TW212204B - - Google Patents

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212204 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1 ) 本發明偽有關從丙_氛醇製造α-羥基異丁醯胺之方 法，及從該醛肢製造ct,/3-不飽和羧酸脂族醇酯或α,/8-不飽和羧酸之方法。 cx-羥基異丁醛肢作為甲基丙烯酸甲酯之中間原料， 且此甲基丙烯酸甲酯作為丙烯条樹脂之原料在工業上有用 之物質。 以往，對於α-羥基異丁醛胺之代表性製法，已知以 錳氣化物為觸媒，由丙酮氡醇之水合反應來製造之方法（ 例如，DE 2527120)。 另知由徹生物所産生之酵素腈水化酶之作用，將各種 醯胺從對應之腈生産之方法，如丙烯醯胺，乙醛胺，甲基 丙烯醯胺，巴豆醯胺，3-羥基丙醯胺，菸ίϋ醛胺，苄醛胺 等可分別由對應之腈藉酵素生産（例如ΕΡ 3 0 7 9 2 6 )。但從 丙酮氣醇生成ct-羥基異丁醛胺之微生物或酵素完全未知。 至於源自親腈棒桿 ® (Corynebacterium nitrilophilus) 之腈水化酶不但丙酮氰醇不為基質，且為強力抑制腈水化 酶活性之物質（生物科技及應用生物化學，νοΐ.11, P49-59 (1989))〇 本發明之目的為利用具有從丙酮氰醇生成α-羥基異 丁醯胺能力之撤生物，從丙酮氰醇有劝生産α-羥基異丁 醯胺，並用該醯胺生産α,/3-不飽和羧酸脂族醇酯或α, /3 -不飽和羧酸。 本發明人等對α-羥基異丁醯胺之新製法反覆研究， 結果發現具有能從丙酮氡醇生成α-羥基異丁醯胺之微生 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) i裝- 訂· i線· 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公發） A6 B6 212204 五、發明説明（2 ) 物，更以這些微生物之培養液，菌體或菌體處理物為酵素 源，在水性介質中與丙酮《醇作用，則發現能以高效率生 成OC-羥基異丁醛胺，進而用此醯胺生産甲基丙烯酸甲酯， 終於完成本發明。 故本發明為提供以具有能從丙酮氛醇生成α-羥基異 丁酿胺之微生物之培養液，菌髏或菌體處理物在水性介質 中與丙麵氰醇作用而生成α-羥基異丁醛胺為特徽之α-羥 基異丁醯胺之製法，及該醯胺，水及/或脂族醇在固體酸 觸媒之存在下，於150t：以上氣相或氣液混合相反應為待 馓之a ,yS-不飽和羧酸脂族醇酯或α ,/3-不飽和羧酸之製 法0 在本發明中所使用之撤生物只要能從丙酮氰醇生成（X-羥基異丁醯胺即可，並無持別限定，無論從天然分離，或 以突變或基因工程來創製者均可。 這些撤生物可舉列如下菌株。 紅極紅球菌（Rhodococcus erythropolis) ATCC 4277、 ATCC 11048、 MT 20082 (FERM P-8282)、 紅球 ®sp.(Rhodococcus sp.)MT 20118 (FERM P-13015)、 石峨節桿菌（Arthrobacter paraffineus) ATCC 21003 乾燥無色桿菌（Achronobacter xerosis)IF0 12668、 乙酸0不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus)IF0 12552 螢光假單抱菌（P s e u d o id ο n a s f 1 u o r e s c β n s ) I F 0 3 9 2 5 可用於本發明之培養微生物之培養基只要能逹成目的，並 無任何限制，含有能被所用菌株利用之磺源，氮源，無機 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297 «釐） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝· 訂. 