DE69218776T2

DE69218776T2 - Verfahren zum nachweis von mutationen

Info

Publication number: DE69218776T2
Application number: DE69218776T
Authority: DE
Inventors: Miroslav Radman; Robert Wagner
Original assignee: Upstate USA Inc
Current assignee: Valigene Corp New York Ny Us
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1992-07-17
Publication date: 1997-11-27
Anticipated expiration: 2012-07-18
Also published as: ZA925427B; DE69218776D1; NZ243615A; CA2113716A1; EP0596028A1; AU2415992A; IE922355A1; IL102550A0; ATE151114T1; TW209248B; JPH07500493A; WO1993002216A1; AU664381B2; EP0596028B1; IL102550A

Description

Beschreibung des Hintergrunds

Assays, die zur Detektion des Vorhandenseins eines bestimmten Nucleinsäure-Moleküls in einer Probe in der Lage sind, sind für Vorhersage und Diagnostik von Krankheiten, forensische Medizin, Epidemiologie und Öffentliche Gesundheitspflege von wesentlicher Bedeutung. Solche Assays können beispielsweise zur Detektion des Vorhandenseins eines mutierten Gens bei einem Lebewesen eingesetzt und dadurch die Wahrscheinlichkeit bestimmt werden, mit der das Lebewesen an einer genetischen Krankheit leidet. Die Detektierbarkeit einer Mutation ist für die Früherkennung einer Krebserkrankung oder die Feststellung einer Anfälligkeit für eine Krebserkrankung mit der Entdeckung zunehmend wichtig geworden, daß einzelne Mutationen in zellulären Onkogenen zur Aktivierung des jeweiligen Onkogens führen können und dadurch die Umwandlung dieser Zelle in eine Krebszelle herbeiführen (Nishimura, S. et al., Biochem. J. 243:313-327 (1987); Bos, J.L., Cancer Res. 49:4682-4689 (1989)).
Nucleinsäure-Detektionsassays können von einer beliebigen der vielfältigen Eigenschaften eines Nucleinsäure-Moleküls ausgehen, zum Beispiel seiner Größe, Sequenz, Empfänglichkeit für Verdauung durch Restriktionsendonucleasen etc. Die Empfindlichkeit solcher Assays kann durch Veränderung der Art und Weise erhöht werden, in der die Detektion der untersuchenden Person berichtet oder signalisiert wird. So läßt sich die Assay-Empfindlichkeit beispielsweise durch die Verwendung detektierbar markierter Reagenzien erhöhen Zu diesem Zweck wird eine breite Vielfalt solcher Markierungen eingesetzt, zum Beispiel Enzym-Markierungen (Kourilsky et al., US-Patentschrift 4.581 333), radioisotope Markierungen (Falkow et al., US-Patentschrift 4.358.535; Berninger, US-Patentschrift 4.446.236), fluoreszierende Markierungen (Albarella et al., EP 144914), chemische Markierungen (Sheldon III et al., US- Patentschrift 4.582.789; Albarella et al., US-Patentschrift 4.563.417), modifizierte Basen (Miyoshi et al., EP 119448) und ähnliches.
Es wurden verschiedene Detektionssysteme für Nucleinsäuren zur Detektion spezifischer Mutationen entworfen, die eine Kombination aus Sonden und zusätzlichen Bindungspartnern umfassen, welche als Reporter dienen. Paau et al., US-Patentschrift 4.556.643 beschreibt eine Polynucleotid-Sonde mit einer Ziel-spezifischen Sequenz und einer Protein-bindenden Sequenz. In den meisten Fällen handelt es sich bei einer solchen Protein-bindenden Sequenz um ein zusätzliches DNS- Segment, das an das Ziel-spezifische Segment gekoppelt ist. Die verwendeten bindenden Proteine können Teil eines Protein- Marker-Komplex sein, zum Beispiel eines Protein-Enzym-Komplex (Col. 7, Zeilen 7-10). Die beschriebenen bindenden Proteine waren DNS-modifizierte Enzyme, Polymerasen, Lac-Repressor oder antigene DNS-Sequenzen (Col. 7, Zeilen 10-29). Ein typisches Beispiel einer durch diese Literatur nahegebrachten Sonde (Beispiel I, Col. 12 und 13) besteht in einem cDNS- Molekül (zur Hybridisierung an die Ziel-DNS-Sequenz fähig), an das T7-Promotor gekoppelt wurde (die Protein-bindende Sequenz). Nach Hybridisierung dieser Sonde wird eine E. coli- RNS-Polymerase als bindendes Protein zugegeben, welche an den T7-Promotor bindet. Das Vorhandensein der gebundenen RNS- Polymerase wird mittels eines für die Polymerase spezifischen Kaninchen-Antiserums detektiert, gefolgt von Peroxidasekonjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-Zweitantikörper und einem Peroxidase-Anti-Peroxidase-Detektionssystem.
Mundy, US-Patentschrift 4.656.127 beschreibt Verfahren zum Detektieren einer Mutation einer spezifischen Nucleotid-Base, welche die Kenntnis der Sequenz in der Region von Interesse erfordern (Col. 1, Zeilen 52-43), und den Vorteil aufweisen, daß sie nicht das Vorliegen der Mutation an einer Restriktionsstelle voraussetzen. Es wird eine lineare Sonde bereitgestellt, die zu einem Teil der Nucleinsäurekette komplementär und von der Mutationsstelle aus in eine Richtung orientiert ist. Auf die Hybridisierung hin wird ein Nucleotid-Derivat zugegeben, welches das Ende der Sonde in Abhängigkeit von der An- oder Abwesenheit einer bestimmten Basensequenz bindet. Der einzelsträngige Abschnitt wird verdaut. Dann wird die An- oder Abwesenheit der Sonde detektiert (Col. 2, Zeilen 3-22). In der Literatur wird ein Thionucleotid als das Nucleotid-Derivat ins Auge gefaßt (Col. 4, Zeilen 46-51), welches kraft seiner detektierbaren Markierung nachgewiesen wird.
Kato et al., Europäische Patentveröffentlichung 407.789 beschreibt Verfahren zum Detektieren einer Nucleinsäure, die auf der Hybridisierung mit einer markierten Sonde basieren. Zu den erwähnten nicht-radioaktiven Markierungen zählen Enzyme, kombiniert mit fluoreszierenden Stoffen, wobei ein Biotin-Avidin-System verwendet wird (S. 2, Zeilen 36-39). Die beispielhaft genannte Markierung ist Biotin-markierte DUTP, die synthetisch in die Sonde eingebaut ist.
Im Fachbereich ist eine Reihe von Verfahren bekannt, die auf die Detektion von Basen-Fehlpaarungen in Nucleinsäure- Hybriden ausgelegt sind. Frühere Verfahren basierten auf einer enzymatischen Spaltung der Fehlpaarungen (Gibbs, R. et al., Science 236:303-305 (1987)). Diese Verfahren umfassen einen Schritt der enzymatischen Spaltung des fehigepaarten DNS-Hybrids. Ein Nachteil dieser Verfahren ist, daß sie nicht alle Fehlpaarungen zuverlässig detektieren. Ein vor kurzem beschriebenes chemisches Verfahren zur Spaltung der fehlgepaarten DNS (Cotton, R.G. et al Proc. Natl. Sci. USA 85: 4397-4401 (1988); Cotton, R.G., Nuc. Acids Res. 17: 4223-4233 (1989)) basiert auf einer chemischen Spaltung an einer fehlgepaarten Stelle in einem DNS-DNS-Heteroduplex unter Verwendung einer Reihe von Agenzien, besonders von Osmiumtetroxid und Hydroxylamin. Bei diesem Verfahren werden die DNS-Sonden durch eine Restriktionsenzym-Spaltung der DNS von Interesse hergestellt. Eine Plasmid-DNS, die die Sequenz von Interesse enthält, wird an markierte DNS-Sonde (entweder mit ³²P endmarkiert oder intern markiert) hybridisiert. Hydroxylamin modifiziert fehlgepaarte Cytosine chemisch, während Osmiumtetroxid fehlgepaarte Thymine modifiziert. Dann wird Piperidin zur Spaltung der DNS an den modifizierten Stellen verwendet, gefolgt von Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Autoradiographie, um die Spaltprodukte zu identifizieren. Diesem Verfahren wird der Vorteil zugesprochen, alle möglichen Einzelbasen-Fehlpaarungen zu detektieren, da das Verfahren auch die Spaltung eines korrekt gepaarten Basenpaars in der Nachbarschaft einer Fehlpaarung herbeiführt.
Caskey und Mitarbeiter beschreiben ein Verfahren zur Lokalisierung einer Mutation, bei weichem PCR-amplifizierte cDNS als eine Quelle für Matrizen für die Fehlpaarungen spaltende Reaktion verwendet wird. Diese Methode wurde bei der Untersuchung von Patienten mit Ornithintranscarbamoylase(OTCase)-Defizienz zur Kartierung von Mutationen angewandt.
Kung et al., US-Patentschrift 4.963.658 beschreibt die Detektion einzelsträngiger DNS (esDNS), indem sie bei hoher Affinität mit einem esDNS-bindenden Protein, zum Beispiel einer Topoisomerase oder einem ONS-entdrillenden Protein (Col. 2. Zeilen 44-47), gebunden wird, welches selbst an eine Markierung, zum Beispiel β-D-Galactosidase (Col. 7, Zeile 1) gebunden werden kann.
Der Wunsch, den Nutzen und die Anwendbarkeit der derzeit verfügbaren Assays zu erhöhen, wird oftmals durch die Assay- Empfindlichkeit als auch dessen Komplexität und Kosten vereitelt. Folglich wäre die Entwicklung empfindlicher, als auch einfacher und relativ preiswerter, Assays zur Detektion von Umwandlungen in der DNS in hohem Maße erwünscht.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Mutationen in einer Nucleinsäure-Sequenz, welche lediglich eine Basisabweichung in der Sequenz umfassen. Auch der Umfang, in dem ein Ziel-Polynucleotid in einer Probe vorkommt, kann bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Verwendung eines Fehlpaarungen bindenden Proteins, wie durch das MutS Protein von E. coli und Salmonella veranschaulicht. Wie hierin verwendet, meint der Begriff Ziel-Polynucleotid eine Nucleinsäure-Sequenz, die detektiert werden soll. Die Ziel-Polynucleotid-Sequenz, die keine Mutation aufweist (die nichtumgewandelte Form), wird als das nichtmutierte Ziel-Polynucleotid oder die nichtmutierte Ziel-Sequenz bezeichnet. Die Ziel-Polynucleotid- Sequenz, die eine Mutation oder Umwandlung aufweist, wird als das mutierte Ziel-Polynucleotid bezeichnet. Das vorliegende Verfahren ist für die Diagnose einer Vielzahl wichtiger krankhafter Zustände oder Anfälligkeiten, etwa durch die Detektion des Vorhandenseins eines mutierten Onkogens, zweckdienlich. Das Verfahren teilt die Vorteile der Wirksamkeit mit den Verfahren auf PCR-Basis, ist jedoch in der Ausführung einfacher und preiswerter. Die Erfinder haben auch ein Set zur Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung konstruiert.
Die zu analysierende DNS kann von beliebiger Art sein, zum Beispiel eine aus Blutzellen, Sperma oder Gewebe eines Organismus, vorzugsweise eines menschlichen Organismus, entnommene DNS. Das Verfahren dieser Erfindung erfordert keine ausgefeilten und teuren Geräte, wie bei der PCR der Fall, und kann von einem Techniker ohne anspruchsvolle Schulung durchgeführt werden. Das Verfahren läßt sich intern derart kontrolliert, daß Testprobe und Kontroll-ONS denselben Behandlungen unterzogen werden. Schließlich kann das Verfahren so ausgelegt werden, daß einfache, leicht interpretierbare Ergebnisse erhalten werden, zum Beispiel ein farbiges "Plus"- oder "Minus"-Zeichen auf einem Membranfilter.
Diese Erfindung basiert aus zwei Schlüsselelementen. Das erste ist die Existenz von Proteinen, die an ein doppelsträngiges Nucleinsäure-Heteroduplex binden, welches eine fehlgepaarte oder ungepaarte Base enthält. Wohlbekannte Beispiele solcher Fehlpaarungen bindender Proteine sind bakterielle Proteine, zum Beispiel das MutS Protein in E. coli, welche bei der DNS-Reparatur fungieren. Das zweite Element ist die relative Leichtigkeit, mit der spezifische Gene und deren mutierte Allele isoliert und sequenziert werden können.
Daher richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Mutation in der Sequenz eines einzelsträngigen Polynucleotids (oder Ziel- Polynucleotids) in einer Probe. Das heißt, es handelt sich um ein Verfahren zur Detektion eines mutierten Ziel-Polynucleotids oder, alternativ dazu, zur Bestimmung des Vorhandenseins (oder der Abwesenheit) einer Mutation in einem Polynucleotid (DNS oder RNS).
Bei dem Verfahren wird eine auf das mutierte Ziel-Polynucleotid zu analysierende Probe mit einem einzelsträngigen Polynucleotid-Hybridisierungspartner inkubiert, der mindestens eine einzelsträngige Basensequenz umfaßt, die zu der nichtmutierten Sequenz des Ziel-Polynucleotids komplementär ist. Der Hybridisierungspartner und die auf das mutierte Ziel- Polynucleotid (z.B. eine DNS- oder RNS-Probe) zu bewertenden Polynucleotide werden unter geeigneten Bedingungen für eine herbeizuführende Hybridisierung des Hybridisierungspartners an ein beliebiges mutiertes oder nichtmutiertes Ziel-Polynucleotid, das in der Probe vorhanden sein kann, inkubiert. Die Hybridisierung der komplementären Sequenzen führt zur Bildung eines Hybrids aus dem Hybridisierungspartner und dem Ziel-Polynucleotid. Das gebildete Hybrid wird kombiniert oder in Kontakt gebracht mit einem Fehlpaarungen bindenden Protein unter geeigneten Bedingungen für eine herbeizuführende Bindung des Fehlpaarungen bindenden Proteins an das mutierte Ziel-Polynucleotid. Dies führt zur Bindung von Fehlpaarungen bindenden Proteinen an Hybride, bei denen das Ziel-Polynucleotid ein mutiertes Ziel-Polynucleotid ist. Die Detektion des Vorhandenseins des an das Hybrid gebundenen Fehlpaarungen bindenden Proteins dient als Hinweis auf das Vorhandensein einer Mutation in der Sequenz des Polynucleotids der Probe (d.h. als Hinweis auf das Vorhandensein des mutierten Ziel- Polynucleotids).
Beim zuvorgenannten ist der Hybridisierungspartner bevorzugt DNS, zum Beispiel cDNS oder ein synthetisches Oligonucleotid. Das Ziel-Polynucleotid kann DNS oder RNS sein. Eine bevorzugte RNS ist mRNS.
Beim obengenannten Verfahren ist ein bevorzugtes Fehlpaarungen bindendes Protein das MutS Protein oder ein funktionales Derivat davon.
Bei einer Ausführungsform des Verfahrens ist die Probe eine biologische Flüssigkeit, die hinreichenden Bedingungen ausgesetzt worden ist, um eine beliebige darin vorhandene Nucleinsäure freizusetzen und zu denaturieren (einzelsträngig zu machen). Gegebenenfalls wird die freigesetzte Nucleinsäure vor der Denaturierung einem Restriktionsendonuclease-Spaltungsschritt unterzogen.
Bei einer Ausführungsform wird der Polynucleotid-Hybridisierungspartner an einem festen Träger immobilisiert und der resultierende, an den festen Träger gebundene Hybridisierungspartner mit einer auf das Vorhandensein des mutierten Ziel-Polynucleotids zu bewertenden Polynucleotid-probe inkubiert. Ein bevorzugter fester Träger ist eine Nitrocellulose-Membran.
Der Oetektionsschritt umfaßt bevorzugt die Zugabe eines detektierbar markierten ersten bindenden Partners, der an das Fehlpaarungen bindende Protein bindet. Der erste bindende Partner kann beispielsweise ein für das Fehlpaarungen bindende Protein spezifische Antikörper oder ein Enzym sein, welches die Bildung eines farbigen, zu detektierenden Reaktionsprodukts katalysiert.
