KR20130032421A - 감국 추출물을 이용한 멜라닌 저색소증 개선제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 티로시나제 활성을 촉진하고 Trp-1/2 및 활성형 ERK(p-ERK)의 발현을 촉진하며 또한 멜라닌의 생성을 촉진하는 감국 추출물을 이용한 멜라닌 저색소증 개선제 조성물을 개시한다.

Description

감국 추출물을 이용한 멜라닌 저색소증 개선제 조성물{Composition for the Improvement of Leukoderma Using an Extract of Chrysanthemum indicum}

본 발명은 감국 추출물을 이용한 멜라닌 저색소증 개선제 조성물에 관한 것이다.

감국(Chrysanthemum indicum)은 국화과에 속하는 다년생 초본으로서 꽃잎이 황색이고 6~10월에 걸쳐 개화하며, 크기가 1.5 cm 내외인 꽃 봉우리가 줄기 끝부분에 밀집되어 있다. 한의학에서는 약제로 사용하는 꽃이 단맛이 나기 때문에 감국(甘菊)이라 하였고, 그 꽃이 해열, 소염 및 혈압 저하 작용이 있으며, 신경쇠약에 의해서 일어나는 두통과 결핵균 및 각종 바이러스에 대한 억제효과 등의 약효가 알려져 있다(DanBensky, R. and Andrew, G., 1986. Chinese herbal medicine. Estland Press, Seattle. p.59). 특히 감국은 예로부터 약용, 향료, 국화주 및 음식물의 첨가제로서도 널리 애용되어 왔다.

이러한 감국의 주요 약리성분으로는 chrysanthermine, camphor 등이 밝혀져 있다(송주택, 1984. 한국자원식물. 미도출판사, p.1048). 또한 apigenin, luteolin, acacetin 및 그의 flavonoid 배당체들(Ryu, S. Y., Choi, S. U., Lee, C. O., Lee, S. H., Ahn, J. W. and Zee, O. P. 1994, Antitumor activity od some phenolic component in plants. Arch . Pharm . Res ., 17, 42.; Chatterjee, A., Saeker, S. and Saha, S. K. 1981. Acacetin 7-O-galactopyranoside from Chrysanthemum indicum . Phytochem., 20, 1760.) lactone류(Chen, Z. and Peijuan, X. 1987. Structural determination of yejuhua lactone, isolated from Chrysanthemum indicum L. Yaoxue Xuebao , 22, 67 : Chem. Abstr . 106, 135326p), 정유(精油)(Uchio, Y., Tomosue, K., Nakayama, M., Yamamura, A. and Wakai, T. 1981. Constituents of the essential oils from three terpenoid species of Chrysanthemum . Phytochem ., 20, 2691), sesquiterpene(Mladenova, K., Tsankova, E. and Hung, D. 1988. New sesquiterpenoid Chrysanthemum indicum var. tuneful . Planta Med., 54, 553), 감국의 새로운 알칼로이드 배당체 성분(Jung, K. Y., Oh, S. R., Kim, J. H. and Lee, H. K., 1996. A new alkyl alcohol glycoside from sesquiterpenoids from Chrysanthemi Flos. Kor . J. Pharmacogn 27 : 15-19) 등의 생약학적인 측면에서 연구가 수행되었으며, 식품학적인 측면에서는 전통주 제조의 고품질화를 위해 에탄올 추출 조건의 최적화에 대한 보고(Park, N. Y., 1995. Volatile flavors of wild and cultivated Chrysanthemum and optimation of ethanol extraction. MS Thesis Kyungpook National University, Daegu, Korea. p 1-41)가 있었다.

또한 감국 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물이 항산화 활성과 항바이러스 활성을 가진다고 알려져 있다(한국 특허 제10-0665313호).

본 발명은 감국 추출물이 멜라닌 저색소증 개선 활성, 피부 미백 활성 등 피부 관련 활성을 가짐을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 멜라닌 저색소증 개선제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 멜라닌 저색소증 개선제 조성물에 관한 것이다.

사람의 모발이나 피부색은 일반적으로 모발이나 피부에 존재하는 멜라닌 색소의 양에 의하여 결정된다.

