KR20220001590A

KR20220001590A - 황칠추출물을 포함하는 여드름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20220001590A
Application number: KR1020200079757A
Authority: KR
Inventors: 조창수
Original assignee: 농업회사법인 휴림황칠(주)
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-01-06
Also published as: KR102581166B1

Abstract

본 발명은 황칠 추출물을 포함하는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시형태에 따른 여드름 피부 개선용 화장료 조성물은 황칠의 잎 추출물을 포함하며, 우수한 항산화 및 항염증 활성과 피부 재생 활성을 가질 수 있다.

Description

황칠추출물을 포함하는 여드름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising Dendropanax morbifera Extract for improving acne skin}

본 발명은 황칠 추출물을 포함하는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 우수한 항산화 및 항염증 활성과 피부 재생 활성을 가지는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

우리나라를 포함하여 동남아시아는 현재 식습관의 서구화, 심한 일교차 및 환경오염 등으로 인해 피부트러블로 고민하는 사람이 크게 증가하고 있다. 그 중에서도 동남아를 중심으로 여드름 개선 화장품 시장이 크게 확대되고 있다. 또한 화장품 시장도 기능적 효능을 가진 화장품을 선호하여 코스메슈티컬 시장이 급성장하고 있다.

화장품은 예전부터 아름다움을 추구하는 방법으로서 주로 여성들이 많은 관심을 갖고 있었다. 그러나 최근에는 피부 미용뿐만 아니라 노화 방지, UV 차단, 미백 등 기능성으로 갖는 제품으로서 많은 관심을 갖고 있다.

특히 과학이 발달하였음에도 불구하고 환경오염 및 스트레스로 인한 면역 저하 등으로 인하여 안면의 미생물 감염으로 인한 여드름과 같은 피부 질환이 빈번히 발생되고 있다. 피부 미용에 있어서 염증 제어는 사람들이 많은 관심을 가지고 있으며 염증 제어를 위한 제품에 대한 수요는 급증하고 있다.

여드름은 모 피지선의 염증성 질환으로 면포, 홍반성 구진, 농포 등을 형성하는 것을 특징으로 하며, 소와성(lacuna) 혹은 비후성(hypertrophic scar) 반흔을 남기기도 한다. 여드름의 정확한 원인은 밝혀져 있지 않았으나 다양한 인자가 관여한다.

여드름의 치료법으로는 전 세계적으로 원인이나 치료에 대한 연구들이 진행되고 왔고, 알려진 여드름의 치료법으로는 다음과 같다.

1) 수술적 치료

피지선 입구를 열어 주기위해 면포를 제거해주는 방법, 비타민 A 제재를 바르거나 벤졸퍼 옥사이드제의 도포 약을 바르는 방법.

2) 항생제를 이용하는 방법

테트라-사이클린계통의 항생제를 사용하여 여드름균 또는 화농성균에 대한 살균치료법.

3) 호르몬 치료

호르몬 치료로 피지 분비량 억제.

4) 음식물과 스트레스 조절

지방의 과다섭취를 피하거나, 스트레스를 조절하는 방법 등이 있다.

여드름 치료에 사용되는 약물은 햇빛에 노출되었을 때 변색의 문제, 피부 자극 등의 문제가 있으며, 항생제는 균에 대한 내성 증가 등의 문제를 일으킨다. 호르몬 치료는 빠른 치료 효과는 있으나, 그 부작용으로 인해 소비자들이 피하는 치료법이다.

음식물과 스트레스 해소 등은 지키기가 매우 어렵고 효능면에서도 검정되지 않은 방법이다.

여드름 제품에 사용되는 살리실산(salicin acid ,BHA)과 트리클로산(Triclosan)은 피부를 건조하게 만들며, 트리클로산의 경우 햇빛을 받아 유해물질로 전환된다는 연구 보고들이 나오고 있다(살리실산 0.5%, 트리클로산 0.3%로 화장품에서의 사용을 제한).

이 밖에도 각질제거성분인 클리콜산(AHA)과 진정효과가 있는 비타민A, 무수 에탄올 등의 화합물과 자몽종자추출물, 오이풀추출물, 계피추출물, 생강추출물, 편백나무 추출물 등이 사용되고 있으나, 효능을 제대로 입증할 만한 천연추출물 소재 개발이 절실하다.

본 발명에 따른 일 실시형태의 목적은 천연추출물 소재로서 우수한 항산화 및 항염증 활성과 피부 재생 활성을 가지는 황칠 추출물을 포함하는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시형태는 황칠의 나무 및 황칠의 잎 추출물을 포함하는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시형태에 따른 여드름 피부 개선용 화장료 조성물은 활성 산소종인 프리라디칼을 제거하는 항산화활성이 높아 여드름 피부의 상태를 개선할 수 있다. 또한, 여드름균에 대한 항균활성 및 피부의 염증을 완화할 수 있는 항염증 활성이 높아 여드름 피부의 상태를 개선할 수 있다.

본 발명에서는 황칠 나무의 부위별, 추출 공정에 따른 활성을 비교하여, 여드름 피부의 개선에 효능이 있는 조성물을 제조한 것으로, 본 발명의 일 실시형태에 따른 여드름 피부 개선용 화장료 조성물은 황칠의 나무 추출물 및 황칠의 잎 추출물을 포함하여 우수한 라디칼 소거활성, NO 생성 저해능, PGE₂ 생성 저해활성을 나타내며, 피부 세포에 대한 독성 없이 피부 재생 효능을 발휘할 수 있다.

