TW209248B

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Priority date: 1991-07-19
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Description

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於對法方的子分酸核的别待 - 某中品模測檢以可些 B- S 十一是現說發來於等用生被衛以共可公法和方學驗病化 -Ί 旳 y/ι άρ 流此，如醫，法説 , 來病例疾舉斷。診的和要測重預分有期因患早基會症癌將癌性者在胞試力細受能為的一的因別變, 掴突要道測重知檢分以以十可可性人種受使這戲 . 〇! 的在性症存能癌否可對是的現因病發基疾和體傳斷變遣診胞細癌成化轉胞細使而 e 1 活 3 激 '.: 因 S 3 基 .4 癌 -2 的 a ‘ 別 r . 傾UJ 於 E 由 i. . 以 h m 可 s e t

B (請先閲¾背面之注念事項再«寫本頁) 7 2 3 - 3 8 9 7 Ν

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Bos, J . L . , Cancer Res. 4 9 ： 4 6 8 2 — 4 6 8 9 ( 1 9 8 9 ) ) 〇 1 訂核酸的檢测化驗方法可以依據核酸分子的各種特性而 1 1 I 設計 » 例如分子的大小 » 序列 > 被限制酶進行酶解的受 1 1 1 性等等〇這些化驗方法的敏感度可以從加強檢测訊號方面 1 線想辦法提高〇因此 » 舉例來說 » 化驗的敏感度可以藉著使 1 1 t 用可以檢測的標記試劑〇可以利用的標記有許多，例如酶 1 1 1 標記 ( K 〇 U r i 1 S k y e t a 1 • U • S 1 1 1 P a t e η t 4 > 5 8 1 > 3 3 3 ) 9 放射性檫記、 1 1 Γ 绖濟部中央標準/e/g工消費合作社印¾ (F a 1 k o w e t a 1 . > U.S· Pate η t 4 , 3 5 8 , 5 3 5 ； B e r n i n s e Γ υ * S . P a t e n t 4 , 4 4 6 ,2 3 6 ) t 螢光標記 (A 1 b a r e 1 1 a e t a 1 . t E P 1 本紙張又度適用中因西家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 209B43 五、發明説明（2·) 經濟邨中央標準局負工消费合作狂印¾ 4 4 9 1 4 ) > 化學標記 ( S h e 1 d 〇 η I I I e t a 1 • 1 U • S • P a t e η t 4 t 5 8 2 9 7 8 9 1 A 1 b a Γ e 1 1 a e t a 1 • > U • S • P a t e η t 4 9 5 6 3 $ 4 1 7 ) » 經修飾的鹼基 ( Μ i y 〇 s h i e t a 1 • > Ε P 1 1 9 4 4 8 ) * 和類似的物質〇巨前已有人設計了幾種核酸檢測 % 統來檢測特異性的突變這些 % 统包括使用 —*· % 列的探針 ( P Γ 〇 b e S ) 和其他结合對象 ( b i η d i η g P a Γ t η e Γ S ) 作為來檢测訊號〇 P a a U e t a 1 - 在美國專利第 4 ， 5 5 6 » 6 4 3 號中掲示出一種多核苷的探針 » 它具有標持異性 ( t a Γ S e t s P e C ί f i C ) 的序列和與蛋白質結合的序列 0 在大多數的情況下 S 該種蛋白質结合序列是外加的 — 段 D N A 片段 • 它是與百標待異性序列連接的〇方法中所利用到的蛋白質可以是蛋白質標記蛋白質複合物的 — 部份 I 例如是蛋白質與酶的複合物 ( 參該專利的說明瞽第 7 概 » 第 7 至 1 0 行 ) 0 掲示出來的結合蛋白質包括 D N A 修飾酶 t 聚合酶 » 1 a C 阻抑物 ( Γ e P Γ e S S 〇 Γ ) » 或具有抗原性的 D N A 序列 ( 參該專利的說明害第 ? 橱 » 第 1 0 至 2 9 行 ) 〇該參考文獻的 „.. 値典型探針例子 ( 參該專利的說明書第 1 2 和 1 3 概的實施例 I ) 是一艟 C D N A 分子 ( 它可以與百標 D N A 序列雜交 ) * 而這艏 C D N A 分子是與 T 7 促進子 ( P Γ -!.----------------------裝------訂------線 (請先《锗背面之注念事項再填寫本頁) 木纸張尺茂適用中因困家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ 209243 五、發明説明（5) omo ter.)連結。T 7促進子是用作蛋白質結合序列。當與這個探針雜交後，加入E. co丨i的RNA聚合酶，使其作為結合蛋白質而與T7促進子結合。檢测是否有結合的R Ν Α聚合酶存在的方法是利用對該聚合酶具有特異性的兔抗血清，然後再使用過氧化酶結合的羊抗兔 .第二抗髏，以及一艟過氣化酶一抗一過氣化酶檢測条統。

Mundy的美國專利第4, 656,127掲示了檢測某些核苷鹺基的突變的方法。這種方法是需要對該持別區域的序列有相當的認識(參考該說明耆第1期，第5 2 — 5 3行）。它的優點是不需要突變發生在限制酶切割部位才能檢_到。該方法裔要的是一値直線形的採針 ,此探針是與突變發生部位左右附近的核酸鐽具有互補的序列。當探針與核酸股雜交结合後，加入一痼核苷酸的衍生物與探針的末端結合，然後把單股的部份進行酶解。其後再檢測探針是否存在（參考該專利說明害第2稱，第3 至2 2行）。該文獻提及的核苷酸的衍生物是硫代核苷酸 (參考該專利說明書第4欄，第46至5 1行），這種核苷酸的衍生物是可以藉著適當標記而檢測出來的。

Kato e t a 1.等於歐洲專利刊物第407 7 8 9號中掲示以標記探針雜交的原理檢測核酸的方法。其中所用的非放射標記是酶、螢光、和生物素-生物素结合蛋白質（b i ot i n — av i d i η)条統（第2頁，第36 — 39行）。其中舉例的是採用以生物素標記的 IL---.------------------裝------#------線 (請先閲讀背面之注念事项再場窝*-頁) 本紙張又度適用中S®家標準（CNS>甲4規格（2W X 297公货） 81.9.20.000 經濟部中央標準总負工消费合作社印«'|代 2〇ί3 二 W A6 B6 五、發明説明（) U T P * 這種檫記可以在合成過程中加入到探針上 0 另外還有許多探測核酸雜交體上鹼基對配對錯誤的方法 0 早期的方法是利用在配對錯誤處進行酶切割 ( G i b b S » R • e t a 1 • » S C i e η C e 2 3 6 ： 3 0 3 — 3 0 5 ( 1 9 8 7 ) ) 0 這些方法包括個對配對錯誤 D N A 雜交體進行酶切割的步驟 0 造些方法的一値缺點是它們並不能可靠的檢測全部所有的配對錯誤〇最近有 — 個報告採用化學方法把配對錯誤的 D N A 進行裂解 ( C 〇 t t 〇 η ， R * G • e t a 1 • 9 P Γ 〇 C • N a t 1 • S C i • U S A 8 5 : 4 3 9 7 — 4 4 0 1 ( 1 9 8 8 ) C 〇 t t 〇 η » R • G • > N U C • A C i d S R e s • 1 7 ： 4 2 2 3 — 4 2 3 3 ( 1 9 8 9 ) ) » 其中的化學裂解是發生於 D N A — D N A 異源雙股構造體 ( h e t e r 〇 d U P 1 e X ) 上的配對錯誤部位〇化學裂解可以採用許多種試劑 9 尤其是四氣化餓和羥基胺 0 在這値方法中 • D N A 探針是利用限制性酶把適當的 D N A 切割後製備而得的〇把含有適當序列的質體 D N A 與標記 D N A 探針雜交 ( 末 U1I m 標記或中間部位以 3 Z P 標記 ) 0 羥基胺可以化學方式修飾配對錯誤的胞苷 » 四氣化 m 可以修飾配對錯誤的胸苷 0 稍後可以利用峨啶在修飾的部位進行切割然後再利用聚丙烯醯胺凝膠電泳 ( P A G E ) 方法和放射白顯影法鑒定切割的産物 0 這傾方法據稱是具有可以檢測所有可能的 acr 早 (請先《讀背面之注念事項#填寫本頁) •装. 訂· 線. 本紙張又度適用中因a家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公龙） 81-9.20.000 A6 209^43_ 五、發明説明（《）一鹼基對配對錯誤優點，其原因是這値方法可以在配對錯誤的部位鄰近的配對_基對進行切割。 C a s k e y等人掲示了一傾檢测突變部位的方法。這値方法是利用PC R -擴增的c DNA作為配對錯誤切割反應中模板的來源。這項技術已經用於研究鳥胺酸胺甲醒基轉移酶（OTC as e)缺乏症患者，以確定突變的位置。

Kung等人於美國專利第4, 963， 658號中掲示一種檢測單股D N A ( s s D N A )的方法。這種方法是利用一種對s sDNA有高度親和力的结合蛋白質，例如拓樸異構酶（topo i somerase)或DN A 解鍵蛋白（unwinding protein)( 第2摒第44 一 47行），其中的结合蛋白質可以與樣記結合，該種標記例如是0_D —半乳糖苷酶（第7拥第1 行）〇現有的測定法在用途和適用性方面都因測定的敏感度不足、技術太後雜、和成本太高而有所限制。因此，十分希望能夠發展出一種更高敏感度、更容易操作、和成本更低的方法來檢測DNA分子上的改變。發明内容本發明是關於檢測在核酸序列上突變的方法，該突變的核酸序列可以包括少至一艏鹾基的改變。這種方法並且可以测定樣品中目標聚核苷酸改變的程度。本發明的方法 -8 - <請先閲¾背面之;±念事項再瑱寫本頁} i装· 訂· 線. 經濟部中央標準-S/MI工消費合作社印¾ 本纸張又度適用中因S家標準（CNS>甲4现格（210 X 297公釐） 81.9-20.000 經濟部中央標準易8工消費合作社印« 五、發明説明（) 是基於利用一種配對錯誤结合蛋白質，如於大腸桿菌（E . col i)和沙門氏菌（Salmonel la)中存在的Mu t S蛋白質。在發明中，『目標聚核苷酸』是指待檢測的核酸序列。不含突變的目檫聚核苷酸序列（即無改變的形式）是指没有突費的目樣聚核苷酸或沒有突變的目標序列。含有一個突變或改變的目標聚核苷酸序列是指經突變目標聚核苷酸。本發明的方法對診斷許多種疾病或易感受性（suscept ibi 1 i t ies)非常有用，例如本方法可以檢測到突變癌基因（〇 n c ο e η e)的存在。本發明的方法除了具有PCR (聚合酶鐽反應）方法的快速優點，而且本方法的手續更為簡單和成本更為便宜。本發明的發明人亦已設計出一種套件實施本發明的方法。待分析的DNA可以羼於任何種類，例如從生物體的血液細胞、精子、或组織中取得的DNA,該生物體較佳是人類。本發明的方法並不需要複雜或昂貴的儀器，例如是在PCR方法所用的，而且本發明的方法可以不需要經過纯熟技巧訓練的技術人員操作。本發明的方法可以使用内對照組的方法，即試驗组和對照組是接受相同的處理。最後，本發明的方法可以設計成能産生簡單、且易於解釋的結果，例如試驗的結果可以在濾膜上呈現『+』或『-』的符號。本發明是基於兩種重要的元素。第一種元素是一種蛋 (請先閲锗背面之注念事項再填寫本頁) ..裝- 訂· .線· 本纸張又度適用中國西家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20.000 £09243 A6 經濟部中央標準'一?負工消«·合作社印Κ B6_ 五、發明説明（1 ) 白質，其可以與含有一個配對錯誤或没有配對的雙股核酸異源雙股體（heterodup 1 ex)结合。這種配對錯誤部位結合蛋白質的著名例子是細菌性蛋白質，例如大腸桿菌的Mu t S蛋白質，這種蛋白質的作用是在DN A修復過程。第二個元素是方法的簡易性，它可以分雞基因和測定待異性基因及突變的等位基因的序列。因此，本發明的方法是用來測定突變是否存在於樣品中的單股聚核苷酸（目標聚核苷酸）之上。即是說，本發明的方法是用來檢潮突變目標聚核苷酸或者掷定是否有突變存在（或不存在）於某種聚核苷酸（DNA或RNA) 在本發明的方法中，把可能含有突變目標聚核苷酸的待分析的樣品與單股聚核苷酸雜交對象（hybr i d i z a t ion partner)培育，其中的卓股聚核苷酸雜交對象是與没有突變的目樣聚核苷酸的序列有最少一個單股鹼基序列互補。雜交對象和待檢測是否帶有突變的目標聚核苷酸的聚核苷酸（例如DNA或RNA樣品）在適合雜交的條件下培育在一起，該條件是適合於讓雜交對象與樣品中的突變或非突變的目檫聚核苷酸進行雜交的。互補的序列雜交後會形成雜交對象和目標聚核苷酸的雜合體。這種雜合體可以與配對錯誤部位結合蛋白質結合或接觸，但條件是要適合配對錯誤部位結合蛋白質與突變目標聚核苷酸結合才行。這樣可以使到配對錯誤部位结合蛋 *10- II'——.------------------裝------ir------線 (請先閲讀背面之注念事項再構寫本頁) ί· 本纸張尺度適用中因3家標準（CNS>甲4现格（210 X 297公货〉 81.9.20.000 209 五、發明説明（f A6 B6 娌濟部中央摞準居δ工消费合作社印製聚髏是 N Μ 可性酶固後突素 e 對在合標合卽CD是其擇切被合有維 η 合合結。目雜ί 如是白，選内是結否ila 结結位物的於在例以蛋體。性象象是基 r 種質部産愛在存，可合液}制對對中硝 b 1 白誤應突存變 A 酸結性式限交交品是Γη第蛋錯反是否突 Ν 苷位：物形行雜雜樣物 e 記合對色酸是有 D .核。部生股進酸與測持 E 標結配顔苷質否。是」聚 A 誤 .是單前苷物檢支已位對生核白是} 象標N錯品成之核持以髏 e 種部如産聚蛋上在對目 R 對。樣變性聚支，固 s 1 誤例化檫合列存交 crn配物.其變，體起的〇入錯：催目結序否雜酸是的生中使在中固一佳 1 加對是以的位酸是，苷 A 佳衍例丨以例的在較U括配以可中部苷酸述核 N 較性施性可施得育。丨包與可或其誤核苷所寡 R .能實薆是實所培在i 是以象體 ,錯聚核上的的中功値酸酸値，品存 e 佳可對抗合對的聚如成佳法其一核核一上樣酸 C 較象合的结配中標，合較方或.的使的的物的苷〇驟對結性體測品目是種。的質明和來明持析核 Γ 步合種異合檢樣的的一 Λ述白發酸出。發支分聚 t 的結一持雜。示變佳或 N 上蛋本核放驟本體待標 i 測種第有與酸表突較 2:0:在3在放釋步在固與目1:: 檢這。質質苷是示 D 或 t 釋，割於以的，、。 •起白白核上表 CJA U 以地切定可變膜} 象一蛋 -裝-------ΤΓ------線 {»先閲¾背面之注t事項再埸寫本頁) 一本纸張尺度適用中因西家標準（CNS>甲4现格（210 X 2町公逄> 81.9.20.000 A6 B6 £09248 五、發明説明（q ) 在S—艏實施例中，檢測步驟包括加入第一種結合對象？卩II二種結合對象。第一種結合對象是與配對錯誤部位结合蛋白質結合，而且没有可撿測的標記。第二種結合對象S可以與第一種結合對象結合，然後檢測是否有第二種 •结合對象存在。第二種結合對象本身可以是一種可檢测標 I己1¾帶有可檢測楗記的第三種結合對象結合。較佳的第結合對象是第—種結合對象的抗體。在另一値實施例中，第二種結合對象是Mvi t L蛋白質或其功能性衍生物，更佳的是一種M u t L W苟以被檢測的第二種蛋白質或狀類的融合蛋白質。其中融合蛋白質中的第二種蛋白質較佳是点一半乳糖苷酶。在3—個實施例中，配對錯誤部位結合蛋白質是融合蛋S質的一個成份，其中的第二種成份是可以被檢測到的第二種蛋白質或肽類。該第二種成份是可以被直接（本身便可以被撿測）或間接（通過可以被檢測到的試劑）檢測到的。在這個實施例中，檢測步驟較佳是包括加入一種具有可檢測標記的結合對象，而該結合對象是與該融合蛋白質中的第二種蛋白質或肽類结合。該第二種蛋白質可以是一種酶，它可以催化從生色酶基質（Chromogen ic enzyme substrate)産生顔色産物的反應。該撿測步驟中包括提供生色基質和顙現顔色反應産物。較佳的第二種蛋白質是/3 —半乳糖苷酶。本發明亦關於一傾分辨樣品中的哺乳類單股目標聚核 -1 2- 本纸張又度適用中因a家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公货） -ί——'-------------------裝------.玎------線. <請先閲讀背面之注念事項再壜寫*.頁) ~ 一經濟部中央標準局S工消費合作社印製 81.9.20,000 09248_：_ 五、發明説明（π) {請先閲¾背面之注念事項再構寫衣頁) 苷酸是否有突變序列。在這個方法中，可以得到哺乳類聚核苷酸（DNA或RNA)的樣品。樣品是藉己知的方法取得的。例如，DNA或RNA可以從細胞取得，然後經過處理得到單股核酸，再將其與單股聚核苷酸雜交對象溫育在一起。該單股聚核苷酸雜交對象含有至少一値單股驗基序列與非突變目標晡乳類目標聚核苷酸 '互補。該D N A 或RNA和雜交對象是在適合雜交的條件下培育。該條件是適合雜交對象與樣品中任何突變或非突變目標聚核苷酸雜交。互_補序列的雜交可以產生雜交驾華抖,標聚核策酸所組成的雜交體。形成的雜交鼷是與配對錯誤部位結合蛋白結合或接觸。其所處的反應條件是適合引起配對錯誤部位結合蛋白質與雜交體结合的。其中的目標聚核苷酸是指突變目標聚核苷酸。如果檢測到雜交體上有配對錯誤部位結合蛋白質的存在，則表示該樣品中的晡乳類聚核苷酸上的突變存在（即表示是突變目標聚核苷酸存在）。本發明包括一組對檢測樣品中是否有突變目標聚核苷酸存在的套件。該套件亦可以用來分辨樣品中的突變目榡聚核苷酸和非突變目標聚核苷酸。該套件包括以下的組成烴濟部中央標準总员工消費合作社印« (a)第一個容器，其中含有單股聚核苷酸雜交對象 •此雜交對象中包括至少一®單股鹼基序列，該單股鹼基序列是與目標聚核苷酸的非突變序列互補的（卽與非突變目標聚核苷酸互補）； -1 3- 81.9.20,000 本纸掁又度適用t因西家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） A6 B6 £09243 五、發明説明（丨丨） (議先閲锗背面之注念事項再填寫衣頁) (b)第二値容器，其中含有配對錯誤部位结合蛋白質；和 (c )第三傾容器或多餾容器，其中含有一種試劑或一些試劑，利用這些試劑能夠檢測到配對錯誤部位結合蛋白質是否與雜交體結合。在上述的套件中配對錯誤部位蛋白質較佳是Mu t S或其功能性衍生物。這値試劑或這些試劑較佳是含有至少一個具有可檢測標記的第一镳結合對象，該結合對象能夠與配對:錯荜邹位結合蛋.白霣結食。其中較佳的第一種結合對象是對配對錯誤部位結合蛋白質有持異性的抗體。在另一種套件賁施例中，該試劑或那些試劑包括一但第一種結合對象，這艏结合對象是具有可撿測標記的。第 —種結合對象能夠與配對錯誤部位結合蛋白霣結合。第二種结合對象，例如是一種抗體，能夠與第一種結合對象结合。第二種结合對象可以具有可檢测的標記。此外，套件中的第二種結合對象也可以是沒有標記的，而是第三種結合對象具有可檢测的標記。該第三種結合對象能夠與第二種結合對象结合。經濟部中夹標準居MK工消費合作社印製 u 1 白。持 Μ 和蛋酶支是 L 種苷體象 t 二糖固對 U 第乳於合 Μ 該半定结種，I 固種一質 Θ 披一是白是是第如蛋的佳 , 例合佳較中，融較象例物的，對施生成的交實衍組到雜件性類測，套能肽檢中的功或被件佳其質以套較或白可的個質蛋是述 I 白種類上在蛋二肽在 L第或 t 値質 81.9.20,000 本纸張尺-度適用中Η國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货）