멜라닌은 표피 내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라닌 세포(Melanocyte)에서 티로신으로부터 도파를 거쳐 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 생성되는데, 이러한 멜라닌 생합성 과정에는 티로시나제(Tyrosinase) 이외에도, Trp-1/2(티로시나제 연관 단백질-1/2)가 관여하는 것으로 알려져 있으며(Korner와 Pawelek, Science (1982) 217:1163-1165; Kobayashi 등, EMBO J (1994) 13:5818-5825; Yokoyama 등, Biochim Biophys Acta (1994) 1217:317-321), 또한 티로시나아제 발현의 상위 신호로서는 고리형 AMP(cAMP)와 그것에 의한 ERK1/2(Extracellular signal-activated kinases-1/2)의 지속적인 활성화가 관여하는 것으로 알려져 있다(Marshall, Cell (1995) 80:179-185; Busca와 Ballotti, Pigment Cell (2000) 13:60-69).

멜라닌은 햇빛 중 자외선의 빛 에너지를 흡수하여 피부 깊숙이 있는 세포들을 자외선에 의한 손상으로부터 보호하는 역할을 하지만, 멜라닌이 비정상적으로 과잉 생산되면 기미, 주근깨, 색소 침착 등과 같은 피부색소 이상 침착 증상이 발생되며, 반대로 적게 생산되면 백반증(vitiligo), 탈색소 모반, 백색 비강진(pseudoleucoderma atopicum), 어루러기(Tinea versicolor), 반상 경피증, 알레르기, 염증 후 탈색증, 특발성 적상 저색소증, 탈색소 모반, 부분 백피증 등의 멜라닌 저색소증 질환(Leukoderma)이 발생한다(Bolognia와 Pawelek, J Am Acad Dermatol (1988) 19:217-255; Pinto와 Bolognia, Pediatr Clin North Am (1991) 38:991-1017). 상기 멜라닌 저색소증 질환 중 백반증은 멜라닌 세포가 파괴되어 발병하는 질환이고, 나머지의 질환은 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 양의 감소로 인해 발병하는 질환이다.

본 발명자들은 아래의 실험예에서 확인되는 바와 같이, 감국 꽃잎의 80% 에탄올(정확히는 에탄올 함량이 80%(v/v) 에탄올 수용액임) 추출물 및 열수 추출물이 티로시나제 활성을 촉진하고 Trp-1/2 및 활성형 ERK(p-ERK)의 발현을 촉진하며 나아가 멜라닌의 생성을 촉진함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 멜라닌 저색소증 개선제 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 멜라닌 저색소증 개선제 조성물은 감국 꽃잎 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "감국 꽃잎 추출물"은 감국 꽃잎을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매에 침지시켜 얻어진 추출물을 의미한다. 감국 꽃잎 추출물을 에탄올 수용액에 침지시겨 얻는 한, 추출 방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 추출 방법이 모두 적용될 수 있다. 상기 추출물은 추출 용매가 제거된 농축된 액상 또는 고형상의 추출물일 수 있다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서 "개선"이란 증상의 경감을 포함하여 질환의 예방, 치료를 포함하는 의미이다.

본 발명의 멜라닌 저색소증 질환 개선제 조성물은 멜라닌 생성이 정상 수준에 이르지 못하여 발생하는 모든 질환에 사용될 수 있는데, 예컨대 백반증, 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증, 점상 백피증 모두에 그 개선 목적으로 사용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 멜라닌 저색소증 질환 개선제 조성물은 멜라닌 생성 감소로 인하여 발생하는 질환 즉 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증, 점상 백피증 등에 사용되는 경우이다.

본 발명의 저색소증 질환 개선제 조성물은 그 유효성분인 감국 꽃잎 추출물을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양으로 포함할 수 있는데, 통상적으로는 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 내지 15중량%로 포함할 것이다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백제 조성물에 관한 것이다.

아래의 실험예에서 개산초나무 잎 추출물의 티로시나제 저해 활성을 확인할 수 있다.

본 명세서에서, "개산초나무 잎 추출물"은 추출 대상이 개산초나무 잎이라는 점을 제외하고는 상기 감국 꽃잎 추출물과 동일한 의미로서 이해될 수 있다. 개산초나무(Zanthoxylum planispinium)는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과의 상록활엽 관목으로 한국(전남·경북·경남), 일본, 대만, 중국 등에 분포하며 개산초나무를 포함한 초피속 식물(genus Zanthoxylum) 추출물이 항코로나바이러스 활성을 가지는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 피부 미백제 조성물에 있어서, 유효성분의 의미, 유효량 등과 관련하여서는 전술한 바가 그대로 유효하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 감국 꽃잎 추출물 및/또는 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선제 조성물에 관한 것이다.

