KR20200064204A

KR20200064204A - 황칠나무 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물

Info

Publication number: KR20200064204A
Application number: KR1020180149091A
Authority: KR
Inventors: 조창수
Original assignee: 농업회사법인 휴림황칠(주)
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-06-08

Abstract

본 발명은 황칠나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물에 관한 것이며, 본 발명의 아토피 피부염 개선 조성물은 우수한 DPPH 라디칼 소거능, 항염증효과, 피부재생효과 및 보습효과에 의해 피부질환, 아토피 피부염의 억제 내지 치료효과를 나타내면서도 이외에 노화촉진, 피부주름 및 색소침착의 예방효과와, 여드름 치료효과를 나타내는 특징이 있다.

Description

황칠나무 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물{Composition for improving atopic dermatitis containing Dendropanax morbifera Lev. extract}

본 발명은 황칠나무 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물에 관한 것이며, 구체적으로는 황칠나무 추출물을 이용하여 항산화 활성, 항염증 효과에 의해 아토피 피부염을 개선 내지 치료하는 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염(atopic dermatitis)은 그 발생 원인이 명확하게 밝혀지지는 않았지만, 만성 염증성 피부질환으로 건조증, 비강진, 습진 등의 징후와 가려움, 피부장벽의 손상, IgE 증가 등이 개인에 따라 다양하게 나타나며, 아토피 병력을 보이는 가족력을 특징으로 한다.

산업화가 가속된 선진국에서는 2000년대 접어들면서 그 유병률이 15 ~ 30(%)이상이 넘을 정도로 매우 빠른 속도로 증가하고 있어 인류가 해결해야할 중요한 난치성 피부질환으로 인식되고 있다. 아토피 피부염은 알레르기 비염, 기관지 천식과 함께 가장 대표적인 알레르기성 질환으로써 최근 유,소아의 유병률이 2 ~ 3배 증가함과 동시에 성인에게도 꾸준히 증가하여 전 인구의 10 ~ 20%정도가 이로 인하여 고통을 받고 있다

아토피성 피부염의 치료법은 주로 염증에 대한 스테로이드 외용제, 국소 칼시뉴린(calcineurin) 억제제, 외용보습제 그리고 소양증에 대한 항히스타민제와 면역반응 조절제, 면역억제제 등의 약물요법으로 관리되고 있으나 약물요법은 장기간 사용했을 때 피부의 위축이나 소아환자에서의 성장 지연 가능성등 각종 부작용이 문제되고 있으므로 최근 천연물 특히, 수목의 목재, 잎 등의 추출성분 중 생리활성이 뛰어난 성분들을 이용하여 아토피성 피부염을 치료제로 활용하는 방안들이 활발히 연구되고 있다

황칠나무(Dendropanox morbifera LEV.)는 두릅나무에 속하는 상록 활엽교목으로 우리나라의 제주도와 완도, 보길도, 해남 등 남ㆍ서해안 일대에 자생하고 있는 우리나라 특산 수종이다. 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피(樹皮)에 상처를 주면 황색의 진(津)이 나오는 데 이것을 황칠(黃漆)이라 하며 전통적으로 가구 및 다양한 분야에 이용되어 왔으며, 이시진의 본초강목에서는 황칠나무가 번열제거, 안질 및 화상치료, 나병에 효과가 있으며 무해하다고 기록되어있다. 황칠나무의 뿌리 및 줄기는 전통 의학에서 편두통, 월경 곤란증, 피부 질환 등을 치료하는데 이용되어 왔으며, 황칠나무 잎은 플라보노이드 및 폴리 아세틸렌 화합물 등을 함유하고 있는 것으로 확인되었다.

아토피 피부염의 예방, 완화 및 치료와 관련하여 천연물을 유효성분으로 하는 선행기술로 예를 들면, 특허문헌1에에 방풍 추출물, 황금(Scutellariae Radix) 추출물 및 시호 추출물을 7:1:2의 비율로 함유하는 아토피 피부염 개선능을 가지는 피부 외용제 조성물을 개시하고 있으며, 특허문헌2에는 증숙 처리된 녹차의 열수추출물, 증숙 처리된 녹차의 에탄올추출물, 증숙 처리되지 않은 녹차의 열수추출물 및 증숙 처리되지 않은 녹차의 에탄올추출물을 각각 1:1:1:1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선용 약학 조성물을 개시하고 있다.