A 絰濟部中央標準局S工消費合作社印製五、發明説明（Ί) 物上。較佳的固體支持物是硝基纖維素膜。在另一値套件實施例中，配對錯誤部位結合蛋白質是一値融合蛋白質，該融合蛋白質是與一値酶和一種試劑融合，其中的試劑是含有該種酶的生色性基質。附圖的簡要說明圖1是一個示_意圖,.它表示寡核苷酸雜交對象或c D ΝΑ雜交對象與『待測定』或『目標j DNA的雜交現象 Λ圖1的下面表示含有雜交醱的配對錯誤構型。其中c D Ν Α己經與基因體D N A Η段雜交，基因睡D Ν Α (内含 • · + ' 子）的非雜交部份形成迺圈。 '圖2是一個示意圖，它表示本發明的突變檢驗測定法。在這個實施例中，配對錯誤部位結合蛋白質是利用第一種結合對象檢測的，該結合對象是對配對錯誤部位结合蛋白質有特異性的抗體。這値抗餳可以是具有可檢測標記的，或可以被具有可檢測標記的試劑檢測到（右下方）。或者，檢測步驟可以利用第二種結合對象擴增。在這裡第二種結合對象是對第一種抗體（『抗一 Ab』）有特異性的抗體（左下方）。 ’圖3是一痼測定方法示意圃。如實施例所述，其中的陽性和陰性對照組是浸漬於硝基缕維素濾膜上。如果沒有配對錯誤存在，則硝基纖維素濾膜上會出現『一』符號。如果有配對錯誤存在，則硝基鐵維素濾膜上會出現『+』符號，即表示目標DNA含有突變（配對錯誤）。 -15- (諳先閲讀背面之注念事項再填窝本頁> 丨裝· 訂. -線. 木紙張又度適用t西因家榫準（CNS)甲4規格（210 X 297公货 81-9.20,000 經濟部中央標準扃员工消費合作社印¾ 09248_^_ 五、發明説明（θ) 圖4表示於溶液中對異源雙股髏檢測是否有配對錯誤存在的結果。 11 5表示對與固定化寡核苷酸配對的異源雙股髏檢测是否有配對錯誤存在的结果。圖6表示對在有寡核苷酸競争的條件下配對的異源雯股體檢測是否有配對錯誤存在的結果。較佳實施例的說明本發明提供一艏新穎、應用廣泛、而且簡易的方法來檢測核酸序列的改妥，即使僅是單一値驗基的改變也輯檢测出來。細菌性的DNA配對錯誤修復機制使用了一条列的蛋白質，包括一個蛋白質，其能辨識含有一傾驗基對配對錯誤的雙股DNA並與之結合（綜述論文如Radma η , M. e t . a 1 . , Annu. Rev.

Genet. 20： 523-538 (1986); R adman, M . e t a 1 . , S c i . A mer., August 1988， p p . 4 〇 -46; Mordrich, P·, J . Biol • C h e m . 264:6597 — 66 〇〇 (198 9) ) 。MutS蛋白質是E. co 1 ί配對錯誤修復条統的成員（Lahue, R.S· e t a 1 ., Science 245:160—164 (1 9 8 9 );Jiricny， J. e t a 1 . , Nuc 1· Acids Res. 16:7843-785 _ 1 6 - 木纸張又度適用中因S家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20,000 ------------------------装-------玎------線、 <請先閲¾背面之注念事项存蟻寫衣頁) ( 209243 A6 B6 經濟部中央標準局負工消費合作社印焚五、發明説明（ 3 ( 1 9 8 8 ) » s u > S • s • e t a 1 • * J • B i o 1 * C h e m • 2 6 3 6 8 2 9 — 6 8 3 5 ( 1 9 8 8 ) » L a h u e t R • S • e t a 1 • t P r o c • N a t 1 A c a d • S C i • U S A 8 4 * 1 4 8 2 — 1 4 8 6 ( 1 9 8 7 ) 9 D o h e t • C * e t a 1 • 9 M o 1 • G e η * G e n e t • 2 0 6 = 1 8 1 — 1 8 4 ( 1 9 8 7 ) » J o n e s 9 M • e t a 1 • 1 G e η e t i c. s 1 1 5 = 6 0 5 一 6 1 0 ( 1 9 8 7 ) t S u » S • S - e t a 1 • > P r o c • N a t 1 • A c a d • s c i • u s A 8 3 ： 5 0 5 7 — 5 〇 6 1 ( 1 9 8 6 ) = D o h e t t C * e t a 1 • I P r o c • N a t 1 • A c a d • S c i * U S A 8 2 ： 5 0 3 一 5 0 5 ( 1 9 8 5 ) 9 C h ο y * H • E * e t a 1 • » M u t a t • R e s * 1 4 2 9 3 一 9 7 ( 1 9 8 5 ) » J o n e s $ M • e t a 1 * M o 1 • G e n • G e n e t • 1 8 4 5 6 2 — 5 6 3 ( 1 9 8 1 ) ) 0 同類功能的蛋白質於其他菌種中也有 f 包括鼠傷寒沙門氏菌 ( S a 1 m o n e 1 1 a t y P h i m u r i u m ) 的 M u t s 蛋白質 ( L u > A • L • e t a 1 » G e n e t i c s 1 1 8 ： 5 9 3 — 6 〇〇 ( 1 9 8 8 ) f H a b e Γ » L T e t a 1 * J -17- (請先閲林？背面之注念事項再壜寫衣頁) 本纸張又度適用中西國家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 A6 B6 蛭濟部中央標準易B：工消費合作社印« 五、發明説明（\Γ) • B a C t e Γ i 〇 1 • 1 6 3 ： 1 〇 0 7 — 1 0 1 5 ( 1 9 8 5 ) ) 和肺炎鍵球菌 ( S t Γ e P t 〇 C 〇 C C U S P η e .U m 〇 η ί a e ) ( P Γ I e b e t S • D • e t a 1 • 1 J • B a C t e r i 〇 1 • 1 7 〇 • 1 9 〇 — 1 9 6 ( 1 9 8 8 ) Η a b e Γ e t a 1 • 1 J • Β a C t e r 1 ο 1 • 1 .6 3 • 1 0 〇 7 — 1 〇 1 5 ( 1 9 8 5 ) ) 0 純化的 Μ u t S 蛋白質與含有配對錯誤鹸基的 D N A 結合 » 但是不會與沒有配對錯誤或 CJO 単股 D Ν A 结合 _〇 Μ U t S — D N A 的相互作用並不會産生 D N A 任何降解或 .修飾 0 本方法的原理是：當突變 D N A 鍵與野生型 D Ν A 互補鏈雜交會形成配對錯誤 D N A 異源雙股體 ( 見圖 1 ) 0 利用配對錯誤部位結合蛋白質 (例如 E • C 〇 1 ί 的 Μ U t S 蛋白質 ) 與該雙股體结合的作用可以特異性地被檢測出來〇結合了的配對錯誤部位結合蛋白質可以利用許多方法加以檢测 » 例如 * 利用對配對錯誤部位結合蛋白質有特異性且具有可檢測標記的抗體 9 例如是抗 Μ U t S 抗蘸〇這値方法與先行技術截然不同 * 以前的方法皆是用切割核酸酶於配對錯誤驗基對附近的 D N A 進行切割〇 is 艏方法於圖 2 的示意圖〇本發明的方法可以用來檢測樣品中是苔育特別的標核酸分子或聚核苷酸存在〇這些樣品例如是血液 S 精子 % •18· (»先閲¾背面之注念事項存填寫本頁) •裝· 訂· .線. 木紙張尺及適用令困园家撑準<CNS) τ 4規格（210 X 297公釐） 81-9.20,〇〇〇

