CN100387718C - 抗蛋白酶k降解的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白 - Google Patents

Abstract

脑膜炎奈瑟氏球菌菌体表面的一种高度保守的，免疫可及的抗原。在治疗，预防和诊断脑膜炎奈瑟氏球菌病上有用的免疫治疗，预防和诊断组合物及方法。一种抗蛋白酶降解的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，其表观分子量为22kDa，以及其相应的核苷酸及衍生的氨基酸序列(SEQID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6和SEQID NO：8)，生产该脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的重组DNA方法，以及与此脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白结合的抗体。

Description

抗蛋白酶K降解的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白

发明的技术领域

本发明涉及一种存在于脑膜炎奈瑟氏球菌表面的高度保守的，免疫可及的抗原。这种独特的抗原可为新的免疫治疗、预防和诊断药物提供基础，这些药物可用于脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的治疗，防护和诊断。更确切地说，本发明涉及：一种抗蛋白酶K的脑膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白，该蛋白的表观分子量为22kDa：其相应的核苷酸序列及衍生的氨基酸序列(序列SEQ ID NO：1号至序列SEQ ID NO：26号)；生产这种脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa的表面蛋白的重组DNA方法；同脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa的表面蛋白抗结合的抗体以及脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的诊断，治疗和预防的方法及组合物。

发明背景

在全世界范围，脑膜炎奈瑟氏球菌是死亡和发病的一个主要原因。脑膜炎奈瑟氏球菌既可引起地方病也可引发传染病，主要是脑膜炎和脑膜炎球菌血症〔Gold，脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的演变69页，Vedros N.A.，CRC Press(1987)，Schwartz等，临床微生物学综述2，p.S118(1989)〕。事实上，在美国，这种有机体是仅次于b型流感嗜血杆菌的引起细菌性脑膜炎的最普遍的病因，大约占所有病例的20％，有充分的资料证明，抗脑膜炎奈瑟氏球菌的主要防御机制是杀菌血清的活力。并且，抵御细菌侵入是同血清中存在的抗脑膜炎抗体相关联〔Goldschneider等，实验医学杂志129，1307页(1969)；Goldschneider等，实验医学杂志129，1327页(1969)〕。

根据荚膜抗原的不同，脑膜炎奈瑟氏球菌可分为多个血清型组。目前，已知有12个血清型组，然而其中以血清型组A、B、C、Y和W-135最为常见。在血清型组内部，可根据荚膜蛋白和荚膜上的脂多糖再分为各血清类型，亚型及免疫型〔Frasch等，传染病综述.7，504页(1985)〕。

当前能提供的荚膜多糖疫苗不能有效地抵抗所有的脑膜炎奈瑟氏球菌分离株并且也不能有效地诱导小儿产生保护抗体〔Frasch，临床微生 物学综述.2，p.S134(1989)；Reingold 等柳叶刀，114页(1985)；Zollinger in Woodrow和Levine，新一代疫苗，325页，MarcelDekker Inc.N.Y(1990)〕。目前，血清型组A、C、Y和W-135的荚膜多糖用于生产抵御此菌的疫苗。这些多糖疫苗在短期内有效。然而，被注射疫苗的个体不能产生免疫记忆，所以他们在三年内必须被重新免疫以维持抵御水平。

进一步说，这些多糖疫苗不能在二岁以下儿童中诱发产生足够水平的杀菌抗体来达到理想的保护效果，而该病的主要受害者正是这些小儿。在发达国家中，血清型组B是脑膜炎疾病主要病因之一。然而，当前却没有有效的疫苗一抵抗此种细菌。事实上，血清型群体B的多糖不是一种好的免疫原，其仅能诱导很低的IgM反应，并且IgM具有较差的特异性，因而保护性也差〔Gotschlich  等，实验医学杂志129页，1349(1969)；Stevakis 等，传染病杂志149，387页(1984)；Zollinger等，临床研究杂志63，836页(1979)〕。再者，新生儿的人脑组织的糖蛋白中存在有非常相似且能引起交叉反应的结构，这可能使得想提高血清型群体B的多糖的免疫原性的企图受挫。

为了得到更有效的疫苗，其它的脑膜炎奈瑟氏球菌的表面抗原正在调研中，比如脂多糖，毛(pili)蛋白和位于外膜上的一些蛋白。还有些报道表明在接受免疫的志愿者及病愈恢复期病人的血清中存在一定的抗前述表面蛋白抗原的免疫反应及杀菌抗体〔Manderell和Zollinger，传染病免疫57，1590页(1989)；Poolman等，感染与免疫40，398页(1983)；Rosenquist等，临床微生物杂志26，1543页(1988)；Wedge和Froholm，感染与免疫51，571页(1986)；Wedge和Michaelsen，临床微生物学杂志25，1349页(1987)〕。

更进一步，有报道称直接抗外膜蛋白，如类1，2/3和类5的单克隆抗体隆抗体也有杀菌效应并且在实验中可保护动物免遭感染〔Brodeur等，感染与免疫.50，510页(1985)；Frasch等，临床医学研究9，101页(1986)；Saukkonen等，微生物病原学3，261页(1987)；Saukkonen等，疫苗7，325页(1989)〕。

基于脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白而制备的抗原，在动物及人体均表明共有免疫原的作用，其中的一些已在进行临床测试〔Bjune等，手 术刀1093页(1991)；Costa等，HIPH年鉴14，215页(1991)；Frasch等，医学和营养学，43，177页(1982)；Frasch等，欧洲临床 微生物学杂志4，533页(1985)；Frasch  等in Robbins，细菌疫 苗262页Praeger Publications，N.Y.(1987)；Frasch 等，传染病 杂志158，710页(1988)；Moreno等，感染与免疫.47，527页(1985)；Rosenqvist等，临床微生物学杂志26，1543页(1988)；Sierra 等，NIPH 年鉴14，195页(1991)；Wedge和Froholm，感 染与免疫.51，571页(1986)；Wedge和Michaelsen，临床微生物学 杂志25，1349页(1987)；Zollinger等，临床研究杂志63，836页(1979)；Zollinger等，NIPH 年鉴14，211页(1991)〕。但是，株系内的外膜蛋白存在有很大的抗原变异性，这将限制其在疫苗上的应用〔Frasch，临床微生物学综述p.S134(1989)〕。事实上，从一种血清型细菌提取的抗原所制备的杀菌抗体严格地只对该种血清型或相关的血清型细胞有作用〔Zollinger in  Woodrow和Levine，新一 代疫苗，325页，Marcel Dekker Inc.N.Y.(1990)〕更进一步，在小儿中由这些疫苗产生的保护作用尚待明确。高度保守的脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白，如类4〔Munkley  等，微生物病原体11，447页(1991)〕蛋白和脂蛋白(lip protein)(也叫H.8)，并不能诱导产生杀菌抗体，因而并非理想的免疫候选者。为了改进这些疫苗，需要有高保守的，位于所有脑膜炎奈瑟氏球菌株系表面的蛋白，且此蛋白可以诱导产生杀菌抗体，以便开发一种广谱的疫苗。

目前实验室中用于检测脑膜炎奈瑟氏球菌的方法有：涂片制备后进行格兰氏染色，胶乳凝集或共凝集，在加富培养基和选择性培养基上培养并分离细菌〔Morello 等in Balows，临床微生物学手册，258页，美国微生物学联合会，华盛顿(1991)〕。碳水化合物降解测试常用来证明脑膜炎奈瑟氏球菌分离物的鉴定。绝大多数上述的实验过程是耗时的并且需受过训练的人员。市售的凝集或共凝集反应试剂盒中含有多价血清，该血清可以直接抗绝大多数流行的血清型组所表达的荚膜抗原，所以可用于快速鉴别脑膜炎奈瑟氏球菌。然而，这些多价血清通常是非特异性的，并且可同其它细菌发生交叉反应，正因如此，它必须同格兰氏染色和细菌培养等方法联用。所以，需要另一种有效的替代办法来提高诊断的速度及可靠性。

发明公开

本发明通过提供了一种高度保守的，位于脑膜炎奈瑟氏球菌表面的且是免疫可及的抗原，解决了前述的问题。本发明还提供了编码前述抗原的重组DNA分子，用这类DNA分子转化的单细胞宿主，以及制备基本上纯的重组抗原的方法。本发明也提供了特异性抗前述脑膜炎奈瑟氏球菌抗原的抗体。本发明中的抗原和抗体为脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的检测、防止及治疗提供了独一无二的方法及药物组合物的基础。

优选的抗原是脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa的表面蛋白，包括其片段，类似物及其衍生物。优选的抗体也是特异地抗脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白的单克隆抗体Me-1和Me-7。这些抗体对脑膜炎奈瑟氏球菌有高的溶菌性并能被动地保护小鼠免遭实验性感染。

本发明进一步提供了一种方法，该方法可用于分离新的脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原及其特异性抗体。

附图简述

图1示脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的22kDa表面蛋白的核苷酸序列及推知的氨基酸序列(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2)。氨基酸残基用常规的三字符表示开放阅读框是从143碱基起始密码子到667碱基的终止密码子。方框表示一般所公认的核糖体结合位点，下划线处显示的是一般所公认的-10启动子序列。一个含19个氨基酸的线号肽也以下划线示出。

图2显示了脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)外膜制备的经α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶消化后，经14％SDS-PAGE胶，再用考马斯蓝染色的结果。泳道1中有下列分子量标准：磷酸化酶b(97,400)；牛血清白蛋白(66,200)；卵清蛋白(45,000)；碳酸酐酶(31,000)；大豆胰蛋白酶抑制剂(21,500)；和溶菌酶(14,400)。泳道2示未经消化的外膜制备物对照。泳道3示经α-胰凝乳蛋白酶消化的制备物(2mg的酶/mg蛋白)；泳道4示胰蛋白酶消化的制备物。

图3a是脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)的外膜制备物经蛋白酶K消化后，经14％SDS-PAGE胶，再用考马斯蓝染色的结果。泳道1、3、5、7示未经消化的对照。泳道2、4、6、8示用蛋白酶K(2IU/mg蛋白)消化后的外膜制备物。泳道1至4示在pH 7.2下处理制备物。泳道5至8为在pH 9.0下处理制备物。泳道1、2、5和6示在无SDS下处理制备物。泳道3、4、7、8示有SDS的条件下处理制备物。分子量标准显示于左侧(单位为千道尔顿)。

图3b是重组的22kDa蛋白经亲合纯化后，经14％SDS-PAGE胶，再用考马斯蓝染色后的电泳迁移图。泳道1中含下列分子量标准：磷酸化酶b(97,400)，牛血清白蛋白(66,200)，卵清蛋白(45,000)，碳酸酐酶(31,000)，大豆胰蛋白酶抑制剂(21,500)和溶菌酶(14,400)。泳道2中为5μg经亲合纯化后的重组的22kDa蛋白对照。泳道3示5μg经亲合纯化后的重组22kDa蛋白100℃下加热5分钟处理后的电泳图，泳道4中为5μg经亲合纯化后的重组22kDa蛋白100℃下加热10分钟处理后的电泳图。泳道5中为5μg经亲合纯化的重组22kDa蛋白100℃下加热15分钟处理后的电泳图。

图4是经14％SDS-PAGE胶后用考马斯亮蓝染色。及其相应的Western印迹后的结果，这些结果显示了特异性地抗脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的单克隆抗体的反应性。由脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)制备的外膜制备物(A)未经处理；(B)经蛋白酶K处理(2IU/mg蛋白)。泳道1为分子量标准及外膜制备物经14％SDS-PAGE胶电泳后的特征迁移图。泳道2示Me-2；泳道3示Me-3；泳道4示Me-5；泳道5示Me-7；泳道6为一无关的作为对照的单克隆抗体。分子量标准是磷酸化酶b(97,400)，牛血清白蛋白(66,200)，卵清蛋白(45,000)，碳酸酐酶(31,000)，大豆胰蛋白酶抑制剂(21,500)和溶菌酶(14,400)。图4中显示的Me-2、Me-3、Me-5、Me-6和Me-7的免疫印迹结果同Me-1的免疫印迹结果相一致。

图5表示单克隆抗体同未经处理的细菌细胞的结合力。作为代表的单克隆抗体Me-5和Me-7的结果在纵轴上以计数/分钟表示。横轴上表示本测试用到的不同的细菌株。流感嗜血杆菌孔蛋白-特异性单克隆抗体用作阴性对照。低于500计数/分钟的本底被记录且被从结合数据中减去。

