TW202304931A - 生物素之製造方法，以及生物素之ｌ－離胺酸鹽及其製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的為提供將表生物素由生成物中有效率地去除，提高生物素之純度，可得到純度高的生物素之生物素之製造方法，以及生物素之L-離胺酸鹽及其製造方法，本發明提供一種生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其包含以下之步驟： (a)於溶劑中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液或懸浮液之步驟，及 (b)於步驟(a)中得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液的情況，由生物素之L-離胺酸鹽之溶液中使該生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟；以及 一種生物素之製造方法，其包含於藉由該製造方法製造生物素之L-離胺酸鹽後，使該生物素之L-離胺酸鹽與酸接觸，而得到生物素之步驟。

Description

生物素之製造方法，以及生物素之Ｌ－離胺酸鹽及其製造方法
本發明係關於生物素之製造方法，以及生物素之L-離胺酸鹽及其製造方法。
生物素為屬於維生素B群的水溶性維生素(非專利文獻1)。生物素被期待具有糖尿病預防效果、皮膚疾病改善效果、生物素缺乏症改善效果等，作為醫藥品、飼料添加劑等之需求增高。生物素係以下述式(1)表示，亦稱為D-生物素。
Figure 02_image001
如下述所示，生物素(BIF)係例如由脲基體(URD)經過7個步驟合成(專利文獻1)。
Figure 02_image003
此處，生物素除了上述式(1)表示之D-生物素以外，係具有7個異構物(非專利文獻2)。於合成D-生物素之過程中，例如，生成物中可能含有下述式(2)表示之L-生物素等之異構物。此等D-生物素以外之異構物，就安全性之觀點亦期望由生成物中被去除。
Figure 02_image005
揭示有藉由使D-生物素及L-生物素之消旋體與L(+)-精胺酸反應，作為難溶性之鹽而結晶化來進行純化，而提高D-生物素之純度的方法，但關於生物素之非鏡像異構物的表生物素(epibiotin)之分離去除，並無記載(非專利文獻3)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2018/025722號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Pierre J. de Clercq,“Biotin：ATimeless Challenge for Total Synthesis” Chemical Reviews, 1997, Vol. 97, No.6. [非專利文獻2]Toru YAMANO, Isao AOKI, and Kunio TAKANOHASHI “Direct Optical Resolution of (±)-Biotin and (±)-Epibiotin by a Reserved-Phase High-Performance Liquid Chromatography” J. Nutr. Sci. Vitaminol., 39, 419-423, 1993. [非專利文獻3]DONALD E. WOLF, RALPH MOZINGO, STANTON A.HARRIS, R. CHRISTIAN ANDERSON AND KARL FOLKERS “Biotin. VI. Resolution of dl-Biotin” CONTRIBUTION FROM THE RESEARCH LABORATORIES, JOURNAL of the American Chemical Society, 1945, Vol. 67, No. 12, 2100-2102
[發明所欲解決之課題]
以如上述之路徑來合成生物素時，含有生物素之生成物，可能含有非鏡像異構物等作為雜質。非鏡像異構物之中，尤其是下述式(3)表示之表生物素，為特別難以由生成物中去除之雜質。
Figure 02_image007
生成物中之表生物素之以高效能液相層析(HPLC)所得的面積百分率約有達到5%，因此亦可能成為生物素之純度降低的要因。該表生物素之去除，例如可藉由重複進行中和晶析處理、活性碳處理等之純化處理而為之，但亦可能產生生物素之產率降低之問題。因而，期望有將表生物素由生成物有效率地去除，提高生物素之純度的方法。
因此，本發明之目的，為提供將表生物素由生成物有效率地去除，提高生物素之純度，可得到純度高的生物素之生物素之製造方法。又，本發明之目的，為提供將表生物素由生成物有效率地去除，提高生物素之純度，可得到純度高的生物素之生物素之L-離胺酸鹽及其製造方法。 [用以解決課題之手段]
本發明者等人深入研究的結果，發現藉由於溶劑中，使含有生物素及表生物素之粗生物素與L-離胺酸接觸，得到生物素之L-離胺酸鹽後，使該生物素之L-離胺酸鹽與酸接觸來進行生物素之脫鹽處理，可得到純度高的生物素。
亦即，本發明包含以下之發明。 [1]一種生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其包含以下之步驟： (a)於溶劑中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液或懸浮液之步驟，及 (b)於步驟(a)中得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液的情況，由生物素之L-離胺酸鹽之溶液中使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟。 [2]如[1]之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中溶劑包含選自由水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種。 [3]如[1]或[2]之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中步驟(a)為於水中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液之步驟。 [4]如[1]~[3]中任一項之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中步驟(b)為藉由使生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑接觸，而使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟。 [5]如[4]之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中析出溶劑包含選自由甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種。 [6]如[4]或[5]之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中水與析出溶劑之體積比(析出溶劑/水)為5以上且30以下。 [7]如[4]~[6]中任一項之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中步驟(b)為藉由將生物素之L-離胺酸鹽之溶液於40℃以上且80℃以下加熱後，與析出溶劑接觸，之後於-10℃以上且10℃以下冷卻，而使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟。 [8]如[1]或[2]之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中步驟(a)為於含有選自由醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種之有機溶劑中，使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液之步驟。 [9]如[8]之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中有機溶劑為醇。 [10]如[8]或[9]之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中相對於粗生物素1g，有機溶劑之使用量為8mL以上。 [11]一種生物素之製造方法，其包含以如[1]~[10]中任一項之方法製造生物素之L-離胺酸鹽後，使該生物素之L-離胺酸鹽與酸接觸，而得到生物素之步驟。 [12]一種生物素之L-離胺酸鹽。 [13]如[12]之生物素之L-離胺酸鹽，表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量為0.035%以下。 [發明之效果]
依照本發明之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，可由粗生物素將表生物素有效率地去除，得到純度高的生物素之L-離胺酸鹽，藉由使用所得之生物素之L-離胺酸鹽，可製造純度高的生物素。又，本發明之生物素之製造方法中，係使用藉由本發明之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法所得到的純度高的生物素之L-離胺酸鹽來製造生物素，因此可得到純度高的生物素。因此，不用進行複數次之生成物之純化處理，即能夠以高產率得到純度高的生物素。如此所得之生物素，由於表生物素之含量少，因此例如可達成藉由生物素之HPLC面積百分率所得之含量(純度)為99.96%以上的超高純度。本發明中，「藉由HPLC面積百分率所得之含量」係遵照實施例記載之方法測定，HPLC係由實施例記載之條件進行。
生物素及表生物素由於為弱酸，故藉由與鹼性高的L-離胺酸接觸，可生成生物素之L-離胺酸鹽與表生物素之L-離胺酸鹽。生物素之L-離胺酸鹽與表生物素之L-離胺酸鹽，對特定溶劑之溶解度相異。該溶解度之差的大小，大於其他之生物素之鹼鹽與表生物素之鹼鹽對特定溶劑之溶解度之差。因此，藉由使生物素之L-離胺酸鹽及表生物素之L-離胺酸鹽，與一方之鹽的溶解度高、另一方之鹽的溶解度低之溶劑接觸，可得到溶解度高的鹽之溶液，與溶解度低的鹽之固體。藉此，能夠更有效率地分離生物素之L-離胺酸鹽與表生物素之L-離胺酸鹽。藉由使經分離之生物素之L-離胺酸鹽與酸接觸，可單離生物素。
以下詳細說明本發明。
本發明之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，包含以下之步驟： (a)於溶劑中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液或懸浮液之步驟，及 (b)於步驟(a)中得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液的情況，由生物素之L-離胺酸鹽之溶液中使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟。 再者，於步驟(a)中得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液的情況，係進行步驟(b)，但於步驟(a)中得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液的情況係不進行。
(粗生物素) 粗生物素含有生物素及表生物素。粗生物素典型而言為固體物。粗生物素中的生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量(純度)，依一例係為90%以上且未達99.92%。又，粗生物素中的表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量，依一例係為約5%以下。
粗生物素，可為由上述生物素合成的7個步驟中之第7步驟(stage 7)所得到的生成物。亦即，可認為於上述生物素合成的7個步驟中之第6步驟中，將乙烯基硫醚體(DVE)還原為N,N’-二苄基生物素(HVC)時，副生成N,N’-二苄基生物素之表異構物。可認為藉由針對該N,N’-二苄基生物素之表異構物於第7步驟中進行去保護反應，會生成表生物素。再者，粗生物素亦可為將第7步驟所得之生成物實施活性碳處理等之純化處理後的生成物。又，粗生物素亦可為市售之生物素。
粗生物素之製造方法之一例係如下所述。
首先，藉由專利文獻1等記載之公知方法，由脲基體(URD)合成下述式(6)所示之乙烯基硫醚體(DVE)。
Figure 02_image009
又，乙烯基硫醚體(DVE)，亦可藉由以專利文獻1等之公知方法(例如專利文獻1之stage1~Stage3)合成下述式(4)所示之內酯化合物(LCT)後，以下述方法合成。
Figure 02_image011
藉由使內酯化合物(4)與乙酸鹼金屬鹽接觸後，與硫代羧酸反應，而得到含有下述式(5)所示之硫內酯(thiolactone)化合物(DTL)之混合物。
Figure 02_image013
於氮環境下，對鋅粉末添加二鹵基乙烷而活性化後，使鹵化烷衍生物接觸而調製鹵化烷基鋅。於其中混合溶解於有機溶劑之硫內酯化合物(5)，對反應液添加酸而得到乙烯基硫醚體(DVE)。
藉由將所合成之乙烯基硫醚體以公知方法還原，得含有到下述式(7)所示之N,N’-二苄基生物素(HVC)的生成物。該生成物，含有副生成的N,N’-二苄基生物素之表異構物。