A6 經濟部中央標準/eytJR工消費合作社印S B6_ 五、發明説明（4 ) 糞便、血清、尿液、唾液、培養液等，以及非生物性的樣本，如廢物或飲用水、奶類、或其他食品、和空氣等。可以由本發明的方法檢測的目標聚核苷酸或核酸分子是DNA或RNA,但較佳是DNA。當雜交對象是cD ΝΑ時，目標聚核酸可以是DNA或mRNA,惟需要相當數量的mRNA的拷貝。以下說明中所用的『目標聚核酸』或『目標聚核苷酸』或『目檫序列』是表示含有想檢測或定量的序列的核酸。它可以包括野生型或非突變的目標聚核苷酸或非突:變的目樣聚核苷酸或非突變的目標序列 - --_ -· 。或者，它亦可以包括有一値改變或突薆（從野生型突變而來）。在這種情況下，它的意義是指突爱的目標聚核苷酸。於目標聚核酸中的目標序列需要有足夠的長度與探針 DNA (雜交對象）進行雜交，至於聚核苷酸内有改變或突變也是如此。目標序列中較佳是具有多於30個鹼基可以被本方法檢測。在一値實施例中，目標核苷酸序列必須是己知的，這樣才可以製備適當的『雜交對象』聚核苷酸或寡核苷酸。這種雜交對象具有與無突變目標序列對應的序列，俾使在檢測突變時有配對錯誤的現象發生，並容許配對錯誤部位結合蛋白與之結合和進行後缅的檢測步驟。在另一脑實施例中，cDNA分子可以用作雜交對象。在這艏例子中，目標核苷酸序列可以事前不知道。當c DNA與基因組DNA片段雜交時，CDNA由於沒有内含子（introns),因此會使基因組DNA於雜交 -19- <請先閲讀背面之注6事項再項寫未頁) _装- 訂- •線· 本紙張尺Λ適用中國3家標準（CNS)甲4现格（210 X 297公货） 81.9.20.000 A6 B6 2〇〇343 五、發明説明（β ) {請先閲請背面之注念事項典瑱寫皋頁) 匾中産生不能配對的迺圈（見圖1)，但這些迺圈既不與配對錯誤部位结合蛋白質結合，也不會影蠼造些配對錯誤部位結合蛋白質與配對錯誤部位的結合。這些配對錯誤是單一鹺基及由加入或刪除1-4個鹼基對而引起的配對錯誤。本發明的方法具有優點是容許在沒有經過分子擴增的情況下檢測突變目標核酸分子（DNA或RNA)。該種分子擴增的步抵是一般甚至最近發展出來的檢测方法所必須的。本發明卻能夠速到不霹要進行分子擴增便可以檢測突變的目的。本發明的做法是建構一値或多値具有與一値或多値野生型目檫聚核苷酸序列互補的『雜交對象』寡核苷酸或聚核苷酸，包括cDNA分子。這些雜交對象是可以與目標核酸分子雜交，結果會産生鹼基對配對錯誤或不能配對的情況，而這些配對錯誤的部位可以由配對錯誤部位结合蛋白質所檢測到。在一櫥較佳的實施例中，雜交對象是單股核酸分子，更佳的是，雜交對象是單股DNA。經濟部中兴摞準局負工消費合作社印製目標聚核酸分子可以是真核細朐、原核細胞、病毒、類病毒、或類似的生物的DNA或RNA。較佳的是，目標聚核酸分子是從晡乳類動物而來，更佳的是，目標聚核酸分子是從人類而來。資際上.目標核酸分子的核苷酸序列或來源並無甚麽限制。 —些移位突變（framesh i f t m u t a t -20- 81.9.20.000 本纸張尺及通用t西S家標準（CNS〉甲4现格（210 X 297公：tt ) ®濟部中央摞準扃w工消費合作社印¾ 〇Q24c3 A6 _B6_ 五、發明説明（j) ions)，不管是增加或缺失鹸基，都會使該序列與野生型序列配對後産生配對錯誤的部位，而且那些部位可以與配對錯誤部位结合蛋白質结合。例如，已知E. c 〇 1 i的MutS驗基修複条統（Radman, Μ. e t a 1 . , Annu. Rev. Genet. 20 : 523—.538 (1 9 8 6))和 Strept ococcus pneumoniae 的 Hex 配對錯誤修複条统可以與由增加或缺失單一曄基而引起的配對錯誤部位發生作用。如果只是增加或缺失兩偏或三値驗基，或甚至四個鹾基，都可以修複。可是如果增加或缺失五艏鹼基，則不能修複。因此，本發明的方法對於檢測小規模的突變十分痤敏，所諝小規模的突變是指一値至四個齡基的突變。在檢測雙股（d s) DNA上的單一鹼基突變的測定法中，較佳的是利用兩個野生型雜交對象序列，此雜交對象序列是與突變種DNA股互補的。這是因為利用兩個野生型雜交對象序列會使檢測法的敏烕度增加兩倍。可是，它亦可以用一値互補的雜交對象序列，該序列是與該兩値 DNA股的其中一股互補的。這樣可以使到測定法仍然有足夠敏威度。雖然使用一條鏈會使敏感度減半（與使用兩條鏈比較），但不會影饗本方法的用途。由於一値配對錯誤部位結合蛋白質（例如M u t S .) 不能與所有可能的配對錯誤部位均具有相等的結合效率（ -2 1- (請先閲¾背面之注念事項再填寫本頁) •-裝· 訂. 線. 本纸張又度適用中aa家標準（CNS> 4规格（210 X 297公釐） 81-9.20,000 二B6 五、發明説明（d ) Dohet， C . e t al. , 1985, sup ra; Jones, M . e t a 1 . , 1987 ,supra),對某些目標序列來説必須製備與兩條鏈均互補的雜交對象。這樣可以産生兩嫡與已知的dsDN A野生型序列配對錯誤的部位，這兩個配對錯誤的部位可以藉以檢測到兩艟突變種序列的其中一艏。雜交對象可能是單一連缠的多核苷酸，該單一連绩的. 多核苷酸部份與比較大的目標序列有互補序列，而該目標序列中有超過單一鹺對被錯.誤配對。或者，在目樣D N A - ：. - • . :; 的單一片段之上有二®突變，而這二値突薆被大約30或更多的鹼基分隔。逭些突變可以使用二個或多的個別的雜交對象檢測到，其中每個雜交對象與該單一目標片段之上的披分開的序列雜交。在一値實施例中，與目檫序列互補的雜交對象的區域可以在3 ~或5 <终端處的左右兩面有非可雜交的序列，條件是可雜交的部分形成穩定的異源雙螺旋體，其長度至少為大約3 0個核苷酸，其中那配對錯誤部位结合蛋白質能夠辨認出配對錯誤的部位和與之結合。 il.——.------------------裝------.玎------線 (請先《識背面之;±+?事項再填寫本頁> < 經濟部中央標準居8工消費合作社印奴週核掲 $- e 所寡有 P 1 眾學經 0 種化已，Μ 多用術 . 用利技 1 · 利是的 a S 以象酸 e 可對¥t R 備交核 e 製雜寡 . 的酸成 .d 象苷合 R i 對核。 C 交寡備，A 雜，製 U A 是法 W . N 的方如 1 D 佳的，〇或較統說U A 。傳來 N N 法成例. R 方合舉 . 的酸，〇知苦示〇本纸張尺度通用中西西家桴準（CNS)甲4规格（210 X 297公;S ) 81.9.20.000 __<_^6_ __<_^6_ 經濟部中央標準！工消費合作社印製 Αβ 五、發明説明（>〇 ) c . Biol. 21 ： 101-141 (1.978) )。或者，RNA雜交對象分離出來是細胞的一個自然的産物，舉例來說，如mRNA分子。RNA或cDNA雜交對象能也可以利用重組DNA方法製備。（舉例來説，可以參考，Green e t a 1 . , C e 1 1 32 ..7-. :6 8 1 ( 1 9 8 3 ) ) 。D N A雜交對象可以從多種來源之中的任何一値製備，舉例來説，可以利用限制核酸内切酶切割或化學切割的方法切割天然的D N A。已知的事實是，E .: c o_l._i的M u t S可以结合到異源雙股體的16個鹼基上（J i r i cny e t a 1 . , supra)，而且該異源雙嫘旋鏈在進行足跡法試驗（footpr int ing assay)時可

以受到Mu t S保護，該異源雙股體可以小至8_ 1 2値齡基（Su，S — S. e t a 1 . , P r o c . N a t; 1 . Acad. Sci. USA 83:50 5 7 - 5 0 6 1 (1 9 8 6))。本發明的雜交對象大小的下限是大約1 〇核苷酸。為了增加雜交的真實度但要使合成核酸的成本保持於低水平，比較大的雜交對象是較適合的，較佳的是從大約20到大約100個核苷酸之間。

根據已知的寡核苷酸合成的成本計算，較適合的寡核苷酸雜交對象具有大約S0到大約40锢核苷酸。這是因為重组方法可以用來製備它們，所以在雜交對象的大小並没有上限。如此，在另外的一値實施例中，可以使用完整的D -23- 本纸張尺度適用tiia家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货〉 81.9.20.000 ——.---------------------裝------#------線| (請先閲锗背面之注念事項再填寫本頁) ( A6 B6 09^48 五、發明説明（>丨） NA分子作為雜交對象。在本發明的方法中，雜交對象序列是一種可以被固定的形式，或較佳的，在被固定於固相支持物之上或載體之上（見第3圖）。雜交對象的一種可以被固定的形式將是 —種易於固定化的形式，固化作用通常是在雜交反應之後進行。使雜交對象固定化對本發明並不重要，而且任何的有效的方法都ιί拿來使用，只要那些雜交體被固定化。該雜交醭是由雜交對象和目榡核酸序列形成。而雜交體的固定体是_择著雜交對象的性質而逹成。，當雜交反應於固定化的産物進行時，雜交對象可能是任何的適當的形式，這種雜交對象使它能夠和反應混合物的任何的成分與之結合，使後來分離的步驟更方便。分離的步驟可能是以離心法，過濾法，色®分析法，傾析法或相似的方法而達成。一値具有普通技術的人員可以根據本發明製備各種適用的雜交對象的組成物和組態。舉例來說，雜交對象能被凝集或沈澱出來，並附著到不溶解的材料，聚合物或支持物之上，或使用凝膠（例如瓊脂糖或聚丙烯醯胺）收集。 (Meth. Enzymol. , 1 2 B ： 6 3 5 ( 1 9 6 8) ； Proc. Natl. Am. Sc i. 67:807 (1970))。最適合的是固髏的支持物，其上可以有雜交對象附著或以共價或非共價化學鍵連結固定。較佳的是，以非共價附著作用，該附著的方 -24- 本纸張尺度適用中西西家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） il·——：------------------裝------訂----——線 (請先閲访背面之注*事項再填寫本頁) ( 經濟部中央標準局負工消费合作社印5ί 81.9.20.000 A6 B6 9.Π9243 五、發明説明（Z2) 法是提供一種合適穩定的和強壯的附著作用。這値方式可以利用一値位於雜交對象之上胺基修飾劑而達成；該胺基修飾劑是用於把雜交對象”鉤”或附著於在固髏的支持物上（舉例來說，膜或濾H)。把一値需要的寡核苷酸或聚核苷酸附著於選定的固體的支持物上是本技薛中的技術人員所知道的。利用『固體相的支持物』是任何可以與寡或聚核苷酸結合的支持物。眾所周知的支持物或載饈包括包括天然的和修-飾_過的雄_素，例如硝華纖維素，聚苯乙烯，酎龍 Τ：·' 聚丙烯醯胺，聚丙烯，聚乙烯，聚葡萄糖，和瓊脂糖。這些支持物可以是任何可能的结構，只要披固定的雜交對象能夠與目標核酸分子雜交，而且那値錯誤配對部位结合蛋白質能夠接著與雜交對象一目檫聚核苷酸雜交體结合。因此，支持物組態可以包括徹粒子，囫珠，多孔的和不能谚透的條和膜，和反應容器的内部的表面，反應容器例如是試管和微滴板，和相似的容器。較適合的支持物包括绻維素片或條。熟練的技萏人員知道許多其他適合的載體，這些載體可以提供寡或聚核苷酸結合，而且可以利用常規的實驗加以確定。

把雜交對象附箸於硝基鐵維素膜之上較適合的方法包括使把雜交對象以碘化納溶液飽和化，並將其點於膜上或以膜過滅（.Brasser e t a 1 . , DNA 2:243 (1 9 8 3))。或者，把雜交對象以乙二醛 -2 5 - 本紙張尺茂適用中因S家標準（CNS>肀4規格（210 X 297公釐） -------------------------裝------，ΤΓ------綠Λ1 <諳先閲讀背面之注6事項再填寫參頁) { 烴濟部中央標準馬®:工消費合作社印製 81.9.20,000 09^43 五、發明説明（乃） A6 經濟部中央摞準尽負工消費合作社印5i ( 少於 1 Μ ) 處理然後使其附箸於膜上〇雜交對象可以被固定 > 處理條件田疋在真空之下以 8 〇 t：溫度乾燥大約 2 — 3 小時 0 ( T h 〇 m a S f P • S • » Μ e t h • E η Z y m 〇 1 • 1 0 0 ： 2 5 5 ) 0 寡核苷酸雜交對象的共價固定亦可以達成的 0 百前己知很多對共價固定的支持物料和聯结方法 0 例子包括聯結到磷纖維素的作用是藉著 m 二 m 胺或羰二咪唑把磷酸鹽基團活化的 ( B a U t Z » E • K * , F • e t a 1 • » P Γ 〇 C • N a t 1 A C a d .« S C i • 4 8 ： 4 0 〇 — 4 〇 8 ( 1 9 6 3 ) ; S h i h ， T • Υ • e t a 1 • t B i 〇 C h e m i S t Γ y * 1 1 3 3 4 1 1 — 3 4 1 8 ( 1 9 7 4 ) ) f 或在間 — 重氮苯甲醛基氧甲基潘維素之上的重氮基園與雜交對象的 G 和 T 殘基的反應 ( N 〇 y e S t B • E • e t a 1 • » C e 1 1 5 ： 3 0 1 — 3 1 0 ( 1 9 7 5 ) R e ί S e Γ * J • e t a 1 • * B i 〇 c h e m Β i 〇 P h y S • R e s • C 〇 m m • 8 5 = 1 1 〇 4 — 1 1 1 2 ( 1 9 7 8 ) ) 0 多糖支持物可以能被偶合起來 » 偶合作用可藉水溶性的碩二 m 胺激活作用在寡核苷酸的终端磷酸和支持物的羥基之間形成磷二酯鍵 ( R i C h W 〇〇 d 1 D • 9 B i 〇 C h • m • B i 〇 P h y S * A C t a 2 6 9 4 7 — 5 0 ( 1 9 7 2 ) ) t 或把在寡核酸上的親核性部位與溴化氡活化的支 -26- {請先«讀背面之;i&事項存瑱窝本頁) 本纸張又度適用fa因家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20.000 _4d - 經濟部中央標準局3工消費合作社印製五、發明説明（>ψ) 持物偶合 ( A Γ η d t — J 〇 V 1 η 1 D • J • e t a 1 • * E U Γ • J • B i 〇 C h e m • 5 4 4 1 1 — 4 1 8 ( 1 9 7 5 ) ) ο 進一步的 • 雜交對象的 3 9 羥基终端能被過碘酸 ( Ρ e Γ 1 〇 d a t e ) 所氣化和以席夫驗 ( S C h i f f b a S e ) 形成作用使其與具有胺基或胼 m 基 ( h Y d Γ a ζ i η e ) 的支持物偶合 ( G i 1 h a m » P • T * • Μ e t h 〇 d E η Ζ y m 〇 1 * 2 1 ： 1 9 1 一 1 9 7 ( 1 9 ? 1 ) Η a η S S k e % Η ♦ D • • e t a 1 • » Μ e t h ο d • E η Z y m 〇 I • 5 9 1 7 2 — 1 8 1 ( 1 9 7 9 ) ) 0 具有親核性部位的支持物能夠與氰尿酸 ( c y a η u Γ ί C ) 氮化物反應而且於其後與聚核苷酸反應 ( Η u η 8 e Γ • Η • D • » e t a 1 • > B i ο c h i m • Β i 〇 Ρ h y s * A C t a 6 5 3 ' 3 4 4 — 3 4 9 ( 1 9 8 1 ) ) 0 — 般來說 t 任何的方法都可能用於把雜交對象固定 9 只要有 — 種與巨標序列互補的序列使其與樣品中的核酸雜交 Ο 本發明並不需要持別的方法或材料〇另外 — 個可行的利用直接固定化的雜交對象的方法是使用可以固定化的形式 » 允許在溶液中進行雜交步驟 9 在溶液中進行雜交的反應動力學速度 -tS> 更快 0 一般來說 9 在 — 値實施例中 » 可以使用包含反應的部位的雜交對象 > 它能夠與反應對象形成穩定的共價或非共價化學鍵 > 並且藉 -2 7 _ {請先閲访背面之注*事項再蟥寫本頁) 本纸張又度通用中國困家標準（CNS)甲4现格（210 X 297公货） 81.9.20,000 經濟部中央標準爲負工消費合作社印製五、發明説明（/) 與固定化的形式的反應對象接觸而得到固定化。較佳的是，這値雜交對象的反鼴部位是結合部位，例如是生物素或半抗原分子，它能夠特異性地以非共價結合方式與结合物質結合，該結合物質例如是生物素結合蛋白質或抗髏，這些结合物質是作為為固定化的反應對象。主要的是，任何一對物質可能包含反應部位/反應對象對，它可以展現適當的反應親和力形成穩定的化學鍵，那是一個使兩者聯結或偶合，該兩種物質在後缠的化驗步驟期間實質上保持完整v;那些化驗步驟主要是分離和檢測的步驟。在雜交對象之上的反應部位稱為『结合部位』，而反應對象則稱為f结合物質J,與它可以形成共價或非共價化學鍵或連结。在一個實施例中，那结合部位較佳是提供雜交對象的 —傾不能雜交的（nonhybr i d i zab 1 e)部分，而且較佳可以得到一傾雜交對象的化學修飾作用的結果。在核苷酸序列之内的结合部位的例子是『促進子序列』，它可能與促進子結合蛋白質结合在一起，『操縱子序列』，它可能是與阻遏物蛋白質结合，或是『被修飾過的核苷酸』，它可能是與特殊的抗體結合，舉例來說，5 — 溴代去氣一尿核苷或5 —碘去氧尿核苷（Br i t i Sh 專利説明書第2, 125, 964號），胸腺嘧聢二醇 (Raj agopa l an e t a 1 . , Radi at. Res. , 97:499 — 510 (1 9 8 4 -28- 本纸張尺度適用中國a家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20,000 ------------------------裝------訂線| f (請先閲讀背面之注念事項再填窝參頁) ( 2〇924d A6 B6 娌濟部中央標準/&員工消费合作社印«'|4«. 五、發明説明（) ); Hubbard, K. e t al., Ra d i a t . Res. 118:257 — 268 (19 8 9))〇那些經化學修飾於寡核苷酸雜交對象而引入的结合部位持別地適用於而且通常參與把待異性結合配對的一値成員與雜交對象連結。有用的结合配對包括生物素/生物素結合蛋白質（包括蛋白生物素結合蛋白質和鏈生物素結合蛋白.），_半抗原.（或抗原）/抗體，碩水化.合物/外源凝集素，酶/抑制劑，和相J[的物質。如声結合配對由蛋白質成員和非蛋白質成員所組成，它一般會把非蛋白質成員連接至雜交對象，這是因為蛋白質成員可能在雜交的爱性條件下是不穩定的。較佳的条統中包括把雜交對象連结至生物素或或半抗原，並且分別是使用固定化的生物素結合蛋白質或抗半抗原抗體試劑（a n t i — h a p t e η antibody reagent) 〇當雜交對象以周定化的形式被引入到雜交反應之中的時候，後續的把形成了的雙股進行固定化的步驟和加人配對錯誤部位结合蛋白質和檢測試劑的步驟可以按照想要的順序進行。固定化作用和加入那些配對錯誤部位结合蛋白質和其他的試劑可以藉著以下的步驟達成：同時或順序加入必需的試劑和材料，不管有或没有洗滌或分離步驟，都可以達成。如果有後缅的順序加入試劑，刖當然要注意加人試劑的濃度，要使形成的雜交體不致過飽和，而且避免 -29- 木纸張尺度適用中西因家標準（CNS)甲4規格（21〇 X 297公货） 81.9.20,000 ------------------------装------ir------^ . {請先閲讀背面之注&事項存填寫*.頁) 一 A6 B6 209248 五、發明説明（刊）配對錯誤部位結合蛋白質和檢測試劑之間交互作用。