도 1은 황칠 저온 및 고온추출물의 제조 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 황칠 추출물의 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 3은 황칠 저온추출물, 고온추출물, 및 살리실산의 여드름균 항균활성을 나타낸 것이다.
도 4는 황칠 저온추출물의 여드름균(propionibacterium acnes) 생장 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 황칠 고온추출물의 여드름균(propionibacterium acnes) 생장 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 황칠 추출물 및 감초 추출물의 RAW264.7 세포 독성(%)을 나타낸 것이다.
도 7은 황칠 저온 추출물, 황칠 고온 추출물 및 감초추출물의 RAW264.7세포에 대한 NO 함량(%)을 나타낸 것이다. *p<0.05 when compared the groups treated with LPS (1 ㎍/ml) alone.
도 8은 황칠 저온 추출물, 황칠 고온 추출물 및 감초추출물의 RAW264.7세포에 대한 PGE₂ 함량(%)을 나타낸 것이다. *p<0.05 when compared the groups treated with LPS (1 ㎍/ml) alone.
도 9는 황칠 추출물의 추출과정을 나타낸 것이다.
도 10은 평균 여드름 중증도 등급(IGA) 변화 양상을 나타낸 것이다.
도 11은 평균 염증성 병변의 기저치 대비 비율 변화 양상을 나타낸 것이다.
도 12는 평균 ASI 수치 변화 양상을 나타낸 것이다.
도 13은 황칠 잎 열수추출물의 사진이다.
도 14는 황칠 열수추출물 및 황칠 상황버섯균사체 발효 0, 1, 3, 5일 추출물의 HaCaT 세포 독성(%)을 나타낸 것이다.
도 15는 황칠 열수추출물 및 황칠 상황버섯균사체 발효 0, 1, 3, 5일 추출물의 HaCaT 세포 증식 활성(%)을 나타낸 것이다.

이하, 본원의 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에”또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우 뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.

본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~ (하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)은 두릅나무과에 속하는 1속 1종의 난대성 상록 활엽수로 세계에서 오직 전남의 해남, 완도, 보길도 등의 서남해안지역 인근과 제주도의 한라산에서만 자생한다. 그늘지고 습한 활엽수림 또는 산비탈의 관목림 속에 자라는 수종으로서 예부터 한방에서 거풍습(祛風濕), 활혈맥(活血脈)의 목적으로 널리 활용되어 왔다.

황칠은 한국의 고유 수종이면서 한의서와 현대의학에서 혈행 개선(항동맥경화 효능), 간기능 개선, 경조직(뼈와 치아) 재생 효능, 항당뇨 효능, 항고혈압 효능, 항암 효능, 항산화효능, 피부조직 재생, 면역력 증진, 신경안정 효능, 항균활성 등이 밝혀져 고부가가치 식품 신소재로 각광을 받고 있다.

황칠에 대한 성분연구는 주로 도료로 사용하는 황칠 수액에 함유된 2개의 환 구조를 갖는 sesquiterpene에 속하는 β-selinene과 capnellane-8-one 등의 정유 및 fatty acid 성분의 분석되어 있다.

최근 관심을 받고 있는 잎, 줄기 등에는 폴리페놀 성분이 다량 함유되어 있다고 하나, 함유된 성분의 약리 효능 또는 기능성과의 관련성 혹은 유효성분의 측면에서 연구가 미비하다. 황칠의 다양한 효능이 알려졌으나 아직까지 실용화 단계라고 볼 수 있다.

현재까지 황칠의 혈압조절, 혈당조절, 간기능 개선, 진해거담, 위장관운동, 발모개선, 성기능 개선 등의 생리활성과 미용 제품 제조 및 기능성 식품의 특허 출원되었으나, 황칠소재에 대한 논문과 특허는 상대적으로 매우 미흡한 실정이다.

황칠나무 잎에는 폴리페놀 성분이 다량 함유되어 항산화 항염증, 미백활성이 있으나, 화장품 원료로의 산업화는 미미한 단계이다.

본 출원인은 하기와 같은 실험을 통하여 황칠추출물을 여드름 완화 기능성 소재로 개발하기 위하여 황칠 잎을 추출용매별 항산화활성을 측정하여, 최적 추출 공정을 확인하였다. 그러나 하기의 실험은 본 발명을 보다 구체적으로 이해하고 설명하기 위한 것으로, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예]

I. 추출용매 탐색

1 황칠 추출용매 확립을 위한 활성 탐색

1) 항산화 활성의 측정

가) ABTS 라디칼 소거활성

ABTS radical 소거 활성은 Re et al. (1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS 5 mL와 140 mM potassium persulfate 88 ㎕를 섞은 후 상온에서 16 시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시킨다. 이후 이 용액을 414 nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 PBS로 희석하였다. 조제된 희석용액 190 ㎕와 시료 10 ㎕를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 용매 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다.

본 실험에서 사용한 추출물은 원료의 10배의 추출용매를 가해 추출하였다. 이것을 원액으로 항산화활성을 측정하였을 때 활성이 매우 높아 대부분 100%의 소거활성을 보여 그 활성을 비교하기 어려워 100배 희석하여 실험을 진행하였다.

추출용매 비율에서는 물과 에탄올 비율"증류수:에탄올 = 40:60"에서 높은 활성을 보여주었다.

시료명 (100배 희석액)		ABTS 라디칼 소거능(%)
시료명	추출용매비(DW : EtOH)	ABTS 라디칼 소거능(%)
황칠 잎	100:0	33.25 ±0.61
	60:40	43.47 ±0.41
	40:60	54.48 ±0.96
	20:80	43.10 ±3.40
	0:100	23.85 ±0.67

2) 황칠 추출용매 확립

ABTS 라디칼 소거활성은 60% 에탄올 추출용매가 가장 우수하였다. 따라서 황칠 추출물의 최적 추출용매는 60% 에탄올로 결정하였다.

2. 추출온도차에 따른 활성 탐색

1) 황칠 저온 및 고온 추출물의 활성 비교

지금까지 원료 최적추출조건을 확보하고, 추출온도를 달리하여 황칠추출액을 제조한 다음 활성을 비교하였다.

가) 황칠 저온 및 고온 추출물 제조

도 10에 나타낸 모식도와 같이 저온추출물 및 고온추출물을 제조하였다.