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 21220^ 五、發明説明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 鹽，更適當地含有撖量有機營養物，則無論合成或天然之 培養基均可。培養時，可添加巴豆醛胺等醯胺類，則有時 可得具有從丙_氡醇生成α -羥基異丁醯胺之能力高之微 生物。此時，該醛胺類之添加量為0.1〜5.0%。 培養條件雖随菌株或培養基而異，惟宜20〜401,而 培養基之P Η為4〜9。 經濟部中央標準局貝工消#合作社印製 本發明中，所得培養液，將培養液離心或過濾之菌體 或菌髏處理物均可當作酵素源。菌體處理物可為將菌體經 機械破壞，超音波處理，凍結融解處理，乾燥處理，溶媒 處理，加壓減壓處理，滲透壓處理，自體消化，界面活性 劑處理，氧處理者，由這些所得之酵素劏分，菌驩及菌體 萃出物之固定化物等。至於酵素或菌體之固定化法，可用 常法（酵素學方法，Vol.44,(1976),同 Vol.135, Vol.136, (1987),同Vol. 137(1988))。例如（1)於不需水載體藉物 理吸附，離子結合，或共軛結合而使酵素或菌體結合之載 體結合法，（2)以具有2個以上官能基之試藥使酵素或菌 體交連之交連法。（3)於高分子凝膠之微細格子中收纳酵 素或菌體之格子模或半透膜之高分子皮膜被覆酵素或菌體 之徹膠囊模之包囊法等方法，可適當選擇使用。菌體之添 加量無特別限定，通常1〜1〇〇克乾菌體/公升（以下除另行 規定外，簡稱g/1)。 反應通常在〇〜5〇υ, PH5〜10,靜置或缓和攪拌下使 酵素源與丙酮氰醇在水性介質中接觸。在水性介質添加丙 酮，則可提高α-羥基異丁醛胺之産量。丙酮之添加量宜 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） - A6 ____B6_ 五、發明説明（4 ) 411以下，此濃度以上則有阻礙酵素活性之處。因丙酮氛醇 在反應介質中，與丙酮及氣酸呈解離平衡，故丙酮氰醇可 代之以丙酮及氰酸（或気酸鹽）之混合物當作基質使用，反 應時閤雖視酵素力價或基質濃度等反應條件而異，但通常 為1〜5 D小時。基質丙酮氰醇之濃度雖無特別限定，但通 常為0.1〜30重量％,丙酮気醇可連續或間歇地添加於反 應液。 如此反應，則在反應液中生成cc-羥基異丁醯胺，至 於從反應液採收α-羥基異丁醯胺之方法可用濃縮晶析等 公知之方法。 所得α-羥基異丁醯胺可與水及/或脂族醇在固體酸觸 媒之存在下，於1 5 0 υ以上氣相或氣液混合相反應，則可 供製造α ,>3-不飽和羧酸脂族醇酯或α ,/3-不飽和狻酸， 此方法可用如日本特公昭63-10940號（美國專利第4464539 (請先Μιϊφί面之注意事項再填寫本頁) i裝- 訂· a 之 I 酸 ， 羧 I 和表 飽期 不週 -及 素 α 元 或屬 酯金 醇有 族含 脂為 酸可 羧媒 和觸 飽酸 不體 〇 -固 法,/3其 方 α , 之此時 > 造 號製 /3 硫其 ，尤 0 , 酸媒 磷钿 之之 EPS ΕΚ一 1 少少 至至 之中 出物 選化 中硫 素及 元物 屬化 金氣 非 ， 之物 族化 ^ 0 V a,鹽 IV酸 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 靥 金 鎳 及 硼 丁醇 異族 , 脂 醇種 丙種 異等 • 0 醇甲 丙一 正醇 ,二 醇丙 α乙 ， ,，醚 脂醇甲 樹甲一 換為醇 交可二 子醇乙 離族 ， 陽脂醇 ,於二 炭至乙 性 ， 活 醇 異 sloa ^羥 族1 脂α 代從 取 及 酯 醇 族 脂 酸 羧 和 飽 不 - θ α 成 生 胺 醛 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公;g·) A6 B6 212204 五、發明説明（5 ) 或α，/?