아래의 실험예에서 감국 꽃잎 추출물 및/또는 개산초나무 잎 추출물이 여드름균으로 알려진 Propionibacterium acnes에 대해 항균 활성을 가질 뿐만 아니라 임상평가에 있어서도 여드름 치료 효과가 있는 것으로 나타났다.

특히 감국 꽃잎 추출물과 개산초나무 잎 추출물을 함께 사용하였을 경우에 여드름 균에 대한 상승적 항균 활성을 나타내었으며, 이와 유사하게 임상평가에 있었어도 감국 꽃잎 추출물과 개산초나무 잎 추출물을 모두 포함한 화장료 조성물의 여드름 치료 효과가 월등히 높은 것으로 나타났다.

그러므로 본 발명의 여드름 개선제 조성물은 감국 꽃잎 추출물과 개산초나무 잎 추출물을 모두 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 여드름 개선제 조성물에 있어서, 유효성분의 의미, 개선의 의미, 유효량 등과 관련하여서는 전술한 바가 그대로 유효하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항히스타민제 조성물로 파악할 수 있고, 또 다른 측면에 있어서 본 발명은 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물로 파악할 수 있으며, 또 다른 측면에 있어서 본 발명은 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 조성물로 파악할 수 있다.

아래의 실험예는 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물이 탈과립 억제 활성(베타-헥소사미니다아제 유리 억제 활성(β-hexosaminidase, 항히스티만 활성), 임상평가를 통해 얻은 아토피성 피부염 개선 활성 및 자외선 차단 활성을 가짐을 보여준다.

또 본 명세서에서, "자외선"이란 장파장 자외선(320～400nm, 이하 "UVA"라 칭함) 및/또는 중파장 자외선(280～320nm, 이하 "UVB"라 칭함)을 의미한다. 자외선은 장파장 자외선인 UVA와 중파장 자외선인 UVB 그리고 단파장 자외선(200～280nm, 이하 UVC라 칭함)으로 분류되는데, 이중 지상에 도달하는 자외선 영역은 290～400nm이며 그 광량은 태양광선 중 약 6%를 차지하며 이중 UVB가 약 0.5%, UVA가 나머지 5.5%를 차지할 정도로 UVA의 광량이 상대적으로 많다. UVA와 UVB는 홍반, 수포, 피부 주름 등을 유발한다고 알려져 있다.

본 발명의 항히스타민제 조성물, 아토피성 피부염 개선제 조성물 및 자외선 차단용 조성물과 관련하여 개선의 의미, 유효성분의 의미, 유효량 등과 관련하여서는 전술한 바가 그대로 유효하다.

본 발명의 멜라닌 저색소증 개선제 조성물, 피부 미백제 조성물, 여드름 개선제 조성물, 항히스타민제 조성물, 아토피 피부염 개선용 조성물 및 자외선 차단용 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서 화장료 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로서 파악될 경우, 그 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장료의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에 알려진 피부 보습 활성 물질, 항아토피 활성 물질, 항여드름 활성 물질, 미백 활성 물질 등 기능성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어 비누 조성물로서 파악될 수 있다.

본 발명의 조성물이 비누 조성물로서 파악될 경우에, 본 발명의 비누 조성물은 비누 기재에 유효성분을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체 중량을 기준으로 하였을 때 99.999 중량 % 내지 50 중량 %로 첨가될 수 있으며, 첨가제는 1 중량 % 내지 20 중량 %로 첨가될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 감국 꽃잎 추출물 및/또는 개산초나무 잎 추출물을 이용한 멜라닌 저색소증 개선제 조성물, 피부 미백제 조성물, 여드름 개선제 조성물, 항히스타민제 조성물, 아토피성 피부염 개선용 조성물 및 자외선 차단용 조성물을 제공할 있다.