나) 황칠 저온 및 고온 추출물 활성 탐색

(1) 총 폴리페놀 함량 비교

(가) 실험방법

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 수정하여 측정하였다. 시료 0.12 mL에 10% Folin-Denis reagent를 0.24 mL을 가하여 혼합한 후 3분간 실온에 반응시켰다. 정확히 3분 후 700 mM sodium carbonate solution 0.84 mL을 가하여 30분 반응 후 상층액을 취하여 UV-VIS spectrophotomete로 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 폴리페놀 함량은 증류수에 녹인 10, 25, 50, 62.5, 100 ㎍/ml의 Gallic acid의 표준곡선을 이용하여 구하였다.

(나) 실험결과

황칠 추출물의 총 폴리페놀함량은 도 2와 같다. 황칠은 저온에서 추출했을 때 보다 고온으로 추출했을 시 더 높은 총 폴리페놀 함량이 확인되었다.

시료명	Total Polyphenol (mg/ml GAE)
황칠 저온추출물	0.092 ±0.001
황칠 고온추출물	0.309 ±0.003

(2) 여드름균 항균활성 측정

(가) Paper disk diffusion 항균활성 측정

i) 실험방법

항균 효능을 평가하기 위해 본 실험에서는 paper disk diffusion 방법을 사용하였다. 균주는 액체배양을 하여 37℃에서 72시간 전배양 하였다. 전배양한 균 현탁액을 준비하고 이를 배양 액체배지로 희석하여 1.5*?*⁸ CFU/㎖의 농도로 준비하였고 미리 준비해 둔 agar plate에 직전의 배지와 혼합하여 굳을때까지 정치하였다. 충분히 굳은 고체배지 위에 멸균된 paper disk를 올려놓은 후 각각 5, 10㎎/㎖의 농도로 희석되어진 시료를 disk에 loading 하였다. 50㎕/disk의 농도로 10분간 정치하여 시료가 모두 배지에 확산되어 흡수된 후, 균의 생장 최적 온도인 37℃에서 배양하였다. 양성 대조군으로 triclosan을 이용하여 시험한 후, 72시간 동안 배양하여 균의 생장 억제환의 직경을 측정하여 항균 활성을 비교 하였다.

ii) 실험결과

Paper disk diffusion 항균활성 측정 결과는 도 3과 같다. 3% 황칠 저온 추출물 100 ul 로딩 시 클리어존은 3.5 mm 나타났으며, 3% 황칠 고온추출물 100 ul 로딩 시 클리어존은 11.28 mm로 나타나 저온추출물보다 우수한 항여드름균 활성을 보였다.

비교대조군으로 사용한 1% 살리실산은 50 ul 로딩 시 클리어존이 22.58 mm로 나타났다.

시료명	분주량 (㎕)	클리어존 (mm)
황칠 저온추출물 (3%)	50	-
황칠 저온추출물 (3%)	100	3.50 ±2.38
황칠 고온추출물 (3%)	50	11.28 ±0.22
황칠 고온추출물 (3%)	100	20.00 ±2.16
살리실산 (1%)	50	22.58 ±0.59
살리실산 (1%)	100	38.18 ±0.8

(나) 최소저해농도 (MIC, Minimum Inhibitory Concentration) 측정

i) 실험방법

최소저해농도 분석은 액체배지희석법 (Mann and Markham, 1998)을 사용하여 수행하였다. 즉, 시료를 50~200 μg/ml의 농도로 희석하였다. 균주(propionibacterium acnes)는 OD₆₀₀=0.1로 희석한 후 본 실험에 사용하였다. 유리 시험관에 균 희석액 1.8 mL과 각 농도별 시료 조제액 0.2 mL를 첨가한 뒤 37℃에서 배양하였다. 24시간 후 OD₆₀₀ 값을 측정하여 무처리 대조구와 유의적 차이가 없는 OD₆₀₀ 값을 갖는 농도를 균의 생장이 검출되지 않는 최소 농도로 간주하였으며, 이를 MIC로 설정하였다.

ii) 여드름균 최소저해농도 결과

황칠 저온추출물 및 고온추출물의 여드름균에 대한 최소저해농도 는 표 4와 같다. 황칠 저온추출물 및 고온추출물의 MIC는 각각 200, 150 ㎍/ml 농도로 나타나 고온 추출물의 활성이 더 높았다.

시료명	*MIC against propionibacterium acnes (㎍/ml)*
황칠 저온추출물	200
황칠 고온추출물	150

(3) 항염 활성

(가) RAW 264.7 세포에 대한 항염 활성 측정

i) 세포 배양

실험에 사용한 세포주 RAW 264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 10% Feral Bovine Serum (FBS)를 함유한 DMEM High glucose 성장배지를 사용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 이 때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제 Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다.

ii) 세포 독성 시험방법

세포주의 생존율을 측정은 MTS (CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 세포를 1*?*cells/well의 농도로 분주 후 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 안정화하였다. 이 후 시료를 농도별로 처리하여 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 시약 1 ㎖에 배지(DMEM high glucose, free FBS) 9 ㎖을 넣어 희석한 후 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60 분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, Versa Max ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.

iii) 세포 독성 결과

황칠 저온 추출물, 황칠 고온 추출물 및 감초추출물의 RAW264.7세포에 대한 독성은 도 6과 같다.

모든 시료는 시험농도에서 독성이 나타나지 않았다.

iv) NO 함량 측정 방법

항염증 효능의 측정은 대식세포주에 LPS를 처리하여 LPS 만을 처리한 군의 NO 생성량에 대한 LPS 와 함께 시료를 처리한 군의 NO 생성량을 측정하여 시료가 NO 생성 저해 효능을 가지는 지를 측정하였다.

RAW 264.7 세포주를 96 well에 분주한 후 세포가 바닥의 약80% 이상 자랄 때까지 배양하였다. 염증을 유발하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS, Sigma-Aldrich, MO, USA)를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 시료의 항염증 효능을 확인하기 위해 LPS 와 함께 시료를 알맞은 농도로 배지에 녹여 24시간동안 배양하였다.