-不飽和羧酸之反應宜為令反應物質與固體酸觸媒 接觸之方法，在氣相或氣液混合相實施。水之用量雖無待 別限制，但通常每莫耳α-羥基異丁醯胺用〇〜200莫耳， 宜1〜50莫耳。醇之用量也無待別限制，但欲僅得α , /3 -不飽和酸，則無須用醇，若欲得α，/3 -不飽和羧酸脂族醇 酯，則通常每莫耳α-羥基異丁醯胺用0〜200莫耳，宜1〜 5〇莫耳。反應溫度為150〜50QO,宜200〜450TC。反應物 質之接觸時間雖視觸媒及反應溫度等反應條件而異，但通 常以0 · 5〜3 6 0秒即足。 實施例 下面舉實施例說明，其中a-羥基異丁醯胺之定量乃 用強酸性陽離子交換樹脂充《柱及UV吸光檢出器之液體 層析法來實施。 實施例1 於含肉汁1%,脒1%, NaCl 0.5%及巴豆醛胺0.2% 之PH 7.0液體培養基ΙΟΟπΙ中接種紅極紅球菌MT 2 0 082 (FERM P-8282),而在28¾振盪培養24小時後，從培養液 離心分離菌體而予以洗淨，凍乾。反應乃在含有丙酮氰醇 4(^/1及凍乾菌體2(^/1之水溶液（？11以》^011調整為8.5) 於8 1C緩和}I拌下進行1 〇小時。反應終了後，將反應液一 部分稀釋而予以液體層析，得知蓄積α -羥基異丁醯胺3Qg/l (莫耳産率62% )。 實施例2 仿賁施例1反應，惟菌株改用如表1之各菌株，結果 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再5=寫本頁) 裝· 訂· 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 212204 A6 B6 五、發明説明（6 ) 在各反應液中生成如表1所示濃度之α-羥基異丁醯胺。 實施例3 於含肉汁1%,脒1%, NaCl 0.5%及巴豆醛胺〇·2% 之PH 7.0液體培養基lOOinl中接種石蟠節桿菌ATCC 21003 ，而在28 t：振盪培養24小時後，從培養液離心分離菌體 而予以洗淨，凍乾。反應乃在含有丙酮氰醇40 g/Ι及凍乾 菌體20g/l之水溶液（pH以NaOH調整為8.5)於緩和愰 拌下進行1 Q小時。反應終了後，將反應液一部分稀釋而 予以液體層析，得知蓄積α -羥基異丁醛胺27g/l(莫耳産 率 5796 )。 贲施例4 依實施例3反應，惟菌株改用如表2之各菌株，結果 在各反應液中生成如表2所示濃度之α-羥基異丁醛胺。 實施例5 於含肉汁1%,脒1%, NaCl 0.5%及巴豆醛胺0.2% 之PH 7.0液體培養基100ml中接種紅球菌sp. MT 20118 (FERM P-13015),而在30Ό振盪培養36小時後，從培養液 離心分離菌體而予以洗淨，凍乾。反應乃在含有丙酮氡醇 2〇3"及凍乾菌體25/1之水溶液（？11以“011調整為8.5) 於8 t緩和攪拌下進行8小時。反應終了後，將反應液一 部分稀釋而予以液體層析，得知蓄積α-羥基異丁醛胺16 g/1 (荑耳産率66% )。 實施例6 依實施例5反應，惟反應液中添加丙酮5 8 g / 1 ,結果 本纸張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐〉 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .丨裝. 訂. A6 B6 21220^ 五、發明説明（7 ) (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 在反應液中蓄積α -羥基異丁醯胺22.5g/l (莫耳産率93%)。 