图6结果示浓集大肠杆菌BL 21(DE3)株的培养上清而得到的脑膜炎奈瑟氏球菌重组的22kDa表面蛋白的纯化经14％SDS-PAGE凝胶电泳，染色并且做其相应的Western印迹。图6(A)为经14％SDS-PAGE胶后考马斯蓝及银染的结果，泳道1包含下列分子量标准，磷酸化酶b(97,400)，牛血清白蛋白(66,200)，卵清蛋白(45,000)，碳酸酐酶(31,000)，大豆胰蛋白酶抑制剂(21,500)和溶菌酶(14,400)。泳道2为抽提脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(血清型B：2a：P1.2)而得到的外膜蛋白制备物。泳道3示经浓集的大肠杆菌BL 21(DE3)(10mg)的培养物上清。泳道4示经亲合纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌重组的22kDa表面蛋白(1mg)。图6(B)是亲合纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌重组的22kDa表面蛋白经α-胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白酶K消化后，经14％SDS-PAGE胶并用考马斯蓝染色的电泳图。泳道1包括下列分子量标准磷酸化酶b(97,400)，牛血清白蛋白(66,200)，卵清蛋白(45,000)，碳酸酐酶(31,000)，大豆胰蛋白酶抑制剂(21,500)和溶菌酶(14,400)。泳道2至泳道5为经纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌重组的22kDa的表面蛋白(2mg)。泳道7至10为牛血清白蛋白(2mg)。泳道2和7中为未经消化的蛋白(“NT”)。泳道3和8为经α-胰凝乳蛋白酶(“C”)处理的蛋白(2mg酶/mg蛋白)。泳道4和9为经胰蛋白酶(“T”)处理的蛋白(2mg酶/mg蛋白)。泳道5和10为经蛋白酶K(“K”)处理的蛋白(2IU/mg蛋白)。图6(C)是用单克隆抗体Me-5时另一相同胶做Western印迹后得到的图象。

图7示经蛋白-A纯化后的抗-脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的单克隆抗体，其对脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)的作用，即其杀菌活性。图的纵轴示脑膜炎奈瑟氏球菌暴露于不同浓度的单克隆抗体后的存活百分率(单克隆抗体浓度在横轴上显示)。

图8示脑膜炎奈瑟氏球菌MCH 88株22kDa表面蛋白的核苷酸序列及推知的氨基酸序列(SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4)。氨基酸残基用常规的三字符表示。开放阅读框是从116碱基的起始密码子到643碱基的终止密码子。

图9示脑膜炎奈瑟氏球菌Z4063株22kDa表面蛋白的核酸序列及推知的氨基酸序列(SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6)。氨基酸残基用常规的三字符表示。开放阅读框显示从208碱基的起始密码子到732碱基的终止密码子。

图10示淋病奈瑟氏球菌b2株22kDa表面蛋白的核酸序列及推知的氨基酸序列(SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8)。氨基酸残基用常规的三字符表示。开放阅读框是从碱基241的起始密码子至碱基765的终止密码子。

图11显示了奈瑟氏菌属四个株间DNA序列的共有序列，并且也揭示了多个株中特定的核苷酸的替换或插入。

图12显示了奈瑟菌属四个株间蛋白序列的共有序列，并且同时揭示了各个株中特定的氨基酸的插入或替换。

图13示大鼠中对重组的22kDa蛋白的免疫反应的时效，是用相应的ELISA(酶连免疫吸附法)滴度来反映的。大鼠注射的外膜制备物来自大肠杆菌JM 109株，该菌带有质粒pN2202，或者是带有对照质粒pWRS30。特异的体液免疫的发展过程也用ELISA分析，该法用来自脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)的外膜制备物作为包被抗原。

图14示食蟹猴中的对重组的22kDa蛋白的免疫反应的时效，是用相应的ELISA滴度来表示的。这两只猴每次注射分别用100μg(K28)和200μg(I276)的亲合纯化的22kDa蛋白免疫。对照猴(K65)用150μg的无关重组蛋白按同样的步骤免疫。特异的体液免疫的发展过程也用ELISA分析，该法用来自脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)的外膜制备物作为包被抗原。

图15示本发明中合成的肽段及其在全长22kDa的蛋白中的相对位置，该22kDa蛋白为脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)的蛋白。

图16是质粒pNP2204的图谱，该质粒上含有编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因：22kDa；氨苄抗性基因：Amp^iR；氨基抗性编码区，ColE1，复制起始区；CI857，噬菌体λCI857温度敏感阻遏物基因：λPL，噬菌体λ转录启动子，T1转录终止子，转录方向用箭头指示。用来插入在p629质粒上的22kDa基因的限制酶切位点是Bgl II和BamHI。

发明详述

在我们研究脑膜炎奈瑟氏球菌外膜的超结构时，我们发现一个新的低分子量的22kDa蛋白，它有独特的性质。此外膜蛋白对于蛋白水解酶如蛋白酶K，一个林伯氏白色念球菌(霉菌)来源的丝氨酸蛋白酶，的处理有着很高的抗性。这一点十分令人吃惊，因为抗蛋白酶K的蛋白在自然界是很少的，这是由于蛋白酶K的水解力强，最适pH范围广并且该酶的肽键特异性也低〔Barrett，A.J.and  N.D.Rawlings，生化协会学报(1991)19：707～715〕现仅有几例报道描述了一些原核来源的蛋白具有对蛋白酶K的抗性。蛋白酶K抗性蛋白仅在钩端螺旋体属内的物种〔Nicholson，V.M.and J.F.Prescott，兽医微生物学(1993)36：123-138〕，支原体〔Bulter，G.H.等，感染免疫学(1991)59：1037-1042〕Spiroplasma mirum〔Bastian F.O.等，临床微生物学杂志(1987)25：2430～2431〕以及病毒和朊病毒中有发现〔Onodera，T.等，微生物免疫学(1993)37：311～316；Prusiner，S.B.等，美国 国家科学院院刊(1993)90：2793-2797〕。这里，我们描述了以这种蛋白作为手段来提高脑膜炎奈瑟氏球菌感染的预防，治疗和诊断。

这样，本发明的一个方面是我们提供了一种高度保守的，免疫可及的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，及其片段，类似物和衍生物。正如此处所用到的，“脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白”指任何由自然发生的脑膜炎奈瑟氏球菌基因所编码的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白。根据本发明，这种脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白可以是自然界来源，或是通过分子生物学技术的运用而得到，目标是产生一种重组蛋白，或是其片段。

此处所用的“高保守”意思是编码这种脑膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白的基因及其蛋白产物存在于50％以上的已知的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中。优选的，此基因及其蛋白存在于99％以上的已知的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中。实施例2和4中提出一种方法，用此法，本领域的技术人员可以检测众多的不同的脑膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白，在确定它们是否是“高保守”。

此处所用的“免疫可及的”指的是脑膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白位于菌体表面并且抗体可及并与其作用。实施例2中提出一种方法，用此种方法，本领域的技术人员可以检测众多的不同的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，以确定它们的否是“免疫可及的”。免疫可及性可用其它方法确定，包括凝集反应分析、ELISA分析、RIA、免疫印迹分析、斑点-酶分析、表面可及性分析、电镜分析，或是这些分析的组合。

此处所用的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的“片段”包括至少含一个肽表位的多肽，或其类似物和衍生物。这类肽可通过分子生物学的应用获得或者用传统的液相或固相肽合成技术来合成。

此处所用的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白“类似物”包括这样一些蛋白或其片段，在这些蛋白中，自然发生序列中的一个或多个氨基酸残基被其它的氨基酸残基所替换，只要此蛋白的整体功能和其具保护性的特征依旧保存。这些类似物可以合成生产或用重组DNA技术生产。比如通过对天然发生的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的突变生产一个类似物，这些方法在本领域内部是尽人皆知的。

例如，正如图10中所述，其中一个这样的类似物由淋病奈瑟氏球菌b2株的编码22kDa蛋白的基因所编码生产的重组蛋白中选出。另一个类似物是通过分离乳糖奈瑟氏球菌来源的相应基因而得到。

此处所用的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的“衍生物”是指被共价修饰过的蛋白或蛋白片段，比如，用二硝基苯酚修饰，目的是使其在人体内有免疫原性。本发明中的衍生物也包括本发明中的氨基酸类似物的衍生物。

应该理解的是通过本发明的实施例，本领域的技术人员可以通过适当的实验来决定一个特定的片段，类似物或衍生物在脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的诊断、防御或治疗上是否有用。

本发明也包括脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，片段，类似物和衍生物的多聚体形式。这些多聚体形式包括，例如，一个或多个多肽通过抗生素蛋白/生物素、戊二醛或二甲基辛二酰亚胺(suberimidate)等交联剂交联在一起。这类多聚体形式也包括含有2个或更多串联或反向邻近的脑膜炎奈瑟氏球菌序列的多肽，这种多肽是由重组DNA技术产生的多顺反子mRNA产生的。

本发明提供了基本上纯的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白。术语“基本上纯”指的是根据本发明该表面蛋白不含其它脑膜炎奈瑟氏球菌来源的蛋白。基本上纯的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的制备可通过多种常规方法实现，比如用实施例3和11中所述的方法。

另一方面，本发明特别提供了脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白，或其片段，类似物或衍生物，其氨基酸序列如图1所示(SEQ IDNO：2)。

另一方面，本发明特别提供了脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白及其片段类似物或衍生物，其氨基酸序列如图8(SEQ ID NO：4)和图9(SEQ ID NO：5)所示。这个片段可能是从图15(SEQ IDNO：9到SEQ ID NO：26)所列的肽中选出的。

另一方面，本发明提供了一个22kDa的淋病奈瑟氏球菌的表面蛋白或其片段，类似物或衍生物，其氨基酸序列如图10所示(SEQ ID NO：8)从以上可清楚地看出，任何关于脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa蛋白的论述也包括从奈瑟氏菌属的其它物种如淋病奈瑟氏球菌或乳糖奈瑟氏球菌中分离到的或是由分离自这些物种的基因产生的22kDa蛋白。

依据本发明，脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白可用下列特征进一步定性。

(1)根据SDS-PAGE凝胶电泳估计其分子量约为22kDa；

(2)其在SDS-PAGE胶上的泳动性不因还原剂的处理而受影响；

(3)其等电点(PI)范围为pI8到pI10；

(4)其对蛋白水解酶如α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的降解有高的抗性；

(5)高碘酸盐氧化不能消除直接抗脑膜炎奈瑟氏球菌表面22kDa蛋白的抗体同其的特异性结合；

(6)它是一个高保守的抗原；

(7)在未经处理的脑膜炎奈瑟氏球菌表面，抗体可同该蛋白相接触；

(8)其能诱导产生杀菌抗体；

(9)其能诱导产生抗体，该抗体可抵抗实验侵染；

(10)当被注射入动物宿主后，它能诱导免疫反应的发展，免疫反应可抵御脑膜炎奈瑟氏球菌的感染。

本发明还首次提供了编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的DNA序列(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7)。

本发明的更优的DNA序列选自：

(a)图1的DNA序列(SEQ ID NO：1)；

(b)图8的DNA序列(SEQ ID NO：3)；

(c)图9的DNA序列(SEQ ID NO：5)；

(d)图10的DNA序列(SEQ ID NO：7)；

(e)前述DNA序列的类似物或衍生物；

(f)与前述DNA序列可简并的DNA序列；和

(g)前述任何DNA序列的片段；其中所说的序列编码的产物可显示脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的免疫活性。

这类片段是优选的肽，正如图15所述(SEQ ID NO：9，SEQID NO：26)。

优选地，本发明首次提供了编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的DNA序列(SEQ ID NO：1)。本发明更优选的DNA序列选自：

(a)图1的DNA序列(SEQ ID NO：1)；

(b)前述DNA序列的类似物或衍生物；

(c)与任一上述序列可简并的DNA序列；和

(d)任一前述DNA序列的片段，此处所说的序列编码的产物可显示脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的免疫活性。

脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的编码基因的类似物或衍生物将用实施例4中所述的条件同22kDa蛋白编码基因杂交。

本发明的目的，如果脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa的表面蛋白的片段，类似物或衍生物在注射给动物宿主后能诱发免疫反应的发展，且免疫反应又能抵御脑膜炎奈瑟氏球菌的感染，则它们有该22kDa的表面蛋白的“免疫活性”。本领域的技术人员通过实施实施例6中所提出的方法可以确定一个特定的DNA序列编码的产物是否有脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的免疫活性。

本发明中的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的分离方法包含下列步骤：

a)分离-脑膜炎奈瑟氏球菌培养物；

b)从该细菌培养物中分离外膜部分；并且

c)从外膜部分分离所说的抗原。

特别需指出，前述步骤(c)可以包含其它的步骤：用蛋白酶K处理脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白抽提物，然后用常规的分离技术比如离子交换和凝胶层析及电泳等将蛋白分成各组分。

另一种方法并且是一种优选的方法是，正如在实施例3中所特别描述的，用分子生物学技术生产本发明中的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，分子生物学技术特别适用于制备基本上纯的重组的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

