおいて髄膜炎菌感染を予防する
    ためのワクチンの製造を目的とする、髄膜炎菌22 kDa表
    面蛋白質またはその断片、相同体もしくは誘導体の使
    用。
  59. 【請求項５９】 ヒトにおいて淋菌感染を予防するため
    のワクチンの製造を目的とする、髄膜炎菌22 kDa表面蛋
    白質またはその断片、相同体もしくは誘導体の使用。
  60. 【請求項６０】 髄膜炎菌の既知の菌株の50％以上に存
    在する約22 kDaの分子量を有する蛋白質に特異的に結合
    する抗体またはその断片。
  61. 【請求項６１】 髄膜炎菌の既知の菌株の約99％に特異
    的に結合する、請求項６０記載の抗体またはその断片。
  62. 【請求項６２】 モノクローナル抗体またはその断片で
    ある、請求項６０記載の抗体またはその断片。
  63. 【請求項６３】 マウス由来である、請求項６２記載の
    モノクローナル抗体またはその断片。
  64. 【請求項６４】 IgGアイソタイプである、請求項６３
    記載のモノクローナル抗体またはその断片。
  65. 【請求項６５】 Me-1、Me-2、Me-3、Me-5、Me-6、また
    はMe-7である、請求項６２記載のモノクローナル抗体ま
    たはその断片。
  66. 【請求項６６】 Me-1またはMe-7モノクローナル抗体で
    ある、請求項６２記載のモノクローナル抗体。
  67. 【請求項６７】 ａ）髄膜炎菌の調製物を哺乳動物に導
    入すること、および、 ｂ）抗体を含む哺乳動物から血清を分離すること、 を含む、請求項６０記載の抗体を単離するための方法。
  68. 【請求項６８】 ａ）髄膜炎菌の調製物を、哺乳動物の
    抗体産生細胞に導入すること、 ｂ）ハイブリドーマ細胞を形成させるために、ミエロー
    マ細胞と抗体産生細胞とを融合させること、および、 ｃ）該ハイブリドーマ細胞から、モノクローナル抗体を
    単離すること、を含む、請求項６２記載のモノクローナ
    ル抗体を単離するための方法。
  69. 【請求項６９】 請求項６０〜６６のいずれか一項に記
    載の抗体またはその断片を１つ以上含む薬学的組成物。
  70. 【請求項７０】 ワクチンである、請求項６９記載の薬
    学的組成物。
  71. 【請求項７１】 薬学的に許容される賦形剤をさらに含
    む、請求項６９記載の薬学的組成物。
  72. 【請求項７２】 抗体がMe-1またはMe-7である、請求項
    ６９記載の薬学的組成物。
  73. 【請求項７３】 請求項７０記載のワクチンを薬学的有
    効量投与することを含む、髄膜炎菌に感染している患者
    または感染の疑いのある患者を治療するための方法。
  74. 【請求項７４】 髄膜炎菌抗原を含む生物試料または含
    むと思われる生物試料において、髄膜炎菌抗原を検出す
    るための、以下を含む方法： ａ）患者から生物試料を分離すること、 ｂ）請求項６０記載の抗体またはその断片を、混合液を
    作るために生物試料とともにインキュベートすること、
    および、 ｃ）髄膜炎菌抗原の存在を示す特異的な結合抗原または
    結合断片を、混合液中から検出すること。
  75. 【請求項７５】 抗体がMe-1またはMe-7である、請求項
    ７２記載の方法。
  76. 【請求項７６】 髄膜炎菌抗体を含む生物試料または含
    むと思われる生物試料において、髄膜炎菌抗原に特異的
    な抗体を検出するための、以下を含む方法： ａ）患者から生物試料を分離すること、 ｂ）請求項１記載の抗原またはその断片を、混合液を作
    るため生物試料とともにインキュベートすること、およ
    び、 ｃ）髄膜炎菌抗原に特異的な抗体の存在を示す特異的な
    結合抗原または結合断片を、混合液中から検出するこ
    と。
  77. 【請求項７７】 抗原が髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質で
    ある、請求項７６記載の方法。
  78. 【請求項７８】 病原性のナイセリア菌を含む生物試料
    または含むと思われる生物試料において、該菌を検出す
    るための、以下を含む方法： ａ）患者から生物試料を分離すること、 ｂ）請求項１３記載のDNA配列を有するDNAプローブを、
    混合液を作るため生物試料とともにインキュベートする
    こと、および、 ｃ）ナイセリア菌が存在することを示す特異的な結合DN
    Aプローブを、混合液中から検出すること。
  79. 【請求項７９】 病原性のナイセリア菌を含む生物試料
    または含むと思われる生物試料において、該菌を検出す
    るための、以下を含む方法： ａ）患者から生物試料を分離すること、 ｂ）請求項１２記載のDNA配列を有するDNAプローブを、
    混合液を作るため生物試料とともにインキュベートする
    こと、および、 ｃ）ナイセリア菌が存在することを示す特異的な結合DN
    Aプローブを、混合液中から検出すること。
  80. 【請求項８０】 DNAプローブが、図１（配列番号：
    １）の525塩基対配列を有する、請求項７８記載の方
    法。
  81. 【請求項８１】 DNAプローブが、図１（配列番号：
    １）の525塩基対配列の部分配列を有する、請求項７８
    記載の方法。
  82. 【請求項８２】 DNAプローブが、図８（配列番号：
    ３）の528塩基対配列の全部または一部を有する、請求
    項７９記載の方法。
  83. 【請求項８３】 DNAプローブが、図９（配列番号：
    ５）の525塩基対配列の全部または一部を有する、請求
    項７９記載の方法。
  84. 【請求項８４】 DNAプローブが、図１０（配列番号：
    ７）の525塩基対配列の一部または全部を有する、請求
    項７９記載の方法。
  85. 【請求項８５】 DNAプローブが、図１（配列番号：
    １）の髄膜炎菌の22 kDa表面蛋白質の、連続した少なく
    とも約６ヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマ
    ーである、請求項７８記載の方法。
  86. 【請求項８６】 DNAプローブが、図８（配列番号：
    ３）、図９（配列番号：５）、および図１０（配列番
    号：７）の中から選択される配列を有する髄膜炎菌の22
