TW202327553A - 奇蘭茶發酵物的製備方法及改善皮膚狀態的組合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種奇蘭茶發酵物的製備方法，包含下述步驟。提供一發酵原料，所述之發酵原料包含一奇蘭茶葉。提供一發酵菌液，所述之發酵菌液包含一酵母菌。進行一發酵步驟，其係混合發酵原料與發酵菌液，以得一混合物，並將混合物於一發酵溫度下培養一發酵時間，以得一發酵後產物。去除發酵後產物之一固體成分，以得一奇蘭茶發酵物。藉此，可有效地萃取奇蘭茶的有效成分並保留其活性，以避免傳統的萃取方法所造成的活性成分流失及有機溶劑的危害。另外，本發明同時提供一種包含奇蘭茶發酵物的改善皮膚狀態的組合物。

Description

奇蘭茶發酵物的製備方法及改善皮膚狀態的組合物

本發明是關於一種發酵物的製備方法，特別是關於一種奇蘭茶發酵物的製備方法以及包含奇蘭茶發酵物之改善皮膚狀態的組合物。

自古至今，茶葉被廣泛地應用於飲品、食品、保健品等相關領域。奇蘭茶為一種盛產於福建省的烏龍茶，其色澤溫潤、滋味醇厚滑爽回甘並帶有蘭花般的香氣，使奇蘭茶在市場上廣受歡迎。再者，奇蘭茶具有豐富的茶多酚，其包含兒茶素、黃酮類等茶葉特有的多酚類物質，是廣為人知的天然抗氧化劑，並具有溫和與良好的抗氧化、抗自由基等功能。

皮膚是人體最大的器官，它可以幫助人體阻擋外來物的入侵，同時它也有排汗、保暖、阻隔、感覺的作用，是以如何使皮膚狀態保持於最佳的水嫩、白皙狀態遂成為相關美容業者所致力發展的目標。在茶葉應用於護膚品的開發方面多以傳統的水煮方式搭配化學物質來萃取其有效成分，然而，以水煮搭配化學物質萃取的方式不僅效率低下，更容易因高溫或化學物質的作用而破壞茶葉中的活性物質，同時也可能使所得之萃取物帶有不益於肌膚的殘留物質。再者，以化學物質萃取而得之茶葉萃取物對於動物細胞有一定的毒殺力，使得茶葉相關之護膚品或化妝品的應用多有侷限。

因此，如何提供一種能改善上述缺點，並可將茶葉有效地應用於美容護膚之相關領域的策略，實為相關學界及業界所致力發展的目標。

本發明之一態樣是在於提供一種奇蘭茶發酵物的製備方法，包含下述步驟。提供一發酵原料，其中所述之發酵原料包含一奇蘭茶葉，且奇蘭茶葉係以70°C至80°C的溫度乾燥而製得。提供一發酵菌液，其中所述之發酵菌液包含一酵母菌。進行一發酵步驟，其係混合所述之發酵原料與所述之發酵菌液，以得一混合物，並將混合物於一發酵溫度下培養一發酵時間，以得一發酵後產物，其中所述之發酵溫度為20°C至50°C，所述之發酵時間為10小時至50小時。去除發酵後產物之一固體成分，以得一奇蘭茶發酵物。

依據前述實施方式之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中所述之發酵原料可以0.1~5 g的奇蘭茶葉與100~300 mL的水混合而得。

依據前述實施方式之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中所述之發酵菌液的濃度可為10 ⁵CFU/mL至10 ⁸CFU/mL。

依據前述實施方式之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中於所述之混合物中，發酵菌液與奇蘭茶葉的混合比例可為5~10 mL:1~5 g。

依據前述實施方式之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中所述之奇蘭茶發酵物的pH值可為4.5至6.8。

依據前述實施方式之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中所述之奇蘭茶發酵物可包含3.0~10.0 mg/mL的蛋白質、6.0~12.0 mg/mL的粗多醣、1.0~5.0 mg/mL的總黃酮以及0.5~1.6 mg/mL的總酚。