또 특허문헌3에는 황칠나무 잎을 메탄올 또는 에탄올에 침지시킨 후 3일 내지 15일 동안 실온에서 방치한 후 추출액을 분리하고, 얻은 추출액을 증발하여 농축시킨 후 동결건조하여 분말상태로 제조한 고지혈증 예방용 식품 조성물을 개시하고 있다.

본 발명의 출원인은 황칠나물 잎의 에탄올 추출물이 항산화 활성, 항염증 효과, 아토피 개선 및 피부재생 효능을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

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10-1147862

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10-1330411

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10-1644183

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본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 황칠나무 추출물을 이용하여 항산화 활성, 항염증 효과에 의해 아토피 피부염을 개선하는 아토피 피부염 개선 조성물의 제공에 관한 것이며, 보다 상세하게는 항산화 활성, 항염증 효과, 피부재생 효능 및 아토피 피부염 개선효과가 우수한 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물이 제공을 목적으로 하는 것이다.

본 발명에 따른 과제의 해결 수단으로 황칠나무 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물은 황칠나무 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물의 일 실시형태는 조성물 총 중량을 기준으로 황칠나무 에탄올 추출물을 유효성분으로 0.1 ~ 100중량% 함유하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물에 따른 또 다른 실시 형태는 본 발명의 조성물 및 피부외용제로 허용되는 보조성분을 함유하는 연고, 크림, 젤, 스프레이, 팩, 액상제 및 첩부제 중 어느 하나의 제형으로 이루어지거나 보조성분을 함유하지 않고 액상의 황칠나무 추출물 그대로 분사하는 것으로 이루어진다. .

본 발명의 아토피 피부염 개선 조성물에서 유효성분으로 함유하는 황칠나무 추출물은 우수한 DPPH 라디칼 소거능, 항염증효과, 피부재생효과 및 보습효과에 의해 피부질환, 아토피 피부염의 억제 내지 치료효과를 나타내면서도 이외에 노화촉진, 피부주름 및 색소침착을 예방하는 효과와 여드름 치료효과를 나타내는 특징이 있다.

도 1은 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물의 DPPH radical 소거능 및 ABTS radical 소거능에 대한 도표
도 2는 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물 및 비교군의 NO 생성에 대한 도표
도 3은 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물의 PGE₂저해활성에 대한 도표
도 4는 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물 및 비교군의 THP-1 세포에서 IL-6 생성 활성에 대한 도표
도 5는 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물의 HaCaT 세포에서의 재생능에 대한 도표

아래에서는 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, <실시예> 및 <시험예>를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는 것이지만, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로 본 발명의 범위가 아래 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분으로 황칠나무 에탄올 추출물을 0.1 ~ 100중량% 함유하는 것으로 이루어진다.

상기 황칠나무(Dendropanox morbifera LEV.)는 두릅나무에 속하는 상록 활엽교목으로 우리나라의 제주도와 완도, 보길도, 해남 등 남ㆍ서해안 일대에 자생하고 있는 우리나라 특산 수종이며,.황칠나무 잎에는 플라보노이드 및 폴리 아세틸렌 화합물 등을 함유하고 있는 것으로 확인되었으며, 또 황칠나무의 뿌리 및 줄기는 전통 의학에서 편두통, 월경 곤란증, 피부 질환 등을 치료하는데 이용되어 왔다.

본 발명에 따른 황칠나무 추출물은 피부노화의 큰 원인인 활성산소에 의한 세포보호 작용 및 멜라닌 생합성 저해효능을 나타내며, 또 황칠나무 잎과 줄기 추출물은 항산화 및 항노화 효과가 있다.

본 발명에 따른 황칠나무는 나무 잎, 줄기 등 어느 것도 가능하고 추출용매로는 물 또는 에탄올이 선택되며, 60 ~ 70%(v/v)의 에탄올을 추출용매로 하여 35℃에서 48시간정도 추출하는 것이 바람직하다.

아래에서는 <실시예> 및 <시험예>를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하기로 하며, 아래 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.