NO 생성량은 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. Griess 시약은 2.5%의 phosphate 용액에 1% sulfanilamide와 0.1% naphthylethylene-diamine-di-hydrochloride를 혼합하여 만들었다. 위에 배양한 세포의 상등액 50 ㎕를 96 well plate에 취하고 여기에 Griess 시약 50 ㎕를 가해 15 분 동안 실온에서 반응시킨 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

NO 함량은 nitrite로 검량선을 작성하여 도출하였다.

v) NO 함량 측정 결과

황칠 저온 추출물, 황칠 고온 추출물 및 감초추출물의 RAW264.7세포에 대한 NO 함량은 도 7과 같다.

황칠 저온추출물과 고온추출물 또한 농도가 증가함에 따라 NO 함량이 유의적으로 감소하였으며, 황칠 저온추출물 및 고온추출물의 0.1% 농도에서 control 대비 NO 함량이 각각 11.45, 5.62%으로 나타났으며(표 5) 양성대조군으로 사용한 감초 추출물 보다 NO 함량이 낮게 나타나 항염 효과가 우수한 것으로 확인하였다.

감초 추출물은 농도가 증가함에 따라 NO 함량이 유의적으로 감소하였으며 0.1% 농도에서 control 대비 44.30%로 나타났다(표 6).

시료명	시료농도 (%)	LPS	NO 생성량(μM)	NO 생성활성 (%)
Control	-	-	0.25 ±0.14¹⁾*	2.22 ±1.18
Control	-	+	11.49 ±0.35	100.00 ±3.03
황칠 저온추출물	0.005	+	11.21 ±0.48*	97.57 ±4.15*
	0.01	+	9.80 ±0.15*	85.26 ±1.32*
	0.02	+	7.64 ±0.52*	66.45 ±4.52*
	0.05	+	3.56 ±0.81*	31.01 ±7.07*
	0.1	+	1.32 ±0.26*	11.45 ±2.24*
황칠 고온추출물	0.005	+	10.13 ±0.11*	88.14 ±0.95*
	0.01	+	7.81 ±0.13*	67.93 ±1.15*
	0.02	+	5.47 ±0.11*	47.61 ±0.96*
	0.05	+	1.60 ±0.61*	13.89 ±5.30*
	0.1	+	0.65 ±0.25*	5.62 ±2.13*
¹⁾배지 상청액은 NO 생성량에 따라 분리 및 분석되었다. 데이터는 4개의 개별 실험체의 평균±표준편차로 나타내었다(n=4). *LPS(1 ㎍/ml) 단독처리한 그룹과 비교했을 때 p<0.05

시료명	시료농도 (%)	LPS처리	NO 함량 (μM)	NO 함량 (%)
Control	-	-	0.45 ±0.41¹⁾	4.17 ±3.80
Control	-	+	10.85 ±0.56	100.00 ±5.19
감초 추출물	0.05	+	10.57 ±0.70	97.38 ±6.43
	0.1	+	9.73 ±0.71*	89.66 ±6.52*
	0.2	+	9.29 ±0.80*	82.72 ±5.64*
	0.5	+	7.41 ±0.64*	65.70 ±3.35*
	1	+	5.01 ±0.41*	44.30 ±0.46*
¹⁾배지 상청액은 NO 생성량에 따라 분리 및 분석되었다. 데이터는 4개의 개별 실험체의 평균±표준편차로 나타내었다(n=4). *LPS(1 ㎍/ml) 단독처리한 그룹과 비교했을 때 p<0.05

vi) Prostaglandin E2 (PGE2) 함량 측정 방법

PGE2의 측정은 Prostaglandin E2 EIA Kit를 Cayman Chemical Company(Ann Arbor, Michigan, USA)에서 구매하여 사용하였으며, 측정 방법은 제조회사의 분석방법에 따라 정량하였다. 즉, RAW264.7 세포에 농도별 시료 및 LPS (1 ㎍/㎖)를 24시간 전 처리 후 세포 배양 상층액을 PGE2 측정에 사용하였다. 배양액을 goat anti-mouse로 coating된 96well plate에 각각 배양액을 50 ㎕씩 loading 하였다. 이 후 primary antibody solution 50 ㎕와 PGE2 conjugate 50 ㎕씩 첨가하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, Washing buffer로 5회 세척 한 후 Ellman's reagent을 200 ㎕씩 처리하여 60-90분간 교반하면서 반응 시킨 후, 405-420 nm에서 흡광도를 측정하여 kit에 따라 계산한 후 단백질함량을 보정하였다. 단백질 함량은 배양액을 이용하여 BCA (Pierce™ BCA Protein Assay Kit)법으로 측정하였다.

vii) Prostaglandin E2 (PGE2) 함량 측정 결과

황칠 저온 추출물, 황칠 고온 추출물 및 감초추출물의 RAW264.7세포에 대한 PGE2 함량은 도 8와 같다.

황칠 저온추출물과 고온추출물 또한 농도가 증가함에 따라 PGE2 함량이 유의적으로 감소하였으며, 황칠 저온추출물 및 고온추출물의 0.1% 농도에서 control 대비 PGE2 함량은 각각 50.17, 33.41%으로 나타났으며 양성대조군으로 사용한 감초 추출물 보다 PGE2 함량이 낮게 나타나 항염 효과가 우수한 것으로 확인하였다(표 7).

감초 추출물 또한 농도가 증가함에 따라 PGE2 함량이 유의적으로 감소하였으며 0.1% 농도에서 control 대비 42.25%로 나타났다(표 8).