一個較適合的配對錯誤部位结合蛋白質的特歡是它可以把 DNA-DNA (或 DNA — RNA 或 RNA — RN A ) 鹼基錯誤配對的雜交龌结合 ( 該雜交體是由雜交對象和百標互補的樣品核酸形成 ) 與單股聚核苷酸或 f=±S> 兀美配對的雜交體結合〇在一锢較適合的實施例中 > 可以使用兀整的 E * C 〇 1 i 的 Μ U t S 蛋白質 0 然而在本發明中 f Γ 配對錯誤部位結合蛋白質 J 包括完整天然的蛋白質的功能性衍生物〇根據本發明 9 所謂 Ί 功能性衍生物 j 是指蛋白質 Γ Η 段 J t f 變異體 Γ 類同物 ϋ » 或 T 化學衍生物 J 9 其可以保持與配對錯誤核酸異源雙螺旋涯結合的能力 0 配對錯誤部位結合蛋白質的 r 片段 1 是指該分子的一 0 子集 ( S U b S e t ) t 是比較短的肽鍵〇蛋白質的 tt 變異體 ” 是指實質上與分子整痼蛋白質或其個 D N A 一雜交體 — 結合片段相似〇配對錯誤部位結合蛋白質的變異體 ( 洌如 » Μ U t S ) 可以利用重組 D Ν A 方法製備而那重組 D Ν A 方法是眾所週知的技藝 0 Μ U t S 的一傾較佳的功能性衍生物是 E • C 〇 1 i 的 Μ U t S 的另 — 種細菌的類同物例如鼠傷寒桿菌的 Μ U t S 蛋白質 ( L U * A • L • e t a 1 . > S U Ρ r a > Η a b e t L * T • e t a 1 . > S U Ρ Γ a 9 Ρ a η g 1 P P e t a 1 » -30- 表纸張尺度適用中因因家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） ---.---------------------装--------ΤΓ------線「 (諳先閲筇背面之注&事項弄填寫本頁) 經濟部中央標準《·«工消費合作社印製 81,9.20,000 A6 209248_ 五、發明説明（4) (請先《讀背面之注A事項再填寫本頁) supra)或肺炎鐽球菌的hexA蛋白質（Pr i e be S.D. e t a 1 . , supra ; Ha b e r e t a 1 . , supra)。除此之外，也可以使用MutS或HexA的真核同源物，例如那些具 Λ 有人類，小鼠或田鼠D Ν Α的同源序列（S h i m a d a ， T . e t a 1 . , J . Biol. Che 2 6 4：2 0 1 7 1 (1 9 8 9) ； Linto n · e t a 1 . , J. Molec. Cell • Biol. 7 ： 3 0 5 8 - 3 0 7 2 ( 1 9 8 9 ) : Fuji, H . e t a 1 . , J . Bio 1. Chem. 264： 10057 (1989)) 0 配對錯誤部位結合蛋白質的『化學衍生物』含有附加的化學部分，該部份一般不是蛋白質，這種衍生物包括融合蛋白質中的附加胺基酸。肽鐽的共價修飾是包括在本發明的範圍之内。這樣的修飾可以引入到分子之内，引入修飾作用的方法可以藉著把目標蛋白質的胺基酸殘基與反應絰濟部中央標準'li? |*工消费合作社印製殘其並標物的，，目生端用合種衍终作偶這學或飾質，化鐽修白榡的支的蛋目合的原與的適定抗是象較特半團對個與如基合一應子原結的反例抗的質學的半記白化用的標蛋藉作似測。合劑化類檢用結試生和可之位化衍基有測部生些苯具檢誤衍這基為於錯機。硝作助對有應三以有配該反如可以 , 基中且可本纸張又度適用中因因家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公：$ ) 81.9.20,000 經濟部中央標準居w工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（1) 是配對錯誤部位結合蛋白質和另一個蛋白質（卽『融合蛋白質對象』）之間的融合蛋白質，其中所謂另一個蛋白質是指可以提供结檐的或功能的特戡，使結合作用可以檢測到。舉例來說，融合蛋白質對象可以提供抗原性部位與抗體結合作為檢測的依據。由配對錯誤部位结合蛋白質或功能性的衍生物與酶組成的融合蛋白質能夠提供一種更直接的方法進行檢測，舉例來說，藉著融合蛋白質中藤的部分可以催化反應，從生色基質産生顔每反鼯産物，這是 ♦ 習知的技蓊。較適合的融合蛋白質是由Mu t S或一種功能性的衍生物與/3 —半乳糖酶所組成。在這値實施例中，與固相支持物結合的的存在可以利用這種酶的生色基質進行來測。如此的基質的例子是NABG(Naphthol A S-B 1-^-d-ga l actopyranos i d e ) 〇配對錯誤部位結合蛋白質的融合蛋白質衍生物可以利用習知的方法製備，（參考資料如：Sambro〇k, J. et a 1 . , Molecular Clo ning: A Laboratory M a n u a k • 2nd edition, Cold S p r i n g Harbor Press, Cold S p r i ng Harbor, NY, 1989)。 -32- 本纸張又度適用中因a家標準（CNS) ψ 4規格（210 X 297公货） 81.9.20,000 ------------------------裝------tr------線~N (請先閲访背面之注6事项再項寫*.頁> 一+ 經濟部中兴標準'¢5工消費合作社印« A6 _B6_ 五、發明説明（^ ) 蛋白質的選擇對本化驗的方法十分有用。選擇蛋白質的方法可以使用習知的技S和傳統的方法。因此，舉例來說，在評估是否有配對錯誤部位結合蛋白質的存在時，可以進行配對錯誤部位結合作用試驗，例如有關Mu t S蛋白質試驗的說明Jiricny e t a 1 .(其整體的方法可.以作為參者）s較佳的是使濾膜結合試驗。為了. 要製備寡核苷酸異源雙螺旋髏，把寡核苷酸，較佳是具有大約1 6値鹼基以3 2 p檫記，標記的方法是使用激酶反應和T 一 3 2 P - A I.P 其中所使用的激酶例如是.T 4 . · . . —- ' .f, 一聚核苷酸激酶。-標記的寡核苷酸（其可以被儲存在一 201C下）然後與互補的寡核苷酸進行黏合（ann ea 1 i ns),該互補的寡核苷酸在標準的情況之下具有一値單驗基對錯誤配對。己黏合的1 6個齡基對異源雙螺旋體與過量的蛋白質混合，並且保持在冰上，為時3〇分鐘。然後把混合物點附於硝基纖維過濾膜上，該濾膜是已經披試驗缓衝液預先弄濕。經過溫和的抽氣數秒後，把濾膜以冰冷的試驗缓衝液徹底清洗。然後把濾膜於空氣中弄乾，以閃爍計數用液體將其懸浮並進行計數。藉箸蛋白質黏附於濾膜上，在濾膜之上的任何的計數是由於該錯誤配對部位結合蛋白霣結合到濾膜所致。在沒有這種蛋白質存在的條件下，已榡記的寡核苷酸異源雙螺旋體將通過濂膜。因此，使用如此簡單的試驗，便可以容易地檢測和選擇配對錯誤部位結合蛋白質，該配對錯誤部位結合蛋白質 -33- 本纸張又度適用中囲西家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公货） 81.9.2〇,〇〇0 ------------------------裝------.ΤΓ------身 (Λ先Mift背ώ之注&事項Λ·壜寫本頁) 209243 五、發明説明o1) 經濟部中央標準局I®工消費合作社印製對本發明的方法是 + 分有用的 0 如在此技 ϋ 中已知的 9 本發明的方法可以使用不同的雜交條件 0 — 般來説 » 雜交將於略高的溫度下箸手進行 > 例如在大約 3 5 ic 和 7 5 之間 » 而且通常在 6 5 1C 左右進行 t 在溶液中缓衝液含有的酸鹼值在大約 6 和 8 之間和適當的離子強度 ( 舉例來說 t 2 X S S C 1 其中 1 X S S C = 0 • 1 5 Μ 氯化鈉和 0 • 〇 1 5 Μ 檸樣酸鈉 » 酸鹼值為 7 • 0 ) f 蛋白質例如是牛血清白蛋白 * F i C 〇 1 1 ( 商標 $ 它是 — 種廉糖和 Θ P ί C h 1 〇 Γ h y d Γ ί η 的 — 値共聚物 9 由 P h a Γ m a C i a F i η e C h e m i C a 1 S 9 P i S C a t a w a y » Ν J 販售 ) 聚乙烯咯烷 » 和已愛性的外來 D N A ( 例如從腓腸胸腺或鲑魚精液製備而得 ) 0 雜交作用發生所需要的樣品和雜交對象鏈之間的互補程度 CB 疋梘乎反應條件的嚴緊程度 ( S t Γ i η S e η C y ) 而定〇雜交的程度和持異性是受下列各項主要條件所影〇 1 • 核酸製劑的純度〇 2 • G — C 驗基對的含量 • G — C 鹼基對與 A — Τ 或 A — U 驗基對比較呈現較大的熱穩定性〇因此 > 具有比較更高的 G — C 含量的雜交髏在比較高的溫度下是較為穩定的 0 3 • 同源的 m 基序列的長度 • 鹼基的任何短的序列 9 . 舉例來說 $ 較 6 傾鹼基更少的 f 在許多核酸中具有的重覆 -34- (請先閱讀背面之注¾事項再場寫本頁) 本纸張尺度通用中aa家標準（CNS)甲4现格（210 X 297公if ) 81.9.20,000 A6 B6 209248 五、發明説明（从） (請先閲讀背面之注&事項再填寫衣頁) 的機率較高。在包活短的序列的雜交反應中只能保持一點或完全沒有待異性。目前這艏雜交對象序列較佳是具有至少大約3 0籲龄基和多至1〇〇値鹼基的赛核苷酸，或如果是c DNA分子的話其長度甚至可以更大。 4.離子強度：如果培育溶液中的離子強度增加，則重黏合_.(r e,.a η n e a 1 i n g.)比率也會增加。雜交. 髏的熱穩定性也增加。 5 _培育溫度..：最佳的重黏合.（r e,a η n e a_l i n g ).是在大約2 5 -3 0 t的溫庠下進行，此溫度是低 . 於該雙股體的融點（Tm)。如果培育在.較最適宜溫度更低的溫度下面，則參與雜交反應配對的驗基序列會減少。 6 .核酸濃度和培育時間：正常的情況下，加速進行雜交反應的方法是使反應混合物中的可雜交的樣S核酸或雜交對象核酸的濃度過置，通常是過量10 0倍或更大的倍數。 7.變性試劑：破壞氫鍵劑的存在例如是甲醯胺和尿素，可以增加雜交的蔌密性（str i nsency)。 8 .培啻時間：培育時間愈長，則雜交作用更完全。經濟部中央標準居S工消費合作社印51 9.容積排除劑：這些試劑的存在，例如利用聚葡萄糖和聚葡萄糖硫酸酯，可以增加雜交元素的有效的濃度，從而增加雜交的比率。正f的情況是，為雜交作用而選擇的反應溫度和錯誤配對部位結合蛋白質與所形成的雜交匾或抗體結合的反應 -35- 本纸張尺度通用中a西家標準（CNS)甲4現格（210 X 297公货> 81.9.20.000 A6 绶濟部中夹揉準扃0工消费合作社印装 209.48 五、發明説明（功）的溫度是不同的，也和其他結合對象與錯誤配對部位结合蛋白質結合的反應溫度不同。因此，配對錯誤部位結合蛋白質和结合對象試劑結合步驟和標記檢測步驟將在雜交步驟的完成之後進行。反應混合物將溫度調整至由大約3¾ 到大約401C的範圍，然後進行配對錯誤部位結合蛋白質和附加的試劑結合和檢測步驟。可以預期的是，在一値使用RNA雜交對象待別的試驗中，把R N A進行降解作用，使其磷二酯鍵進行鹹性水 ..解作用或以R N A分解酶（R N_a s e s )將其降解。在第一個情況下，水解作用中可以儘量避免使雜交對象暴露在酸鹼值高於大約1 0的條件下。這些物質可以有效地是抑制RNase,例如鈉十二烷基硫酸酯，三羧酸金，核糖苷氣钒基複合物，肝素二乙基焦碩酸鹽和從哺乳動物分離出來的蛋白質類RNa s e抑制劑。配對錯誤部位結合蛋白質可以與雜交對象-目標多核苷酸（DNA-DNA, DNA — RNA 或 RNA— RN A)雜交體结合，並且可以被直接地或間接地檢测（參考第2圖）。藉著直接方式的檢測是採用可檢測的標記標記那配對錯誤部位結合蛋白質。可檢測的標記例如放射性標記，螢光標記，結合酶，或相似的標記物質。這些物質於在下面有比較多的說明。或者，如在上面所述；配對錯誤部位結合蛋白質是從重組DNA技術製備，它是一種融合蛋白質•其中的融合對象是可以容易地被檢測的。重要的 -3 6 - {請先閲讀背面之注&寧項具塡窝表頁) 本紙張尺及適用中因a家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20.000 ύ Α6 Β6 五、發明説明（44) 是，該融合蛋白質，與及一可檢測的標記或偶合性配對錯誤部位結合蛋白質，可以維持天然和未經修飾的配對錯誤部位結合蛋白質的反應性和结合特異性。這種反應性和待異性可以利用一般的技術進行常規测試而確定，舉例來說，藉著本發明所述的試驗。間接的檢測的方法可以採用一種結合對象，這種結合對象對下列物質具有結合特異性：配對錯誤部位結合蛋白質、與配對錯誤部位结合蛋白質偶合反應性部分、與錯誤配對部位結合蛋白質形成融合蛋白質的融合對象。當錯誤 - .r·. 配對部位结合蛋白質是Mu t S的時候，較適合的結合對象是一種抗Mu t S的抗饈或（或其抗原结合Μ段）。對本發明有用的任何一値抗體試劑可以包含抗體片段，多功能抗體凝聚園（aggregates),或一般的任何的物質，其包含一種或多種特異性抗醱結合部位。該抗體可能是任何的免疫球蛋白霣，例如，IgG, Is Μ,及如此類推者。也可以採用任何抗匾的抗原结合片段，舉例來說，Fab >或第F (ab Μ 2片段。除此之外，免疫球蛋白質或其片段的凝聚團，聚合物，衍生物和 i:----------------------装------.ΤΓ------名. <請先1¾¾背面之注念事項存塡窝本贾) ( 經濟部中央標準/ryg工消费合作社印製