依據前述實施方式之奇蘭茶發酵物的製備方法，可更包含一滅菌步驟，其係對發酵後產物進行一滅菌處理，且所述之固體成分可利用一離心方式、一過濾方式或上述方式之組合而去除。

本發明之另一態樣在於提供一種改善皮膚狀態的組合物，包含一有效劑量之一奇蘭茶發酵物，其中所述之奇蘭茶發酵物係利用如前段所述之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得。

依據前述實施方式之改善皮膚狀態的組合物，其中所述之改善皮膚狀態的組合物可用以降低皮膚之一黑色素指數。

依據前述實施方式之改善皮膚狀態的組合物，其中所述之改善皮膚狀態的組合物可用以提高皮膚之一保濕能力。

藉此，本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法採用酵母菌對奇蘭茶葉進行發酵，不僅可有效地萃取奇蘭茶的有效成分並保留其活性，以避免傳統的萃取方法所造成的活性成分流失及有機溶劑的危害，進而使本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物可應用於改善皮膚狀態的組合物中，並具有保濕、美白等功效，使本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法及改善皮膚狀態的組合物具有優異的市場應用潛力。

下述將更詳細討論本發明各實施方式。然而，此實施方式可為各種發明概念的應用，可被具體實行在各種不同的特定範圍內。特定的實施方式是僅以說明為目的，且不受限於揭露的範圍。

[本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法]

請參照第1圖，其係繪示本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法100的步驟流程圖。奇蘭茶發酵物的製備方法100包含步驟110、步驟120、步驟130以及步驟140。

步驟110為提供一發酵原料，其中所述之發酵原料包含一奇蘭茶葉。詳細而言，本發明之發酵原料中的奇蘭茶葉係以70°C至80°C的溫度乾燥而製得，且發酵原料係以0.1~5 g的奇蘭茶葉與100~300 mL的水混合而得，而奇蘭茶葉亦可先進行適當的裁切工序而成細塊或粉末後再行與水混合，但本發明並不以此為限。較佳地，發酵原料可以3 g的奇蘭茶葉與300 mL的水混合而得。

步驟120為提供一發酵菌液，其中發酵菌液包含一酵母菌。詳細而言，本發明所使用的酵母菌可為但不限於任何品系之釀酒酵母菌( Saccharomyces cerevisiae)，而在將酵母菌用於進行發酵之前將先進行一預處理步驟。在預處理步驟方面，首先將酵母菌放入呈現液體的PDA培養基中並於培養箱中進行活化，而後將活化的酵母菌塗布接種於平板培養基上而挑選單一菌落進行擴增，並以25°C至50°C的條件培養至OD值 = 0.5~1.0，此時的酵母菌將處於對數期而具有較佳的活性，即可用於後續之發酵。較佳地，發酵菌液的濃度可為10 ⁵CFU/mL至10 ⁸CFU/mL，但本發明並不以此為限。

步驟130為進行一發酵步驟，其係混合所述之發酵原料與所述之發酵菌液，以得一混合物，並將混合物於一發酵溫度下培養一發酵時間，以得一發酵後產物。具體而言，於所述之混合物中，發酵菌液與奇蘭茶葉的混合比例可為5~10 mL:1~5 g。較佳地，於所述之混合物中，發酵菌液與奇蘭茶葉的混合比例可為5 mL:1 g。另外，在發酵步驟中，發酵溫度為20°C至50°C，而發酵時間為10小時至50小時。在上述溫度範圍下，酵母菌具有最佳的發酵效率。再者，若發酵時間過短，將使奇蘭茶葉的有效成分無法充分釋出；反之，若發酵時間過長，則可能使其他雜菌滋生而影響發酵的品質。較佳地，發酵溫度可為30°C，發酵時間可為48小時，但本發明並不以此為限。

步驟140為去除發酵後產物之一固體成分，以得一奇蘭茶發酵物。詳細而言，在經過步驟110至步驟130的處理後，奇蘭茶葉的有效成分已全數進入奇蘭茶發酵物中，而在將發酵後產物中的固體成分去除後，餘下之液體成分為本發明之奇蘭茶發酵物，其中奇蘭茶發酵物的pH值可為4.5至6.8，且奇蘭茶發酵物可包含3.0~10.0 mg/mL的蛋白質、6.0~12.0 mg/mL的粗多醣、1.0~5.0 mg/mL的總黃酮以及0.5~1.6 mg/mL的總酚。