이러한 본 발명의 조성물들은 화장품, 비누 또는 약품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 감국 꽃잎의 80% 에탄올 추출물 및 열수 추출물이 B16/F10 흑색종 세포주에서 티로시나제 활성을 촉진함을 보여주는 결과이다.
도 2는 감국 꽃잎의 80% 에탄올 추출물 및 열수 추출물이 B16/F10 흑색종 세포주에서 티로시나제 관련 단백질의 발현을 촉진시킴을 보여주는 결과이다.
도 3은 감국 꽃잎의 80% 에탄올 추출물이 B16/F10 흑색종 세포주에 처리될 때 멜라닌 색소의 생합성이 촉진되어 세포는 전체적으로 검게 보이고 세포 형태가 변화되었음을 보여주는 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 감국 꽃잎 추출물 및 개산초나무 잎 추출물의 제조

<실시예 1> 감국 꽃잎 70% 에탄올 추출물의 제조

제주도 중산간 지대에서 재배되는 감국 꽃잎을 10월 말경에 채취하고 -60℃이하에서 급속 동결시키고 가정용 믹서를 사용하여 분쇄하였다. 감국 꽃잎 분말을 1kg에 70% 에탄올 3ℓ를 가하고 24시간 동안 상온에서 교반·추출하였다. 추출액을 2㎛ 여과지로 여과한 후 그 여과액을 감압 농축하여 고형상의 추출물을 얻었다.

<실시예 2> 감국 꽃잎의 80% 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 제조

상기 <실시예 1>과 동일한 방식으로 얻어진 감국 꽃잎 분말 400g을 5ℓ삼각플라스크에 넣고, 각각 4ℓ의 80% 에탄올과 증류수를 가하고, 80% 에탄올에서는 24시간 추출하였고, 증류수 추출은 Auto clave를 이용하여 100℃, 120℃, 두 온도에서 2시간 추출하였다. 추출액은 여과하고, 여과액을 40℃에서 회전농축기로 농축하고 동결 건조하여 고형상의 추출물을 얻었다.

<실시예 3> 감국 꽃잎 정유 추출물의 제조

감국 꽃잎 정유 추출물의 제조는 감국 꽃잎 분말 200g을 1ℓ의 증류수가 들어있는 추출기에 넣고 3시간 동안 리비히 냉각기를 따라 흐르는 증류물을 약 200~300㎖를 수집하였다. 이 증류물을 분액깔때기에서 동량의 diethylether를 가하여 3회 분획하였다. 모아진 상층을 다시 분액깔때기에서 소량의 증류수로 세척한 다음, 추출물을 무수 MgSO₄로 충분히 탈수하고 여과하였다. 여과물을 회전농축기를 이용하여 감압하지 않고 40℃에서 용매를 증발시켜 유동성 잔유물인 정유를 얻었다. 이 정유 추출물은 아래의 여드름 균의 항균 활성 실험에 사용하였다.

<실시예 4> 개산초나무 잎 추출물의 제조

개산초나무 잎을 건조시키고 가정용 믹서를 사용하여 분쇄한 후에 그 분말 1kg에 70% 에탄올 3ℓ를 가하고 24시간 동안 상온에서 교반·추출하였다. 추출액을 2㎛ 여과지로 여과한 후 그 여과액을 감압 농축하여 고형상의 추출물을 얻었다.

< 제조예 > 감국 꽃잎 추출물과 개산초나무 잎 추출물을 이용한 화장료 조성물의 제조

아래의 [표 1]에서와 같이, 상기 실시예의 감국 꽃잎 추출물과 개산초나무 잎 추출물을 통상의 화장료 성분들과 혼합하여 화장료 조성물을 제조하였다.

화장수 조성물의 성분 및 함량(중량%)

성분	제조예 1	제조예 2	제조예 3
<실시예1>의 감국 꽃잎 추출물	3.0	-	-
<실시예4>의 개산초나무 잎 추출물	-	3.0	-
<실시예1>의 추출물과 <실시예4>의 추출물의 동량의 혼합물	-	-	3.0
바셀린	5.0	5.0	5.0
글리세린	4.0	4.0	4.0
1,3-부틸글리콜	3.0	3.0	3.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0	3.0
폴리솔베이트20	0.2	0.2	0.2
폴리옥시에틸렌알킬에테르	0.5	0.5	0.5
밀납	3.0	3.0	3.0
유동 파라핀	5.0	5.0	5.0
스쿠알란	4.0	4.0	4.0
카르복시비닐폴리머	0.5	0.5	0.5
토코페릴아세테이트	0.1	0.1	0.1
방부제	0.05	0.05	0.05
향료	0.05	0.05	0.05
정제수	잔량