<실시예> 황칠나무 에탄올 추출물의 제조

정선된 황칠나무 잎을 열풍 건조하고 분쇄한 분말 5g에 대하여 10배의 부피비율로 60% 에탄올을 첨가하고 35℃에서 48시간동안 교반하면서 추출하여 수득한 추출물을 여과포로 여과하여 고형물을 분리 제거한 후 감압하에서 증류에 의해 용매를 제거하고 황칠나무 잎 에탄올 추출물를 수득하였으며, 황칠나무 줄기를 이용하여 동일한 방법으로 추출하여 황칠나무 줄기 에탄올 추출물을 수득하고, 이후 이를 시료로 하여 이래와 같이 시험을 진행하였다.

<시험예 1> 항산화 활성

활성산소는 산화작용으로 노화촉진, 암, 관절염, 에이즈, 피부질환, 피부주름, 색소침착, 여드름, 아토피 등 생리적인 항상성이 깨지면서 면역력과 저항력을 떨어뜨리는 등 신체와 피부에 문제를 일으키게 된다. 아토피 피부염 환자의 각질층에는 활성산소에 의해 손상된 단백질들이 정상인에 비해 크게 증가되며 활성산소 제거효소(superoxide dismutase, SOD)의 활성도 크게 감소해있다는 연구 결과가 있다. 피부뿐만 아니라 아토피 피부염이 걸린 아동의 소변 내 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG)의 양 역시 약 1.6배 정도 증가되어, 활성산소에 의한 내부적 손상에 대한 결과로 보고된 바가 있다. 또한 아토피 피부염 환자의 혈청에는 NO유도체의 농도가 정상인에 비해 3배 넘게 증가되어 있으며, 피부염이 개선되면 혈청 내 NO의 농도도 감소한다고 보고된 바가 있다.

상기 황칠나무 잎 에탄올 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위하여 항산화 효능의 측정기준으로 사용되고 있는 DPPH에 대한 free-radical 소거 활성, ABTS free-radical 소거 활성에 미치는 영향을 시험하였다.

1). DPPH radical 소거능

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) assay 방법은 Yoshida et al. (1989)이 사용한 방법에 따라 측정하였으며, 96well plate에 control에는 추출물을 추출한 용매를 100㎕, 시험군에는 시료 100㎕ 씩 각각 넣는다.

모든 well에 100㎕씩 넣고 50㎕의 DPPH(0.5mM DPPH/ethanol) 용액을 가하여 혼합한다. 25℃의 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, 라디칼 소거능은 아래 [계산식1]에 따라 백분율로 나타내었다. 그리고 비교시험을 위하여 항산화성이 뛰어난 비타민C로 알려진 아스코르브산을 이용하였으며 그 결과를 아래 [표 1] 및 [도 1]로 나타내었다

[계산식 1]

시료명			DPPH 라디칼 소거 활성(%)
황칠나무 잎 추출물	128배 희석	0.8%	14.3	±	5.0
	64배 희석	1.6%	27.9	±	1.2
	32배 희석	3.1%	49.2	±	4.0
	16배 희석	6.3%	76.1	±	0.8
	8배 희석	12.5%	82.0	±	0.3
	4배 희석	25%	83.7	±	0.3
	2배 희석	50%	97.2	±	0.1
	원액	100%	97.6	±	0.3
아스코르브산	1㎍/㎖		13.6	±	0.6
	10㎍/㎖		25.2	±	0.2
	100㎍/㎖		73.5	±	1.9
*IC₅₀ :　황칠 추출물; 3.6% , 아스코르브산; 59.9㎍/㎖

상기 [표 1]에 나타낸 바와 같이 항산화활성을 측정하였을 때 활성이 매우 높아 대부분 100%의 소거활성을 나타내어 비교가 어렵고, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128배로 희석한 시료에서 2, 4, 8, 16배로 희석한 시료의 결과도 소거활성이 50% 이상으로 나타내어 비교가 어렵지만, 32배로 희석한 시료에서 DPPH 라디칼 소거활성이 49.2%로 나타났으며 , 이는 황칠 추출물 원액을 100%로 보았을 때 IC₅₀은 3.6%로 나타났다. 비교시험구로 아스코르브산은 10㎍/㎖, 100㎍/㎖의 농도에서 각각 25.2%, 73.5%의 DPPH 라디칼 소거능을 보였다. IC₅₀은 약 60㎍/㎖로 나타났다.