Bei einer anderen Ausführungsform umfaßt der Detektionsschritt die Zugabe eines ersten bindenden Partners, welcher an das Fehlpaarungen bindende Protein bindet und nicht detektierbar markiert ist, und eines zweiten bindenden Partners, welcher an den ersten bindenden Partner bindet und das Vorhandensein des ersten bindenden Partners detektiert. Der zweite bindende Partner kann entweder selbst detektierbar markiert sein, oder es kann ein detektierbar markierter dritter bindender Partner verwendet werden, welcher an den zweiten bindenden Partner bindet. Ein bevorzugter zweiter bindender Partner ist ein Antikörper für den ersten bindenden Partner. Bei einer weiteren Ausführungsform ist der erste bindende Partner ein MutL Protein oder ein funktionales Derivat davon, vorzugsweise ein Fusionsprotein aus MutL und einem zweiten Protein oder Peptid, das detektierbar ist. Ein bevorzugtes zweites Protein im Fusionsprotein ist beta- Galactosidase.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Fehlpaarungen bindende Protein eine Komponente eines Fusionsproteins, bei dem die zweite Komponente ein zweites Protein oder Peptid ist, das detektierbar ist, und zwar entweder direkt (d.h. es ist selbst detektierbar) oder indirekt (d.h. durch die Verwendung eines Reagenz, welches detektierbar ist). Bei dieser Ausführungsform umfaßt der Detektionsschritt vorzugsweise die Zugabe eines detektierbar markierten bindenden Partners, welcher an das im Fusionsprotein vorhandene zweite Protein oder Peptid bindet. Das zweite Protein kann ein Enzym sein, das in der Lage ist, die Bildung eines farbigen Reaktionsprodukts aus einem chromogenen Enzymsubstrat zu katalysieren. Der Detektionsschritt umfaßt die Bereitstellung des chromogenen Substrats und die Visualisierung des farbigen Reaktionsprodukts. Ein bevorzugtes zweites Protein ist beta- Galactosidase.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zum Detektieren (Unterscheiden) einer mutierten von einer nichtmutierten Sequenz eines einzelsträngigen Ziel- Säugerpolynucleotids in einer Probe. Bei diesem Verfahren wird eine Probe des Säugerpolynucleotids (DNS oder RNS) unter Anwendung bekannter Verfahren erhalten. So kann zum Beispiel die DNS oder RNS aus einer Zelle erhalten werden, einer Behandlung unterzogen werden, um sie einzelsträngig zu machen, und mit einem einzelsträngigen Polynucleotid- Hybridisierungspartner inkubiert werden, der mindestens eine einzelsträngige Basensequenz umfaßt, die zu der nichtmutierten Sequenz des Ziel-Säugerpolynucleotids komplementär ist. Die DNS oder RNS und der Hybridisierungspartner werden unter geeigneten Bedingungen für eine herbeizuführende Hybridisierung des Hybridisierungspartners an ein beliebiges mutiertes oder nichtmutiertes Ziel-Polynucleotid, welches in der Probe vorhanden sein kann, inkubiert. Die Hybridisierung der komplementären Sequenzen führt zur Bildung eines Hybrids aus dem Hybridisierungspartner und dem Ziel-Polynucleotid. Das gebildete Hybrid wird kombiniert oder in Kontakt gebracht mit einem Fehlpaarungen bindenden Protein unter geeigneten Bedingungen für eine herbeizuführende Bindung des Fehlpaarungen bindenden Proteins und der Hybride, bei denen das Ziel- Polynucleotid mutiertes Ziel-Polynucleotid ist. Die Detektion der Bindung des Fehlpaarungen bindenden Proteins an das Hybrid dient als Hinweis auf das Vorhandensein einer Mutation in der Sequenz des Säugerpolynucleotids der Probe (d.h. als Hinweis auf das Vorhandensein der mutierten Ziel-Polynucleotide).
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Set, das zum Detektieren eines mutierten Ziel-Polynucleotids (Unterscheiden eines mutierten Ziel-Polynucleotids von einer nichtmutierten Ziel- Polynucleotid-Sequenz) in einer Probe zweckdienlich ist. Das Set umfaßt das folgende:
(a) einen ersten Behälter, der einen einzelsträngigen Polynucleotid-Hybridisierungspartner enthält, umfassend mindestens eine einzelsträngige Basensequenz, die zu der nichtmutierten Sequenz des Ziel-Polynucleotids komplementär ist (d.h. zum nichtmutierten Ziel-Polynucleotid komplementär ist);
(b) einen zweiten Behälter, der ein Fehlpaarungen bindendes Protein enthält; und
(c) einen dritten Behälter oder mehrere Behälter, die ein Reagenz oder Reagenzien enthalten, die in der Lage sind, die Bindung des Fehlpaarungen bindenden Proteins an das Hybrid zu detektieren.
In obengenanntem Set ist das Fehlpaarungen bindende Protein vorzugsweise MutS oder ein funktionales Derivat davon. Das Reagenz oder die Reagenzien umfassen vorzugsweise mindestens einen detektierbar markierten ersten bindenden Partner, der in der Lage ist, an das Fehlpaarungen bindende Protein zu binden. Ein bevorzugter erster bindender Partner ist ein für das Fehlpaarungen bindende Protein spezifischer Antikörper.
Bei einer alternativen Ausführungsform des Sets umfassen das Reagenz oder die Reagenzien einen ersten bindenden Partner, der nicht detektierbar markiert ist, wobei der erste bindende Partner zum Binden an das Fehlpaarungen bindende Protein in der Lage ist, und einen zweiten bindenden Partner, zum Beispiel einen Antikörper, der zum Binden an den ersten bindenden Partner in der Lage ist. Der zweite bindende Partner kann detektierbar markiert sein. Ebenfalls vorgesehen ist ein Set, bei dem der zweite bindende Partner nicht markiert ist und ein detektierbar markierter dritter bindender Partner enthalten ist, der zum Binden an den zweiten bindenden Partner in der Lage ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Sets ist der erste bindende Partner ein MutL Protein oder ein funktionales Derivat davon, zum Beispiel ein Fusionsprotein aus MutL und einem zweiten Protein oder Peptid, das detektierbar ist, vorzugsweise β-Galactosidase. Ein zweiter bindender Partner ist zum Binden an das MutL Protein oder seinen Fusionsprotein-Partner, zum Beispiel ein für β-Galactosidase spezifischer Antikörper, in der Lage.
Beim obengenannten Set wird der Hybridisierungspartner bevorzugt an einem festen Träger immobilisiert. Ein bevorzugter fester Träger ist eine Nitrocellulose-Membran.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Sets ist das Fehlpaarungen bindende Protein ein Fusionsprotein, das mit einem Enzym fusioniert ist, und das Reagenz umfaßt ein chromogenes Substrat für das Enzym.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Hybridisierung der Hybridisierungspartner in der Form eines Oligonucleotids oder einer cDNS mit der Test- oder "Ziel"- DNS. Der untere Abschnitt der Abbildung zeigt die Struktur der Fehlpaarungen enthaltenden Hybride. Dort, wo eine cDNS an ein genomisches DNS-Fragment hybridisiert hat, sind die nicht-hybridisierenden Abschnitte der Gen-DNS (Introne) als ausbuchtende Schleifen dargestellt.
Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung des Mutations-Detektionsassays der vorliegenden Erfindung. Bei dieser speziellen Ausführungsform wird das Vorhandensein des Fehlpaarungen bindenden Proteins durch Verwendung eines ersten bindenden Partners detektiert, nämlich eines für das Fehlpaarungen bindende Protein spezifischen Antikörpers.
Dieser Antikörper kann detektierbar markiert sein oder mittels eines detektierbar markierten Reagenz detektiert werden (unten rechts). Alternativ dazu kann der Detektionsschritt unter Verwendung eines zweiten bindenden Partners, hier eines für den ersten Antikörper spezifischen Antikörpers ("Anti-Ab") amplifiziert werden (unten links).
Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung eines speziellen Assay-Formats, wie in den Beispielen beschrieben, bei dem positive und negative Kontrollen auf einem Nitrocellulose-Filter derart aufgebracht werden, daß ein sichtbares "Minus"-Zeichen erhalten wird, wenn keine Fehlpaarung vorliegt, und ein sichtbares "Plus"-Zeichen erhalten wird, wenn die Ziel-DNS eine Mutation (Fehlpaarung) aufweist.
Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse der Fehlpaarungs-Detektion bei in Lösung anelierten Heteroduplices.
Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse der Fehlpaarungs-Detektion bei an immobilisierte Oligonucleotide anelierten Heteroduplices.
Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse der Fehlpaarungs-Detektion bei in Gegenwart konkurrierender Oligonucleotide anelierten Heteroduplices.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung ersonnen ein neuartiges, breit anwendbares und relativ einfaches Verfahren zum Detektieren von Umwandlungen, selbst so geringen wie einer einzigen Basenabweichung, in einer DNS-Sequenz. Die Fehlpaarungs-Reparaturmechanismen der bakteriellen DNS verwenden eine Protein-Familie, zu der ein Protein zählt, das doppelsträngige, eine Basen-Fehlpaarung aufweisende DNS erkennt und an sie bindet (zur Übersicht, siehe Radman, M. et al., Annu. Rev. Genet. 20: 523-538 (1986); Radman, M. et al., Sci. Amer., August 1988, S. 40-46; Modrich, P., J. Biol. Chem. 264:6597-6600 (1989)). Das MutS Protein wurde als eine derartige Komponente des E. coli Fehlpaarungs-Reparatur systems identifiziert (Lahue, R.S. et al., Science 245:160- 164 (1989); Jiricny, J. et al., Nucl. Acids Res. 16:7843-7853 (1988); Su, S.S. et al., J. Biol. Chem. 263:6829-6835 (1988); Lahue, R.S. et al., Mutat. Res. 198:37-43 (1988); Lahue, R.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1482-1486 (1987); Dohet, C. et al., Mol. Gen. Genet. 206:181-184 (1987); Jones, M. et al., Genetics 115:605-610 (1987); Su, S.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5057-5061 (1986); Dohet, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:503-505 (1985); Choy, H.E. et al., Mutat. Res. 142:93-97 (1985); Jones, M. et al., Mol. Gen. Genet. 184:562-563 (1981)). Analoge Proteine sind in weiteren Bakterienspezies bekannt, einschließlich MutS und Salmonella typhimunum (Lu, A.L. et. al., Genetics 118:593-600 (1988); Haber. L.T. et al., J. Bacteriol. 170:197-202 (1988); Pang, P.P. et al., J. Bacteriol. 163:1007-1015 (1985)) und das hexA Protein von Streptococcus pneumoniae (Priebe, S.D. et al., J. Bacteriol. 170:190-196 (1988); Haber et al., supra).
Gereinigtes MutS Protein bindet an fehlgepaarte Basen aufweisende ONS, doch bindet nicht an DNS ohne Fehlpaarungen oder an einzelsträngige DNS. Die MutS-DNS-Wechselwirkung führt zu keinerlei Abbau oder Modifikation der DNS.
Das Verfahren basiert auf der Detektion eines fehlgepaarten DNS-Heteroduplex, was entsteht, wenn ein Strang einer mutierten DNS und ein "komplementärer" Strang einer Wildtyp- DNS hybridisieren (siehe Abbildung 1). Das Vorhandensein der Fehlpaarung wird in einer hochspezifischen Weise detektiert, indem zunächst die Bindung eines Fehlpaarungen bindenden Proteins, zum Beispiel des E. coli MutS Proteins, an das DNS- Duplex ermöglicht wird. Das Vorhandensein des gebundenen Fehlpaarungen bindenden Proteins wird dann auf beliebige von mehreren Weisen detektiert, zum Beispiel unter Verwendung eines detektierbar markierten Antikörpers, der für das Fehlpaarungen bindende Protein spezifisch ist, zum Beispiel eines Anti-MutS-Antikörpers. Dieses Verfahren steht in starkem Kontrast zu Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen Fehlpaarungen-ausschneidende Nucleaseenzyme verwendet werden, die zum Aufbrechen der DNS am oder nahe dem fehlgepaarten Basenpaar in der Lage sind. Eine schematische Veranschaulichung dieses Ansatzes ist in Abbildung 2 gezeigt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Detektion des Vorhandenseins eines bestimmten "Ziel"- Nucleinsäure-Moleküls oder -Polynucleotids in einer Probe. Bei diesen Proben handelt es sich gewöhnlich um biologische Proben, zum Beispiel Blut, Sperma, Stuhl, Serum, Urin, Speichel, Kulturmedium etc., als auch um nicht-biologische Proben, zum Beispiel Abwasser oder Trinkwasser, Milch oder andere Nahrungsmittel, Luft etc.
Das Ziel-Polynucleotid oder -Nucleinsäure-Molekül, das mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung detektiert wird, kann entweder DNS oder RNS sein, doch ist vorzugsweise DNS. Ist der Hybridisierungspartner cDNS, so kann die Ziel- Nucleinsäure entweder DNS oder mRNS sein, wobei die mRNS in höherer Kopienzahl vorhanden ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Ziel-Nucleinsäure", "Ziel- Polynucleotid" oder "Ziel-Sequenz" auf eine Nucleinsäure, die eine zu detektierende und/oder quantifizierende Sequenz von Interesse aufweist. Sie kann die Wildtyp-Sequenz aufweisen, in welchem Fall diese als das Wildtyp- oder nichtmutierte Ziel-Polynucleotid oder die nichtmutierte Ziel-Sequenz bezeichnet wird. Alternativ dazu kann sie eine Umwandlung oder Mutation (vom Wildtyp mutiert) aufweisen, in welchem Fall sie als mutiertes Ziel-Polynucleotid bezeichnet wird. Eine Ziel-Sequenz in der Ziel-Nucleinsäure muß ausreichend lang sein, um mit einer Sonden-DNS (Hybridisierungspartner) selbst dann zu hybridisieren, wenn eine Umwandlung oder mutation im Polynucleotid vorliegt. Eine Ziel-Sequenz ist zur Detektion mittels des vorliegenden Verfahrens bevorzugt länger als 30 Basen. Bei einer Ausführungsform muß die Ziel- Polynucleotid-Sequenz bekannt sein, um die Konstruktion eines "Hybridisierungspartner"-Polynucleotids oder -Oligonucleotids einer Sequenz mit der erforderlichen Fehlpaarung relativ zur Ziel-Sequenz und damit die Bindung des Fehlpaarungen bindenden Proteins und seine anschließende Detektion zu ermöglichen.
Bei einer anderen Ausführungsform wird ein cDNS-Molekül als Hybridisierungspartner verwendet. In diesem Fall ist es nicht erforderlich, die Ziel-Polynucleotid-Sequenz im voraus zu kennen. Bei der Hybridisierung der cDNS mit einem genomischen DNS-Fragment bilden die nicht in der cDNS repräsentierten Introne ungepaarte Schleifen (siehe Abbildung 1), die weder durch das Fehlpaarungen bindende Protein detektiert werden noch in dessen Bindung an Einzelbasen-Fehlpaarungen oder an durch Addition oder Deletion von 1-4 Basenpaaren verursachte Fehlpaarungen eingreifen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zeigt den Vorteil, die Detektion eines mutierten Ziel-Nucleinsäure-Moleküls (entweder DNS oder RNS) zuzulassen, ohne dabei die Amplifikation eines solchen Moleküls erforderlich zu machen, wie bei einer Reihe in jüngerer Zeit entwickelter Mutations- Detektionsassays der Fall. Bei der vorliegenden Erfindung wird dieses Ziel durch Konstruktion und Verwendung eines oder mehrerer Hybridisierungspartner-Oligonucleotid- oder -Polynucleotid-Moleküle, einschließlich cDNS-Moleküle, erreicht, die komplementäre Sequenzen zu einer oder mehreren Ziel-Nucleotid-Sequenzen des Wildtyps aufweisen. Der Hybridisierungspartner ist zur Hybridisierung an ein Ziel- Nucleinsäure-Molekül in der Weise in der Lage, daß bei Auftreten einer Basen-Fehlpaarung oder einer ungepaarten Base diese Fehlpaarung oder ungepaarte Base mittels des Fehlpaarungen bindenden Proteins erkannt wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Hybridisierungspartner ein einzelsträngiges Nukleinsäure- Molekül, am bevorzugtesten eine einzelsträngige DNS.