< 실험예 > 멜라닌 저색소증 개선 활성 실험, 미백 활성, 여드름 개선 활성, 아토피성 피부염 개선 활성 및 자외선 차단 활성

<실험예 1> 멜라닌 저색소증 개선 활성 실험

<실험예 1-1> 티로시나제 활성 분석

상기 <실시예 2>의 80% 에탄올 감국 꽃잎 추출물과 100℃, 120℃ 열수 추출물을 이용하여 세포내 티로시나제 활성을 분석하였다.

분석 쥐(Mus musculus)의 B16/F10 흑색종 세포주를 6 well plate에 5×10⁴/mL이 되게 준비한 후, 24시간 동안 37℃, CO_{2 ,} 항온기에서 배양하고, 시료 자체를 31, 63, 125, 250 mg/mL의 농도로 각각 처리하였다. 72 시간 동안 37℃, CO_{2 ,} 항온기에서 배양하였으며 36시간이 지난 후, 배지 교체와 동시에 시료를 다시 동일한 농도로 처리하였다.

세포를 트립신-EDTA를 이용하여 수확하였다. 이렇게 수확된 세포에 0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)와 1% Triton X-100을 함유한 67mM 인산 나트륨 완충용액(pH 6.8)을 500mL 처리하고 초음파로 분쇄하였으며, 이 상태로 1시간 동안 얼음에서 보관하였다. 1시간 후, 4 원심분리기에서 15,000rpm으로 20분간 원심분리하였으며 상층액을 취하여 세포내 티로시나제 활성분석에 사용했다.

세포 내 티로시나제 활성분석은 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정했다. 120mL의 67mM 인산 나트륨 완충용액(pH 6.8)에 기질로서 5mL의 1.5mM L-tyrosine과 40mL의 25mM L-DOPA를 혼합한 후 위에서 얻은 상층액 100mL를 처리하여 37℃ 항온기에서 30분간 반응시켰다.

반응액 중에 생성된 L-DOPA와 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. 적정농도의 버섯 티로시나제의 활성과 비교하여 농도의존적인 시료의 활성을 측정하였고, 각각의 데이터는 단백질의 양으로 보정하여 나타내었다.

결과를 [도 1]에 나타내었다.

[도 1]을 참조하여 보면, 250 mg/mL의 농도로 처리시 80% 에탄올 추출물(CHR-80)의 경우, 세포 내 티로시나제 활성이 처리하지 않은 대조군에 비해 약 5배 정도 높아지는 양상을 확인할 수 있었고, 멜라닌 생합성 유도물질인 MSH 처리시에 비해 약 14%정도 높아지는 양상을 관찰할 수 있었다. 그러나 100℃ 열수 추출물(CHR-00)의 경우, 약 2.5배 정도 높아지는 양상과 MSH 처리시에 비해 약 43% 낮은 활성을 보였고, 120℃ 열수 추출물(CHR-20)의 경우, 약 4배 정도 높아지고 MSH 처리시에 비해 약 9% 낮은 활성이 관찰되었다.

<실험예 1-2> 티로시나제 관련 단백질의 발현 양상 분석

<실시예 2>의 80% 에탄올 추출물과 100℃, 120℃ 열수 추출물을 이용하여 티로시나제 단백질 발현양상을 분석하였다.

B16/F10 흑색종 세포(5×10⁴/mL)에 시료를 125, 250, 500mg/mL의 농도로 처리한 다음 72시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 먼저 배지를 제거하고, 1×PBS 1mL를 첨가하여 scraper로 수거하여, 4℃, 2,000rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 세척하였다. 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 100mL RIPA buffer (10×RIPA, 0.1M PMSF, 0.1M Na₃VO₄, 0.5M NaF, 5mg/mL aprotinin, 5mg/mL leupeptin)를 첨가하여 30분 동안 용해시켰으며, 4℃, 13,000rpm에서 20분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다.

