KR102055098B1

KR102055098B1 - 여드름 피부 예방, 개선 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102055098B1
Application number: KR1020190091019A
Authority: KR
Inventors: 신중진; 최동식; 박규현; 이하나; 박진수; 김판수; 최동화; 남연주
Original assignee: (주)티이엔
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2019-12-12

Abstract

본 발명은 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎의 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 복합 추출물을 포함하는 조성물은 항산화 활성이 우수하며, 케라티노사이트에 대해서는 영향을 미치지 않는 반면 피지 세포에 대해서는 유의적인 성장 억제능을 나타내어 피지 분비 억제 효과를 보이며, 케라티노사이트에서 분비하는 염증성 사이토카인 IL-6과 대식세포에서 분비하는 염증성 사이토카인 TNF-α를 농도 의존적으로 억제하며, 여드름균 P. acnes에 대해서도 성장을 억제하는 유의적인 효과를 나타낸다. 이에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 피부 여드름을 개선, 예방, 또는 치료하는 효과가 우수하여, 화장품, 피부외용제, 화장료 등으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

여드름 피부 예방, 개선 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING, IMPROVING AND TREATING ACNE SKIN}

여드름은 얼굴, 목, 등, 어깨 부위에 발생하는 염증성 피부 질환으로서, 주로 10대 연령에서 발생하지만 20대 내지 40대의 성인에게서도 발생하는 경우가 많다. 여드름을 적절하게 치료하지 않을 경우 영구적인 흉터로 남을 수 있기 때문에, 미용적으로 큰 관심 대상이다.

여드름은 여러 다양한 원인들이 복합적으로 작용하여 발생하는 것으로 알려져 있다. 일례로서, 여드름이 주로 발생하는 얼굴, 등 부위에 많이 존재하는 피지선은 피지라고 불리우는 기름 물질을 생성하는데, 피지 분비가 많아지게 되면 모낭의 구멍이 막힘에 따라 피지가 모낭의 구멍을 통해 피부 밖으로 정상적으로 배출되지 못하게 된다. 이 경우, 모낭 속에 고여 딱딱해진 피지는 면포(comedone)를 구성하며, 이것은 여드름의 기본 병변이 된다.

또다른 예로서, 여드름균 Propionibacterium acnes에 대한 면역학적 반응이 여드름의 염증 반응을 야기하는 원인이 되기도 한다.

여드름을 치료하기 위한 약에는 피부에 도포하는 약과 경구 약 등이 있으며, 또한 외과적 치료도 이루어진다. 종래 사용되어오던 항생제는 피부 표면과 모낭 내 여드름균(P. acnes)에 작용하여 세균 수를 감소시키고 염증을 억제하는 역할을 하는데, 여기에는 클린다마이신(clindamycin), 에리스로마이신(erythromycin) 등이 있다. 그러나, 항생제를 함유하는 제제를 피부에 도포할 경우 피부가 건조해지고 각질이 생기는 부작용이 있으며, 경구로 투여하는 경우에도 부작용이 발생한다.

특히, 여드름은 중증도가 커기지 전에 미리 치료하거나 예방하는 것이 중요한데, 이는 평상시 바르는 화장품 제제를 통해 달성할 수 있다. 최근에는 화학합성물에 비해 천연물이 부작용 측면에서 각광을 받고 있다. 예를 들어, 공개특허공보 제10-2019-0006303호(2019.01.18)에는 누룩으로 발효시킨 복합생약추출물을 포함하는 여드름 개선용 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 공개특허공보 제10-2018-0123799호(2018.11.20)에는 녹차수, 감국꽃 추출물, 고삼 추출물, 어성초 추출물 발효 여과물, 멜랄레우카 알테르니폴리아 추출물, 마그놀올, 토타롤, 녹차카테킨, 프로폴리스 추출물, 삼나무잎 추출물 및 연잎 추출물 중 적어도 어느 하나를 포함하는 여드름 개선용 화장료 조성물이 개시되어 있다.