Das Ziel-Nukleinsäure-Molekül kann zum Beispiel eine DNS oder RNS von eukaryontischen Zellen, prokaryontischen Zellen, Viren, Viroiden oder ähnlichem sein. Vorzugsweise stammt das Ziel-Nukleinsäure-Molekül von einem Säuger, noch bevorzugter von einem Menschen. Tatsächlich bestehen keine Beschränkungen hinsichtlich der Nucleotidsequenz oder des Ursprungs des "Ziel"-Nucleinsäure-Moleküls.
Kleine Frameshift-Mutationen, nämlich entweder Additionen oder Deletionen, ergeben ebenfalls eine Sequenz, die sich mit der Wildtyp-Sequenz in einer Weise paart, daß das Fehlpaarungen bindende Protein anbindet. So ist beispielsweise bekannt, daß sowohl das auf E. coli MutS-basierende Reparatursystem (Radman, M. et al., Annu. Rev. Genet. 20:523-538 (1986)) und das Streptococcus pneumoniae Hex Fehlpaarungs- Reparatursystem auf Fehlpaarungen, die aus der Addition oder Deletion einer Einzelbase resultieren, wirken. Additionen oder Deletionen von zwei oder drei Basenpaaren, und in geringerem Umfang von vier Basenpaaren, werden ebenfalls repariert, eine Addition oder Deletion von fünf Basenpaaren dagegen nicht. Folglich sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Detektion geringer Additions- oder Deletionsmutationen von ein bis vier Basen zweckmäßig.
Bei einem Assay zur Detektion einer bestimmten Einzelbasen- Mutation bei doppelsträngiger (ds) DNS ist die Verwendung von zwei Wildtyp-Hybridisierungspartner-Sequenzen bevorzugt, welche, bis auf eine einzige Base, zu jedem der beiden mutierten DNS-Stränge komplementär sind, da die Empfindlichkeit des Assays um ein Zweifaches erhöht ist gegenüber der Verwendung lediglich eines Hybridisierungspartners. Allerdings ist auch die Verwendung einer einzigen Hybridisierungspartner-Sequenz, die zu lediglich einem der beiden DNS-Stränge komplementär ist, möglich, da der Assay hinreichend empfindlich ist, sodaß die zweifache Abnahme der Empfindlichkeit (im Vergleich zur Verwendung von zwei Hybridisierungspartnern) den Nutzen des Verfahrens nicht schmälert.
Da ein Fehlpaarungen bindendes Protein, zum Beispiel MutS, nicht an alle möglichen Fehlpaarungen mit gleicher Wirksamkeit bindet (Dohet, C. et al., 1985, supra; Jones, M. et al., 1987, supra), kann es bei bestimmten Ziel-Sequenzen erforderlich sein, komplementäre Hybridisierungspartner zu beiden Strängen in der Region von Interesse zu präparieren, um jede der beiden möglichen Fehlpaarungen aus einer gegebenen Wildtyp-dsDNS-Sequenz zu erhalten und so zumindest eine der beiden mutierten Sequenzen zu detektieren.
Der Hybridisierungspartner kann ein einzelnes kontinuierliches Polynukleotid-Segment sein, das zu einer größeren Ziel-Sequenz komplementär ist, in der mehr als ein einzelnes Basenpaar fehlgepaart ist. Alternativ dazu können zwei Mutationen auf einem Einzelfragment der Ziel-DNS, die durch etwa 30 oder mehr Basen getrennt sind, unter Verwendung von zwei oder mehreren individuellen Hybridisierungspartnern, von denen jeder mit einer separaten Sequenz auf dem einzelnen Ziel-Fragment hybridisiert, detektiert werden.
Bei einer Ausführungsform kann die Region des zur Ziel- Sequenz komplementären Hybridisierungspartners an den 3'- oder 5'-Enden durch nicht-hybridisierbare Sequenzen flankiert sein, vorausgesetzt, daß der hybridisierbare Abschnitt ein stabiles Heteroduplex von mindestens etwa 30 Nucleotiden bildet, in dem das Fehlpaarungen bindende Protein eine Fehlpaarung erkennen und binden kann.
Der RNS- oder DNS-Hybridisierungspartner kann mittels einer Vielfalt wohlbekannter Methoden präpariert werden. Am bevorzugtesten wird ein Oligonucleotid-Hybridisierungspartner mittels chemischer Oligonucleotid-Synthese unter Anwendung herkömmlicher Verfahren präpariert. Methoden zur Synthese der Oligonucleotide sind beispielsweise beschrieben bei Wu, R., et al., Proc. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978)). Alternativ dazu kann ein RNS-Hybridisierungspartner als ein natürliches Produkt aus Zellen isoliert werden, beispielswe4se als ein mRNS-Molekül. RNS- oder cDNS- Hybridisierungspartner können auch mittels rekombinanter ONS-Verfahren präpariert werden. (Siehe zum Beispiel Green et al., Cell 32:681 (1983)). Die DNS-Hybridisierungspartner können mittels einer beliebigen von vielfältigen Quellen präpariert werden, die den Fachleuten des Bereichs leicht erkennbar sind, zum Beispiel mittels Restriktionsendonudease-Spaltung oder chemischer Spaltung natürlich vorkommender DNS.
In Anbetracht der Tatsache, daß E. coli MutS an Heterduplices von 16 Basen bindet (Jiricny et al., supra) und daß die Größe des durch MutS geschützten Heteroduplex bei einem Footprinting Assay lediglich 8-12 Basen beträgt (Su, S.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5057-5061 (1986)), liegt die Untergrenze für die Größe des Hybridisierungspartners der vorliegenden Erfindung bei etwa 10 Nucleotiden. Um die genaue Übereinstimmung der Hybridisierung bei gleichzeitiger Niedrighaltung der Kosten für die Synthese zu erhöhen, ist ein größerer Hybridisierungspartner von vorzugsweise etwa 20 bis etwa 100 Nucleotiden bevorzugt. Unter Berücksichtigung der Wirtschaftlichkeit der Oligonucleotid-Synthese besteht ein noch bevorzugterer Oligonucleotid-Hybridisierungspartner aus etwa 20 bis etwa 40 Nucleotiden. Es ist keine Obergrenze für die Größe des Hybridisierungspartner, gegeben, da rekombinante Verfahren zu seiner Herstellung verwendet werden können, wie hierin beschrieben. So besteht bei einer weiteren Ausführungsform der Hybridisierungspartner in einem intakten cDNS-Molekül.
Zur Verwendung bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung liegt die Hybridisierungspartner-Sequenz in immobilisierbarer Form vor, oder ist bevorzugter an einem Festphasen-Träger oder -Carrier immobilisiert (siehe Abbildung 3). Eine immobilisierbare Form des Hybridisierungspartners ist eine solche, die bequem immobilisiert werden kann, und zwar im allgemeinen im Anschluß an die Hybridisierungsreaktion. Die Methode, mittels derer der Hybridisierungspartner letzten Endes immobilisiert wird, ist bei der vorliegenden Erfindung nicht entscheidend; es kann dazu jeder beliebige, zur Verfügung stehende Ansatz gewählt werden, solange die zwischen dem Hybridisierungspartner und der Ziel-Nucleinsäure-Sequenz gebildeten Hybride durch eine Eigenschaft des Hybridisierungspartners immobilisiert werden können.
Der Hybridisierungspartner kann, wenn er in einer immobilisierten Form in die Hybridisierungsreaktjon eingebracht wird, in jeglicher Form vorliegen, die ihn, ebenso wie jegliche andere an ihn gebundene Komponente des Reaktionsgemischs, dazu geeignet macht, anschließend isoliert oder aus dem verbliebenen Gemisch abgetrennt zu werden. Die Abtrennung kann mittels Zentrifugation, Filtration, Chromatographie, Abschöpfung oder ähnlichem vorgenommen werden.
Fachleute des Bereichs mit den üblichen Sachkenntnissen werden die Vielfalt der Zusammensetzungen und Gestalten eines immobilisierten Hybridisierungspartners, der gemäß der Erfindung zweckmäßig ist, zu schätzen wissen. So kann der Hybridisierungspartner aggregiert oder andernfalls präzipitiert sein, an ein unlösliches Material, Polymer oder Träger gebunden sein oder in einem Gel, zum Beispiel Agarose oder Acrylamid, eingefangen sein. (Meth. Enzymol., 128:635 (1968); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67:807 (1970)). Am bevorzugtesten ist ein fester Träger, an den der Hybridisierungspartner mittels kovalenter oder nichtkovalenter Bindungen gebunden oder fixiert ist. Die nichtkovalente Bindung findet vorzugsweise mittels Adsorption unter Verwendung von Verfahren statt, die für eine angemessen stabile und starke Bindung sorgen. Dies läßt sich auch mittels eines Amino-Modifikators am Hybridisierungspartner erzielen; der Amino-Modifikator dient zum "Haken" oder Binden des Hybridisierungspartners an einen festen Träger (z.B. eine Membran oder ein Filter). Die Methoden zum Binden eines gewünschten Oligonucleotids oder Polynukleotids an einen ausgewählten festen Träger sind den Fachleuten des Bereichs mit üblicher Sachkenntnis wohlbekannt.
Mit "Festphasen-Träger" ist jeder beliebige Träger gemeint, der zum Binden eines Oligo- oder Polynucleotids in der Lage ist. Zu wohlbekannten Trägern oder Carriern zählen natürliche und modifizierte Cellulosen, zum Beispiel Nitrocellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Polyacrylamide und Agarosen. Das Trägermaterial kann nahezu jede mögliche strukturelle Gestalt aufweisen, solange der immobilisierte Hybridisierungspartner mit dem Ziel-Nucleinsäure-Molekül hybridisieren und das Fehlpaarungen bindende Protein anschließend an das Hybridisierungspartner-Ziel- Polynucleotid-Hybrid binden kann. So kann die Trägerstruktur Mikropartikel, Körnchen, poröse und undurchlässige Streifen und Membranen, die innere Oberfläche von Reaktionsgefäßen, zum Beispiel von Reagenzgläsern und Mikrotiterplatten, und ähnliches umfassen. Zu bevorzugten Trägern zählen Nitrocellulose-Scheiben oder -Streifen. Fachleute des Bereichs werden viele andere geeignete Träger zur Bindung der Oligo- oder Polynukleotid-Hybridisierungspartner erkennen oder diese anhand von routinemäßigem Experimentieren ermitteln können.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Adsorption des Hybridisierungspartners an Nitrocellulose-Membranen umfaßt das Sättigen einer Lösung des Hybridisierungspartners mit Natriumiodid und das Auftupfen oder Auffiltern von Teilmengen auf die Membran (Bresser et al., DNA 2:243 (1983)). Alternativ dazu kann der Hybridisierungspartner mit Glyoxal (weniger als 1 M) behandelt und dann an die Membran adsorbiert werden. Der Hybridisierungspartner läßt sich durch Backen bei etwa 80ºC unter Vakuum über etwa 2-3 Stunden hinweg fixieren (Thomas, P.S., Meth. Enzymol. 100:255).
Auch kann eine kovalente Immobilisierung der Oligonucleotid- Hybridisierungspartner vorgenommen werden. Es sind zahlreiche, für die kovalente Immobilisierung nützliche Trägermaterialien und Kupplungsverfahren bekannt. Zu Beispielen zählen die Kupplung an Phosphocellulose durch Phosphatgruppen, die durch Carbodiimid oder Carbonyldiimidazol aktiviert ist (Bautz, E.K.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:400-408 (1963); Shih, T.Y. et al Biochemistry 113:3411-3418 (1974)), oder die Umsetzung von Diazogruppen auf m-Diazobenzoyloxymethylcellulose mit G- und T-Resten des Hybridisierungspartners (Noyes, B.E. et al., Cell 5:301-310 (1975); Reiser, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 85:1104-1112 (1978)). Polysaccharid-Träger können durch Phosphodiester-Bindungen gekoppelt werden, die zwischen endständigem Phosphat des Oligonucleotids und Hydroxyl-Komponenten des Trägers durch Aktivierung mit wasserlöslichem Carbodiimid gebildet werden (Richwood, D., Biochim. Biophys. Acta 269:47-50 (1972)), oder durch Kupplung nucleophiler Stellen auf dem Oligonucleotid mit einem Cyanbromidaktivierten Träger (Arndt-Jovin, D.J. et al., Eur. J. Biochem. 54:411-418 (1975). Außerdem kann das 3'-Hydroxy-Ende des Hybridisierungspartners durch Periodat oxidiert und durch Schiffsche Basenbildung mit Trägern gekoppelt werden, die Amin- oder Hydrazid-Gruppen aufweisen (Gilham, P.T., Method. Enzymol. 21:191-197 (1971); Hansske, H.D., et al., Method. Enzymol. 59:172-181 (1979)). Träger mit nukleophilen Stellen können mit Cyanurchlorid und dann mit dem Polynucleotid umgesetzt werden (Hunger, H.D. et al., Biochim. Biophys. Acta 653:344-349 (1981)).
Allgemein kann jedes beliebige Verfahren zur Immobilisierung des Hybridisierungspartners angewandt werden, solange eine zur Zielsequenz komplementäre Sequenz für die Hybridisierung an eine Nukleinsäure-Probe verfügbar ist. Bestimmte Verfahren oder Stoffe sind nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung.
Eine Alternative zur Verwendung eines direkt immobilisierten Hybridisierungspartners ist die Verwendung einer immobilisierbaren Form, was die Durchführung des Hybridisierungsschritts in Lösung ermöglicht, in der die Kinetik schneller ist. Gewöhnlich würde man bei solch einer Ausführungsform einen Hybridisierungspartner mit einer reaktiven Stelle verwenden, die zur Bildung einer stabilen kovalenten oder nichtkovalenten Bindung mit einem Reaktionspartner in der Lage ist, und die Immobilisierung durch Zusammenbringen mit einer immobilisierten Form des Reaktionspartners erzielen. Eine derartige reaktive Stelle im Hybridisierungspartner ist vorzugsweise eine Bindestelle, wie etwa eine Biotin- oder Hapten-Komponente, die zur spezifischen nichtkovalenten Bindung mit einer als dem immobilisierten Reaktionspartner dienenden Bindesubstanz, zum Beispiel Avidin oder einem Antikörper, in der Lage ist.
Eigentlich kann jedes beliebige Substanzenpaar die reaktive Stelle/reaktiver Partner-Kombination stellen, solange diese Substanzen eine angemessene Wechselwirkungs-Affinität zum Erhalt einer stabilen Bindung zeigen, daß heißt, einer Verknüpfung oder Kupplung der beiden, die während der nachfolgenden Assayschritte, vor allem der Separations- und Detektionsschritte, im wesentlichen intakt bleibt. Die reaktive Stelle auf dem Hybridisierungspartner wird als eine "Bindestelle" und der Reaktionspartner als eine "Bindesubstanz" bezeichnet, mit der sie eine kovalente oder nichtkovalente Bindung oder Verknüpfung eingeht.
Bei einer Ausführungsform liegt die Bindestelle vorzugsweise in einem nichthybridisierbaren Abschnitt des Hybridisierungspartners vor und ist vorzugsweise ein Ergebnis einer chemischen Modifikation des Hybridisierungspartners.
Beispiele für die in der Nucleotid-Sequenz vorliegende Bindestelle sind eine Promotor-Sequenz, die durch ein Promotor-Protein gebunden werden kann, eine Operator-Sequenz, die durch ein Repressor-Protein gebunden werden kann, oder ein modifiziertes Nucleotid, das durch einen spezifischen Antikörper, zum Beispiel 5-Bromdesoxyuridin oder 5-Iododesoxyuridin (Britische Patentschrift 2.125.964), oder Thyminglycol (Rajagopalan et al., Radiat. Res. 97:499-510 (1984); Hubbard, K. et al., Radiat. Res. 118:257-268 (1989)) gebunden werden kann.