단백질 농도는 Bradford 방법을 이용하여 정량하였다(Bradford et al., 1976). 배양세포로부터 얻어진 30mg의 단백질 시료를 10% SDS-PAGE (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 전기영동으로 분리하고, 전이용액 (25mM Tris, 192mM glycine, 20% methanol, pH 8.3)을 사용하여 단백질을 PVDF (Polyvinyldene fluoride) membrane (Millipore)에 200mA로 2시간 동안 전이시켰다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)용액에서 상온에서 1시간 동안 실시하였다.

p-ERK의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 mouse monoclonal anti-p-ERK (Santa-Cruz), Tyrosinase의 항체로는 goat polyclonal anti-Tyrosinase (Santa-Cruz), Trp-1의 항체로는 goat polyclonal anti-Trp-1 (Santa-Cruz), Trp-2의 항체로는 rabbit polyclonal anti-Trp-2 (Santa-Cruz), β-actin의 항체로 mouse monoclonal anti-β-actin (SIGMA)을 5% skim milk가 함유된 TTBS용액에 희석하여 4℃, 24시간 동안 반응시켰다. TTBS 용액으로 세척한 후, 2차 항체로는 HRP (Horse Radish peroxidase)가 결합된 anti-goat, anti-mouse, anti-rabbit IgG를 5% Skim milk가 함유된 TTBS용액에 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, membrane을 TTBS로 세 번 세척 후 ECL kit(Amersham Cat. No. RPN2106V2)을 사용하여 1~3분간 반응시킨 후 X-ray 필름으로 현상하였다(Sambrook, J. and Russell, D. W., 2001).

결과를 [도 2]에 나타내었다.

[도 2]를 참조하여 보면 세 가지 조건의 추출물 모두에서 티로시나제 (Tyrosinase)와 티로시나제 연관 단백질 1 (Trp-1)의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다. 이는 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 두 가지 효소의 활성을 높여주는데 영향을 주고 있음을 시사하며, 이중 80% 에탄올 추출물(CHR-80)의 경우가 가장 강한 티로시나제 활성을 보여주고 있었고, 세 추출물 모두 농도 의존적인 티로시나제 활성 증가 양상을 보여주고 있음이 확인되었다.

<실험예 1-3> 세포 형태 관찰

쥐(Mus musculus)의 B16/F10 흑색종 세포주를 6 well plate에 1.25×10⁴/mL이 되게 준비한 후, 24시간 동안 37℃, CO_{2 ,} 항온기에서 배양하고, 이에 <실시예 2>의 80% 에탄올 추출물 시료를 250mg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간이 지난 후, 37 CO_{2 ,} 항온기에서 꺼내어 광학현미경(Olympus, japan)하에서 200배의 배율로 세포형태를 관찰하였다.

결과를 [도 3]에 나타내었다.

[도 3]을 참조하여 보면, 3가지 조건의 추출물 중에서 가장 활성이 좋은 것으로 판명된 80% 에탄올 추출물(CHR-80)을 250 mg/mL 농도로 처리하여, B16/F10 흑색종 세포의 형태변화를 관찰한 결과, 처리하지 않은 세포에 비해 멜라닌 색소의 생합성이 촉진되어 세포는 전체적으로 검게 보이고 또 다른 차이점은 수상돌기의 생성이 많아지면서 세포의 형태가 변화되었음을 관찰할 수 있었다.

<실험예 2> 미백 활성 - 티로시나아제 억제 활성

티로시나아제 저해 활성은 Kubo 등의 방법(Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998(46):5338-5341)으로 측정하였다.

구체적으로 0.1M potassium phosphate buffer(pH6.8)에 2.5 mM의 3,4-다이하이드록시-L-페닐알라닌(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine; L-DOPA, Sigma, USA) 1 ㎖를 첨가하여 25℃에서 10분간 교반한 후, 아래의 [표 2]와 같이 농도별로 상기 실시예에서 얻어진 개산초나무 잎 추출물의 수용액을 0.1 ㎖ 첨가하였다. 그 후 버섯에서 분리된 티로시나아제 0.1㎖ (138 units)를 첨가하여 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하여, 시료가 첨가되지 아니한 음성대조군과 비교하여 아래의 식에 따라 티로시나아제 저해율을 평가하였다.