另外，在本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法100中，可更包含一滅菌步驟，其係對發酵後產物進行一滅菌處理，而固體成分則可利用離心方式、過濾方式或上述方式之組合而去除，但本發明並不以此為限。具體而言，發酵後產物可在121°C的條件下高壓滅菌15分鐘，以使其中的酵母菌失活並去除其他雜菌，而滅菌後的發酵後產物將進一步以4000 r/min至12000 r/min、離心半徑為9公分至12公分的條件離心20分鐘後收集上清液，所述之上清液即為本發明之奇蘭茶發酵物。

藉此，本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法100採用酵母菌對奇蘭茶葉進行發酵，在萃取過程中亦不添加任何有機試劑，如此一來不僅可有效地萃取奇蘭茶的有效成分並保留其活性，避免傳統的萃取方法所造成的活性成分流失及有機溶劑的危害，更可使本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法100所製得之奇蘭茶發酵物具有優異的生物安全性，並可用於改善皮膚狀態的組合物等美容品與化妝品中，而具有優異的市場應用潛力。

[本發明之改善皮膚狀態的組合物]

本發明之改善皮膚狀態的組合物包含本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物，其中奇蘭茶發酵物具有溫和的pH值並富含與保濕功能相關的多醣以及與抗氧化及抗敏功能相關的多酚與黃酮，可降低皮膚之黑色素指數與提高皮膚之保濕能力，是以本發明之改善皮膚狀態的組合物具有優異的保濕、美白、提亮、舒緩等功效而有絕佳的市場應用潛力。

另外，本發明之改善皮膚狀態的組合物之劑型可為液劑、乳劑、霜劑、安瓿、膠囊、丸劑、錠劑、粉末、顆粒、凝膠，並可應用於乳液、化妝水、精華液、隔離霜、洗面乳、面膜或防曬乳上，但本發明並不以此為限。

[實施例與比較例]

一、本發明之奇蘭茶發酵物

以下將以實施例1的奇蘭茶發酵物來詳細說明本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物的性質，並進一步分析其應用於皮膚保濕、美白、舒緩等效果。

實施例1的奇蘭茶發酵物是以下述步驟製得。首先，將5 mL擴增培養後之濃度為10 ⁵CFU/mL至10 ⁸CFU/mL的發酵菌液接種至發酵原料中，其中發酵原料係以5 g的奇蘭茶葉粉末和300 mL的水混合而得，接著將前述的混合物於30°C的培養箱中培養48小時後，將所得之發酵後產物以121°C的條件高壓滅菌15分鐘而使酵母菌失活，而後將滅菌後的發酵後產物以4500 r/min、離心半徑為9公分的條件離心20分鐘後收集上清液，此上清液即為本發明實施例1的奇蘭茶發酵物。

實施例1的奇蘭茶發酵物在外觀上呈現淺褐色半透明狀態的液體，而利用習知的酸鹼度或黏度測定法(如酸鹼度計定法及旋轉黏度測定計)測得其pH值為4.5至6.8，黏度為10 cP至15 cP。再者，實施例1的奇蘭茶發酵物的可溶性固含物的含量約為0.9 wt%至2.0 wt%，菌落總數小於50 CFU/mL，且無致病菌檢出，符合化妝品的品質要求。

二、本發明之奇蘭茶發酵物的成分分析

本試驗是利用高效液相層析(HPLC)並參照試驗方法GB/T 30483-2013來分析實施例1的奇蘭茶發酵物的成分。另外，本試驗同時以高效液相層析分析實施例1的奇蘭茶發酵物的兒茶素種類與含量，而分析兒茶素種類與含量的高效液相層析的檢測條件列示於表一。