Bindestellen, die durch chemische Modifikation des Oligonucleotid-Hybridisierungspartners eingeführt werden, sind besonders nützlich und umfassen normalerweise das Verknüpfen einer Komponente eines spezifischen Bindungspaars mit dem Hybridisierungspartner. Zu nützlichen Bindungspaaren, aus denen gewählt werden kann, gehören Biotin/Avidin (einschließlich Eiweiß-Avidin und Streptavidin), Haptene (oder Antigene) /Antikörper, Carbohydrate/Lectine, Enzyme/Inhibitoren und ähnliches. Besteht das Bindungspaar aus einer Proteinkomponente und einer Nicht-Proteinkomponente, so wird normalerweise bevorzugt die Nicht-Proteinkomponente an den Hybridisierungspartner geknüpft, da die Proteinkomponente unter den denaturierenden Bedingungen der Hybridisierung instabil sein kann. Bevorzugte Systeme umfassen die Verknüpfung des Hybridisierungspartners mit Biotin oder einem Hapten und die Verwendung eines immobilisierten Avidin- bzw. eines Anti- Hapten-Antikörper-Reagenz.
Wird der Hybridisierungspartner in die Hybridisierungsreaktion in einer immobilisierbaren Form eingebracht, so können die nachfolgenden Schritte der Immobilisierung der gebildeten Duplices und der Zugabe des Fehlpaarungen bindenden Proteins und der Detektionsreagenzien in jeglicher gewünschten Reihenfolge vonstatten gehen. Die Immobilisierung und Zugabe des Fehlpaarungen bindenden Proteins und der anderen Reagenzien kann mittels gleichzeitiger Zugabe der erforderlichen Reagenzien und Stoffe, mittels aufeinanderfolgender Zugabe mit oder ohne dazwischenliegenden Wasch- und Trennschritten in der einen oder anderen Reihenfolge vorgenommen werden. Wo aufeinanderfolgende Zugaben befolgt werden, sollten natürlich die Konzentrationen der zugegeben Reagenzien berücksichtigt werden, um die gebildeten Hybride nicht zu übersättigen und die Wechselwirkung mit dem Fehlpaarungen bindenden Protein und den Detektionsreagenzien nicht zu hemmen.
Ein bevorzugtes Fehlpaarungen bindendes Protein ist durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, an die fehlgepaarten DNS-DNS- (oder DNS-RNS- oder RNS-RNS-)-Basenpaar-Hybride zu binden, die zwischen dem Hybridisierungspartner und der komplementären Ziel-Nucleinsäure-Probe gebildet wurden, um die einzelsträngigen Polynucleotide oder korrekt gepaarten Hybride im wesentlichen auszuschließen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das intakte, native MutS Protein von E. coli verwendet. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Fehlpaarungen bindendes Protein" ein funktionales Derivat des intakten, nativen Proteins umfassen. Mit "funktionalem Derivat" ist ein "Fragment", "Variante", "Analog" oder "chemisches Derivat" des Proteins gemeint, welches die Fähigkeit zum Binden an ein fehlgepaartes Nucleinsäure- Heteroduplex gemäß der vorliegenden Erfindung beibehalten hat.
Ein "Fragment" eines Fehlpaarungen bindenden Proteins bezieht sich auf jegliches Subset des Moleküls, d.h. ein kürzeres Peptid. Eine "Variante" des Proteins bezieht sich auf ein Molekül, das entweder dem Gesamtprotein oder einem DNS- Hybrid-bindenden Fragment davon im wesentlichen gleich ist. Eine Variante des Fehlpaarungen bindenden Proteins von beispielsweise MutS kann mittels der im Fachbereich wohlbekannten rekombinanten DNS-Methoden präpariert werden.
Ein bevorzugtes funktionales Derivat von MutS ist ein Homolog des E. coli MutS in einer anderen Bakterienspezies, zum Beispiel das MutS Protein von Salmonella typhimunum (Lu, A.L. et al., supra; Habet, L.T. et al., supra; Pang, P.P. et al., supra) oder das hexA Protein von Streptococcus pneumoniae (Priebe, S.D. et al., supra; Haber et al., supra). Außerdem können auch mögliche eukaryontische Homologe von MutS oder hexa verwendet werden, zum Beispiel jene, die durch die in Mensch-, Maus- oder Hamster-DNS identifizierten homologen Sequenzen codiert sind (Shimada, T. et al., J. Biol. Chem. 264:20171 (1989); Linton, J. et al., Molec. Cell. Biol. 7:3058-3072 (1989); Fuji, H. et al., J. Biol. Chem. 264:10057 (1989)).
Ein "chemisches Derivat" des Fehlpaarungen bindenden Proteins enthält zusätzliche chemische Komponenten, die normalerweise nicht Teil des Proteins sind, einschließlich zusätzlicher Aminosäure-Strecken wie bei einem Fusionsprotein. Kovalente Modifikationen des Peptids fallen in den Schutzumfang dieser Erfindung. Solche Modifikationen können in das Molekül durch Umsetzen der angezielten Aminosäure-Reste des Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das zum Reagieren mit ausgewählten Seitenketten oder endständigen Restgruppen fähig ist, eingeführt werden. Beispiele für eine derartige Derivatisierung ist eine Hapten-Modifikation, bei der eine Haptengruppe, zum Beispiel Trinitrophenyl oder ähnliches, an das Protein konjugiert wird und als das Ziel eines detektierbar markierten bindenden Partners für Detektionszwecke dient. Alternativ dazu kann das Protein durch Konjugation von Biotingruppen modifiziert und detektierbar markiertes Avidin oder Streptavidin als der bindende Partner für Detektionszwecke verwendet werden.
Ein bevorzugtes chemisches Derivat des Fehlpaarungen bindenden Proteins ist ein Fusionsprotein aus dem Fehlpaarungen bindenden Protein und einem anderen Protein (dem "Fusionsprotein-Partner"), wobei das andere Protein ein strukturelles oder funktionales Merkmal bereitstellt, das es zur Detektion der Bindung nützlich macht. So kann beispielsweise der Fusionsprotein-Partner Antigen-Stellen beisteuern an die ein Antikörper zu Detektionszwecken binden kann. Ein Fusionsprotein aus dem Fehlpaarungen bindenden Protein oder funktionalem Derivat und einem Enzym kann eine direktere Detektionsmethode beispielsweise dank der Fähigkeit des Enzymanteils des Fusionsproteins ermöglichen, die Bildung eines farbigen Reaktionsprodukts aus einem chromogenen Substrat zu katalysieren, wie im Fachbereich wohlbekannt.
Ein bevorzugtes Fusionsprotein besteht aus MutS oder einem funktionalen Derivat und dem Enzym β-Galactosidase. Bei dieser Ausführungsform kann das Vorhandensein der an den festen Träger gebundenen β-Galactosidase unter Verwendung eines chromogenen Substrats für dieses Enzym detektiert werden. Ein Beispiel eines solchen Substrats ist NABG (Naphthol-AS-B1-β-d-Galactopyranosid).
Ein Fusionsprotein-Derivat des Fehlpaarungen bindenden Proteins kann unter Anwendung im Fachbereich wohlbekannter Verfahren präpariert werden (siehe zum Beispiel Sambrook, J. et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Die Auswahl eines für die Verfahren des vorliegenden Assays zweckmäßigen Proteins kann von einem Fachmann des Bereichs bei üblicher Sachkenntnis unter Anwendung herkömmlicher Verfahren vorgenommen werden. So kann beispielsweise zur Auswertung einer Ouelle auf das Vorhandensein eines Fehlpaarungen bindenden Proteins, das bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist, ein Assay auf Fehlpaarungs-Bindung durchgeführt werden, wie zum Beispiel beschrieben für MutS von Jiricny et al.. Vorzugsweise wird ein Filterbindungs- Assay eingesetzt. Um das Oligonucleotid-Heteroduplex zu präparieren, wird ein Oligonucleotid von vorzugsweise etwa 16 Basen mit ³²P mittels einer Kinase-Reaktion und Gamma-³²P-- ATP unter Anwendung einer Kinase, zum Beispiel T4-Polynucleotid-Kinase, markiert. Das 5'-markierte Oligonucleotid (welches bei -20ºC gelagert werden kann) wird dann mit eine komplementären Oligonucleotid, das eine Einzelbasen-Fehlpaarung aufweist, unter standardmäßigen Bedingungen aneliert. Das anelierte Heteroduplex mit 16 Basenpaaren wird mit einer Überschußmenge des zu testenden Proteins gemischt und 30 Minuten lang auf Eis gelagert. Das Gemisch wird dann auf ein Nitrocellulose-Filter aufgebracht, das zuvor im Assay-Puffer befeuchtet worden war. Über mehrere Sekunden hinweg wird ein leichter Sog angelegt und das Filter dann mit eiskaltem Assay-Puffer ausführlich gewaschen. Das Filter wird nun an der Luft getrocknet, in Szintillationsflüssigkeit suspendiert und ausgezählt. Dank des am Filter haftenden Proteins können jegliche Zählungen auf dem Filter einer Bindung an das mutmaßliche Fehlpaarungen bindende Protein zugeschrieben werden. Bei Abwesenheit eines solchen Proteins tritt das markierte Oligonucleotid-Heteroduplex durch das Filter durch. Es kann also unter Verwendung eines solch einfachen Assays ein für die Verfahren der vorliegenden Erfindung zweckmäßiges Fehlpaarungen bindendes Protein leicht detektiert und ausgewählt werden.
Wie im Fachbereich bekannt, können beim Verfahren der vorliegenden Erfindung verschiedene Hybridisierungsbedingungen angewandt werden. Gewöhnlich läuft die Hybridisierung bei leicht erhöhten Temperaturen, z.B. bei etwa 35ºC bis 75ºC und üblicherweise um 65ºC, in einer Lösung ab, die einen Puffer bei pH-Wert etwa 6 bis 8 und eine geeignete Ionenstärke aufweist (z.B. 2X SSC, wobei 1X SSC = 0,15 M Natriumchlorid und 0,015 M Natriuncitrat, pH 7,0), Protein, zum Beispiel Rinderserumalbumin, Ficoll (ein Warenname, der ein Copolymer von Sucrose und Epichlorhydrin bezeichnet, vertrieben durch Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), Polyvinylpyrrolidon und eine denaturierte Fremd-DNS, zum Beispiel aus Kälberthymus oder Lachssperma. Der Grad der Komplementarität zwischen der Probe und den Hybridisierungspartner-Strängen, der zum Ablaufen der Hybridisierung erforderlich ist, hängt von der Schärfe der Bedingungen ab. Der Umfang und die Spezifität der Hybridisierung wird durch die folgenden Hauptbedingungen beeinflußt:
1. Reinheit der Nucleinsäure-Präparation.
2. Gehalt an G-C-Basenpaaren: G-C-Basenpaare zeigen eine größere Wärmestabilität als A-T- oder A-U-Basenpaare. Daher sind Hybride mit höherem G-C-Gehalt bei höheren Temperaturen stabil.
3. Länge der homologen Basensequenz: Jegliche kurze Basensequenz von z.B. weniger als 6 Basen widerholt sich mit hoher Wahrscheinlichkeit in vielen Nucleinsäuren. Bei Hybridisierungen, die solche kurzen Sequenzen umfassen, kann wenig oder keine Spezifität erreicht werden. Die vorliegende Hybridisierungspartner-Sequenz umfaßt vorzugsweise mindestens etwa 30 Basen und bis zu etwa 100 Basen bei einem Oligonucleotid, und bei einem cDNS- Molekül sogar noch mehr.
4. Ionenstärke: Die Rate der Reanelierungen steigt mit der lonenstärke der Inkubationslösung. Die Wärmestabilität der Hybride steigt ebenfalls.
5. Inkubationstemperatur: Eine optimale Reanelierung findet bei einer Temperatur von etwa 25-30ºC unter der Schmelztemperatur (Tm) eines gegebenen Duplex statt. Eine Inkubation bei Temperaturen, die signifikant unter dem Optimum liegen, führt dazu, daß eine geringere Menge an miteinander verwandten Basensequenzen hybridisieren.
6. Nucleinsäure-Konzentration und Inkubationszeit: Um die Reaktion bis zur Hybridisierung voranzutreiben, liegt normalerweise entweder die hybridisierbare Nucleinsäure- Probe oder die Hybridisierungspartner-Nucleinsäure im Überschuß, nämlich üblicherweise einem 100fachen oder mehr, vor.
7. Denaturierende Reagenzien: Das Vorhandensein Wasserstoffbrücken-zerstörender Agenzien, zum Beispiel Formamid und Harnstoff, erhöht die Schärfe der hybridisierung.
8. Inkubationszeit: Je länger die Inkubationszeit, desto vollständiger die Hybridisierung.
9. Volumenausschlußmittel: Das Vorhandensein dieser Agenzien, wie durch Dextran und Dextransulfat veranschaulicht, dient der Erhöhung der effektiven Konzentrationen der hybridisierenden Elemente, wodurch die Rate der resultierenden Hybridisierung erhöht wird.
Normalerweise sind die für die Hybridisierung gewählten Temperaturbedingungen inkompatibel mit der Bindung des Fehlpaarungen bindenden Proteins an die gebildeten Hybride oder der Antikörper oder anderen bindenden Partner an das Fehlpaarungen bindende Protein. Dementsprechend laufen die Schritte der Bindung und der markierten Detektion von Fehlpaarungen bindendem Protein und Bindungspartner-Reagenz nach Abschluß des Hybridisierungsschritts ab. Das Reaktionsgemisch wird üblicherweise auf eine Temperatur im Bereich von etwa 3ºC bis etwa 40ºC gebracht und daraufhin die Bindung des Fehlpaarungen bindenden Proteins und des zusätzlichen Reagenz und die Detektionsschritte vorgenommen.
Bei einem bestimmten Assay unter Verwendung eines RNS- Hybridisierungspartners steht zu erwarten, daß die RNS einem teilweisen Abbau durch alkalische Hydrolyse der Phosphodiester-Bindungen oder durch Vorhandensein von Ribonudeasen (RNasen) unterworfen sein wird. In ersterem Fall kann die Hydrolyse kontrolliert werden, indem es vermieden wird, den Hybridisierungspartner einem pH-Wert von mehr als etwa 10 auszusetzen. RNasen lassen sich durch das Vorhandensein solcher Substanzen wie Natriumdodecylsulfat, Aurintricarboxylsäure, Ribonucleosidvanadyl-Komplexe, Heparindiethylpyrocarbonat und proteinartige, aus Säugetier-Quellen isolierte Rnase-Inhibitoren, wirksam hemmen.
Ein an das Hybrid aus Hybridisierungspartner und Ziel- Polynucleotid (DNS-DNS, DNS-RNS oder RNS-RNS) gebundenes fehlpaarungen bindendes Protein kann entweder direkt oder indirekt detektiert werden (siehe Abbildung 2). Mit direkter Detektion ist die Markierung des Fehlpaarungen bindenden Proteins mit einer detektierbaren Markierung gemeint, zum Beispiel mit radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Markierungen, konjugierten Enzymen oder ähnlichem, die nachfolgend ausführlicher oder alternativ dazu oben beschrieben sind. Das Fehlpaarungen bindende Protein kann mittels rekombinanter DNS-Methoden als ein Fusionsprotein mit einem Fusionspartner hergestellt werden, der leicht detektierbar ist. Es ist wichtig, daß das Fusionsprotein, ebenso wie ein detektierbar markiertes oder konjugiertes Fehlpaarungen bindendes Protein, die Reaktivität und Bindungsspezifität des nativen, unmodifizierten Fehlpaarungen bindenden Proteins beibehält. Diese Reaktivität und Spezifität kann durch einen Fachmann des Bereichs bei üblicher Sachkenntnis mittels routinemäßiger Untersuchung, zum Beispiel mit hierin beschriebenem Assay, ermittelt werden.
Mit indirekter Detektion ist ein Verfahren gemeint, welches von einem bindenden Partner Gebrauch macht, der entweder für das Fehlpaarungen bindende Protein, für eine an das Fehlpaarungen bindende Protein konjugierte Komponente oder für einen Fusionsprotein-Partner des Fehlpaarungen bindenden Proteins spezifisch ist. Ist MutS das Fehlpaarungen bindende Protein, so ist ein bevorzugter bindender Partner ein Anti-MutS- Antikörper (oder ein Antigen-bindendes Fragment davon).