티로시나아제 저해율(%) = [(A-B)/A]×100

A: 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 475nm에서 흡광도

B: 시료를 첨가한 반응용액의 475nm에서 흡광도

개산초나무 잎 추출물의 티로시나아제 저해율(㎍/㎖)

처리농도(㎍/㎖)	티로시나아제 저해율(%)
50	12.7
100	19.5
200	31.4

상기 [표 2]의 결과는 개산초나무 잎 추출물이 티로시나제 저해 활성을 보여주며, 개산초나무 잎 추출물이 피부 미백제로서 사용될 수 있음을 보여준다.

<실험예 3> 여드름 개선 활성

<실험예 3-1> 여드름균에 대한 항균 활성 - 최소억제농도의 측정

상기 실시예 추출물의 ATCC로부터 구입한 여드름균(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 최소억제농도로 측정하였다.

먼저 상기 <실시예 3>의 감국 꽃잎 추출물, <실시예 4>의 개산초나무 잎 추출물 및 <실시예 3>의 감국 꽃잎 추출물과 <실시예 4>의 개산초나무 잎 추출물의 동량의 혼합물이 농도별(0.01~5.0%(w/v))로 첨가된 GAM Semisolid(Nissui) 아가배지를 제조하고 여기에 여드름균을 접종하여 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 세균의 증식 정도를 Microplate reader(Powerwave XS, BioTek)로 650 nm에서 측정하여 상기 여드름균의 증식이 억제되는 추출물의 농도를 결정하였다.

결과를 [표 3]에 나타내었다.

시험균	MIC(%)
실시예 3의 추출물	0.20
실시예 4의 추출물	0.10
실시예 3의 추출물과 실시예 4의 추출물의 동량의 혼합물	0.07

상기 [표 3]의 결과는 <실시예 3>의 감국 꽃잎 추출물과 <실시예 4>의 개산초나무 잎 추출물 모두 여드름 균에 대한 항균 활성을 보임을 보여준다. 특히 <실시예 3>의 감국 꽃잎 추출물과 <실시예 4>의 개산초나무 잎 추출물의 동량의 혼합물의 여드름 균에 대한 항균 활성이 가장 높다.

<실험예 3-2> 여드름 개선 활성에 대한 임상평가

상기 제조예의 화장료 조성물을 이용하여 여드름 개선 활성에 대한 임상평가를 실시하였다. 비교예의 화장료 조성물로서는 상기 [표 1]에서 실시예의 추출물 대신에 정제수 더 포함되어 제조된 화장료 조성물을 사용하였다.

여드름 증상을 갖고 있는 남녀 40명을 네 그룹으로 어느 3 그룹에는 상기 제조예의 화장료 조성물을, 1 그룹에는 비교예의 화장료 조성물을 매일 2회씩 4주간 사용하게 하였다. 2주째와 4주째에 치료 효과가 있다고 응답한 사용자의 수를 아래의 [표 4]에 나타내었다.

여드름 개선 활성에 대한 임상평가 결과

구분	제조예 1	제조예 2	제조예 3	비교예
2주	2명	1명	7명	1명
4주	5명	4명	3명	0명

상기 [표 4]의 결과도 [표 3]의 결과와 유사한 경향을 보이며 <실시예 1>의 감국 꽃잎 추출물을 사용한 <제조예 1>의 화장료 조성물과 <실시예 4>의 개산초나무 잎 추출물을 사용한 <제조예 2>의 화장료 조성물 모두 여드름 개선 활성을 보임을 보여주며, 특히 <실시예 1>의 감국 꽃잎 추출물과 <실시예 4>의 개산초나무 잎 추출물의 동량의 혼합물을 사용한 <제조예 3>의 경우가 가장 우수한 여드름 개선 활성을 보임을 보여준다.

<실험예 4> 탈과립 억제 활성 측정 - β- hexosaminidase assay

RBL-2H3 세포주를 10% FBS(Fetal bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM(Dulbeccos' modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. RBL-2H3 세포주를 monoclonal antibody IgE(0.5㎍/ml)로 활성화시킨 후, 활성화된 세포에 안티젠(DNP-HSA) 200ng/㎖을 처리하고 상기 <실시예 1>의 감국 꽃잎 추출물과 <실시예 4>의 개산초나무 잎 추출물을 농도별로 처리하여 30분 동안 배양하였다. 10분간 ice bath에 처리하여 반응을 정지시킨 후 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 0.02㎖의 상등액에 0.02㎖의 기질액 1mM p-NAG(p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide)를 처리한 후, 이를 37℃, 5% CO₂에서 60분간 반응시킨 다음 0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃ 0.2ml를 가하여 반응을 정지시켰다. 405 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 결과를 베타-헥소사미니다아제의 유리 억제 효과에 대해 50% 억제하는데 필요한 농도(IC₅₀)로 아래의 [표 5]에 나타내었다. 베타 헥소사미니다제 분비 양의 억제는 면역세포의 탈과립화를 방지함을 의미하며 결과적으로 항히스타민 활성을 가짐을 의미한다.