得 i 術取 a r 技的ne 的式 om知方 1 ί 習的 c h 過何yc 通任 1 ί 以從〇性可以 Ρ 因得可 ί 基獲白 } 異的蛋源或清球多株血疫 ί 單.抗免株或。的多法法劑的方方試統備備體傳製製抗種清的。為一血體物作如抗抗合例 } } 偶，1 C 81.9.20.000 本紙張又度適用中因西家棵準（CNS〉甲4规格（210 X 297公釐）娌濟邡中央標準居Β工消費合作社印« ^.09-43_ 五、發明説明（此）製備，包括為動行免疫注射適當 ,M u t S蛋白或者，結合。例如，配對錯合。除此之外，。該半抗體基圃 &另外一種結合 i η )或鏈生物 )，其中的配對了生物素。然而種非免疫球蛋白的性質，例如葡 c c a 1 P r t r e p t o c 些蛋白質都是廣的標記或可以是，例如，對抗體抗一配對錯誤部 ,則次级結合對免疫球蛋白的抗位結合蛋白質的 ,擴大訊號的方 A6 B6 物. 例 1如弓鼠. 兔子的免疫原 ( i m m U 質。對象可以是對融合蛋誤部位結合蛋白質可也可以採用對半抗驩是與配對錯誤部位結對象可以是生物素結素結合蛋白 (s t Γ 錯誤部位结合蛋白質在另外一儸實施例中的蛋白質 » 其具有與萄球菌蛋白質A (S 〇 t e η A )或 O C C a 1 P Γ 〇為人知的 0 該结合對間接與可檢測的次级有待異性的次级抗體位結合蛋白質的抗腥象可以是一値己镲記體。在另一値的實施融合蛋白霣對象所産法是利用對該融合蛋 •38- ,天兰鼠或山羊，進 η 〇 g e η ),例如白質有特異性的抗體以與/3 _半乳耱酶结基團有特異性的抗體合蛋白質分子结合的合蛋白質（a ν i d e p t a v i d in 已經i修飾過，加入，結合對象可以是一免疫球蛋白分子结合 taphyloco 鏈球菌蛋白質G (S t e X n G ),這象本身可以是可檢测標記结合的結合對象。因此，如果兔類— 作為第一種結合對象的山羊一抗一兔類_ 例中，由配對錯誤部生的訊號可以被擴大白質的待異性的抗龌 ------------------------裝------tr------線「 <請先閲讀背面之注&事項再填寫本頁) 一本紙張尺度適用t因园家標準（CNS)甲4现格（210 X 297公釐） 81·9·20,000 203^48 A6 B6 五、發明説明（扎）經濟部中央標準居S工消費合作社印製進行反應（例如 9 抗 -0 一半乳糖酶抗醱 ) • 該抗體是具有可檢測標記的〇一般的技術人員能夠使用傳統的方法而不需經過繁複的實驗便可以設計出許多這類適用的第一種和第二種（次级 ) 结合對象 % 統 ) 這傳統的方法是眾所 ica Μ 知的技藝〇在另外 — 個的實施例中，結合對象可以是 Μ U t L 蛋白質 ( G r i 1 1 e y . Μ • e t a 1 • > J • Β ί 〇 1 .. C h e m • 2 6 4 1 0 0 〇 — 1 0 0 4 ( 1 9 8 9 ) \ Μ 0 d r i； C h » P • 1 1 9 8 9 1 · S u P Γ a ； L a h u e e t a 1 • I 1 9 8 9 t S u P Γ a ) 0 垣種 Μ u t L 蛋白質可以從 E • C 〇 1 i I S • t y P h i m U Γ i U m t 或任何其他的來源獲得 » 或其功能性的衍生物 0 較佳的功能性衍生物是融合蛋白質，該融合蛋白質是由 Μ U t L 和可以檢測的第二種融合對象蛋白質 1 例如/3 — 半乳糖酶 0 純化的 Μ U t L 蛋白質具有9 0 k D a 的分子量 t 它可以選擇地在有 A T P 存在的筷件下與 Μ u t S 和核酸異源雙螺旋體的複合物結合〇 Μ u t L 不與含有配對錯誤部位的異源雙螺旋鱷直接地结合，也不會使其釋放出 Μ U t S 〇 Μ U t L 蛋白質已經於細菌中擇 m 出來並進行表達 ( P a η g e t a 1 • > S U P Γ a ) 。因此 > 為了提供本發明使用 • Μ U t L 蛋白質或其功能性衍生物可以在有 A Τ P 存在的條件下參與突變的檢 m 試驗。其中的 Μ U t L 蛋白質或其功能 -39- (請先W請背面之：;1念事項再壜寫本頁) 本纸張又戍通用中a西家標準（CNS)甲4峴格（210 X 297公货） 81.9.20,000 A6 B6 〇9. 娌濟部中央標準爲*®工消費合作社印製五、發明説明（θ) 性衍生物較佳是可以檢測的標記 I 0 然後檢測 Μ u t L 0 或者 9 没有標記的 Μ U t L 可以用作為第 — 値結合對象 i 這種物質可以利用 Μ U t L 結合的有檫記第二種結合對象檢測 t 或先與無標記的第二種結合對象結合再利用有標記第二種結合對象進行檢測 f \ JL. Μ 些方法正如在上面所討論過的〇如在上面所作有關 Μ u t S 結合對象的說明 » 第二種 Μ U t L 結合對象可以是 M u t L 的抗體 .t 對與 Μ U t L 結合半抗原的特異性的抗賸生物素结合蛋白質或生物素 Mr **«P 合蛋白 » 其中生物素晕與 Μ U t L 興 *合在起 9 與 Μ U t L 的融合蛋白質结合對象的抗體 > 和相似的物質〇如在上面描述的第 —>- 種或第二種结合對象是抗體 » 檢測方法是可以利用多種傳統的免疫測定法 ( i m m U η 〇 a S S a y ) 之中的任何一値 9 包括酶免疫测定法 ( Ε I A ) ( V 〇 1 1 e Γ » A • t D D i a g η 〇 S t ί c Η 〇 Γ i Z 〇 η S 2 ： 1 — 7 t 1 9 7 8 » Μ ί c Γ 〇 b i 〇 I 〇 S i C a 1 A S S 〇 C i a t e s Q U a Γ t e Γ 1 y P u b 1 i C a t ί ο η 9 W a 1 k e Γ s V i 1 1 e $ Μ D f V Ο 1 1 e Γ 9 A * e t a 1 • > J • C 1 i η • Ρ a t h o 1 • 3 1 5 0 7 — 5 2 0 ( 1 9 7 8 ) » 美國 R e i s s U e 專利號碼第 3 1 1 0 0 6 » 英國專利策 2 9 0 1 9 9 4 0 8 9 B u t 1 e Γ » J • E * t Μ e t h • E η z y m 〇 1 • 7 3 ♦ • 4 8 2 — 5 2 3 ( 1 9 8 -40- (請先1¾¾背面之注念事項再瑱«本頁) 本纸張尺度適用中SB家標準（CNS>甲4现格（210 X 297公;S ) 81.9.20,000 2〇9^4b A6 B6 經濟部中央摞準居S工消费合作社印製五、發明説明（#) 1 ) » Μ a g S i 〇 1 E • ( e d * ) ， E η Z y m e I m m u Π 〇 a S S a y > C R C P Γ e s S 耋 B 〇 C a R a t 0 η » F L t 1 9 8 0 ) 或放射免疫測定法 ( R I A ) ( W e i η t Γ a U b f B • * P Γ i π c i Ρ 1 e s 0 f R a d i 〇 i m m U π 〇 a S S a y s » S e V e n t h T Γ a i η i η S C 〇 U Γ s e ο η R a d i ο 1 i S a η d A S S a y Τ e c h η i q U e s 9 Τ h e Ε η d o c Γ i η e S o c i e t y » M a Γ c h 1 9 8 6 P Ρ ·· 1 — 5 4 6 — 4 9 a η d 6 8 — 7 8 ) 〇在一値較佳的實施例中 9 M υ t S — 待異性抗驩或抗體片段的標記方法是利用與酶结合 > 並且可以使用於進行 Ε i A ，或酶結合免疫吸附測定法 ( E L I S A ) 0 這種酶於是可以在與酶基質接觸時産生可檢測的化學基画〇這種化學基圃可以利用吸光光譜法螢光光譜法或視覺方法檢測到 0 更佳的是 > 該基質是 — 種生色基質 > 其 > 可以産生 — 種肉眼可見顔色的反應産物 ο 可以用於標記配對錯誤部位結合蛋白質的結合對象 ( 例如 Μ U t S — 恃異性的抗體 ) 的酶包括 ( 卻不受限制於 ) 鹼性磷酸酶 » 辣根過氣化酶 ( h ο Γ S e Γ a d i S h P e Γ 〇 X 1 d a S e ) i 蕕萄糖 — 6 一磷酸鹽脱 Μ 酶 > m 萄球菌核酸酶 ( S t a P h y 1 〇 C 〇 C c a 1 η U C 1 e a S e ) > δ — V 類固醇異構酶 » 酵母醇脱氫 -4 1- (請先閲讀背面之注念事項再填寫本頁) 本纸張又度適用中西S家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20,000 A6 B6 〇9』必 11---------------------裝------ir------專 (諳先閲讀背面之注±事項再填寫衣π> 絰濟部中喪標準居δ工消费合作社印製五、發明説明（η) 酶，α —甘油磷酸脱氫酶，酶，核糖核酸酶，尿素酶（ ,葡萄耱—6—磷酸脱氫酶 myl ase)和乙醯基® 利用具有放射性標記的特異性的抗體，可以檢測到匾的支持物結合，檢測的方。放射性的同位素的檢測可器或放射自顯影技術（a u )。對本發明有用的同位素 .Α 4 C.且較佳的是*2 此外，也可以利用螢光合對象。當把那螢光標記抗的時候，它的存在可以因為所用的螢光標記化合物是螢 e s c e ί η i s ο t h 明（rhodamine) rythrin),藻藍蛋 n ),別藻藍蛋白質（a 1 )* 〇-phtha 1 de orescamine) 〇第一種或第二種結合對是把結合對象與化學發光的三糖磷酸鹽異構酶，天冬醯胺 U Γ e a s e ) > 過氧化氫脚 9 葡糖澱粉酶 ( g 1 u c O a 鹼酵酶〇結合對象 » 例如 » Μ u t S — Μ U t S ο 該 Μ U t s是與固法是放射兔疫測定 ( R I A ) 以利用如 7 計數器或閃爍計數 t 〇 Γ a d; 〇 S Γ a P h y 是 : 3 Η 9 1 3 1 I t 3 5 S 5 I 〇化合物樣記第 — 種或第二種結齷裊露在適當的波長的光線下其發出螢光而被撿測到 ο — 般光素異硫氰酸酯 ( f 1 U Ο r i 〇 C y a η a t e ) t 若丹 t 藻紅蛋白質 ( P h y c Ο e 白質 P h y C 〇 c y a η ί 1 〇 P h y C 〇 C y a n i η h y d e 和螢光素胺 ( f 1 u 象也可以被標記，標記的方法化合物偶合。化學發光的檫記 42- 819,20,000 本紙張又度適用中國因家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） ί ^*· A6 _B6_ 五、發明説明（1^ ) 的抗體是可以利用其在化學反應的過程期間所發出的光而檢测到。持別有用的化學發光標記化合物的例子是胺基苯二醛胼（1 umi no 1)，異胺基苯二醯胼（i so 1 uminol) , theromat i c acridi n i um酯類，咪唑，acr i d i n i um鹽類和草酸鹽酯。同樣地，生物發光（b i ο i umi nescent )性化合物可以用來標記第一種或第二種的結合對象。生 ^物性發光是化學發光法的其中一掴類型，這種化學攀.光現 ♦ :- 象是在生物条統中發現的，其中的反應可以由催化蛋白質加速其化學發光反應的效率。一種生物發光蛋白質的测定方法是藉著檢測其是否可以發光。可以用於標記的生物發光化合物主要是蟲螢光素（1 uc i f er i η)，蟲螢光素酶（1 uc ί ferase)和 aequor in。測試樣品的化驗可以存在於任何的介質中，而且樣品通常具有醫學，獸醫學，環境，營養，或工業上的重要性。人類和動物的樣品和體液可以利用本發明的方法檢測，條件是這些樣品中包含的細胞可以製備出核酸。較佳的來源包括血液，精液，其他的組織，乳液，小便，腦W液，唾液，糞便，肺吸取液，咽喉拭子樣品，生殖道拭子樣品和滲出液，直腸拭子樣品，和鼻咽吸取液。樣品中主要含有雙股的核酸，例如於天然細胞中的D NA。首先可以處理樣品使細胞的核酸釋放出來。這艟過 -43- 木紙張尺·度適用中西西家摞準（CNS〉V 4现格（2U) X 297公釐） il----------------------裝------訂------^ . {揞先閲¾背面之注念事項再填寫本頁) 、經濟邾中央標準爲負工消費合作社印 81.9.20,000 A6 B6 〇9,㈤五、發明説明（Ψ丨） (請先閲請背面之注念事項再填寫本頁) 程可以使用機械性的破壞細胞（例如凍結/融雪解凍，磨蝕，超音波處理），物理性/化學性破壊，例如以清潔劑處理（例如，Tr i ton, Tween,或十二院基硫酸納），渗透性休克（osmot ic shock) ，熱力，或酶解作用（溶菌酶，蛋白酶K ,胃蛋白酶，及其他的酶類）〇依照本發明的方法，釋放出來d sDNA可以利用限 Λ · 制核酸内切酶進行酶解作用，使其為分解成適當的長度的片段，而且這些Η段中包含所需要序列。限制醱的選擇是 . ‘ 二-..... ' ；：... 視乎需要的目標序列和在序列中是否有適當的限制酶識別部位存而定。一般的技術人員可以雜別出這些位置而不需要進行繁複的實驗。參考資料例如是，S amb r ο 〇 k » J · e t a 1 . , supra (如前面所引述 )ο 於進行限制酶酶解作用之後，核酸的失活（變性）作用較佳是把核酸置於沸水中加熱或利用餘處理而完成（舉例來說，所使用的鹸是0. 1N氫氣化納）。那産生出來經濟部中央撑準居R工消費合作社印製的測試介質將包含單股核酸，其能夠於稍後依照本發明的方法檢測出來。本發明也提供一些方法和套件來檢測人類的突變。在表1中（在下面）提供了一部份人類的突變類型，這些突變能夠以本發明的方法撿測出來。參考資料如c 〇〇 p e r * D.N. e t a 1 . , Hum. Gene -4 4 - 本紙張尺度適用肀因西家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81-9.20,000