这样，本发明的另一个方面就是提供了一种制备重组的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的方法，也包括制备其片段，类似物及衍生物，该方法包括步骤(1)培养单细胞宿主菌，该菌是经重组DNA分子转化过的，而该重组DNA分子含有目的蛋白或其片段，类似物或衍生物的编码序列，以及含同该编码序列相连的一个或多个表达调控序列，和步骤(2)收集基本上纯的蛋白，片段，类似物或衍生物。

为了使得转染的基因在宿主体内高表达，该基因必须经操作同转染和翻译表达调控序列相连，这些调控序列在所选定的表达宿主体内是有功能的，这点是本领域内所熟知的。优选地，表达调控序列和目的基因应包含在一个含有细菌选择标记和复制起点的表达载体中，如果表达宿主为真核细胞，该表达载体还应包含一个在表达宿主内有效的表达标记。

可以用很多的表达宿主/载体组合来表达本发明中的DNA序列。有效的真核宿主表达载体包括，比如，来自SV₄₀，牛乳头瘤病毒，腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列。有效的细菌宿主表达载体包括已知的细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒ColE1，pCR1，pBR322，pNB9及其衍生质粒，广泛宿主质粒，如RP4，噬菌体DNA，如众多的λ噬菌体的衍生物，如NM989，以及其它DNA噬菌体，比如M₁₃和丝状单链DNA噬菌体。有效的酵母细胞表达载体包括2μ质粒及其衍生物。有效的昆虫细胞表达载体包括pVL941。

此外，有许多表达调控序列都可用于这些载体来表达本发明中的DNA序列。这些有效的表达调控序列包括那些连有前述表达载体的结构基因的表达调控序列。有效的表达调控序列的例子包括，如SV₄₀或腺病毒的早期和晚期启动子，Lac系统，trp系统，TAC和TRC系统，λ噬菌体的主操纵子和启动子区，fd包被蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子，如Pho5，酵母α-结合系统的启动子和其它已知序列，这些已知序列可控制原核和真核细胞基因的表达，或足可控制原核，真核生物病毒的基因的表达，以及上述这些序列的组合。脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白的表达调控序列用于在大肠杆菌中表达该蛋白时是非常有效的(实施例3)。

用前述载体转化宿主细胞构成了本发明的另一方面。许多单细胞宿主在表达本发明中的DNA序列时都是有效的。这些宿主包括熟知的真核和原核宿主，比如一些大肠杆菌株、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、真菌、酵母、昆虫细胞如草地夜蛾(SF9)、动物细胞如CHO和小鼠细胞、非洲绿猴细胞如COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10，以及组织培养的人和植物细胞。优选的宿主包括细菌如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌及组织培养的哺乳动物细胞。

当然，应该明白的是并非所有的载体和表达调控序列在表达本发明的DNA序列时是一样好的，对同样的表达系统，所有的宿主系统也并非是一样好。然而，本领域的技术人员可以通过适当的实验，在本发明范围内，在这些载体，表达调控序列和宿主间进行选择。比如，在选择载体时，也必须考虑宿主，因载体须在宿主中复制。载体的拷贝数，控制拷贝数的能力，和由该载体编码的任意其它蛋白如抗生素标记的表达，也均需考虑。

在选择表达调控序列时，也需考虑许多因素。这些因素包括，例如，该序列的相对强度，它的控制性，和其同本发明中的DNA序列的相容性，特别应考虑其潜在的二级结构，单细胞宿主的选择应考虑其与所选载体的相容性，本发明中DNA序列的编码产物的毒性，它们的分泌特性，其正确折叠蛋白的能力，其发酵或培养的需求，以及本发明中的DNA序列的编码产物应该容易从宿主中纯化。

在这些参考中，本领域的技术人员可选择不同的载体/表达调控序列/宿主组合，通过发酵或大规模动物培养来表达本发明中的DNA序列。

本发明中的DNA序列编码的多肽可通过发酵或细胞培养分离制得并且可用多种的常规方法对之纯化。本领域的技术人员在本发明范围内可选择最合适的分离、纯化技术。

本发明中的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白对由脑膜炎奈瑟氏球菌感染引起疾病的预防，治疗和诊断都将是有用的。

本发明中的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白对由淋病奈瑟氏球菌或乳糖奈瑟氏球菌感染引起的疾病的预防，治疗和诊断都将是有用的。

根据本发明，脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白特别适合于产生抗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的抗体，并形成抗病的保护性反应。

根据本发明，脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白特别适合于产生抗淋病奈瑟氏球菌疾病或乳屑奈瑟氏球菌疾病的抗体，并形成抗病的保护性反应。

我们特别提出一种脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，类似物或衍生物用作免疫原和疫苗，该蛋白的氨基酸序列如图1(SEQID NO：2)所示。

我们特别提出一种脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，类似物或衍生物用作免疫原和疫苗，其氨基酸序列如图1(SEQ ID NO：2)，图8(SEQ ID NO：4)，图9(SEQ ID NO：6)或图10(SEQ ID NO：8)所示。

可对此脑膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白运用标准的免疫技术以使之可被用作免疫原和疫苗。特别是，任何合适的宿主被注射药理学上有效剂量的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白后，可产生单克隆或多价抗脑膜炎奈瑟氏球菌的抗体，或是诱发抗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的保护性免疫反应的形成。在宿主被注射前，可使脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白形成合适的颗粒，这样我们提供一种药物组合物，其包含一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原或其片段。优选地，此抗原就是脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，类似物或衍生物。另加一种或多种药学上可接受的赋形剂。此处用的“药理学上有效剂量”指的是一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原或其片段的剂量，该剂量可以诱导产生足够高的抗脑膜炎奈瑟氏球菌抗体的滴度，此抗体滴度可用来治疗或预防脑膜炎奈瑟氏球菌感染。

本发明中的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白也可为脑膜炎奈瑟氏球菌感染的诊断测试提供基础。有几种诊断方法是可行的。比如，本发明提供了一种方法来检测一个生物样品中的脑膜炎奈瑟氏球菌抗原，该样品含有或怀疑含有脑膜炎奈瑟氏球菌抗原，方法包括：

a)从患者处分离生物样品；

b)将该生物样品同抗-抗脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的抗体或其片段温育，形成混合物，并

c)在混合物中检测特异结合抗体或片段，以显示脑膜炎奈瑟氏球菌抗原的存在。

优选的的用于前述诊断方法中的抗体是Me-1和Me-7。

另一方面，本发明提供了一种方法来检测生物样品中的脑膜炎奈瑟氏球菌抗原特异的抗体，该样品含有或怀疑含有所说的抗体，方法包括：

a)从患者处分离生物样品；

b)将该生物样品同本发明中的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白或其片段温育，形成混合物；并

c)在混合物中检测特异结合的抗原或其片段以显示特异性地抗脑膜炎奈瑟氏球菌的抗体的存在。本领域的技术人员会认识到这种诊断测试可采用几种形式，包括免疫测试如酶连免疫吸附分析(ELISA)，注射免疫分析或胶乳凝集分析，来决定该蛋白的特异性抗体是否存在于生物体中。

本发明中的DNA序列也可用来设计探针并检测一含有或怀疑含有奈瑟菌的生物样品中存在的病原奈瑟菌。本发明的检测方法包含下列步骤：

a)从患者处分离生物样品；

b)将生物样品同含本发明DNA序列的探针温育，形成混合物；并

c)检测混合物中的特异结合的DNA探针来显示奈瑟菌的存在。

优选的的DNA探针含有下列图中所示的碱基序列：图1(SEQ IDNO：1)，图8(SEQ ID NO：3)，图9(SEQ ID NO：5)，或图10(SEQ ID NO：7)，或是图11(SEQ ID NO：9)中的共有序列。

更优选的DNA探针应含有图1(SEQ ID NO：1)中的525碱基对序列。

作为一种诊断脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，本发明的DNA探针也可用来检测样品中的环形脑膜炎奈瑟氏球菌的核酸，比如用多聚酶链式反应探针可用常规技术合成并且可固化于固相物上，或者也可用可检测的标记来标记探针。

这一应用中的优选的DNA探针是一含有同脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因中的至少6个连续核苷酸互补的一段寡聚核苷酸，基因的序列见图1(SEQ ID NO：1)，图8(SEQ ID NO：3)，图9(SEQ ID NO：5)，图10(SEQ ID NO：7)，或图11(SEQID  NO：9)中的共有序列。

该应用中更为优选的DNA探针是一含有同脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因中至少6个连续核苷酸互补的一段寡聚核苷酸，该基因序列在图1中(SEQ ID NO：1)。

另一种检测病人中的脑膜炎奈瑟氏球菌的诊断方法包含以下步骤：

a)用一种可检测的标记来标记本发明中的抗体或其片段；

b)对病人使用标记的抗体或标记片段，并

c)检测病人中的特异结合的标记抗体或片段以揭示脑膜炎奈瑟氏球菌的存在。

为了纯化任何的抗-脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白抗体，可用亲合层析法，亲合层析中需用固化的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白作为亲合介质。

这样，根据本发明的另一方面，我们提供了一种共价结合于不溶支持物上的脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白或是其一部分或是其类似物，该蛋白的氨基酸序列包括图1(SEQ ID NO：2)，图8(SEQ IDNO：4)，图9(SEQ ID NO：6)或图10(SEQ ID  NO：8)中的序列。

根据本发明中的一个优选的方面，我们提供了一种共价结合于不溶支持物上的脑膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白或是其一部分或是其类似物，该蛋白的氨基酸序列包括图1(SEQ ID NO：2)的序列。

本发明的另一个特点是运用本发明中的脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白作为免疫原来产生特异性抗体，这样就可对脑膜炎奈瑟氏球菌的感染进行诊断，或者特别的是可对之进行治疗。用合适的筛选方法可以确定合适的抗体，比如通过在一个测试模型中测量特定抗体对脑膜炎奈瑟氏球菌感染的被动抵御力来衡量特定抗体的能力。动物模型中的一例即小鼠模型将在实施例中描述。抗体可以是完整抗体也可是其抗原结合部分并且其通常可以属于任一类免疫球蛋白，抗体或片段可以是动物来源，特定是哺乳动物来源，进一步特定为鼠，大鼠或人类来源。抗体可以是天然抗体或其片段，如果需要，也可是重组抗体或其片段。术语重组抗体或抗体片段的意思是用分子生物学技术产生的抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可以是多克隆的，或优选的，是单克隆来源。它可以是对许多个脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白相关的表位特异但它最好是对一个表位特异，优选地，此抗体或其片段是对一个或多个脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白相关的表位特异。此处描述的Me-1和Me-7单克隆抗体也是优选的。

实施例

为了更好地理解本发明，提出以下实施例。这些实施例只以阐明为目的，在任何方面均非用来限制本发明的范围。

实施例1描述了用蛋白水解酶处理脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白制备物并在其后对脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白进行鉴定。

实施例2描述了脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的特异性的单克隆抗体的制备。

实施例3描述了脑膜炎奈瑟氏球菌重组22kDa表面蛋白的制备。

实施例4描述了用DNA探针来鉴定表达脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的生物体。

实施例5描述了用抗脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的单克隆抗体来保护小鼠免受脑膜炎奈瑟氏球菌的感染。

实施例6描述了用纯化的重组22kDa表面蛋白来诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的保护性反应。

实施例7描述了对22kDa蛋白的序列及脑膜炎奈瑟氏球菌其它株(MCH88和E4063)的编码蛋白的基因序列的鉴定，并且也鉴定了淋病奈瑟氏球菌的一个株。

实施例8描述了兔和猴对此22kDa脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的免疫反应。

实施例9描述了对该22kDa脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的不同的免疫表位进行做图的方法

实施例10描述了用热来诱导一个表达载体以达到大规模生产该22kDa表面蛋白。

实施例11描述了当用重组技术生产此22kDa表面蛋白时，它的纯化过程。

实施例12描述了用22kDa表面蛋白作人的疫苗。

实施例1蛋白水解酶处理脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜制备物及其后的一种抗酶水解的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的鉴定。