Figure 02_image015
藉由將該生成物與酸混合，產生N,N’-二苄基生物素及其表異構物之去苄基化反應，而得到含有生物素及表生物素之生成物。作為粗生物素，可使用如此所得之生成物、亦可使用活性碳處理後之生成物。
活性碳處理，為藉由將粗生物素與活性碳混合，而由粗生物素去除雜質之方法。
(生物素) 生物素係以下述式(1)表示，亦稱為D-生物素。
Figure 02_image017
藉由於溶劑中使生物素與L-離胺酸接觸，可生成生物素之L-離胺酸鹽。
(表生物素) 表生物素係以下述式(3)表示，亦稱為D-表生物素。表生物素可包含L-表生物素。
Figure 02_image019
藉由於溶劑中使表生物素與L-離胺酸接觸，可生成表生物素之L-離胺酸鹽。
(L-離胺酸) 本發明所用之L-離胺酸不特別限制。
相對於1莫耳之生物素，L-離胺酸之使用量較佳為0.50莫耳以上且2.0莫耳以下、更佳為1.0莫耳以上且1.5莫耳以下。
(溶劑) 用以使粗生物素與L-離胺酸接觸之溶劑，較佳包含選自由水、醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種。其中尤佳使用由選自由水、或、醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種所構成的有機溶劑；更佳使用水或醇。水包含蒸餾水、純化水、純水、超純水、自來水或此等之混合物。亦可使用含水有機溶劑。含水有機溶劑中，體積基準之含水率較佳為50%以下、更佳為20%以下。
醇較佳包含選自由甲醇、乙醇及2-丙醇所成之群的至少一種，其中尤佳使用乙醇。
(L-離胺酸鹽之製造) 本發明之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，可列舉 (1)包含於水中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液之步驟，及由生物素之L-離胺酸鹽之溶液中使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟的生物素之L-離胺酸鹽之製造方法(以下亦稱「製造方法(1)」)，以及 (2)包含於包含選自由醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種之有機溶劑中，使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液之步驟的生物素之L-離胺酸鹽之製造方法(以下亦稱「製造方法(2)」)。
各自依照製造方法(1)及(2)，可得到表生物素或其鹽少的高純度之生物素之L-離胺酸鹽。所得之高純度之生物素之L-離胺酸鹽中的表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量，依照一例，係為0.035%以下，依照其他例子，係為0.020%以下，依照其他例子，係為0.010%以下，依照其他例子，係為0.004%以下。下限值為0%或檢測極限值。所得之高純度之生物素之L-離胺酸鹽中的生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量(純度)，依照一例，係為99.92%以上，依照其他例子，係為99.94%以上，依照其他例子，係為99.95%以上，依照其他例子，係為99.96%以上。上限值為100%。
(製造方法(1)) (得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液之步驟) 生物素之L-離胺酸鹽，係以下述式(8)表示。
Figure 02_image021
製造方法(1)中，首先，藉由於水中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。該步驟為步驟(a)之一態樣。
於水中使粗生物素與L-離胺酸接觸之方法不特別限制。只要於水中將粗生物素與L-離胺酸攪拌混合，則可得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。水、粗生物素及L-離胺酸之添加順序亦不特別限制。
依照一例，相對於1g之粗生物素，水的使用量例如為1mL以上且10mL以下、較佳為3mL以上且5mL以下。依照其他例子，相對於1g之粗生物素，水的使用量例如為0.5mL以上且5mL以下、較佳為0.5mL以上且2mL以下。
粗生物素與L-離胺酸接觸時之溫度不特別限制。可於室溫接觸，亦可於其後步驟(使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟)中使生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑之接觸時的溫度進行接觸。
亦可於使粗生物素與L-離胺酸於水中接觸後，將所得之混合物攪拌混合。進行攪拌時，攪拌時間例如為1分鐘以上且24小時以下、較佳為10分鐘以上且12小時以下。又，攪拌可於接觸時之溫度或其以上之溫度進行、可與前述接觸時之溫度同樣地為室溫、亦可為其後步驟中使生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑之接觸時的溫度。
所生成之生物素之L-離胺酸鹽及表生物素之L-離胺酸鹽分別可為於水中溶解或溶劑合的狀態，本發明中，包含此等狀態，係稱為生物素之L-離胺酸鹽之溶液。
生物素之L-離胺酸鹽之溶液中，例如可藉由核磁共振(NMR)分光分析確認生物素之L-離胺酸鹽生成。
(使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟) 製造方法(1)中，接著，由上述步驟(得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液之步驟)所得之生物素之L-離胺酸鹽之溶液中，使生物素之L-離胺酸鹽析出，而得到生物素之L-離胺酸鹽之析出物。該步驟相當於步驟(b)。
生物素之L-離胺酸鹽之溶液中，除了生物素之L-離胺酸鹽以外，可含有表生物素之L-離胺酸鹽。因此，較佳由生物素之L-離胺酸鹽之溶液中，僅將生物素之L-離胺酸鹽分離。由生物素之L-離胺酸鹽之溶液中分離生物素之L-離胺酸鹽之方法，可列舉將選擇性地溶解或選擇性地析出生物素之L-離胺酸鹽的溶劑，與生物素之L-離胺酸鹽之溶液混合的方法。由於操作容易的理由，較佳為藉由使生物素之L-離胺酸鹽之溶液與選擇性地析出生物素之L-離胺酸鹽的溶劑(以下亦稱「析出溶劑」)接觸，使生物素之L-離胺酸鹽析出，而得到生物素之L-離胺酸鹽之析出物。
