CN116440034A - 奇兰茶发酵物的制备方法及改善皮肤状态的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种奇兰茶发酵物的制备方法，包含下述步骤。提供发酵原料，所述的发酵原料包含奇兰茶叶。提供发酵菌液，所述的发酵菌液包含酵母菌。进行发酵步骤，其混合发酵原料与发酵菌液，以得混合物，并将混合物于发酵温度下培养发酵时间，以得发酵后产物。去除发酵后产物的固体成分，以得奇兰茶发酵物。借此，可有效地萃取奇兰茶的有效成分并保留其活性，以避免传统的萃取方法所造成的活性成分流失及有机溶剂的危害。另外，本发明同时提供一种包含奇兰茶发酵物的改善皮肤状态的组合物。

Description

奇兰茶发酵物的制备方法及改善皮肤状态的组合物
技术领域
本发明是关于一种发酵物的制备方法，特别是关于一种奇兰茶发酵物的制备方法以及包含奇兰茶发酵物的改善皮肤状态的组合物。
背景技术
自古至今，茶叶被广泛地应用于饮品、食品、保健品等相关领域。奇兰茶为一种盛产于福建省的乌龙茶，其色泽温润、滋味醇厚滑爽回甘并带有兰花般的香气，使奇兰茶在市场上广受欢迎。再者，奇兰茶具有丰富的茶多酚，其包含儿茶素、黄酮类等茶叶特有的多酚类物质，是广为人知的天然抗氧化剂，并具有温和与良好的抗氧化、抗自由基等功能。
皮肤是人体最大的器官，它可以帮助人体阻挡外来物的入侵，同时它也有排汗、保暖、阻隔、感觉的作用，是以如何使皮肤状态保持于最佳的水嫩、白皙状态遂成为相关美容业者所致力发展的目标。在茶叶应用于护肤品的开发方面多以传统的水煮方式搭配化学物质来萃取其有效成分，然而，以水煮搭配化学物质萃取的方式不仅效率低下，更容易因高温或化学物质的作用而破坏茶叶中的活性物质，同时也可能使所得的萃取物带有不益于肌肤的残留物质。再者，以化学物质萃取而得的茶叶萃取物对于动物细胞有一定的毒杀力，使得茶叶相关的护肤品或化妆品的应用多有局限。
因此，如何提供一种能改善上述缺点，并可将茶叶有效地应用于美容护肤的相关领域的策略，实为相关学界及业界所致力发展的目标。
发明内容
本发明的一态样是在于提供一种奇兰茶发酵物的制备方法，包含下述步骤。提供发酵原料，其中所述的发酵原料包含奇兰茶叶，且奇兰茶叶以70℃至80℃的温度干燥而制得。提供发酵菌液，其中所述的发酵菌液包含酵母菌。进行发酵步骤，其混合所述的发酵原料与所述的发酵菌液，以得混合物，并将混合物于发酵温度下培养发酵时间，以得发酵后产物，其中所述的发酵温度为20℃至50℃，所述的发酵时间为10小时至50小时。去除发酵后产物的固体成分，以得奇兰茶发酵物。
依据前述实施方式的奇兰茶发酵物的制备方法，其中所述的发酵原料可以0.1～5g的奇兰茶叶与100～300mL的水混合而得。
依据前述实施方式的奇兰茶发酵物的制备方法，其中所述的发酵菌液的浓度可为105CFU/mL至108CFU/mL。
依据前述实施方式的奇兰茶发酵物的制备方法，其中于所述的混合物中，发酵菌液与奇兰茶叶的混合比例可为5～10mL:1～5g。
依据前述实施方式的奇兰茶发酵物的制备方法，其中所述的奇兰茶发酵物的pH值可为4.5至6.8。
依据前述实施方式的奇兰茶发酵物的制备方法，其中所述的奇兰茶发酵物可包含3.0～10.0mg/mL的蛋白质、6.0～12.0mg/mL的粗多糖、1.0～5.0mg/mL的总黄酮以及0.5～1.6mg/mL的总酚。
依据前述实施方式的奇兰茶发酵物的制备方法，可还包含灭菌步骤，其对发酵后产物进行灭菌处理，且所述的固体成分可利用离心方式、过滤方式或上述方式的组合而去除。
本发明的另一态样在于提供一种改善皮肤状态的组合物，包含有效剂量的奇兰茶发酵物，其中所述的奇兰茶发酵物利用如前段所述的奇兰茶发酵物的制备方法所制得。
依据前述实施方式的改善皮肤状态的组合物，其中所述的改善皮肤状态的组合物可用以降低皮肤的黑色素指数。
依据前述实施方式的改善皮肤状态的组合物，其中所述的改善皮肤状态的组合物可用以提高皮肤的保湿能力。