그러나, 부작용을 없애기 위해 개발되고 있는 천연 화장료 조성물은 오히려 높은 유효성을 나타내지 못한다는 문제점이 있기에, 여드름을 효과적으로 치료, 개선 또는 예방할 수 있는 화장료 조성물에 대한 필요성은 여전히 당업계에 크게 존재한다.

공개특허공보 제10-2019-0006303호(2019.01.18)

본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 인식하고 항균, 항염, 피지 분비 억제작용에 의해 우수한 여드름 피부 예방, 개선 및 치료 효과를 나타낼 수 있는 천연 복합제제를 오랜 기간 동안 실험해온 결과, 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎의 추출물을 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "흰버드나무"는 Salix Alba 또는 White Willow를 가리키며, 한국 전지역에서 자란다. 흰버드나무 껍질은 유백피라고도 불리우며, 흰버드나무의 껍질(Bark)을 가리킨다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "녹차"는 차나무과에 속하는 다년생 상록교목을 가리키며, 학명은 Camellia sinensis이며, 한국, 일본, 중국 등지에 분포한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "병풀"은 쌍떡잎식물 이판화군 산형화목 미나리과의 여러해살이풀을 가리키며, 학명은 Centella asiatica이며, 한국, 일본, 중국 등지에 분포한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "오카무라큰실말"은 해조류의 일종으로서 Cladosiphon Okamuranus이며, 한국, 일본 등지에 분포한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "커피 콩"은 커피나무의 씨앗을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "베르가모트(bergamot)"는 쌍떡잎식물 이판화군 무환자나무목 운향과의 상록관목으로서 학명은 Citrus bergamia이며, 주로 이탈리아에서 재배되며 한국에서도 재배되고 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "소나무"는 겉씨식물 구과목 소나무과의 상록침엽 교목으로서 학명은 Pinus densiflora이며, 솔, 솔나무, 소오리나무라고도 불리운다. 한국, 중국 북동부, 일본 등에 주로 분포되어 있다.

본 발명에 따른 조성물은 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎의 복합 추출물을 포함한다. 여기서, 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎은 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 적절한 추출용매로 추출하여 수득한 결과물을 의미하는데, 여기에는 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물, 또는 분획물이 포함되는 것으로 해석된다. 바람직하게는, 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎의 복합물(예를 들어, 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎이 건조 형태로 조합된 형태)을 추출함으로써, 본 발명에 따른 조성물에 포함시킬 추출물을 수득할 수 있다.

상기 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎은 상기 복합물의 전체 중량을 기준으로 각각 흰버드나무 껍질 1 내지 91 중량%, 녹차 잎 1 내지 91 중량%, 병풀 잎 1 내지 91 중량%, 오카무라큰실말 1 내지 91 중량%, 커피 콩 1 내지 91 중량%, 베르가모트 잎 1 내지 91 중량%, 및 소나무 잎 1 내지 91 중량%일 수 있다.

본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 고온가압 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상온 또는 가열 환류 추출이 사용된다.

본 발명에 따른 추출물을 제조하기 위해 사용되는 추출용매로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세롤, 프로판디올 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,2-헥산디올 등의 다가알코올 등에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 물이 추출용매로 사용될 수 있으며, 특히 바람직하게는 정제수가 사용된다. 상기 추출용매는 복합물의 건조 중량에 대해 약 5 내지 20배의 양으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎의 추출물을 유효성분으로 포함한다. 화장료 조성물 중 추출물의 함량은 사용 목적, 사용 기간, 제형의 종류, 투여 경로, 대상체의 피부 상태 등 다양한 요인을 고려하여 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 복합 추출물의 함량은 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 10 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 포함되는 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎의 추출물은 바람직하게는 각각 10.0 내지 30.0 중량부, 10.0 내지 30.0 중량부, 10.0 내지 30.0 중량부, 10.0 내지 20.0 중량부, 1.0 내지 20.0 중량부, 0.1 내지 10.0 중량부, 0.1 내지 10.0 중량부의 비율로 혼합되어 사용된다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 특히 피부 여드름을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 우수하게 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "개선"은 피부 여드름과 직간접적으로 관련되는 파라미터, 예를 들면 증상 또는 진행의 정도를 감소, 지연, 완화 또는 억제시키는 모든 행위 뿐만 아니라 역전시키는 행위도 포함시키는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 이때, 본 발명의 화장료 조성물은 패치류, 연고류, 피부접착용 겔류, 크림류, 팩류, 화장수류, 에센스류, 스프레이류, 마스크류, 파운데이션류, 메이크업베이스류, 세정제류, 수(W)형, 유(O)형, 실리콘(S)형, 수중유(O/W)형, 유중수(W/O)형, 실리콘중수(W/S)형, 수중실리콘(S/W)형, 고체상, 액상 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 화장료 제조방법이 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 효능 증진을 위해 상기 추출물 이외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가 성분은 추출물의 효능을 상쇄시키거나 감소시키지 않는다면 제한이 없다. 선택적으로, 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 담체 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 화장품 기능을 부가하거나 증대시키기 위하여 전형적으로 사용되는 성분들이 또한 추가될 수 있다. 예를 들면, 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH 조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 산화 방지조제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제 등일 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎의 복합물에 용매를 첨가하는 단계; 추출 공정을 수행하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