Jegliches der beim Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Antikörper-Reagenzien kann ganze Antikörper, Antikörper-Fragmente, polyfunktionale Antikörper-Aggregate oder allgemein jegliche Substanz umfassen, die ein oder mehrere spezifische Bindestellen von einem Antikörper enthält. Der Antikörper kann von beliebigem Immunglobulin- Isotyp sein, z.B. IgG, IgM und so weiter. Auch kann jedes beliebige Antigen bindende Fragment eines jeglichen dieser Antikörper verwendet werden, zum Beispiel die Fab'- oder F(ab')&sub2;-Fragmente. Außerdem könnenc wo geeignet, Aggregate, Polymere, Derivate und Konjugate der Immunglobuline oder deren Fragmente verwendet werden.
Die Immunglobulin-Quelle für ein Antikörper-Reagenz kann auf jede beliebige Weise erhalten werden, zum Beispiel durch Präparation eines herkömmlichen polyklonalen Antiserums oder durch Präparation eines monoklonalen oder eines Chimären- Antikörpers. Das Antiserum kann mittels wohlbekannter Methoden erhalten werden, die die Immunisierung eines Tieres, z.B. Maus, Kaninchen, Meerschweinchen oder Ziege, mit einem geeigneten Immunogen, z.B. dem MutS Protein, umfassen.
Alternativ dazu kann der bindende Partner auch ein für den Fusionsprotein-Partner spezifischer Antikörper sein, zum Beispiel β-Galactosidase, der mit einem Fehlpaarungen bindenden Protein fusioniert ist. Außerdem kann ein für eine Hapten-Gruppe, die an das Fehlpaarungen bindende Protein- Molekül konjugiert ist, spezifischer Antikörper verwendet werden. Ein anderer bindender Partner kann in Avidin oder Streptavidin bestehen, wenn das Fehlpaarungen bindende Protein durch Zugabe von Biotin modifiziert wurde. Bei noch einer weiteren Ausführungsform kann der bindende Partner ein Nicht-Immunglobulin-Protein sein, welches die Eigenschaft aufweist, an ein Immunglobulin-Molekül zu binden, zum Beispiel Staphylococcen-Protein A oder Streptococcen-Protein G, die im Fachbereich wohlbekannt sind. Der bindende Partner kann entweder selbst detektierbar markiert sein oder kann mittels eines detektierbar markierten Sekundär-Bindungspartners indirekt detektiert werden, zum Beispiel eines für den ersten Antikörper spezifischen zweiten Antikörpers. Dient also ein Kaninchen-Anti-Fehlpaarungen-bindender-Protein- Antikörper als der erste bindende Partner, so wäre markierter Ziege-Anti-Kaninchen-Immunglobulin-Antikörper der zweite bindende Partner. Bei einer weiteren Ausführungsform wird ein Signal, das durch Vorhandensein des Fusionsprotein-Partners des Fehlpaarungen bindenden Proteins erzeugt wird, durch reaktion mit einem spezifischen Antikörper für dieses Fusionsprotein (z.B. ein Anti-β-Galactosidase-Antikörper), welcher detektierbar markiert ist, amplifiziert. Ein Fachmann des Bereichs kann mit der üblichen Sachkenntnis eine Reihe solcher möglicher Systeme aus erstem und zweitem bindenden Partner ohne unnötiges Experimentieren unter Anwendung herkömmlicher, im Fachbereich wohlbekannter Verfahren finden.
Bei wiederum einer weiteren Ausführungsform kann der bindende Partner das MutL Protein sein (Grilley, M. et al., J. Biol. Chem. 264:1000-1004 (1989); Modrich, P., 1989, supra; Lahue, et al., 1989, supra), das aus E. coli , S. typhimunum oder einer anderen Quelle erhalten wurde, oder ein funktionales Derivat davon. Ein bevorzugtes funktionales Derivat ist ein Fusionsprotein aus MutL und einem zweiten Fusionsprotein- Partner, der leicht detektierbar ist, zum Beispiel β- Galactosidase. Vom gereinigten MutL Protein, das ein Molekulargewicht von 90 kDa besitzt, ist bekannt, daß es selektiv an den Komplex aus MutS und einem Nucleinsäure Heteroduplex in Gegenwart von ATP bindet. MutL bindet weder direkt an einen Fehlpaarungen enthaltenden Heteroduplex noch an freie MutS. Das MutL Protein wurde geklont und in Bakterien exprimiert (Pang et al supra). Daher wird zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung das MutL Protein oder funktionale Derivat, vorzugsweise in detektierbar markierter Form, dem Mutations-Detektionsassay in Gegenwart von ATP zugegeben. Das gebundene MutL wird dann detektiert. Alternativ dazu kann ein unmarkiertes MutL als der erste bindende Partner verwendet werden, gefolgt von einem markierten zweiten bindenden Partner, welcher an Mutibindet, oder von einem unmarkierten zweiten bindenden Partner, gefolgt von einem detektierbar markierten dritten bindenden Partner, wie oben erörtert. Wie oben bei den MutS bindenden Partnern beschrieben, kann ein zweiter bindender Partner für MutL ein für MutL spezifischer Antikörper sein, ein für ein an MutL konjugiertes Hapten spezifischer Antikörper, Avidin oder Streptavidin, wenn Biotin an MutL konjugiert ist, ein antikörper für den Fusionsprotein-Partner von MutL und ähnliches.
Ist der erste und zweite oben beschriebene bindende Partner ein Antikörper, so kann die Detektion unter Verwendung eines beliebigen von vielfältigen herkömmlichen Immunoassays vorgenommen werden, einschließlich Enzymimmunoassay (EIA) (Voller, A., Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller, A. et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); US-Patent- Wiederausgabe Nr. 31.006; UK-Patentschrift 2.019.408; Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (Hsg.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980) oder Radioimmunoassays (RIA) (Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986, pp. 1-5, 46-49 und 68-78).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein MutS- spezifischer Antikörper oder Antikörper-Fragment durch Verknüpfen desselben mit einem Enzym detektierbar markiert und bei einem EIA oder einem 'enzyme-linked immunosorbent assay' (ELISA) verwendet. Dieses Enzym wiederum läßt man später in solcher Weise auf ein Substrat einwirken, daß eine beispielsweise mittels Spektrophotometrie, Fluorometrie oder, am bevorzugtesten, mittels visueller Methoden detektierbare chemische Komponente erzeugt wird. Vorzugsweise ist das Sustrat ein chromogenes Substrat, welches ein mit bloβem Auge erkennbares Reaktionsprodukt erzeugt.
Enzyme, die zur detektierbaren Markierung des bindenden Partners für das Fehlpaarungen bindende Protein, zum Beispiel MutS-spezifische Antikörper, verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Staphylococcen-Nuclease, delta-V-Steroidisomerase, Hefealkoholdehydrogenase, alpha-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Asparaginase, Ribonudease, Urease, Catalase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase.
Durch radioaktive Markierung des bindenden Partners, zum Beispiel des Mut-spezifischen Antikörpers, ist die Detektion des an einen festen Trägers gebundenen MutS durch Verwenden eines Radioimmunoassays (RIA) möglich. Das radioaktive Isotop kann anhand von Methoden wie der Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder mittels Autoradiographie detektiert werden. Zu Isotopen, die für den Zweck der vorliegenden Erfindung besonders nützlich sind, gehören: ³H, ¹³¹I, ³&sup5;S, ¹&sup4;C und bevorzugt ¹²&sup5;I.
Es ist auch möglich, den ersten oder zweiten bindenden Partner mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wird der fluoreszent markierte Antikörper einem Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt, so kann sein Vorhandensein aufgrund von Fluoreszenz detektiert werden. Zu den am häufigsten verwendeten fluoreszent markierten Verbindungen zählen Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Auch kann der erste oder zweite bindende Partner detektierbar markiert werden, indem er an eine chemilumineszierende Verbindung gekoppelt wird. Das Vorhandensein des chemilumineszierend markierten Antikörpers wird dann durch Detektieren des Vorhandenseins von Lumineszenz bestimmt, die während des Ablaufs einer chemischen Reaktion zeigt. Zu Beispielen besonders nützlicher chemilumineszierend markierter Verbindungen zählen Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridinium-Salz und Oxalatester.
Entsprechend kann eine biolumineszierende Verbindung zur Markierung des ersten oder zweiten bindenden Partners verwendet werden. Bioluminszenz ist eine Art von Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen zu finden ist, bei denen ein katalytisches Enzym die Wirksamkeit der chemilumineszierenden Reaktion erhöht. Das Vorhandensein eines biolumineszierenden Proteins wird durch Detektieren des Vorhandenseins der Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszierende Verbindungen für Markierungszwecke sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Die zu untersuchende Testprobe kann jedes beliebige Medium von Interesse sein und besteht im allgemeinen in einer Probe von medizinischer, veterinärmedizinischer, ökologischer, diätetischer oder industrieller Signifikanz. Besonders Proben und Körperflüssigkeiten von Menschen und Tieren können mittels des vorliegenden Verfahrens untersucht werden, vorausgesetzt, sie enthalten Zellen, aus denen sich Nucleinsäuren präparieren lassen. Zu bevorzugten Quellen gehören Blut, Sperma, anderes Gewebe, Milch, Urin, Hirnflüssigkeit, Auswurf, Stuhl, Lungenaspirate, Halsabstriche, Genitalabstriche und Exsudate, Rektalabstriche und nasopharyngeale Aspirate.
Enthält die Probe hauptsächlich doppelsträngige Nucleinsäure, wie etwa die in Zellen natürlich vorkommende DNS, so wird die Probe zunächst zur Freisetzung der Nucleinsäure aus der Zelle behandelt, was erzielt werden kann durch mechanischen Aufschluß (zum Beispiel Einfrieren/Auftauen, Abrieb, Beschallung), physikalischen/chemischen Aufschluß, zum Beispiel Behandlung mit Detergentien (z.B. Triton, Tween oder Natriumdodecylsulfat), osmotischen Schock, Wärme oder enzymatische Lyse (Lysozym, Proteinase K, Pepsin etc.)
Gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann die freigesetzte dsDNS einer Spaltung durch Restriktionsendonudease-Enzyme unterzogen werden, um Fragmente der geeigneten Länge für den Assay zu erhalten, die die gewünschte Sequenz enthalten. Die Wahl der Restriktionsenzyme hängt von der gewünschten Zielsequenz und dem Vorhandensein der entsprechenden Restriktionsenzym-Erkennungsstellen auf jeder der beiden Seiten dieser Sequenz ab. Ein Fachmann des Bereichs wird mit der üblichen Sachkenntnis in der Lage sein, die Stelle zu identifizieren und die Enzyme ohne unnötiges Experimentieren auszuwählen. Siehe zum Beispiel Sambrook, H et al., supra.
Der Verdauung durch Restriktionsenzyme folgend wird bevorzugt die Denaturierung der Nucleinsäuren durch Erhitzen in kochendem Wasser oder durch Alkalibehandlung (z.B. 0,1 N Natriumhydroxid) vorgenommen. Das resultierende Testmedium enthält Nucleinsäuren in einzelsträngiger Form, die dann gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung untersucht werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren und Sets zur Detektion bestimmter Mutationen beim Menschen bereit. Untenstehende Tabelle 1 zeigt eine nicht-beschränkende Liste von Mutationen beim Menschen, die unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung detektiert werden können. Siehe auch Cooper, D.N. et al., Hum. Genet. 85:55-74 (1990). TABELLE 1 PUNK-MUTATIONEN VERURSACHEND HUMANGENETISCHE ERKRANKUNGEN Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)
Abkürzungen:
ADA- Adenosin-Deminase; AJHG - Am. J. Hum. Genet.; Apo- Apolipoprotein; APRT - Adenosinphosphoribosyltransferase; Atrophy - Atrophie; BBRC - Biochem. Biopys. Res. Comm. ; CD - Kodon (Codon); Def. - Mangel (Deficiency); Desease - Krankheit; G6PD - Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase; HPRT- Hypoxanthinphosphoribosyltransferase; imperf. - Mangel (imperfection); JBC - J. Biol. Chem; JCI - J. Clin. Invest.; JCBS - J. Cell. Biol. (Suppl.); J Nchem - J. Neurochem. ; LDLR - Lipoprotein niedriger Dichte Rezeptor (Low density lipoprotein receptor); MBM - Mol. Biol. Med.; MODY - Altersdiabetis in der Jugend (Maturity-onset diabetes of the young); NAR - Nucl. Acids. Res.; NEJM - New Eng. J. Med.; NIDDM - Nicht-Insulin-abhängige Diabetes mellitus (Non insulin dependent diabetis mellitus); OTC - Ornithin-Transcarbamylase; PNAS - Proc. Natl. Acad. Sci. USA; PNP - Purin Nucleosid Phosphorylase; TPI - Triosephosphat Isomerase; TSH - Thyrid stimuliertes Hormon; type - Typ
Die Erfindung betrifft ferner ein Set oder ein Reagenzsystem, das zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens geeignet ist. Ein solches Set enthält eine Reagenzkombination, die die wesentlichen Elemente umfaßt, die zur Durchführung eines Tests durch die hier offenbarten Verfahren erforderlich sind. Das Reagenzsystem wird in einer handelsüblich abgepackten Form angeboten, als Zusammensetzung oder Gemisch, in der die Kompatibilität der Reagenzien eine Testvorrichtungsanordnung oder typischer ein Testset zuläßt, d.h. eine abgepackte Kombination von einem oder mehreren Behältern, Vorrichtungen oder dergleichen, die die notwendigen Reagenzien beinhalten, und die im allgemeinen schriftliche Gebrauchsanweisungen zur Durchführung der Tests einschließt. Das erfindungsgemäße Set kann beliebige Anordnungen und Zusammensetzungen zur Durchführung der hier beschriebenen Testabläufe umfassen.
In allen Fällen umfaßt das Reagenzsystem (1) einen immobilisierbaren oder immobilisierten Hybridisierungspartner, wie er hier beschrieben ist, und (2) ein Fehlpaarungen bindendes Protein oder ein funktionelles Derivat. Das Fehlpaarungen bindende Protein kann gegebenenfalls detektierbar markiert sein. Das Set kann gegebenenfalls einen ersten bindenden Partner für das Fehlpaarungen bindende Protein enthalten, z.B. einen Anti-MutS-Antikörper, ein MutL-Protein oder ein funktionelles Derivat, und beliebige zusätzliche bindende Partner oder detektierbare Markierungsreagenzien. Ein erfindungsgemäßes Set kann zudem Hilfschemikalien umfassen, wie die Komponenten der Hybridisierungslösung, ein Denatune rungsmittel, das in der Lage ist, die doppelsträngigen Nucleinsäuren in einer Testprobe in die einzelsträngige Form umzuwandeln, oder Restriktionsenzyme zur Herstellung von Fragmenten der Proben-Nucleinsäure.
Nach der allgemeinen Beschreibung die Erfindung, wird diese besser verstanden, indem die folgenden Beispiele betrachtet werden, die zur Erläuterung vorgesehen und nicht als Einschränkung der Erfindung gedacht sind.