借此，本发明的奇兰茶发酵物的制备方法采用酵母菌对奇兰茶叶进行发酵，不仅可有效地萃取奇兰茶的有效成分并保留其活性，以避免传统的萃取方法所造成的活性成分流失及有机溶剂的危害，进而使本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物可应用于改善皮肤状态的组合物中，并具有保湿、美白等功效，使本发明的奇兰茶发酵物的制备方法及改善皮肤状态的组合物具有优异的市场应用潜力。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1为绘示本发明的奇兰茶发酵物的制备方法的步骤流程图；
图2为本发明的奇兰茶发酵物的总酚含量分析图；
图3为本发明的奇兰茶发酵物的总黄酮含量分析图；
图4为本发明的奇兰茶发酵物的透明质酸酶抑制效果的分析结果图；
图5A为本发明的奇兰茶发酵物的酪氨酸酶抑制效果的分析结果图；
图5B为本发明的奇兰茶发酵物的黑色素抑制效果的分析结果图；以及
图6为本发明的奇兰茶发酵物的改善肌肤含水量的分析结果图。
具体实施方式
下述将更详细讨论本发明各实施方式。然而，此实施方式可为各种发明概念的应用，可被具体实行在各种不同的特定范围内。特定的实施方式是仅以说明为目的，且不受限于公开的范围。
[本发明的奇兰茶发酵物的制备方法]
请参照图1，其为绘示本发明的奇兰茶发酵物的制备方法100的步骤流程图。奇兰茶发酵物的制备方法100包含步骤110、步骤120、步骤130以及步骤140。
步骤110为提供发酵原料，其中所述的发酵原料包含奇兰茶叶。详细而言，本发明的发酵原料中的奇兰茶叶以70℃至80℃的温度干燥而制得，且发酵原料以0.1～5g的奇兰茶叶与100～300mL的水混合而得，而奇兰茶叶也可先进行适当的裁切工序而成细块或粉末后再进行与水混合，但本发明并不以此为限。较佳地，发酵原料可以3g的奇兰茶叶与300mL的水混合而得。
步骤120为提供发酵菌液，其中发酵菌液包含酵母菌。详细而言，本发明所使用的酵母菌可为但不限于任何品系的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，而在将酵母菌用于进行发酵之前将先进行预处理步骤。在预处理步骤方面，首先将酵母菌放入呈现液体的PDA培养基中并于培养箱中进行活化，而后将活化的酵母菌涂布接种于平板培养基上而挑选单一菌落进行扩增，并以25℃至50℃的条件培养至OD值＝0.5～1.0，此时的酵母菌将处于对数期而具有较佳的活性，即可用于后续的发酵。较佳地，发酵菌液的浓度可为105CFU/mL至108CFU/mL，但本发明并不以此为限。
步骤130为进行发酵步骤，其混合所述的发酵原料与所述的发酵菌液，以得混合物，并将混合物于发酵温度下培养发酵时间，以得发酵后产物。具体而言，于所述的混合物中，发酵菌液与奇兰茶叶的混合比例可为5～10mL:1～5g。较佳地，于所述的混合物中，发酵菌液与奇兰茶叶的混合比例可为5mL:1g。另外，在发酵步骤中，发酵温度为20℃至50℃，而发酵时间为10小时至50小时。在上述温度范围下，酵母菌具有最佳的发酵效率。再者，若发酵时间过短，将使奇兰茶叶的有效成分无法充分释出；反之，若发酵时间过长，则可能使其他杂菌滋生而影响发酵的品质。较佳地，发酵温度可为30℃，发酵时间可为48小时，但本发明并不以此为限。
步骤140为去除发酵后产物的固体成分，以得奇兰茶发酵物。详细而言，在经过步骤110至步骤130的处理后，奇兰茶叶的有效成分已全数进入奇兰茶发酵物中，而在将发酵后产物中的固体成分去除后，余下的液体成分为本发明的奇兰茶发酵物，其中奇兰茶发酵物的pH值可为4.5至6.8，且奇兰茶发酵物可包含3.0～10.0mg/mL的蛋白质、6.0～12.0mg/mL的粗多糖、1.0～5.0mg/mL的总黄酮以及0.5～1.6mg/mL的总酚。
另外，在本发明的奇兰茶发酵物的制备方法100中，可还包含灭菌步骤，其对发酵后产物进行灭菌处理，而固体成分则可利用离心方式、过滤方式或上述方式的组合而去除，但本发明并不以此为限。具体而言，发酵后产物可在121℃的条件下高压灭菌15分钟，以使其中的酵母菌失活并去除其他杂菌，而灭菌后的发酵后产物将进一步以4000r/min至12000r/min、离心半径为9公分至12公分的条件离心20分钟后收集上清液，所述的上清液即为本发明的奇兰茶发酵物。