表一
分離管柱	Shim-pack GIST C18 (4.6mm×250 mm, 5 μm)
移動相	移動相A： 900 mL乙腈、20 mL冰醋酸、2 mL (10mg/mL)EDTA
移動相B： 800 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL (10mg/mL)EDTA
檢測波長 (nm)	278 (UV)
溫度 (°C)	35
流速 (mL/min)	1
梯度條件	(1) 100%移動相A保持10分鐘 (2) 15分鐘內由100%移動相A到68%移動相A與32%移動相B (3) 68%移動相A與32%移動相B保持10分鐘 (4) 100%移動相A穩定5分鐘
樣品處理	取乙醇稀釋樣品至濃度為1%，經0.45 μm濾膜過濾後作為待測液

另外，本試驗同時包含以傳統的水煮方式處理奇蘭茶葉而未經過任何發酵的比較例1(以下稱為「比較例1的奇蘭茶水萃物」)，以進一步分析以本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物的有效成分含量。

由高效液相層析的結果顯示，每毫升之實施例1的奇蘭茶發酵物含有3.0 mg至10.0 mg的蛋白質、6.0 mg至12.0 mg的粗多醣、1.0 mg至5.0 mg的總黃酮以及0.5 mg至1.6 mg的總酚。再請參照表二，其係實施例1的奇蘭茶發酵物的兒茶素含量分析結果。

表二
	兒茶素種類	含量 (mg/mL)	出峰時間 (分)
實施例1	EC	82.894	21.378
EGCG	7.372	23.883
比較例1	EC	0	-
EGCG	61.352	23.098

由表二的內容可知，實施例1的奇蘭茶發酵物包含表兒茶酚(epicatechin, EC)與表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)，其中表兒茶酚具有抗氧化、清除自由基、廣效抗菌能力等生物活性，而實施例1的奇蘭茶發酵物中含有大量的表兒茶酚，顯示其具有優異的抗衰老、抑菌、消炎等功效。然而，比較例1的奇蘭茶水萃物中並未有表兒茶酚，顯示本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法可有效地萃取奇蘭茶之蛋白質、多醣、黃酮與兒茶素等有效成分，並具有優異的市場應用潛力。

三、本發明之奇蘭茶發酵物的總酚含量測定

本試驗是參照試驗方法GB/T 8313-2018而利用福林酚試劑(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)來測定實施例1的奇蘭茶發酵物的相對總酚含量，並使用沒食子酸(gallic acid, GA)作為標準品，而總酚含量則以沒食子酸的當量來表示。

在實驗方面，首先以去離子水進行稀釋而配製濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的沒食子酸溶液，以作為標準曲線之用，並另配製7.5%的Na ₂CO ₃溶液作為實驗試劑。接著，取1 mL的實施例1的奇蘭茶發酵物加入5 mL的10 mol/L的福林酚試劑混合均勻後，再加入4 mL的7.5%Na ₂CO ₃混合均勻，於室溫下避光靜置1小時後，使用分光光度計測定其於波長765 nm下的吸光值，並將所得數據依標準曲線換算成沒食子酸的當量，而後依照式(I)計算實施例1的奇蘭茶發酵物的總酚含量，式(I)如下： X = C × 10 × n； 其中X為樣品中總酚的含量(mg/L)，C為由標準曲線計算而得之待測液中總酚的含量(mg/L)，而n則為樣品的稀釋倍數。

另外，本試驗同樣包含前述之比較例1的奇蘭茶水萃物，以進一步分析以本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物的總酚含量。

請參照第2圖與表三，第2圖係本發明之奇蘭茶發酵物的總酚含量分析圖，而表三則呈現實施例1的奇蘭茶發酵物與比較例1的奇蘭茶水萃物的總酚含量分析結果。

表三
	多酚含量 (μg/mL)	樣本濃度 (%)	總酚含量 (mg/mL)
實施例1	121.092	10	1.211±0.011
比較例1	45.026	10	0.450±0.006

如第2圖與表三所示，實施例1的奇蘭茶發酵物的總酚含量為1.211±0.011 mg/mL，明顯多於比較例1的奇蘭茶水萃物的總酚含量，顯示本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物具有高含量的總酚而有優異的自由基清除效果，並有潛力應用於具有保濕、美白、提亮、舒緩功效之改善皮膚狀態的組合物或其他化妝品之中，具有相關市場的應用潛力。