由全细胞，经氯化锂，或十二烷基肌氨酸钠抽提制备的几种抗原制备物被用于研究脑膜炎奈瑟氏球菌外膜的超结构。格兰氏阴性细菌的外膜作为菌体内部和环境的界面，其中含有绝大多数的可自由暴露给宿主免疫防御的抗原。本研究的主要目标是鉴定一种能诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌的保护性反应的新抗原。发明者用的鉴定这种抗原的一种方法是，用蛋白水解酶部分降解上述的抗原制备物。这种酶处理产生的抗原决定簇然后可用下列分析来鉴定，即分析这些经处理的抗原制备物的免疫性和保护性。令我们吃惊的是，在用电泳分离脑膜炎奈瑟氏球菌氯化锂外膜抽提物后，经考马斯亮蓝R-250染色，我们观察到一低分子量条带不会因蛋白水解酶处理而破坏。考马斯亮蓝用来染蛋白或多肽并且其与外膜的另一些主要组分多糖或脂没有或几乎没有亲和性。该低分子量抗原可被考马斯亮蓝染色这一事实提示至少部分的该抗原是由肽组成并且此肽不被蛋白酶消化，或者由其它外膜结构保护其免遭酶的降解。进一步，如下面所示，即使在过度处理时，作用力非常强大的蛋白酶K也不能降解此低分子量抗原。

从不同的脑膜炎奈瑟氏球菌株用氯化锂抽提来得外膜制备物，抽提按以前发明人描述的方法进行〔Brodeur 等，感染与免疫50，510页(1985)〕。这些制备物中的蛋白成分用Lowry法确定，该法适用于膜组分〔Lowry 等，生物化学杂志193，265页(1951)〕。得自脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的外膜制备物在37℃和不断振摇的条件下，和牛胰来源的α-胰凝乳蛋白酶(E.C.3.4.21.1)(Sigma)或牛胰(E.C.3.4.21.4)(Sigma)来源的胰蛋白酶类I处理24小时。酶浓度为每毫克被处理蛋白加2mg酶。同样的外膜制备物用不同浓度(0.5到24mg/mg蛋白)的林伯氏白色念珠菌来源的蛋白酶K(Sigma  或Boehringer Mannheim Laval.Canacla)(E.C.3.4.21.14)处理。为了蛋白酶K对蛋白的降解，用了不同的实验条件。样品在振摇或不振摇时在37℃或56℃下温育1、2或24或48小时。样品混合物的pH被调为7.2或9.0。也在一些样品中加入了1％的十二烷基磺酸钠(SDS)(体积比)。处理后，马上用SDS-PAGE凝胶电泳分离样品，胶浓度为14％(重量/体积)，电泳装置用MiniProtean

(Bio-Rad，Mississauga，Ontario，加拿大)系统电泳按制造者说明进行。蛋白在SDS和2-巯基乙醇存在下于100℃加热5分钟，用14％SDS胶分离，并用考马斯亮蓝R-250染色。

图2示得自脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)的外膜制备物，经α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶在37℃下处理24小时后，14％SDS-PAGE凝胶电泳分离所得的迁移图象。同未处理时对照(图2，泳道2)相比，处理过的样品(图2，泳道3和4)中可看到高分子量蛋白和几个主要的外膜蛋白被强烈地水解消化。相反，一分子量为22kDa的蛋白带即使被处理24小时也不受任一蛋白水解酶的影响。

这个特别的蛋白用更强烈的水解条件用蛋白酶K做进一步的研究(图3)，由于蛋白酶K肽键特异性低且最适pH宽，故是最强大的蛋白水解酶之一。令人惊讶的是，该22kDa蛋白可抵御2个国际单位的蛋白酶K在56℃下作用24小时(图3，泳道2)。这样的处理在我们实验室中是用来制备几乎不含蛋白的脂多糖或DNA的。事实上，外膜制备物经此强烈的蛋白水解处理后，只能看到小肽。进一步，长时间的处理，至48小时，或高的酶量(至24个国际单位)的处理也不能改变该22kDa蛋白的量。将反应混合物pH升至9.0或是加入1.0％SDS，一种强烈的蛋白变性剂，SDS-PAGE电泳显示该22kDa蛋白的量及其迁移并不受影响(图3，泳道4，6和8)。联用此二种变性条件通常导致外膜制备物中的蛋白的完全降解，以剩下氨基酸残基。低分子量多肽在消化时经常可观察到并被认为是敏感蛋白在酶处理时未能完全消化的片段。这些片段最有可能受到外膜中碳水化合物和脂的保护而免遭进一步降解。处理过的样品中的分子量为28kDa和34kDa的带分别是残余的酶以及存在于所有检测过的酶制剂中的一种污染蛋白。

有兴趣的是，关于该22kDa蛋白抗蛋白酶的研究显示了另一表观分子量为18kDa蛋白带似乎也能抗酶的降解(图3a)。当经亲合纯化的重组22kDa蛋白经SDS-PAGE凝胶后，分析其迁移图象从而得到了这个18kDa蛋白的线索(图3b)。在上样前，当经亲合纯化的重组22kDa蛋白在含有去污剂SDS的样品缓冲液中再加热一段时间时，那条18kDa的带才是明显的。用Edman降解法进行N-末端氨基酸分析(实施例3)表明18kDa蛋白带氨基酸残基(E-G-A-S-G-F-Y-V-Q)同第1～9位氨基酸相对应(SEQ ID NO：1)。这些结果表明SDS-PAGE上看到的18和22kDa二蛋白带事实上是来自同一蛋白。这最后的结果也显示前导序列从成熟的18kDa蛋白上被切去。将进行进一步的研究来确定分子修饰以解释这种表观分子量的变化并且来估计其对该蛋白抗原性及保护性的影响。

结论是，这种有着抵御蛋白水解消化的非常罕见的性质的脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白的发现使得对其分子和免疫特性进行了进一步的研究。实施例3中纯化的，由大肠杆菌生产的重组22kDa表面蛋白也有很强的抗蛋白酶K降解的特性。目前，我们正试图理解是什么机制导致了脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的这种不寻常的对蛋白水解酶的抗性。

实施例2特异性抗22kDa脑膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的单克隆抗体的产生

此处所述的单克隆抗体由三个独立的融合实验得到。用分属血清型群体A、B、C的脑膜炎奈瑟氏球菌株604A，608B和224/C的外膜制备物去免疫雄性Balb/c小鼠(Chares River实验室，St-Constant，魁北克，加拿大)。按先前发明者所述的方法用氯化锂抽提制得外膜制备物〔Brodeur 等，感染与免疫50，510页(1985)〕。这些制备物中所含的蛋白用Lowry法确定，该法适用于膜级分〔Lowry  等，生物 化学杂志193，265页(1951)〕，用10mg的上述外膜制备物的不同的组合，对多群小鼠进行二次腹膜内及皮下注射，间隔为3周。用于免疫的佐剂为弗氏完全或不完全佐剂(Gibco试验室，Grand Island，N.Y.)或QuilA(Cedarlane实验室，Hornby，Ont.，加拿大)，这要依小鼠群体而定。在融合步骤前三天，免疫过的小鼠接受最后一次静脉注射，用10mg的上述的外膜制备物。用于产生能分泌所需单克隆抗体的杂交瘤细胞系的融合方案以前已由发明人提出〔Hamel等，医学微生物学杂志25，2434页(1987)〕。单克隆抗体Me-1，Me-2，Me-3，Me-5，Me-6和Me-7的类，亚类及轻链类型用以前报道的ELISA来确定〔Martin 等，临床微生物学28，1720页(1990)〕并且列于表1中。

单克隆抗体的特异性用Western免疫印迹检测，方法依据先前发明人所述〔Martin 等，欧洲免疫学杂志18，601页(1988)〕进行并有如下修改。从不同的脑膜炎奈瑟氏球菌株获得的外膜制备物在14％SDS-PAGE胶上电泳分离。用半干仪(Bio-Rad)将蛋白从胶上转至硝酸纤维素膜上。每块胶(6×10厘米)用60mA电流作用10min，电印迹缓冲液含有25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸和20％甲醇，pH 8.3。Western印迹实验清楚地表明单克隆抗体Me-1，Me-2，Me-3，Me-5，Me-6和Me-7识别脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的特定的表位(图4A)。SDS-PAGE凝胶和相应的Western印迹分析也表明该蛋白的分子量不随菌株的变化而变化。然而，该蛋白在外膜制备物中的量却随菌种不同而变化，并且同菌株的血清型组无关。更有甚者，在用2IU的蛋白酶K/mg蛋白处理外膜制备物后(处理在实施例1中描述，上文)，这些单克隆抗体仍能识别脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白上的各自的表位(图4B)。令人感兴趣的是，在酶消化后，表位仍旧未受影响，这样证实了在膜制备物中既使它们同抗体是可及的，也不会被酶处理所破坏。后者的结果暗示所观察到的抗蛋白酶K的现象的机制很可能同表面结构阻抑酶同该蛋白接近无关，或者也表明该机制同膜对深嵌其内的蛋白提供保护无关。Me-1的免疫印迹的结果同其它5个单克隆抗体的结果相一致，这在图4中没有表示。

又进行了一系列实验来对此脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白定性并将之同其它已知的脑膜炎奈瑟氏球菌的表明蛋白区分。存在或不存在巯基乙醇时，在电泳样品缓冲液中的外膜制备物在100℃加热5分钟，或在37℃和56℃加热30分钟，SDS-PAGE胶上未观察到脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白表观分子量的变化。这显示了存在于外膜上的22kDa表面蛋白的迁移并不受热或2-巯基乙醇影响。

用高碘酸钠氧化来确定单克隆抗体是否同脑膜炎奈瑟氏球菌外膜制备物上的碳水化合物表位起反应。该法按照先前发明者所述〔Martin等，感染与免疫60，2718-2725页(1992)〕进行。用100mM的高碘酸钠室温下对外膜制备物处理1小时并不能改变单克隆抗体同脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的反应性。这一处理一般可以消除抗体同其特异的碳水化合物的结合。

单克隆抗体2-1-CA2(由PA.Bhattaoharjee博士提供，WalteReed Army Institute of Research，华盛顿，哥伦比亚特区)是一种脂蛋白特异的抗体(也叫H.8)，该脂蛋白在所有病原奈瑟菌中均是一种表面抗原。这种单克隆抗体同外膜制备物的反应性用来同Me-5单克隆抗体的反应性作比较。此种脂-特异性单克隆抗体同一分子量为30kDa的蛋白带反应，而Me-5单克隆抗体同22kDa蛋白带反应。该结果清楚地表明脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白同脂蛋白无关，而脂蛋白为另一高保守的外膜蛋白。

为证明在未处理过的脑膜炎奈瑟氏球菌细胞表面，该22kDa蛋白是暴露在外的，用了放免的方法，该方法按先前发明人描述的进行〔Proulx等，感染与免疫59，963页(1991)〕。该法中用的是86小时和18小时的细菌培养物。6个单克隆抗体分别同以下菌株反应，9个脑膜炎奈瑟氏球菌菌株(各株的血清型组在图5的括号中显示)。2个淋病奈瑟氏球菌菌株(“NG”)2个粘膜炎莫拉氏菌菌株(“NC”)和2个乳糖奈瑟氏球菌菌株(“NL”)。放射免疫实验证明单克隆抗体识别的表位是暴露在未经处理的多个不同的血清型和血清型组的脑膜炎奈瑟氏球菌分离物的表面而且也是同蛋白水解酶可及的(图5)。单克隆抗体同其位于所有被检测的脑膜炎奈瑟氏球菌表面的靶表位强烈结合。记录到的结合值(3000到35000CPM间)随菌株不同而异，并且受到细菌生理状态的影响。流感嗜血杆菌孔蛋白-特异的单克隆抗体被用作每种菌株的阳性对照。500CPM以下的计数被记下并随后从每个结合值中减去。就本法中所检测的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株而言，图5中所示的单克隆抗体Me-5和Me-7的结果代表了用单克隆抗体Me-1，Me-2，Me-3和Me-6所得的结果，就其它测试的菌的菌株而言，所示的Me-7的结合活力代表了识别同样菌株的其它单克隆抗体的结合活力。