Beispiel 1

TEST EINER PROBE AUS BLUT AUF EINE MUTIERTE DNS-SEOUENZ

Der Testablauf ist in Figur 3 allgemein beschrieben. Die Proben-DNS wird aus Blutzellen gewonnen, die auf das Vorhan densein einer bestimmten Mutation getestet werden, die sich vom wildtyp durch ein einziges Basenpaar oder durch Addition oder Deletion von einem oder wenigen Basenpaaren unterscheidet. Anschließend wird die DNS denaturiert, wonach sie für den Test einsatzbereit ist.
Ein Test-DNS-Hybridisierungspartner von etwa 30 Nucleotiden wird so konstruiert, daß er eine Sequenz aufweist, die der Wildtyp-Gensequenz um die Mutation von Interesse entspricht. Als positive Kontrolle für eine Fehlpaarung wird die Punkt mutation des Sichelzellenhämoglobins eingesetzt. Es wird ein Oligonucleotid mit der mutierten Sequenz (Exon 10) hergestellt. Als negative Kontrolle für den Test wird ein Oligonucleotid, das bekanntermaßen die Wildtyp-Sequenz aufweist, die Wildtyp-Humanhämoglobinsequenz von Exon 10, hergestellt.
Die Hybridisierungspartner-DNS wird folgendermaßen auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert:
(a) Test-Hybridisierungspartner-DNS in Form eines vertikalen Striches eines "Plus"-Zeichens.
(b) Die Positivkontrolle-DNS wird auf dem Filter in Form eines horizontalen Elementes desselben "Plus"-Zeichens immobilisiert.
(c) Die Negativkontrolle-DNS wird auf das Filter in Form eines Tupf ens in der Nähe des "Plus"-Zeichens aufgebracht.
Die Filter werden zur Fixierung der Oligonualeotide und zur Blockierung sämtlicher nichtumgesetzter Stellen unter Anwendung herkömmlicher Methoden behandelt, um eine nichtspezifische Bindung von DNS und Proteinen während des Test zu verhindern (Sambrook et al., supra).
Die Proben-DNS wird in einer Konzentration zwischen 10 und 100 µg/ml zugesetzt, und die Hybridisierungsreaktion wird bei 45-55 ºC in 0,1-0,3 M NaCl ablaufen gelassen, was zu den geeigneten Restriktionsfragmenten führt, die an die drei Oligonucleotidfragmente binden.
Das Filter wird gewaschen, und MutS wird auf das Filter aufgegeben und binden gelassen, und das Filter wird nochmals gewaschen.
Polyklonale Kaninchen-Anti-MutS-Antikörper werden auf das Filter aufgegeben, binden gelassen, und die ungebundenen Antikörper werden abgewaschen.
Anschließend wird ein konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen- Immunglobulinantikörper gegen Meerrettichperoxidase zugesetzt, binden gelassen, und ungebundener Antikörper wird abgewaschen.
Ein chromogenes Substrat für Meerrettichperoxidase wird zugegeben, und die Farbreaktion wird sich entwickeln gelassen, bis ein farbiger Strich (oder das "Plus"-Zeichen) auftritt, wonach die Reaktion gestoppt wird.
Die Ergebnisse sehen wie folgt aus:
A. Für eine Probe ohne die Punktmutation in der DNS (ein Negativ):
(1) Der Tupfen (Negativkontrolle-Hybridisierungspartner) ist nicht sichtbar, was ein Hinweis ist darauf, daß der Test nicht falsch positiv war.
(2) Nur der horizontale Strich ist sichtbar. Da der Proband vermutlich ein normales Hb-Gen besitzt und der Positivkontrolle-Oligonucleotid-Hybridisierungspartner die mutierte Sequenz aufwies, trat eine Reaktion ein.
(3) Somit erscheint auf dem Filter ein farbiges "Minus"- Zeichen, was ein Hinweis ist auf ein negatives Ergebnis in dem Test auf mutierte DNS in der Probe.
B. Für eine Probe mit der Punktmutation in der DNS (ein Positiv):
(1) Der Tupfen (Negativkontrolle-Hybridisierungspartner) ist nicht sichtbar, was ein Hinweis darauf ist, daß der Test nicht falsch positiv war.
(2) Ein "Plus"-Zeichen ist sichtbar. Der horizontale Strich ist sichtbar, da der Proband vermutlich ein normales Hb-Gen aufweist und der Positivkontrolle-oligonucleotid- Hybridisierungspartner die mutierte Sequenz aufwies, was zu einer Reaktion führte. Da die DNS von dieser Probe eine Punktmutation in der Ziel-DNS-Sequenz aufweist, ergibt der vertikale Strich des "Plus"-Zeichens ein farbiges Reaktionsprodukt.

Beispiel II

TEST AUF EINE MUTIERTE DNS-SEQUENZ UNTER VERWENDUNG EINES MutL BINDENDEN PARTNERS

Der allgemeine Testablauf entspricht demjenigen, der in Beispiel I beschrieben wurde. Die Proben-DNS wird aus Blutzellen gewonnen, die auf das Vorhandensein einer bestimmten Mutation getestet werden, die sich vom Wildtyp durch ein einziges Basenpaar oder durch eine Addition oder Deletion von einem oder wenigen Basenpaaren unterscheidet. Anschließend wird die DNS denaturiert, wonach sie für den Test einsatzbereit ist.
Ein Test-DNS-Hybridisierungspartner von etwa 30 Nucleotiden wird so konstruiert, daß er eine Sequenz aufweist, die der Wildtyp-Gensequenz um die Mutation von Interesse entspricht. Als positive Kontrolle für eine Fehlpaarung wird die Punktmutation des Sichelzellenhämoglobins eingesetzt. Es wird ein Oligonucleotid mit der mutierten Sequenz (Exon 10) hergestellt. Als negative Kontrolle für den Test wird ein Oligonucleotid hergestellt, das bekanntermaßen die Wildtyp- Sequenz, die Wildtyp-Humanhämoglobinsequenz von Exon 10, aufweist.
Die Hybridisierungspartner-DNS wird folgendermaßen auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert:
(a) Die Test-Hybridisierungspartner-DNS in Form eines vertikalen Striches eines "Plus"-Zeichens.
(b) Die positivkontrolle-DNS wird auf dem Filter in Form eines horizontalen Elementes desselben "Plus"-Zeichens immobilisiert.
(c) Die Negativkontrolle-DNS wird auf das Filter in Form eines Tupfens in der Nähe des "Plus"-Zeichens aufgebracht.
Die Filter werden zur Fixierung der Oligonualeotide und zur Blockierung sämtlicher nicht umgesetzter Stellen unter Anwendung herkömmlicher Methoden behandelt, um eine nichtspezifische Bindung von DNS und Proteinen während des Tests zu verhindern (Sambrook et al., supra).
Die Proben-DNS wird in einer Konzentration zwischen 10 und 100 µg/ml zugesetzt, und die Hybridisierungsreaktion wird bei 45-55 ºC in 0,1-0,3 M NaCl ablaufen gelassen, was zu den geeigneten Restriktionsfragmenten führt, die die drei Oligonucleotidfragmente binden.
Das Filter wird gewaschen, und MutS wird auf das Filter aufgegeben und binden gelassen, und das Filter wird nochmals gewaschen.
Ein MutL-β-Galactosidase-Fusionsprotein wird als erster bindender Partner zugegeben und binden gelassen, und das ungebundene Material wird abgewaschen.
Der zweite bindende Partner, ein polyklonales Kaninchen-Anti- p-Galactosidase-Antiserum wird auf das Filter aufgegeben, binden gelassen, und die ungebundenen Antikörper werden abgewaschen.
Anschließend wird der dritte bindende Partner, ein konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulinantikörper gegen Meerrettichperoxidase, zugegeben, binden gelassen und ungebundener Antikörper abgewaschen.
Ein chromogenes Substrat für Meerrettichperoxidase wird zugesetzt, und die Farbreaktion wird sich entwickeln gelassen, bis eine farbiger Strich (oder ein "Plus"-Zeichen) auftritt, wonach die Reaktion gestoppt wird.
Die Ergebnisse sehen wie folgt aus:
A. Für eine Probe ohne die Punktmutation in der DNS (ein Negativ):
(1) Der Tupfen (Negativkontrolle-Hybridisierungspartner) ist nicht sichtbar, was ein Hinweis darauf ist, daß der Test nicht falsch positiv war.
(2) Nur der horizontale Strich ist sichtbar. Da der Proband vermutlich ein normales Hb-Gen besitzt und der Positivkontrolle-Oligonucleotid-Hybridisierungspartner die mutierte Sequenz aufwies, trat eine Reaktion ein.
(3) Somit erscheint auf dem Filter ein farbiges "Minus"-Zeichen, was ein Hinweis ist auf ein negatives Ergebnis in dem Test auf mutierte DNS in der Probe.
B. Für eine Probe mit der Punktmutation in der DNS (ein Positiv):
(1) Der Tupfen (Negativkontrolle-Hybridisierungspartner) ist nicht sichtbar, was ein Hinweis darauf ist, daß der Test nicht falsch positiv war.
(2) Ein "Plus"-Zeichen ist sichtbar. Da die DNS von dieser Probe eine Punktmutation in der Ziel-DNS-Sequenz aufweist, ergibt der vertikale Strich des "Plus"-Zeichen ein farbiges Reaktionsprodukt.