    kDa表面蛋白質の、連続した少なくとも約６ヌクレオチ
    ドに相補的な配列を有するオリゴマーである、請求項７
    ９記載の方法。
  87. 【請求項８７】 ａ）ポリメラーゼ連鎖反応法のための
    プライマーであり、標的領域に隣接した位置にあるオリ
    ゴマーのセットを提供すること、および、 ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法によって、標的領域を増幅
    すること、をさらに含む、請求項８５または８６記載の
    方法。
  88. 【請求項８８】 以下を含む、患者から髄膜炎菌を検出
    するための方法： ａ）請求項６０記載の抗体またはその断片を、検出可能
    な標識で標識すること、 ｂ）標識した抗体または標識した断片を患者に投与する
    こと、および、 ｃ）髄膜炎菌が存在することを示す特異的結合標識抗体
    または標識断片を、患者から検出すること。
  89. 【請求項８９】 ヒトにおける髄膜炎菌感染の予防を目
    的とする、髄膜炎菌22 kDa表面蛋白質に特異的な抗体の
    薬学的有効量の使用。
  90. 【請求項９０】 ヒトにおける髄膜炎菌感染を検出また
    は診断するためのキットの製造を目的とする、髄膜炎菌
    22 kDa表面蛋白質またはその断片、相同体もしくは誘導
    体の使用。
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Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0909323B1 (en) 1996-01-04 2007-02-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Helicobacter pylori bacterioferritin
WO1998012332A1 (en) 1996-09-17 1998-03-26 Chiron Corporation Compositions and methods for treating intracellular diseases
AU9363798A (en) 1997-11-06 1999-05-31 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
GB9726398D0 (en) 1997-12-12 1998-02-11 Isis Innovation Polypeptide and coding sequences
SG152917A1 (en) * 1998-01-14 2009-06-29 Chiron Srl Neisseria meningitidis antigens
EP2261347A3 (en) 1998-05-01 2012-01-11 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
CA2359492A1 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Neisseria meningitidis antigen
US7081244B2 (en) 1999-02-22 2006-07-25 Health Protection Agency Neisserial vaccine compositions and methods
EP1852125A3 (en) * 1999-02-22 2010-09-22 Health Protection Agency Neisserial vaccine compositions and methods
NZ581940A (en) 1999-04-30 2011-07-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Conserved neisserial antigens
GB9910168D0 (en) * 1999-04-30 1999-06-30 Chiron Spa Conserved antigens
EP1179072A2 (en) * 1999-05-19 2002-02-13 Chiron S.P.A. Combination neisserial compositions
GB9911683D0 (en) * 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
AU2013203304B2 (en) * 1999-05-19 2014-10-09 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Combination Neisserial compositions
GB9918319D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
CN1433470A (zh) 1999-10-29 2003-07-30 启龙股份公司 奈瑟球菌的抗原性肽
GB9928196D0 (en) * 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
JP4840956B2 (ja) 1999-11-29 2011-12-21 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル ８５ｋＤａのナイセリア抗原
DK1248647T3 (da) 2000-01-17 2010-09-27 Novartis Vaccines & Diagnostic Ydre membranvesikel (OMV) vaccine omfattende N. meningitidis serogruppe B ydre membranproteiner
PT1947187E (pt) 2000-02-28 2011-07-04 Novartis Vaccines & Diagnostic Expressões híbridas de proteínas de neisseria
MXPA03000822A (es) 2000-07-27 2004-11-01 Childrens Hosp & Res Ct Oak Vacunas para proteccion de espectro amplio contra enfermedades causadas por neisseria meningitidis.