상기한 시험에 의해 황칠나무 잎 추출물이 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었으며, 이는 피부질환, 피부주름, 아토피 등 생리적인 항상성 및 면역력을 떨어뜨리는 활성산소를 저해하는 것을 확인할 수 있으므로 아토피 등의 피부질환을 개선 내지 치료하는데 효과가 있는 것은 물론 피부 노화촉진, 암, 피부주름, 색소침착, 여드름 등의 억제에도 효과가 있는 것을 예측할 수 있다.

2). ABTS radical 소거능

ABTS assay 방법은 Re et al.(1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 7mM ABTS 5㎖와 140mM potassium persulfate 88㎕를 섞은 후 상온에서 16시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시킨다. 이후 이 용액을 414nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 PBS로 희석하였다. 조제된 희석용액 190㎕와 시료 10㎕를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다. 용매 대조군로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 아래 [계산식2]와 같이 백분율로 나타내었다. 그리고 비교시험을 위하여 아스코르브산을 이용하였으며 그 결과를 아래 [표 2] 및 [도 1]로 나타내었다.

[계산식 2]

시료명			ABST 라디칼 소거 활성(%)
황칠나무 잎 추출물	128배 희석	0.8%	23.5	±	1.3
	64배 희석	1.6%	36.8	±	3.9
	32배 희석	3.1%	59.9	±	3.0
	16배 희석	6.3%	87.8	±	3.0
	8배 희석	12.5%	94.7	±	1.7
	4배 희석	25%	99.6	±	0.0
	2배 희석	50%	99.5	±	0.1
	원액	100%	99.3	±	0.1
아스코르브산	1㎍/㎖		12.4	±	1.3
	10㎍/㎖		60.2	±	0.7
	100㎍/㎖		94.2	±	1.1
*IC₅₀ :　황칠 추출물; 3.0% , 아스코르브산; 22.0㎍/㎖

상기 [표 2]에 나타낸 바와같이 ABTS 라디칼 소거활성도 DPPH 라디칼 소거활성과 마찬가지로 매우 높은 활성을 나타내었으며, 64배 희석에서 36.8%의 ABTS 라디칼 소거능을 나타냈다. 32배 희석에서 59.9%의 라디칼 소거활성을 보였으며 이는 25㎍/㎖ 아스코르브산의 ABTS 소거능과 유사한 결과를 보였다(60.2%). IC₅₀은 3.0%로 나타났다.

상기 시험결과에 의해 황칠 추출물이 우수한 ABTS 라디칼 소거능을 나타내는 것을 확인할 수 있으므로 이는 각종 유전자 변화 및 면역력을 떨어뜨리는 ROS를 저해한다고 볼 수 있으며, 이는 곧 ROS의 손상으로부터 신체를 보호할 수 있다고 예측할 수가 있다.

<시험예 2> 항염증 효능 시험

염증은 인체에 침입한 병원체나 내인적으로 유발되는 염증활성인자를 인지하고 제거하기 위해 활성화되는 인체의 적극적인 생체 방어기전이며, 염증반응에 관여하는 주요세포는 macrophage(대식세포)로 알려져 있으며, 여러 자극이나 면역세포들이 분비하는 사이토카인 등에 의해 활성화되어, 염증성 사이토카인, nitric oxide (NO)와 prostaglandinE₂ (PGE₂)를 생성함으로써 통증, 부종, 기능장애, 홍반 및 발열 등의 염증반응을 유발하고, 염증유발부위로 면역세포의 이동을 활성화시킨다.

본 발명에 따른 황칠나무 잎 추출물을 대상으로 LPS 유도 RAW264.7 세포에서의 항염증 효능 시험을 아래와 같이 수행하였다.