實施例7 除於反應液中添加丙刚2 3 2 g / 1之外，其餘悉依實施 例5實施。反應終了後，在反應液中蓄積cx-羥基異丁醛 胺20. lg/Ι(莫耳産率83% )。 實施例8 於含肉汁1%,脒1%, NaCl 0.5%及巴豆醯胺0.2% 之pH 7.Q液體培養基ΙΟΟπΙ中接種如表3之各菌株，而在 28υ振盪培養40小時後，從培養液離心分離菌髏予以洗 淨，凍乾。反應乃在含有丙酮氡醇2Qg/l,丙_〇或58g/l 及凍乾@体50g/l之水溶液（pH以NaOH調整為7.5)於lOt： 緩和攪拌下進行1 2小時。結果在各反應液中生成如表3 所示濃度之α-羥基異丁醛胺。 實施例9 於含肉汁1%,脒1%, NaCl 0.5%及巴豆醛胺0.2% 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 之PH 7.0液體培養基100ml中接種紅球菌sp. MT 20118 (FERM P-13015),而在25C振盪培養56小時後，從培養液 離心分離菌體而予以洗淨，收集。反應乃在含有丙_58g/l 及濕菌體150g/l(換算乾菌體40g/l)之水溶液10〇Bl中用泵 隔2小時間歇添加氰酸鉀80ηg,以硫酸調整為8.8並於5*C 缓和攪拌下進行2 0小時後，將反應液一部分稀釋而予以液 體層析，得知蓄積α-羥基異丁醯胺10g/l(對氰酸鉀其耳 産率78% )。 實施例10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 212204 A6 經濟部中央標準局員工消費合作社印5取 B6 _ 五、發明説明（8 ) 於含肉汁1%,觫1%, NaCl 0.5%及巴豆醯胺0.2% 之pH 7.0液體培養基6 0 0 0 ml中接種红球菌Sp. MT 20118 (FERM P-13015),而在28t：振盪培養45小時後，從培養液 離心分離菌髏而予以洗淨，凍乾。反應乃在含有丙酮6g/l 及凍乾菌體25g/l之水溶液30ral中用泵連續添加丙酮氡 醇0.45纟/小時，？11以以〇{{調整為8.3,於6<〇缓和攪拌下 進行24小時後，將反應液一部分稀釋而予以液體層析， 得知蓄積α-羥基異丁醯胺303g/l (莫耳産率93%)。 實施例1 1 於含肉汁1%, fl束1%，NaCl 0.5%及巴豆醯胺0.2% 之PH 7.0液體培養基5 0 0 0 1 1中接種紅球菌sp. MT 20 118 (F E R Μ P - 1 3 0 1 5 ),而在2 8 t：振盪培養5 0小時後，從培養液 離心分離菌體而予以洗淨收集。洗淨菌體100克（乾燥菌髏 27克）懸浮於50mM磷酸鉀緩衝液（pH6.8)75nl,丙烯醛胺 8.4克，甲基丙烯酸二甲胺甲酯氣化甲基4级化物0.8克 及亞甲基雙丙烯醯胺0.8克之均勻混合物，又將10%二甲 胺基丙腈5ml, 5%過硫酸鉀10π1均勻混合，而在冰水中 予以聚合凝願化。將此含菌體之凝膠在混合機破痰成小片 ，而與50mM磷酸鉀緩衝液（pH 6.8)60Qml及50%戊二醛 lml混合，在冰水中緩和攪拌下處理30分後洗淨為固定 化菌體。反應乃在含有丙酮28g/l之水溶液50ml中加固定 化菌體35g, pH以NaOH調整為8.5,於61缓和搜拌下進 行40小時後，反應液中蓄積α-羥基異丁醯胺10U/1 (莫 耳産率78% )。 -10- (請先閲讀背面之注意事項再«寫本頁) .