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
GB0103171D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
NZ533428A (en) 2001-12-12 2008-03-28 Chiron Srl Immunisation against chlamydia trachomatis
CA2476626A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Chiron Corporation Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
GB0220197D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Univ Utrecht Refolding method
JP2006506467A (ja) 2002-08-02 2006-02-23 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン組成物
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
SI2351579T1 (sl) 2002-10-11 2017-05-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polipeptidna cepiva za široko zaščito proti hipervirulentnim meningokoknim linijam
KR101130948B1 (ko) 2002-11-01 2012-03-30 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 건조 공정
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
WO2004060396A2 (en) 2002-12-27 2004-07-22 Chiron Corporation Immunogenic compositions containing phospholpid
WO2004087153A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Chiron Corporation Use of organic compounds for immunopotentiation
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
US9107831B2 (en) 2003-06-02 2015-08-18 Novartis Vaccines And Diagonstics, Inc. Immunogenic compositions containing microparticles comprising adsorbed toxoid and polysaccharide-containing antigens
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
US8574596B2 (en) 2003-10-02 2013-11-05 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Pertussis antigens and use thereof in vaccination
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
EP1765313A2 (en) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
CA2571710A1 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Nicholas Valiante Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
WO2006078318A2 (en) 2004-07-29 2006-07-27 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
PT2682126T (pt) 2005-01-27 2017-02-28 Children`S Hospital & Res Center At Oakland Vacinas de vesícula com base em agn1870 para proteção de amplo espetro contra doenças causadas por neisseria meningitidis
GB0502096D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Purification of streptococcal capsular polysaccharide
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
GB0505996D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
JP2009511636A (ja) 2005-10-18 2009-03-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド アルファウイルスレプリコン粒子による粘膜免疫および全身免疫
EP2360175B1 (en) 2005-11-22 2014-07-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and Sapovirus virus-like particles (VLPs)
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
ES2376492T3 (es) 2006-03-23 2012-03-14 Novartis Ag Compuestos de imidazoquinoxalina como inmunomoduladores.