1). RAW264.7 세포의 배양

시험에 사용한 세포주 RAW264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 각 세포주를 10㎝ well plate에서 배양하여 1주일에 2 ~ 3회 계대하였으며, 배지는 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Lonza, Valais, Switzerland) medium을 함유한 성장배지를 이용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 배지는 2일에 한번 씩 교환하였다. 이때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline- EDTA(PBS-EDTA)로 세척한 후 트립신 처리하여 계대 배양하였으며, 배지는 48시간마다 교환하여 세포를 배양하였다.

2). NO 생성량 측정

RAW 264.7 세포주를 96 well에 분주한 후 세포가 바닥의 약 80% 이상 자랄 때까지 배양하였다. 염증을 유발하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS, Sigma- Aldrich, MO, USA)를 1㎍/㎖의 농도로 처리하였다.

시료 및 대비를 위한 감초추출물의 항염증 효능을 확인하기 위해 LPS와 함께 시료농도 0.001%, 0.01%, 0.02% 및 감초추출물 농도 0.001%, 0.005%, 0,01% 되도록 세포 배지에 녹여 24시간 동안 배양하고, NO 생성량은 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. Griess 시약은 2.5%의 phosphate 용액에 1% sulfanilamide와 0.1% naphthylethylene-diamine dihydrochloride를 혼합하여 만들었다. 상기 배양한 세포의 상등액 50㎕를 96 well plate에 취하고 여기에 Griess 시약 50㎕를 가해 15분 동안 실온에서 반응시킨 후 microplate reader(Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 항염증 효능의 측정은 대식세포주에 LPS를 처리하여 LPS만을 처리한 군의 NO 생성량에 대한 LPS와 함께 시료 및 감초출물을 처리한 군의 NO 생성량을 측정하여 시료가 NO 생성 저해 효능을 측정하였으며, 그 결과를 아래 [표 3] 및 [도 2]으로 나타내었다.

시료명			NO 생성량(%)
무처리군			26.8±2.3^*
대조군(+ LPS)			100.0±8.3
황칠나무 잎 추출물	+LPS	0.001%	90.9 ±7.5
		0.1%	75.7±4.6^*
		0.02	62.8±4.6^*
감초 추출물		0.001%	79.8 ±4.2^*
		0.005%	68.9±3.9^*
		0.01%	57.6±5.6^*
* : p < 0.05, LPS처리 무처리과 비교함

상기 [표 3]에 나타낸 바와 같이 0.001% 농도의 황칠 추출물을 제외한 나머지 농도구간에서 NO생성 저해능은 유의적으로 감소하였다(표 3, p<0.05). 특히 0.02% 황칠 추출물에서 62.8 %의 NO 생성을 하였으며, 이는 NO 저해능이 37.2%라는 것을 확인할 수 있으며 0.01% 감초 추출물은 NO 생성을 57.6% 유도하였고 즉, 42.4%의 NO 생성 저해능이 있음을 알 수 있으므로 황칠나무 잎 추출물이 대식세포에서 NO생성 저해 활성이 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

3). PGE₂ 생성량 측정

PGE₂의 측정은 Prostaglandin E2 EIA Kit를 Cayman Chemical Company(Ann Arbor, Michigan, USA)에서 구매하여 사용하였으며, 측정방법은 제조회사의 분석방법에 따라 정량하였다. 즉, RAW264.7 세포에 시료 0.001%, 0.01%, 0.02% 농도로 24시간 전처리 후 세포 배양 상층액을 PGE₂ 측정에 사용하였는데, 배양액을 goat anti -mouse로 coating된 96well plate에 각각 배양액을 50㎕씩 loading 하였다. 여기에 primary antibody solution 50㎕와 PGE₂ conjugate 50㎕씩 첨가하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, Washing buffer로 5회 세척 한 후, Ellman's reagent을 200㎕씩 처리하여 60 ~ 90분간 교반하면서 반응 시킨 후, 405 ~ 420nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 아래 [표 4] 및 [도 3]으로 나타내었다.

시료명			Prostaglandin E ₂ 생성량(%)
무처리군			21.0±1.8^*
무처리군(+ LPS)			100.0±2.5
황칠나무 잎 추출물	+LPS	0.001%	105.1±10.3
		0.01%	102.5±8.2 ^*
		0.02%	71.6±4.9^*
* : p < 0.05, LPS처리 무처리군과 비교함

상기 [표 4]에 나타난 바와 같이 0.02% 농도의 황칠나무 잎 추출물은 PGE₂생성을 71.6%로 나타난 결과에 에 의해 PGE₂생성 저해능이 28.4%인 것을 알 수 있으며, 이는 ROS의 손상으로부터 피부를 보호하여 피부에 발생하는 여드름, 아토피 및 피부질환을 예방 내지 개선하는 효과가 있는 것을 예측할 수 있다.