經濟部中央標準爲W：工消費合作社印製五、發明説明（Ψ2-) t. 8 5 ： 5 5 - 7 4 (1 9 9 0)，這鍤文獻的整體内容於此是作為參考之用。本發明亦是關於一種套件或試劑統，這種条統適用於實施如上面所描述的本發明。這樣的套件將包含試劑組合，而該組合包含依照本發明方法所掲示的試驗。該試劑条統可以提供一種商業化包裝形式，只要在試劑条统中的成分相容，便可以提供組成物或摻和劑。在测試套件中，或 .更典型的是一種測試套件，即是一種包裝好的組合物或一掴或多痼.的容器，装置，+或装有.那些必需的試劑的相I物 ' ' 件，和通常包括為化驗的程序的書面的指示（説明書）。本發明的套件可能包括任何的组成物或裝置，逋些组成物或裝置可以常助進行如本發明的各種試驗。在所有的案例中，試劑条統將包含（1)可以被固定化的或已固定化的雜交對象（如在本發明所描逑的），和 (2)—種配對錯誤部位結合蛋白質或其功能性衍生物。那種配對錯誤部位結合蛋白質可以可菝擇地具有可檢測的標記。該套件中可以選擇地包含第一種结合對象，該结合對象可以與配對錯誤部位结合蛋白質結合，舉例來說，抗 —Mu t S的抗匾，Mu t L蛋白質或其功能性衍生物. 和任何其他的結合對象或可檢测的檫記試劑。本發明的套件中可以另外包括一些輔助性化學物質，輔助的化學物例如是雜交溶液的成分，失活（變性）作用劑，或限制性酶。這些失活作用劑能夠使測試樣品中的雙股核酸轉變為單 -45- (靖先閲¾背面之注念事項再填寫本頁) .裝_ 訂· 本纸張又度適用中西a家標準（CNS)甲4说格（210 X 297公货） 81.9.20.000 五、發明説明（牯） (諳先閲讀背由之注念事項再壜寫本頁) 股形式。這些限制性酶可以使樣品核酸産生片段。本發明所提供的一般性説明，於此是作為參考之用，而且所提供實施例只是作為對本發明的舉例說明，提供實施例並不是有意限制的本發明的範面。

實施例I 對血液樣品檢測突變D N A序列本發明的試驗方式如圖3所示。樣品DNA是從血液細胞取得，並對其测試是否是特別的突變存在。突變部位的龄基對與野生聖不同，差異之處可以是一値或一些齡基對的改變，也可以是增加了或丟失了一値或一些鹾基對。然後把取得DNA進行變性作用，經過處理後便可以進行化驗。 *{濟部中我標準居员工消费合作社印絮測試用DNA雜交對象大約有3 0値核苷酸。該序列的構迪提供與野生型基序列對應的序列，而且該序列是靠近待測試突變部位的序列。做為配對錯誤陽性的對照組，可以利用鐮刀型細胞血红素的基因點突變。産生具有突變序列（exon 10)的寡核苷酸。做為試驗陰性的對照組，已知寡核苷酸序列的野生型序列，即人類血紅素野生型e X ο η 1 0序列的序列。

雜交對象DNA是披固定於硝基纖維過濾膜上，然後進行下列步驟：（a )測試雜交對象D Ν Α被置於” + ” 字符號的垂直筆劃部份。（b)陽性的對照組DNA被置於濂膜上"十”符號的水平線部份。（c)陰性對照組D -46- 81.9.20.000 本纸張尺度適用中四四家榇準（CNS) Ψ 4现格（210 X 297公货）五、發明説明（w) (請先閲筇背面之注&事項再塡寫-4頁) ΝΑ被置於濾膜上是置於”十”符號的附近區域。為了有效固定寡核苷酸和阻塞濾膜上所有未反應位置 ,及避免非特異性的DNA和蛋白質結合作用，可以使用傳統的方法（Sambrook e t a 1 . , s u pr a)預先處理濾膜。樣品DNA的濃度在1 0和之間1 00« g/毫升。雜交反應是在◦. 1-0. 3 M NaCl中和45 — 5 51C下的條件進行•這樣可以産生適當的限制Η段，這些片段可以與前述三種寡核苷酸片段結合。把濾膜清洗和把M u t S加到濾膜上和使其進行結合作用，然後對濾膜再清洗一次。把多株（多源）（Pol yc丨ona 1)兔子抗一 MutS抗體加到濾膜上，使其進行結合作用，和以清洗方式把沒有结合的抗體除去。然後加入辣根過氣化酶-偶合山羊抗一兔子免疫球蛋白抗體是，並使其結合作用進行和以清洗方式把没有结合的抗體除去。經濟部中央標準局員工消費合作社印^ 加入辣根過氣化酶的生色性基質，而且讓生色反應發展，使濾膜出現彩色（或『十』字）符號，此時便可以停止反應。試驗結果如下： A.對於缺乏點突變的DnA (陰性反應）： (1)點（d 〇 t)(陰性對照組雜交對象）並不可見時，表示該試驗的結果並非假陽性。 _ 4 7 - 81.9.20,000 本纸張尺度通用中國3家標準（CNS〉甲4规格（210 X 297公货） A6 Λα c ο 2

6 B 經濟部中央摞準局MR工消費合作社印製五、發明説明（A) (2) 只見有樓線。由於受試者的H b基因是正常的，因此如果陽性對照組寡核苷酸雜交對象具有『突變』序列，反應便會發生。 (3) 濾膜上出現『一』符號表示試驗呈陰性反應，此結果表示樣品中没有檢測到突變D N A。 B .對於具有點突變的D N A樣品（陽性反應）： (1)點（dot)(陰性對照組雜交對象）並不可見時，表示該試驗的结果並非假陽性。 (2 ) R見有十字_線。_—由於H考的H b基因是正常的，因此如果陽性對照組寡核苷酸雜交對象具有『突變』序列，反應便會發生。同時因為樣品中的目標DNA序列具有點突變，垂直線便會出現，與横線一同組成『十』字付號。

實施例I I 利用Mu t L結合對象檢測突變DNA序列本方法大體上與實施例所述的相同。樣品DNA是從血液細胞取得，並對其測試是否是特別的突變存在。突變部位的鹼基對與野生型不同，差異之處可以是一値或一些鹼基對的改變，也可以是增加了或丟失了一傾或一些鹼基對。然後把取得DNA進行變性作用，經過處理後便可以進行化驗。測試用DMA雜交對象大約有3 0値核苷酸。該序列的構造提供與野生型基序列對應的序列，而且該序列是靠 -48" 本纸張尺及適用t國國家標準（CNS) T 4现格（210 X 297么、;S ) 81.9.20.000 --------------II--------裝------.ΤΓ------線(. (請先閲¾背面之注+?事項再項窝本頁) ( 五、發明説明（4) <請先閲讀背面之注±事項再碘寫本頁> 近待測試突薆部位的序列。做為配對偽陽性的對照組，可以利用鐮刀型細胞血紅素的基因點突變。産生具有突變序列（ex〇n 10)的寡核苷酸。做為試驗陰性的對照組，已知寡核苷酸序列的野生型序列，即人類血红素野生型exon 10序列的序列。雜交對象D N A是被固定於硝基潘維過濾膜上，然後進行下列步驟：（a )測試雜交對象D N A被置於”十” 字符號的垂直筆劃部份。（b)陽性的對照组DNA被置於濾膜上”十”符號的水平線部份。（c )陰性對照組D N A被置於濾膜上是置於”十”符號的附近區域。為了有效固定募核苷酸和阻塞瀘膜上所有未反應位置，及避免非持異性的DNA和蛋白質结合作用，可以使用傳統的方法（Sambrook e t a 1 . , s u pra)預先處理濂膜。樣品DNA的濃度在1 0和之間1 00 w g/毫升。雜交反應是在0. 1 — 0. 3 M NaCl中和45 — 5 5 t：下的條件進行，這樣可以産生適當的限制片段，這些片：段可以與前述三種寡核苷酸片段結合。經濟部t央標準局R工消費合作社印¾ 把濾膜清洗和把Mu t L-/S —半乳糖酶融合蛋白質加到濾膜上和使其進行結合作用，然後對濾膜再淸洗一次。把多株（多源）（Po iyc 1 ona 1)兔子抗—M utL_/3 —半乳糖酶抗體加到减膜上，使其進行结合作用，和以清洗方式把没有結合的抗髏除去。 -49- 81.9.20.000 本纸張又度通用中因因家棵準（CNS〉甲4現格（210 X 297公» ) 烴濟部t央標準局S工消費合作社印$ 五、發明説明（β) 然後加入辣根過氣化酶一偶合山羊抗一兔子免疫球蛋白抗髏是，並使其結合作用進行和以清洗方式把没有结合的抗髏除去。加入辣根過氣化酶的生色性基質，而且譲生色反應發展，使濾膜出現彩色（或『十』字）符號，此時便可以停止反應。試驗結果如下： A. 對於缺乏點突變的DNA (陰性反應）： (1 )點.（d o t )(.陰性對照组雜交對象）並不可見時，表示該試驗的结果並非假陽性。 (2) 只見有横線。由於受試者的H 基因是正常的，因此如果陽性對照組寡核苷酸雜交對象具有『突變』序列，反應便會發生。 (3) 濾膜上出現『_』符號表示試驗呈陰性反匾，此结果表示樣品中没有檢測到突變DNA。 B. 對於具有點突變的DNA樣品（陽性反醮）： (1 )點（d 〇 t )(陰性對照組雜交對象）並不可見時，表7F该試驗的結果並非假陽性。 (2)只見有十字線。由於受試者的Hb基因是正常的，因此如果陽性對照組寡核苷酸雜交對象具有『突變』序列，反應便會發生。同時因為樣品中的目標DMA序列具有點突薆，垂直線便會出現，與橫線一同組成『十j字 » 符號。胃 -50- 本纸張A及適用中西四家標準（CNS)甲4现格（210 X 297公釐） 81-9.20.000 ------------------------裝------ΤΓ------線(' {請先閲访背面之注念事項再填窝本頁> ( 2〇92功 A6 2〇92功 A6 娌濟部中央標準>6员工消费合作社印製 _B6_ 五、發明説明（Ιί/)

實施例I I I 對組織樣品檢测突變ρ 5 3癌基因 Ρ53基因大槪是一値腫瘤抑制基因（Lev i ne , A. e t a 1 · . Nature 351:4 53-455 (1991))，其中許多部位如有突變則會牽生腫瘤，尤其是結腸直膈癌。參考資料如Κ ί η z 1 e r , K . W . e t a 1 . , Science 2 51 :1366 - 1370 (1991) ； K e r n , S . E · e t . a 1 . *» 〇 n o g e n e 6:13 ' '- ' .‘： .... .:...

1- 1 3 6 (1 9 9 1) ；VogeIstein, B ,, Nature 34 3.:681 - 682 (199 0) ? Baker, S - J . et al,，Sc ience 2 49 ： 912 — 915 ( 1 9 9 0) 〇採用的人類DNA是從腫瘤組織分雞出來的。這種分離的DNA在標準的情況之下利用擠壓使其斷裂成Η段。這樣，D Ν Α可以經過變性失活後進行化驗。與P 5 3基因對應的c DNA分子可以利用標準的方法（Sambrook et a 1 · > supra) 産生和將其用作為雜交對象。具有突變的區域可能在整傾 ρ 5 3序列分佈。雜交對象DNA被固定在硝基继維過濾膜上，實驗程序如下（看見第3圖）： (a)測試雜交對象（p53 cDNA)被『點』 -5 1- 本纸張又度適用中國因家榇準（CNS) >F 4规格（210 X 297公货） 81.9.20.000 ------------------------装------tr------線( (請先閲访背面之注&事項再填寫本頁) 『 A6 B6

Qd'^0 五、發明説明（θ) (S P 〇 t t e d)於濾膜上，形成一條垂直線的形狀。 (b) 陽性的對照組DNA是被固定在濾膜上，並使其形成一條水平橫線。 (c) 把陰性對照组DNA置於濾膜上，並使其成為『十』字符號附近的一點。那些濾膜經處理後可以用於.固定雜交對象的聚-或寡一核苷酸，同時為了要阻塞濾膜全部未反應部位以避免在化驗期間發生非特異性DNA和蛋白質的結合作用。把樣品D N. A .加入和並_讓反應在雜交條件之下進行。反應條件如在上面所述，其中不同的是雜交溫度是55 一 6 01C,所産生的適當DNAH段是與該三锢雜交對象聚~或寡核苷酸结合。把濾膜清洗，並把MutS置於濾膜上，進行结合作用，和再一次清洗洗濾膜。把多株（多源）（Po 1 yc 1 ona 1)兔子抗一 MutS抗體加在濾膜上，使結合作用發生，和洗脱没有結合的抗體。然後加入辣根過氧化酶一偶合山羊抗兔子免疫球蛋白抗體，進行結合作用，和洗脱没有結合的抗體。把辣根過氣化酶的生色性（chromogen ί c )基質因加入，而且該産生顔色的反應發展，直至濾膜上出現『一 j或『+ J符號，此時便可以停止反應。試驗結果如下： -5 2- 本纸張尺度通用中S因家標準（CNS〉甲4现格（210 X 297公货）装------.订------線『 (請先閲¾背面之注*寧項存填窝木頁) 一經濟邾中央標準局R工消费合作社印製 81.9.20,000 經濟部中央標準局負工消費合作社印« A6 B6 五、發明説明（h) A. 對於缺乏突變p53癌基因的樣品（陰性反應） (1) 點（dot)(陰性對照組雜交對象）並不可見時，表示該試驗的結果並非假陽性。 (2) 只見有橫線。由於受試者的並沒有突變基因，因此如果陽性對照組寡核苷酸雜交對象具有『突變』序列，反應便會發生。 (3) 濾膜上出現『一』符號表示試驗呈陰性反應，此結果表示樣品中没有檢測到突變D N A。 B. 對於具有突變p53癌基因的樣品（陽性反應） (1) 點（dot)(陰性對照组雜交對象）並不可見時，表示該試驗的結果並非假陽性。 (2) 只見有十字線。由於假設受試者基因是正常的，因此如果陽性對照組寡核苷酸雜交對象具有『突變』序列，反應便會發生。同時因為樣品中的目標DNA序列至少具有一個點突變，垂直線便會出現，與横線一同組成『十』字符號。