상기 용매는 바람직하게는 정제수가 사용되며, 상기 추출은 바람직하게는 상온 또는 열수 환류 추출이 사용된다.

선택적으로, 상기 추출 공정을 통해 수득된 결과물을 여과하는 단계 및/또는 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 포함되는 추출물은은 건조된 형태, 농축된 형태, 용액 형태 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎으로 이루어진 복합물의 추출물은 피부 여드름을 치료, 개선 또는 예방함에 있어서 현저하게 우수한 효과를 나타낸다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 항산화 활성이 우수하며, 이는 후술하는 라디칼 소거능 실험을 통해 입증되었다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 케라티노사이트에 대해서는 영향을 미치지 않는 반면, 피지 세포에 대해서는 유의적인 성장 억제능을 나타내어 피지 분비 억제 효과를 보인다. 이와 같은 선택적 효과는 본 발명에 따른 조성물이 부작용이 없다는 것을 의미한다.

더욱이, 본 발명에 따른 조성물은 케라티노사이트에서 분비하는 염증성 사이토카인 IL-6과 대식세포에서 분비하는 염증성 사이토카인 TNF-α를 농도 의존적으로 억제한다. 이에 따라, 피부에서 염증 반응을 일으키는 사이토카인의 분비가 억제됨으로써 피지의 양이 감소되며 염증이 완화되는 효과를 나타낼 수 있게 된다.

뿐만 아니라, 여드름균 P. acnes에 대해서도 성장을 억제하는 유의적인 효과가 관찰되었다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 피부 여드름을 개선, 예방, 또는 치료하는 효과가 우수하여, 화장품, 피부외용제, 화장료 등으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 케라티노사이트 HaCaT 세포에 대해 본 발명의 복합 추출물을 농도별로 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 피지 세포에 대해 본 발명의 복합 추출물을 농도별로 24시간 또는 48시간 동안 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 복합 추출물을 농도별로 처리하였을 때 케라티노사이트 HaCaT 세포로부터 분비되는 IL-6의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 복합 추출물을 농도별로 처리하였을 때 대식세포로부터 분비되는 TNF-α의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 복합 추출물을 함유하는 에센스 제형을 사용하기 전과 6주 경과 후의 사진으로서, 피지는 하얀 점으로 보여진다.
도 6은 본 발명의 복합 추출물을 함유하는 에센스 제형을 사용하기 전의 피지 양을 기준으로 에센스 사용 6주 경과 후의 피지 양을 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 복합 추출물을 함유하는 에센스 제형을 사용하기 전과 4주 경과 후의 사진으로서, 여드름을 비교 관찰한 사진이다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기위해 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나, 하기의 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

실시예 1

흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎을 각각 세척하고 건조하였다. 건조된 원물은 10g의 중량을 기준으로 흰버드나무 껍질 2.39g, 녹차 잎 2.38g, 병풀 잎 2.38g, 오카무라큰실말 1.5g, 커피 콩 1.2g, 베르가모트 잎 0.1g 및 소나무 잎 0.05g으로 혼합하였다.