借此，本发明的奇兰茶发酵物的制备方法100采用酵母菌对奇兰茶叶进行发酵，在萃取过程中也不添加任何有机试剂，如此一来不仅可有效地萃取奇兰茶的有效成分并保留其活性，避免传统的萃取方法所造成的活性成分流失及有机溶剂的危害，还可使本发明的奇兰茶发酵物的制备方法100所制得的奇兰茶发酵物具有优异的生物安全性，并可用于改善皮肤状态的组合物等美容品与化妆品中，而具有优异的市场应用潜力。
[本发明的改善皮肤状态的组合物]
本发明的改善皮肤状态的组合物包含本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物，其中奇兰茶发酵物具有温和的pH值并富含与保湿功能相关的多糖以及与抗氧化及抗敏功能相关的多酚与黄酮，可降低皮肤的黑色素指数与提高皮肤的保湿能力，是以本发明的改善皮肤状态的组合物具有优异的保湿、美白、提亮、舒缓等功效而有绝佳的市场应用潜力。
另外，本发明的改善皮肤状态的组合物的剂型可为液剂、乳剂、霜剂、安瓿、胶囊、丸剂、锭剂、粉末、颗粒、凝胶，并可应用于乳液、化妆水、精华液、隔离霜、洗面奶、面膜或防晒乳上，但本发明并不以此为限。
[实施例与比较例]
一、本发明的奇兰茶发酵物
以下将以实施例1的奇兰茶发酵物来详细说明本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物的性质，并进一步分析其应用于皮肤保湿、美白、舒缓等效果。
实施例1的奇兰茶发酵物是以下述步骤制得。首先，将5mL扩增培养后的浓度为105CFU/mL至108CFU/mL的发酵菌液接种至发酵原料中，其中发酵原料以5g的奇兰茶叶粉末和300mL的水混合而得，接着将前述的混合物于30℃的培养箱中培养48小时后，将所得的发酵后产物以121℃的条件高压灭菌15分钟而使酵母菌失活，而后将灭菌后的发酵后产物以4500r/min、离心半径为9公分的条件离心20分钟后收集上清液，此上清液即为本发明实施例1的奇兰茶发酵物。
实施例1的奇兰茶发酵物在外观上呈现浅褐色半透明状态的液体，而利用现有的酸碱度或粘度测定法(如酸碱度计定法及旋转粘度测定计)测得其pH值为4.5至6.8，粘度为10cP至15cP。再者，实施例1的奇兰茶发酵物的可溶性固含物的含量约为0.9wt％至2.0wt％，菌落总数小于50CFU/mL，且无致病菌检出，符合化妆品的品质要求。
二、本发明的奇兰茶发酵物的成分分析
本试验是利用高效液相层析(HPLC)并参照试验方法GB/T 30483-2013来分析实施例1的奇兰茶发酵物的成分。另外，本试验同时以高效液相层析分析实施例1的奇兰茶发酵物的儿茶素种类与含量，而分析儿茶素种类与含量的高效液相层析的检测条件列示于表一。
另外，本试验同时包含以传统的水煮方式处理奇兰茶叶而未经过任何发酵的比较例1(以下称为“比较例1的奇兰茶水萃物”)，以进一步分析以本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物的有效成分含量。
由高效液相层析的结果显示，每毫升的实施例1的奇兰茶发酵物含有3.0mg至10.0mg的蛋白质、6.0mg至12.0mg的粗多糖、1.0mg至5.0mg的总黄酮以及0.5mg至1.6mg的总酚。再请参照表二，其为实施例1的奇兰茶发酵物的儿茶素含量分析结果。
由表二的内容可知，实施例1的奇兰茶发酵物包含表儿茶酚(epicatechin,EC)与表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)，其中表儿茶酚具有抗氧化、清除自由基、广效抗菌能力等生物活性，而实施例1的奇兰茶发酵物中含有大量的表儿茶酚，显示其具有优异的抗衰老、抑菌、消炎等功效。然而，比较例1的奇兰茶水萃物中并未有表儿茶酚，显示本发明的奇兰茶发酵物的制备方法可有效地萃取奇兰茶的蛋白质、多糖、黄酮与儿茶素等有效成分，并具有优异的市场应用潜力。