析出溶劑較佳使用含有選自由甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種之有機溶劑；更佳使用由選自由甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種所構成之有機溶劑。作為析出溶劑，由於對生物素之L-離胺酸鹽的選擇性高的理由，較佳使用含有選自由乙醇及2-丙醇所成之群的至少一種之有機溶劑；更佳使用由選自由乙醇及2-丙醇所成之群的至少一種所構成之有機溶劑。就提高生物素之L-離胺酸鹽的純度與產率之觀點，更佳使用2-丙醇。
依照一例，相對於1g之粗生物素，析出溶劑的使用量例如為1mL以上且200mL以下、較佳為10mL以上且100mL以下、更佳為32mL以上且50mL以下。依照其他例子，相對於1g之粗生物素，析出溶劑的使用量例如為5mL以上50mL以下、較佳為8mL以上且20mL以下。
水與析出溶劑之體積比(析出溶劑/水)，例如為1以上且50以下、較佳為5以上且30以下。體積比大時，有生物素之L-離胺酸鹽的產率提高之傾向。另一方面，體積比小時，有生物素之L-離胺酸鹽中所含的表生物素或其鹽之量降低之傾向。由於可得到表生物素或其鹽少的高純度之生物素之L-離胺酸鹽的理由，相對於1g之粗生物素，特佳析出溶劑的使用量及水與析出溶劑之體積比(析出溶劑/水)成為上述範圍。再者，使用複數種類之析出溶劑作為析出溶劑時，析出溶劑之體積，意指複數種類之析出溶劑的合計體積。
生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑接觸時的溫度，例如為0℃以上且100℃以下、較佳為40℃以上且80℃以下。使生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑接觸時，生物素之L-離胺酸鹽會析出，成為生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液。生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑之接觸若在更高溫下進行時，生物素之L-離胺酸鹽之溶液的流動性提高，生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑會充分接觸，因此有生物素之L-離胺酸鹽之析出量增加，生物素之L-離胺酸鹽之產率提高的傾向。再者，亦可使加熱或冷卻至上述接觸溫度的生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑接觸後，將所得之混合物進一步加熱。
生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑的接觸，係藉由對生物素之L-離胺酸鹽之溶液添加析出溶劑來進行即可。再者，析出溶劑亦可分為複數次添加於生物素之L-離胺酸鹽之溶液中。例如可於攪拌下滴下析出溶劑、亦可將第1析出溶劑添加於生物素之L-離胺酸鹽之溶液中並攪拌一定時間後，於其中進一步添加第2析出溶劑並攪拌一定時間。第1析出溶劑與第2析出溶劑，可使用彼此相異之種類者、亦可使用同一種類者。又，第1析出溶劑之量與第2析出溶劑之量可相同亦可相異。
得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液時，較佳於使生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑接觸後，將所得之混合物攪拌混合。攪拌時間例如為1分鐘以上且24小時以下、較佳為10分鐘以上且12小時以下。攪拌較佳於接觸時之溫度或其以上之溫度下進行，例如於0℃以上且100℃以下、較佳為40℃以上且80℃以下之溫度攪拌為佳。使生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑之混合物的攪拌在更高溫下進行時，混合物之流動性提高，生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑會充分接觸，因此有生物素之L-離胺酸鹽之析出量增加，生物素之L-離胺酸鹽之產率提高的傾向。
得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液時，較佳於將生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑之混合物在上述溫度攪拌混合後予以冷卻，再攪拌混合。生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑之混合物的冷卻溫度，例如可為-20℃以上且10℃以下，較佳為-10℃以上且10℃以下。將生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑之混合物予以冷卻時，有生物素之L-離胺酸鹽之析出量增加，生物素之L-離胺酸鹽之產率提高的傾向。又，攪拌時間例如為1分鐘以上且24小時以下、較佳為10分鐘以上且12小時以下。
生物素之L-離胺酸鹽之析出物，係由生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液藉由過濾等取出即可。之後，較佳以洗淨溶劑洗淨。作為洗淨溶劑，係使用與析出溶劑相同種類之溶劑。藉由將洗淨後之析出物乾燥，可得到生物素之L-離胺酸鹽之固體物。生物素之L-離胺酸鹽例如為粉末狀。
(製造方法(2)) 製造方法(2)中，係於包含選自由醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種之有機溶劑中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液。該步驟為步驟(a)之一態樣。
於有機溶劑中使粗生物素與L-離胺酸接觸之方法不特別限制。係於有機溶劑中將粗生物素與L-離胺酸混合即可，有機溶劑、粗生物素及L-離胺酸之添加順序亦不特別限制。
相對於1g之粗生物素，有機溶劑的使用量例如為1mL以上、較佳為5mL以上、更佳為8mL以上。生物素之L-離胺酸鹽幾乎不溶解於醇，故對產量無影響。因此，有機溶劑的使用量之上限並無限制，考慮到操作性時，較佳為100mL以下、更佳為50mL以下。
用於使粗生物素與L-離胺酸接觸之有機溶劑，較佳為由選自由醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種所構成之有機溶劑；更佳為醇。如上所述，由於醇可得到表生物素或其鹽少的高純度之生物素之L-離胺酸鹽，故較佳包含選自由甲醇、乙醇及2-丙醇所成之群的至少一種，其中尤佳使用乙醇。
粗生物素與L-離胺酸之接觸時的溫度不特別限制，例如為0℃以上且100℃以下、較佳為20℃以上且80℃以下。
於有機溶劑中使粗生物素與L-離胺酸接觸時，係將粗生物素與L-離胺酸於有機溶劑中慢慢溶解，所生成的生物素之L-離胺酸鹽會析出，最終成為生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液。