이와 같이 수득된 원물 10g에 200ml의 증류수를 첨가하여 상온 또는 가열하에 환류 추출한 후, 여과 및 감압 농축을 통해 복합 추출물 1.17g을 획득하였다. 그 결과 획득한 복합 추출물을 "시료 1"이라 지칭하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1. 항산화 효과

본 시험예에서는 본 발명에 따른 복합 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여 당업계에서 자주 사용되는 자유라디칼 소거 시험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 자유라디칼 소거 시험은 안정적인 2,2-디페닐-1-피크릴-히드라질(DPPH)의 흡광도가 517 nm에서 최대값을 나타내는 원리에 기초한 것이다. 따라서, 자유라디칼 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록, 즉 자유라디칼 소거율이 증가될수록, 517 nm에서의 흡광도는 감소하게 된다.

먼저 상기 실시예 1에서 획득한 시료 1의 복합 추출물을 메탄올에 희석시킨 용액 100 μl (농도: 100 μg/ml)에 0.2 mM DPPH(Sigma) 용액 100 μl를 첨가하였다. 이어서, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대조군은 DPPH 100 μl 및 메탄올 100 μl를 넣어 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.

하기 식 1을 이용하여 자유라디칼소거율을 산출하였다.

[식 1]

자유라디칼소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

그 결과, 시료 1의 자유라디칼소거율(%)은 복합 추출물의 농도가 100 μg/ml일 때, 86.56%인 것으로 산출되었다. 이는 본 발명에 따른 복합 추출물이 유의적인 항산화 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.

시험예 2. 케라티노사이트(keratinocyte)에 대한 세포 독성

본 시험예에서는 본 발명에 따른 복합 추출물이 효과를 나타내고자 하는 특정 세포에 대해서만 선택성을 가질 수 있는지 확인하고자 하였다. 즉, 본 발명에 따른 추출물은 피지 세포(sebocyte)에 대해서는 억제 효과를 나타낼 수 있어야 하지만, 부작용을 나타내지 않기 위해서는 케라티노사이트의 세포생존율을 저해하지 않고 독성을 나타내지 않아야 한다.

이를 위해, 복합추출물의 세포 독성(cell viability)를 확인할 수 있도록 MTS 분석을 수행하였다.

HaCaT 세포(Human Keratinocyte)를 96-웰 플레이트에 1x10⁴ cells/well, 100μl/well이 되도록 분주하였다. 세포를 배양하기 위한 배지로서, 10% FBS (Gibco, 16000-044) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Sigma, P4458)이 보충된 DMEM (Gibco, 11965-092) 배지를 사용하였다. 그 후, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 복합 추출물을 0.39 내지 100 μg/ml 범위 내에서 다양한 농도별로 세포에 각각 처리하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다.

음성대조군으로서 추출물의 용매로 사용한 DMSO를 사용하였다.

MTS (Promega, G3581, Cell titer 96 Aqueous One solution) 20 μl를 첨가하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, Envision(Perkin-Elmer, A485-MTS assay 96well)을 이용하여 세포수를 측정하였다.

실험 결과를 나타낸 도 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 추출물은 농도 0.39 μg/ml, 0.78 μg/ml, 1.56 μg/ml, 3.12 μg/ml, 6.25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml를 증가시키면서 인간 케라티노사이트를 처리하였을 때, DMSO를 사용한 대조군에 비해 세포생존율의 유의적인 차이가 없었다. 즉, 본 발명에 따른 추출물은 고농도로 사용하더라도 인간 케라티노사이트의 생존율에 대해서는 영향을 미치지 않는다. 이는 본 발명에 따른 추출물이 정상세포에 대한 독성과 같이 예상하지 못한 부작용을 나타내지 않을 것이라는 점을 의미한다.

시험예 3. 피지 세포의 생장 억제

상기 시험예 2와 달리 본 시험예에서는 본 발명에 따른 복합 추출물이 효과를 나타내고자 하는 피지 세포(sebocyte)에 대해 세포성장을 유의적으로 억제할 수 있는지 확인하고자 하였으며, 이를 위해 MTS 분석을 수행하였다.