三、本发明的奇兰茶发酵物的总酚含量测定
本试验是参照试验方法GB/T 8313-2018而利用福林酚试剂(Folin-Ciocalteu’sphenol reagent)来测定实施例1的奇兰茶发酵物的相对总酚含量，并使用没食子酸(gallic acid,GA)作为标准品，而总酚含量则以没食子酸的当量来表示。
在实验方面，首先以去离子水进行稀释而配制浓度为10、20、30、40、50μg/mL的没食子酸溶液，以作为标准曲线之用，并另配制7.5％的Na2CO3溶液作为实验试剂。接着，取1mL的实施例1的奇兰茶发酵物加入5mL的10mol/L的福林酚试剂混合均匀后，再加入4mL的7.5％Na2CO3混合均匀，于室温下避光静置1小时后，使用分光光度计测定其于波长765nm下的吸光值，并将所得数据依标准曲线换算成没食子酸的当量，而后依照式(I)计算实施例1的奇兰茶发酵物的总酚含量，式(I)如下：
X＝C×10×n；
其中X为样品中总酚的含量(mg/L)，C为由标准曲线计算而得的待测液中总酚的含量(mg/L)，而n则为样品的稀释倍数。
另外，本试验同样包含前述的比较例1的奇兰茶水萃物，以进一步分析以本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物的总酚含量。
请参照图2与表三，图2为本发明的奇兰茶发酵物的总酚含量分析图，而表三则呈现实施例1的奇兰茶发酵物与比较例1的奇兰茶水萃物的总酚含量分析结果。
如图2与表三所示，实施例1的奇兰茶发酵物的总酚含量为1.211±0.011mg/mL，明显多于比较例1的奇兰茶水萃物的总酚含量，显示本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物具有高含量的总酚而有优异的自由基清除效果，并有潜力应用于具有保湿、美白、提亮、舒缓功效的改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中，具有相关市场的应用潜力。
四、本发明的奇兰茶发酵物的总黄酮含量测定
本试验是利用化学反应呈色法测定实施例1的奇兰茶发酵物的相对总黄酮含量，并使用芦丁(Rutin)作为标准品，而总黄酮含量则以芦丁的当量来表示。
在实验方面，首先精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL的芦丁标准储备液(纯度≥90.0％)分别置于25mL容量瓶中并加水至6mL，接着依序加入1mL的5％亚硝酸钠溶液(静置反应6分钟)、1mL的10％硝酸铝溶液(静置反应6分钟)与10mL的4.3％氢氧化钠试液(静置反应15分钟)，以配制浓度为0.0、8.0、16、24、32、40、48μg/mL的芦丁溶液而作为标准曲线之用，并另配制10％的硝酸铝溶液作为实验试剂。接着，取2mL的实施例1的奇兰茶发酵物并加水至6mL，接着依序加入1mL的5％亚硝酸钠溶液(静置反应6分钟)、1mL的10％硝酸铝溶液(静置反应6分钟)与10mL的4.3％氢氧化钠试液(静置反应15分钟)后，使用分光光度计测定其于波长510nm下的吸光值，并将所得数据依标准曲线换算成芦丁的当量，而后依照式(II)计算实施例1的奇兰茶发酵物的总黄酮含量，式(II)如下：
其中X为样品中总黄酮的含量(g/100mL或g/100mL)，C为由标准曲线计算而得的待测样品的总黄酮浓度(mg/mL)，V1为试样定容体积(mL)，V2为吸取试样溶液体积(mL)，V3为显色定容体积(mL)，而M为试样取样量(g或mL)。
另外，本试验同样包含前述的比较例1的奇兰茶水萃物，以进一步分析以本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物的总黄酮含量。
请参照图3与表四，图3为本发明的奇兰茶发酵物的总黄酮含量分析图，而表四则呈现实施例1的奇兰茶发酵物与比较例1的奇兰茶水萃物的总黄酮含量分析结果。