也估计了被单克隆抗体识别的表位的抗原保守性。斑点一酶免疫法被用于快速筛选抗大量的细菌菌株的单克隆抗体。本法按先前发明者所述进行〔Lussier等，免疫分析杂志10，373页(1989)〕。本研究中用了71种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株。样品包含19个血清型组A的分离物，23个血清型组B的分离物，13个血清型组C的分离物，1个血清型组29E的分离物，6个血清型组W-135的分离物，1个血清型组X的分离物，2个血清型组Y的分离物，2个血清型组Z的分离物，和4个当未划分血清型组的菌的分离物(“NS”)。这些分离物由下列单位获得：加勒比流行病中心，西班牙港，特立尼达；东安大略儿童医院，渥太华，加拿大；Department of Saskatchewan Health，Regina，加拿大；Laboratorire de SantèPublique Du Ouèbec，蒙特利尔，加拿大；Max-Planck Institut fur Molekulare Genetik，柏林，FRG；蒙特利尔儿童医院，蒙特利尔，加拿大；维多利亚综合医院CeeneralHospital，Halifax，加拿大；以及我们自己的菌株收藏。以下的菌种也被检验：16种淋病奈瑟氏球菌，4种灰色奈瑟氏球菌，5种乳糖奈瑟氏球菌，1种黄色奈氏球菌，1种浅黄奈氏球菌，3种粘液奈瑟氏球菌，4种深黄/干燥奈瑟氏球菌，5种深黄色奈瑟氏球菌，1种干燥奈瑟氏球菌，1种微黄奈瑟氏球菌和5种粘膜炎莫拉氏菌，1种粪产碱菌(ATCC8750)，1种弗氏柠檬酸菌(ATCC 2080)，1种迟钝爱德华氏菌(ATCC 15947)，1种阴沟肠杆菌(ATCC 23355)，1种产气肠杆菌(ATCC 13048)，1种大肠杆菌，1种气味黄杆菌，流感嗜血杆菌类型b的一种(Eagan株)，1种肺炎克氏杆菌(ATCC 13883)，1种雷氏变形菌(ATCC 25932)，1种普通变形菌(ATCC 13315)，1种绿浓杆菌(ATCC 9027)，1种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)，1种粘质沙番氏菌(ATCC 8100)，1种弗氏志贺氏菌(ATCC 12022)，1种索氏志贺氏菌(ATCC 9290)。这些菌来自下单位：美国标准培养物保藏中心或加拿大，渥太华的疾病控制实验中心的收藏。单克隆抗体同最相关的奈氏菌株的反应性列于表1中。Me-7这种单克隆抗体可识别全部71种检测脑膜炎奈瑟氏球菌菌株上的其特异性的表位。该单克隆抗体，以及Me-2，Me-3，Me-5和Me-6也同属于奈瑟氏菌属的其它一些特定的菌种反应，这表明它们的特异的表位在奈瑟菌科中一些密切相关的菌中也表述。单克隆抗体Me-1除可同一种乳糖奈瑟氏球菌有轻微反应外，其中能同脑膜炎奈瑟氏球菌分离物反应。Me-1继而再用另外177个脑膜炎奈瑟氏球菌分离物样品进一步测试，结果它可以正确地识别多于99％的总的受试脑膜炎奈瑟氏球菌菌株。除表1列的奈瑟氏菌菌株外，单克隆抗体不能同上面所提的任何其它菌种起反应。

结论是，发明人生产出6种可特异性地同脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白起反应的单克隆抗体。运用这些单克隆抗体，我们揭示了它们特异的表位是1)位于一存在于脑膜炎奈瑟氏球菌外膜上的抗蛋白酶K的22kDa蛋白上，2)在脑膜炎奈瑟氏球菌各分离物中保守，3)暴露于未处理的脑膜炎奈瑟氏球菌表面并且是抗体可及的，和4)这些单克隆抗体同脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的反应性不被高碘酸钠处理影响，提示其特异性表位不在碳水化合物上。

尽管我们发现脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白在严格条件下加热时，其迁移会变为18kDa蛋白的迁移，然而我们发现其迁移不被2-巯基乙醇处理所影响。

我们还揭示该脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白在抗原性方面与脂蛋白无相似处，而脂蛋白是另一低分子量且高度保守的存在于脑膜炎奈瑟氏球菌外膜上的蛋白。

正如将要在实施例3中所示，这些单克隆抗体同纯的，重组22kDa表面蛋白也能反应，这些重组蛋白是将含有编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因的质粒载体pNP2202转化大肠杆菌BL 21(DE3)株后制得。

表1单克隆抗体同奈瑟菌属各种菌分离物的反应性

未区分血清型组的分离物

实施例3脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的分子克隆，基因测序，高产率表达及其纯化

A.分子克隆

根据制造商的建议(普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康星)，建立脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)的λGEM-11基因组文库。简要地说，608B株的基因组DNA经Sau 3AI部分消化，9到23kb间的片段用琼脂糖凝胶纯化，然后连接到GEM-11臂的BamHI位点上。得到的重组噬菌体用于转染大肠杆菌LE392株(普洛麦格)，然后将菌铺LB琼脂板。用实施例2中的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特异的单克隆抗体按下面的方法去对文库进行免疫筛选，得到19个阳性噬菌斑。平板在-20℃下放置15分钟以使上层琼脂变硬。将硝酸纤维素膜轻轻放在平板的表面上，4℃，30分钟，以吸附重组病毒克隆产生的蛋白。然后用PBS-吐温0.02％(体积比)洗膜并进行前述的免疫印迹〔Lussier等，免疫分析杂志10，373页(1989)〕。在扩增和DNA纯化后，一个病毒克隆，定名为克隆8，其中含13kb插入片段，被选出来进行亚克隆。用SacI消化该克隆后，得到5和8kb二个片段。这二个片段用琼脂糖凝胶纯化后连接到低拷贝数质粒pWKS30的SacI限制性位点上〔Wang and Kushner，基因，100，195页(1991)〕。此重组质粒用于转化大肠杆菌JM 109株(普洛麦格)，转化按照生产商的建议用电穿孔法(Bio-Rad，Mississauga Ont.，加拿大)进行。得到的克隆用实施例2中的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特异的单克隆抗体筛选。仅是含有8kb插入片段的质粒转化产生的细菌的克隆是阳性的。阳性克隆的Western印迹分析(方法见实施例2中)表明，由大肠杆菌表达的蛋白是完整的，且其在SDS-PAGE凝胶上的迁移同脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白一致。进一步减小插入片段长度，即用Cla I消化含8kb插入片段的克隆，得到2.75kb片段，将之连入pWKS30质粒的Cla I位点。所得克隆的Western印迹分析再一次清楚地表明大肠杆菌表达的蛋白是完整且其在SDS-PAGE凝胶上的迁移同天然的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白一致。

限制性酶切分析表明，二个命名为pNP2202和pNP2203的克隆含有2.75kb的插入片段，且方向相反，此二克隆用于继续进行编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白基因的序列分析。由发玛西亚生物技术公司(Piscataway，NJ)购得的“双链巢居缺失试剂盒”用于从二克隆产生一系列的巢居缺失，方法按生产商提供的进行，得到的截短的插入片段用于测序，测序从pWKS30载体上的M₁₃E正向引物进行，用AppliedBiosystems Inc.(Foster City，CA)公司的自动测序仪，型号373A，按制造者的说明进行，用的试剂盒是“Taq染色脱氧终止子循环测序试剂盒”。

B.序列分析

插入片段从二个方向测序后，核酸序列显示了一个含525个核苷酸的开放阅读框(包括终止密码子)，编码蛋白由174个氨基酸残基组成，其预期分子量为18,000 Dalton，pI值为9.93，核酸及所得的氨基酸序列列于图1中(SEQ ID  NO：1，SEQ ID  NO：2)。

为了验证该克隆基因的正确表达，得自脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的天然22kDa表面蛋白的N-末端氨基酸序列被测定，以同由核酸序列推知的氨基酸序列作比较。来自脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的外膜制备物用14％SDS-PAGE凝胶电泳分离并按照先前所描述的方法〔Sambrook等，分子克隆：实验指南，冷泉港实验室出版社(1989)〕轩到聚偏二氟乙烯膜上(Millipore Products，Bedford MA)。22kDa蛋白带从胶上切下并进行Edman降解，用的是Applied Biosystems.Inc.公司(FosterCity，CA)的473A型自动蛋白测序仪，按厂商的说明进行。氨基酸序列E-G-A-S-G-F-Y-V-Q-A同开放阅读框1-10的氨基酸相对应(SEQ  ID NO：2)，这表明脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的22kDa表面蛋白有一19氨基酸的前导肽(SEQ ID NO：2中的氨基酸残基-19到-1)。

搜索已有的数据库后表明该脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的22kDa表面蛋白(SEQ ID NO：2)或其基因(SEQ ID NO：1)在以前未有报道。

C.重组脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的高产率表达及纯化

开发以下方法是为了使表达于大肠杆菌的重组脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表明蛋白的产量最大化并纯化之。这一方法是基于此观察，即带有质粒pNP2202的大肠杆菌BL 21(DE 3)株生产的重组22kDa表面蛋白大量存在于外膜中，但同时也可在培养上清中得到，在上清中，它是含量最丰富的蛋白。所以培养物上清被用于用亲合层析柱来纯化所重组22kDa蛋白(图6A)。

按厂商的说明，将单克隆抗体Me-2、Me-3和Me-5(实施例2中所述)固化于经溴化氰活化的Sepharose 4B(发玛西亚生物技术公司，Piscataway，NJ)上以产生亲合层析柱的基质。

过夜培养的带有质粒pNP2202的大肠杆菌BL 21(DE 3)株接种于含25mg/ml氨苄(Sigma)的LB液体培养基中(Gibco Laboratories，Grand Island，N.Y.)，在37℃下振摇培养4小时，以制备培养物上清。菌体用2次4℃下10,000g，10分钟的离心从培养基中除去。培养物上清用0.22mm膜(Millipore，Bedfords，MA)过滤，然后用一截流量为10,000Daltons的超滤膜(Amicon Co.，Bererly，MA)将上清浓缩约一百倍。为了使膜颗粒完全溶解，向浓缩过的培养物上清中加入EmpigenBB(Calbiochem  Co.，LaJolla，CA)至终浓度为1％(体积比)悬液于室温放1小时，再用几升含有0.05％Empigen BB(体积比)的10mMTris-HCl缓冲液，pH 7.3，透析，然后在4℃以10,000g离心20分钟。将抗原制备物加入亲合基质中，在不断振摇下，于4℃放置过夜。胶浆注入一层析柱并用含0.05％Empigen BB(体积比)的10mM Tris-HCl缓冲液反复洗涤。然后用含1M LiCl的10mM Tris-HCl缓冲液pH 7.3，将重组22kDa蛋白洗脱下来。含有洗脱下的蛋白的溶液再用几升的含0.05％Empigen BB的10mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.3，反复透析。在每步纯化过程中，均用考马斯蓝和银染SDS-Page胶〔Tsaiand Frash，分析生化分析生物化学119，19页(1982)〕来估测重组22kDa表面蛋白的纯度，代表性结果于图6A中给出。胶的银染结果表明纯化过程可产生很纯的重组22kDa蛋白，仅存有很少量的大肠杆菌脂多糖。

纯化的重组22kDa表面蛋白的抗蛋白水解也被证明，结果于图6B中给出。如实施例1中所描述的，纯化的重组22kDa表面蛋白2mg/mg蛋白的α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶以及每毫克蛋白用2IU的蛋白酶K在37℃不断振摇下处理1小时。任何处理后均未观察到蛋白量的减少。与之相对比，对照蛋白〔本例中用牛血清白蛋白(BSA，Simga)〕则部分或全部被降解，降解程度依赖于所选用的酶。进一步，更长时间的处理也不能导致该蛋白的任何改变。后面的这些结果表明转化的大肠杆菌可以表达完整的重组22kDa表面蛋白，并且同天然存在的脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白一样，这种重组蛋白也是对于三种蛋白水解酶水解有强的抗性。此外，纯化的但未镶嵌在大肠杆菌外膜上的重组22kDa表面蛋白对于蛋白水解酶的作用依旧有高的抗性。

我们也证明了酶处理对于该重组22kDa蛋白的抗原性质的影响。通过ELISA和Western免疫印迹可以判定实施例2中所述的单克隆抗体可识别按上述过程纯化的重组22kDa表面蛋白(图6C)。进一步，单克隆抗体Me-5及其它22kDa蛋白-特异性单克隆抗体同纯化的重组22kDa表面蛋白的反应性不因酶处理而改变，这就证明了重组22kDa蛋白的抗原性似乎同天然蛋白的相似。

重要的数据显示于实施例3中并可总结如下：

1)得到了脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的完整的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2)；

2)天然蛋白N-末端序列分析证明确实克隆了脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa基因；

3)该蛋白以前未见记述；

4)可以转化宿主如大肠杆菌并获得该重组脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的高产表达；

5)可得到不含其它脑膜炎奈瑟氏球菌分子的重组蛋白且该蛋白几乎不含大肠杆菌的级分；

6)纯化过的重组22kDa表面蛋白依然对诸如α-胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白酶K的水解有强的抗性；并且

7)该重组22kDa蛋白的抗原性同天然的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的相一致。

实施例4编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因的分子保守性

为了证明奈瑟氏菌属内部各种分离物间编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因的分子保守性，做了DNA点杂交来检测不同的奈瑟氏菌的种及其它细菌的种。首先，用PCR扩增525碱基对的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的编码基因，用琼脂糖凝胶纯化后再按厂商的说明，用非放射性的地高辛DNA标记及检测系统(宝灵曼，Laval，加拿大)对之进行随机引物标记。