實施例I V 突變p 5 3癌基因表達作用的檢測利用傳統的方法從腫瘤的組織中分離出人類的m R N A (參考：Sambrook e t a 1 · » sup

r a)。利用檫準的方法製備與P 5 3基因對應的cDN -5 3- 本纸張尺度適用中西因家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公货〉 81.9.20,000 -裝------.Tr------身 (請先閲讀背面之注念事項再螬寫本頁) 一 A6 B6 娌濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（e) A 分子（Sambrook e t a 1 . , supr a),並將此cDNA分子用作雜交對象。試驗的方式如圔3所示。雜交對象DNA是被固定於硝基鑷維過濾膜上，然後進行下列步驟：（a )測試雜交對象D N A被置於”十” 字符號的1直筆劃部份。（b )陽性的_照組D n A包含與腫廇組織中表達的基因對應，把這種DNA固定於濾膜上”十”符號的水平線部份。（c )陰性對照组D N A , :其每含有用於陽性_對照組的裏核，苦酸的野生型序列_把該二 ... -- · ： · . . » * ......-w-— * . ,. .· · - ·...·» 义. · - D N A置於濾膜上是置於”十”符號的附ί區域，為了有效固定寡核苷酸和咀塞濾膜上所有未反應位置，及避免非特異性的DNA和蛋白質结合作用，可以使用傳統的方法（Sambrook e t a 1 . , s u pra)預先處理濾膜。樣品DNA的濃度在1 0和之間1 0 0 μ g/毫升。雜交反應是在0. 1 — 0. 3 M NaCl中和45 — 55¾下的條件進行，這樣可以産生適當的限制片段，這些片段可以與前述三種雜交對象聚-或寡一核苷酸片段結合。把濾膜淸洗和把Mu t S加到濾膜上和使其進行结合作用，然後對濾膜再淸洗一次。把多株（多源）（P〇l yc 1 ona丨）兔子抗—MutS抗體加到澈膜上，使其進行結合作用，和以清洗方式把没有結合的抗體除去。 -5 4 _ -----------------；-------装-------玎------線( (請先«访背面之注+?事項再壜窝本頁) 一本纸張尺度適用ta西家標準（CNS>甲4现格（210 X 297公釐） 81.9.20.000 209^48 A6 B6 _ 五、發明説明（b) 然後加入辣根過氣化酶-偶合山羊抗-兔子免疫球蛋白抗體是，並使其結合作用進行和以清洗方式把沒有結合的抗髏除去。加入辣根過氣化酶的生色性基質，而且讓生色反應發展，使濾膜出現彩色（或『十』字）符號，此時便可以停止反應。試驗結果如下： A. 對於能夠表逹野生型p 5 3基因的樣品（陰性反 m)： ·. _ - - __ (1) 點（dot)(陰性對照組雜交對象）並不可見時，表示該試驗的結果並非假陽性。 (2) 只見有横線。由於假設受試者的基因是野生型的，因此如果濾膜上出現『一』符號，表示試驗呈陰性，卽樣品mRNA中¾有『突變』的p53癌基因。 B. 對於能夠表逢突變型p 53基因的樣品（陽性反應）·· (1) 點（dot)(陰性對照組雜交對象）並不可見時，表示該試驗的結果並非假陽性。 (2) 只見有十字線。由於假設受試者的基因是沒有突變序列（與陽性對照組DNA互補的序列），因此如果陽性對照組寡核苷酸雜交對象具有『突變』序列，反應便會發生。同時因為樣品中的目標DNA序列具有點突變，垂直線便會出現，與橫線一同組成『十』字符號。 -55- 本纸張又度適用t因困家櫺準（CNS〉甲4规格（210 X 297公;S ) 81.9.20.000 ------------------------裝------.ΤΓ------1 (諳先閱請背面之;±δ事項再項寫本頁) ( is濟部中央榡準局ΜΚ工消費合作·社印 20^43 A6 B6

五、發明説明（〇) 實施例V 經濟部中央標準局員工消費合作社印焚利用 Μ U t S 蛋白質檢測配對錯誤部位材料和方法細胞 = 利用引入 m U t S 表達質粒 P Μ S 3 1 2 轉化製備可以大量生産 m u t S 的細胞 9 細胞量為 1 • 2 L ( 1 a m b d a C I 8 5 7 个 Δ Η k 1 1 - ) ( S U a η d Μ 〇 d Γ i c h ， P Γ 〇 C * N a t • A c a d * S C 1 • U S A • 8 3 * 5 0 5 7 » 1 9 8 6 ) 0 - m u t S 的纯化： m u t S 的純化方法是改良白 S U a η d Μ 〇 d r i c h • P Γ 〇 C • N a t * A c a d • S C i ·' U S A • 8 3 5 〇 5 7 t 1 9 8 6 ) Q 把 1 • 2 L ( P Μ S 3 1 2 ) 細胞培養生長於 3 0 1C 8 L 的 8 6 9 培養液中 ( 1 0 g / 1 B a C t o — T r y P t ο n e ( D i f C 〇 ) * 5 g / 1 酵母萃取物 ( D i f c o ) f 5 g / 1 N a C 1 ) > 並含有 5 0 u g / m 1 的氨苄青徽素 ( a m P ί C i 1 1 ί η ) o 培養過程直至細胞培養液於 0 • D * 5 9 ο 達 1 • 3 1 • 8 的數值為止 Ο 把培養物以 8 6 9 培養液稀樺 ( 1 ： 2 ) i 該培養液是曾於 6 〇下預埶〇然後把細胞培 3CS； m 於 4 2 t：下 > 為時 5 小時 0 把培養物冷凍 9 利用離心方法收集細胞 1 並把細胞離心沈降物貯存於 — 7 0 下 0 把細胞離心沈降物 ( 1 5 一 2 9 克 ) 於冰上解凍 1 並把細 -56- {請先閲讀背面之注念事項再填寫本頁) 本纸張又Λ適用中國西家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20,000 A6 B6 209^48 五、發明説明（押） (請先閲访背面之注+?事項再填寫參頁) 胞再懸浮於相等體積的缓衝液A ( 2 0 m Μ Κ Ρ Ο 4 ,

ρ Η 7 . 4 . 1 m Μ EDTA, 1 m Μ PMSF , 1 〇 m Μ 2 —魏基乙醇）。利用超音波方法把細胞於一値冰一丙酮浴中分解。把細胞分解物離心分離（4〇 ,〇〇〇 g； 3◦分鐘）。把上清液以1/4體積的 2 5 % ( w / v )硫酸鍵徽素的緩衝劑A溶液處理，並於 4亡下81拌4 5分鐘。在15分鐘的時間内，加人硫酸錄! (0 . 2 g / m I的上清液），並且把懸浮液於4 t下進 -步規拌4 0分鐘。利用離心.方法（4 〇 . .〇〇 ◦ g , 3 0分鐘）收集沈降物。並且將該沈降物再懸浮於 1的缓衝液A中。將lml的懸浮液以含有〇. 025M KC1 的缓衝液 B ( 2 0 m Μ Κ Ρ Ο 4 . Ρ Η 7 . 4 , 0 . 1 m Μ EDTA. 1 m Μ PMSF, 1

0 m Μ 2 —頸基乙醇）。稀釋.比例為1 : 1〇。把稀釋液立即投樣至1. 5x30cm肝素一 Separos e CL6B (Pharmac i a)層析柱，並以 2m 1/m i n的流速進行層析分析。該層析柱是利用300 ml直線KC1梯度（0. 1—0. 5M)的缓衝液B 經濟部中央標準岛S工消费合作社印« 作為洗脱液。收集1 00傾3m 1洗脱部份。把樣品置於 4一20%SDS—PAGE凝膠中進行電泳分析。該凝 _電泳是在具有還原性的條件下進行。把含有>9 5%m ut S蛋白質（97 k D a )部份合併。於合併部份加入甘油，使最终濃度達到20%,並且貯存在下 -5 7 - 本纸張又度適用中因西家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20,000

A6 B6 五、發明説明（代）〇寡核苷酸：採用的寡核苷酸是從Β ί ο P 〇丨yme r L a b s取得。'寡核苷酸的序列是按照人類/3 —珠蛋白基因中的鐮刀形細胞突變部位及周圍的3 0健驗基匾域而製備。為了使募核苷酸可以固定於硝基纖維素濾膜上，該寡核梦轉必.須具有5/聚C.尾部（共25痼C),而且 5 z端也有胺基的修飾物。用於本實驗的序列可參考表2 。（注意：真正的鐮刀形细胞突變是A :T — T: A顛換 (...Λ ..r .a .n:.s.,::y .:._.βΛ.Γ .. _s_i ..o.，n ).。使寡...核聲.酸進行黏合作. 用（anneal ins)，使其産生 G:T, A:C, 和G : G等不同的配對錯誤的組合。邸産生一個雙股饈，其中中有一傾不配對的鹺基（例如可以利用野生型序列的寡核苷酸與具有增加或丢失單一鹹基的突變的寡核苷酸進行黏合作用）。而且産生有兩値不同的同源雙股髏，即可以完美配對互補的雙股體。至於黏合作用的反應條件所逑。抗一mutS抗體：多克隆（ρο 1 yc 1 〇na 1 )抗一 mu t S抗髏是從兔子血清中製備出來的。該鬼子是 New Zealand White (Pel Fr e e z)種，它經過注射純化mu t S蛋白質而産生該蛋白質的抗匾。抗體的純化步驟是利用蛋白質G — S e P h arose (Pharmac ί a)柱層析分析法進行的。於點漬法分析（dot blot analysis -58- 本纸張尺Λ適用中國园家標準（CNS)甲4現格（210 X 297公货） ——.---------------------裝------#------線{ (請先閲¾背面之注¾事項再增寫本頁) 一經濟部中央標準扃KK工消費合作社印¾ 81.9.20,000 五、發明説明（4) <請先閲請背面之注&事項再填寫本頁) )中，檢测lng純化mutS蛋白質只需要l〇wg/ 结果於丨容液中黏合之異源雙股體配對錯誤部位的檢測圖4所示的结果顯示含有g:T和G:C的異源雙股體是可以被mu t S蛋白質所檢测到。檢測的效率是視乎 mu tS，而且可以分辨異源雙股體（不是同源雙股鱧）的D N A。對於a : C配對錯誤和含有一個未配對驗基的 -異源雙股髏,也可以得到相同的结果。 . 固定化寡核苷酸的黏合『加尾』的寡核苷酸可以披點漬於濾膜上，並且該具有3 0痼核苷酸的聚合物可以進行黏合。它的結果（如圖 5)與那些在溶液中進行黏合的異源雙股體的結果（圖4 )相同。但不能夠檢測到同源雙股體（由一艟具有30値核苷酸的聚合物與另一値完全互補的具有3 0個核苷酸的聚合物所形成的）。經濟部中央標準局WK工消費合作社印焚在有競爭性寡核苷酸存在的條件下進行黏合同源雙股護是由黏合互補的3 ◦合物（30mers )製備而成。然後加入『加尾』的寡核苷酸，再把同源雙鏈髏進行變性作.用（使其失活），並把混合物重新黏合。把樣品點漬於濾膜上。如圖6所示，G:T配對錯誤可以在這些條件下披檢測到，表示該『加尾』的寡核苷酸可以有效的『30合物』競爭與該互補的寡核苷酸結合。這樣 -59- 81.9.20,000 本纸張尺度適用中a园家標準（CNS>甲4现格（210 κ 297公货）經濟部中央標準总^:工消费合作社印製少, __ 五、發明説明（州）的條件可以用於突變檢測試驗中。在這種試驗中，樣品D NA可以被限制性酶切割（基因組DNA),或利用PC R反應製備。不管在述那個情況中，DNA是雙股的，因此其所含的序列相同，而且能夠在用作探針時與『加尾』的寡核苷酸競争。圖4的结果是從下列實驗中取得的。異源雙股體和同源雙股體是利用相等數量的寡核苷酸 .製備而成的。由於『加尾』寡核苷酸的長度是55個驗基幾乎是3 0合物的2倍長度，因此.『加尾』寡核苷酸較容易形成雙股。5Wg (於50wl中）的各種寡核苷酸置於 TNE(l〇mM Tris, ρ Η 8 . 0 , 0 .1 Μ Ν a C 1 , 1 m Μ EDTA)混合，加熱至 7〇1〇,為時10分鐘.冷卻至室溫，為時30分鐘，然後將其置於冰上冷凍。把已黏合的分子（1 /is於2W 1 中）點漬於濾膜上，作為陽性對照組，邸第一级（抗一 m u t S)和第二级抗體及鹾性磷酸酶。把濂膜於空氣中乾燥.並轉移至6孔洞的組織培養板（Fa 1 con)上，每艏孔洞中載有2m 1的反應缓衝液（20 mM T r i s . pH 7.0， O.OlmM EDTA, 0. 5 m Μ M g C 1 2 , O.OlmM DTT) + 3 % (w/v)脱脂乾燥奶粉，並於4¾下輕微搖動培育過夜。利用冰冷的反應缓衝液（4 X 2 m 1 )把濾膜清洗，並於下與單股結合蛋白質（prornega)溶液（ -6 0- 本纸张尺度適用肀因园家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公货） 81*9.20,000 • I:------------Μ---------裝------tr------Μ (請先閲¾背面之注&事項再塡寫本頁) ( A6 < :久

-S B6 經濟部中央標準居負工消费合作社印製五、發明説明（J) lml, l〇0Wg/ml·於反應缓衝液中）培育30 分鐘。利用冰冷的反應缓衝液（4 X 2 m 1 )把濾膜清洗，並與以下物質於4=下培育30分鐘：（i) 1ml的反鼷缓衝液，（i i)1ml反應缓衝液+l〇wg/ml mut.. S.或（.i i i) lm.丨反應缓衝液 +10tfg/ ml m u t S + lwg/ml同源雙股體或異源雙鐽髏3 0合物，其是如在上述的條件下進行黏合作用。利用冰冷的反應缓衝液(4 X 2 ra〖）把濾膜淸洗，並與抗一mutS抗體（2ml於50wg/ml於反應緩衝液+ 3 %脱脂奶粉）於4 t下培育2小時。利用冰冷的反應緩衝液（4x2ml)把濾膜清洗，並與2ml的 1 : 100 ◦和山羊抗一兔子IgG —鹼性磷酸酶（Bi 〇 — Rad)偶合物的稀釋物（於反應缓衝液+3%脱脂奶粉）於4TC下培育1小時。利用冰冷的反應缓衝液（4 X 2 m 1 )把濾膜清洗，並與2 m 1新鮮的反應缓衝液（ 1 0 0 m M Tris. ρ Η 9 . 5 , 1 0 0 m Μ N a C 1 , 5 m Μ M g C 1 2 , 0 . 1 6 5 m g / m 1磷酸溴氛吲跺（從於二甲基甲醯胺中的貯存濃縮液稀釋1 : 100) ,0.33 mg/ml硝基藍四唑（從於二甲基甲醛胺中的貯存濃縮液稀釋1:100))於室溫下培育1 0 — 20分鐘。然後利用水把濾膜清洗數次以中止反應。 -6 1 - 木纸张尺度適用中因园家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 —:---.-------------------装------ir------線一 (請先閲-4背面之注ft事項再項寫本頁) 一