四、本發明之奇蘭茶發酵物的總黃酮含量測定

本試驗是利用化學反應呈色法測定實施例1的奇蘭茶發酵物的相對總黃酮含量，並使用蘆丁(Rutin)作為標準品，而總黃酮含量則以蘆丁的當量來表示。

在實驗方面，首先精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL的蘆丁標準儲備液(純度 ≥ 90.0%)分別置於25 mL容量瓶中並加水至6 mL，接著依序加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液(靜置反應6分鐘)、1 mL的10%硝酸鋁溶液(靜置反應6分鐘)與10 mL的4.3%氫氧化鈉試液(靜置反應15分鐘)，以配製濃度為0.0、8.0、16、24、32、40、48 μg/mL的蘆丁溶液而作為標準曲線之用，並另配製10%的硝酸鋁溶液作為實驗試劑。接著，取2 mL的實施例1的奇蘭茶發酵物並加水至6 mL，接著依序加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液(靜置反應6分鐘)、1 mL的10%硝酸鋁溶液(靜置反應6分鐘)與10 mL的4.3%氫氧化鈉試液(靜置反應15分鐘)後，使用分光光度計測定其於波長510 nm下的吸光值，並將所得數據依標準曲線換算成蘆丁的當量，而後依照式(II)計算實施例1的奇蘭茶發酵物的總黃酮含量，式(II)如下： X = ； 其中X為樣品中總黃酮的含量(g/100 mL或g/100 mL)，C為由標準曲線計算而得的待測樣品的總黃酮濃度(mg/mL)，V ₁為試樣定容體積(mL)，V ₂為吸取試樣溶液體積(mL)，V ₃為顯色定容體積(mL)，而M為試樣取樣量(g或mL)。

另外，本試驗同樣包含前述之比較例1的奇蘭茶水萃物，以進一步分析以本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物的總黃酮含量。

請參照第3圖與表四，第3圖係本發明之奇蘭茶發酵物的總黃酮含量分析圖，而表四則呈現實施例1的奇蘭茶發酵物與比較例1的奇蘭茶水萃物的總黃酮含量分析結果。

表四
	黃酮含量 (μg/mL)	樣本濃度 (%)	總黃酮含量 (mg/mL)
實施例1	284.089	10	2.841±0.270
比較例1	70.465	10	0.705±0.133

如第3圖與表四所示，實施例1的奇蘭茶發酵物的總黃酮含量為2.841±0.270 mg/mL，明顯多於比較例1的奇蘭茶水萃物的總黃酮含量，顯示本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物具有高含量的總黃酮而有優異的自由基清除效果，並有潛力應用於具有保濕、美白、提亮、舒緩功效之改善皮膚狀態的組合物或其他化妝品之中，具有相關市場的應用潛力。

五、本發明之奇蘭茶發酵物的透明質酸酶抑制效果分析

透明質酸(hyaluronic acid)主要存在於皮膚、關節、玻璃體等組織中，並具有維持細胞結構、保水與修復組織等功用，而透明質酸酶(hyaluronidase, HAase)則是能降解透明質酸並降低體內透明質酸的活性，從而提高組織中液體滲透能力的一種酶，是以本試驗透過測定實施例1的奇蘭茶發酵物的透明質酸酶的抑制效果，進而評估其應用於保濕、除皺等改善皮膚狀態的效果。

在實驗方面，首先取0.1 mL的CaCl ₂與0.5 mL的透明質酸酶於37°C的條件下水浴20分鐘後，加入0.5 mL之實施例1的奇蘭茶發酵物並再次以37°C的條件下水浴20分鐘，接著加入0.5 mL的透明質酸鈉後依序於37°C的條件下水浴30分鐘並於常溫反應5分鐘。而後，加入0.1 mL的NaOH並於冰上冷卻5分鐘後，再次加入0.1 mL的乙醯丙酮並於100°C的條件下反應30分鐘，並在冷卻後加入1.0 mL的埃爾利希試劑並於常溫反應20分鐘後，使用分光光度計測定其於波長555 nm下的吸光值。