베타-헥소사미니다아제 유리 억제 활성(IC₅₀, ㎍/㎖)

시료	IC50 (㎍/ml)
실시예 1의 감국 꽃잎 추출물	47.54
실시예 4의 개산초나무 잎 추출물	35.63

상기 [표 5]의 결과는 <실시예 1>의 감국 꽃잎 추출물과 <실시예 4>의 개산초나무 잎 추출물 모두 베타-헥소사미니다아제 유리 억제 활성을 가짐을 보여준다.

<실험예 5> 아토피성 피부염 개선 활성에 대한 임상평가

상기 제조예의 화장료 조성물을 이용하여 감국 꽃잎 추출물과 개산초나무 잎 추출물의 아토피성 피부염 개선 활성에 대한 임상평가를 실시하였다. 비교예의 화장료 조성물로서는 상기 [표 1]에서 실시예의 추출물 대신에 정제수 더 포함되어 제조된 화장료 조성물을 사용하였다.

먼저 아토피성 피부염을 앓고 있는 소아 15명을 3그룹으로 나누고 매일 2회씩 총 6주간 상기 각 제조예 및 비교예의 화장료 조성물을 도포하게 하였다.

6주 후의 아토피성 피부염의 개선 정도를 The European Task Force on Atopic Dermatitis가 개발한 SCORAD 지수(SCORing Atopic Dermatitis Index, 아토피 증상이 심할수록 높은 수치로 나타남)로 평가하여 아래의 [표 6]에 나타내었다.

SCORAD 지수

구분	도포 전(평균값)	도포 후(평균값)
제조예 1의 화장료 조성물	46.72±8.94	28.63±11.32**
제조예 2의 화장료 조성물	52.54±11.32	34.53±9.54
비교예의 화장료 조성물	42.27±10.28	44.38±9.93
* 모든 실험 결과는 Mean±SD 값으로 나타냈으며, ANOVA 분석을 실시하고, Duncan 테스트로 유의차를 검증하였다(p<0.05이고 **는 p<0.01임).

상기 [표 6]의 결과는 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물이 포함된 제조예의 화장료 조성물이 실시예의 추출물이 포함되지 아니한 비교예의 화장료 조성물에 비해 뚜렷하게 아토피성 피부염 개선 활성이 있음을 보여준다.

<실험예 6> 자외선 차단 효과 측정 실험

상기 제조예의 화장료 조성물의 SPF(Sun Protection Factor) 및 PFA(Protection Factor of UVA)를 식품의약품안전청 고시한 기능성 화장품 방법 중 자외선 차단 기능 시험법에 따라 측정하였다. 상기 [표 1]에서 감국 꽃잎 추출물 대신에 정제수 더 포함되어 제조된 비교예의 화장료 조성물의 SPF와 PFA를 함께 측정하여 감국 꽃잎 추출물의 자외선 차단 효과를 평가하였다. SPF/PFA가 높을수록 UVB/UVA 차단효과가 우수하다는 것을 의미한다.

결과를 [표 7]에 나타내었다.

SPF/UVA 측정 결과

구분	SPF	UVA
제조예 1의 화장료 조성물	22.5	8.7
제조예 2의 화장료 조성물	17.2	7.4
비교예의 화장료 조성물	13.8	4.6

상기 [표 7]의 결과는 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물이 자외선 차단 효과를 가지고 있음을 보여준다.

Claims (7)

1. 감국 꽃잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증 개선제 조성물.
   
2. 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백제 조성물.
   
3. 감국 꽃잎 추출물 및 개산초나무 잎 추출물 모두를 유효성분으로 포함하는 여드름 개선제 조성물.
   
4. 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항히스타민제 조성물.
   
5. 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선제 조성물.
   
6. 감국 꽃잎 추출물 또는 개산초나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 차단제 조성물.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
   

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