시료명	시료농도 (%)	LPS 처리	PGE ₂ 함량 (㎍/g of protein)	PGE ₂ 함량 (%)
Control	-	-	0.07 ±0.01¹⁾*	11.18 ±1.38*
Control	-	+	0.62 ±0.05	100.00 ±8.59
황칠 저온추출물	0.005	+	0.55 ±0.04	88.66 ±5.89
	0.01	+	0.49 ±0.02*	78.75 ±2.62*
	0.05	+	0.47 ±0.04*	76.00 ±6.74*
	0.1	+	0.31 ±0.05*	50.17 ±7.51*
황칠 고온추출물	0.005	+	0.47 ±0.03*	75.78 ±4.33*
	0.01	+	0.42 ±0.04*	67.85 ±6.12*
	0.05	+	0.32 ±0.01*	52.56 ±2.36*
	0.1	+	0.21 ±0.01*	33.41 ±2.25*
¹⁾배지 상청액은 NO 생성량에 따라 분리 및 분석되었다. 데이터는 4개의 개별 실험체의 평균±표준편차로 나타내었다(n=4). *LPS(1 ㎍/ml) 단독처리한 그룹과 비교했을 때 p<0.05

시료명	시료농도 (%)	LPS 처리	PGE ₂ 함량 (㎍/g of protein)	PGE ₂ 함량 (%)
Control	-	-	0.08 ±0.00¹⁾*	15.44 ±0.68*
Control	-	+	0.51 ±0.04	100.00 ±7.95
감초 추출물	0.005	+	0.49 ±0.00	96.68 ±0.17
	0.01	+	0.45 ±0.01*	89.30 ±1.86*
	0.05	+	0.33 ±0.04*	65.45 ±7.29*
	0.1	+	0.21 ±0.02*	42.25 ±4.75*
¹⁾배지 상청액은 NO 생성량에 따라 분리 및 분석되었다. 데이터는 4개의 개별 실험체의 평균±표준편차로 나타내었다(n=4). *LPS(1 ㎍/ml) 단독처리한 그룹과 비교했을 때 p<0.05

다) 황칠 추출용매 온도 확립

루틴(rutin)의 함량은 초잎, 중잎, 대잎 순으로 확인되었으며, 5년 초잎에서 유효물질들이 가장 많은 함량을 나타내었다.

따라서, 최종 추출 부위는 유효성분(rutin)함량이 많은 초잎으로 확립하였다.

4 황칠 추출액 제조를 위한 원료 표준화 확립

1) 황칠 원료의 최적 추출공정 기술 개발

가) 황칠 원료 선택의 표준화

● 생산지역 : 경상남도 하동

● 채취 범위 : 7년산 이상

● 부위: 잎, 줄기

● 추출용매 : 60% 에탄올

● 추출온도 : 80℃

● 최종 원료 명 : DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT

2) DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT의 표준공정도

3) 표준공정도에 따른 DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT 다량 추출

● DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT의 표준공정도에 따라 다량 추출공정 확보

● 50 kg 씩 3회 제조 (3 Batch 제조)

5 황칠 추출액 대량생산 공정 확립

1) 대량생산공정

성분	함량 (%)
정제수	64.50
Butylene Glycol	30.00
황칠 잎 & 줄기 농축액	4.00
1,2 Hexandiol	1.02
Caprylyl Glycol	0.48
Total	100.00

6 황칠 추출액의 특성 연구

1) 여드름 치료제의 경우 스테로이드 호르몬의 오남용이 문제가 되고 있다. 황칠 추출액에 이러한 스테로이드 성분의 함량을 공인인정시험기관인 KOTITI 에 의뢰하여 27종의 스테로이드에 대한 불검출 확인으로 원료의 안정성을 확보하였다.

II. 황칠 잎&줄기 추출액을 함유한 여드름 기능성 화장품의 제조

1. DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT를 함유한 여드름 기능성 화장품 주요 성분

성분명

DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT 10%

SALICYLIC ACID 1.8%

DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT를
함유한 여드름 기능성 화장품의 전성분명

WATER

DISODIUM COCOAMPHODIACETATE

DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT

PEG-8

SODIUM CHLORIDE

SALICYLIC ACID

COCAMIDOPROPYL BETAINE

CENTELLA ASIATICA EXTRACT

FICUSCARICA (FIG) FRUIT EXTRACT

ACMELLA OLERACEA EXTRACT

ULMUS DAVIDIANA ROOT EXTRACT

AMARANTHUS CAUDATUS SEED EXTRACT

HYDROGENATED LECITHIN

CITRIC ACID

HEXYLENE GLYCOL

BUTYLENE GLYCOL

CERAMIDE NP

1,2-HEXANEDIOL

대조군 화장품의 전성분명

WATER

DISODIUM COCOAMPHODIACETATE

PEG-8

SODIUM CHLORIDE

COCAMIDOPROPYL BETAINE

CENTELLA ASIATICA EXTRACT

FICUSCARICA (FIG) FRUIT EXTRACT

ACMELLA OLERACEA EXTRACT

ULMUS DAVIDIANA ROOT EXTRACT

AMARANTHUS CAUDATUS SEED EXTRACT

HYDROGENATED LECITHIN

CITRIC ACID

HEXYLENE GLYCOL

BUTYLENE GLYCOL

CERAMIDE NP

1,2-HEXANEDIOL

4.2 DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT를 함유한 여드름 기능성 화장품의 여드름 기능성 확인시험

1) 시험 방법

가) 시험 순서

(1) 첫 번째 방문

- 연구 대상자들은 연구소를 방문하여 시험자가 제공하는 세안제로 세안 후 30분간 항온 항습조건 (20~22℃, 40~60RH)에서 대기한다.

- 안면 사진 촬영을 실시한다. (이마부터 턱까지 안면부 전체가 나오도록 촬영하며, 정면, 좌측, 우측 3면을 촬영)

- 시험자 2명이 다음과 같은 항목에 대해 평가를 실시한다.

a. 여드름 중증도 등급 (Investigator’Global Assessment Grade)

b. 염증성 및 비염증성 병변의 기저치 대비 비율

c. ASI (Michaelson’Acne Severity Index)

- 연구 대상자에게 시험 시료의 사용 방법 등을 교육한 후 시료를 배포한다.