裝· 訂· 線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 2l2ki〇^ A6 B6 五、發明説明（9) 表 1 經濟部中央標準局S工消#合作社印ίί 使用菌株 a - -羥基異丁醯胺U/l) 紅極紅球菌 (Rhodococcus erythropolis) ATCC 4277 4 红極红球菌 (Rhodococcus erythropolis) ATCC 11048 11 表 2 使用菌株 a * -羥基異丁醛胺（g/1) 乾燥無色桿菌 (Achromobact er xerosis) IFO 12668 8 乙酸鈣不動桿菌 (Acinetobacter calcoacetic us) IFO 12552 4 螢光假單抱菌 (Pseudomonas fluorescens) IFO 3 9 2 5 2 表 3 使用菌株 a -羥基異丁醛胺（g/1) 無添加丙酮 添加丙酮 乾燥無色捍菌 (Achronobacter xerosis) IFO 12668 9 14 乙酸鈣不動桿菌 (Acinetobacter calcoaceticus) IFO 12552 5.5 13 石蠟節桿菌 (Arthrobacter paraffineus) ATCC 21003 11 19 螢光假單孢菌 (Pseudomonas fluorescens) IFO 3925 3 8 -11- (靖先IVJfr背«61之ii*事項再塌.萬本頁) i ·—裝· 訂. 線. 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 212204 A6 B6 五、發明説明（10·) 水 α 在 成物 生理 醇處 氣體 酮菌 丙或 從體 能菌 有 ， 具液 將養 ,培 明之 發物 本生 依微 之 胺 0 丁 異 基 羥 與 中 質 介 性 用α 作此 醇將 氡又 _ 丙 異 基 羥 I α 産 生 地 率 效 高 可 則 異 基 羥 胺 醛 觸 酸 體 固 在 醇 族 脂 或 / 及 水 與 胺 醛

應 反 相 合 混·=¾ 液， 氣 或 相 氣 上 以 V α 或 酯 醇 族 旨 fl 酸 羧 15和 於飽 ，不 下 在 存 α 之産 媒生 可 則 酸 羧 和 飽 不 {請先閲讀背面之注$項再塡寫本頁) i裝- 訂· .線. 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（2i0 X 297公釐）

Claims (1)

1. 修正本8)卑，衫“ 21 触4

   A7 B7 C7 D7 公告本 六、申請專利範園 1.—種α-羥基異丁醯胺之製法，其特欺為：令具 有能從丙酮氡醇生成α -羥基異丁醯胺之選自红球薗（ R h 〇 d 〇 c 〇 c u s )篪、節桿菌靥石蟠節桿菌（A r t h r 〇 b a c t e r paraffineus) ATCC 2 1 0 0 3、無色桿_屬乾燥無色桿菌 (A c h r ο π 〇 b a c t e r x e r o s i s) I F 0 1 2 6 6 8、不動桿菌靥乙酸鈣 不動捍菌（Acinetobacter calcoaceticus)IFO 12552、及 假單抱菌屬蛮光假單孢菌（pseudomonas fluorescens) IFO 3925之一種微生物之培養液、菌體或菌體處理物在 水性介質中與丙酮氡醇作用，以生成α-羥基異丁醯胺。 2. 如申請專利範圍第1項之製法，其中具有能從丙 _氡醇生成α -羥基異丁醛胺之徹生物而屬於紅球菌屬之 微生物為紅極紅球菌（Rhodococcus erythropolis) ATCC 4277, ATCC 11048 或 MT 20082(FERM P-8282)。 3. 如申請專利範圍第1項之製法，其中具有能從丙 酮氡醇生成α -羥基異丁醯胺之微生物而屬於紅球菌屬之 微生物為红球菌 sp. ΜΤ 20118 (FERM Ρ-13015)。 4 . 如申請專利範圍第1至3項之任一項之製法，其 特激乃在於水性介質中添加丙酮。 5. 如申請專利範圍第4項之製法，其中於水性介質 中添加之丙酮量為4Μ以下且在菌體中施行。 -1 3- 本紙張尺度適用中0國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）