4). THP-1세포의 사이토카인 저해 활성 측정

아토피 피부염의 정확한 원인은 규명하고 있지 못하고 있으나 생활, 환경의 영향, 손상된 피부층을 통해 유입된 항원 물질에 대한 면역반응에 따른 면역세포의 변화 등으로 알려져 있다. 아토피 피부염은 면역학적인 기전에 있어서 Th1, Th2세포간의 불균형, 랑게르한스 세포 활성 증가, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13등의 사이토카인 체계이상 등이 제시되고 있다. 본 시험에서는 단핵구인 THP-1 세포에 아토피 피부염을 유발하는 인자 중 하나인 LPS로 염증을 유발시킨 후, 염증성 사이토카인인 IL-6 분비에 대한 황칠나무 잎 추출물의 염증 억제 효과를 시험하였다.

사이토카인 조절작용은 면역관련 질환의 발병과정에 중요한 경로이다. IL-6는 B세포와 상피세포를 포함한 피부 관련 세포의 성장과 분화를 촉진시키며 염증반응의 급성기에서 만성기로의 전환을 매개한다.

(a). THP-1 세포의 배양

실험에 사용한 세포주 THP-1은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 각 세포주를 75T-flask에서 배양하여 1 주일에 2 ~ 3회 계대하였으며, 배지는 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Lonza, Valais, Switzerland), L-glutamin (300mg/ℓ), 25mM NaHCO₃, 25mM HEPES 을 함유한 RPMI 1640배지를 이용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 배지는 2 ~ 3일에 한번 씩 교환하였다. 이때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다.

(b). THP-1세포를 통한 Interleukin-6 생성 저해 활성 측정

먼저, 황칠나물 잎 추출물의 THP-1세포에 대한 독성을 확인하였으며 아래 [표 5] 및 [도 4]에 나타낸 바와 같이 황칠나무 잎 추출물 0.5%, 0.2%에서 독성이 확인되고, 0.2% 이하의 농도에서는 독성이 없는 것으로 나타났다(p<0.05).

시료명		THP-1Cell Viability(5)
무처리군		100.0±1.0
황칠나무 잎 추출물	0.05%	104.3±2.5^*
	0.1%	108.6±4.8^*
	0.2%	100.3±4.7
	0.5%	84.4±0.8^*
	1%	±82.91.0^*
* : p<0.05, 무처리군과 비교함.

상기 독성시험 결과에 의해 THP-1세포를 통한 Interleukin-6 생성 저해활성 측정은 황칠나무 잎 추출물의 농도를 0.1%, 0.2% 이하에서 진행하였으며, Interleukin-6는 kit(RayBio^® Human IL-6 ELISA)를 구매하여 측정하였으며, 측정방법은 제조회사의 분석방법에 따라 정량하였다. 즉, 세포를 24well plate에 1×10⁶cells/㎖의 농도로 0.5㎖ 분주한 후 시료를 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2%의 농도로 첨가하였다. 또한 염증을 유발하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS, Sigma-Aldrich, MO, USA)를 1㎍/㎖의 농도로 처리하여 24시간 배양 후 배지를 원심분리하여 상등액만을 취하여 시험액으로 사용하였으며 비교시험을 위하여 편백추출물을 이용하고 그 결과를 아래 [표 6] 및 [도 4]에 나타내었다.

시료명		Interleukin-6 생성 (%)
무처리군		27.6±1.3^*
무처리군 (+LPS)		100.0±1.4
황칠나무 잎 추출물 (%)	0.02	94.5±4.0
	0.05	85.6±4.1^*
	0.1	72.1±0.3^*
	0.2	44.0±2.2^*
편백 추출물 (%)	0.1	104.2±3.9
	0.2	93.2±3.5
	0.5	91.2±1.1^*
	1	85.4±1.5^*
* : p<0.05, LPS 처리 무처리군과 비교함.