按厂商的说明(宝灵曼)进行点印迹。简要地说，待检细菌株点样于一张带子电荷的尼龙膜上(宝灵曼)，干燥后再依照地高辛用户指南中的菌落转移说明处理，在含50％甲酰胺(Sigma)的溶液中于42℃下做预杂交及杂交。预杂交液中含有100mg/ml的变性的鲱鱼精子DNA(宝灵曼)作为补充封闭剂来避免DNA探针的非特异性杂交。严格漂洗及用化学发光的收光物PPD-底物进行检测均按地高辛系统的用户指南进行。

对于被检测的71个脑膜炎奈瑟氏球菌，用单克隆抗体Me-7得到的结果同用525bp的DNA探针得到的结果完全一致。根据该结果，被检的所有脑膜炎奈瑟氏球菌菌株均含有脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白基因且均表达蛋白，因为它们均可被单克隆抗体识别。由此证明了该蛋白在脑膜炎奈瑟氏球菌分离物中高度保守(表2)。

DNA探针也检测到编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因也存在于所有检测的淋病奈瑟氏球菌菌株中。

相反，单克隆抗体Me-7却仅同16个经检测的淋病奈瑟氏球菌菌株中的2个起反应，表明在淋病奈瑟氏球菌中，特异性的表位是以某种方式不存在的，不可及或是受到修饰，或者是绝大多数的淋病奈瑟氏球菌菌株不表达此蛋白，既使它们在其基因组中有编码序列(表2)。

在乳糖奈瑟氏球菌中也观察到二种检测法有很好的一致性，因为仅发现有1种乳糖奈瑟氏球菌是有基因却不表达蛋白(表2)。该结果也可用最后一段中的理由来解释。

这可以表明，尽管淋病奈瑟氏球菌菌株表面的该22kDa蛋白未表达或不被接近，但淋病奈瑟氏球菌或乳糖奈瑟氏菌的22kDa蛋白的编码基因却可用于重组质粒的构建，该重组质粒用于生产22kDa表面蛋白或其类似物，所有的这些蛋白或其类似物均可用于防御，检测或诊断奈瑟氏菌的侵染。更具体地说，这种侵染可来自脑膜炎奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌和乳糖奈瑟氏球菌。因此，该22kDa表面蛋白或其类似物可用作生产疫苗来抵御这类感染。此外，该22kDa蛋白或其类似物也可用于生产一可检测或诊断这种感染的试剂盒。

用粘膜炎莫拉氏菌得到的结果表明，在5个经检测的菌株中，3个同单克隆抗体Me-7起反应，但无一例同DNA探针反应，表明脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的编码基因在这些菌株的基因组中不存在(表2)。

也检测了几个其它的奈瑟氏菌属的菌及其它细菌(见脚注，表2)并发现它们在二种测试中无一是阳性结果。后一结果似乎能说明22kDa表面蛋白的基因仅在奈瑟氏菌科密切相关的种中存在。

表2525碱基对DNA探针和Me-7单克隆抗体同不同奈瑟氏属菌种间的反应性

(表2的脚注)：

也用二种方法测试了以下奈瑟氏属菌和其它细菌并且结果为阴性：1种灰色奈瑟氏球菌，1种黄色奈瑟氏球菌，1种浅黄色奈瑟氏球菌，2种粘液奈瑟氏球菌，4种深黄/干燥奈瑟氏球菌，1种深黄奈瑟氏球菌，1种干燥奈瑟氏球菌，1种微黄奈瑟氏球菌，1种粪产碱菌(ATCC8750)，1种百日咳博德特氏菌(ATCC 9340)，1种支气管炎博德特氏菌，1种弗氏柠檬酸菌(ATCC 2080)，1种迟钝爱德华氏菌(ATCC 1594)，1种大肠杆菌，1种气味黄杆菌，流感嗜血杆菌类型b的一种(Eagan株)，1种肺炎克氏杆菌(ATCC 13883)，1种雷氏变形菌(ATCC 25932)，1种普通变形菌(ATCC 13315)，1种绿脓杆菌(ATCC 9027)，1种鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)，1种粘质沙雷氏菌(ATCC 8100)，1种弗氏志贺氏菌(ATCC 12022)，1种索氏志贺氏菌(ATCC 9290)，和1种嗜麦芽黄单孢菌。

结论是，DNA杂交实验清楚地表明编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因在病原性奈瑟氏菌中高度保守。进一步说，所得结果清楚地显示出DNA探针可以成为快速和直接检测临床标本中的病原性奈瑟氏细菌的有用的工具。该探针甚至可进一步精制为可区分脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌。

实施例5单克隆抗体的细菌裂解性及其保护性特征

仿照以前讲述的方法〔Brodeur 等，感染与免疫50，510页(1985)；Martin等，感染与免疫60，2718(1992)〕，在体外估测纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特异的单克隆抗体的裂解细菌的能力。在存在有豚鼠血清补体的情况下，纯化的单克隆抗体Me-1和Me-7可有效杀灭脑膜炎奈瑟氏球菌608B株。相对较低浓度的每种单克隆抗体均可减少多于50％的活细菌。用较高浓度的纯化的单克隆抗体Me-1和Me-7导致细菌克隆形成单位数急剧减少(至99％)。重要的是，这些单克隆抗体的杀菌活动是补体依赖性的，因为在56℃加热30分钟热灭活豚鼠血清后，杀菌活性完全消失。其它单克隆抗体对于同一细菌株未显示出重要的杀菌活性。几个实验的组合，有代表性的结果于图7中给出，其中Me-7的结果同Me-1的结果相一致。所示的Me-2的结果具代表性且同其它单克隆抗体Me-3，Me-5和Me-6所得的结果一致。

先前由发明者之一所描述的鼠的感染模型〔Brodeur等，感染与免 疫50，510页(1985)；Brodeur 等，加拿大微生物学杂志32，33页(1986)〕被用于测算每种单克隆抗体的保护性。简要地说，在细菌攻击前18小时，用600ml的含单克隆抗体的腹水液对Balb/c小鼠进行腹膜内注射。然后用含有4％粘蛋白(Sigma)，1.6％血红蛋白(Sigma)及1000个克隆形成单位的脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的悬液1ml对小鼠进行攻击。几个实验的总结果列于表3中。重要的是要注意只有具有菌裂解能力的单克隆抗体Me-1和Me-7可以保护小鼠抗实验用脑膜炎奈瑟氏球菌的侵染。事实上，在细菌攻击前注射含这二种单克隆抗体的腹水液可大大提高Balb/c小鼠的存活率，至70％或更多，而接受600mlsp 2/0诱导腹水液或600ml含有无关单克隆抗体的腹水液的对照组群体的存活率仅只9％。结果也显示了在细菌攻击前18小时注射400Hg的蛋白A纯化的Me-7可使80％的小鼠存活。其后做的实验是用来决定保护50％的小鼠存活所需的最低抗体浓度。对于其它的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特异性单克隆抗体，观察到较低的存活率：从20％到40％。

表3抗脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1，2)的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa

表面蛋白特异的单克隆抗体的免疫保护能力的评估

结论是，这些结果清楚地表明脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的特异性抗体可有效地保护小鼠以抵抗实验中的致死的菌的攻击。由抗原诱导的保护性抗体是最重要的标准之一，此标准用来确定是否再进行进一步的潜在疫苗候选者的研究。

实施例6用纯化的重组22kDa表面蛋白免疫后引起的抗细菌攻击的保护

纯化的重组22kDa表面蛋白按照实施例3中提供的方案制备，然后用于免疫Balb/c小鼠以确定其对致死量的脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)攻击的保护效果。在所进行的实验中，为了保证在疫苗制备中不含有其它脑膜炎抗原，决定用纯化的重组蛋白代替天然的脑膜炎蛋白。用于这些实验中的感染小鼠的模型在以前已被其中的一个发明人所描述〔Brodeur等，感染与免疫50，510页(1985)；Brodeur等，加拿大微生物学杂志32，33页(1986)〕。每只小鼠用100ml的含10或20μg纯化的重组22kDa表面蛋白的抗原制备物皮下注射三次，注射间隔为3周。Quil A用作这些实验中的佐剂，其浓度为每次注射25μg。对照组小鼠按同样的步骤注射，注射的是10或20μg的BSA，20μg浓缩的大肠杆菌BL 21(DE 3)株的培养物上清，该大肠杆菌所带质粒pWKS30上无编码脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白的基因插入，上述大肠杆菌的制备方法见实施例3中。或是向对照组注射磷酸盐缓冲液。在每次注射前，均取每只鼠的血清样本以便分析抗重组蛋白的免疫反应的发展过程。第三次免疫后2周，所有小鼠均腹膜内注射1ml含1000个克隆形成单位的脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的悬液，悬液中还含4％粘蛋白(Sigma)和1.6％的血红蛋白(Sigma)。

这些实验的结果列于表4中。80％的用纯化的重组22kDa表面蛋白免疫过的小鼠在细菌攻击后存活下来，而对照组中存活率仅0％到42％。重要的是，对照组中注射浓缩的大肠杆菌培养上清的小鼠并不能抵抗细菌的攻击。后一结果清楚地表明培养基中的成分或纯化后少量留存的大肠杆菌的抗原并不是所观察到的抗脑膜炎奈瑟氏球菌的原因。

表4用纯化的重组22kDa表面蛋白免疫后获得的抵抗其后的脑膜炎双球菌608B株(B：2a：P1.2)攻击的保护作用

结论

纯化的重组22kDa表面蛋白的注射可极大地保护被免疫鼠，以抵御由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的致死性感染的发生依据本发明，抗体是以由鼠杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体Me-1和Me-7为例，此二抗体已于1995年7月21日存入美国马里兰州洛克维尔的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。保藏号是HB 11959(Me-1)和HB 11958(Me-7)。

实施例7脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的其它株的序列分析

按实施例3中所述，从不同株的脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的基因组DNA中分离含有编码22kDa表面蛋白基因的2.75kb的ClaI消化的DNA片段。

a)MCH 88株：MCH 88株(临床分离物)的核酸序列如图8中所示(SEQ ID NO：3)。根据608B株得到的实验证据(实施例3)推导出假定的先导肽序列，对应于氨基酸-19至-1(M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A)。

搜索已建立的数据库后证明从脑膜炎奈瑟氏球菌MCH 188株(SEQID  NO：4)得到的22kDa表面蛋白或其基因(SEQ ID NO：3)以前未有报道。

b)Z4063：Z4063株〔Wang J.F.等，感染与免疫60，5267页(1992)〕的核酸序列列于图9中(SEQ ID NO：5)根据608B株得到的实验证据(实施例3)推导出假定的先导肽序列，对应于氨基酸-19到-1(M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A)。搜索已建立的数据库后证明从脑膜炎奈瑟氏球菌Z4063株(SEQ ID NO：6)得到的22kDa表面蛋白或其基因(SEQ ID NO：5)以前未有报道。

c)淋病奈瑟氏球菌b2株：淋病奈瑟氏球菌b2株(血清型1奈瑟氏菌国家基金中心，LCDC.渥太华，加拿大)的核酸序列列于图10中(SEQID NO：7)。根据608株(实施例3)得到的实验证据，推导出假定的先导肽序列，对应于氨基酸-19到-1(M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A)。搜索已建立的数据库后证明从淋病奈瑟氏球菌b2株(SEQ ID NO：8)得到的22kDa表面蛋白或其基因(SEQ ID NO：7)以前未有报道。

图11示已检测的所有四个菌株的DNA序列中的相同的序列。MCH88株在217位核苷酸处有一个密码子(TCA)的插入，但总的来说，四种菌株有惊人的同源性。

图12示四个菌株不推得的氨基酸序列的同源性。在四个菌株中，有大于90％的相同性。

实施例8兔和猴子对脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的免疫反应

用重组22kDa蛋白免疫兔和猴以估测定除鼠之外的物种中的抗体反应。

a)兔

用带有质粒pN2202或对照质粒pWKS30的大肠杆菌JM 109株外膜制备物免疫雄性新西兰兔(菌株和质粒在实施例3中描述)。按以前由发明者所述的方法〔Brodeur 等，Infect 感染与免疫50，510页(1985)〕用氯化锂抽提得到外膜制备物。制备物中蛋白的成分用适用于膜组分的Lowry法确定〔Lowry等，生物化学杂志193，265(1951)〕。用上述的150μg的其中一种外膜制备物对兔进行皮下和几个位点的肌内注射二次，间隔为3周。QuilA用作这些免疫实验的佐剂，终浓度为20％(体积比)。特定体液反应的形成用ELISA和Western免疫印迹，按发明者以前描述的方法进行分析〔Brodeur 等，感染与免疫50，510页(1985)；Martin等，欧洲免疫学杂志18，601，(1988)〕，其中ELISA的包被抗原用的是从脑膜炎奈瑟氏球菌608B株(B：2a：P1.2)抽提制得的外膜制备物，碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的驴抗兔免疫球蛋白用于这些方法中(Jackson Immuno ResearchLaboratories，West Grove，PA)。