請參照第4圖，其係本發明之奇蘭茶發酵物的透明質酸酶抑制效果的分析結果圖。如第4圖所示，體積百分率為25%之實施例1的奇蘭茶發酵物的透明質酸酶抑制率大於20%，而體積百分率為100%之實施例1的奇蘭茶發酵物的透明質酸酶抑制率更可達95%以上，顯示本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物具有優異的透明質酸酶抑制效果，並有潛力應用於具有保濕、美白、提亮、舒緩功效之改善皮膚狀態的組合物或其他化妝品之中，具有相關市場的應用潛力。

六、本發明之奇蘭茶發酵物的酪胺酸酶抑制效果與黑色素抑制效果分析

人體皮膚黑色素的形成起因於集中在表皮底層的黑色素細胞(Melanocytes)。當角質細胞受到陽光照射，便會活化黑色素細胞中的酪胺酸酶(Tyrosinase)活性，進而啟動一連串的化學反應並產生黑色素(Melanin)，此時含有大量黑色素的黑色素體便釋放到角質細胞中，使皮膚變黑，是以抑制酪胺酸酶活性被視為減少黑色素產生並達成美白效果的關鍵步驟。因此，本試驗透過測定實施例1的奇蘭茶發酵物對於B16黑色素瘤細胞株(B16 melanoma cells，以下稱為「B16細胞」)的酪胺酸酶抑制效果，進而評估其美白的功效。

在實驗方面先依照下表五的配方進行試劑的配製。

表五
單位 (mL)	試劑C 1	試劑C 2	樣品T 1	樣品T 2
0.05% L-酪胺酸	0.5	0.5	0.5	0.5
實施例1的 奇蘭茶發酵物	0	0	0.5	0.5
1 × PBS	2	2.5	1.5	2
100 U/mL 酪胺酸酶	0.5	0	0.5	0
總體積	3	3	3	3

而後，將試劑C ₁於37°C的條件下水浴10分鐘後，加入1 mL的酪胺酸酶並繼續以37°C的條件反應10分鐘後，使用分光光度計測定其於波長475 nm下的吸光值，並同時將試劑C ₂於37°C的條件下水浴10分鐘後，在波長475 nm下歸零。接著，比照試劑C ₁與試劑C ₂的處理方式而分別對樣品T ₁與樣品T ₂進行處理，並根據式(III)計算實施例1的奇蘭茶發酵物對於酪胺酸酶的抑制率，式(III)如下： 酪胺酸酶抑制率(%) =[(C1 - T1)/C1] × 100%； 其中T1為樣品T ₁的吸光值，即實施例1的奇蘭茶發酵物與酪胺酸酶反應後溶液的吸光值，C1為試劑C ₁於波長475 nm之吸光值的3次平均值，即未加實施例1的奇蘭茶發酵物時酪胺酸酶的反應吸光值。

請參照第5A圖與第5B圖，第5A圖係本發明之奇蘭茶發酵物的酪胺酸酶抑制效果的分析結果圖，第5B圖係本發明之奇蘭茶發酵物的黑色素抑制效果的分析結果圖。如第5A圖與第5B圖所示，實施例1的奇蘭茶發酵物可以抑制B16細胞的酪胺酸酶活性，其抑制效果呈劑量依賴型的趨勢，且實施例1的奇蘭茶發酵物同樣可以有效降低B16細胞中的黑色素含量，顯示本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物可降低皮膚之黑色素指數而具有相當的美白功效，並有潛力應用於具有保濕、美白、提亮、舒緩功效之改善皮膚狀態的組合物或其他化妝品之中，具有相關市場的應用潛力。

七、本發明之奇蘭茶發酵物的保濕能力評估

本試驗是利用經皮水分散失量(trans-epidermal water loss，TEWL)做為皮膚表層含水量的指標，以評估實施例1的奇蘭茶發酵物的保濕能力。另外，本試驗同樣包含前述之比較例1的奇蘭茶水萃物，以進一步評估以本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物的保濕能力。