- 시험 기간 중 및 시험 종료 직후 피부과 전문의가 이상반응 (소양증, 홍반 등의 자극 증상) 유무를 확인한다.

- 정해진 측정 시점에 방문한 연구 대상자에 대해 두 명 이상의 전문가가 얼굴을 면밀히 관찰하고, 여드름 병변수를 계수 및 평가한다.

- 두 전문가의 평가 결과에 현저한 차이가 있는 경우, 여드름 완화 정도가 낮은 결과값을 선택한다.

(2) 두 번째 ~ 네 번째 방문 (시험 2주, 4주, 6주 후)

- 시험자 2명이 다음과 같은 항목에 대해 평가를 실시한다.

a. 여드름 중증도 등급 (Investigator’Global Assessment Grade)

b. 염증성 및 비염증성 병변의 기저치 대비 비율

c. ASI (Michaelson’Acne Severity Index)

- 피부과 전문의가 피부 이상반응의 유무를 평가한다.

(3) 다섯 번째 방문 (시험 8주 후)

- 연구 대상자들은 연구소를 방문하여 시험자가 제공하는 세안제로 세안 한 후 30분간 항온 항습 조건 (20~22℃, 40~60RH)에서 대기한다.

- 시험자 2명이 다음과 같은 항목에 대해 평가를 실시한다.

a. 여드름 중증도 등급 (Investigator’Global Assessment Grade)

b. 염증성 및 비염증성 병변의 기저치 대비 비율

c. ASI (Michaelson’Acne Severity Index)

- 피부과 전문의가 피부 이상반응의 유무를 평가한다.

- 시료를 수거하고 시험 참여비를 지급한다.

나) 평가 방법

(1) 여드름 중증도 등급 (Investigator’Global Assessment Grade)

등급	특징
0	병변없음
1	병변 거의 없음 (결절: 없음, 구진/농포: 1개 이하, 면포: 1개 이상 10개 미만
2	경증 (결절: 없음, 구진/농포: 2이상 5개 이하, 면포: 10개 이상 20개 미만)
3	중증도 (결절: 1개 이하, 구진/농포: 6이상 20개 이하, 면포: 20개 이상 30개 미만)
4	중증 (결절 : 2개 이상, 구진/농포 : 20개 이상, 면포 : 30개 이상)

(2) 염증성 및 비염증성 병변의 기저치 대비 비율

- 비염증성 병변 : 면포 (폐쇄면포와 개방면포 포함)

- 염증성 병변 : 구진, 농포, 결절 (결절은 5mm 이상의 염증성 병변을 말함)

- 기저치 대비 비율 = 시험 시료 적용 후 측정 시점에서 병변 수 / 시험 시료 적용 전 병변 수

(3) Michaelson’Acne Severity Index (ASI)

- 정해진 측정 시점마다 연구 대상자의 얼굴에서 병변수를 계수하고 ASI 수치를 계산

- 시험 시료의 적용 전과 8주 후의 ASI 수치 변화를 비교하여 통계 분석

- ASI = (면포수 x 0.5) + (구진수 x 1) + (농포수 x 2) + (결절수 x 3)

2) 시험 결과

가) 여드름 중증도 등급 (Investigator’Global Assessment Grade) 결과

- 여드름 중증도(IGA) 육안 판독 결과의 전후 변화 양상을 반복측정분산분석으로 확인한 결과, 시험군의 경우 시험 전후 여드름 중증도(IGA) 지수가 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)으로 소하는 것을 확인하였으며, 대조군의 경우 시험 전후 통계적으로 유의한 차이를 확인 할 수 없었다. 또한, 반복측정분산분석의 사후 검정과 시점별 군내 전후 통계분석을 통해서는 시험군의 경우 시험 8주 후 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 가지는 것을 확인할 수 있었으나, 대조군의 경우 유의한 차이를 확인할 수 없었다.

구분	시험 전	시험 2주 후	시험 4주 후	시험 6주 후	시험 8주 후
시험군	2.09 ±0.30	2.06 ±0.72	1.88 ±0.71	1.91 ±0.69	1.75 ±0.67
대조군	2.09 ±0.29	2.21 ±0.60	2.03 ±0.68	2.12 ±0.60	2.09 ±0.63

나) 염증성 및 비염증성 병변의 기저치 대비 비율 결과

- 염증성 병변의 기저치 대비 비율 결과의 전후 변화 양상을 반복측정분산분석으로 확인한 결과, 시험군은 시험 전과 비교하여 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 확인할 수 없었지만, 대조군은 시험 전과 비교하여 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 증가를 확인 할 수 있었다. 사후 검증을 통해 시험군과 대조군의 염증성 병변 기저치 대비 비율을 분석한 결과, 시험 전후 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 변화 경향은 확인 할 수 없었다. 또한, 염증성 병변 기저치 대비 비율의 그룹 간 차이를 확인하기 위해 반복측정분산분석을 한 결과, 시험군과 대조군의 염증성 병변 기저치 대비 비율은 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 가지는 것을 확인하였다.