피지 세포(human Sebocyte, Celprogen, 36079-01)를 콜라겐이 코팅된 96-웰 플레이트에 1x10⁴ cells/well, 100μl/well이 되도록 분주하였다. 세포를 배양하기 위한 배지로서, Celprogen사에서 구입한 M36079-01S (2 part kit consisting of Basal medium and frozen supplement) 배지를 사용하였다. 그 후, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 복합 추출물을 0.39 내지 100 μg/ml 범위 내에서 다양한 농도별로 세포에 각각 처리하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다.

실험 결과를 나타낸 도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 추출물은 농도 0.39 μg/ml, 0.78 μg/ml, 1.56 μg/ml, 3.12 μg/ml, 6.25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml를 증가시키면서 인간 피지세포를 처리하였을 때, 복합 추출물의 농도가 25 μg/ml 이상의 조건에서 DMSO를 사용한 대조군에 비해 농도 의존적으로 피지세포의 생존율이 억제된다는 것이 입증되었다.

특히, 본 발명에 따른 추출물을 동일한 농도로 처리하되 24시간과 48시간을 비교하면, 48시간 처리하였을 때가 24시간 처리하였을 때에 비해 피지세포의 생존율이 훨씬 더 억제된다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 추출물이 인간 케라티노사이트에 대해서는 영향을 미치지 않지만, 피지세포에 대해서는 선택적으로 세포성장 억제능을 나타내며, 이는 농도의존적으로 그리고 시간의존적으로 나타난다. 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 추출물이 피지세포의 성장 억제능을 통해 우수한 피지 분비 억제 효과를 나타낸다는 것을 보여주는 것이다.

시험예 4. 케라티노사이트에서 분비하는 염증성 사이토카인의 억제능

사이토카인은 면역반응에 작용하는 신호 분자로서 감염과 손상에 대한 방어 기작에서 중요한 역할을 한다고 알려져 왔다. 피부에서 염증 반응을 매개하는 사이토카인에는 TNF-α, IL-6 등이 있는 것으로 보고되고 있다.

본 시험은 복합 추출물이 케라티노사이트(Keratinocyte)에서 염증을 유발하는 사이토카인 IL-6의 분비를 억제할 수 있는지 확인하기 위해 수행되었다.

케라티노사이트 세포 HaCaT를 96-웰 플레이트(corning costar, 3599)에 1x10⁴ cells/well, 100 μl/well의 농도로 분주하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터로 하루 동안 배양하였다. 세포를 배양하기 위한 배지로서, 10% FBS (Gibco, 16000-044) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Sigma, P4458)이 보충된 DMEM (Gibco, 11965-092) 배지를 사용하였다.

다음날 배지를 제거하고, 0.39 내지 100 μg/ml 범위 내에서 다양한 농도의 복합 추출물과 100 ng/mL LPS(Sigma, L2630, 용매는 증류수 사용)를 포함한 배지를 세포에 첨가하고 24시간 동안 처리하였으며, 그 후 세포의 상층액을 시험에 사용하였다. 음성대조군으로서 추출물의 용매 DMSO를 사용하였다.

IL-6 포획 항체(capture antibody)를 96-웰 Nunc-Immuno™ polystyrene ELISA 플레이트(Greiner 655061)에 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 4℃에서 24시간 동안 코팅하였다. 여기서, IL-6 포획 항체는 BD OptEIA^TM anti-human IL-6 모노클로날 항체를 사용하였다. 또한, BD OptEIA^TM Human IL-6 ELISA (BD Bioscience, Cat. No. 555220)와 BD OptEIA^TM Reagent Set B (pH 9.5 buffer, Cat. No. 550534)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 진행하였다.

상기 코팅한 플레이트를 세척 버퍼액(51-9003739)으로 3회 세척한 후, 24시간 처리한 세포의 상층액 50 μl와 Assay Diluent(51-2641KC) 50 μl를 첨가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후 3회 세척하고, 검출 항체(Detection antibody)와 Streptavidin-HRP 100 μl를 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 여기서, 검출 항체는 비오티닐화 항-인간 IL-6 모노클로날 항체를 사용하였다.