如图3与表四所示，实施例1的奇兰茶发酵物的总黄酮含量为2.841±0.270mg/mL，明显多于比较例1的奇兰茶水萃物的总黄酮含量，显示本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物具有高含量的总黄酮而有优异的自由基清除效果，并有潜力应用于具有保湿、美白、提亮、舒缓功效的改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中，具有相关市场的应用潜力。
五、本发明的奇兰茶发酵物的透明质酸酶抑制效果分析
透明质酸(hyaluronic acid)主要存在于皮肤、关节、玻璃体等组织中，并具有维持细胞结构、保水与修复组织等功用，而透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)则是能降解透明质酸并降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的一种酶，是以本试验通过测定实施例1的奇兰茶发酵物的透明质酸酶的抑制效果，进而评估其应用于保湿、除皱等改善皮肤状态的效果。
在实验方面，首先取0.1mL的CaCl2与0.5mL的透明质酸酶于37℃的条件下水浴20分钟后，加入0.5mL的实施例1的奇兰茶发酵物并再次以37℃的条件下水浴20分钟，接着加入0.5mL的透明质酸钠后依序于37℃的条件下水浴30分钟并于常温反应5分钟。而后，加入0.1mL的NaOH并于冰上冷却5分钟后，再次加入0.1mL的乙酰丙酮并于100℃的条件下反应30分钟，并在冷却后加入1.0mL的埃尔利希试剂并于常温反应20分钟后，使用分光光度计测定其于波长555nm下的吸光值。
请参照图4，其为本发明的奇兰茶发酵物的透明质酸酶抑制效果的分析结果图。如图4所示，体积百分率为25％的实施例1的奇兰茶发酵物的透明质酸酶抑制率大于20％，而体积百分率为100％的实施例1的奇兰茶发酵物的透明质酸酶抑制率更可达95％以上，显示本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物具有优异的透明质酸酶抑制效果，并有潜力应用于具有保湿、美白、提亮、舒缓功效的改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中，具有相关市场的应用潜力。
六、本发明的奇兰茶发酵物的酪氨酸酶抑制效果与黑色素抑制效果分析
人体皮肤黑色素的形成起因于集中在表皮底层的黑色素细胞(Melanocytes)。当角质细胞受到阳光照射，便会活化黑色素细胞中的酪氨酸酶(Tyrosinase)活性，进而启动一连串的化学反应并产生黑色素(Melanin)，此时含有大量黑色素的黑色素体便释放到角质细胞中，使皮肤变黑，是以抑制酪氨酸酶活性被视为减少黑色素产生并达成美白效果的关键步骤。因此，本试验通过测定实施例1的奇兰茶发酵物对于B16黑色素瘤细胞株(B16melanoma cells，以下称为“B16细胞”)的酪氨酸酶抑制效果，进而评估其美白的功效。
在实验方面先依照下表五的配方进行试剂的配制。
而后，将试剂C1于37℃的条件下水浴10分钟后，加入1mL的酪氨酸酶并继续以37℃的条件反应10分钟后，使用分光光度计测定其于波长475nm下的吸光值，并同时将试剂C2于37℃的条件下水浴10分钟后，在波长475nm下归零。接着，比照试剂C1与试剂C2的处理方式而分别对样品T1与样品T2进行处理，并根据式(III)计算实施例1的奇兰茶发酵物对于酪氨酸酶的抑制率，式(III)如下：
酪氨酸酶抑制率(％)＝[(C1-T1)/C1]×100％；
其中T1为样品T1的吸光值，即实施例1的奇兰茶发酵物与酪氨酸酶反应后溶液的吸光值，C1为试剂C1于波长475nm的吸光值的3次平均值，即未加实施例1的奇兰茶发酵物时酪氨酸酶的反应吸光值。