使粗生物素與L-離胺酸於有機溶劑中接觸後，較佳將所得之混合物攪拌混合。攪拌時間例如為1分鐘以上且24小時以下、較佳為30分鐘以上且12小時以下。攪拌較佳於接觸時之溫度或其以上之溫度下進行，例如於0℃以上且100℃以下、較佳為40℃以上且80℃以下之溫度攪拌為佳。若在更高溫下進行混合物之攪拌，則混合物之流動性提高，生物素與L-離胺酸會充分接觸，因此有生物素之L-離胺酸鹽之析出量增加，生物素之L-離胺酸鹽之產率提高的傾向。
所得之生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液，較佳於上述溫度攪拌混合後冷卻，再攪拌混合。生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液的冷卻溫度，例如可為-20℃以上且10℃以下，較佳為-10℃以上且10℃以下。將生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液冷卻時，係有生物素之L-離胺酸鹽之析出量增加，生物素之L-離胺酸鹽之產率提高的傾向。又，攪拌時間例如為1分鐘以上且24小時以下、較佳為30分鐘以上且12小時以下。
生物素之L-離胺酸鹽之析出物，係由生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液中藉由過濾等而取出即可。之後，較佳以洗淨溶劑洗淨。作為洗淨溶劑，係使用與使粗生物素與L-離胺酸接觸時所用的醇相同種類之醇。藉由將洗淨後之析出物乾燥，可得到生物素之L-離胺酸鹽之固體物。生物素之L-離胺酸鹽例如為粉末狀。
(生物素之製造方法) 藉由使以本發明之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法所得的生物素之L-離胺酸鹽與酸接觸，可分解生物素之L-離胺酸鹽而得到生物素。典型而言，係藉由使生物素之L-離胺酸鹽與酸接觸，使固體狀之生物素析出。
本發明之生物素之製造方法中，生物素係將幾乎不含表生物素或其鹽的高純度之生物素之L-離胺酸鹽分解而得到，因此可使所得之生物素中的表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量成為非常低。所得之生物素中的表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量，依照一例，係為0.1%以下，依照其他例子，係為0.01%以下，依照其他例子，係為0.006%以下。該含量之下限值為0%或檢測極限值。
作為酸，例如可使用選自由鹽酸、硫酸、甲磺酸、磷酸、磷酸氫鈉、磷酸氫鉀及檸檬酸所成之群的至少1種酸。酸較佳使用鹽酸。若使用鹽酸，則有生物素之L-離胺酸鹽中可含有的表生物素等之雜質量降低之傾向。鹽酸之濃度例如可為1質量%以上且20質量%以下。又，亦可使用可生成上述酸之酸性鹽以取代酸。酸性鹽較佳使用選自由硫酸氫鉀、硫酸氫鈉、磷酸氫鈉及磷酸氫鉀所成之群的至少1種。亦可合併使用酸與酸性鹽。
相對於1莫耳之生物素之L-離胺酸鹽，酸的使用量例如為0.1莫耳以上且20莫耳以下、較佳為0.5莫耳以上且10莫耳以下、更佳為1.0莫耳以上且3.0莫耳以下。
生物素之L-離胺酸鹽與酸之接觸，可於將生物素之L-離胺酸鹽溶解於溶解溶劑後進行。藉由與酸之接觸，使生物素析出。生物素之L-離胺酸鹽之溶解溶劑，較佳包含選自由水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈所成之群的至少1種。溶解溶劑更佳使用水。
相對於1g之生物素之L-離胺酸鹽，溶解溶劑之量例如為1mL以上且100mL以下、較佳為1mL以上且30mL以下、更佳為1mL以上且15mL以下。
將生物素之L-離胺酸鹽溶解於溶解溶劑後，與酸之接觸較佳於加溫下進行。接觸時之溫度例如為50℃以上且120℃以下、較佳為70℃以上且100℃以下。
與酸之接觸，較佳藉由在將生物素之L-離胺酸鹽溶解於溶解溶劑而得的溶液中滴下酸來進行。酸之滴下所花費的時間，例如為10分鐘以上且2小時以下、較佳為15分鐘以上且2小時以下。
較佳為在攪拌生物素之L-離胺酸鹽之溶液的同時添加酸進行接觸，酸添加後亦在接觸時之溫度下攪拌。酸添加後之攪拌時間，例如為1分鐘以上且5小時以下、較佳為20分鐘以上且2小時以下。
生物素之L-離胺酸鹽之溶液與酸之混合溶液，較佳為在上述溫度下攪拌後冷卻。生物素之L-離胺酸鹽之溶液與酸之混合溶液的冷卻溫度，例如為-20℃以上且10℃以下、較佳為-10℃以上且10℃以下。將生物素之L-離胺酸鹽之溶液與酸之混合溶液冷卻時，係有生物素之析出量增加，生物素之產率提高的傾向。
生物素之L-離胺酸鹽之溶液與酸之混合溶液，較期望一邊攪拌一邊冷卻。生物素之L-離胺酸鹽之溶液與酸之混合溶液的冷卻時間，例如為1分鐘以上且5小時以下、較佳為20分鐘以上且2小時以下。
生物素之析出物，係由經添加酸的生物素之L-離胺酸鹽之溶液中藉由過濾等而取出即可。之後，亦可將由生物素之L-離胺酸鹽所分離的生物素之固體物，使用洗淨溶劑洗淨。洗淨溶劑可使用與可溶解生物素之L-離胺酸鹽的溶解溶劑相同者。藉由將洗淨後之固體物例如於常溫下乾燥，可得到高純度之生物素。
如此所得之生物素，由於不含表生物素等之雜質，因此可達成非常高的純度。所得之高純度生物素中的生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量(純度)，依照一例，係為99.96%以上。藉由HPLC面積百分率所得之含量(純度)之上限值為100%。
再者，藉由以上方法所得之生物素，為了更提高純度，亦可進一步實施上述中和晶析處理、活性碳處理等之純化處理，亦可重複進行複數次以L-離胺酸所為之中和晶析處理。 [實施例]
以下舉例來更詳細說明本發明，但此等例子並非限定本發明之範圍者。
＜純度測定＞ 使用高效能液相層析(HPLC)，由下述條件測定製造例所得之粗生物素、實施例所得之乾燥後的生物素之L-離胺酸鹽，及實施例所得之乾燥後的生物素中，生物素及表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量。
再者，生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量，係作為由下述條件所測定的生物素之波峰的面積值相對於溶劑之波峰及L-離胺酸之波峰以外的全部波峰之合計面積值的比例而求得。表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量，除了使用表生物素之波峰的面積值來取代生物素之波峰的面積值這點以外，係同上述來求得。
裝置：Waters Corporation製Waters Alliance (註冊商標) e2695 檢測器：紫外吸光光度計 Waters 2489 測定波長：200nm 移動相A：20mM KH 2PO 4水溶液(pH3) 移動相B：乙腈 移動相之送液： 0-30分鐘：移動相A92%、移動相B8% 30-35分鐘：移動相A20%、移動相B80% 35-40分鐘：移動相A92%、移動相B8% 流速：1.0mL/min 管柱溫度：40℃ 管柱、填充劑：XBridge C18、5μm(4.6x150mm) L-離胺酸之RT：1.493 生物素之RT：11.912 表生物素之RT：15.729。