在實驗方面，首先在3位受試者的手臂皮膚設定對照區域及實驗區域(各為3 cm × 3 cm)，並利用市售之經皮水分散失測定儀Tewameter ^®TM300(Courage + Khazaka Electronic)檢測對照區域及實驗區域之皮膚的經皮水分散失量。接著，將使用量為2.0±1.0 mg/cm ²之實施例1的奇蘭茶發酵物與比較例1的奇蘭茶水萃物單次塗抹於實驗區域的皮膚上，但不對對照區域的皮膚進行任何處理，並於測試前、使用後第1天、使用後第5天、使用後第7天及使用後第14天測量經皮水分散失量，並將所測得之數據以對照區域的經皮水分散失量數據進行校正而得皮膚含水量的評估結果。

請參照第6圖，其係本發明之奇蘭茶發酵物的改善肌膚含水量的分析結果圖。如第6圖所示，在使用後第14天，受試者使用實施例1的奇蘭茶發酵物後的皮膚含水量明顯高於比較例1的奇蘭茶水萃物的皮膚含水量，顯示使用實施例1的奇蘭茶發酵物的經皮水分散失量較少。由此可見，本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物具有優異保濕功效並可提高皮膚之保濕能力，並有潛力應用於改善皮膚狀態的組合物或其他化妝品之中而具有相關市場的應用潛力。

八、本發明之奇蘭茶發酵物的安全性評估

本試驗是利用封閉式貼布試驗(Closed Patch Test)評估實施例1的奇蘭茶發酵物對皮膚的潛在刺激性，以確認本發明之奇蘭茶發酵物應用於人體的安全性。在實驗方面，首先將0.2 mL至0.25 mL的實施例1的奇蘭茶發酵物滴加於濾紙片上，再將濾紙片置於斑試器中備用。在受試者方面，隨機選擇年齡為18歲至60歲共30位受試者，並以無刺激性的膠帶於每位受試者的背部固定2個斑試器，使斑試器中的濾紙片貼附於受試者的背部皮膚上24小時，在試驗期間內不移除斑試器，也盡量避免斑試器沾染汗液或水。另外，每個試驗組別皆對應設定一控制組，控制組係以0.20 mL至0.25 mL的蒸餾水進行測試。在測試24小時後取下斑試器，並分別於取下斑試器30分鐘後、24小時後及48小時後觀察斑試器下的皮膚(以下稱為「受試區域」)及受試區域周圍的皮膚是否出現紅斑、浸潤、水腫、丘疹及/或皰疹等過敏或發炎的症狀。

請參照表六，其為實施例1的奇蘭茶發酵物的安全性測試結果。安全性測試結果共分五個等級，其中圖號「-」代表受試區域為陰性反應而未有任何過敏或發炎的症狀，圖號「±」代表受試區域出現可疑反應(如：具有輕微的紅斑)，圖號「+」代表受試區域出現弱陽性反應(亦稱為紅斑反應，即出現紅斑、浸潤、水腫及/或丘疹)，圖號「++」代表受試區域出現強陽性反應(亦稱為皰疹反應，即出現紅斑、浸潤、水腫、丘疹、皰疹，且皰疹反應超出受試區域以外的皮膚)，圖號「+++」代表受試區域出現極強陽性反應(亦稱為融合性皰疹反應，即出現明顯紅斑、嚴重浸潤、水腫、融合性丘疹，且融合性皰疹反應超出受試區域以外的皮膚)。另外，於表六中同時計算反應程度為陽性反應(即圖號為+、++與+++)的人數，以更清楚確認本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物的人體安全性。

表六
	反應 程度	反應人數 (取下斑試器後)	陽性反應人數
30分鐘	24小時	48小時
控制組	-	30	30	30	0
±	0	0	0
+	0	0	0
++	0	0	0
+++	0	0	0
實施例1	-	30	30	30	0
±	0	0	0
+	0	0	0
++	0	0	0
+++	0	0	0

如表六所示，在取下斑試器30分鐘後、24小時後或48小時後，受試者在受試區域及其周圍的皮膚皆無紅斑、浸潤、水腫、丘疹、皰疹及融合性皰疹等反應，顯示本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物具有優異的生物安全性，並具有相關市場的應用潛力。