请参照图5A与图5B，图5A为本发明的奇兰茶发酵物的酪氨酸酶抑制效果的分析结果图，图5B为本发明的奇兰茶发酵物的黑色素抑制效果的分析结果图。如图5A与图5B所示，实施例1的奇兰茶发酵物可以抑制B16细胞的酪氨酸酶活性，其抑制效果呈剂量依赖型的趋势，且实施例1的奇兰茶发酵物同样可以有效降低B16细胞中的黑色素含量，显示本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物可降低皮肤的黑色素指数而具有相当的美白功效，并有潜力应用于具有保湿、美白、提亮、舒缓功效的改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中，具有相关市场的应用潜力。
七、本发明的奇兰茶发酵物的保湿能力评估
本试验是利用经皮水分散失量(trans-epidermal water loss，TEWL)做为皮肤表层含水量的指标，以评估实施例1的奇兰茶发酵物的保湿能力。另外，本试验同样包含前述的比较例1的奇兰茶水萃物，以进一步评估以本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物的保湿能力。
在实验方面，首先在3位受试者的手臂皮肤设定对照区域及实验区域(各为3cm×3cm)，并利用市售的经皮水分散失测定仪TM300(Courage+KhazakaElectronic)检测对照区域及实验区域的皮肤的经皮水分散失量。接着，将使用量为2.0±1.0mg/cm2的实施例1的奇兰茶发酵物与比较例1的奇兰茶水萃物单次涂抹于实验区域的皮肤上，但不对对照区域的皮肤进行任何处理，并于测试前、使用后第1天、使用后第5天、使用后第7天及使用后第14天测量经皮水分散失量，并将所测得的数据以对照区域的经皮水分散失量数据进行校正而得皮肤含水量的评估结果。
请参照图6，其为本发明的奇兰茶发酵物的改善肌肤含水量的分析结果图。如图6所示，在使用后第14天，受试者使用实施例1的奇兰茶发酵物后的皮肤含水量明显高于比较例1的奇兰茶水萃物的皮肤含水量，显示使用实施例1的奇兰茶发酵物的经皮水分散失量较少。由此可见，本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物具有优异保湿功效并可提高皮肤的保湿能力，并有潜力应用于改善皮肤状态的组合物或其他化妆品之中而具有相关市场的应用潜力。
八、本发明的奇兰茶发酵物的安全性评估
本试验是利用封闭式贴布试验(Closed Patch Test)评估实施例1的奇兰茶发酵物对皮肤的潜在刺激性，以确认本发明的奇兰茶发酵物应用于人体的安全性。在实验方面，首先将0.2mL至0.25mL的实施例1的奇兰茶发酵物滴加于滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器中备用。在受试者方面，随机选择年龄为18岁至60岁共30位受试者，并以无刺激性的胶带于每位受试者的背部固定2个斑试器，使斑试器中的滤纸片贴附于受试者的背部皮肤上24小时，在试验期间内不移除斑试器，也尽量避免斑试器沾染汗液或水。另外，每个试验组别皆对应设定控制组，控制组以0.20mL至0.25mL的蒸馏水进行测试。在测试24小时后取下斑试器，并分别于取下斑试器30分钟后、24小时后及48小时后观察斑试器下的皮肤(以下称为“受试区域”)及受试区域周围的皮肤是否出现红斑、浸润、水肿、丘疹及/或疱疹等过敏或发炎的症状。
请参照表六，其为实施例1的奇兰茶发酵物的安全性测试结果。安全性测试结果共分五个等级，其中图号“-”代表受试区域为阴性反应而未有任何过敏或发炎的症状，图号“±”代表受试区域出现可疑反应(如：具有轻微的红斑)，图号“+”代表受试区域出现弱阳性反应(也称为红斑反应，即出现红斑、浸润、水肿及/或丘疹)，图号“++”代表受试区域出现强阳性反应(也称为疱疹反应，即出现红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，且疱疹反应超出受试区域以外的皮肤)，图号“+++”代表受试区域出现极强阳性反应(也称为融合性疱疹反应，即出现明显红斑、严重浸润、水肿、融合性丘疹，且融合性疱疹反应超出受试区域以外的皮肤)。另外，于表六中同时计算反应程度为阳性反应(即图号为+、++与+++)的人数，以更清楚确认本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物的人体安全性。