＜粗生物素之製造例1＞ (內酯化合物(LCT)之合成) 首先，以專利文獻1記載之方法，由脲基體(URD)經過3個步驟合成內酯化合物(LCT)15.00g。
(硫內酯化合物(DTL)之合成) 將內酯化合物15.00g(0.047mol)、乙酸鉀鹽7.31g(0.074 mol)、N,N-二甲基乙醯胺(DMA) 22.5mL置入200mL四口燒瓶中，於室溫、氮氣流下攪拌而得到混合物。
將該混合物加熱至125℃之溫度後，將硫乙酸4.25g(0.056mol)分為十分之一的量每隔3分鐘添加，於125℃之溫度攪拌2小時，得到含有硫內酯化合物之混合物。
接著，將該混合物冷卻至80℃之溫度後，添加15mL之DMA。花30分鐘於其中進一步添加40mL之水，於25℃以上且30℃以下之溫度攪拌2小時，得到含有硫內酯化合物之析出物的混合物。將其過濾，濾離硫內酯化合物之析出物。將經濾離之硫內酯化合物之析出物以洗淨液洗淨。洗淨液係使用10mL丙酮與20mL水之混合溶劑。洗淨後之硫內酯化合物之析出物之量為16.34g。使用HPLC由上述條件進行測定後，洗淨後之硫內酯化合物之析出物(濕體)中所含的硫內酯化合物之量為13.39g，從內酯化合物的產率為85%(stage 4)。
(5-碘戊酸乙基鋅之合成) 於氮環境下，使鋅粉末(HAKUSUI TECH公司製R粉末、4.29g、65.6mmol)懸浮於四氫呋喃(THF、7.0mL)、甲苯(4.9mL)之混合溶劑，於75℃花30分鐘滴下1,2-二溴乙烷(2.57g、13.7mmol)，於同溫度下攪拌30分鐘。之後，於55℃花30分鐘滴下5-碘戊酸乙酯(I-TAI 7.0g、27.3mmol)，於同溫度下攪拌3小時。取一部分反應液，藉由上述方法以氣相層析進行分析後，對鋅化合物之轉化率為97.96%。
(乙烯基硫醚體(DVE)之合成) 將反應液冷卻至25℃，添加硫內酯化合物(6.48g、19.1mmol)、甲苯(14mL)。之後，於同溫度下添加10%Pd/C (179.4mg、0.169mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(DMF、1.8mL)懸浮液，於40℃攪拌3小時、25℃攪拌14小時。
反應結束後，於25℃添加16%鹽酸(14mL)，於同溫度下攪拌1小時後，過濾反應液。將濾液於40℃攪拌1小時後，將有機層以水(14mL、2x21mL)、5%亞硫酸鈉水溶液(21mL)、5%碳酸氫鈉水溶液(21mL)、水(14mL)進行洗淨並水洗、濃縮而得到乙烯基硫醚體。將所得之有機層以高效能液相層析進行分析後，對乙烯基硫醚體之轉化率為98.37%(stage 5)。
(N,N’-二苄基生物素(HVC)之合成) 將該乙烯基硫醚體(最大19.1mmol)溶解於甲醇(59mL)及水(16mL)之混合液，添加Pd(OH) 2/C(50質量%濕、0.59g)，於11℃、氫壓0.9MPa進行12小時接觸還原。反應結束後，過濾反應液，對濾液添加31質量%NaOH水溶液(7.01g)於40℃進行2小時攪拌混合。氫化結束後，對反應液添加10質量%鹽酸，使成為pH1。將甲醇減壓餾去，將生成物以乙酸乙酯萃取並水洗、濃縮，藉以得到含有N,N’-二苄基生物素之生成物。該生成物，含有副生成之N,N’-二苄基生物素之表異構物。
(生物素(BIF)之合成) 對N,N’-二苄基生物素(2.04g,4.81mmol)於室溫添加均三甲苯(6.6mL)與硫酸(1.7mL)，於100℃攪拌2.5小時。反應結束後，去除均三甲苯，添加甲苯(7.7mL)進行10分鐘攪拌。去除甲苯後，將反應液於保持80℃下將水(25mL)8等分，每隔10分鐘添加，於同溫度下攪拌10分鐘。將反應液放冷後，冷卻至5℃，攪拌3小時。濾取所得到之結晶，以水(8.2mL)、丙酮(10mL)洗淨。之後，於60℃減壓乾燥16小時藉以得到生物素(1.02g、產率86.5%)。以下將該生物素亦稱為粗生物素。該粗生物素中的生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量(純度)為99.914%、表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量為0.037%。
＜實施例1＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS1之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與5mL之蒸餾水依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，溶解而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。於攪拌該溶液下，加熱至60℃後，滴下30mL之2-異丙醇(IPA)，於同溫度下攪拌30分鐘。將滴下後之溶液於攪拌下冷卻至5℃後，保持5℃攪拌一晩，使生物素之L-離胺酸鹽析出。藉由過濾而取出所析出的生物素之L-離胺酸鹽，於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.32g，其產率為82.67%。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS1。
針對所得之生物素之L-離胺酸鹽BLS1，以400MHz進行1H-NMR分光分析，結果如下述所示。溶劑係使用重水(D 2O)。 δ4.60(m, 1H) 4.46(m, 1H) 3.72(t, 1H) 3.36(m, 1H) 3.02(m, 3H) 2.80(d, 1H) 2.20(t, 2H) 1.88(m, 2H) 1.75(m, 3H) 1.62(m, 3H) 1.40-1.55(m, 4H)。
＜實施例2＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS2之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與5mL之蒸餾水依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，溶解而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。於攪拌該溶液下，加熱至60℃後，滴下40mL之2-異丙醇(IPA)，於同溫度下攪拌30分鐘。將滴下後之溶液於攪拌下冷卻至5℃後，保持5℃攪拌一晩，使生物素之L-離胺酸鹽析出。藉由過濾而取出所析出的生物素之L-離胺酸鹽，於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.58g，其產率為98.67%。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS2。