Beispiel III

DETEKTION EINES MUTIERTEN p53-ONKOGENS IN EINER GEWEBEPROBE

Das p53-Gen ist anscheinend ein Tumorsuppressor-Gen (Levine, A. et al., Nature 351:453-455 (1991)), in dem Mutation an zahlreichen Stellen zu einer Expression eines Tumors, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms, führen kann. Siehe beispielsweise auch Kinzler, K.W. et al., Science 251:1366-1370 (1991); Kern, SE. et al., Onkogene 6:131-136 (1991); Vogelstein, B., Nature 348:681-682 (1990); Baker, S.J. et al., Science 249:912-915 (1990).
Menschliche DNS wird aus Tumorgewebe isoliert. Die isolierte DNS wird unter Standardbedingungen geschert. Anschließend wird die DNS denaturiert, wonach sie testbereit ist.
Ein dem p53-Gen entsprechendes cDNS-Molekül wird durch die Standardmethoden hergestellt (Sambrook et al., supra) und dient als Hybridisierungspartner. Die Regionen, die die bekannten Mutationen beherbergen, können überall in der p53- Sequenz verstreut liegen.
Die Hybridisierungspartner-DNS wird folgendermaßen auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert (siehe Figur 3):
(a) Der Test-Hybridisierungspartner (p53-cDNS) wird in Form eines vertikalen Striches eines "Plus"-Zeichens aufgetüpfelt.
(b) Positivkontrolle-DNS wird auf dem Filter in Form eines horizontalen Elementes desselben "Plus"-Zeichens immobilisiert.
(c) Negativkontrolle-DNS wird auf das Filter in Form eines Tupfens in der Nähe des "Plus"-Zeichens aufgebracht.
Die Filter werden zur Fixierung der Hybridisierungspartner- Poly- oder -Oligonucleotide und zur Blockierung sämtlicher nichtumgesetzter Stellen behandelt, um eine nichtspezifische Bindung von DNS und Proteinen während des Tests zu verhindern.
Die Proben-DNS wird zugesetzt, und die Reaktion wird unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert (wie oben beschrieben), außer daß die Hybridisierungstemperatur 55-60 ºC beträgt, was zu den passenden DNS-Fragmenten führt, die an die drei Hybridisierungspartner-Poly- oder -Oligonucleotide binden.
Das Filter wird gewaschen, und MutL wird auf das Filter aufgegeben und binden gelassen, und das Filter wird nochmals gewaschen.
Polyklonale Kaninchen-Anti-MutS-Antikörper werden auf das Filter aufgegeben, binden gelassen, und ungebundener Antikörper wird abgewaschen.
Sodann wird ein konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulinantikörper gegen Meerrettichperoxidase zugesetzt, binden gelassen, und ungebundener Antikörper wird abgewaschen.
Ein chromogenes Substrat für die Meerrettichperoxidase wird zugesetzt, und die Farbreaktion wird sich entwickeln gelassen, bis ein farbiges "Minus"- oder "Plus"-Zeichen auftritt, wonach die Reaktion gestoppt wird.
Die Ergebnisse sehen wie folgt aus:
A. Für eine Probe ohne das mutierte p53-Onkogen:
(1) Der Tupfen (Negativkontrolle-Hybridisierungspartner) ist nicht sichtbar, was ein Hinweis darauf ist, daß der Test nicht falsch positiv war.
(2) Nur der horizontale Strich ist sichtbar. Da der Proband vermutlich eine nicht mutierte, zu der Positivkontrolle DNS komplementäre Sequenz aufweist und der Positivkontrolle-Oligonucleotid-Hybridisierungspartner eine mutierte Sequenz aufweist, tritt eine Reaktion ein.
(3) Somit erscheint auf dem Filter ein farbiges "Minus"-Zeichen, was ein Hinweis ist für ein negatives Ergebnis in dem Test auf ein mutiertes p53-Onkogen in der Proben-DNS.
B. Für eine Probe mit einem mutierten p53-Gen:
(1) Der Tupfen (Negativkontrolle-Hybridisierungspartner) ist nicht sichtbar, was ein Hinweis darauf ist, daß der Test nicht falsch positiv war.
(2) Ein "Plus"-Zeichen ist sichtbar. Der horizontale Strich ist sichtbar, da der Proband vermutlich ein normales Hb-Gen aufweist und der Positivkontrolle-Oligonucleotid- Hybridisierungspartner die mutierte Sequenz aufwies, was zu einer Reaktion führte. Da die DNS von dieser Probe wenigstens eine Punktmutation in der Ziel-DNS-Sequenz aufweist, ergibt der vertikale Strich des "Plus"-Zeichens ein farbiges Reaktionsprodukt.

Beispiel IV

DETEKTION DER EXPRESSION EINES MUTIERTEN p53-ONKOGENS

Menschliche mRNS wird durch die herkömmlichen Methoden (siehe Sambrook et al., supra) aus Tumorgewebe isoliert. Ein dem p53-Gen entsprechendes cDNS-Molekül wird durch Standardmethoden (Sambrook et al., supra) hergestellt und dient als Hybridisierungspartner. Das Testablauf ist allgemein in Figur 3 beschrieben.
Die Hybridisierungspartner-DNS wird folgendermaßen auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert:
(a) Der Test-Hybridisierungspartner (p53-DNS) wird in Form eines vertikalen Striches eines "Plus"-Zeichens aufgetüpfelt.
(b) Die Positivkontrolle-DNS umfaßt eine Oligonucleotid- Sequenz, die einem bekanntermaßen in dem Tumorgewebe exprimierten Gen entspricht, bei dem eine Base modifiziert ist. Diese DNS wird auf dem Filter in Form eines horizontalen Elementes desselben "Plus"-Zeichens immobilisiert.
(C) Negativkontrolle-DNS, die die Wildtyp-Sequenz des als positive Kontrolle eingesetzten Oligonucleotids umfaßt, wird in Form eines Tupfens in der Nähe des "Plus"-Zeichens auf das Filter aufgebracht.
Die Filter werden zur Fixierung der Hybridisierungspartner- Poly- oder -Oligonualeotide und zur Blockierung sämtlicher nichtumgesetzter Stellen behandelt, um eine nichtspezifische Bindung von Nualeinsäure und Proteinen während des Tests zu verhindern.
Die Proben-mRNS wird zugesetzt, und die Reaktion wird unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, was zu einer mRNS-Bindung an die drei Hybridisierungspartner-Poly- oder Hybridisierungspartner-Oligonucleotide führt.
Das Filter wird gewaschen, und MutS wird auf das Filter aufgegeben und binden gelassen, und das Filter wird nochmals gewaschen.
Polyklonale Kaninchen-Anti-MutS-Antikörper werden auf das Filter aufgegeben, binden gelassen und nicht gebundener Antikörper wird abgewaschen.
Anschließend wird ein konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen- Immunglobulinantikörper gegen Meerrettichperoxidase zugegeben, binden gelassen, und ungebundener Antikörper wird abgewaschen.
Ein chromogenes Substrat für Meerrettichperoxidase wird Zugesetzt, und die Farbreaktion wird sich entwickeln gelassen, bis ein farbiges "Minus"- oder "Plus"-Zeichen auftritt, wonach die Reaktion gestoppt wird.
Die Ergebnisse sehen wie folgt aus:
A. Für eine Probe, in der das Wildtyp-p53-Gen exprimiert wird:
(1) Der Tupfen (Negativkontrolle-Hybridisierungspartner) ist nicht sichtbar, was ein Hinweis darauf ist, daß der Test nicht falsch positiv war.
(2) Nur der horizontale Strich ist sichtbar. Somit erscheint auf dem Filter ein farbiges "Minus"-Zeichen, was ein Hinweis ist auf ein negatives Ergebnis in dem Test auf die Expression eines mutierten p53-Onkogens in der Proben-mRNS.
B. Für eine Probe, in der ein mutiertes p53-Gen exprimiert wird:
(1) Der Tupfen (Negativkontrolle-Hybridisierungspartner) ist nicht sichtbar, was ein Hinweis darauf ist, daß der Test nicht falsch positiv war.
(2) Ein "Pluszeichen" ist sichtbar. Der horizontale Strich ist sichtbar, da der Proband vermutlich eine nichtmutierte, zu der Positivkontrolle-DNS komplementäre Sequenz aufweist und der Positivkontrolle-Oligonucleotid-Hybridisierungspartner eine mutierte Sequenz aufweist, tritt eine Reaktion ein. Da die mRNS von dieser Probe wenigstens eine Punktmutation in der Zielsequenz aufweist, ergibt der vertikale Strich des "Pluszeichens" ein farbiges Reaktionsprodukt.

Beispiel V

FEHLPAARUNGSDETEKTION DURCH mutS - PROTEIN MATERIALIEN UND METHODEN

Zellen.

1,2L (Lambda cI857 N' ΔH kil&supmin;) wurde zu einem mutS- Überproduktionsstamm gemacht, indem das mutS-exprimierende Plasmid pMS312 (Su und Modrich, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:5057, 1986) eingeschleust wurde.

Reinigung von mutS.

Das mutS-Reinigungsschema ist eine Abänderung des von Su und Modrich (ibid.) beschriebenen Schemas. 1,2L(pMS312)-Zellen wurden bei 30 ºC in 8 l 869-Medium (10 g/l Bactro-Trypton (Difco), 5 g/l Hefeextrakt (Difco), 5 g/l NaCl), das 50 µg/ml Ampicillin für eine OD&sub5;&sub9;&sub0; von 1,3-1,8 enthielt, angezogen. Die Kulturen wurden in 869-Medium, das auf 60 ºC vorgewärmt war, 1:2 verdünnt und 5 Stunden lang bei 42 ºC inkubiert. Die Kulturen wurden eisgekühlt, die Zellen durch Zentrifugieren geerntet und die Zellpaste bei -70 ºC aufbewahrt. Die Zelipaste (15-29 g) wurde auf Eis aufgetaut und die Zellen in einem gleichen Volumen von Puffer A (20 mM KPO&sub4;, pH 7,4, 1, mM EDTA, 1mM PMSF, 10 mM 2-Mercaptoethanol) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall in einem Eis-Aceton-Bad lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugieren (40 000g, 30 min) geklärt. Der Überstand wurde mit 1/4 Volumen 25 % (W/V) Streptomycinsulfat in Puffer A behandelt und 45 min lang bei 4 ºC gerührt. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren (40 000g, 30 min) entfernt. Ammoniumsulfat (0,2 g pro ml Überstand) wurde im Verlauf von 15 min zugegeben und der Überstand noch 40 min bei 4 ºC gerührt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren (40 000g, 30 min) gesammelt und in 10 ml Puffer A resuspendiert. 1-ml-Fraktionen wurden in Puffer B (20 mm KPO&sub4;, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mM 2-Mercaptoethanol), der 0,25 mM KCl enthielt, 1:10 resuspendiert und sofort mit 2 ml/min auf eine Heparin- Separose-Cl6B-Säule von 1,5 x 30 cm (Pharmacia) aufgegeben. Die Säule wurde mit 100 ml Puffer B gewaschen, der 0,1 M KCl enthielt, und mit 300 ml eines linearen KCl-Gradienten (0,1 bis 0,5 M) in Puffer B eluiert. Es wurden 100 3-ml-Fraktionen gesammelt. Die Probe wurden unter reduzierenden Bedingungen auf 4- bis 20%igen SDS-PAGE-Gelen laufen gelassen, und die Fraktionen, die über 95 % mutS-Protein (97 kd) enthielten, wurden vereinigt. Dem vereinigten Material wurde Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 20 % zugesetzt, und Aliquote wurde bei -70 ºC aufbewahrt.

Oligonucleotide

Die Oligonucleotide wurden von der Firma Biopolymer Labs bezogen. Die Sequenz der Oligonucleotide wurde der 30-Basen-Region entnommen, die die Stelle der Sichelzellenmutation im menschlichen β-Globingen umgibt. Damit sich die Oligonucleotide auf Nitrocellulosefiltern immobilisieren lassen, wurden ausgewählte Oligonucleotide mit einem 5'-25mer-Poly(C)-"Schwanz" und einem modifizierenden Gen für ein 5'-Aminoende hergestellt. Die Sequenzen, die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, sind in Tabelle 2 dargestellt. (Anmerkung: Die tatsächliche Sichelzellenmutation ist eine A:T T T:A-Transversion.) Die Oligonucleotide wurden zu verschiedenen Kombinationen reassozuert, um G:T-, A:C- und G:G-Fehlpaarungen, einen Heterodoppelstrang mit einer ungepaarten Base (wie er durch Reassozuerung eines Oligonucleotids mit einer Wildtyp-Sequenz zu einem Doppelstrang mit einer Ein-Basen-Additions- oder einer Ein-Basen- Deletionsmutation gebildet wird) und zwei unterschiedliche Homodoppelstränge, d.h. zwei perfekt komplementäre Doppelstränge, zu bilden. Die Reassoziierungsbedingungen sind nachstehend beschrieben.

Anti-mutS-Antikörper

Die polyklonalen Anti-mutS-Antikörper wurden aus Serum hergestellt, das erhalten wurde, indem weißen Neuseeland-Kaninchen (Pel Freez) gereinigtes mutS-Protein injiziert wurde. Die Antikörper wurden durch Protein-G- Sepharose-(Pharmacia)-Säulenchromatographie teilweise aufgereinigt. Mit der Dot-Blot-Analyse wurde festgestellt, daß 10 µg/ml Anti-mutS-Antikörper 1 ng gereinigtes mutS-Protein detektieren.

ERGEBNISSE

Detektion von Fehlpaarungen in in Lösung reassoziierten Heterodoppelsträngen

Die in Figur 4 gezeigten Daten weisen darauf hin, daß die G:T- und G:G-haltigen Heterodoppelstränge durch mutS-Protein detektiert werden können. Die Detektion ist mutS-abhängig und kann von einer Heterodoppelstrang- jedoch nicht von einer Homodoppelstrang-DNS kompetitiv gestört werden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit A:C-Fehlpaarungen und Heterodoppelsträngen mit einer ungepaarten Base erhalten (Daten nicht gezeigt).

Reassoziierung zu immobilisierten Oligonualeotiden

"Mit einem Schwanz versehene" Oligonucleotide wurden auf Filter aufgetüpfelt, und an sie wurden 30mer-Oligonucleotide angeheftet. Die Ergebnisse (Figur 5) entsprechen den Ergebnissen, die mit Heterodoppeisträngen erhaltenen wurden, die durch Reassozuerung in Lösung hergestellt wurden (Figur 4) Homodoppeistränge (gebildet unter Verwendung von 30mer-Oligonucleotiden, die exakt komplementär waren zu dem 30mer-Teil der immobilisierten Oligonucleotide) wurden nicht detektiert.