WO2007144316A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
BRPI0816689B1 (pt) 2007-09-12 2021-08-24 Novartis Ag Composição de vacina, kit e método para a confecção de uma composição de vacina para a prevenção ou tratamento de infecção por streptococcus pyogenes
SI2200642T1 (sl) 2007-10-19 2012-06-29 Novartis Ag Formulacije meningokoknega cepiva
US8815253B2 (en) 2007-12-07 2014-08-26 Novartis Ag Compositions for inducing immune responses
NZ601543A (en) 2007-12-21 2013-03-28 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o
EP2886551A3 (en) 2008-02-21 2015-09-23 Novartis AG Meningococcal fhbp polypeptides
AU2009222105B2 (en) 2008-03-03 2012-05-17 Novartis Ag Compounds and compositions as TLR activity modulators
AU2009309416B2 (en) 2008-10-27 2015-05-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification method
US8585505B2 (en) 2008-12-15 2013-11-19 Tetris Online, Inc. Inter-game interactive hybrid asynchronous computer game infrastructure
AU2009329193A1 (en) 2008-12-17 2011-07-14 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
CA2748788C (en) 2009-01-05 2021-02-09 Epitogenesis Inc. The use of a composition comprising mustard oil, catechin, and vitamin a for modulating an immune response
NZ594029A (en) 2009-01-12 2014-01-31 Novartis Ag Cna_b domain antigens in vaccines against gram positive bacteria
EP2411048B1 (en) 2009-03-24 2020-05-06 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
RU2555757C2 (ru) 2009-03-24 2015-07-10 Новартис Аг Комбинации менингококкового фактор н-связывающего белка и пневмококковых сахаридных конъюгатов
ITMI20090946A1 (it) 2009-05-28 2010-11-29 Novartis Ag Espressione di proteine ricombinanti
US9517263B2 (en) 2009-06-10 2016-12-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Benzonaphthyridine-containing vaccines
AU2010288239B2 (en) 2009-08-27 2014-01-16 Novartis Ag Adjuvant comprising aluminium, oligonucleotide and polycation
EP2470204B1 (en) 2009-08-27 2015-12-16 GlaxoSmithKline Biologicals SA Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
JO3257B1 (ar) 2009-09-02 2018-09-16 Novartis Ag مركبات وتركيبات كمعدلات لفاعلية tlr
CN102844047B (zh) 2009-09-02 2017-04-05 诺华股份有限公司 含tlr活性调节剂的免疫原性组合物
WO2011039631A2 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novartis Ag Expression of meningococcal fhbp polypeptides
CA2779798C (en) 2009-09-30 2019-03-19 Novartis Ag Conjugation of staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides
BR112012010531A2 (pt) 2009-10-27 2019-09-24 Novartis Ag "polipeptídeos de modificação meningocócica fhbp"
AU2010310919B2 (en) 2009-10-30 2015-05-07 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular saccharides
WO2011057148A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Irm Llc Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators
JP5814933B2 (ja) 2009-12-15 2015-11-17 ノバルティス アーゲー 免疫増強化合物の均質な懸濁物およびその使用
JP2013521770A (ja) 2010-03-10 2013-06-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン組成物
CA2793510A1 (en) 2010-03-18 2012-02-16 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for serogroup b meningococcus
KR101853513B1 (ko) 2010-03-23 2018-04-30 노파르티스 아게 감염, 염증, 호흡기 질환 등의 치료를 위해 사용되는 ｔｌｒ2 효능제로서의 화합물 (시스테인 기재 리포펩티드) 및 조성물
EP2552942B1 (en) 2010-03-30 2017-12-27 Children's Hospital & Research Center at Oakland Factor h binding proteins (fhbp) with altered properties and methods of use thereof
CA2796571C (en) 2010-04-13 2019-10-29 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
WO2011161653A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
EP3831406B1 (en) 2010-08-23 2024-06-05 Wyeth LLC Stable formulations of neisseria meningitidis rlp2086 antigens
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