구분	시험 2주 후	시험 4주 후	시험 6주 후	시험 8주 후
시험군	0.86 ±0.63	0.94 ±0.79	0.91 ±0.83	0.90 ±0.71
대조군	1.25 ±0.68	1.13 ±0.75	1.50 ±1.05	1.63 ±1.25

다) Michaelson’Acne Severity Index (ASI) 결과

- 여드름 중증도(ASI) 육안 판독 결과의 전후 변화 양상을 반복측정분산분석으로 확인한 결과, 시험군의 경우 시험 전후 여드름 중증도(ASI) 지수가 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)으로 감소하는 것을 확인하였으며, 대조군의 경우 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 반복측정분산분석의 사후 검정과 시점별 군내 전후 통계 분석을 통해서는 시험군의 경우 시험 8주 후 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 대조군의 경우 사후 검정에서는 차이가 없었으나 시점별 군내 전후 통계 분석에서 시험 2주 후부터 6주 후까지 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

구분	시험 전	시험 2주 후	시험 4주 후	시험 6주 후	시험 8주 후
시험군	6.98 ±3.53	7.08 ±3.62	6.81 ±3.58	6.80 ±3.99	5.45 ±3.93
대조군	6.36 ±3.30	7.73 ±3.82	7.61 ±4.87	7.65 ±4.59	7.80 ±4.64

라) 최종 결과

IGA(Investigator’Global Assessment) 등급 2(경증) ~ 3(중증도)의 여드름이 있는 연구 대상자를 대상으로 한 본 시험에서 DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT를 함유한 여드름 기능성 화장품을 8 주 동안 사용한 시험군 연구 대상자와 대조시료를 사용한 대조군 연구 대상자의 여드름 중증도와 염증성 및 비염증성 병변의 기저치 대비 비율의 변화를 비교한 결과, 시험군의 여드름 중증도(Investigator’Global Assessment; IGA, Michaelson’Acne Severity Index; ASI) 및 비염증성 병변의 기저치 대비 비율이 시험 전에 비해 통계적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 대조군과 시험군 간의 비교 통계 결과에서도 여드름 중증도(ASI)의 변화 경향, 염증성 병변의 기저치 대비 비율, 염증성 병변 및 구진의 기저치 대비 비율과 비염증성 병변의 기저치 대비 비율이 통계적으로 유의한(p<0.05) 수준의 차이를 가지는 것을 확인하였다. 따라서 본시험에 사용한 시험 시료는 여드름성 피부를 완화하는 데 도움을 줄 수 있는 것으로 판단된다.

3. DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT를 함유한 여드름 기능성 화장품의 피부 자극 시험

1) 시험 방법

가) 시험시료적용방법

시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시킨 후 연구대상자의 등에 15㎕의 시료를 Finn chamber에 도포 후 plaster로 고정한다.

나) 시험순서

첫 번째 방문일 - 피부과 전문의의 면담 및 진찰 후 패치를 부착한다.

두 번째 방문일 - 첫 번째 방문 24시간 후 패치를 제거하고, 제거 30분 뒤 시험 부위를 피부과전문의가 판독한다.

세 번째 방문일 - 첫 번째 방문 48시간 후 시험부위를 피부과전문의가 판독한다.

네 번째 방문일 - 첫 번째 방문 72시간 후 시험부위를 피부과전문의가 판독한다.

육안 평가 방법 : 패치 제거 후 피부반응 육안평가는 국제접촉피부염연구회 (ICDRG, International contact dermatitis research group)의 판정기준과 미국화장품협회 (PCPC, Personal Care Products Council)의 안전성 평가 가이드라인을 응용한 다음 기준 (표 17)에 따라 평가한다.

점수	판정기준
0(-)	No signs of inflammation, normal skin
0.5(±	Doubtful or slight reaction
1(+)	Slight erythema
2(++)	Moderate erythema with or without partial edema or papules
3(+++)	Moderate erythema with diffuse edema
4(++++)	Intense erythema with diffuse edema with vesicles

다) 결과 분석

: 연구 대상자들의 피부 반응 점수를 이용하여 다음과 같이 자극지수를 계산한다.

자극 지수	자극성 평가
0≤ <0.02	무자극 no irritancy
0.02≤ <0.25	저자극 low irritancy
0.25≤ <1	경자극 slight irritancy
1≤ <2.5	중자극 moderate irritancy
2.5≤	강자극 severe irritancy

2) 시험결과

가) 시험 결과

DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT를 함유한 여드름 기능성 화장품은 1% 희석액 상태로 24시간 첩포 시험을 실시하였다. 패치 제거 후 30분, 24시간, 48시간에 각각 일차 피부자극 유무를 피부과 전문의가 판정하였다. 피부반응 판정은 ICDRG 기준 및 PCPC 가이드라인에 의거하였으며, 각 연구 대상자들의 피부반응 점수를 이용하여 자극 지수를 산출한 결과 피부자극 지수 0.016점을 얻어 DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT를 함유한 여드름 기능성 화장품을 무자극 시료로 판단하였다.

No.	DENDROPANAX MORBIFERUS EXTRACT를 함유한 여드름 기능성 화장품			CONTROL
	Reaction			Reaction
	24h*	48h	72h	24h*	48h	72h
1	0	0	0	0	0	0
2	0	0	0	0	0	0
3	0.5	0	0	0	0	0
4	0	0	0	0	0	0
5	0	0	0	0	0	0
6	0	0	0	0	0	0
7	0	0	0	0	0	0
8	0.5	0	0	0	0	0
9	0	0	0	0	0	0
10	0	0	0	0	0	0
11	0	0	0	0	0	0
12	0	0	0	0	0	0
13	0	0	0	0	0	0
14	0	0	0	0	0	0
15	0	0	0	0	0	0
16	0	0	0	0	0	0
17	0	0	0	0	0	0
18	0	0	0	0	0	0
19	0	0	0	0	0	0
20	0.5	0	0	0.5	0	0
21	0	0	0	0	0	0
22	0	0	0	0	0	0
23	0	0	0	0	0	0
24	0	0	0	0	0	0
25	0	0	0	0	0	0
26	0	0	0	0	0	0
27	0	0	0	0	0	0
28	0	0	0	0	0	0
29	0	0	0	0	0	0
30	0	0	0	0	0	0
31	0	0	0	0	0	0
32	0	0	0	0	0	0
자극 지수	0.016			0.005
판정	무자극			-

III. 황칠 상황버섯균사체 발효 추출물의 제조 및 활성

여드름이 있는 피부에 항염증 효능과 함께 피부의 빠른 회복을 위해 피부재생 효능이 있는 원료를 제조하기 위해 상황버섯균사체를 이용하여 발효 추출물을 제조하고, 그 활성을 확인하였다.