需補充的是，本發明雖以特定的菌株、特定的材料、特定的比例、特定的製程、特定的分析方法或特定儀器做為例示，以說明本發明之奇蘭茶發酵物具有美白、保濕等功效，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之奇蘭茶發酵物的成分與功效亦可使用其他的菌株、其他的材料、其他的比例、其他的製程、其他分析方法或其他儀器進行分析，且本發明並不以此為限。

綜上所述，本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法採用酵母菌對奇蘭茶葉進行發酵，在萃取過程中不添加任何有機試劑，如此一來不僅可有效地萃取奇蘭茶的有效成分並保留其活性，更可避免傳統的萃取方法所造成的活性成分流失及有機溶劑的危害。再者，本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法所製得之奇蘭茶發酵物富含與保濕功能相關的多醣以及與抗氧化與抗敏功能相關的多酚與黃酮，且奇蘭茶發酵物具有溫和的pH值並可降低皮膚之黑色素指數與提高皮膚之保濕能力，並具有美白、提亮、舒緩等功效而可應用於改善皮膚狀態的組合物中，具有優異的市場應用潛力。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

100:奇蘭茶發酵物的製備方法 110,120,130,140:步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖係繪示本發明之奇蘭茶發酵物的製備方法的步驟流程圖； 第2圖係本發明之奇蘭茶發酵物的總酚含量分析圖； 第3圖係本發明之奇蘭茶發酵物的總黃酮含量分析圖； 第4圖係本發明之奇蘭茶發酵物的透明質酸酶抑制效果的分析結果圖； 第5A圖係本發明之奇蘭茶發酵物的酪胺酸酶抑制效果的分析結果圖； 第5B圖係本發明之奇蘭茶發酵物的黑色素抑制效果的分析結果圖；以及 第6圖係本發明之奇蘭茶發酵物的改善肌膚含水量的分析結果圖。

100:奇蘭茶發酵物的製備方法

110,120,130,140:步驟

Claims (10)

1. 一種奇蘭茶發酵物的製備方法，包含： 提供一發酵原料，其中該發酵原料包含一奇蘭茶葉，且該奇蘭茶葉係以70°C至80°C的溫度乾燥而製得； 提供一發酵菌液，其中該發酵菌液包含一酵母菌； 進行一發酵步驟，其係混合該發酵原料與該發酵菌液，以得一混合物，並將該混合物於一發酵溫度下培養一發酵時間，以得一發酵後產物，其中該發酵溫度為20°C至50°C，該發酵時間為10小時至50小時；以及 去除該發酵後產物之一固體成分，以得一奇蘭茶發酵物。
2. 如請求項1所述之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中該發酵原料係以0.1~5 g的該奇蘭茶葉與100~300 mL的水混合而得。
3. 如請求項1所述之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中該發酵菌液的濃度為10 ⁵CFU/mL至10 ⁸CFU/mL。
4. 如請求項3所述之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中於該混合物中，該發酵菌液與該奇蘭茶葉的混合比例為5~10 mL:1~5 g。
5. 如請求項1所述之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中該奇蘭茶發酵物的pH值為4.5至6.8。
6. 如請求項1所述之奇蘭茶發酵物的製備方法，其中該奇蘭茶發酵物包含3.0~10.0 mg/mL的蛋白質、6.0~12.0 mg/mL的粗多醣、1.0~5.0 mg/mL的總黃酮以及0.5~1.6 mg/mL的總酚。
7. 如請求項1所述之奇蘭茶發酵物的製備方法，更包含： 一滅菌步驟，其係對該發酵後產物進行一滅菌處理，且該固體成分係利用一離心方式、一過濾方式或上述方式之組合而去除。
8. 一種改善皮膚狀態的組合物，包含： 一有效劑量之一奇蘭茶發酵物，其中該奇蘭茶發酵物係利用如請求項1至請求項7任一項之製備方法所製得。
9. 如請求項8所述之改善皮膚狀態的組合物，其中該改善皮膚狀態的組合物係用以降低皮膚之一黑色素指數。
10. 如請求項8所述之改善皮膚狀態的組合物，其中該改善皮膚狀態的組合物係用以提高皮膚之一保濕能力。

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