同QuilA佐剂一起注射含有22kDa重组蛋白的大肠杆菌外膜制备物在兔中诱导了强的特异性体液反应，ELISA测定其为1/32,000(图13)。注射重组22kDa蛋白后诱导产生的抗体同纯化的重组22kDa蛋白起反应，但更重要的是，它们也能识别脑膜炎奈瑟氏球菌外膜上表达，折叠和镶嵌的天然蛋白。Western免疫印迹实验清楚地表明第二次注射后产生的抗体可在硝基膜上识别Mab  Me-2(实施例2中描述)也识别的同一条蛋白带，而Me-2是特异性抗22kDa蛋白的。

b)猴子

向二只食蟹猴分别注射100μg(K28)和200μg(I 276)的亲合层析纯化的重组22kDa蛋白，共注射二次。用于生产和纯化大肠杆菌BL21DE3株的蛋白的方法在实施例3中已叙述过。终浓度为20％(体积比)的Alhydrogel(Cedarlane Laboratories，Hornby，Ont.，Canada)用作这些免疫试验的佐剂。对猴子进行间隔为三周的二次肌内注射。对照组猴子(K65)用一不相关的重组蛋白制备物按同样的步骤免疫。按前述方法分析血清。在这些方法中，用了碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories，WestGrove，PA)。

用每次注射100μg的纯化的蛋白免疫的K28猴的特异的抗体反应较用200μg的蛋白注射的I 276猴的特异的抗体反应出现得快且较强烈(图14)。第一次注射后21天，用Western免疫印迹可检测出被免疫猴子的血清中出现天然22kDa蛋白的特异性抗体，但在对照猴的血清中，二次对照抗原注射后仍旧无抗体出现。

结论

实施例2和5中所示的数据清楚地表明注射重组22kDa蛋白可在小鼠中诱导直接抗脑膜炎奈瑟氏球菌的保护性体液反应。更重要的是，本例中的结果显示这种免疫反应并非限于一个物种，该重组表面蛋白也可刺激诸如兔和猴等其它物种的免疫系统。

实施例922kDa脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白的表位图谱

用一个发明者所描述的方法可以对脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的表位作图〔Martin 等，感染与免疫(1991)：59：1457～1464〕。用18个相重叠的合成肽成功地对线性表位进行了鉴定，这些合成肽覆盖了来自菌株608B(图15)的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的整个序列，并且和此蛋白免疫后得到了超免疫血清。22kDa蛋白上的免疫决定部分的鉴定有助于新的有效的疫苗的设计。进一步地，这些B细胞表位的定位也提供了脑膜炎奈瑟氏球菌外膜上的该蛋白的结构构型的有价值的信息。

所有肽均由BioChem Immunosystems Inc.公司(蒙特利尔，加拿大)用Applied Biosystems(Foster City Calif)的自动肽合成仪合成。合成肽用反相高压液相色谱纯化。肽CS-845，CS-847，CS-848，CS-851，CS-852和CS-856(图15)溶于小体积的6M盐酸胍(J.T.Baker)或二甲基亚砜(J.T.Baker)中。这些肽然后用蒸馏水调至1mg/ml。所有其它肽均溶于蒸馏水中并调至1mg/ml。

在pH 9.6的50mM碳酸盐缓冲液中将合成肽以50μg/ml的浓度包被到微滴定板上(Immulon 4，Dynatech Laboratories Inc.，Chantilly，VA)以进行肽的酶连免疫吸附实验(ELISA)。室温温育过夜后，滴定板用含0.05％(体积比)吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)洗，然后用含0.5％(重量体积比)牛血清白蛋白(Sigma)的PBS封闭。用亲合纯化的重组22kDa表面蛋白免疫小鼠或猴子，然后取其血清并将之稀释，ELISA板的每个孔中均加入100μl的稀释物并在37℃温育1小时。将板洗三次，再加上按生产商建议稀释后的连有碱性磷酸酶的羊抗鼠或抗人的免疫球蛋白100μl(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)。37℃温育1小时后，洗板并加入100μl含1mg/ml的对-硝基-苯基磷酸(Sigma)的二乙醇胺(10％(体积比)pH9.8)。60分钟后，用微滴定板阅读仪读取反应的光密度变化(λ＝410nm)。

用亲合层析纯化的重组22kDa蛋白免疫鼠和猴后得到的抗血清(实施例8)与18个相互重叠的合成肽一起成功地用于定位蛋白上的B细胞表位，这些表位成簇位于该蛋白的三个抗原结构域中。

第一个区域在氨基酸残基51和86间。用不同算法进行计算机分析提示该区最有可能在免疫上是重要的，因为此区为亲水性且表面暴露。进一步，比较列于图12中的四种蛋白序列表明其中的一个主要变化，即在73位插入一个氨基酸残基，也是位于该区。

抗血清鉴别出的第二个抗原区域位于氨基酸残基110和140间。有趣的是，序列分析表明在四种蛋白序列中不保守的14个氨基酸中的7个成簇位于蛋白的此区内。

第三个抗原结构域位于该蛋白的一个高保守的区域内，在氨基酸31和55间，该区仅被猴子的血清识别。

实施例10大规模生产该22kDa表面蛋白的热-诱导表达载体

将编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因插入质粒p629中〔George等，生物和工程(Bio/technology)5：600～603(1981)〕。质粒p629用pL启动子来控制22kDa表面蛋白的合成，同时该质粒带有噬菌体λcI 857温度敏感抑制基因的一断序列，但该基因的功能性Pr启动子已被删除。温度从30℃变化至高于38℃可以失活cI 857阻遏物，结果是质粒编码的该蛋白就会表达。在大规模发酵中，用温度改变来诱导大肠杆菌内基因的表达是有利的，因其可用现代发酵罐简单地完成。其它的诱导质粒一般需向培养基中加入特殊的分子例如乳糖或异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)以诱导目的基因的表达。

用PCR从脑膜炎奈瑟氏球菌608B株的基因组DNA中扩增出一540核苷酸的片段，所用引物为：OCRR8：

 5′-TAATAGATCTATGAAAAAAGCACTTGCCAC-3′和OCRR9：3′-CACGCGCAGTTTAAGACTTCTAGATTA-5′。此二引物同22kDa基因的二端的核苷酸序列相对应。为了向在PCR产物的克隆，引物上加入了BgI II(AGATCT)的位点。PCR产物用琼脂糖凝胶纯化后用BglII消化。然后将此525碱基对的BglII片段插入质粒p629的BglII和BamHI位点上。含有PCR产物插入的质粒定名为pNP2204并用于转化大肠杆菌DH5αF′IQ株。质粒pNP2204的部分图谱列于图16中。得到的菌斑用实施例2中所述的脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特异的单克隆抗体去筛选。所得克隆的Western印迹分析清楚地表明由大肠杆菌合成的蛋白是完整的且其在SDS-PAGE胶上的迁移同天然脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的相同。从所选克隆提取DNA产将之测序。质粒中的插入片段的核酸序列同图1中所示的编码脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的基因的序列完全一致。

为了研究该22kDa表面蛋白的合成水平，温度诱导质粒pNP2204用于转化下列大肠杆菌菌株W3110，JM 105，BL 21，TOPP1，TOPP2和TOPP3。确定了每株菌中22kDa表面蛋白的合成水平及其在不同细胞级分中的定位。在LB肉汤培养基(Gibco  BRL，Life TechnologiesGrand Island，NY)中用三角瓶振摇培养表明温度从30℃升至39℃可有效诱导该基因的表达。合成水平的时间过程测定表明在诱导后30分钟该蛋白就出现并且该蛋白的量在诱导期稳步增加，SDS-PAGE凝胶的结果同前述结果一致。对于大肠杆菌W3110和TOPP1株，测出每升培养物中22kDa蛋白的表达水平在8到10mg间。在此二株菌中，大部分的22kDa蛋白是整合入细菌外膜中。

实施例11脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的纯化

因为发现大部分的22kDa蛋白是嵌于大肠杆菌菌株的外膜上，所以此处的纯化方案不同于实施例3中的那一个，在实施例3中，大量蛋白被释放到培养物上清中。带有质粒pNP2204的大肠杆菌W3110或TOPP1株，30℃下的过夜培养物接种到含50μg/ml的氨苄(Sigma)的LB肉汤培养基中，30℃下旋转培养(250rpm)直至其菌体密度为0.6(λ＝600nm)，在此点，培养温度变为39℃并培养3到5小时也诱导蛋白的产生。4℃下以8000g离心15分钟收集菌体，然后在pH 7.3的磷酸缓冲液(PBS)中洗二次。菌体用超声破碎(冲击破碎或用细菌破碎仪进行机械破碎也可)。未破碎细胞以5,000g离心5分钟除去并弃掉。在10℃下，10,000g离心1小时将外膜同胞质且分分离。含膜的沉淀块用小量的pH 7.3的PBS重悬。为了将22kDa表面蛋白从膜上溶解下来，需用诸如Empigem BB(Calbiochem Co.，Lajolla，CA)，Zwiffergent-3.14(Calbiochem Co.，)或β-辛基葡糖苷(Sigma)等去污剂。加入到膜级分的去污剂的终浓度为3％，混合物于20℃温育1小时。不溶物通过10℃下100,000离心一小时除去。

22kDa蛋白可被三种去污剂有效溶解，但β-辛基葡糖苷的优点在于用其可以轻易除去几种不想要的膜蛋白，因为这些膜蛋白不溶于它，这样就可用离心将这些膜蛋白从上清中分离。含22kDa蛋白的上清用PBS缓冲液反复透析以去除去污剂。可用蛋白酶K处理(实施例1中所述)以进一步从22kDa表面蛋白制备物中去除不想要的蛋白。用硫酸铵或有机溶剂分布沉淀及超滤是另外的二步，此二步可以除去不想要的核酸及脂多糖。此二步过后，可用凝胶过滤和离子交换层析来得到纯的22kDa蛋白。实施例3中所述的亲合层析，也可用来纯化此22kDa蛋白。

实施例12用22kDa蛋白作为人的疫苗

为了制备一个为人所用的疫苗，需从此处所描述的多肽中选择合适的22kDa表面蛋白抗原。比如，本领域的技术人员可以设计出一种同此含有免疫原表位的22kDa多肽或其片段有关的疫苗。分子生物学技术的应用特别适合于制备基本上纯的重组抗原。

疫苗的组分可采用不同的形式。这些包括，如固体、半固体和液体剂量形式，诸如粉剂、液体溶液或悬液及脂质体。基于我们的信念，本发明的22kDa表面蛋白抗原当施用于人时可诱导保护性免疫反应，本发明的组合物将同那些用于免疫人的其它蛋白和多肽相似，比如破伤风和白喉。因此，本发明的组合物将优选地包括一种药理学可接受的佐剂，比如不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、胞壁肽、水油乳剂、脂质体、ISCOM或CTB，或是非毒性B亚基形式霍乱毒素。最优选地是该组合物包括水油乳剂或氢氧化铝作为佐剂。

该组合物将以多种药理学可接受形式中的一种施用于患者，这些形式包括肌内、真皮内、皮下或表面施用。优选地，该疫苗将肌内施用。

一般地讲，用药量将包括初次注射，大多数是同佐剂一起使用，每位患者用约0.01到10mg，更好的是用0.1到1.0mg的22kDa表面蛋白抗原，其后最有可能的是再进行一次或多次的加强剂量注射。优选地，加强注射将在初次注射后1到6个月进行。

疫苗发展中需考虑的一个问题是粘膜免疫。理想的粘膜免疫疫苗是经口服或鼻内使用一剂或几剂后，能诱导产生系统免疫，并能在适当的表面诱导产生保护性抗体。粘膜疫苗组合物可以包括佐剂，惰性颗粒载体或重组活载体。

本发明的抗22kDa表面蛋白抗体在被动免疫治疗中有用，并在免疫预防感染人的脑膜炎奈瑟氏球菌或相关细菌如淋病奈瑟氏球菌或乳糖奈瑟氏球菌中有用。用于被动免疫的剂量形式及制度同其它被动免疫治疗疫苗相似。

根据本发明，用作例子的抗体为杂交瘤产生的MABs Me-1和Me-7抗体，此二抗体已于1995年7月21日存入美国马里兰州洛克维尔的美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，并被鉴定为鼠杂交瘤细胞系，分别为Me-1和Me-7。这些保藏物的保藏号是HB11959(Me-1)和HB11958(Me-7)。