AU2011300409B2 (en) 2010-09-10 2015-03-26 Wyeth Llc Non-lipidated variants of Neisseria meningitidis ORF2086 antigens
BR112013005626B1 (pt) 2010-09-10 2022-07-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Meningococo, processo para a preparação de uma cepa meningocócica, vesículas de membrana externa, composição farmacêutica imunogênica, e, uso de uma composição
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
US20130315959A1 (en) 2010-12-24 2013-11-28 Novartis Ag Compounds
WO2012153302A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Novartis Ag Antipyretics to enhance tolerability of vesicle-based vaccines
AU2012272652B2 (en) 2011-06-24 2017-06-01 Epitogenesis Inc. Pharmaceutical compositions, comprising a combination of select carriers, vitamins, tannins and flavonoids as antigen-specific immuno-modulators
BR112014016223A8 (pt) 2011-12-29 2017-07-04 Novartis Ag combinações adjuvantes de proteínas de ligação de fator h meningocócico
ES2654613T3 (es) 2012-02-02 2018-02-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Promotores para una expresión aumentada de proteínas en meningococos
EP2823312B1 (en) 2012-03-08 2019-08-07 GlaxoSmithKline Biologicals SA In vitro potency assay for protein-based meningococcal vaccines
MX351993B (es) 2012-03-09 2017-11-03 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de las mismas.
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
NZ630133A (en) 2012-06-14 2016-10-28 Novartis Ag Vaccines for serogroup x meningococcus
AU2013311702A1 (en) 2012-09-06 2015-02-19 Novartis Ag Combination vaccines with serogroup B meningococcus and D/T/P
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
MX369534B (es) 2013-09-08 2019-11-11 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y sus metodos.
HUE052293T2 (hu) 2014-02-28 2021-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Módosított fHbp meningococcus-polipeptidek
CA3212723A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 Peter T. Beernink Factor h binding protein variants and methods of use thereof
RU2723045C2 (ru) 2015-02-19 2020-06-08 Пфайзер Инк. Композиции neisseria meningitidis и способы их получения
US20180044429A1 (en) 2015-03-09 2018-02-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
MA41842A (fr) 2015-03-31 2018-02-06 Oblique Therapeutics Ab Nouveaux procédés de sélection d'épitope
US11612664B2 (en) 2016-04-05 2023-03-28 Gsk Vaccines S.R.L. Immunogenic compositions
WO2017184619A2 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Celldex Therapeutics, Inc. Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof
GB201617002D0 (en) 2016-10-06 2016-11-23 Oblique Therapeutics Ab Multi-protease method
JP7010961B2 (ja) 2017-01-31 2022-02-10 ファイザー・インク 髄膜炎菌組成物およびその方法
US11459393B2 (en) 2018-04-17 2022-10-04 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-CD27 and anti-PD-L1 antibodies and bispecific constructs
US20220016168A1 (en) 2018-12-11 2022-01-20 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy
EP4320159A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Celldex Therapeutics, Inc. Antibodies against ilt4, bispecific anti-ilt4/pd-l1 antibody and uses thereof
GB202115077D0 (en) 2021-10-21 2021-12-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Assay
WO2023077521A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Celldex Therapeutics, Inc Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0273116A3 (en) 1986-10-09 1990-05-02 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Gonococcal and meningococcal polypeptides, vaccines and diagnostics
CA2122630A1 (en) * 1992-08-31 1994-03-17 Global Tek, Inc. Monoclonal antibody to cell surface protein of the bacterium neisseria meningitidis

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