Reassozuerung in Gegenwart von konkurrierenden Oligonucleotiden

Homodoppelstränge wurden durch Reassozuerung von komplementären 30meren hergestellt. Sodann wurden "mit einem Schwanz versehene" Oligonucleotide zugegeben, die Homodoppelstränge denaturiert und das Gemisch erneut reassozueren gelassen. Die Proben wurden auf Filter aufgetüpfelt. Figur 6 zeigt, daß unter solchen Bedingungen G:T-Fehlpaarungen detektiert werden, was darauf hinweist, daß die "mit einem Schwanz versehenen" Oligonucleotide mit den 30meren effektiv um die komplementären Oligonucleotide konkurrieren. Solche Bedingungen entsprechen den Bedingungen, die bei einem Mutations-Detektionstest eingesetzt werden könnten. In einem solchen Test könnte die Proben-DNS durch Restriktionsenzyme (für genomische DNS) geschnitten oder durch PCR hergestellt werden. In jedem Fall ist die DNS doppelsträngig und enthält darum Sequenzen, die den Sequenzen der "mit einem Schwanz versehenen", als Sonden eingesetzten Oligonucleotide entsprechen und in der Lage sind, mit ihnen zu konkurrieren.
Die in Figur 4 angegebenen Ergebnisse wurden aus den folgendermaßen durchgeführten Versuchen erhalten:
Hetero- und Homodoppelstränge wurden durch Reassozuerung gleicher Mengen von Oligonucleotiden hergestellt. Da die mit einem "Schwanz" versehenen Oligonucleotide eine Länge von 55 Basen aufweisen, bestand ein nahezu zweifacher Überschuß an 30meren, was die Wahrscheinlichkeit vergrößerte, daß alle "mit einem Schwanz versehenen Oligonudeotide doppelsträngig werden. 5 µg (50 µl) von jedem Oligonucleotid in TNE (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA) wurden vermischt, 10 min lang auf 70 ºC erwärmt, 30 min lang auf Raumtemperatur abgekühlt und eisgekühlt. Die reassozuerten Moleküle (1 µg in 2 µl) wurden auf 25-mm-Nitrocelullosescheiben (Porengröße 0,45 µm, Schleicher und Schuell) aufgetüpfelt. 10 ng gereinigtes mutS wurden als positive Kontrolle für die primären (AntimutS) und sekundären Antikörper und das alkalische Phosphatase-Entwicklungssystem auf die Filter aufgetüpfelt. Die Filter wurden luftgetrocknet und auf Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen (Falcon) überführt, die 2 ml Reaktionspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 0,01 mM EDTA; 0,5 mM MgCl&sub2;, 0,01 mM DTT) + 3 % (W/V) fettlose Trockenmilch enthielten, und über Nacht bei 4 ºC unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Filter wurden mit kaltem Reaktionspuffer (4x2 ml) gewaschen und mit einer Lösung von einzeisträngigem bindenden Protein (Pomega) (1 ml bei 100 µg/ml in Reaktionspuffer) inkubiert (30 min bei 4 ºC) Die Filter wurden mit kaltem Reaktionspuffer (4x2 ml) gewaschen und mit (i) 1 ml Reaktionspuffer, (ii) 1 ml Reaktionspuffer + 10 µg/ml mutS oder (iii) 1 ml Reaktionspuffer + 10 µg/ml mutS + 1 µg/ml Homodoppeistrang- oder Heterodoppelstrang-30meren, die wie vorstehend beschrieben reassozuert worden waren, inkubiert (30 min bei 4 ºC) Die Filter wurden mit kaltem Reaktionspuffer (4x2 ml) gewaschen und mit Anti-mutS-Antikörpern (2 ml bei 50 µg/ml in Reaktionspuffer + 3 % fettlose Trockenmilch) inkubiert (2 h bei 4 ºC). Die Filter wurden mit kaltem Reaktionspuffer (4x2 ml) gewaschen und mit 2 ml einer 1: 1000-Verdünnung (in Reaktionspuffer + 3 % fettlose Trockenmilch von Ziegen-Anti-Kaninchen-IgC, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Bio-Rad)) inkubiert (1 h bei 4 ºC). Die Filter wurden mit kaltem Reaktionspuffer (4x2 ml) gewaschen und mit 2 ml frischem Enwicklungspuffer (100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 165 mg/ml Bromchlorindoylphosphat (Stammlösung 1:100 mit Dimethylformamid verdünnt), 0,33 mg/ml Nitroblautetrazolinium (Stammlösung 1:100 mit Dimethylformamid verdünnt)) inkubiert (10 bis 20 min bei Raumtemperatur). Die Filter wurden mehrmals mit Wasser gewaschen, um die Reaktion zu stoppen.
Die in Figur 5 gezeigten Ergebnisse wurden aus den folgendermaßen durchgeführten Versuchen erhalten:
1 µg (2 µl) der mit einem "Schwanz" versehenen Oligonudeotide wurde auf Nitrocelullosefilter aufgetüpfelt. Die Filter wurden luftgetrocknet und auf Platten mit 6 Vertiefungen überführt, die 20 ml TNE enthielten. 2 µg (4 µl) 30mer-Oligonucleotide wurden zugegeben. Die Platten wurden 10 min in einem 70-ºC-Wasserbad schwimmen gelassen, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und auf Eis gestellt. Sodann wurden die Filter behandelt, wie es oben im Zusammenhang mit den in Figur 4 erhaltenen Ergebnissen beschrieben wurde.
Die in Figur 6 dargestellten Ergebnisse wurden aus den folgendermaßen durchgeführten Versuchen erhalten:
Gleiche Mengen von 30mer-Oligonucleotiden wurden reassozuert, wie in der Legende zu Figur 4 beschrieben. Eine gleiche Anzahl von "mit ein m Schwanz versehenen" Oligonucleotiden wurde zugesetzt und das Gemisch 10 min auf 85 ºC erwärmt und anschließend 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Sämtliche nachfolgenden Schritte entsprachen der Beschreibung in der Legende zu Figur 4.
Es sollte darauf hingewiesen werden, daß recA-Protein anstelle des einzeisträngigen DNS-bindenden Proteins eingesetzt werden kann, um die Reassozuerung zu erleichtern. TABELLE 2 OLIGONUCLEOTID-SEQUENZEN
* = 5'-Aminomodifizierer
1 = auch ohne poly(C)-Schwanz und 5'-Aminomodifizierer hergestellt
Legende zu Tabelle 2

SEQUENZ -AUFLISTUNG

(1) Allgemeine Information
(i) Anmelder: Wagner, Jr., Robert Radman, Miroslav
(ii) Titel der Erfindung: Verfahren zur Entdeckung von Mutationen
(iii) Anzahl der Sequenzen: 6
(iv) Korrespondenz-Adresse
(A) Adressat: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
(B) Straße: 2 Militia Drive
(C) Stadt: Lexington
(D) Staat: Massachusetts
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 02173
(v) computerlesbare Form:
(A) Medium-Typ: Floppy Disk
(B) Computer: IMB PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release Nr. 1,0, Version 1.25
(vi) Aktuelle Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungs-Nr.: US
(B) Einreichungsdatum:
(C) Klassifizierung:
(Viii) Anwalt/Agent-Information:
(A) Name: Granahan, Patricia
(B) Registriernummer: 32 227
(C) Referenz/Aktenzeichen: USI91-91A
(ix) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: 617-861-6240
(B) Telefax: 617-861-9540
(2) Information über SEQ ID Nr.1:
(i) Sequenz-Eigenschaften:
(A) Länge: 35 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNS
(xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 1 CCCCCGCACC TGACTCCTGG GGAGAAGTCT GCCGT 35
(2) Information über SEQ ID Nr.2:
(i) Sequenz-Eigenschaften:
(A) Länge: 35 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNS
(xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 2 CCCCCGCACC TGACTCCTGA GGAGAAGTCT GCCGT 35
(2) Information über SEQ ID Nr.3:
(i) Sequenz-Eigenschaften:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nualeinsäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNS
(xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 3 CGTGGACTGA GGACTCCTCT TCAGACGGCA 30
(2) Information über SEQ ID Nr.4:
(i) Sequenz-Eigenschaften:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNS
(xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 4 CGTGGACTGA GGACGCCTCT TCAGACGGCA 30
(2) Information über SEQ ID Nr.5:
(i) Sequenz-Eigenschaften:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNS
(xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 5 CGTGGACTGA GGACCCCTCT TCAGACGGCA 30
(2) Information über SEQ ID Nr.6:
(1) Sequenz-Eigenschaften:
(A) Länge: 31 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNS
(xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 6 CGTGGACTGA GGACCCCCTC TTCAGACGGC A 31

Claims

Beansprucht wird:

1. Ein Verfahren zur Detektion einer Mutation von einer nichtmutierten Sequenz eines einzelsträngigen Ziel- Polynucleotids in einer Probe, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Inkubation der Probe mit einem einzeisträngigen Polynucleotid-Hybridisierungspartner, der mindestens eine einzeisträngige Basensequenz umfaßt, die zu der nichtmutierten Sequenz des Ziel-Polynucleotids komplementär ist, unter geeigneten Bedingungen für eine herbeizuführende Hybridisierung besagten Hybridisierungspartners an beliebige mutierte oder nichtmutierte Sequenzen von besagtem Ziel-Polynucleotid, das in der Probe vorhanden sein kann, um ein Hybrid zu bilden;

(b) In-Kontakt-Bringen des in Schritt (a) gebildeten Hybrids mit einem Fehlpaarungen bindenden Protein; und

(c) Detektieren des Vorhandenseins eines beliebigen an besagtes Hybrid gebundenen Fehlpaarungen bindenden Proteins,

wonach die Detektion des Vorhandenseins des Fehlpaarungen bindenden Proteins ein Hinweis auf das Vorhandensein einer Mutation in der Sequenz des Polynucleotids der Probe ist.

2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagter Polynucleotid-Hybridisierungspartner DNS, z.B. cDNS, ist und/oder besagtes Ziel-Polynucleotid DNS ist.

3. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagtes Fehlpaarungen bindendes Protein das MutS Protein oder ein funktionales Derivat davon ist.

4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagte Probe eine biologische Probe oder Flüssigkeit ist, die hinreichenden Bedingungen ausgesetzt worden ist, um eine beliebige darin vorhandene Nucleinsäure freizusetzen und zu denaturieren, und besagte freigesetzte Nucleinsäure vor besagter Denaturierung gegebenenfalls einem Restriktionsendonuclease-Spaltungsschritt unterzogen wird.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagter Polynucleotid-Hybridisierungspartner vor besagtem Inkubationsschritt (a) an einern festen Träger immobilisiert wird, und zum Beispiel besagter fester Träger eine Nitrocellulose-Membran ist.

6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagter Detektionsschritt Zugabe eines detektierbar markierten ersten bindenden Partners umfaßt, der in der Lage ist, an besagtes Fehlpaarungen bindendes Protein zu binden, und z.B. besagter erster bindender Partner ein für besagtes Fehlpaarungen bindendes Protein spezifischer Antikörper ist.

7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagter Detektionsschritt Zugabe eines ersten. bindenden Partners, der nicht detektierbar markiert ist, wobei besagter erster bindender Partner in der Lage ist, an besagtes Fehlpaarungen bindendes Protein zu binden, und eines zweiten bindenden Partners umfaßt, der in der Lage ist, an besagten ersten bindenden Partner zu binden und das Vorhandensein von besagtem zweiten bindenden Partner zu detektieren, und z.B. besagter zweiter bindender Partner ein für besagten ersten bindenden Partner spezifischer Antikörper ist.

8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 3, worin besagter Detektionsschritt Zugabe eines ersten bindenden Partners umfaßt und (a) besagter erster bindender Partner ein MutL Protein oder ein funktionales Derivat davon ist und detektierbar ist, oder (b) besagter erster bindender Partner ein Fusionsprotein aus MutL und einem zweiten Protein oder Peptid ist, das detektierbar ist, wobei besagtes zweites Protein z.B. beta-Galactosidase ist.

9. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagtes Fehlpaarungen bindendes Protein von Schritt (b) ein Fusionsprotein ist, das mit einem zweiten Protein oder Peptid fusioniert ist, das detektierbar ist, und z.B. besagter Detektionsschritt Zugabe eines ersten bindenden Partners umfaßt, der in der Lage ist, an besagtes zweites Protein oder Peptid zu binden und das Vorhandensein von besagtem ersten bindenden Partner zu detektieren, und z.B. besagtes zweites Protein beta-Galactosidase ist.

10. Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin besagtes zweites Protein ein Enzym ist, das in der Lage ist, die Bildung eines farbigen Reaktionsprodukts aus einem chromogenen Enzymsubstrat zu katalysieren, und besagter Detektionsschritt die Bereitstellung besagten chromogenen Substrats und Visualisierung besagten farbigen Reaktionsprodukts umfaßt.

11. Ein Verfahren zur Detektion einer Mutation von einer nichtmutierten Sequenz eines einzelsträngigen Ziel- Säugerpolynucleotids in einer Probe, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Inkubation der Probe mit einem einzeisträngigen Polynucleotid-Hybridisierungspartner, der mindestens eine einzeisträngige Basensequenz umfaßt, die zu der nichtmutierten Sequenz des Ziel-Säugerpolynucleotids komplementär ist, unter geeigneten Bedingungen für eine herbeizuführende Hybridisierung besagten Hybridisierungspartners an beliebige mutierte oder nichtmutierte Sequenzen von besagtem Ziel-Säugerpolynucleotid, das in der Probe vorhanden sein kann, um ein Hybrid zu bilden;

(c) Detektieren einer beliebigen Bindung von besagtem Fehlpaarungen bindenden Protein und besagtem Hybrid,

wonach die Detektion der Bindung des Fehlpaarungen bindenden Proteins ein Hinweis auf das Vorhandensein einer Mutation in der Sequenz des Säuger-Polynucleotids der Probe ist.

12. Ein Set, das zur Detektion einer Mutation von einer nichtmutierten Sequenz einer Ziel-Polynucleotidsequenz in einer Probe zweckdienlich ist, in einem Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei besagtes Set ausgelegt ist, einen oder mehrere Behälter zu enthalten, und besagtes Set umfaßt:

(a) einen ersten Behälter, der einen einzelsträngigen Hybridisierungspartner enthält, der mindestens eine einzelsträngige Basensequenz umfaßt, die zu der nichtmutierten Sequenz des Ziel-Polynucleotids komplementär ist;

(b) einen zweiten Behälter, der ein Fehlpaarungen bindendes Protein enthält; und

(c) einen dritten Behälter oder mehrere Behälter, die ein Reagenz oder Reagenzien enthalten, die in der Lage sind, die Bindung besagten Fehlpaarungen bindenden Proteins an besagtes Hybrid zu detektieren.

13. Ein Set gemäß Anspruch 12, worin besagtes Fehlpaarungen bindendes Protein MutS oder ein funktionales Derivat davon ist.

14. Ein Set gemäß Anspruch 12, worin besagtes Reagenz oder besagte Reagenzien mindestens einen ersten bindenden Partner umfassen, der in der Lage ist, an das Fehlpaarungen bindende Protein zu binden, und z.B. besagter erster Partner ein für das Fehlpaarungen bindende Protein spezifischer Antikörper ist.

15. Ein Set gemäß Anspruch 12, worin besagtes Reagenz oder besagte Reagenzien einen ersten bindenden Partner, der nicht detektierbar markiert ist, wobei besagter erster bindender Partner in der Lage ist, an besagtes Fehlpaarungen bindendes Protein zu binden, und einen zweiten bindenden Partner umfassen, der in der Lage ist, an den ersten bindenden Partner zu binden, und z.B. besagter zweiter bindender Partner ein für besagten ersten bindenden Partner spezifischer Antikörper ist.

16. Ein Set gemäß Anspruch 15, worin besagter erster bindender Partner ein MutL Protein oder ein funktionales Derivat davon ist, oder ein Fusionsprotein aus MutL und einem zweiten Protein oder Peptid ist, das detektierbar ist, und z.B. besagtes zweites Protein beta-Galactosidase ist.

17. Ein Set gemäß Anspruch 16, worin besagtes zweites bindendes Protein in der Lage ist, an besagtes MutL Protein oder funktionales Derivat davon zu binden.

18. Ein Set gemäß Anspruch 12, worin besagter Hybridisierungspartner an einem festen Träger, wie beispielsweise eine Nitrocellulose-Membran, immobilisiert ist.

19. Ein Set gemäß Anspruch 12, worin besagtes Fehlpaarungen bindendes Protein ein Fusionsprotein ist, das mit einem Enzym fusioniert ist, und besagtes Reagenz ein ahromogenes Substrat für besagtes Enzym umfaßt.