五、發明説明（θ) 經濟部中央撑準曷員工消費合作社印« 於圖5所示的結果是由以下所述的實驗中取得：把1 w g ( 2 u )的『加尾』寡核苷酸點漬到硝基纖維素濾膜上。這些濾膜是在空氣中乾燥，並轉移至6孔洞培養板中，每値孔洞載有2xnl的TNE。加入2wg ( I)的30合物寡核苷酸。把培養板浮於70t的水浴上，為時10分鐘，然後再置於空溫下培育30分鐘，最後置於冰上。然後，利用上逑取得如圔4結果的方法處理這些濾膜。邏6的结果是從下述的實驗中取得的。 .一 . -- 把相等數量的『30合物』進行黏合，其步驟如圖4 説明所述。加入相等數目的『加尾』寡核苷酸，並把混合物加熱至85t,為時10分鐘，再於置室溫下30分鐘。其餘的後缅步驟與圖4的有關說明相同。需要指出的是，為了提高黏合作用的效率，recA 蛋白質可以用來代替單股DNA結合蛋白質。與實施例相當的方法由於前面己對本發明的内容充份說明，一般精於此》的人士己能按照説明加以實施，卽使他們按需要改變相當的條件參數，例如濃度、和不違背本發明精神和範圍的條件下也可以實施本發明，而無需事前進行繁複的試驗。雖然本發明是與其實施例有關，但上述的實施例所提供的條件是可以改變的。只要在不違背本發明精神和範圜的條件下，任何本發明的方法和用途等皆可以根據習用的 -62- 本纸張尺度通中aa家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公;s ) 81.9.20.000 装-------ΤΓ------多 (請先《讀背面之注+?事項存增寫*.頁) 一_ 五、發明説明措施加以改變 S((

C G Α6 Β6

序列資料 E Q ID N 0 : 1 i )序列持戡： A)長度：35値鹾基對 B )類型：核酸 C)雙股或單股：單股 D )形狀：直線 i i )分子類型：D N A … ί丨丨）序列説明： CCCCGCACC TGACTCCTGG GAGAAGTCT GCCGT {請先閲請背面之注+?事項再項寫本頁) r •I裝· 訂. 經濟部中央標準局δ工消費合作社印31

S E Q ID Ν Ο ： 2 (i )序列特戲： (A)長度：35値鹸基對 (B )類型：核酸 (C )雙股或單股：單股 (D )形狀：直線 (i丨）分子類型：DNA (i i i )序列說明： CCCCCGCACC TGACTCCTGA GGAGAAGTCT GCCGT -63 本纸張尺度適用申國a家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 81.9.20,000 .崠r. ^6 A6 B6 五、發明説明（fe丨）， s E Q ID N 0 ： 3 (i )序列持歡： (A )長度：30値鹸基對 (B )類型：核酸 (C)雙股或單股：單股 (D )形狀：直線

(i i)分子類型：DNA (i i i )序列說明：

CGTGGACT G A G G AG T G C T C T

TCAGACGGCA S E Q ID N 0 ： 4 (i )序列持歡： (A)長度：30値鹺基對 (B )類型：核酸 (C)雙股或單股：單股 (D )形狀：直線

(i i)分子類S:DNA (i i i )序列說明：

CGTGGACTGA GGACGCCTCT TCAGACGGCA -6 4 - 木纸張又度適用中國西家標準（CNS)甲4现格（210 X 297公货> (請先閲¾背面之注A事項再填寫本頁) •裝. 訂· 經濟部中央標準局負工消费合作社印¾ 81.9.20,000

A6 B6_ 五、發明説明（ S E Q. ID N Ο ： 5 (i )序列待歡： (A)長度：30値齡基對 (B )類型：核酸 (C )雙股或單股：單股 (D )形狀：直線 (ii)分子類型：DNA (i : i i )序列説明：

CGTGGACTGA GGACCCCTCT TCAGACGGCA S E Q ID N 0 ： 6 (ί )序列特戡： (A )長度：31個齡基對 (B )類型：核酸 (C )雙股或箪股：單股 (D )形狀：直線 (i i)分子類型：DNA (i i ί )序列說明：

CGTGGACTGA GGACCCCCTC TTCAGACGGC A -65- 木纸張又度適用中a困家標準（CNS) r 4规格（210 X 297公釐） ——'---------------------裝------ir------線！ i <請先閲讀背面之注¾事項再填寫本頁) f 經濟部中央標準居员工消贽合作社印¾ 81.9.20.000 ·54· m^-2 . 寡核苷酸序列- 1) *ccc. . .CCGCACCTGACTCCTGGGGAGAAGTCTGCCGT 突變種 2) *ccc …ccGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGT 野生型 .5 3) CGTGSACTGAGGACTCCTCTTCAGACSGCA 野生型 4) 5) C0TGSACTGAGGACGCCTCTTCAGACGGCA 突變種 _ » -- — - ::…. ' - , / . CGTGGACTGAGGACCCCTCTTCAGACGGCA 突變秦 ‘ - —" f 'Ttr -Jr ΤΙ* —iCGTGiSACIGAiSSACCe.CCrCTTCAGACGGCA 突變種 _. (驗基） 10 * -5^胺基修飾物 1 -亦製備無聚C尾端和5 \胺基修鈽物的寡核管酸表2的說明寡核苷辣黏合作用序列ID編號. • . - 15 1 + 3 » » G:T配對鍺誤 1) SEQ工D #工 1 + 4 5 ==G:G配對錯誤 2) SEQ ID 1 + 5.= 词源鼙股渣. 3) -----SEQ ·Ι3〇Ί 1 + 6 * -.增加./-丢失異原雙股體_ . 4) •SEQ ID #4 2 + 3 = =同i聲股遵 5) SEQ ID #5 20 2 + 5 = =A:C配對錯誤 δ) SSQ ID #6

Claims

Λ7 公告衣^ Ε7 經濟部中央揉準肩工消費合作社印製六、申請專利範® 1 . 一種檢測一樣本中單股目標聚核苷酸突變的方法，此方法包括： (a)把樣品與單股聚核苷酸雜交對象培育，其中的單股聚核苷酸雜交對象是含有最少一摘單股鹸基序列，此單股齡基序列是與目標聚核苷酸的非突變序列互補，培育的條件是適合讓雜交對象與樣品中的任何己突變或非突變的目標聚核苷酸進行雜交而成為一傾雜合體； (b )把逭艏於（a )步思中形成的雜合體與能與一具一配對錯誤鹼基對或微量增或減性質突變的聚核苷酸結合之配對錯誤部位结合蛋白質接觸；並且 (c )藉由直接或間接偵測錯誤部位結合蛋白質，檢測配對錯誤部位結合蛋白質是否存在於上述的雜合體上，由這些測定是否有配對錯誤部位結合蛋白質存在而頚示搛品中的聚核苷酸的序列是否有突變存在。 2. 如申謓專利範圍第1項的方法，其中的聚核苷酸雜交對象是DNA。 3. 如申請專利範圍第2項的方法，其中的DNA 雜交對象是c DNA。 4. 如申請專利範圍第1項的方法，其中的目榡聚核苷酸是D N A。 5. 如申請專利範圃第1項的方法，其中的配對錯誤部位結合蛋白質是Mu t S蛋白質或其功能性衍生物。 6. 如申謓專利範圍第1項的方法，其中的樣品是 (請先閱讀背面之注意事項再場寫本頁)> 丨裝. 訂· -/· 本纸張尺度適用t國园家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） d A7 B7 C7 D7 六、申請專利範固經濟部中央標準局SX消#合作杜印製中核。苷用支測结第性測夠 .1 對否第其放用丨核作體檢該的異檢能 b 合是的出釋作丨聚的固的，中特的 -ί 結象中。放的解的化的中入。其有中象象種對其體釋中酶中定中其加的，質其對對一合，抗下其的其固其 -象合法白，合合第結法的件，酶，且，法對結方蛋法結結與種方性條法酸法而- 法方合質的合方種種夠二的異的方核方，方:的結白項结的一一能第項持當的切的上的項種蛋 ο 位項第第和測 2 有適項内項物項 1 一合 1 部 1 的的-檢 1 象在 6 性 1 持 8 第第结第誤第記合 }且第對以。第制第支第圍的位圍錯圍標结 Γ 並圍合可活圍限圍體。圔範記部範對範剷質 e, 範結品失範行範固行範利標誤利配利檢白η象利種樣性利進利於進利。專測錯專對專可蛋 t 對專一該變專前專定前專膜諳檢對請種諳有合 Γ 合請第 , 之請之請固之請素申可配申一申具結 a 結申對體將申用申被 }申維.如有與如是如不位 P 種如是液並如作如是 a 如纖具夠象入部二象或酸性象 ί 基 ·把能 .對 ·加誤 S 第 .對品核 .變 .對驟 .硝0括是 1 合。2括錯£:的 3 合樣的 7 在 8 交步 9 是 1 包象 1 結體 1 包對 .1 合。1 结物含是雜在物驟對種抗驟配 d 結在種生所酸酸是持步合一的步與 η 象存二本纸張尺度適用中因國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货〉 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 43 A7 37 C7 D7 六、申請專利範面 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 14. 如申請專利範圍第12項的方法，其中的第二種結合對象是Mu t L蛋白質或其功能性衍生物。 15. 如申請專利範圍第14項的方法，其中的第二種結合對象是融合蛋白質，其是由Mu t L和第二種可以被檢測的蛋白質或肽類所組成的。 16. 如申請專利範圍第15項的方法，其中的第二種蛋白質是/3 —半乳糖蕗。 17. 如申請專利範圍笫1項的方法，其中步驟（ b )的配對錯誤部位结合蛋白質是融合蛋白質，其可以與第二種可以被檢測的蛋白質或肽類融合的。 18. 如申請專利範圍第17項的方法，其中的檢測步驟包括加入第二種结合對象，該結合對象能夠與苐二種蛋白質或肽類结合i並且檢測第二種結合對象是否存在 0 19. 如申請專利範圍第18項的方法，其中的第二種蛋白質是卢一半乳糖酶。經濟部中央標準局R工消f合作社印製 2 0 . 如申請專利範圍第17項的方法，其中第二種蛋白質是一種可以催化生色反應的酶，這種酶是可以利用生色基質産生顔色反應産物，並且檢测反應包括提供這種生色基質，和把顔色反應産物顯色。 2 1. —種撿測一樣本中單股目檫哺乳類聚核苷酸突變的方法，此方法包括： (a)把樣.品與單股聚核苷酸雜交對象培育，其中的本纸張尺度適用中因國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）六、申請專利範圓 A7 B7 C7 D7 此補 , 互列列序序基變鹼突股非 »勺 AHH 儲酸 1 苷少核最聚有類含乳是哺象標對目交與雜是酸列苷序核基聚鹼股股單單或髏變合突雜己値何一任為的成中而品交 £< ,/£ 樣雜與行象進對酸交苷雜核讓聚合類適乳是晡件標條目的的育變培突 , 非 1 酸與苷能核與聚匾之合變雜突且的質並成性；形減觸中或接驟增質步之白 } 量蛋 a 微合 ί 或结於對位個基部這鹼誤把誤錯 } 錯對 b 對配 ^^配之一合具結檢 -, 上質體白合 E 隹 S 菊合的結述位上部於誤在錯存測否偵是接質間白或蛋接合直结由位藉部 }誤 C 錯 ί 對配測顯而在〇存在質存白變蛋突合有結否位是部列誤序錯的對酸配苷有核否聚是類定乳測哺些的這中由品 clK 0 示套件 S 套變此突，酸列苷序核變聚突檫非目酸股苷單核测聚檢標於目用股適單種自一來是 • 變 2 突 2 該件於載以可 a 酸苷 : 核括聚包股件單套有該含 , 中中其器，容器値容多傾或一個第 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •-裝- 訂- 經濟部中央標準屬員工消費合作社印製的酸苷核少聚最標有目含與是是象列對序交基雜驗酸股苷單核此聚，股列單序該基，鹼象股對單交個雜 1 白 i 5 合結位部誤，錯對配有含中其器容 • 1 傾補二互第列 } 序 b 變ί 突非且並質錯對配測檢有含中其器容個多或器容値三第 \1/ C 本纸張又度適用t國因家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公«·) 經濟部t央樑準馬W工消費合作社印製 Α7 Β7 C7 D7 六、申請專利範園誤部位结合蛋白質與雜合體结合的試劑或多種試劑。 23. 如申請專利範圍第22項的套件，其中的配對錯誤部位結合蛋白質是Mu t S或其功能性衍生物。 24. 如申請專利範面第22項的套件，其中的試劑或多種試劑包括至少有第一種结合對象，此種結合對象是能夠與配對錯誤部位結合蛋白質結合的。 25. 如申諳專利範圍第24項的套件，其中的第 —種結合對象是對配對錯誤部位结合蛋白質有持異性的抗鱧。 2 6 . 如申請專利範圍第22項的套件，其中的試劑或多種試劑包括至少有第一種結合對象和第二種結合對象.第^種结合對象是沒有可檢測標記的，第一種结合對象是能夠與配對錯誤部位结合蛋白質結合，並且第二種结合對象能夠與第一種结合對象結合。 27. 如申請專利範画第26項的套件，其中的第二種結合對象是對第一種結合對象有持異性的抗體。 28. 如申請專利範園第26項的套件，其中的第一種結合對象是Mu t L蛋白質或其功能性衍生物s 29. 如申請專利範圍第28項的套件，其中的第 —種結合對象是融合蛋白，此融合蛋白是由Mu t L和可以被檢測的第二種蛋白質或.肽類融合而成。 30. 如申請專利範圍第29項的套件，其中的第二種蛋白質是>3 —半乳糖酶。 ~ 5 ' 本纸張尺度適用中國园家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） {請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) i裝· 訂.

A7 B7 C7 D7 六、申請專利範® 第物的生中衍其性 , 能件功套其的或項質 9 白 2 蛋第 L 圍 t 範 U 利M 專與請夠申能如是象 . 對 1 合 3 結種二合結 2 3 雜的中其件套的項 2 2 第圍範利專請串如固的中其件套的項 ο 1 . 上 3 之第物圍持範支利體專固請於申定如固被 · 是 3 象 3 對交配的中其件套的項 2 2 第圍 ο 範膜利素專維請讖申基如硝是 · 物 4 持 3 支體酶 I1—H 種一 / 與. 以〇可質它基 , 色白生蛋的合酶融種種該一括是包質劑白試蛋的合中结·其位且部而誤，錯合對融 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂. 經濟部中央標準局工消费合作社印製本纸張尺度適用t國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）