＜實施例3＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS3之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與5mL之蒸餾水依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，溶解而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。於攪拌該溶液下，加熱至60℃後，滴下50mL之2-異丙醇(IPA)，於同溫度下攪拌30分鐘。將滴下後之溶液於攪拌下冷卻至5℃後，保持5℃攪拌1小時，使生物素之L-離胺酸鹽析出。藉由過濾而取出所析出的生物素之L-離胺酸鹽，將其以25mL之2-異丙醇洗淨。於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.61g，其產率為quant.。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS3。
＜實施例4＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS4之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與4mL之蒸餾水依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，溶解而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。於攪拌該溶液下，加熱至60℃後，滴下32mL之2-異丙醇(IPA)，於同溫度下攪拌30分鐘。將滴下後之溶液於攪拌下冷卻至5℃後，保持5℃攪拌1小時，使生物素之L-離胺酸鹽析出。藉由過濾而取出所析出的生物素之L-離胺酸鹽，將其以16mL之2-異丙醇洗淨。於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.61g，其產率為quant.。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS4。
＜實施例5＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS5之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與1mL之蒸餾水依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，溶解而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。於攪拌該溶液下，加熱至60℃後，滴下20mL之乙醇(EtOH)，於同溫度下攪拌30分鐘。將滴下後之溶液於攪拌下冷卻至5℃後，保持5℃攪拌1小時，使生物素之L-離胺酸鹽析出。藉由過濾而取出所析出的生物素之L-離胺酸鹽，將其以10mL之冷乙醇洗淨。於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.58g，其產率為98.60%。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS5。
＜實施例6＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS6之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與0.5mL之蒸餾水依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，溶解而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。於攪拌該溶液下，加熱至60℃後，滴下10mL之乙醇(EtOH)，於同溫度下攪拌30分鐘。將滴下後之溶液於攪拌下冷卻至5℃後，保持5℃攪拌1小時，使生物素之L-離胺酸鹽析出。藉由過濾而取出所析出的生物素之L-離胺酸鹽，將其以25mL之冷乙醇洗淨。於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.61g，其產率為quant.。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS6。
＜實施例7＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS7之製造) 將製造例1所得之粗生物素5g(20.47mmol)、3.29g (20.51mmol)之L-離胺酸與5mL之蒸餾水依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，溶解而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液。於攪拌該溶液下，加熱至60℃後，滴下100mL之乙醇(EtOH)，於同溫度下攪拌30分鐘。將滴下後之溶液於攪拌下冷卻至5℃後，保持5℃攪拌1小時，使生物素之L-離胺酸鹽析出。藉由過濾而取出所析出的生物素之L-離胺酸鹽，將其以25mL之冷乙醇洗淨。於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為7.93g，其產率為99.24%。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS7。
＜實施例8＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS8之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與20mL之乙醇(EtOH)依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液。於攪拌該懸浮液下，加熱至60℃後，於同溫度下攪拌30分鐘，之後冷卻至5℃，於同溫度下攪拌1小時。藉由過濾而取出生物素之L-離胺酸鹽，將其以25mL之乙醇洗淨。於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.61g，其產率為quant.。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS8。