2시간 후 3회 세척하고 substrate를 넣고 반응시키면 TMB 반응에 의해 색깔이 변화된다. Standard의 색 변화를 관찰하면서 반응이 종료되면 종결 용액(51-2608KZ, 1M 인산)을 넣고 반응을 종료시켰다. 그 후, Flexstation을 이용하여 흡광도 450nm에서 측정하였다.

실험 결과를 나타낸 도 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 추출물은 DMSO를 사용한 대조군에 비해 농도 의존적으로 케라티노사이트에서 분비된 IL-6을 감소시킨다는 것이 입증되었다. 특히, 본 발명에 따른 추출물의 농도가 25 μg/ml 이상인 조건에서 농도 의존적인 경향이 두드러지게 나타났다.

따라서, 본 발명에 따른 추출물이 염증성 사이토카인 IL-6의 생성을 억제함으로써 인간 피부세포에 대해 항염 효과가 있다는 점이 입증되었다.

시험예 5. 대식세포에서 분비하는 염증성 사이토카인의 억제능

앞서 시험예 5에서 살펴본 바와 같이, 피부에서 염증 반응을 매개하는 사이토카인에는 IL-6 외에도 TNF-α(종양괴사인자 알파)가 있다. TNF-α는 피지세포의 지질 형성(Lipogenesis)을 유도하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 시험은 복합 추출물이 대식세포(Macrophage)에서 염증과 지질 형성을 유도하는 사이토카인 TNF-α의 분비를 억제함으로써 피지의 양을 감소시키고 염증을 완화시키는지 확인하기 위해 수행되었다.

마우스 대식세포 Raw264.7을 96-웰 플레이트(corning costar, 3599)에 1x10⁴ cells/well, 100 μl/well의 농도로 분주하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터로 하루 동안 배양하였다. 세포를 배양하기 위한 배지로서, 10% FBS (Gibco, 16000-044) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Sigma, P4458)이 보충된 DMEM (Gibco, 11965-092) 배지를 사용하였다.

TNF 포획 항체(capture antibody)를 96-웰 Nunc-Immuno™ polystyrene ELISA 플레이트(Greiner 655061)에 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 4℃에서 24시간 동안 코팅하였다. 여기서, TNF 포획 항체는 anti-mouse TNF 항체를 사용하였다. 또한, BD OptEIA^TM Mouse TNF-α ELISA (BD Bioscience, Cat. No. 555268)와 BD OptEIA^TM Reagent Set A (pH 6.5 buffer, Cat. No. 550536)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 진행하였다.

상기 코팅한 플레이트를 세척 버퍼액(51-9003739)으로 3회 세척한 후, 24시간 처리한 세포의 상층액 50 μl와 Assay Diluent(51-2641KC) 50 μl를 첨가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후 3회 세척하고, 검출 항체(Detection antibody)와 Streptavidin-HRP 100 μl를 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 여기서, 검출 항체는 비오티닐화 항-마우스 TNF 항체를 사용하였다.

실험 결과를 나타낸 도 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 추출물은 DMSO를 사용한 대조군에 비해 농도 의존적으로 대식세포에서 분비된 TNF-α를 현저하게 감소시킨다는 것이 입증되었다.

따라서, 본 발명에 따른 추출물이 염증성 사이토카인 TNF-α의 생성을 억제함으로써 피지 생성 저해 및 항염 효과가 있다는 점이 입증되었다.

시험예 6. 항균 효과

본 시험예에서는 본 발명에 따른 추출물의 여드름균에 대한 항균 효과를 측정하기 위하여, P.acnes(Propionibacterium acnes)에 대한 최소 억제 농도(Minimum inhibitory concentration : MIC)를 확인하는 실험을 진행하였다.