상기 [표 6]에 나타낸 바와같이 황칠니무 잎 추출물 0.2% 농도에서 IL-6 함량은 대조군 대비 44.0%로 매우 낮은 함량을 보여주었으며 이로보아 0.2% 황칠 추출물은 우수한 IL-6 저해활성이 있음을 알 수 있었다(56%).

그리고 비교시험군으로 사용한 편백 추출물의 약리학적 효과는 지혈작용, 항혈전작용, 항암작용, 진정작용, 항균작용 등을 한다고 알려져 있으며, 특히 피부진정에 도움을 주어 아토피환자들이 많이 사용하는 것으로 알려져 있다. 0.2% 농도의 편백 추출물은 LPS처리된 무처리군 대비 IL-6 함량이 93.2%로 6.8%의 저해활성을 보여주었다 이러한 결과로부터 황칠나무 잎 추출물이 편백 추출물보다 뛰어난 IL-6 저해 활성을 보여주었고, 알레르기성 접촉피부염에 효과가 있는 것을 알 수 있다.

<시험예 3> 피부표피(HaCaT)세포재생 활성 시험

HaCaT cell에서의 세포증식능에 대한 시험은 황칠나무 줄기 추출물을 시료로 하여 시험하였다.

1). HaCaT 세포의 배양

실험에 사용한 세포주 HaCaT은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 각 세포주를 10 cm well plate에서 배양하여 1주일에 2 ~ 3회 계대하였으며, 배지는 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Lonza, Valais, Switzerland) medium을 함유한 성장배지를 이용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 배지는 2일에 한번 씩 교환하였다. 이때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline-EDTA(PBS-EDTA)로 세척한 후 트립신 처리하여 계대 배양하였으며, 배지는 48시간마다 교환하여 세포를 배양하였다.

2). 피부표피(HaCaT)세포의 재생효과 평가

HaCaT 세포주를 2×10³cells/㎖의 농도로 96 well plate에 분주하고, 24시간 동안 37℃, 습도 95%, CO₂ 5%로 조절된 CO₂배양기에서 배양하였다. 새로운 배지에 각 시료를 농도 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.1%범위 내에서 적절한 농도에 맞춰 세포에 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 세포주의 생존율을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Mol. Tech., Rockville., MD, USA)를 이용하여 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 재생효과는 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였으며, 그 결과를 아래 [도 5]로 나타내었다.

[도 5]에 나타낸 바와같이 0.005, 0.01, 0.02%의 황칠나무 줄기 추출물 농도에서 HaCaT 세포가 증가하였으며 이로부터 황칠니무 줄기 추출물은 각질형성세포의 증가에는 도움을 주는 것으로 알 수 있으며, 이는 소양증을 완화 및 피부 건조 완화에 도움을 주어 알러지성 염증 질환을 완화하는 것을 예측할 수 있다.

Claims

황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물.
청구항 1에 있어서, 황칠나무는 나무, 줄기 또는 잎 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물.
청구항 2에 있어서 황칠나무 추출용매는 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물.
청구항 3에 있어서, 황칠나무 추출물은 60 ~ 70%(v/v)의 에탄올을 추출용매로 하여 30 ~ 35℃에서 45 ~ 48시간 추출한 황칠나무 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물.
청구항 4에 있어서, 유효성분이 조성물 총중량에 대하여 0.1 내지 100중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물.
청구항 5에 있어서, 유효성분이 DPPH radical 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물..
청구항 5에 있어서, 유효성분이 항염증 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물.
청구항 5에 있어서, 유효성분이 일산화질소(Nitric Oxide) 생성 저해능을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물
청구항 5에 있어서 유효성분이 Interleukin-6 생성 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선 조성물.
청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 하나의 항에 기재된 아토피 피부염 개선 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선용 피부외용제.
청구항 10에 있어서 피부외용제가 연고, 크림, 젤, 스프레이, 팩, 액상제 및 첩부제 중 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선용 피부외용제.
청구항 10에 있어서 피부외용제가 황칠나무 100%를 유효성분으로 함유하는 액상 또는 스프레이 제형인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선용 피부외용제.