我们此处描述的是本发明的许多具体实施方案，很明显，可通过将基本实施方案改变来提供运用本发明中的组合物及过程的其它的实施方案。因此，本发明范围包括所有的变化的实施方案及变体是完全可以理解的，这已在前面的特别声明中定义，并将在附于后面的权利要求中定义；并且本发明不限于此处以实施例方式列出的特定的实施方案。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：Brodeur，Bernard R

Martin，Denis

Hamel，Josee

Rioux，Clement

(ii)发明标题：脑膜炎奈瑟氏球菌抗蛋白酶K降解的表面蛋白

(iii)序列数：26

(iv)通讯地址：

(A)地址：Goudreau Gage Dubuc & Martineau Walker

(B)街道：800Place Victoria，Suite 340O，Tour de la Bourse

(C)城市：蒙特利尔

(D)州：魁北克

(E)国家：加拿大

(F)邮编：H4Z 1E9

(v)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM 个人计算机兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatertIn Release #1.0，Version 1.25版

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日期：

(C)类别：

(vii)在先申请信息：

(A)申请号：US 08/406.362

(B)申请日期：1995年3月17日

(vii)在先申请信息：

(A)申请号：US(PROVIS)60001.983

(B)申请日期：1995年8月4日

(viii)律师/事务所信息：

(A)名字：Leclerc/Dubuc/Prince.Alain/Jean/Gaetan

(C)文献/目录号：BIOVAC-1PCT

(ix)通讯信息：

(A)电话：514-397-7400

(B)电传：514-397-4382

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：830碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假说：无

(iv)反义：无

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(ix)性质：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：143..667

(ix)性质：

(A)名称/键：信号肽

(B)位置：143..199

(ix)性质：

(A)名称/键：成熟肽

(B)位置：200..667

(xi)序列描述：SEQ  ID  NO：1：

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：174氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：710碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假说：无

(iv)反义：无

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：MCH 88

(ix)性质：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：116..643

(ix)性质：

(A)名称/键：信号肽

(B)位置：116..172

(ix)性质：

(A)名称/键：成熟肽

(B)位置：173..643

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：175氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：850碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假说：无

(iv)反义：无

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：Z4063

(ix)性质：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：208..732

(ix)性质：

(A)名称/键：信号肽

(B)位置：208..264

(ix)性质：

(A)名称/键：成熟肽

(B)位置：265..732

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

(2)SEQ ID  NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：174氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：810碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假说：无

(iv)反义：无

(vi)来源：

(A)生物体：淋病奈瑟氏球菌

(B)株：b2

(ix)性质：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：241..765

(ix)性质：

(A)名称/键：信号肽

(B)位置：241..297

(ix)性质：

(A)名称/键：成熟肽

(B)位置：298..765

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：174氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

(2)SEO ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

(2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

(2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

(2)SEQ ID NO：21的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：

(2)SEQ ID NO：22的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：

(2)SEQ ID NO：23的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

(2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

(2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：14氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：

(2)SEQ ID NO：26的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)生物体：脑膜炎奈瑟氏球菌

(B)株：608B

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：

Claims (89)

1.一种分离的多核苷酸，它与编码奈瑟氏球菌表面蛋白的DNA序列的互补序列特异性杂交；其中所述的DNA序列包括图11所示共有序列。

2.一种分离的多核苷酸，它与编码奈瑟氏球菌表面蛋白的DNA序列的互补序列特异性杂交；其中所述奈瑟氏球菌表面蛋白：包括图12所示的共有序列。

3.权利要求1或2的多核苷酸，它与编码奈瑟氏球菌表面蛋白的DNA序列的互补序列特异性杂交，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO：1的碱基200到664。

4.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO：1的碱基143到664。

5.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述DNA序列包括SEQ IDNO：1。

6.权利要求1或2的多核苷酸，它与编码奈瑟氏球菌表面蛋白的DNA序列的互补序列特异性杂交，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO：3的碱基173到640。

7.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO：3的碱基116到640。

8.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述DNA序列包括SEQ IDNO：3。

9.权利要求1或2的多核苷酸，它与编码奈瑟氏球菌表面蛋白的DNA序列的互补序列特异性杂交，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO：5的碱基265到729。

10.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO：5的碱基208到729。

11.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述DNA序列包括SEQ IDNO：5。

12.权利要求1或2的多核苷酸，它与编码奈瑟氏球菌表面蛋白的DNA序列的互补序列特异性杂交，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO：7的碱基298到762。

13.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO：7的碱基241到762。

14.权利要求1或2的多核苷酸，其中所述DNA序列包括SEQ IDNO：7。

15.包括SEQ ID NO：1的碱基200到664的分离多核苷酸。

16.包括SEQ ID NO：1的碱基143到664的分离多核苷酸。

17.包括SEQ ID NO：1的分离多核苷酸。

18.包括SEQ ID NO：3的碱基173到640的分离多核苷酸。

19.包括SEQ ID NO：3的碱基116到640的分离多核苷酸。

20.包括SEQ ID NO：3的分离多核苷酸。

21.包括SEQ ID NO：5的碱基265到729的分离多核苷酸。

22.包括SEQ ID NO：5的碱基208到729的分离多核苷酸。

23.包括SEQ ID NO：5的分离多核苷酸。

24.包括SEQ ID NO：7的碱基298到762的分离多核苷酸。

25.包括SEQ ID NO：7的碱基241到762的分离多核苷酸。

26.包括SEQ ID NO：7的分离多核苷酸。

27.一种重组DNA分子，包括

(i)权利要求1-26任一项定义的分离多核苷酸；和

(ii)与所述多核苷酸操纵性连接的表达控制序列。

28.权利要求27的重组DNA分子，其中所述表达控制序列包括可诱导表达控制序列。

29.权利要求28的重组DNA分子，其中所述可诱导表达控制序列可由选自温度、乳糖和IPTG的刺激因素诱导。

30.权利要求28的重组DNA分子，其中所述可诱导表达控制序列选自λPL，λPR，TAC，T7，T3，LAC和TRP启动子。

31.权利要求27的重组DNA分子，其中所述DNA分子是pNP2204。

32.用权利要求27的重组DNA分子转化的单细胞宿主。

33.权利要求32的单细胞宿主，其中所述宿主选自以下宿主之一：大肠杆菌JM 109、大肠杆菌BL 21(DE3)、大肠杆菌DH5αF′IQ、大肠杆菌W3110、大肠杆菌JM 105、大肠杆菌BL 21、大肠杆菌TOPP1、大肠杆菌TOPP2和大肠杆菌TOPP3。

34.一种制备权利要求1-26任一项的多核苷酸的方法，包括有培养权利要求32的单细胞宿主和分离所说的多核苷酸的步骤。

35.一种分离的多肽，由权利要求1-26任一项所述的分离的多核苷酸编码，其中所述多肽具有抗原性。

36.权利要求35的分离多肽，包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的序列。

37.权利要求35的分离多肽，包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的序列，其中所述序列不含有信号序列。

38.权利要求35的分离多肽，包括选自以下的一种序列：SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26。

39.权利要求37的分离多肽，包括SEQ ID NO：2的氨基酸31到55。

40.权利要求37的分离多肽，包括SEQ ID NO：2的氨基酸51到86。

41.权利要求37的分离多肽，包括SEQ ID NO：2的氨基酸110到140。

42.权利要求37的分离多肽，包括SEQ ID NO：2的氨基酸1到155。

43.权利要求35的分离多肽，其中所述多肽是重组体，且通过培养权利要求32的单细胞宿主获得。

44.分离权利要求35的多肽的方法，包括：

a)分离脑膜炎奈瑟氏球菌培养物；和

b)分离来自该培养物的外膜部分。

45.权利要求44的方法，进一步包括从所述外膜部分分离所述多肽。

46.权利要求44的方法，还包括用蛋白酶K处理所述外膜。

47.药物组合物，含有药物有效量的权利要求35的多肽和药物赋形剂。

48.权利要求47的药物组合物，它是一种疫苗。

49.制备预防人体奈瑟氏球菌感染的疫苗的方法，包括混合药物有效量的权利要求35的多肽与可药用稀释剂、赋形剂或佐剂。

50.权利要求49的制备方法，其中所述多肽是奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

51.权利要求35的多肽用于制备预防人体奈瑟氏球菌感染的药物的用途。

52.权利要求51的用途，其中所述多肽是奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

53.权利要求52的用途，其中所述奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白是脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

54.权利要求35的多肽用于制备预防人体奈瑟氏球菌感染的疫苗的用途。

55.权利要求54的用途，其中所述多肽是奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

56.权利要求55的用途，其中所述奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白是脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

57.特异性与权利要求35的多肽结合的抗体或其抗原结合片段。

58.权利要求57的抗体，其中所述多肽是奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

59.权利要求58的抗体，其中所述奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白是脑膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

60.权利要求57的抗体，它是单克隆抗体。

61.权利要求60的抗体，它是鼠源的或人源的。

62.权利要求61的抗体，它是IgG同种型。

63.权利要求60的抗体，其中所述抗体是鼠源的，并且选自Me-1和Me-7。

64.分离权利要求57的抗体的方法，包括

a)将(1)一种奈瑟氏球菌制备物，(2)一种奈瑟式球菌的外膜制备物，或(3)权利要求35的多肽导入哺乳动物；并且

b)由含有该抗体的哺乳动物分离血清。

65.权利要求64的方法，其中所述奈瑟氏球菌是脑膜炎奈瑟氏球菌。

66.分离权利要求60的单克隆抗体的方法，包括

a)将(1)奈瑟氏球菌制备物，(2)一种奈瑟式球菌的外膜制备物，或(3)权利要求35的多肽导入哺乳动物；

b)由哺乳动物中分离抗体产生细胞；

c)将所述细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤细胞；并且

d)由所述杂交瘤细胞分离所述单克隆抗体。

67.权利要求66的方法，其中所述奈瑟氏球菌是脑膜炎奈瑟氏球菌。

68.含有权利要求57的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

69.权利要求68的药物组合物，它是一种疫苗。

70.权利要求68的药物组合物，包括药物赋形剂。

71.权利要求68的药物组合物，其中所述抗体选自Me-1和Me-7。

72.制备预防人体奈瑟氏球菌感染的药物组合物的方法，包括将药物有效量的权利要求35的多肽与可药用稀释剂或赋形剂混合。

73.权利要求72的制备方法，其中所述多肽是奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

74.权利要求58的抗体用于制备预防人体奈瑟氏球菌感染的药物的用途。

75.权利要求57的抗体用于制备在分离自患者的生物样品中检测奈瑟氏球菌抗原的试剂盒的用途，包括：

a)将权利要求57的抗体与所述生物样品一起温育；并且

b)检测与抗原特异性结合的抗体。

76.权利要求75的用途，其中所述病原体是脑膜炎奈瑟氏球菌。

77.权利要求75的用途，其中所述抗体选自Me-1和Me-7。

78.权利要求35的多肽用于制备在分离自患者的生物样品中检测奈瑟氏球菌抗原的特异性抗体的试剂盒的用途，包括：

a)将权利要求35的多肽与所述生物样品一起温育；并且

b)检测与抗体特异性结合的多肽。

79.权利要求78的用途，其中所述多肽是脑膜炎奈瑟氏球菌抗原。

80.权利要求79的用途，其中所述多肽是南也门奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。

81.权利要求57的抗体用于制备在患者中检测奈瑟氏球菌病原体的试剂盒的用途，包括：

a)用可检测标记标记权利要求57的抗体；

b)将标记抗体给予患者；并且

c)检测与病原体特异性结合的标记抗体。

82.权利要求81的用途，其中所述病原体是脑膜炎奈瑟氏球菌。

83.权利要求35的多肽用于制备检测或诊断人体脑膜炎奈瑟氏球菌感染的试剂盒的用途。

84.DNA探针用于制备用来检测分离自患者的生物样品中的奈瑟氏球菌的试剂盒的用途，包括：

a)将所述样品与DNA探针接触，所述DNA探针能与权利要求15-26任一项的多核苷酸特异性杂交；其中所述DNA探针是一种寡聚体，该寡聚体具有与权利要求15-26的多核苷酸中的任一种中的至少6个连续核苷酸互补的序列；和

b)检测所述DNA探针与所述多核苷酸的杂交。

85.权利要求84的用途，还包括使用具有以下序列的一组寡聚体通过聚合酶链反应扩增所述DNA探针与之杂交的靶DNA的步骤：(i)与权利要求1-26任一项的多核苷酸中至少6个连续核苷酸互补；(ii)位于所述靶DNA旁侧。

86.分离的多肽，其中包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

87.权利要求86的分离的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列构成。

88.分离的多肽，其中包括SEQ ID NO：2的氨基酸51到86，并且具有抗原性。

89.分离的多肽，其中包括SEQ ID NO：2的氨基酸110到140，并且具有抗原性。

Images