1. 황칠 열수추출물 제조 및 황칠 상황버섯균사체 발효 추출물 제조

1) 황칠 잎 열수추출물 제조

가) 건조된 황칠 잎 분쇄

나) 황칠 잎 중량의 10배의 증류수를 첨가

다) 85℃에서 2시간 동안 추출

라) 추출물을 회수한 후 황칠 잎에 100℃ 증류수를 추가하여 2차 추출

마) 1차 추출액에 2차 추출액을 첨가하여 황칠 잎 중량의 10배로 mess up

2) 황칠 상황버섯균사체 발효 추출물 제조

가) 상황버섯 균사체 전 배양

(1) 고체배양

(가) 상황버섯(Phellinus xeranticus)을 PDA(potato dextrose agar) 배지에 25℃에서 7~ 10 일 동안 정치 배양

(나) 액체배양

상기 배지로부터 cork borer를 이용하여 균사체 단편을 분리

액체 배양용 기본배지(Potato Dextrose Broth, PDB)가 100ml 함유된 250 mL 삼각플라스크에 분리한 균사체 단편을 접종

25℃에서 10일 이상 진탕 배양하여 상황버섯 전 배양 균주 제조.

(3) 황칠 상황버섯균사체 발효 추출물

(가) 상황버섯 전 배양 균주를 homogenizer로 마쇄

(나) 황칠 열수추출물에 마쇄한 균주 10%를 접종

(다) 25℃, 130~150 rpm 에서 0일, 1일, 3일, 5일간 발효

(라) 멸균 및 수득된 발효물을 여과 (25 um filter paper)

2. 황칠 열수추출물 및 황칠 열수추출 상황버섯균사체 발효액의 피부 재생활성

1) HaCaT 세포의 재생 활성

가) 세포 독성 시험방법

세포주의 생존율을 측정은 MTS (CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 세포를 1×104 cells/well의 농도로 분주 후 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 안정화하였다. 이 후 시료를 농도별로 처리하여 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 시약 1 ㎖에 배지(DMEM low glucose, free FBS) 9 ㎖을 넣어 희석한 후 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60 분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, Versa Max ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.

나) 세포 독성 결과

황칠 열수추출물, 황칠 상황버섯균사체 0, 1, 3, 5일 발효 추출물의 HaCaT세포에 대한 독성은 도 14와 같다.

모든 시료는 시험농도에서 독성이 나타나지 않았다.

다) 인간피부세포 증식 활성

HaCaT 세포주를 2×104 cells/㎖의 농도로 96 well plate에 100 ㎕분주하고, 24 시간 동안 37℃, 습도 95%, 5% CO2로 조절된 CO2 배양기에서 세포 안정화하였다. 새로운 배지에 각 시료를 세포독성이 나타나지 않는 알맞은 농도 범위로 희석 후 세포에 처리하여 1, 2 일 동안 배양하였다. 세포주의 생존율을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Mol. Tech., Rockville., MD, USA)를 이용하여 microplate reader (Molecular Devices, Versa Max ELISA Microplate Reader, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 재생 활성은 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.

라) 인간피부세포 증식 활성 측정 결과

황칠 열수추출물, 황칠 상황버섯균사체 0, 1, 3, 5일 발효 추출물의 HaCaT세포에 대한 피부 증식활성은 도 15와 같다.

황칠 열수추출물, 황칠 상황버섯균사체 0일 발효 및 황칠 상황버섯균사체 5일 발효는 농도가 증가함에 따라 세포가 증식하는 것을 확인하였다. 특히 황칠 상황버섯균사체 5일 발효는 1% 농도에서 약 200%의 세포 증식을 확인하였다(표 20).

시료명	시료농도 (%)	HaCaT 세포 증식 활성 (%)
시료명	시료농도 (%)	DAY 1	DAY 2
황칠 열수추출물	Control	100.00 ±2.59¹⁾	100.00 ±5.41
	0.05	92.58 ±1.11*	93.72 ±1.95*
	0.5	108.9 ±4.66*	144.88 ±10.03*
	1	109.32 ±5.64*	154.13 ±12.18*
황칠 상황버섯 균사체 0일 발효 추출물	Control	100.00 ±2.59	100.00 ±5.41
	0.05	109.41 ±3.42*	159.44 ±6.37*
	0.5	111.97 ±8.61*	174.23 ±12.89*
	1	108.36 ±5.37*	170.73 ±15.80*
황칠 상황버섯 균사체 1일 발효 추출물	Control	100.00 ±2.59	100.00 ±5.41
	0.05	112.74 ±3.32*	193.39 ±15.56*
	0.5	119.84 ±8.29*	140.75 ±11.32*
	1	114.41 ±7.08*	145.95 ±11.88*
황칠 상황버섯 균사체 3일 발효 추출물	Control	100.00 ±2.59	100.00 ±5.41
	0.05	99.56 ±3.86	173.57 ± 18.57*
	0.5	94.42 ±4.40	134.01 ±16.51*
	1	104.00 ±5.22	115.45 ±18.41
황칠 상황버섯 균사체 5일 발효 추출물	Control	100.00 ±2.59	100.00 ±5.41
	0.05	116.54 ±7.67*	161.37 ± 17.38*
	0.5	113.54 ±11.20	173.83 ±2.75*
	1	111.85 ±8.82*	196.28 ±5.85*
¹⁾⁾배지 상청액은 NO 생성량에 따라 분리 및 분석되었다. 데이터는 3개의 개별 실험체의 평균±표준편차로 나타내었다(n=3). *LPS(1 ㎍/ml) 단독처리한 그룹과 비교했을 때 p<0.05

Claims

황칠의 잎 추출물을 포함하는 여드름 피부 개선용 화장료 조성물로서,
추출용매는 물:에탄올 = 60~20:40~80의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.