＜實施例9＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS9之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與10mL之乙醇(EtOH)依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液。於攪拌該懸浮液下，加熱至60℃後，於同溫度下攪拌30分鐘，之後冷卻至5℃，於同溫度下攪拌1小時。藉由過濾而取出生物素之L-離胺酸鹽，將其以15mL之冷乙醇洗淨。於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.61g，其產率為quant.。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS9。
＜實施例10＞ (生物素之L-離胺酸鹽BLS10之製造) 將製造例1所得之粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg (4.50mmol)之L-離胺酸與8mL之乙醇(EtOH)依序置入反應容器中並進行攪拌、混合，得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液。於攪拌該懸浮液下，加熱至60℃後，於同溫度下攪拌30分鐘，之後冷卻至5℃，於同溫度下攪拌1小時。藉由過濾而取出生物素之L-離胺酸鹽，將其以20mL之冷乙醇洗淨。於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽。乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽之量為1.62g，其產率為quant.。以下，將該生物素之L-離胺酸鹽亦稱為生物素之L-離胺酸鹽BLS10。
＜實施例11＞ (生物素之製造) 將6.0g(15.37mmol)的乾燥後之生物素之L-離胺酸鹽BLS7，溶解於21.0mL之蒸餾水而得到溶液。於攪拌該溶液下，加熱至90℃後，保持90℃，花30分鐘滴下11.2g (15.37mmol)之10質量%鹽酸。將鹽酸滴下後之懸浮液於同溫度下攪拌30分鐘，於攪拌下冷卻至5℃後，於同溫度下攪拌30分鐘。藉由過濾將所析出之生物素取出，將其以12mL之蒸餾水洗淨。將洗淨後之生物素於25℃減壓乾燥，得到乾燥後之生物素。乾燥後之生物素之量為3.59g，其產率為95.58%。
關於實施例1至10之生物素之L-離胺酸鹽的製造之條件及測定結果係歸納於下述表1。表1中之「含量」，為藉由HPLC面積百分率所得之含量(%)。
Figure 02_image023
關於實施例11之生物素的製造之條件，以及關於製造例1、實施例11之測定結果係歸納於下述表2。表2中之「含量」，為藉由HPLC面積百分率所得之含量(%)。
Figure 02_image025
如表1所示，藉由於溶劑中使粗生物素與L-離胺酸接觸，由生物素之L-離胺酸鹽之溶液或懸浮液中分離生物素之L-離胺酸鹽，而得到生物素之L-離胺酸鹽，而可減少表生物素之量。又，如表2所示，於溶劑中使生物素之L-離胺酸鹽與酸接觸的實施例11之乾燥後之生物素，幾乎不含表生物素，可提高生物素之純度。

Claims (13)

  1. 一種生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其包含以下之步驟： (a)於溶劑中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液或懸浮液之步驟，及 (b)於步驟(a)中得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液的情況，由生物素之L-離胺酸鹽之溶液中使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟。
  2. 如請求項1之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中溶劑包含選自由水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種。
  3. 如請求項1或2之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中步驟(a)為於水中使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之溶液之步驟。
  4. 如請求項1或2之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中步驟(b)為藉由使生物素之L-離胺酸鹽之溶液與析出溶劑接觸，而使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟。
  5. 如請求項4之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中析出溶劑包含選自由甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種。
  6. 如請求項4之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中水與析出溶劑之體積比(析出溶劑/水)為5以上且30以下。
  7. 如請求項4之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中步驟(b)為藉由將生物素之L-離胺酸鹽之溶液於40℃以上且80℃以下加熱後，與析出溶劑接觸，之後於-10℃以上且10℃以下冷卻，而使生物素之L-離胺酸鹽析出之步驟。
  8. 如請求項1或2之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中步驟(a)為於含有選自由醇、丙酮及乙腈所成之群的至少一種之有機溶劑中，使粗生物素與L-離胺酸接觸，而得到生物素之L-離胺酸鹽之懸浮液之步驟。
  9. 如請求項8之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中有機溶劑為醇。
  10. 如請求項8之生物素之L-離胺酸鹽之製造方法，其中相對於粗生物素1g，有機溶劑之使用量為8mL以上。
  11. 一種生物素之製造方法，其包含於藉由如請求項1~10中任一項之方法製造生物素之L-離胺酸鹽後，使該生物素之L-離胺酸鹽與酸接觸，而得到生物素之步驟。
  12. 一種生物素之L-離胺酸鹽。
  13. 如請求項12之生物素之L-離胺酸鹽，其中表生物素之藉由HPLC面積百分率所得之含量為0.035%以下。
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