RCM(Reinforced Clostridial Medium) 액체 배지 10ml에 혼복추출물을 각 농도별로 처리하였다. 그리고 P.acnes를 활성화시켜, 최종농도 10⁵ CFU/ml가 되도록 접종하였다. 접종 후, 37℃에서 각각 3일 동안 배양하여 MIC를 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 복합 추출물의 MIC는 200 ppm으로 산출되었다. 또한, 복합 추출물이 처리되지 않은 대조군에서는 여드름균이 제한받지 않고 활발하게 증식되는 것이 관찰된 반면, 혼합추물물이 5,000ppm 이상 함유되었을 때는 여드름균(P.acnes)의 생장이 현저하게 저해되는 것이 관찰되었다.

따라서, 본 발명의 복합 추출물이 여드름균에 대해 우수한 항균력을 가지므로, 여드름을 근본적으로 치유하는 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

시험예 7. 인비보 테스트 (1)

본 발명에 따른 복합 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 다음과 같은 조성비의 에센스 제형으로 제조하였다. 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

번호	성분	함량 (%)
1	정제수	잔량
2	글리세린	10.00
3	시료 1	2.0
4	부틸렌글라이콜	5.00
5	카올린	4.00
6	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.00
7	사이클로메티콘	1.00
8	마그네슘알루미늄실리케이트	1.00
9	피이지-100 스테아레이트, 글리세릴스테아레이트	2.00
10	잔탄검	0.10
11	에탄올	3.00
12	메틸파라벤	0.20
13	클로페네신	0.10
14	착향료	미량

PIE사의 YANUS-3 장비를 사용하여 임상 평가를 진행하였다. 상기 표 1의 에센스 조성물을 매일 아침 저녁으로 35세 남성에게 2차례 도포하여, 실험 전과 6주 후의 피지 분비량을 확인하였다. 이 때, 피지 측정은 YANUS-3 장비의 UV 촬영 모드를 사용하여 이마, 코, 양 볼의 피지량을 각각 측정하였으며, 피지는 하얀 점으로 나타난다.

그 결과는 도 5에 나타낸 바와 같이, 하얀 점으로 나타나는 피지의 수가 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있다.

또한, 도 6은 실험 6주 후의 피지 분비량을 실험 전 수치를 기준으로 얼굴 전체와 부분에서 상대적인 감소율을 나타낸 그래프이다. 본 발명에 따른 에센스를 사용함으로써 얼굴 전체와 부분에서 피지가 유의적으로 감소되었음을 정량적으로 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 복합 추출물은 피지 분비를 효과적으로 감소시킴으로써 피지의 과잉 분비로 인해 여드름이 발생하는 것을 예방할 수 있다.

시험예 8. 인비보 테스트 (2)

앞서 시험예 7에서 제조한 복합 추출물을 함유하는 에센스 조성물을 여드름 피부를 갖고 있는 17세 남성에게 4주 동안 매일 아침과 저녁에 얼굴 피부에 도포하여 여드름 치료 효과를 관찰하였다.

PIE社의 YANUS-Ⅲ 장비의 편광 모드를 이용하여, 복합 추출믈을 함유하는 에센스 조성물을 사용하기 전과 6주 동안 사용한 후의 안면을 촬영하였다. 그 결과는 도 6에서 보는 바와 같이, 에센스를 4주 동안 사용했을 때 여드름 치료 효과가 현저하게 나타난다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 에센스를 사용하기 전에는 없었던 새로운 염증의 발생도 일어나지 않았음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 복합 추출물은 여드름 피부를 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 우수하며, 다양한 제형을 통해 인간 피부에게 적용될 수 있다.

Claims

흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎의 추출물을 포함하는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물을 용매로 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 흰버드나무 껍질, 녹차 잎, 병풀 잎, 오카무라큰실말, 커피 콩, 베르가모트 잎 및 소나무 잎을 각각 10.0 내지 30.0 중량부, 10.0 내지 30.0 중량부, 10.0 내지 30.0 중량부, 10.0 내지 20.0 중량부, 1.0 내지 20.0 중량부, 0.1 내지 10.0 중량부, 및 0.1 내지 10.0 중량부의 비율로 혼합하여 추출한 생성물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.