如表六所示，在取下斑试器30分钟后、24小时后或48小时后，受试者在受试区域及其周围的皮肤皆无红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹及融合性疱疹等反应，显示本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物具有优异的生物安全性，并具有相关市场的应用潜力。
需补充的是，本发明虽以特定的菌株、特定的材料、特定的比例、特定的工艺、特定的分析方法或特定仪器做为例示，以说明本发明的奇兰茶发酵物具有美白、保湿等功效，惟本发明所属技术领域中技术人员可知，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的奇兰茶发酵物的成分与功效也可使用其他的菌株、其他的材料、其他的比例、其他的工艺、其他分析方法或其他仪器进行分析，且本发明并不以此为限。
综上所述，本发明的奇兰茶发酵物的制备方法采用酵母菌对奇兰茶叶进行发酵，在萃取过程中不添加任何有机试剂，如此一来不仅可有效地萃取奇兰茶的有效成分并保留其活性，还可避免传统的萃取方法所造成的活性成分流失及有机溶剂的危害。再者，本发明的奇兰茶发酵物的制备方法所制得的奇兰茶发酵物富含与保湿功能相关的多糖以及与抗氧化与抗敏功能相关的多酚与黄酮，且奇兰茶发酵物具有温和的pH值并可降低皮肤的黑色素指数与提高皮肤的保湿能力，并具有美白、提亮、舒缓等功效而可应用于改善皮肤状态的组合物中，具有优异的市场应用潜力。
虽然本发明已以实施方式公开如上，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。
【符号说明】
100:奇兰茶发酵物的制备方法
110,120,130,140:步骤。

Claims (10)

1.一种奇兰茶发酵物的制备方法，其特征在于，包含：
提供发酵原料，其中该发酵原料包含奇兰茶叶，且该奇兰茶叶以70℃至80℃的温度干燥而制得；
提供发酵菌液，其中该发酵菌液包含酵母菌；
进行发酵步骤，其混合该发酵原料与该发酵菌液，以得混合物，并将该混合物于发酵温度下培养发酵时间，以得发酵后产物，其中该发酵温度为20℃至50℃，该发酵时间为10小时至50小时；以及
去除该发酵后产物的固体成分，以得奇兰茶发酵物。
2.根据权利要求1所述的奇兰茶发酵物的制备方法，其中该发酵原料以0.1～5g的该奇兰茶叶与100～300mL的水混合而得。
3.根据权利要求1所述的奇兰茶发酵物的制备方法，其中该发酵菌液的浓度为105CFU/mL至108CFU/mL。
4.根据权利要求3所述的奇兰茶发酵物的制备方法，其中于该混合物中，该发酵菌液与该奇兰茶叶的混合比例为5～10mL:1～5g。
5.根据权利要求1所述的奇兰茶发酵物的制备方法，其中该奇兰茶发酵物的pH值为4.5至6.8。
6.根据权利要求1所述的奇兰茶发酵物的制备方法，其中该奇兰茶发酵物包含3.0～10.0mg/mL的蛋白质、6.0～12.0mg/mL的粗多糖、1.0～5.0mg/mL的总黄酮以及0.5～1.6mg/mL的总酚。
7.根据权利要求1所述的奇兰茶发酵物的制备方法，其中，还包含：
灭菌步骤，其对该发酵后产物进行灭菌处理，且该固体成分利用离心方式、过滤方式或上述方式的组合而去除。
8.一种改善皮肤状态的组合物，其特征在于，包含：
有效剂量的奇兰茶发酵物，其中该奇兰茶发酵物利用根据权利要求1至7任一项的制备方法所制得。
9.根据权利要求8所述的改善皮肤状态的组合物，其中该改善皮肤状态的组合物用以降低皮肤的黑色素指数。
10.根据权利要求8所述的改善皮肤状态的组合物，其中该改善皮肤状态的组合物用以提高皮肤的保湿能力。
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